基于吲哚胺2，3-双加氧酶的免疫疗法
阅读：765发布：2020-05-27
专利汇可以提供基于吲哚胺2，3-双加氧酶的免疫疗法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及癌症的 预防 和 治疗 的领域。特别地，提供了能够引起抗癌免疫应答的 蛋白质 吲哚胺2，3-双加 氧 酶(IDO)或其肽 片段 。具体地，本发明涉及IDO或由其衍生的肽或IDO特异性T细胞在治疗癌症中的应用。因此本发明涉及抗癌 疫苗 ，其任选地可以与其他免疫疗法联合使用，并且涉及过继转移的或在体内通过疫苗接种诱导的IDO特异性T细胞作为 癌症治疗 方法。本发明的一个方面是本文提供的药物可以与癌症化疗联合使用。更多的方面涉及通过如上所述的相同方式对感染的预防和治疗。还提供了IDO和其免疫原性肽片段在癌症和感染治疗、诊断和 预后 中的应用。，下面是基于吲哚胺2，3-双加氧酶的免疫疗法专利的具体信息内容。
1.一种用作药物的疫苗组合物，包含：
a)吲哚胺2,3-双加氧酶的免疫原性活性肽片段，所述免疫原性活性肽片段选自由SEQ ID NO:3、6和7组成的组；和
b)佐剂。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物当施用于患有以吲哚胺
2,3-双加氧酶的表达为特征的临床病症的个体时能够引起针对表达SEQ ID NO:1、13、14、
15和/或16的吲哚胺2,3-双加氧酶或其功能同源物的癌症和/或抗原呈递细胞的免疫应答。
3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物能够在所述个体中引起细胞免疫应答。
4.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中所述临床病症是癌症。
5.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中所述临床病症是感染。
6.根据权利要求1所述的疫苗组合物，包含具有下列特征的至少一种的MHC I类-限制性肽：
4
a)能够以通过ELISPOT测定法测定的至少1个/10 个PBL的频率在患有临床病症的个体的PBL群中诱发INF-γ产生细胞，和/或
b)能够在肿瘤组织中原位检测与所述MHC I类-限制性肽具有反应性的CTL，
c)能够在体外诱导吲哚胺2,3-双加氧酶特异性T细胞的生长。
7.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中所述癌症是形成肿瘤的癌症疾病。
8.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述肽片段为SEQ ID NO:3或6。
9.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物在接种的个体中诱发产生对表达吲哚胺2,3-双加氧酶的癌细胞和/或表达吲哚胺2,3-双加氧酶的抗原呈递细胞具有细胞毒性作用的调节性T细胞。
10.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物能够诱导抗原特异性T细胞在受试者的肿瘤基质中浸润。
11.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物能够在受试者中引起临床反应，其中所述临床反应的特征为疾病稳定、部分反应或完全缓解。
12.根据权利要求1所述的疫苗组合物，还包含选自不是吲哚胺2,3-双加氧酶的蛋白质或肽片段的免疫原性蛋白质或肽片段。
13.根据权利要求1或12所述的疫苗组合物，其中所述佐剂选自由基于细菌DNA的佐剂、基于油/表面活性剂的佐剂、基于病毒dsRNA的佐剂和咪唑并喹啉组成的组。
14.根据权利要求13所述的疫苗组合物，其中所述佐剂为Montanide ISA佐剂。
15.根据权利要求14所述的疫苗组合物，其中所述佐剂为Montanide ISA51或
Montanide ISA720。
16.根据权利要求15所述的疫苗组合物，其中所述佐剂为Montanide ISA51。
17.根据权利要求1或12所述的疫苗组合物，其中所述佐剂为GM-CSF。
18.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞包含所述免疫原性活性肽片段或编码所述免疫原性活性肽片段的核酸。
19.根据权利要求18所述的疫苗组合物，其中所述抗原呈递细胞是树突细胞。
20.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述组合物还包含不属于或不来自吲哚胺2,3-双加氧酶的蛋白质或肽片段。
21.一种多组分试剂盒，其包含根据权利要求1所述的疫苗组合物和第二活性成分。
22.根据权利要求21所述的包含疫苗组合物的多组分试剂盒，其中所述第二活性成分是免疫刺激组合物。
23.根据权利要求22所述的多组分试剂盒，其中所述免疫刺激组合物包含一种或多种白介素。
24.根据权利要求23所述的多组分试剂盒，其中所述白介素选自IL-2和/或IL-21。
25.根据权利要求21所述的包含根据权利要求1所述的疫苗组合物的多组分试剂盒，其中所述第二活性成分为抗癌剂。
26.根据权利要求25所述的多组分试剂盒，其中所述抗癌剂为化疗剂。
27.根据权利要求26所述的多组分试剂盒，其中所述化疗剂选自：辅酶B12、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西紫杉醇、去氧氟尿苷、阿霉素、表阿霉素、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊立替康、来那度胺、甲酰四氢叶酸、氮芥、马法兰、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、Revlimid、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。
28.根据权利要求21所述的包含根据权利要求1所述的疫苗组合物的多组分试剂盒，其中所述第二活性成分是抗生素。
29.根据权利要求28所述的多组分试剂盒，其中所述抗生素选自：阿莫西林、青霉素、阿昔洛韦和/或阿糖腺苷。
30.根据权利要求21所述的多组分试剂盒，其中根据权利要求1所述的疫苗组合物和所述第二活性成分同时或相继施用。
31.一种用于离体或原位诊断在患有临床病症的个体中在PBL或在肿瘤组织中与吲哚胺2,3-双加氧酶有反应性的T细胞的存在的组合物，所述组合物包含根据权利要求1所限定的肽片段。
32.一种用于离体或原位诊断在患有临床病症的个体中在PBL或在肿瘤组织中与吲哚胺2,3-双加氧酶有反应性的T细胞的存在的诊断试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1所限定的肽片段。
33.根据权利要求1所限定的肽片段与I类HLA或II类HLA分子或所述分子的片段的复合物。
34.权利要求33所述的复合物，所述复合物是单体。
35.权利要求33所述的复合物，所述复合物是多聚体。
36.权利要求33的复合物在制备用于检测患有临床病症的个体中吲哚胺2,3-双加氧酶反应性T细胞的存在的药物中的应用，其中所述复合物被配制用于接触肿瘤组织或血样并且检测所述复合物与所述组织或所述血细胞的结合。
37.有效量的根据权利要求1所述的组合物或根据权利要求21所述的多组分试剂盒在制备用于治疗以表达吲哚胺2,3-双加氧酶为特征的临床病症的药物中的应用。
38.权利要求37所述的应用，其中待治疗的临床病症是其中表达吲哚胺2,3-双加氧酶的癌症疾病。
39.权利要求38所述的应用，所述药物被制备来与另外的癌症治疗联合。
40.权利要求39所述的应用，其中另外的癌症治疗选自由化学疗法、放射疗法、使用免疫刺激物质的治疗、基因疗法、使用抗体的治疗和使用树突细胞的治疗组成的组。
41.权利要求37所述的应用，其中待治疗的临床病症是导致吲哚胺2,3-双加氧酶在APC中表达的感染。
42.权利要求41所述的应用，所述药物被制备来与另外的针对所述感染的治疗联合。
43.权利要求42所述的应用，其中另外的针对所述感染的治疗选自由化学疗法、使用免疫刺激物质的治疗、基因疗法、使用抗体的治疗和使用树突细胞的治疗组成的组。
44.根据权利要求1所述的疫苗组合物在制造用于治疗或预防临床病症的药物中的应用，其中所述临床病症是癌症或感染。
45.权利要求44所述的应用，其中待治疗的疾病是其中表达吲哚胺2,3-双加氧酶的癌症疾病。
46.根据权利要求44所述的应用，所述药物被制备来与另外的癌症治疗联合。
47.权利要求46所述的应用，其中另外的癌症治疗选自由化学疗法、放射疗法、使用免疫刺激物质的治疗、基因疗法、使用抗体的治疗和使用树突细胞的治疗组成的组。
48.权利要求44所述的应用，其中待治疗的临床病症是导致吲哚胺2,3-双加氧酶在APC中表达的感染。
49.权利要求48所述的应用，所述药物被制备来与另外的针对所述感染的治疗联合。
50.权利要求49所述的应用，其中所述另外的针对所述感染的治疗选自由化学疗法、使用免疫刺激物质的治疗、基因疗法、使用抗体的治疗和使用树突细胞的治疗组成的组。
51.吲哚胺2,3-双加氧酶的免疫原性活性肽片段在制备用于在个体中监测免疫接种作用的药物中的应用，其中所述免疫原性活性肽片段选自由SEQ IDNO:3、6和7组成的组。
52.用于治疗或预防与吲哚胺2,3-双加氧酶的表达相关的临床病症的吲哚胺2,3-双加氧酶的免疫原性活性肽片段，其中所述免疫原性活性肽片段选自由SEQ ID NO:3、6和7组成的组。
53.根据权利要求52所述的免疫原性活性肽片段，其中所述与吲哚胺2,3-双加氧酶的表达相关的临床病症是癌症和/或感染。
54.用于治疗或预防癌症的根据权利要求1所述的疫苗组合物。
基于吲哚胺2，3-双加氧酶的免疫疗法
[0001] 相关申请的交叉引用
技术领域
[0003] 本发明涉及癌症的预防和治疗的领域。特别地，提供了能够引起抗癌免疫应答的蛋白质——吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)——或其肽片段。具体地，本发明涉及IDO或由其衍生的肽或IDO特异性T细胞在治疗癌症中的应用。因此本发明涉及抗癌疫苗，其任选地可以与其他免疫疗法结合使用，并且涉及过继转移的或在体内通过疫苗接种诱导的IDO特异性T细胞作为癌症治疗方法。本发明的一个方面是本文提供的药物可以与癌症化疗治疗联合使用。进一步的方面涉及通过如上所述的相同方式对感染的预防和治疗。
[0004] 还提供了IDO和其免疫原性肽片段在癌症和感染治疗、诊断和预后中的应用。
背景技术
[0005] 免疫系统具有识别和破坏赘生性细胞的能力；然而，尽管致瘤性转化与免疫原性抗原的表达相关这一事实，但免疫系统经常不能有效地对这些抗原应答。免疫系统显然耐1
受这些抗原 。当这种情况发生时，赘生性细胞不受控制地增殖，导致恶性癌症的形成，其中对于受累的个体其预后很差。对于癌症免疫治疗的成功进行，必须克服获得性的耐受状态。
受这些抗原 。当这种情况发生时，赘生性细胞不受控制地增殖，导致恶性癌症的形成，其中对于受累的个体其预后很差。对于癌症免疫治疗的成功进行，必须克服获得性的耐受状态。
[0006] 吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)是维持免疫系统的内稳态的主要成分，然而其也促进肿瘤诱导的耐受性。IDO的表达和激活在肿瘤和肿瘤引流淋巴结(LN)中经由必需氨基酸色氨酸的降解直接抑制T细胞或经由局部Treg-(激活调节性T细胞)介导的免疫抑制的增强来建立致耐受性的环境。就前者而言，IDO的一些生物学作用通过色氨酸的局部耗竭介3，4
导，而另一些作用则经免疫调节性色氨酸代谢物来介导 。近年来，已经鉴定了T细胞中的IDO-应答信号传导系统，其包括应激激酶GCN25。GCN2对不带电荷tRNA的增加发生应答，如果T细胞耗尽色氨酸这将会发生，并且缺乏GCN2的T细胞耐受IDO介导的抑制和无反应
6
性诱导 。
导，而另一些作用则经免疫调节性色氨酸代谢物来介导 。近年来，已经鉴定了T细胞中的IDO-应答信号传导系统，其包括应激激酶GCN25。GCN2对不带电荷tRNA的增加发生应答，如果T细胞耗尽色氨酸这将会发生，并且缺乏GCN2的T细胞耐受IDO介导的抑制和无反应
6
性诱导 。
[0007] IDO可以在肿瘤内由肿瘤细胞以及肿瘤基质细胞表达，在此其抑制免疫应答的效应期。另外，表达IDO的抗原呈递细胞(APC)存在于肿瘤引流淋巴结中，在此认为它们建立+了致耐受性的微环境。实际上，从肿瘤引流淋巴结分离的表达IDO的CD19 浆细胞样树突细
7，8
胞(DC)在体内介导复杂的免疫抑制和T细胞无反应性 ；来自正常淋巴结和脾脏的浆细胞样DC不表达IDO。在除肠之外的正常淋巴组织中非常少的细胞构成性地表达IDO。此暗示肿瘤引流淋巴结中的、组成型表达IDO的DC必须接受到了刺激，该刺激与肿瘤的存在有关。
认为此刺激是由从肿瘤迁移至引流淋巴结的激活调节性T细胞(Tregs)传递的。Tregs已
9
经显示能经由CTLA-4的细胞表面表达来诱导IDO。IDO的诱导将肿瘤引流淋巴结从免疫环+
境转变成耐受环境。实际上，当IDODC注射至体内时，它们在引流注射部位的淋巴结中建
10
立抗原特异性T细胞的抑制和无反应性 。除了其在免疫活性细胞中的表达以外，IDO常常在肿瘤微环境中表达，或在肿瘤细胞本身中，或在不同的基质细胞中。在此情况下，IDO被
11，12
认为抑制免疫应答的效应期 。在临床中，已经反复地观察到，肿瘤细胞中IDO的表达与
13，14
不佳的预后有关 。
7，8
胞(DC)在体内介导复杂的免疫抑制和T细胞无反应性 ；来自正常淋巴结和脾脏的浆细胞样DC不表达IDO。在除肠之外的正常淋巴组织中非常少的细胞构成性地表达IDO。此暗示肿瘤引流淋巴结中的、组成型表达IDO的DC必须接受到了刺激，该刺激与肿瘤的存在有关。
认为此刺激是由从肿瘤迁移至引流淋巴结的激活调节性T细胞(Tregs)传递的。Tregs已
9
经显示能经由CTLA-4的细胞表面表达来诱导IDO。IDO的诱导将肿瘤引流淋巴结从免疫环+
境转变成耐受环境。实际上，当IDODC注射至体内时，它们在引流注射部位的淋巴结中建
10
立抗原特异性T细胞的抑制和无反应性 。除了其在免疫活性细胞中的表达以外，IDO常常在肿瘤微环境中表达，或在肿瘤细胞本身中，或在不同的基质细胞中。在此情况下，IDO被
11，12
认为抑制免疫应答的效应期 。在临床中，已经反复地观察到，肿瘤细胞中IDO的表达与
13，14
不佳的预后有关 。
[0008] 因此，IDO的表达和伴随的IDO诱导的癌症免疫抑制造成了癌症治疗中的问题。
发明内容
[0009] 本发明基于发明人的出人意料的发现解决了癌症免疫抑制的问题，该发现是在癌症患者中针对IDO表达细胞的自发性细胞毒性免疫应答。这些发现开启了新型治疗和诊断方式之路，其可以广泛地应用于癌症疾病的控制中。
[0010] 本发明通过直接杀死表达IDO的癌细胞和通过杀死表达IDO、诱导无反应性的APC/DC来靶向癌症疾病。这通过使T细胞能够识别表达IDO的细胞来完成。同样地，当临床病症是感染时，T细胞能够杀死表达IDO的APC/DC。因此，癌细胞和APC中免疫抑制酶IDO的表达与本发明的方法的应用结合是有积极意义的，本发明的方法靶向这些表达IDO的细胞。此方法，尤其是因为其必须杀死APC/DC，与本领域中的普遍观点相反，在本领域的普遍观点中通常试图下调/抑制IDO以便去除APC/DC周围的耐受环境同时保留这些细胞，这被认为是必须的以便引起有效的免疫应答。
[0011] 此外，针对表达IDO的细胞的自发性细胞毒性免疫应答的发现是特别出人意料的，因为表达IDO的细胞拮抗其他免疫治疗方法的所需效应。因此，靶向IDO和靶向肿瘤的免疫疗法的组合是高度协同的。
[0012] 本发明涉及一种用作药物的疫苗组合物，其包含SEQ ID NO：(1，13，14，15和/或16)的吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)或与SEQ ID NO：(1，13，14，15和/或16)具有至少70％同一性的其功能同源物或包含所述IDO或所述其功能同源物的连续序列的免疫原性活性肽片段或编码所述IDO或所述肽片段的核酸；以及佐剂。
[0014] 本文还提供了将本发明的疫苗与其他的癌症治疗诸如化疗剂结合的方面。
[0015] 本文还提供了将本发明的疫苗与其他的针对感染的治疗诸如免疫疗法和/或抗生素结合的方面。
[0016] 本发明的另一方面涉及一种用于离体或原位诊断癌症患者中在PBL或在肿瘤组织中与IDO有反应性的T细胞的存在的组合物，所述组合物包含SEQ ID NO：(1，13，14，15和/或16)的吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)或与SEQ ID NO：(1，13，14，15和/或16)具有至少70％同一性的其功能同源物或包含所述IDO或所述其功能同源物的连续序列的免疫原性活性肽片段。
[0017] 另外的一个方面涉及一种用于离体或原位诊断癌症患者中在PBL或在肿瘤组织中与IDO有反应性的T细胞的存在的诊断试剂盒，所述试剂盒包含SEQ IDNO：(1，13，14，15和/或16)的吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)或与SEQ ID NO：(1，13，14，15和/或16)具有至少70％同一性的其功能同源物或包含所述IDO或所述其功能同源物的连续序列的免疫原性活性肽片段。
[0018] 本文还提供了一种包含所述IDO或所述其功能同源物的连续序列的肽片段和I类HLA或II类HLA分子或此类分子的片段的复合物。
[0019] 本发明的另一个方面是一种检测癌症患者中IDO反应性T细胞的存在的方法，所述方法包括将肿瘤组织或血样与包含所述IDO或所述其功能同源物的连续序列的肽片段和I类HLA或II类HLA分子或此类分子的片段的复合物接触，并且检测所述复合物与所述组织或所述血细胞的结合。
[0020] 本发明还有一个方面涉及一种能够与包含所述IDO或所述其功能同源物的连续序列的肽片段特异性结合的分子。
[0021] 由此可见，通过上述的任一种方式治疗临床病症诸如癌症或感染的方法包括在本发明的范围内；所述方式包括向患有临床病症的个体施用有效量的如上所述的疫苗组合物；能够与包含所述IDO或所述其功能同源物的连续序列的肽片段特异性结合的分子，或包含上述的疫苗或分子以及其他的免疫刺激组合物和/或化疗剂的多组分试剂盒。
[0022] 因此包含所述IDO或所述其功能同源物的连续序列的免疫原性活性肽片段或上述疫苗组合物在制造用于治疗或预防癌症疾病的药物中的应用也是本发明的目的。
[0023] 本发明的另一个目的是一种监测免疫接种作用的方法，所述方法包括以下步骤：提供来自个体的血样；提供SEQ ID NO：(1，13，14，15和/或16)的IDO或与SEQ ID NO：(1，
13，14，15和/或16)具有至少70％同一性的其功能同源物或包含所述IDO或所述其功能同源物的连续序列的免疫原性活性肽片段或编码所述IDO或所述肽片段的核酸；确定所述血样是否包含与所述蛋白质或肽特异性结合的抗体或含有与所述蛋白质或肽特异性结合的T细胞受体的T细胞；以及从而确定在所述个体中是否已经产生了针对所述蛋白质或肽的免疫应答。
附图说明
13，14，15和/或16)具有至少70％同一性的其功能同源物或包含所述IDO或所述其功能同源物的连续序列的免疫原性活性肽片段或编码所述IDO或所述肽片段的核酸；确定所述血样是否包含与所述蛋白质或肽特异性结合的抗体或含有与所述蛋白质或肽特异性结合的T细胞受体的T细胞；以及从而确定在所述个体中是否已经产生了针对所述蛋白质或肽的免疫应答。
附图说明
[0024] 图1针对IDO的HLA-A2-限制性T细胞应答；
[0025] 图2a HLA-A2-限制性阳性对照肽的结合；
[0026] 图2b来自肾细胞癌患者的PBL中的IDO5-特异性CD8T细胞；
[0027] 图2c-f IDO5-特异性T细胞的四聚体分析；
[0028] 图3IDO5-特异性T细胞克隆的特异性和功能性能力；
[0029] 图4直方图显示细胞内IDO染色；
[0030] 图5IDO5-特异性T细胞克隆(RBS35)杀死IFN-γ处理的乳腺癌细胞系的功能性能力；
[0031] 图6IDO5-特异性T细胞克隆(RBS35)杀死DC的功能性能力；
[0032] 图7通过51Cr-释放测定法测定IDO5-特异性T细胞的特异性和功能性能力；
[0033] 图8IDO序列IDO、IDOA、IDOB和IDOC的多序列比对；
[0034] 图9IDO和IDOLIKE的配对比对。
具体实施方式
[0036] 定义
[0037] 佐剂：与施用的免疫原决定簇/抗原/核酸构建体的混合增加或以其他的方式改变对所述决定簇的免疫应答的任何物质。
[0038] 氨基酸：任何合成或天然存在的氨基羧酸，包括存在于肽和多肽中的任何氨基酸，所述肽和多肽包括体内合成的蛋白质和酶，因此包括氨基酸的修饰。本文中使用的术语氨基酸与术语“氨基酸残基”同义，氨基酸残基的含义包含如所述的已经与至少一种其他物类，诸如2种，例如3种，诸如超过3种的其他物类反应的氨基酸。上位术语氨基酸包括天然的和非天然的氨基酸两者，它们的任一种可以处于“D”或“L”异构形式。
[0039] 抗体：免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的活性部分。抗体例如是完整的免疫球蛋白分子或其保留免疫学活性的片段。
[0040] 抗原：可以与克隆性分布的免疫受体(T细胞或B细胞受体)结合的任何物质。通常，为肽、多肽或多聚多肽。抗原优选地能够引起免疫应答。
[0041] APC：抗原呈递细胞。APC是在其表面上展示与MHC复合的外来抗原的细胞。T细胞可以使用其T细胞受体(TCR)识别此复合物。APC分为两类：专职性，(其有三种类型：树突细胞、巨噬细胞和B细胞)或非专职性(不组成型表达与幼稚T细胞相互作用所需的主要组织相容性复合物蛋白质；这些仅在通过某些细胞因子诸如IFN-γ刺激非专职性APC时表达)。
[0042] 加强：通过加强接种或剂量进行加强是给予额外剂量的免疫试剂，诸如疫苗，该免疫试剂在初始剂量后的一定时间给予从而保持由先前剂量的相同试剂所引起的免疫应答。
[0043] 癌症：本文中任何肿瘤前或肿瘤性疾病，良性的或恶性的，其中“肿瘤性”是指细胞的异常增殖。
[0044] 载体：与抗原结合以辅助诱导免疫应答的实体或化合物。
[0045] 嵌合蛋白：一种遗传改造的蛋白质，其由通过将两种或多种完全的或部分的基因或一系列(非)随机核酸拼接在一起制备的核苷酸序列编码。
[0046] 临床病症：需要医学救护的病症，本文中尤其是与IDO的表达有关的病症。所述病症的实例包括：癌症和感染。
[0047] 补体：一系列复杂的血液蛋白，其作用“补充”抗体的作用。补体破坏细菌，产生炎症，并且调节免疫反应。
[0048] CTL：细胞毒性T淋巴细胞。一种表达CD8以及T细胞受体并且因此能够对由I类分子呈递的抗原应答的T细胞亚群。
[0050] 递送载体：一种实体，凭借该实体，核苷酸序列或多肽或两者可以从至少一种介质转运至另一种介质。
[0052] 片段：用来表示核酸或多肽的非全长部分。因此，片段本身也分别是核酸或多肽。
[0053] 功能同源物：功能同源物可以是与给定基因/基因产物/蛋白质/多肽的野生型形式/序列显示至少一些序列同一性并且保留初始序列功能性的至少一个方面的任何核酸/蛋白质/多肽。本文中IDO的功能同源物具有诱导对表达IDO的细胞的免疫应答的能力。
[0054] IDO：吲哚胺2，3-双加氧酶。在SEQ ID NOs：(1，13，14，15，和16)中被标识。
[0055] 个体：通常为鸟、哺乳动物、鱼、两栖动物、或爬行动物的任何种或亚种，优选哺乳动物，最优选人类。
[0056] 感染：本文术语“感染”涉及产生免疫应答的任何类型的临床病症，并且因此包括感染、慢性感染、自身免疫性疾病和变态反应性炎症。
[0057] 分离的：与本文公开的核酸、多肽和抗体结合使用的“分离的”是指这些核酸、多肽和抗体已经被鉴定和从其天然环境(通常为细胞环境)的组分中分离和/或回收。本发明的核酸、多肽和抗体优选是分离的，并且本发明的疫苗和其他组合物优选包含分离的核酸、多肽或分离的抗体。
[0058] MHC：主要组织相容性复合物，存在两种主要亚类的MHC，I类和II类。
[0059] 核酸：传递遗传信息的核苷酸的链或序列。就本发明而言，核酸是脱氧核糖核酸(DNA)。
[0060] 核酸构建体：遗传改造的核酸。典型地包含几种元件诸如基因或其片段、启动子、增强子、终止子、polyA尾、接头、多接头、操作接头、多克隆位点(MCS)、标志物、STOP密码子、其他调控元件、内部核糖体进入位点(IRES)等等。
[0061] 操作接头：以确保核酸或多肽的生物学加工的方式将两部分核酸构建体或(嵌合)多肽结合在一起的核苷酸或氨基酸残基的序列。
[0062] 病原体：疾病的特异性致病因子，尤其是生物剂诸如病毒、细菌、朊病毒或寄生虫，它们可以使其宿主导致疾病，也称为传染剂(infectious agent)。
[0063] PBL：外周血细胞是血液的细胞组分，其由红细胞、白细胞和血小板组成，其在血液的循环池中发现并且在淋巴系统、脾脏、肝脏或骨髓内不被隔离。
[0064] PBMC：外周血单核细胞(PBMC)是具有圆形细胞核的血细胞，诸如淋巴细胞或单核细胞。这些血细胞是免疫系统对抗感染并适应入侵者的关键组分。淋巴细胞群由T细胞(CD4和CD8阳性～75％)、B细胞和NK细胞(合在一起～25％)组成。
[0065] 肽：形成序列并由酰胺键连接的多个共价连接的氨基酸残基。该术语与寡肽和多肽类似地使用。天然和/或非天然氨基酸可以通过肽键或通过非肽键连接。术语肽也包括通过化学或酶催化的反应引入的翻译后修饰，如本领域中所公知的。该术语可以指多肽的变体或片段。
[0066] 药用载体：也称为赋形剂或稳定剂，在采用的剂量和浓度下其对接触其的细胞或个体是无毒性的。通常，生理学可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理学可接受的载体的实例包括缓冲液诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖醇诸如甘露醇或山梨醇；形成盐的抗衡离子诸如钠；和/或非离子型表面活性剂诸如TWEEN.TM.、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS.TM。
[0067] 多个(种)：至少两个(种)。
[0068] 启动子：DNA链中的结合位点，RNA聚合酶结合在该位点以启动一个或多个相邻的结构基因对信使RNA的转录。
[0069] 信号肽：氨基酸的短序列，其确定蛋白质在细胞中的最终位置，也称为分选肽(sorting peptide)。
[0070] 表面活性剂：能够减少溶解其的液体的表面张力的表面活性试剂。表面活性剂是含有亲水的极性基团和疏水的且经常由脂肪链组成的非极性基团的化合物。
[0071] Treg：调节性T细胞/T淋巴细胞。
[0072] 疫苗：一种能够在动物中诱导免疫应答的物质或组合物。在本文中也称为免疫原性组合物。免疫应答是在生物体中诱发记忆的免疫应答(体液/抗体和/或细胞免疫)，导致传染剂被继发应答而非初次应答对抗，由此减少其对宿主生物体的影响。本发明的疫苗可以作为预防性和/或治疗性药物给予。该组合物可以包含下列的一种或多种：一种或多种抗原，包含与Ii可操作地连接的一种或多种抗原的核酸构建体，载体，佐剂和药用载体。
[0074] 吲哚胺2，3-双加氧酶
[0075] 吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)是催化L-色氨酸转变为N-甲酰犬尿氨酸的酶，并且因此是通过犬尿氨酸途径的色氨酸分解代谢的第一个酶和限速酶。色氨酸的分解代谢导致色氨酸的消耗，其消耗抑制T细胞应答并且促进哺乳动物妊娠、肿瘤抵抗(tumor resistance)、慢性感染、自身免疫性和变态反应性炎症中的免疫耐受性。因此，不仅癌症，而且通常感染，且尤其是慢性感染的感染，自身免疫性和特别地变态反应性炎症所有均是与本发明相关的临床病症。
[0076] IDO在人中以5种形式存在：IDO，IDOA，IDOB，IDOC和IDOLIKE(在文献中也称为IDO2)。IDO是如SEQ ID NO：1中所公开的403个氨基酸残基长的多肽，并且与SEQ ID NO：16的IDOLIKE一起是本文中优选的IDO。其他的IDO也与本发明相关，尽管关于它们知之甚少；它们在本文中被标识为IDOA：SEQ ID NO：13，IDOB：SEQ ID NO：14和IDOC：SEQ ID NO 15。IDOLIKE不如IDO那样广泛地表达，但如其亲缘体一样，也在抗原呈递树突细胞中表达，在所述树突细胞中色氨酸分解代谢驱动免疫耐受。如IDO一样，IDOLIKE使色氨酸分解代谢，触发翻译起始因子eIF2α的磷酸化，并且动员LIP的翻译，所述LIP是免疫调节转录因子NF-IL6的一种抑制性亚型(Popov&Schultze，2008)。本文中术语IDO通常指所有上述IDO和它们相应的序列。
[0077] IDO已经被鉴定为一种主要的免疫调节分子，其是几个负反馈机制的一部分，通过这些机制免疫应答处于控制之下。以此方式，IDO也在癌症中发挥关键性的免疫抑制功能。在本发明所基于的研究中，检验了是否IDO本身可以充当免疫应答的靶标，其可开发用于免疫治疗，特别是对于癌症的治疗。通过采取“反向免疫”方式，鉴定了IDO蛋白内的HLA-A2肽，在患有不相关的肿瘤类型，即，黑色素瘤、肾细胞癌和乳腺癌的患者中对其检测到自发性T细胞反应性。这些天然存在的T细胞应答容易地使用HLA/肽四聚体在体外刺激后通过流式细胞术而可见，而且也容易地在直接离体测定中可见。此外，明确地证实IDO反应性T细胞实际上是肽特异性的细胞毒性效应细胞。换句话说：IDO特异性T细胞有效地溶解不同来源(诸如黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌以及直接离体富集的AML母细胞)的IDO+癌细胞系。在来自患有不相关癌症类型的患者的PBL中针对IDO来源的肽表位的自发性CTL应答的存在以及IDO特异性T细胞杀死不同来源的癌细胞说明了IDO的免疫治疗潜力。更为独特的是下面的发现，即，IDO特异性CTL识别并杀死IDO+成熟DC；因此，IDO特异性T细胞
23，24
能够杀死免疫活性DC。近年来的报道已经证明IDO在人DC中在成熟后被上调 。而且，在拟用于在癌症患者中疫苗接种的DC中也观察到IDO表达并且此表达在s.c.(皮下)注
25
射后保持在原位 。在基于DC的治疗疫苗中IDO的表达经由吸引或诱导FoxP3(+)Treg来保持其关键性的临床相关性。
23，24
能够杀死免疫活性DC。近年来的报道已经证明IDO在人DC中在成熟后被上调 。而且，在拟用于在癌症患者中疫苗接种的DC中也观察到IDO表达并且此表达在s.c.(皮下)注
25
射后保持在原位 。在基于DC的治疗疫苗中IDO的表达经由吸引或诱导FoxP3(+)Treg来保持其关键性的临床相关性。
[0078] IDO的双重作用(抑制免疫应答的初发期和效应期两者)不是相互排斥的；实际上，有可能两者在特定的肿瘤中均起作用。IDO发挥的另一作用可能与癌症免疫治疗的结果高度相关：作为炎症诱导的抗调节机制。抗调节应答在免疫系统中是重要的，因为它们有助于限制免疫应答的强度和程度，否则免疫应答可能导致对宿主的危险的损害。然而，就抗癌免疫治疗而言，抗调节应答拮抗针对肿瘤建立强免疫应答的能力。就抗调节是仅响应于免疫激活而引发的继发事件而言，抗调节不同于耐受。IDO已知由I型和II型干扰素两种26，27
类型诱导，这些干扰素有可能在免疫激活和炎症部位被发现 。值得注意的是，在此证明了通过与IFN-γ的预温育增加了肿瘤细胞对IDO反应性T细胞导致的杀死的易感性。同
28
样地，已报道共刺激分子4-1BB(CD137)的系统性连接诱导IDO 。当然大多数抗癌免疫治疗策略不管其分子靶标为何，均针对诱导免疫激活和炎症(例如，在疫苗的部位处或肿瘤内)。事实上，在可接受的毒性范围内，达到尽可能多的免疫激活是目标；因此，抗调节不合乎需要。就此而言，在用CTLA-4阻断(即，抗CTLA-4抗体)治疗的黑色素瘤和肾细胞癌患
29
者两者中，已经报道了小肠结肠炎和肿瘤消退之间的关联性 。因此，自身免疫反应明确地
30，31
与临床功效相关 。CTLA-4阻断被认为通过抑制Treg的功能来减少对自身抗原的外周耐受性和增加T细胞激活来介导其抗肿瘤和IRAE-诱导效应。
类型诱导，这些干扰素有可能在免疫激活和炎症部位被发现 。值得注意的是，在此证明了通过与IFN-γ的预温育增加了肿瘤细胞对IDO反应性T细胞导致的杀死的易感性。同
28
样地，已报道共刺激分子4-1BB(CD137)的系统性连接诱导IDO 。当然大多数抗癌免疫治疗策略不管其分子靶标为何，均针对诱导免疫激活和炎症(例如，在疫苗的部位处或肿瘤内)。事实上，在可接受的毒性范围内，达到尽可能多的免疫激活是目标；因此，抗调节不合乎需要。就此而言，在用CTLA-4阻断(即，抗CTLA-4抗体)治疗的黑色素瘤和肾细胞癌患
29
者两者中，已经报道了小肠结肠炎和肿瘤消退之间的关联性 。因此，自身免疫反应明确地
30，31
与临床功效相关 。CTLA-4阻断被认为通过抑制Treg的功能来减少对自身抗原的外周耐受性和增加T细胞激活来介导其抗肿瘤和IRAE-诱导效应。
[0079] 由于表达IDO的细胞拮抗其他免疫治疗方法的所需效应，例如通过疫苗接种靶向表达IDO的细胞，过继T细胞转移或免疫刺激剂(所有这些均是本发明的方面)，因此与其他抗癌免疫治疗在作用上是高度协同的。在本公开中，证明了CTL限定的IDO表位可广泛地应用于治疗性疫苗接种中，并且因此具有重要的免疫治疗价值。
[0080] 因此本发明的一个方面是提供一种用作用于治疗临床病症的药物的疫苗组合物，其包含吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)或其免疫活性多肽片段。所述临床病症可以是癌症，并且本发明的另一方面是预防癌症、减少形成癌症的风险或治疗癌症。另一方面涉及本发明的疫苗组合物与其他药物诸如免疫治疗药物和/或化疗剂的联合应用。还有一个方面涉及如本文所公开的疫苗组合物在病毒和/或微生物来源的疾病的治疗中的应用，并还涉及所述疫苗与其他药物诸如免疫治疗药物和/或抗生素和/或抗病毒剂的联合应用。
[0081] 功能同源物
[0082] 序列
[0083] 野生型人IDO，即，该蛋白质的天然存在的未突变形式，在SEQ ID NO：1中鉴定。本发明涵盖包含下列的疫苗组合物：IDO；IDO的免疫活性肽片段；IDO的肽片段的组合物，其中至多两个氨基酸已经被置换；和/或IDO的功能同源物，其与SEQ ID NO：1具有至少
70％的序列同一性。术语多肽片段在本文中用来定义氨基酸残基的任何非全长(如与SEQ ID NO：1相比)链，其直接来源于如SEQID NO：1中所鉴定的IDO，或合成以与其相同，或合成以与其具有至少70％的序列同一性。
70％的序列同一性。术语多肽片段在本文中用来定义氨基酸残基的任何非全长(如与SEQ ID NO：1相比)链，其直接来源于如SEQID NO：1中所鉴定的IDO，或合成以与其相同，或合成以与其具有至少70％的序列同一性。
[0084] 功能同源物可以被定义为在序列上与野生型IDO(诸如野生型人IDO)不同但仍然能够诱导针对表达IDO的细胞(诸如癌细胞和DC)的免疫应答的IDO的全长或片段。在这些细胞中表达的IDO可以是野生型或内源性突变的(诸如在细胞分裂期间诱导的先天性突变体或突变等等)。功能同源物可以是野生型IDO的突变形式或选择性剪接形式。在另一个方面，IDO的功能同源物如本文下面所述进行定义。功能同源物可以是，但不限于，具有离体引入的一个或多个突变和/或一个或多个序列缺失和/或添加的全长或片段化IDO的重组形式。
[0085] IDO的功能同源物可以是与SEQ ID NO：1显示至少一些序列同一性并且具有诱导对表达IDO的细胞的免疫应答的能力的任何蛋白质/多肽。
[0086] 因此，在具体实施方案中，本发明的免疫原性活性肽片段由如SEQ ID NO：1中所鉴定的IDO或其功能同源物的50个氨基酸残基，例如至多45个氨基酸残基，诸如至多40个氨基酸残基，例如至多35个氨基酸残基，诸如至多30个氨基酸残基，例如至多25个氨基酸残基，诸如18-25个连续氨基酸组成；所述功能同源物为其中至多三个氨基酸，诸如两个氨基酸，诸如一个氨基酸已经被置换的功能同源物。
[0087] 因此在另一个具体实施方案中，本发明的免疫原性活性肽片段由来自SEQID NO：1的IDO或其功能同源物的至多25个氨基酸残基，诸如至多24个氨基酸残基，诸如至多23个氨基酸残基，诸如至多22个氨基酸残基，诸如至多21个氨基酸残基，诸如至多20个氨基酸残基，例如至多19个氨基酸残基，诸如至多18个氨基酸残基，例如至多17个氨基酸残基，诸如至多16个氨基酸残基，例如至多15个氨基酸残基，诸如至多14个氨基酸残基，例如至多13个氨基酸残基，诸如至多12个氨基酸残基，例如至多11个氨基酸残基，诸如8-10个连续氨基酸残基组成；所述功能同源物为其中至多三个氨基酸，诸如两个氨基酸，诸如一个氨基酸已经被置换的功能同源物。优选地，所述肽包含来自如SEQ IDNO：1中所鉴定的IDO或其功能同源物的至多10个连续氨基酸残基，诸如至多9个连续氨基酸残基，诸如8个连续氨基酸残基，诸如来自IDO的7个连续氨基酸残基；所述功能同源物为其中至多三个氨基酸，诸如两个氨基酸，诸如一个氨基酸已经被置换的功能同源物。
[0088] 因此在一些实施方案中，本发明的肽为九肽(包含9个氨基酸残基的肽)，和一些十肽(包含10个残基)，并且这些可以选自下列的非限制性群组(首先为肽名称，然后是序列、IDO序列中的位置和SEQ ID NO.)：IDO1：Q L R E R V E K L(54-62)(SEQ ID NO：2)；IDO2：F L V S L L V E I(164-172)(SEQ ID NO：3)；IDO3：T L L K A L L E I(195-203)(SEQ ID NO：4)；IDO4：F I A K H L P D L(41-49)(SEQ ID NO：5)；IDO5：A L L E I A S C L(199-207)(SEQ ID NO：6)；IDO6：V L SK G D A G L(320-328)(SEQ ID NO：7)；IDO7：D L M N F L K T V(383-391)(SEQ ID NO：8)；IDO8：V L L G I Q Q T A(275-283)(SEQ ID NO：9)；IDO9：K VL P R N I A V(101-109)(SEQ ID NO：10)；IDO10：K L N M L S I D H L(61-70)(SEQ ID NO：11)；IDO11：S L R S Y H L Q I V(341-350)(SEQ ID NO：12)。优选地，本发明的肽为IDO5：A L L E I A S C L(199-207)(SEQ ID NO：6)；IDO2：F LV S L L V E I(164-172)(SEQ ID NO：3)；和/或IDO6：V L S K G D A G L(320-328)(SEQ ID NO：
7)。最优选地，本发明的疫苗组合物包含具有IDO5：A LL E I A S C L(199-207)(SEQ ID NO：6)的至少一种肽。
7)。最优选地，本发明的疫苗组合物包含具有IDO5：A LL E I A S C L(199-207)(SEQ ID NO：6)的至少一种肽。
[0089] 本发明的其他肽包含(或更优选地由其组成)SEQ ID NO：1的IDO或与SEQID NO：1具有至少70％同一性的其功能同源物的4-120，优选8-100，更优选10-75，还更优选12-60，甚至更优选15-40，诸如18-25个连续氨基酸，在所述功能同源物中，SEQ ID NO：1的IDO的至多三个氨基酸已经被置换、删除或添加，诸如两个氨基酸已经被置换、删除或添加，或一个氨基酸已经被置换、删除或添加。
[0090] 在本发明的一个实施方案中，IDO肽包含变体肽。如本文所使用，表述“变体”是指与基础蛋白(适当地为人IDO)同源但与得到它们的基础序列不同的肽，不同之处在于该序列内的一个或多个氨基酸被置换为其他氨基酸。适当的变体将具有至多6个氨基酸置换，例如至多5个氨基酸置换，诸如至多4个氨基酸置换，例如至多3个氨基酸置换，诸如至多2个氨基酸置换，例如至多1个氨基酸置换。
[0091] 适当的变体将与SEQ ID NO：1的IDO共享至少70％的序列同一性，并且因此，变体优选与人IDO的序列具有至少75％序列同一性、例如至少80％序列同一性、诸如至少85％序列同一性、例如至少90％序列同一性、诸如至少91％序列同一性、例如至少91％序列同一性、诸如至少92％序列同一性、例如至少93％序列同一性、诸如至少94％序列同一性、例如至少95％序列同一性、诸如至少96％序列同一性、例如至少97％序列同一性、诸如至少98％序列同一性、例如99％序列同一性。
[0092] 序列同一性可以使用许多熟知的算法并应用许多不同的空位罚分来计算。序列同一性相对于全长SEQ ID NO：1来计算。任意的序列比对工具，诸如但不限于FASTA、BLAST或LALIGN，可以用于搜索同源物和计算序列同一性。此外，当适当时，任何公知的置换矩阵，诸如但不限于PAM、BLOSSUM或PSSM矩阵，可以使用搜索算法来应用。例如，PSSM(位置特异性记分矩阵(positionspecific scoring matrix))可以经PSI-BLAST程序来应用。此外，序列比对可以使用一定范围的用于空位开放和延伸的罚分来进行。例如，BLAST算法可以使用5-12的范围内的空位开放罚分，和1-2的范围内的空位延伸罚分。
[0093] 功能等同物可以进一步包含化学修饰诸如泛素化、标记(例如，使用放射性核素、各种酶等)、聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生)、或通过插入(或通过化学合成置换)氨基酸(多个氨基酸)诸如鸟氨酸(正常情况下其不存在于人蛋白中)，然而，优选功能等同物不包含化学修饰。
[0094] 与SEQ ID NO：1的IDO相比对氨基酸残基的序列作出的任何改变优选地是保守置换。本领域技术人员将知晓如何作出和评估“保守”氨基酸置换，通过该保守置换，一个氨基酸置换成另一个具有一种或多种共同的化学和/或物理特性的氨基酸。保守氨基酸置换较不可能影响蛋白质的功能性。氨基酸可以根据共同的特性进行分组。保守氨基酸置换是预定组的氨基酸内的一个氨基酸替换成相同组内的另一个氨基酸，其中预定组内的氨基酸显示相似的或基本上相似的特性。
[0095] 因此，在本发明的一个实施方案中，疫苗组合物包含由SEQ ID NO：1的IDO的8-50个氨基酸的范围内、优选8-10或20-25个氨基酸的范围内的连续序列组成的多肽，其中至多三个氨基酸已经被置换，并且优选所述置换是保守的。
[0096] MHC
[0097] 存在两种类型的MHC分子；MHC I类分子和MHC II类分子。MHC I类分子被CD8T细胞识别，该细胞是适应性免疫应答的主要效应细胞。MHC II类分子主要在抗原呈递细胞(APC)的表面上表达，其中最重要的似乎是树突细胞。APC刺激幼稚T细胞，以及免疫系统中的其他细胞。它们刺激CD8T细胞和CD4T细胞两者。
[0098] 在一个实施方案中，提供了新的MHC I类-限制性肽片段，该肽片段由来自SEQ ID NO 1的IDO或其功能同源物的8-10个氨基酸组成，其中SEQ ID NO 1的至多两个氨基酸已经被置换，其特征为具有几个特征中的至少一个，其中之一是以一定的亲和力结合对其是限制性的I类HLA分子的能力，所述亲和力如通过能够达到I类HLA分子的半数最大回收值(C50值)(其至多50μM)的肽的量来测量，如通过本文所述的装配结合测定法(assembly binding assay)来测定。此装配测定法基于在将肽负载至肽转运蛋白缺陷细胞系T2后HLA分子的稳定。随后，正确折叠的稳定HLA重链使用构象依赖性抗体免疫沉淀，并且对肽结合进行定量。此实施方案的肽包含(或更优选由其组成)SEQ ID NO 1的IDO或其中SEQ ID NO 1的至多两个氨基酸已经被置换的其功能同源物的至多200个，优选至多100个，更优选至多50个，还更优选至多25个，甚至更优选至多20个，还甚至更优选至多15个，诸如至多10个，例如8-10个范围内的连续氨基酸。
[0099] 此测定提供了筛选候选肽以上述亲和力结合特定HLA等位基因分子的能力的简单方式。在优选的实施方案中，本发明的肽片段是具有至多30μM的C50值，诸如至多20μM的C50值，包括至多10μM、至多5μM和至多2μM的C50值的肽片段。
[0100] 在另一个优选的实施方案中，提供了SEQ ID NO 1的IDO或其功能同源物的新的MHC II类-限制性肽片段，在所述功能同源物中，SEQ ID NO 1的至多两个氨基酸已经被置换，(本文中也称为“肽”)，其特征为具有本文下面所述的几个特征中的至少一个。此实施方案的肽包含(或更优选由其组成)SEQ ID NO 1的IDO或其中SEQ ID NO 1的至多两个氨基酸已经被置换的其功能同源物的4-120个，优选8-100个，更优选10-75个，还更优选12-60个，甚至更优选15-40个，诸如18-25个连续氨基酸，。
[0101] 因此，提供了SEQ ID NO 1的IDO或其功能同源物的新的具有8-10个氨基酸的MHC I类-限制性肽片段和新的具有18-25个氨基酸的MHC II类-限制性肽片段，在所述功能同源物中，SEQ ID NO 1的至多两个氨基酸已经被置换，其特征为具有本文下面所述的几个特征中的至少一个，其中之一是结合对其是限制性的I类或II类HLA分子的能力。
[0102] 在具体实施方案中，提供了肽片段，其是具有下列特征的至少一个的MHCI类限制性肽或MHC II类限制性肽：
[0103] (i)能够以如通过ELISPOT测定法测定的至少1个/104个PBL的频率在癌症患者的PBL群中诱发INF-γ产生细胞，和/或
[0104] (ii)能够在肿瘤组织中原位检测与所述表位肽反应的CTL，
[0105] (iii)能够在体外诱导IDO特异性T细胞的生长。
[0106] 根据本发明更优选的肽是能够引起如通过ELISPOT测定法(例如，本文下面实施例1中所述的ELISPOT测定法)测定的特异性T细胞应答的肽。一些肽尽管不以高亲和力结合I类或II类MHC，但可以仍然产生如通过ELISPOT测定的T细胞应答。能够以高亲和力结合MHC I类或II类的其他肽也产生如通过ELISPOT测定的T细胞应答。两种类型的肽是根据本发明优选的肽。
[0107] 因此，根据本发明优选的肽是能够产生如通过ELISPOT测定法测定的特异性T细8 7 6
胞应答的肽，其中每10 个细胞、更优选每10 个细胞、甚至更优选每10 个细胞、还更优选
5 4
每10 个细胞、诸如每10 个细胞测量50个特异性斑点。
胞应答的肽，其中每10 个细胞、更优选每10 个细胞、甚至更优选每10 个细胞、还更优选
5 4
每10 个细胞、诸如每10 个细胞测量50个特异性斑点。
[0108] 根据本发明最优选的肽是能够在患有以表达IDO为特征的临床病症的个体中引起细胞免疫应答的肽，所述临床病症优选为癌症或感染，且最优选是癌症。
[0109] 如上所述，HLA系统代表人主要组织相容性(MHC)系统。一般而言，MHC系统控制一系列特性：移植抗原，胸腺依赖性免疫应答，某些补体因子和某些疾病的诱因。更具体地，MHC编码三种不同类型的分子，即，I类、II类和III类分子，其决定MHC的更普遍的特性。在这些分子中，I类分子是所谓的HLA-A、HLA-B和HLA-C分子，它们存在于大多数有核细胞和凝血细胞的表面上。
[0110] 本发明的肽的特征为它们结合(受限于)特定的MHC I类HLA分子的能力。因此，在一个实施方案中，肽是由MHC I类HLA-A分子限制的肽，所述I类HLA-A分子包括HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A9、HLA-A10、HLA-A11、HLA-Aw19、HLA-A23(9)、HLA-A24(9)、HLA-A25(10)、HLA-A26(10)、HLA-A28、HLA-A29(w19)、HLA-A30(w19)、HLA-A31(w19)、HLA-A32(w19)、HLA-Aw33(w19)、HLA-Aw34(10)、HLA-Aw36、HLA-Aw43、HLA-Aw66(10)、HLA-Aw68(28)、HLA-A69(28)。在文献中也使用更简单的命名，其中仅使用主要数字命名，例如，HLA-A19或HLA-A24分别代替HLA-Aw19和HLA-A24(49)。在具体的实施方案中，本发明的肽受限于选自由HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11和HLA-A24组成的组的MHC I类HLA物种。在具体的实施方案中，本发明的肽受限于MHC I类HLA物种HLA-A2或HLA-A3。
[0111] 在更多的有用的实施方案中，本发明的肽是由MHC I类HLA-B分子限制的肽，所述I类HLA-B分子包括下列的任一种：HLA-B5、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B12、HLA-B13、HLA-B14、HLA-B15、HLA-B16、HLA-B17、HLA-B18、HLA-B21、HLA-Bw22、HLA-B27、HLA-B35、HLA-B37、HLA-B38、HLA-B39、HLA-B40、HLA-Bw41、HLA-Bw42、HLA-B44、HLA-B45、HLA-Bw46和HLA-Bw47。在本发明的具体实施方案中，能够结合本发明的肽的MHC I类HLA-B物种选自HLA-B7、HLA-B35、HLA-B44、HLA-B8、HLA-B15、HLA-B27和HLA-B51。
[0112] 在更多的有用的实施方案中，本发明的肽是由MHC I类HLA-C分子限制的肽，所述I类HLA-C分子包括但不限于下列的任一种：HLA-Cw1、HLA-Cw2、HLA-Cw3、HLA-Cw4、HLA-Cw5、HLA-Cw6、HLA-Cw7和HLA-Cw 1。
[0113] 在更多的有用的实施方案中，本发明的肽是由MHC II类HLA分子限制的肽，所述II类HLA分子包括但不限于下列的任一种：HLA-DPA-1、HLA-DPB-1、HLA-DQA1、HLA-DQB 1、HLA-DRA、HLA-DRB和这些组中的所有等位基因以及HLA-DM、HLA-DO。
[0114] 可以通过比对结合给定的特定HLA分子的已知序列从而揭示在肽中特定位点处的少数相关氨基酸的超优势度来选择潜在地具有结合特定HLA分子的能力的肽。这些占优势的氨基酸残基在本文中也称为“锚定残基”或“锚定残基基序”。基于在可进入的数据库中可以发现的已知序列数据，通过按照这样的相对简单的步骤，可以从IDO得到可能与具体HLA分子结合的肽。对于一定范围的HLA分子这些分析的代表性实例在下表中给出：
[0115] 表2
[0116]
[0117]
[0118] *在一个实施方案中，对于此位置没有具体锚定残基，然而在优选的实施方案中，该锚定残基为R或A。
[0119] 因此，作为实例，潜在地具有结合HLA-A3的能力的九肽具有下列序列之 一：Xaa-L-Y-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-K，Xaa-L-Y-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Y；
Xaa-L-Y-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-F或Xaa-V-Y-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-K(Xaa指任何氨基酸残基)。以类似的方式，可以设计潜在地具有结合任何其他HLA分子的能力的序列。要理解，本领域普通技术人员将能够对指定的HLA分子鉴定更多的“锚定残基基序”。
Xaa-L-Y-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-F或Xaa-V-Y-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-K(Xaa指任何氨基酸残基)。以类似的方式，可以设计潜在地具有结合任何其他HLA分子的能力的序列。要理解，本领域普通技术人员将能够对指定的HLA分子鉴定更多的“锚定残基基序”。
[0120] 本发明的肽可以具有这样的序列，即得到其的IDO的天然序列。然而，具有较高的与任何指定HLA分子的亲和力的肽可以从这样的天然序列通过下列的方法得到：例如，基于上述的步骤，通过置换、删除或添加至少一个氨基酸残基来修饰该序列，从而鉴定关于该指定的HLA分子的锚定残基基序。
[0121] 因此，在有用的实施方案中，本发明的多肽包括这样的肽，其序列包含，对于表中所列举的每一种特定HLA等位基因，如表中所指出的任一个氨基酸残基。
[0122] 因此，本发明的肽可以是上述包含来自IDO的连续序列的肽中的任一个，其中1-10个范围内的氨基酸，优选1-5个范围内的氨基酸，更优选1-3个范围内的氨基酸，甚至更优选1-2个范围内的氨基酸，还更优选1个氨基酸已经替换为另一个氨基酸，优选以这样的方式，即，使得该肽包含如在上表中指出的指定的HLA-A特定肽的一个或多个、优选所有锚定残基。
[0123] 优选的HLA物种的实例包括，限制本发明的优选肽的HLA物种，包括：选自由HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11和HLA-A24组成的组的MHCI类HLA物种，更优选该肽由HLA-A3或HLA-A2限制。备选地，优选的HLA物种包括选自由HLA-B7、HLA-B35、HLA-B44、HLA-B8、HLA-B15、HLA-B27和HLA-B51组成的组的MHC I类HLA-B物种。
[0124] 鉴定本发明的多肽的方式包括下列步骤：选择特定的HLA分子，例如，以高频率出现在指定群体中的HLA分子，如上所述进行比对分析以鉴定IDO蛋白中的“锚定残基基序”，分离或构建包含所鉴定的锚定残基中的一个或多个的适当大小的肽以及测试所得肽以如4
实施例1中所述通过ELISPOT测定法测定的至少1个/10 个PBL的频率在癌症患者的PBL群中诱发INF-γ产生细胞的能力。
实施例1中所述通过ELISPOT测定法测定的至少1个/10 个PBL的频率在癌症患者的PBL群中诱发INF-γ产生细胞的能力。
[0125] 在本发明的一个方面中，提供了长于8-10个氨基酸残基的IDO衍生肽。长于8-10个氨基酸的多肽被蛋白酶体加工成较短的长度用于结合HLA分子。因此，当施用长于8-10个氨基酸残基的多肽时，此IDO的“长”多肽/蛋白质/蛋白片段/变体在胞质溶胶中被蛋白酶体加工成一系列较小的肽。使用可以被蛋白酶体加工成许多不同的短肽的较长多肽的优点是与受特定HLA类型限制的一种8-10氨基酸肽相比，可以用一种肽靶向更多的HLA类型。
[0126] 出人意料地，本发明的肽中的一些以足够高的亲和力与MHC分子结合，使得置换变得没有必要(见图2)并且在此当它们呈递时容易作为抗原使用。优选地，本发明的疫苗组合物包含下列的一种或多种：IDO蛋白(SEQ ID NO：1)、来自其的多肽片段、来自其的变体、全长和部分长度IDO的功能同源物、IDO的连续肽和这些的功能同源物。更优选地，疫苗组合物包含本公开的序列表中列举的任一个序列。非常优选地，疫苗组合物包含肽IDO5(SEQ ID NO：6)、IDO 2(SEQID NO：3)和/或IDO6(SEQ ID NO：7)。
[0127] 本发明的肽的显著特征是其识别或诱发产生INF-γ的应答T细胞的能力，所述应答T细胞，即特异性识别患有癌症和/或感染的个体的PBL群中、APC或肿瘤/赘生性细胞(靶细胞)上的特定肽的细胞毒性T细胞(CTL)。此活性容易地通过将来自个体的PBL、APC或肿瘤细胞进行ELISPOT测定来确定。在测定前，通过将待测细胞与待测肽接触来刺激该细胞可以是有利的。优选地，该肽能够以通过如本文使用的ELISPOT测定法测定的至少14 4
个/10 个PBL的频率诱发或识别产生INF-γ的T细胞。更优选地，该频率为至少5个/10
4 4
个PBL，最优选至少10个/10 个PBL，诸如至少50或100个/10 个PBL。
个/10 个PBL的频率诱发或识别产生INF-γ的T细胞。更优选地，该频率为至少5个/10
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个PBL，最优选至少10个/10 个PBL，诸如至少50或100个/10 个PBL。
[0128] ELISPOT测定法代表了一种监测IDO肽特异性T细胞应答的强大的工具。本文的发现的主要意义是本发明的肽表达并与癌细胞和/或表达IDO的APC上的HLA分子复合。这使得这些癌细胞易于被CTL破坏，并且强调了IDO免疫对抗癌症和感染的潜在有用性。来自黑色素瘤患者的PBL中针对HLA限制性IDO衍生肽表位的自发性CTL应答的存在显示了IDO免疫原性肽的免疫治疗潜力。
[0129] 在本发明的实施方案中，本发明的肽能够在患有临床病症的个体的PBL群中诱发INF-γ产生细胞，在所述临床病症中SEQ ID NO：(1、13、14、15和/或16)的IDO或与SEQ ID NO 1具有至少70％同一性的其功能同源物被表达。临床病症优选是癌症或/和感染，并且最优选是癌症。
[0130] 来源
[0131] 如上所述，本发明的肽来源于SEQ ID NO：1、13、14、15和/或16的IDO或其片段，更优选地，该肽来源于SEQ ID NO：1和/或16的IDO；和最优选地，该肽来源于SEQ ID NO：1的IDO。可以得到该肽的蛋白质可以是来自其中表达该蛋白质的任何动物物种的任何IDO。在优选的实施方案中，起始蛋白来自哺乳动物物种，包括啮齿类动物、兔和灵长类动物诸如人。基于所选择的蛋白质的序列，本发明的肽通过蛋白质起始物质的任何适当的化学或酶处理来得到，所述处理得到如上所述的适当大小的肽，或其可以通过本领域普通技术人员熟悉的任何常规肽合成步骤来合成。最优选地，当在人中表达该蛋白质的序列时，IDO蛋白、蛋白片段、肽、变体和/或这些的任一种的功能同源物来源于IDO。
[0132] 个体
[0133] 要用本发明的疫苗组合物治疗的个体是患有临床病症的个体。所述个体优选是哺乳动物物种，并且最优选是人。个体可以是任何年龄，年轻的或年长的，并且可以是男性(雄性)或女性(雌性)。该个体患有的临床病症可以是肿瘤性疾病诸如癌症，或感染诸如微生物或病毒感染，例如HIV。
[0134] 本发明的实施方案提供了用于治疗癌症、减少形成癌症的风险、稳定癌症或预防癌症的疫苗。在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗源自感染的疾病、减少形成源自感染的疾病的风险、稳定源自感染的疾病或预防源自感染的疾病的疫苗，所述感染诸如微生物或病毒感染。
[0135] 更多的实施方案涉及一种用于治疗以表达IDO为特征的临床病症的疫苗组合物，其包含SEQ ID NO：(1、13、14、15和/或16)的IDO或与SEQ ID NO：(1、13、14、15和/或16)具有至少70％同一性的其功能同源物或包含所述IDO或所述其功能同源物的连续序列的免疫原性活性肽片段或编码所述IDO或所述肽片段的核酸；和佐剂。
[0136] 癌症
[0137] 本发明的疫苗组合物可以用来预防临床病症、减少形成临床病症的风险或治疗临床病症。优选地，临床病症与IDO的表达相关或以IDO的表达为特征。IDO可以是如SEQ ID NOs：(1、13、14、15和/或16)中任一个中所鉴定的IDO，并且可以是与这些中的任一个的野生型形式具有至少70％同一性但不必须是有功能的同源物。因此要理解，IDO的表达水平(该表达是hnRNA、mRNA、前体蛋白、完全加工的蛋白等的表达)与未患有临床病症的个体中的表达水平相同或高于后者的表达水平。在本发明的优选实施方案中，该临床病症是癌症。癌症(恶性肿瘤)是这样的一类疾病，其中一组细胞显示不受控制的生长(正常限度之外的生长和分裂)、侵袭(对邻近组织的侵入和破坏)、和有时转移(经淋巴或血液扩散至身体中的其他部位)的特性。癌症的这三种恶性性质使其与良性肿瘤相区分，良性肿瘤是自限性的，不会侵入或转移。大多数癌症形成肿瘤，但一些不会，如白血病。如本文使用的术语“癌症”意在包括任何癌症、肿瘤性疾病和肿瘤前疾病(preneoplastic disease)。
[0138] 作为可以通过施用本发明的疫苗而治疗、控制和/或预防的癌症的实例给出的癌症的非限制性群组包括：结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤(lymphangeosarcoma)、淋巴管内皮肉瘤(lymphangeoendothelia sarcoma)、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌(cystandeocarcinoma)、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆道癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质母细胞瘤、神经瘤(neuronomas)、颅咽管瘤(craniopharingiomas)、神经鞘瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤(craniopharyngioma)、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病和淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞性真性红细胞增多症、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、和重链病、急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、直肠癌、泌尿系癌症、子宫癌、口腔癌、皮肤癌、胃癌、脑肿瘤、肝癌、喉癌、食道癌、乳腺肿瘤、儿童-null急性淋巴细胞白血病(ALL)、胸腺细胞型ALL、B细胞型ALL、急性髓系白血病、粒单核细胞白血病、急性巨核细胞性白血病、伯基特淋巴瘤、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、和T细胞白血病、小和大的非小细胞肺癌(small and large non-small cell lung carcinoma)、急性粒细胞性白血病、生殖细胞肿瘤、子宫内膜癌、胃癌、头颈部癌症、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病和甲状腺癌。
[0139] 在优选的实施方案中，根据本发明的疫苗组合物能够在受试者中引起临床反应，其中该临床反应的特征可以是稳定的疾病，在优选的实施方案中，该临床反应的特征可以是部分反应或优选该临床反应的特征可以是癌症的完全缓解。优选地，癌症选自下列组成的组：黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、血液癌症(诸如白血病)、结肠癌和肾细胞癌。
[0140] 在本发明的一个方面，疫苗组合物能够在个体中引起临床反应。在一个实施方案中，临床反应的特征可以是稳定的疾病(不再恶化或进展)，在优选的实施方案中，临床反应的特征可以是部分反应或优选临床反应的特征可以是癌症或感染的完全缓解。临床反应可以如下所述确定。
[0141] 在本发明的另一个方面，疫苗组合物能够在受试者中引起临床反应，其中该临床反应的特征是最大靶病灶的最长直径的总和减小。该减小可以如下所述确定。
[0142] 可达最大每个器官5个病灶和总计10个病灶的所有可测量的病灶(代表所有受累器官)应当标识为靶病灶并且在基线时记录和测量。
[0143] ·靶病灶应当基于其尺寸(具有最长直径的病灶)和其准确地反复测量的适合性(通过成像技术或临床测量)进行选择。
[0144] ·计算所有靶病灶的最长直径(LD)的总和并且记录为基线总LD。基线总LD将用作表征目标肿瘤的参照物。
[0145] ·所有其他病变(或疾病的部位)应当被标识为非靶病灶，并且也应当在基线时记录。这些病灶的测量不是必须的，但每个病灶的存在与否应该在整个随访期间进行记录。
[0146] 靶病灶的评价
[0147] ·完全反应(CR)：所有靶病灶的消失
[0148] ·部分反应(PR)：基线总LD作为参照物，靶病灶的LD总和减小至少30％[0149] ·进行性疾病(PD)：自治疗开始起起记录的最小总LD作为参照物，靶病灶的LD总和增加至少20％，或者出现一个或多个新病灶
[0150] ·稳定的疾病(SD)：自治疗开始起的最小总LD为参照物，缩小不足以定性为PR或增加不足以定性为PD
[0151] 非靶病灶的评价
[0152] ·完全反应(CR)：所有非靶病灶消失和肿瘤标志物水平的正常化
[0153] ·不完全反应/稳定的疾病(SD)：一个或多个非靶病灶的持续存在或/和肿瘤标志物水平保持在正常限度之上
[0154] ·进行性疾病(PD)：出现一个或多个新的病灶和/或现有非靶病灶明确的进展[0155] 在本发明的一个实施方案中，包含上述蛋白质和/或多肽的任一种的疫苗组合物能够在受试者中引起临床反应，其中所述临床反应的特征是最大靶病灶的最长直径总和的减小。
[0156] 预期本发明的疫苗组合物当施用于患有表达IDO的癌症的个体中时能够引起针对表达SEQ ID NO：1的IDO或与SEQ ID NO：1具有至少70％同一性的其功能同源物的癌症的免疫应答。本发明的疫苗组合物能够在接种疫苗的个体中诱发产生具有针对癌细胞、表达IDO的APC的细胞毒性作用的效应T细胞和/或在受试者中诱导抗原特异性T细胞在肿瘤间质中的浸润。
[0157] 除了其在PBL群中引起免疫应答的能力以外，还预期本发明的肽能够原位即在实体肿瘤组织中引起溶细胞性免疫应答。这可以例如通过如下来证明：提供HLA-肽复合物，例如，其被多聚化且提供有可检测标记，并且使用这样的复合物用于免疫组织化学染色以检测肿瘤组织中与本发明的表位肽具有反应性的CTL。因此，本发明的肽的进一步的显著特征是其能够在肿瘤组织中原位检测与表位肽具有反应性的CTL。
[0158] 还预期本发明的肽，除了其结合HLA分子导致HLA和肽的复合物呈递在细胞表面上(该复合物再充当表位或溶细胞性T细胞的靶标)的能力以外，可以引起其他类型的免疫应答，诸如导致产生针对复合物的抗体的B细胞应答和/或迟发型超敏反应(DTH)。后一类型的免疫应答被定义为在本发明的肽的注射部位处的发红和可触及的硬结。
[0159] 本发明的一个目的是提供一种用于预防癌症、减少形成癌症的风险或治疗癌症的疫苗组合物，其包含SEQ ID NO：(1、13、14、15和/或16)的吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)或与SEQ ID NO：(1、13、14、15和/或16)具有至少70％同一性的其功能同源物或包含所述IDO或所述其功能同源物的连续序列的免疫原性活性肽片段或编码所述IDO或所述肽片段的核酸；和佐剂。
[0160] 癌症联合治疗
[0161] 在一些情况下，将本发明的治疗方法与另外的常规癌症治疗诸如化疗、放疗、使用免疫刺激物质的治疗、基因治疗、使用抗体的治疗和使用树突细胞的治疗联合是适当的。
[0162] 由于肿瘤细胞中IDO的表达增加导致免疫系统的抑制，因此如由本发明公开的基于IDO的免疫疗法与细胞毒性化疗和/或另一种抗癌免疫治疗性治疗的联合是治疗癌症的有效方式。这些药物在本文中也称为“第二活性成分”。
[0163] 就与本发明的疫苗组合物共同给药(相继地或同时地)而言相关的化疗剂的实例包括，但不限于：全反式维甲酸、辅酶B12、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西紫杉醇、去氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊立替康、雷利度胺、甲酰四氢叶酸、氮芥、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、来那度胺(Revlimid)、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。在一个实施方案中，用于与本发明的药剂联合的化疗剂可以本身是不同化疗剂的联合。合适的联合包括FOLFOX和IFL。FOLFOX是包括5氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸和奥沙利铂的联合。IFL治疗包括伊立替康、5-FU和甲酰四氢叶酸。
[0164] 另一第二活性成分可以是激酶抑制剂，用于在肿瘤治疗中单独、同时或联合使用。适当的激酶抑制剂包括已经显示具有抗肿瘤活性的那些(诸如吉非替尼(易瑞沙(Iressa))和厄洛替尼(特罗凯(Tarceva))并且这些可以与肽联合使用。受体酪氨酸激酶抑制剂也适合用作第二活性成分，诸如已经显示有效治疗肾细胞癌的舒尼替尼苹果酸盐(Sunitinib malate)和索拉非尼。
[0165] 第二活性成分的更多实例是免疫刺激物质，例如细胞因子和抗体。这些细胞因子可以选自下列各项组成的组，但不限于：GM-CSF、I型IFN、白介素21、白介素2、白介素12和白介素15。抗体优选是免疫刺激抗体诸如抗-CD40或抗-CTLA-4抗体。免疫刺激物质还可以是能够清除免疫抑制细胞(例如，调节性T细胞)或因子的物质，所述物质可以例如是E3泛素连接酶。E3泛素连接酶(HECT、RING和U-盒蛋白)已经作为免疫细胞功能的关键分子调节物出现，并且每一种均可能通过靶向用于蛋白水解破坏的特异性抑制分子而参与感染期间免疫应答的调节。现在还将几种HECT和RING E3蛋白与免疫自身耐受性的诱导和维持相联系：c-CbI、Cbl-b、GRAIL、Itch和Nedd4，它们各自负性地调节T细胞生长因子的产生和增殖。
[0166] 在一个实施方案中，本发明的包含IDO衍生多肽的疫苗组合物与第二活性成分诸如免疫刺激物质联合给药。免疫刺激物优选是白介素诸如IL-21或IL-2，或是化疗剂。
[0167] 感染
[0168] 如本文使用的词感染涉及产生免疫应答的任何类型的临床病症，诸如炎症，并且因此包括感染性疾病、慢性感染、自身免疫性病症和变态反应性炎症。因此，感染，诸如感染性疾病、慢性感染、自身免疫性病症和变态反应性疾病，均是与本发明相关的临床病症，并且依次地在下面进行论述。此外，术语感染和炎症在本文中可互换使用。
[0169] 炎症是血管组织对有害刺激诸如病原体、受损细胞或刺激物的复杂的生物学反应。其是生物体去除有害刺激以及启动组织的愈合过程所进行的保护性措施。炎症可以分类为急性或慢性。急性炎症是机体对有害刺激的初始反应，并且通过血浆和白细胞从血液中至受损组织中的移动增加来实现。生化事件的级联传播并形成炎性反应，涉及局部血管系统、免疫系统和受损组织内的各种细胞。延长的炎症，已知为慢性炎症，导致存在于炎症部位处的细胞类型的进行性迁移，并且其特征是组织通过炎症过程的同时破坏和愈合。在每一种情况下，IDO均由免疫系统的细胞诸如APC表达，并且因此感染和炎症是通过本发明的疫苗组合物的施用可以治疗、预防，或其形成的风险可以减小的临床病症。疫苗组合物优选地包含IDO蛋白、蛋白片段、由其衍生的多肽或肽或这些的任一种的功能同源物。
[0170] 与本发明相关的炎症相联系的疾病的实例包括，但不限于：过敏性炎症、哮喘、自身免疫性疾病、慢性炎症、慢性前列腺炎、肾小球肾炎、超敏反应、感染性疾病、炎症肠病、盆腔炎性炎症、再灌注损伤、类风湿性关节炎、移植排斥反应、和血管炎。
[0171] 慢性感染和炎症
[0172] 慢性炎症与本发明尤其相关。慢性炎症是以并发活动性炎症、组织破坏和试图修复为特征的病理状态。慢性发炎的组织的特征是单核免疫细胞(单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和浆细胞)的浸润、组织破坏和试图修复，后者包括血管发生和纤维化。
[0173] 在急性炎症中，刺激的去除使单核细胞(在适当激活时变成巨噬细胞)至发炎组织的募集停止，并且现有的巨噬细胞经淋巴管离开该组织。然而在慢性发炎的组织中，刺激是持久性的，并且因此保持了单核细胞的募集，现有的巨噬细胞被局限在原位，并且刺激巨噬细胞的增殖(尤其在动脉粥样硬化斑块中)。
[0174] 本发明的一个目的是提供一种用于预防慢性炎症、减少形成慢性炎症的风险或治疗慢性炎症的疫苗组合物，其包含SEQ ID NO：(1、13、14、15和/或16)的吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)或与SEQ ID NO：(1、13、14、15和/或16)具有至少70％同一性的其功能同源物或包含所述IDO或所述其功能同源物的连续序列的免疫原性活性肽片段或编码所述IDO或所述肽片段的核酸；和佐剂。
[0175] 感染性疾病
[0176] 本发明的疫苗组合物可以用来预防临床病症、减少形成临床病症的风险或治疗临床病症。在本发明的优选实施方案中，临床病症是感染性疾病。感染性疾病可以被任何传染剂诸如细菌、病毒、寄生虫和/或真菌促进，这些传染剂能够诱导患有感染性疾病的个体中IDO的表达增加，优选地，感染性疾病是慢性疾病或处于形成慢性疾病的风险中。如发明背景中所述，IDO的表达增加在表达IDO的生物体附近通过去除其色氨酸发挥对微生物剂的即时作用。然而，当增加的IDO表达诱导抑制Treg细胞的活性时，如果此IDO表达细胞是APC，则此方式事与愿违。因此，本发明的一个方面是提供一种用于治疗由传染剂引起的疾病、改善(减轻严重性)由传染剂引起的疾病的稳定和/或预防由传染剂引起的疾病的疫苗组合物，其包含IDO蛋白、蛋白片段、肽和/或这些的任一种的变体。
[0177] 感染性疾病可以由病毒引起，并且在针对其的治疗中可以施用本发明的疫苗组合物的病毒疾病包括，但不限于下列的病毒疾病：HIV、AIDS、AIDS相关复合症、水痘(Varicella)、普通感冒、巨细胞病毒感染、科罗拉多蜱热、登革热、埃博拉出血热、手足口病、肝炎、单纯疱疹、带状疱疹、HPV(人类乳头状瘤病毒)、流行性感冒(Flu)、拉沙热、麻疹、马尔堡出血热、感染性单核细胞增多症、流行性腮腺炎、诺沃克类病毒(Norovirus)、脊髓灰质炎、进行性多灶性脑白质病(Progressive multifocal leukencephalopathy)、狂犬病、风疹、SARS、天花(Variola)、病毒性脑炎、病毒性胃肠炎、病毒性脑膜炎、病毒性肺炎、西尼罗河病和黄热病。优选地，疫苗组合物施用于患有HIV/AIDS和可能导致癌症的病毒感染的个体。与人类癌症相关的主要病毒是人类乳头状瘤病毒、乙型肝炎和丙型肝炎病毒、EB病毒、人T淋巴病毒；因此作为这些病毒感染的治疗或作为治疗的一部分施用是本发明的一个目的。
[0178] 与本发明相关的细菌感染的实例包括，但不限于：炭疽、细菌性脑膜炎、肉毒中毒、布鲁杆菌病、弯曲菌病、猫抓病、霍乱、白喉、流行性斑疹伤寒、淋病、脓疱病、军团杆菌病、麻风(汉森病)、钩端螺旋体病、李斯特菌病、莱姆病、类鼻疽、风湿热、MRSA感染、诺卡菌病、百日咳(Whooping Cough)、鼠疫、肺炎球菌性肺炎、鹦鹉热、Q热、落基山斑疹热(RMSF)、沙门菌病、猩红热、细菌性痢疾、梅毒、破伤风、沙眼、结核、土拉菌病、伤寒、斑疹伤寒和泌尿道感染。提供治疗细菌感染和/或预防细菌感染和/或减少形成细菌感染的风险的疫苗是本发明的一个目的。
[0179] 本发明的另一个方面是提供用于治疗下列疾病和/或预防下列疾病和/或减少形成下列疾病的风险的疫苗组合物：寄生虫感染性疾病诸如，但不限于：非洲锥虫病、阿米巴病、蛔虫病、巴贝虫病、美洲锥虫病、华支睾吸虫病、隐孢子虫病、囊虫病、裂头绦虫病、龙线虫病、棘球蚴病、蛲虫病、片形吸虫病、姜片虫病、丝虫病、自由生活性阿米巴感染、贾第虫病、腭口线虫病、膜壳绦虫病、等孢子球虫病、黑热病、利什曼病、疟疾、后殖吸虫病、蝇蛆病、盘尾丝虫病、虱病、蛲虫感染、疥疮、血吸虫病、绦虫病、弓蛔虫病、弓形虫病、旋毛虫病、旋毛虫病、鞭虫病、滴虫病和锥虫病；真菌感染性疾病，诸如但不限于：曲霉菌病、芽生菌病、念珠菌病、球孢菌病、隐球菌病、组织胞浆菌病、足癣；朊病毒传染病，包括但不限于：传染性海绵状脑病、牛海绵状脑病、克雅氏病、库鲁致死性家族性失眠症，及阿尔佩斯综合征；因此作为这些寄生虫、真菌或朊病毒导致的感染的治疗或作为治疗的一部分施用是本发明的一个目的。
[0180] 感染性疾病联合治疗
[0181] 进一步提供了通过施用根据本发明的疫苗组合物对任何感染性疾病的治疗可以与另外的(第二)活性成分结合给予或与另外的治疗诸如抗生素治疗、化疗、使用免疫刺激物质的治疗，使用树突细胞的治疗、抗病毒剂、抗寄生虫剂等等联合给予。
[0182] 可以与本发明的疫苗联合用于感染性疾病的治疗中的第二活性成分的实例包括，但不限于抗生素。本文中术语抗生素是指具有抗细菌、抗真菌、抗病毒和/或抗寄生虫活性的物质；与本发明相关的实例包括，但不限于：丁胺卡那霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、链霉素、妥布霉素、厄他培南、亚胺培南、美罗培南、氯霉素、氟喹诺酮类、环丙沙星、加替沙星、吉米沙星、格帕沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、司帕沙星、曲伐沙星、糖肽、万古霉素、林可胺类、克林霉素、大环内酯类/酮内酯类、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢噻吩、头孢匹林、头孢拉定、头孢克洛、头孢孟多、头孢尼西、头孢替坦、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、氯碳头孢、头孢地尼、头孢托仑、头孢克肟、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢吡肟、单菌胺类、氨曲南、硝基咪唑类、甲硝唑、唑烷酮类、利奈唑胺、青霉素、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸盐、氨苄西林、舒巴坦、巴氨西林、羧苄西林、邻氯唑西林、双氯西林、甲氧西林、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林、替卡西林/克拉维酸盐、链阳菌素类、奎奴普丁、达福普汀、磺胺类药物/磺胺甲基异 唑、甲氧苄啶、四环素类、地美环素、多西环素、米诺环素、四环素、吡咯抗真菌药物克霉唑、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑、咪康唑、伏立康唑、两性霉素B、制霉菌素、棘球白素、卡泊芬净、米卡芬净、环吡酮、氟胞嘧啶、灰黄霉素、和特比萘芬。还相关的是抗病毒剂诸如阿糖腺苷、阿昔洛韦、丙氧鸟苷和万赛维(缬更昔洛韦)，核苷类似物逆转录酶抑制剂(NRTI)：AZT(齐多夫定)、ddI(去羟肌苷)、ddC(扎西他滨)、d4T(司他夫定)、3TC(拉米夫定)，非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)：奈韦拉平、地拉韦啶，蛋白酶抑制剂：沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、利巴韦林、金刚烷胺/金刚乙胺、瑞乐沙(Relenza)和达菲(Tamiflu)、普米可那立、干扰素。
[0183] 在一个实施方案中，本发明涉及用于与至少一种抗生素联合治疗感染性疾病的疫苗组合物，其包含IDO衍生蛋白、多肽和/或这些的功能同源物。优选地，本发明的疫苗组合物用于治疗慢性感染，例如，HIV，并且因此与上面列举的抗生素的任一种诸如抗病毒剂联合使用。
[0184] 自身免疫性疾病
[0185] 当生物体不能将其自身组成部分(下至亚分子水平)识别为自身时发生自身免疫性疾病，其导致针对其自身细胞和组织的免疫应答。由这样的异常免疫应答导致的任何疾病称为自身免疫性疾病，并且与本发明相关。其实例包括但不限于：腹部疾病(Coeliac disease)、1型糖尿病(IDDM)、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合症、多发性硬化症(MS)、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病(Graves′disease)、特发性血小板减少性紫癜、和类风湿关节炎(RA)。
[0186] 本发明的一个目的是提供一种用于预防自身免疫性疾病、减少形成自身免疫性疾病的风险或治疗自身免疫性疾病的疫苗组合物，其包含SEQ ID NO：(1、13、14、15和/或16)的吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)或与SEQ ID NO：(1、13、14、15和/或16)具有至少70％同一性的其功能同源物或包含所述IDO或所述其功能同源物的连续序列的免疫原性活性肽片段或编码所述IDO或所述肽片段的核酸；和佐剂。
[0187] 自身免疫性疾病联合治疗
[0188] 目前用于自身免疫性疾病的治疗通常是免疫抑制性的、抗炎的或姑息性的。非免疫治疗，诸如桥本甲状腺炎或1型糖尿病治疗中的激素替代的结局是自身攻击性反应。饮食控制限制乳糜泻的严重程度。甾体药物或NSAID治疗限制许多疾病的炎性症状。免疫球蛋白的静脉制剂(IVIG)用于慢性炎症性脱髓鞘多发性神经病(CIDP)和格-巴二式综合征(GBS)。更具体的免疫调节治疗，诸如TNFα拮抗剂依那西普，已经显示可用于治疗RA。这些免疫治疗与增加的不良反应风险有关，诸如易于发生感染。
[0189] 基于这些观察已经开发了蠕虫治疗，并且其包括用特殊的寄生虫肠道线虫(蠕虫)接种个体。目前有两种密切相关的治疗可用，用美洲板口线虫(俗称钩虫)或猪毛首线虫卵(Trichuris Suis Ova)(俗称猪鞭虫卵)接种。有研究证明此方式在治疗许多自身免疫性疾病方面非常有效，这些疾病包括克隆病、溃疡性结肠炎、哮喘、变态反应、多发性硬化症和慢性炎性疾病。
[0190] 在一个实施方案中，本文公开的疫苗与第二活性成分联合使用，所述第二活性成分诸如针对自身免疫性疾病的上述药物和治疗的任一种。
[0191] 变态反应性炎症
[0192] 变态反应是免疫系统的一种功能紊乱，也经常称为特异反应性(atopy)。变态反应针对已知为变应原的环境物质而发生；这些反应是获得性的、可预测的和快速的。严格来说，变态反应是超敏反应的四种形式之一，并且称为I型(或速发型)超敏反应。其特征是称为肥大细胞和嗜碱性粒细胞的某些白细胞被一种类型的抗体(已知为IgE)的过度激活，导致极度的炎性反应。常见的变态反应包括湿疹、荨麻疹、花粉症、哮喘、食物变态反应和对螫刺昆虫诸如黄蜂和蜜蜂的毒液的反应。
[0193] 变态反应性炎症是几种残疾或医学病症的重要病理学特征，包括变应性哮喘、特应性皮炎、变态反应性鼻炎和几种眼变态反应性疾病。
[0194] 本发明的一个目的是提供一种用于预防变态反应性炎症、减少形成变态反应性炎症或治疗变态反应性炎症的疫苗组合物，其包含SEQ ID NO：(1、13、14、15和/或16)的吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)或与SEQ ID NO：(1、13、14、15和/或16)具有至少70％同一性的其功能同源物或包含所述IDO或所述其功能同源物的连续序列的免疫原性活性肽片段或编码所述IDO或所述肽片段的核酸；和佐剂。
[0195] 变态反应性炎症联合治疗
[0196] 两种类型的治疗可用于治疗变态反应性炎症：药物疗法和免疫疗法。
[0197] 药物疗法，是使用拮抗药物来阻断变态反应介质的作用，或阻止细胞的激活和脱颗粒过程。这些包括抗组织胺药、可的松、地塞米松、氢化可的松、肾上腺素(adrenaline)、茶碱、色甘酸钠、抗白三烯药，如孟鲁司特(顺尔宁)或扎鲁司特(安可来)；抗胆碱能药、减充血剂、肥大细胞稳定剂，并且也通常使用认为损害嗜酸性粒细胞趋化性的其他化合物。
[0198] 免疫疗法是减敏或脱敏治疗，其中个体渐进地接种以渐进性增加的剂量的目标变应原。第二种形式的免疫疗法包括静脉注射抗-IgE单克隆抗体。第三种类型——舌下免疫疗法是口服施用的疗法，其利用了对非致病性抗原诸如食物和驻留细菌的口服免疫耐受性。
[0199] 在一个实施方案中，本文公开的疫苗与第二活性成分联合使用，所述第二活性成分诸如针对变态反应性炎症的上述药物和治疗的任一种。
[0200] 药物组合物
[0201] 本发明涉及能够在个体中治疗与IDO表达相关的临床病症、减少形成该临床病症的风险和/或预防该临床病症的药物组合物；换句话说，术语疫苗和药物组合物在本文中可互换使用。本发明的疫苗/药物组合物可以是“传统的”疫苗组合物，其包含抗原诸如蛋白多肽和/或核酸分子。它们还可以是包含细胞的组合物形式，所述细胞诸如源自该个体和以后加工的修饰细胞，或包含复合物分子诸如抗体或TCR的组合物。
[0202] 通常，疫苗是能够在个体中诱导免疫应答的物质或组合物。该组合物可以包含下列的一种或多种：“活性组分”诸如一种或多种抗原(例如，蛋白质、多肽、肽、核酸等)，除了其他元件还包含一种或多种抗原的核酸构建体，细胞(例如，负载的APC，用于过继转移(adoptive transder aso.)的T细胞)，复合物分子(抗体、TCR和MHC复合物等等)，载体，佐剂，和药物载体。下面，更详细地公开根据本发明的疫苗组合物的各个组分。
[0203] 本发明的疫苗组合物当施用于患有癌症和/或感染(导致IDO的表达)的个体时能够引起针对表达SEQ ID NO：1的IDO或与SEQ ID NO 1具有至少70％同一性的其功能同源物的癌症、DC或APC的免疫应答。在优选的实施方案中，该临床病症是癌症。本发明的疫苗组合物能够在接种疫苗的个体中诱发产生具有针对表达IDO的癌细胞、APC和DC的细胞毒性作用的效应T细胞和/或在受试者中诱导抗原特异性T细胞在肿瘤基质中的浸润。
[0204] 抗原和其他活性组分
[0205] 基于蛋白/多肽的疫苗组合物
[0206] 本发明的肽以出人意料高的亲和力结合(参见图2)，并且在此当它们呈递时容易用作抗原。优选地，本发明的疫苗组合物包含下列中的一种或多种：IDO蛋白(SEQ ID NO：1)，来自其的多肽片段，来自其的变体，全长和部分长度IDO的功能同源物，IDO的连续肽和这些的功能同源物。更优选地，疫苗组合物包含本公开的序列表中列举的任一个序列。非常优选地，疫苗组合物包含肽IDO5(SEQ ID NO：6)、IDO2(SEQ ID NO：3)和/或IDO6(SEQ ID NO：7)。
[0207] 本发明的疫苗组合物中抗原的选择将取决于可由本领域技术人员确定的参数。如已经提到的那样，本发明的不同肽的每一种均通过特定HLA分子呈递在细胞表面上。如此，如果待治疗的受试者关于HLA表型进行分类，则选择已知结合该特定HLA分子的一种或多种肽。备选地，基于指定群体中各种HLA表型的优势度来选择目的抗原。作为实例，HLA-A2是高加索人(Caucasian population)中最占优势的表型，并且因此，含有结合HLA-A2的肽的组合物将在大部分该群体中是有效的。此外，本发明的抗原/肽可以根据表2中给出的锚定残基基序进行修饰以增强与特定HLA分子的结合。
[0208] 本发明的组合物还可以含有两种或多种IDO衍生肽的组合，每种肽与不同的HLA分子特异性地相互作用以便覆盖靶群体的大部分。因此，作为实例，药物组合物可以含有受HLA-A分子限制的肽和受HLA-B分子限制的肽的组合，例如包括与靶群体中HLA表型的优势度相对应的那些HLA-A和HLA-B分子，诸如，例如HLA-A2和HLA-B35。另外，该组合物可以包含由HLA-C分子限制的肽。
[0209] 在基于肽的疫苗的情况下，表位可以以“MHC-备用(MHC-ready)”的形式施用，其能够通过独立于抗原摄取的外源性负载和被宿主抗原呈递细胞加工来进行呈递。本发明的肽包含处于短的“MHC-备用”形式和需要被蛋白酶体加工的较长形式的两种肽，从而提供更为复杂的疫苗组合物，其可以靶向多种肿瘤抗原。疫苗靶向的不同HLA群越多，则疫苗在不同的群体中起作用的可能性越高。
[0210] 本发明在优选的实施方案中涉及一种用作药物的疫苗组合物，其包含SEQID NO：1的吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)或与SEQ ID NO：1具有至少70％同一性的其功能同源物或包含所述IDO或所述其功能同源物的连续序列的免疫原性活性肽片段或编码所述IDO或所述肽片段的核酸；以及佐剂。该疫苗组合物可以在个体中施用以治疗临床病症、预防临床病症或减少与临床病症相关的风险。
[0211] 多表位疫苗组合物
[0212] 本发明还涉及高免疫原性多表位疫苗。优选地，这样的疫苗应该被设计成促进最适合的IDO衍生肽的同时递送，任选地结合以其他合适的肽和/或佐剂，如下面所述。本发明包括这样的多表位疫苗，其包含IDO衍生肽，任选地结合以另外的不属于或不来自IDO的蛋白质或肽片段和/或佐剂，如下面所述。驱使开发具有更复杂的组成的疫苗的重要因素是靶向多种肿瘤抗原的愿望，例如通过设计包含或编码精心选择的CTL和Th细胞表位的集合的疫苗。因此本发明在一个方面涉及包含I类和II类限制的IDO表位的疫苗组合物。
[0213] 本发明的肽因此包含处于短的“MHC-备用”形式(I类限制性)和需要被蛋白酶体加工的较长形式(II类限制性)的两种肽。因此，根据本发明的组合物可以作为如上所定义的包含I类限制的表位和/或II类限制的表位的多表位疫苗提供。
[0214] 基于核酸的疫苗组合物
[0215] 根据本发明的疫苗组合物可以包含编码属于IDO的蛋白质或其免疫学活性肽片段的核酸。所述核酸因此可以编码上面提及的蛋白质和肽片段的任一种。核酸可以是例如DNA、RNA、LNA、HNA、PNA，优选核酸是DNA或RNA。
[0216] 本发明的核酸可以包含在任何适当的载体中，诸如表达载体。大量载体可以利用，并且技术人员将能够为具体的目的选择有用的载体。载体可以是，例如，质粒、粘粒、病毒颗粒或人工染色体的形式。适当的核酸序列可以通过多种方法插入至载体中，例如，DNA可以使用本领域中熟知的技术插入至适当的一个或多个限制性内切酶核酸位点中。除根据本发明的核酸序列以外，载体可以另外包含信号序列、复制起始点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列中的一个或多个。载体还可以包含其他的序列，诸如增强子、多聚腺苷酸尾、接头、多接头、操作接头、多克隆位点(MCS)、STOP密码子、内部核糖体进入位点(IRES)和用于整合的宿主同源序列或其他确定的元件。用于改造核酸构建体的方法是本领域中熟知的(参见，例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室指南)，Sambrook等，编辑，Cold Spring Harbor Laboratory，第2版，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。载体优选地是表达载体，包含与调节性核酸序列可操作连接的核酸，该调节性核酸序列引导其在适当细胞中的表达。所述调节性核酸序列通常应当能够引导在哺乳动物细胞，优选人细胞，更优选抗原呈递细胞中的表达，这包括在本发明的范围内。
[0217] 在一个优选实施方案中，载体是病毒载体。该载体还可以是细菌载体，诸如减毒细菌载体。减毒细菌载体可以用来在感染部位处诱导持久的粘膜免疫应答并使其持续存在。不同的重组细菌可以用作载体，例如，细菌载体可以选自由沙门菌属、乳球菌属和李斯特菌属组成的组。通常，可以显示对异种抗原HPV16L1或E7的免疫性的诱导，在小鼠中具有强的CTL诱导和肿瘤消退。载体可以另外包含编码T细胞刺激多肽的核酸。
[0218] 负载的APC
[0219] 在有用的实施方案中，通过将MHC I类或II类分子负载在来自个体的抗原呈递细胞(APC)上，通过从该个体分离PBL并将所述细胞与本发明的肽温育，然后将该细胞注射回该个体，或通过从该个体分离前体APC并且使用细胞因子和抗原将该细胞分化为专职APC，然后将该细胞注射回该个体，从而通过施用本发明的肽引发针对癌症疾病的免疫原性应答。
[0220] 因此本发明的一个方面是提供这样的疫苗组合物，其包含IDO或其免疫学活性肽片段或编码所述蛋白或所述免疫学活性肽片段的核酸。抗原呈递细胞可以是能够将抗原呈递至T细胞的任何细胞。优选的抗原呈递细胞是树突细胞。树突细胞(DC)可以根据任何适当的试验方案，例如如下所述的试验方案，在治疗方法中制备和使用。本领域技术人员将理解，该试验方案可以被改动以供具有不同HLA类型和患有不同疾病的个体使用。
[0221] 树突细胞(DC)可以用50μg/ml HLA-限制性肽(以GMP质量合成)在37℃下脉冲6
(pulse)1h，肽和5×10 细胞在第1天和第14天皮下施用，接下来每4周施用，在5次接种后进行另外的白细胞去除术。用于临床应用的DC的生成和质量控制可以基本上如Nicolette等(2007)中所述进行。
(pulse)1h，肽和5×10 细胞在第1天和第14天皮下施用，接下来每4周施用，在5次接种后进行另外的白细胞去除术。用于临床应用的DC的生成和质量控制可以基本上如Nicolette等(2007)中所述进行。
[0222] 因此，在本发明的一个实施方案中，治疗患有以IDO的表达为特征的临床病症的个体的方法，优选地其中所述临床病症是癌症或感染，该方法是其中通过在离体条件下将肽呈递给该个体的抗原呈递细胞(APC)，然后将由此处理的APC注射回该个体中来施用该肽的方法。存在进行该方法的至少两种备选方式。一种备选方式是从个体分离APC，并将MHC I类分子与该肽温育(负载)。负载MHC I类分子是指将APC与肽温育使得带有对该肽特异的MHC I类分子的APC将结合该肽并且因此能够将其呈递给T细胞。随后，将APC再注射至个体中。另一备选方式依赖于近年来在树突细胞生物学领域中作出的发现。在此情况下，单核细胞(为树突细胞前体)从个体中分离，并且通过使用细胞因子和抗原在体外分化成为专职APC(或树突细胞)。接着，体外生成的DC用该肽脉冲并注射至该个体中。
[0223] 过继免疫疗法/过继转移
[0224] 本发明的一个重要方面涉及体外培养IDO特异性T细胞和将它们过继转移至个体。过继转移是指医生将已经能够产生特异性免疫应答的免疫系统的实际组分直接转移至个体。
[0225] 本发明的一个目的是提供IDO特异性T细胞，其可以用于，例如过继转移。包含能够特异性结合IDO肽/MHC I类或IDO肽/MHC II类复合物的T细胞受体的分离T细胞可以被过继转移给个体，所述T细胞优选地是已经在体外扩增的T细胞，其中所述IDO肽可以是本文上面提到的IDO肽的任一种。体外扩增T细胞的方法对于普通技术人员是熟知的。本发明还涉及治疗方法，该方法包括将包含能够特异性结合MHC限制性IDO肽复合物的T细胞受体的T细胞施用于个体诸如患有癌症疾病的人，其中所述IDO衍生肽可以是上述IDO肽的任一种。此外本发明涉及包含能够特异性结合IDO或其肽片段的T细胞受体的T细胞在制备用于治疗癌症或感染的药物中的应用。自体T细胞转移可以基本上如Walter等，(1995)所述进行。
[0226] TCR转移
[0227] 还在另一个实施方案中，这样的T细胞可以在过继转移之前被照射以控制在个体中的增殖。能够通过TCR基因转移遗传改造T细胞的特异性(Engels等，2007)。这能够将带有IDO肽特异性的T细胞转移至个体中。通常，T细胞在过继免疫疗法中的应用是有吸引力的，因为其允许在无肿瘤或无病毒的环境中扩增T细胞，并且在输注之前分析T细胞功能。TCR基因修饰的T细胞(诸如用引导异源TCR表达的表达构建体转化的T细胞)在过继转移中的应用与T细胞系的转移相比具有几个优点：(i)重导向T细胞的生成通常是可应用的。(ii)可以选择或建立高亲和力或极高亲和力的TCR，并且将其用来改造T细胞。(iii)使用密码子优化或鼠源化(murinized)TCR可以生成高亲和力T细胞，允许所稳定的TCR的更佳表面表达。通过T细胞受体(TCR)基因转移遗传改造T细胞特异性可以基本上如Morgan等，(2006)所述进行。
[0228] TCR转染
[0229] 具有已知抗肿瘤反应性的TCR可以被遗传地引入至原代人T淋巴细胞中。编码来自肿瘤特异性CTL克隆的TCRα和β链的基因可以转染至原代T细胞中并且以此方式重新编程T细胞的针对肿瘤抗原的特异性。TCR RNA通过电穿孔转染至PBL中(Schaft等，2006)。备选地，T细胞可以使用逆转录病毒载体通过TCR基因转移提供以新的特异性(Morgan等，2006)。然而，来自逆转录病毒载体的原病毒可能随机地整合在转染细胞的基因组中并随后干扰细胞生长。用编码TCR的RNA电穿孔T细胞克服了此缺点，因为RNA仅暂时地存在于转染细胞中，并且不能整合进基因组中(Schaft等，2006)。此外，细胞的转染在实验室中被常规地使用。
[0230] 佐剂和载体
[0231] 根据本发明的疫苗组合物优选地包含佐剂和/或载体。可用的佐剂和载体的实例在下面给出。因此IDO蛋白、多肽片段、由其得到的变体或肽可以与佐剂和/或载体结合在本发明的组合物中。
[0232] 佐剂是其在疫苗组合物中的混合增加或以其他的方式改变对IDO或其肽片段的免疫应答的任何物质，进一步参见下面。载体是支架结构，例如多肽或多糖，其能够与IDO或其肽片段结合并且其有助于尤其是本发明的肽的呈递。
[0233] 本发明的许多肽是相对小的分子，并且因此其可能需要将肽与多种物质诸如佐剂和/或载体结合在如本文所述的组合物中以产生疫苗、免疫原性组合物等。佐剂，从广义上定义，是促进免疫应答的物质。佐剂的综合性讨论提供在Goding，Monoclonal Antibodies：Principles&Practice(单克隆抗体：原理和实践)(第2版，1986)的第61-63页中。Goding注意到，当目的抗原具有低分子量时，或免疫原性差时，推荐与免疫原性载体结合。这样的载体分子的实例包括钥孔戚血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白和家禽免疫球蛋白(fowl immunoglobulin)。已经提出多种皂苷提取物也可用作免疫原性组合物中的佐剂。已经提出使用一种熟知的细胞因子——粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)作为佐剂(WO97/28816)。
[0234] 载体可以独立于佐剂而存在。载体的功能可以为例如增加特别是肽片段的分子量从而增加其活性或免疫原性、赋予稳定性、增加生物学活性或增加血清半衰期。此外，载体可以辅助IDO蛋白、多肽、其变体或肽片段至T细胞的呈递。载体可以是本领域技术人员熟知的任何适当的载体，例如，蛋白质或抗原呈递细胞。载体蛋白可以是，但不限于，钥孔戚血蓝蛋白、血清蛋白诸如转铁蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、甲状腺球蛋白或卵清蛋白、免疫球蛋白，或激素，诸如胰岛素或棕榈酸。对于人的免疫，载体必须是人可接受的生理学可接受的载体并且是安全的。然而，在本发明的一个实施方案中，破伤风类毒素和/或白喉类毒素是合适的载体。备选地，载体可以是葡聚糖例如琼脂糖(sepharose)。
[0235] 因此，本发明的一个方面是存在于组合物中的IDO蛋白、多肽片段、由其得到的变体或肽与载体诸如例如上面的蛋白，或抗原呈递细胞诸如例如树突细胞(DC)结合。
[0236] 佐剂可以例如选自下列各项组成的组：AlK(SO4)2、AlNa(SO4)2、AlNH4(SO4)、二氧化硅、明矾、Al(OH)3、Ca3(PO4)2、高岭土、碳、氢氧化铝、胞壁酰二肽、N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-DMP)、N-乙酰-nornuramyl-L-丙氨酰-D-异谷酰胺(CGP 11687，也称为nor-MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1′2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)乙胺(CGP 19835A，也被称为MTP-PE)、在2％角鲨烯/Tween-80.RTM乳液中的RIBI(MPL+TDM+CWS)；脂多糖及其各种衍生物，包括脂质A、弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂、默克佐剂65(Merck Adiuvant 65)、多核苷酸(例如，poly IC和poly AU酸)；来自结核分枝杆菌的蜡D；在短小棒状杆菌、百日咳博德特菌和布鲁氏菌属(genus Brucella)的成员中发现的物质；Titermax、ISCOMS、Quil A、ALUN(见US58767和5,554,372)、脂质A衍生物、霍乱毒素衍生物、HSP衍生物、LPS衍生物、合成肽基质或GMDP、白介素1、白介素2、Montanide ISA-51和QS-21。用于本发明的优选佐剂包括基于油/表面活性剂的佐剂诸如Montanide佐剂(获自Seppic，Belgium)，优选Montanide ISA-51。其他优选的佐剂是基于细菌DNA的佐剂，诸如包括CpG寡核苷酸序列的佐剂。其他优选的佐剂还有基于病毒dsRNA的佐剂，诸如poly I:C。咪唑并喹啉(imidazochinilines)也是优选佐剂的另一实例。最优选的佐剂是适合于人使用的佐剂。
[0237] Montanide佐剂(全部获自Seppic，Belgium)可以选自下列各项组成的组：Montanide ISA-51、Montanide ISA-50、Montanide ISA-70、Montanide ISA-206、Montanide ISA-25、Montanide ISA-720、Montanide ISA-708、Montanide ISA-763A、Montanide ISA-207、Montanide ISA-264、Montanide ISA-27、Montanide ISA-35、Montanide ISA
51F、Montanide ISA 016D和Montanide IMS，优选选自由Montanide ISA-51、Montanide IMS和Montanide ISA-720组成的组，更优选选自由Montanide ISA-51组成的组。
Montanide ISA-51(Seppic，Inc.)是基于油/表面活性剂的佐剂，其中不同的表面活性剂与不可代谢的矿物油、可代谢的油或两者的混合物组合。它们与包含IDO或其肽片段的水溶液制备，用作乳液。表面活性剂是二缩甘露醇油酸酯。QS-21(Antigenics；Aquila Biopharmaceuticals，Framingham，MA)是高度纯化的水溶性皂苷，其作为水溶液进行操作。
QS-21和Montanide ISA-51佐剂可以在无菌的一次性小瓶中提供。
51F、Montanide ISA 016D和Montanide IMS，优选选自由Montanide ISA-51、Montanide IMS和Montanide ISA-720组成的组，更优选选自由Montanide ISA-51组成的组。
Montanide ISA-51(Seppic，Inc.)是基于油/表面活性剂的佐剂，其中不同的表面活性剂与不可代谢的矿物油、可代谢的油或两者的混合物组合。它们与包含IDO或其肽片段的水溶液制备，用作乳液。表面活性剂是二缩甘露醇油酸酯。QS-21(Antigenics；Aquila Biopharmaceuticals，Framingham，MA)是高度纯化的水溶性皂苷，其作为水溶液进行操作。
QS-21和Montanide ISA-51佐剂可以在无菌的一次性小瓶中提供。
[0238] 熟知的细胞因子GM-CSF是本发明的另一优选佐剂。GM-CSF作为佐剂已经使用了十年，并且可以优选是如WO 97/28816中所述的GM-CSF。
[0239] 能够根据本发明使用的佐剂的所需功能性列举在下表中。
[0240] 表2：佐剂作用方式
[0241]
[0242] 来源：Cox，J.C.，和Coulter，A.R.(1997).Vaccine 15，248-56.
[0243] 根据本发明的疫苗组合物可以包含一种以上的佐剂。此外，本发明包括一种治疗性组合物，其还包含包括上述的任一种或其组合的任何佐剂物质和/或载体。还预期IDO蛋白、其变体或肽片段和佐剂可以以任何适当的顺序分开施用。优选，本发明的疫苗组合物包含Montanide佐剂诸如Montanide ISA 51或Montanide ISA 720或GM-CSF佐剂。
[0244] 因此，本发明包括一种治疗性组合物，其还包含包括上述的任一种或其组合的佐剂物质。还预期抗原(即，本发明的肽)和佐剂可以同时或以任何适当的顺序分开施用。
[0245] 剂量和给药
[0246] 在药物组合物中本发明的免疫原性肽的量可以根据特殊的应用而变化。然而，肽组合物的单剂量优选为约10μg-约5000μg，更优选约50μg-约2500μg诸如约100μg-约1000μg中的任一值。给药方式包括皮内、皮下和静脉内给药，以延时释放制剂的形式的植入等。在本文中包括本领域中已知的任何和所有给药形式。还包括本领域中已知适合于配制可注射免疫原性肽组合物的任何和所有常规剂型，诸如冻干形式和溶液、悬液或乳液形式，如果需要，含有常规的药学可接受的载体、稀释剂、防腐剂、佐剂、缓冲剂组分等。
[0247] 药物组合物可以使用本领域技术人员已知的任何常规试验方法制备和施用。在实施例3-5中，给出了根据本发明的疫苗组合物的制备的非限制性实例以及这样的疫苗给药的非限制性实例。本领域技术人员将理解，该试验方法可以容易地改变以适合于本文所述的任一种疫苗组合物。在本发明的更多实施方案中，本发明的药物组合物可用于治疗患有以IDO的表达为特征的临床病症(诸如癌症和感染)的个体。
[0248] 本发明的组合物的免疫保护作用可以使用本领域技术人员已知的几种方法来确定。成功的免疫应答也可以通过免疫后DTH反应的发生和/或检测特异性识别该疫苗组合物的一种或多种肽的抗体来确定。
[0249] 根据本发明的疫苗组合物可以以治疗有效量施用于个体。有效量可以根据多种因素而变化，这些因素诸如个体的状况、体重、性别和年龄。其他因素包括给药方式。
[0250] 药物组合物可以通过多种途径提供给个体，诸如皮下、局部、经口和肌内。药物组合物的给药经口服或胃肠外实现。胃肠外递送的方法包括局部、动脉内(直接至组织)、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内、或鼻内给药。本发明还具有这样的目的：提供合适的局部、口服、全身和胃肠外药物制剂用于使用疫苗组合物的预防和治疗的方法中。
[0251] 例如，疫苗组合物可以以诸如片剂、胶囊(各包括延时释放和持续释放制剂)、丸剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、酊剂、溶液、悬液、糖浆剂和乳液的口服剂型，或通过注射施用。同样地，它们也可以以静脉内形式(推注和输注两种)、腹膜内形式、皮下形式、带有和不带有吸留(occlusion)的局部形式、或肌内形式施用，所有均使用制药领域中普通技术人员熟知的形式。有效但无毒性的量的包含任一种本文所述的化合物的疫苗可以用作预防剂或治疗剂。还包括本领域中已知适合于配制可注射免疫原性肽组合物的任何和所有常规剂型，诸如冻干形式和溶液、悬液或乳液形式，如果需要，含有常规的药学可接受的载体、稀释剂、防腐剂、佐剂、缓冲剂组分等。
[0252] 根据本发明的疫苗组合物的优选给药方式包括，但不限于全身给药，诸如诸如静脉内或皮下给药、皮内给药、肌内给药、鼻内给药、口服给药、直肠给药、阴道给药、肺给药和通常任何形式的粘膜给药。此外，包括在本发明的范围内的是，用于本文中提及的任一种给药形式的方式包括在本发明中。
[0253] 根据本发明的疫苗可以施用一次，或任何次数诸如两次、三次、四次或五次。施用疫苗一次以上具有加强所得的免疫应答的作用。通过将疫苗以不同于前次给药的形式或身体部位给药，疫苗可以进一步被加强。加强接种是同源的或异源的加强接种。同源加强接种是第一次和接下来的疫苗接种包含相同的构建体，并且更具体地包含相同的递送载体，尤其是相同的病毒载体。异源加强接种是在不同的病毒载体中包含相同的构建体。
[0254] 第二活性成分
[0255] 本发明的一个方面是，本文提供的疫苗组合物与第二活性组分联合使用。疫苗组合物和第二活性成分的给药可以是相继的或联合的。上面对于癌症和感染两者给出了第二活性成分的实例。还有一个方面是，疫苗组合物可以与与待治疗的指定临床病症相关的其他治疗联合使用。这些治疗可以包括手术、化疗或基因治疗、免疫刺激物质或抗体；本领域技术人员能够对于指定的情况确定适当的联合治疗。
[0256] 在一些情况下，将本发明的治疗方法与更多的医学治疗方法诸如化疗、放疗、使用免疫刺激物质的治疗、基因治疗、使用抗体和/或抗生素的治疗和使用树突细胞的治疗组合将是合适的。
[0257] 诊断和预后工具
[0258] 本发明的肽对开发可广泛使用的关于癌症疾病和感染的诊断和预后方法提供了基础。因此，在其他有用的实施方案中，本发明的组合物是用于离体或原位诊断在个体中表达IDO的细胞的存在的组合物。该诊断方法基于对PBL中或肿瘤组织中IDO反应性T细胞的检测。
[0259] 因此，提供了一种用于离体或原位诊断个体中在PBL中或肿瘤组织中IDO反应性T细胞的存在的诊断试剂盒，该试剂盒包含本发明的一种或多种肽，并且提供了一种检测个体中这种反应性T细胞的存在的方法，该方法包括将肿瘤组织或血样与本发明的肽与I类或II类HLA分子或此类分子的片段的复合物接触并且检测所述复合物与所述组织或所述血细胞的结合。在一个方面，本发明提供了本发明的肽和I类或II类HLA分子或此类分子的片段的复合物，其可用作诸如本文所述的诊断试剂。这样的复合物可以是单体或多聚体。
[0260] 另一有用的诊断或预后方法基于在异种动物物种中生成抗体，例如，针对本发明的人IDO衍生肽的鼠抗体，然后其可以用来，例如，诊断呈递该肽的癌细胞的存在。对于这样的免疫目的，肽的量可以小于在体内治疗期间使用的量，诸如上面提及的那些量。通常，优选的剂量可以为约1μg-约750μg范围内的肽。也可能基于使用本发明的肽免疫产生单克隆抗体。因此，本发明还涉及能够特异性结合本发明的肽的分子，特别是单克隆或多克隆抗体，包括其片段，和涉及能够阻断这样的结合的分子，例如，针对本发明的肽的单克隆或多克隆抗体所产生的抗体。本发明还涉及能够特异性结合本发明的肽或蛋白质的分离的T细胞受体以及其分离的编码核酸。这样的T细胞受体可以例如使用普通技术人员熟知的标准技术克隆自蛋白质或肽特异性T细胞。
[0261] 在一个方面，本发明还涉及包含能够特异性结合本文所述的IDO和/或其肽片段的T细胞受体的分离的T细胞。分离的T细胞可以是CD8T细胞或CD4T细胞。分离的T细胞优选是已经在体外扩增的T细胞。体外扩增T细胞的方法是普通技术人员熟知的。这样的T细胞可以特别地用于通过过继转移或自体细胞转移治疗癌症。因此，本发明还涉及包含T细胞的药物组合物以及治疗方法，该方法包括将包含能够特异性结合IDO或其肽片段的T细胞受体的T细胞施用于需要其的个体诸如患有癌症和/或感染的个体。自体细胞转移可以基本上如Walter等，(1995)中所述进行。
[0262] 本发明提供了用于治疗、预防、减轻或治愈以IDO的表达为特征的临床病症诸如癌症和感染(优选癌症)的方式，该方式包括向患有该疾病的个体施用有效量的如本文所定义的组合物、能够特异性结合肽片段的分子(可以例如是本文所述的抗体或T细胞受体或多组分试剂盒)。因此，本发明的另一个方面是提供一种治疗与SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：16的IDO的表达相关的临床病症的方法。
[0263] 监测免疫接种作用
[0264] 在优选的实施方案中，本发明的药物组合物是疫苗组合物。因此令人感兴趣的和本发明的一个方面是在施用本发明的疫苗组合物的个体中监测免疫接种作用。因此，药物组合物可以是能够引起对癌症和/或感染的免疫应答的免疫原性组合物或疫苗。如本文所使用，表述“免疫原性组合物或疫苗”是指引起针对表达IDO的细胞诸如癌细胞、APC或DC的至少一种类型的免疫应答的组合物。因此，这样的免疫应答可以是下列的任一种：CTL应答，其中生成能够识别在细胞表面上呈递的HLA/肽复合物、从而引起细胞溶解的CTL，即，疫苗引起接种的受试者中产生对癌细胞具有细胞毒性作用的效应T细胞；引起抗癌症抗体产生的B细胞应答；和/或DTH型免疫应答。本发明的一个目的是通过监测将本发明的组合物施用于个体后的上述任一种反应来监测所述个体的免疫。
[0265] 在一个方面，本发明涉及监测免疫接种作用的方法，所述方法包括以下步骤：
[0266] i)提供来自个体的血样，
[0267] ii)提供IDO或其片段，其中所述蛋白质或肽可以是本文所述的任一种蛋白质或肽，
[0268] iii)确定所述血样是否包含与所述蛋白质或肽特异性结合的抗体或含有与所述蛋白质或肽特异性结合的T细胞受体的T细胞，和
[0269] iv)从而确定在所述个体中是否已经产生了针对所述蛋白质或肽的免疫应答。
[0270] 该个体优选是人，例如，已经用IDO或其肽片段或编码所述蛋白质或肽的核酸免疫的人。
[0271] 多组分试剂盒(Kit of Parts)
[0272] 本发明还涉及一种多组分试剂盒，其包含
[0273] ·本文所述的任一种疫苗组合物，和/或
[0274] ·IDO蛋白或其变体，和/或
[0277] 本发明还涉及一种多组分试剂盒，其包含
[0278] ·本文所述的任一种疫苗组合物，和/或
[0279] ·IDO蛋白或其变体，和/或
[0280] ·如本文所述的IDO的多肽片段、其变体和/或由其得到的肽的任一种，和/或[0281] ·任一种编码上述两个项目符号的蛋白质的核酸和第二活性成分。
[0282] 优选地，与待治疗的临床病症相联系地选择第二活性成分，使得在治疗癌症的情况下，第二活性成分在例如上面列举的化疗剂中选择。同样地，如果治疗微生物/病毒感染，第二活性成分优选地是抗生素和/或抗病毒剂。
[0283] 多组分试剂盒的组分优选地包含在独立的组合物中，然而，多组分试剂盒的所有组分均包含在同一组合物中，这也包括在本发明的范围内的。因此多组分试剂盒的组分可以同时或以任何次序相继给药。
[0284] 附图详述
[0285] 图1：如通过IFN-γELISPOT测量的针对IDO的HLA-A2-限制性T细胞应答。分析来自13名健康个体、4名乳腺癌患者、6名黑色素瘤患者和10名肾细胞癌患者的PBL。所有个体均为HLA-A2阳性。检验肽IDO2(FLVSLLVEI)(a)，IDO6(VLSKGDGL)(b)，和
5
IDO5(ALLEIASCL)(c)。T淋巴细胞用肽刺激一次，然后一式两份地以4×10 细胞/孔接种，含有或不含有相关肽。使用ImmunoSpotSeries 2.0分析仪(CTL分析仪)对每名患者计算肽特异性斑点的平均数目(在减去无加入肽的斑点后)(d)通过IFN-γELISPOT测量的PBMC中IDO5特异性细胞的数目与通过细胞内IDO染色测量的PBMC中的IDO表达相关联。患者分成两个组：IDO-PBMC或IDO+PBMC。细胞内IDO表达通过比较MFIIDO和MFI同型(MFIIsotype)对照的单尾双样本t-检验来给出，其中MFI是平均荧光强度。对于p-值＜0.05(显著性水平)，PBMC定义为IDO+。白色三角给出了各组中IDO5-特异性斑点平均
5
数/4×10PBMC。黑色三角表示各组中IDO5-特异性斑点的平均数。(e)来自乳腺癌患者的PBMC中针对IDO5的ELISPOT反应的实例。
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IDO5(ALLEIASCL)(c)。T淋巴细胞用肽刺激一次，然后一式两份地以4×10 细胞/孔接种，含有或不含有相关肽。使用ImmunoSpotSeries 2.0分析仪(CTL分析仪)对每名患者计算肽特异性斑点的平均数目(在减去无加入肽的斑点后)(d)通过IFN-γELISPOT测量的PBMC中IDO5特异性细胞的数目与通过细胞内IDO染色测量的PBMC中的IDO表达相关联。患者分成两个组：IDO-PBMC或IDO+PBMC。细胞内IDO表达通过比较MFIIDO和MFI同型(MFIIsotype)对照的单尾双样本t-检验来给出，其中MFI是平均荧光强度。对于p-值＜0.05(显著性水平)，PBMC定义为IDO+。白色三角给出了各组中IDO5-特异性斑点平均
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数/4×10PBMC。黑色三角表示各组中IDO5-特异性斑点的平均数。(e)来自乳腺癌患者的PBMC中针对IDO5的ELISPOT反应的实例。
[0286] 图2：IDO5特异性T细胞的四聚体分析。(a)，HLA-A2-限制性阳性对照肽HIV-1pol476-484(ILKEPVHGV)的结合与肽IDO5通过装配测定进行比较。(b)，来自肾细胞癌患者的PBL中IDO5特异性CD8T细胞的实例，其使用四聚体复合物HLA-A2/IDO5-PE和CD8-别藻蓝蛋白通过流式细胞术染色进行显像。作为阴性对照，来自同一患者的PBL用四聚体复合物HLA-A2/HIV pol476-484-PE和CD8-别藻蓝蛋白进行染色。(c)，离体或在体外肽刺激一次后，来自健康供体或来自乳腺癌、黑色素瘤癌症或肾细胞癌患者的PBL用四聚体复合物HLA-A2/IDO5或HLA-A2/HIV pol进行染色并通过流式细胞术分析。虚线说明在同一患者中IDO5四聚体阳性细胞在离体和体外两种情况下均可检测到。(d)，通过流式细胞术离体显像的来自肾细胞癌患者的富含CD8T细胞的PBMC中IDO5四聚体/CD8门控细胞(gated cell)的CD45RA和CD28表型分析的实例。为了比较，细胞用同型匹配对照染色。(e)，来自黑色素瘤患者的IL-2扩增的TIL培养物的实例，其使用四聚体复合物HLAA2/IDO5-PE和CD8-APC-Cy7通过流式细胞术染色而显像。作为阴性对照，TIL用四聚体复合物HLA-A2/HIV pol476-484-PE和CD8-APC-Cy7染色。(f)，作为IDO5四聚体的阳性对照，IDO5特异性T细胞克隆用HLA-A2/HIV-PE和HLA-A2/IDO5-PE四聚体染色。
[0287] 图3：IDO5-特异性T细胞克隆的特异性和功能能力。(RBS35)通过51Cr-释放测定法测定。(a)，未用肽或用IDO5肽脉冲的T2-细胞的溶解。(b)，不加入或加入HLA-I类特异性抗体W6/32的IDO+，HLA-A2+结肠癌细胞系SW480的特异性溶解，和IDO-，HLA-A2+结肠癌细胞系HCT-116的溶解。(c)，不加入和加入用IDO脉冲的或未脉冲的冷T2-细胞的IDO+，HLA-A2+黑色素瘤细胞系FM55M的溶解(抑制剂与靶标比＝20∶1)(d)，从HLA-A2阳+ +性AML患者富集的AML-母细胞的溶解。分别使用CD19 和CD3 微珠从AML患者的骨髓中去除AML-母细胞、B细胞和T细胞。使用高度富集的AML-母细胞作为加入或不加入HLA-I类特异性抗体W6/32的靶细胞。所有测定以不同的E∶T比进行。(e)显示癌细胞系中的细胞内IDO表达的直方图。数据代表3次试验。细胞内IDO表达通过比较MFIIDO(深色直方图)和MFI同型对照(浅色直方图)的单尾双样本t-检验来给出，其中MFI是平均荧光强度。左：HCT-116(p＝0.300)。右：SW480(p＝0.002)。
[0288] 图4：显示细胞内IDO染色的直方图(深色直方图)。阴性对照用荧光染料结合的二抗单独地染色(浅色直方图)。使用染色指数确定IDO表达，染色指数定义为MFI阳性-MFI背景/2×SD背景，其中MFI是平均荧光强度。如果染色指数＞1，则细胞定义为IDO阳21
性 。(a)，结肠癌细胞系HCT-116(0，01)，和SW480(1，3)(b)，乳腺癌细胞系CAMA-1(1，3)，和CAMA-1+IFN-γ(1，8)，和(c)，未成熟DC(0，2)，和成熟DC(1，2)。
性 。(a)，结肠癌细胞系HCT-116(0，01)，和SW480(1，3)(b)，乳腺癌细胞系CAMA-1(1，3)，和CAMA-1+IFN-γ(1，8)，和(c)，未成熟DC(0，2)，和成熟DC(1，2)。
[0289] 图5：通过51Cr-释放测定法测定的IDO5-特异性T细胞克隆(RBS35)杀死IFN-γ处理的乳腺癌细胞系的功能能力。HLA-A2阳性乳腺癌细胞系CAMA-1(a)和MDA-MB-231(b)在IFN-γ处理之前和之后的溶解。所有测定以不同的E∶T比进行。(c)，左：显示在IFN-γ处理之前和之后CAMA-1中细胞内IDO表达的直方图。数据代表3次试验。细胞内IDO表达通过比较MFIIDO(深色直方图)和MFI同型对照(浅色直方图)的单尾双样本t-检验来给出，其中MFI是平均荧光强度。顶部：CAMA-1(p＝0.020和MFIIDO/MFI同型对照＝2.3)。底部：CAMA-1+IFN-γ治疗25(p＝0.004和MFIIDO/MFI同型对照＝3.5)。右：显示在IFN-γ处理之前和之后CAMA-1中HLA-A2表达的直方图。数据代表3次试验。
HLA-A2表达通过比较MFIHLA-A2(深色直方图)和MFI同型对照(浅色直方图)的单尾双样本t-检验来给出。顶部：CAMA-1(p＝0.004和MFIHLA-A2/MFI同型对照＝43.7)。底部：CAMA-1+IFN-γ处理(p＝0.002和MFIIDO/MFIHLA-A2＝141.2)。(d)，通过IDO5-特异性T细胞大批培养，使用用于下调IDO蛋白表达的IDOShRNA转染的结肠癌细胞系SW480的溶解。作为阳性对照，用对照ShRNA转染的SW480细胞用作靶细胞。所有测定以不同的E∶T比进行。(d)，显示用对照ShRNA(p＝0.001和MFIIDO/MFI同型对照＝4.8)(顶部)和IDO ShRNA(p＝0.040和MFIIDO/MFI同型对照＝2.1)(底部)转染的SW480中细胞内IDO表达的直方图。
HLA-A2表达通过比较MFIHLA-A2(深色直方图)和MFI同型对照(浅色直方图)的单尾双样本t-检验来给出。顶部：CAMA-1(p＝0.004和MFIHLA-A2/MFI同型对照＝43.7)。底部：CAMA-1+IFN-γ处理(p＝0.002和MFIIDO/MFIHLA-A2＝141.2)。(d)，通过IDO5-特异性T细胞大批培养，使用用于下调IDO蛋白表达的IDOShRNA转染的结肠癌细胞系SW480的溶解。作为阳性对照，用对照ShRNA转染的SW480细胞用作靶细胞。所有测定以不同的E∶T比进行。(d)，显示用对照ShRNA(p＝0.001和MFIIDO/MFI同型对照＝4.8)(顶部)和IDO ShRNA(p＝0.040和MFIIDO/MFI同型对照＝2.1)(底部)转染的SW480中细胞内IDO表达的直方图。
[0290] 图6：通过51Cr-释放测定法测定的IDO5-特异性T细胞克隆(RBS35)杀死DC的功能能力。(a)，自体未成熟和成熟DC的溶解。(b)，HLA-A2+同种异体的未成熟和成熟DC的溶解。所有测定以不同的E∶T比进行。(c)，显示DC中细胞内IDO表达的直方图。数据代表3次试验。细胞内IDO表达通过比较MFIIDO(深色直方图)和MFI同型对照(浅色直方图)的单尾双样本t-检验来给出，其中MFI是平均荧光强度。左：体外未成熟DC(p＝0.100)。右：体外成熟DC(p＝0.001)。(d)，从IDO+PBMC直接离体分离的自体CD14+单核细胞、CD3+T细胞和CD19+B细胞的溶解。作为对照，我们使用体外产生的自体IDO-未成熟DC和IDO+成熟DC。(e)，如通过ELISPOT测量的来自乳腺癌患者的PBMC中针对EBV BMLF1280-288(GLCTLVAML)的HLA-A2限制性T细胞应答的实例。PBMC的培养物用IFN-γ处理5天，不含有(左)和含有26IDO-特异性T细胞(以3000∶1的PBMC∶IDO-特异性T细胞比)(右)，然后检验针对来自EBV BMLF1的HLA-A2限制性表位(GLCTLVAML)的
5 4 4
反应性。检验三个不同的PMBC浓度：1.5×10 细胞，5×10 细胞(上面两行)和10 细胞(下面两行)。
5 4 4
反应性。检验三个不同的PMBC浓度：1.5×10 细胞，5×10 细胞(上面两行)和10 细胞(下面两行)。
[0291] 图7：通过51Cr-释放测定法测定的IDO5-特异性T细胞的特异性和功能能力：(a)，RBS35对不加入和加入用IDO肽或不相关肽(HIV-1 pol476-484)脉冲的冷T2-细胞的HLA-A2+/IDO+黑色素瘤细胞系FM55M的溶解(抑制剂与靶标比＝20∶1)，和使用自然杀伤细胞系K562作为靶细胞测定的RBS35的NK细胞活性。(b)，RBS35对从HLA-A2+AML患者富+ +
集的AML-母细胞的溶解。分别使用CD19 和CD3 微珠从AML患者的骨髓中去除AML-母细胞、B细胞和T细胞。使用高度富集的AML-母细胞作为加入或不加入HLA-I类特异性抗体W6/32的靶细胞。(c)，用IDO肽或不相关肽(HIV-1 pol476-484)脉冲的T2-细胞的溶解，和通过IDO5-特异性T-细胞大批培养对HLAA2+/IDO+结肠癌细胞系SW480的溶解。(d)，通
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过 Cr-释放测定法测定的通过三种不同的IDO5-特异性T-细胞克隆(RBS26(白色三角)、RBS31(黑色三角)、RBS46(灰色三角))对HLA-A2+/IDO+结肠癌细胞系SW480和HLA-A2+/IDO-结肠癌细胞系HCT-116的溶解。所有测定以不同的E∶T比进行。
集的AML-母细胞的溶解。分别使用CD19 和CD3 微珠从AML患者的骨髓中去除AML-母细胞、B细胞和T细胞。使用高度富集的AML-母细胞作为加入或不加入HLA-I类特异性抗体W6/32的靶细胞。(c)，用IDO肽或不相关肽(HIV-1 pol476-484)脉冲的T2-细胞的溶解，和通过IDO5-特异性T-细胞大批培养对HLAA2+/IDO+结肠癌细胞系SW480的溶解。(d)，通
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过 Cr-释放测定法测定的通过三种不同的IDO5-特异性T-细胞克隆(RBS26(白色三角)、RBS31(黑色三角)、RBS46(灰色三角))对HLA-A2+/IDO+结肠癌细胞系SW480和HLA-A2+/IDO-结肠癌细胞系HCT-116的溶解。所有测定以不同的E∶T比进行。
[0292] 图8：通过Clustal W对IDO序列的多重比对
[0293] 图9：通过Clustal W对IDO和IDOLIKE的配对比对
[0294] 实施例
[0295] 实施例1
[0296] 患者/个体
[0297] PBL/PBMC采集自癌症患者(乳腺癌、黑色素瘤和肾细胞癌)和健康对照。在任一类型抗癌治疗终止最少4周后抽取血样。大多数肾细胞癌患者以前已经用IL2和IFN-α治疗，大多数黑色素瘤患者已经接受过高剂量的IL2和IFN-α，而所有乳腺癌患者用几种类型的化疗(例如，表柔比星、多西紫杉醇、卡培他滨)、曲妥珠单抗和/或内分泌疗法预先治疗。使用淋巴细胞分离剂(Lymphoprep)分离法分离PBL，HLA分型(Department of Clinical Immunology，University Hospital，Copenhagen，Denmark)并冷冻在含有10％DMSO的FCS中。包括总计20名HLA-A2+患者，在采血之前他们均未接受免疫治疗。在进行这些治疗措施的任一种措施之前从这些患者获得知情同意。
[0298] 肽
[0299] 根据关于HLA-A2等位基因的优选肽长度、锚定残基和辅锚定残基(auxiliary32
anchor)的知识预测来自IDO的表位。使用“数据库SYFPEITHIP” 结合手工检查MHC I类锚定残基的蛋白序列，进行IDO蛋白的扫描。选择的肽购自Genscript。产生11个合成
9mer和10mer肽：IDO1位置54-62(QLRERVEKL)、IDO2位置164-172(FLVSLLVEI)、IDO3位置
195-203(TLLKALLEI)、IDO4位置41-49(FIAKHLPDL)、IDO5位置199-207(ALLEIASCL)、IDO6位置320-328(VLSKGDGL)、IDO7位置383-391(DLMNFLKTV)、IDO8位置275-283(VLLGIQQTA)、IDO9 位 置 101-109(KVLPRNIAV)、IDO10 位 置 61-70(KLNMLSIDHL) 和 IDO11 位 置
341-350(SLRSYHLQIV)。肽溶解在DMSO(终浓度10mM)中或蒸馏水(终浓度2mM)中。使用HLA-A2高亲和力结合表位HIV-1pol476-484(ILKEPVHGV)作为不相关对照。HLA-A2限制性EB病毒肽EBVBMLF1280-288(GLCTLVAML)用作对照。
anchor)的知识预测来自IDO的表位。使用“数据库SYFPEITHIP” 结合手工检查MHC I类锚定残基的蛋白序列，进行IDO蛋白的扫描。选择的肽购自Genscript。产生11个合成
9mer和10mer肽：IDO1位置54-62(QLRERVEKL)、IDO2位置164-172(FLVSLLVEI)、IDO3位置
195-203(TLLKALLEI)、IDO4位置41-49(FIAKHLPDL)、IDO5位置199-207(ALLEIASCL)、IDO6位置320-328(VLSKGDGL)、IDO7位置383-391(DLMNFLKTV)、IDO8位置275-283(VLLGIQQTA)、IDO9 位 置 101-109(KVLPRNIAV)、IDO10 位 置 61-70(KLNMLSIDHL) 和 IDO11 位 置
341-350(SLRSYHLQIV)。肽溶解在DMSO(终浓度10mM)中或蒸馏水(终浓度2mM)中。使用HLA-A2高亲和力结合表位HIV-1pol476-484(ILKEPVHGV)作为不相关对照。HLA-A2限制性EB病毒肽EBVBMLF1280-288(GLCTLVAML)用作对照。
[0300] 用于与MHC I类分子结合的肽的装配测定法
[0301] 如前所述33在装配测定法中测量合成肽(Genscript)与用[35s]-蛋氨酸代谢性标记的HLA-A2分子的结合亲和力。该测定法基于在细胞溶解后从TAP缺陷细胞系T2释放的空HLA分子的肽介导的稳定。稳定折叠的HLA分子通过使用HLA I类特异性构象依赖性单克隆抗体(mAb)W6/32免疫沉淀并通过等电点聚焦(IEF)凝胶电泳分离。使用ImageGauge Phosphoimager程序(FUJI Photo Film，Carrolton，TX)定量主要组织相容性复合物(MHC)重链条带。条带的强度与在测定期间回收的肽结合的I类MHC复合物的量直接相关。HLA-A2的回收在100、10、1、和0.1μM相关肽的存在下测量。对于每种肽，C50值被计算为足以达到半数最大稳定的肽浓度。
[0302] PBL的抗原刺激
[0303] 为了扩大酶联免疫斑点(ELISPOT)测定的灵敏度，在分析前PBL在体外用肽刺激134 6
次 。在第0天，将PBL解冻，并以2×10 细胞的浓度在24孔板(Nunc)中以2ml/孔在10μM肽(GenScript)的存在下接种在含有5％热灭活人血清的X-vivo培养基(BioWhittaker)中。1天后，向培养物中加入40IU/ml重组白介素-2(IL-2)(PeproTech)。培养的细胞在第
8天在IFN-γELISPOT测定中测试。
次 。在第0天，将PBL解冻，并以2×10 细胞的浓度在24孔板(Nunc)中以2ml/孔在10μM肽(GenScript)的存在下接种在含有5％热灭活人血清的X-vivo培养基(BioWhittaker)中。1天后，向培养物中加入40IU/ml重组白介素-2(IL-2)(PeproTech)。培养的细胞在第
8天在IFN-γELISPOT测定中测试。
[0304] IFN-γELISPOT测定法
[0305] 如以前所述17，ELISPOT测定法用来定量释放肽表位-特异性INF-γ的效应细(34)胞。在一些试验中，如所述的那样 在分析前PBMC用肽在体外刺激1次以扩大测定的灵敏度。简言之，硝酸纤维素铺底的96孔板(MultiScreen MAIP N45；Millipore)包被以抗-IFN-γAb(1-D1K；Mabtech)。将各孔洗涤，通过X-vivo培养基封闭，以不同的细胞浓度一式两份地加入效应细胞，加入或不加入1OμM肽。各板温育过夜。第二天，弃去培养基，洗涤各孔，然后加入生物素化二抗(7-B6-1-Biotin；Mabtech)。各板在室温(RT)下温育
2h，洗涤，并向各孔中加入亲和素-酶偶联物(AP-亲和素；Calbiochem/Invitrogen Life Technologies)。各板在RT下温育1h，并向各孔中加入酶底物NBT/BCIP(Invitrogen Life Technologies)并在RT下温育5-10min。在出现深紫色斑点后，通过用自来水洗涤终止反应。使用ImmunoSpot Series 2.0分析仪(CTL分析仪)对斑点进行计数并且可以从形成斑点的细胞的数目计算肽特异性CTL频率。
2h，洗涤，并向各孔中加入亲和素-酶偶联物(AP-亲和素；Calbiochem/Invitrogen Life Technologies)。各板在RT下温育1h，并向各孔中加入酶底物NBT/BCIP(Invitrogen Life Technologies)并在RT下温育5-10min。在出现深紫色斑点后，通过用自来水洗涤终止反应。使用ImmunoSpot Series 2.0分析仪(CTL分析仪)对斑点进行计数并且可以从形成斑点的细胞的数目计算肽特异性CTL频率。
[0306] 流式细胞术
[0307] 对于四聚体染色，来自癌症患者和健康供体的PBL以及来自癌症患者的TIL在体外用肽刺激1次，或直接离体分析。在第7天使用Dynal CD8阴性分离试剂盒(Dynal Biotech)从PBL分离CD8细胞。得到的T细胞培养物用PE结合的四聚体染色，接着用荧光染料结合的mAb进行抗体染色：CD8-别藻蓝蛋白/APC-Cy7、CD3-FITC、CD3-FITC、CD45RO-FITC、CD45RA-PE-Cy5和CD28-别藻蓝蛋白(BD Immunocytometry Systems)。四聚体染色在PBS+2％FCS中，RT，避光进行15min，而抗体染色在PBS+2％FCS中，
4℃，避光进行。使用的MHC四聚体复合物为：HLA-A2/IDO5(ALLEIASCL)和HLA-A2/HIV-1pol476-484(ILKEPVHGV)。样品在BD FACS aria上使用DIVA软件(BD Biosciences)分析。
4℃，避光进行。使用的MHC四聚体复合物为：HLA-A2/IDO5(ALLEIASCL)和HLA-A2/HIV-1pol476-484(ILKEPVHGV)。样品在BD FACS aria上使用DIVA软件(BD Biosciences)分析。
[0308] 使用流式细胞术检查癌细胞系和DC的IDO表达。在固定和透化(Cytofix/Cytoperm，BD)后，细胞用小鼠抗IDO抗体(Millipore Corporation)染色，然后用FITC-标记的抗小鼠二抗(DAKO)染色。对于所有试验，包括仅用FITC-结合的二抗染色的阴性对照，以确定由错误地附着的二抗和自发荧光产生的背景荧光。使用染色指数确定IDO表达，该染色指数定义为MFI阳性-MFI背景/2×SD背景，其中MFI是平均荧光强度。如果染色指数＞1，21
则细胞定义为IDO阳性 。
则细胞定义为IDO阳性 。
[0309] 使用流式细胞术检查癌细胞的HLA-A2表达。细胞用荧光染料结合的HLA-A2 mAb(BD Bioscience)染色。为比较，细胞用同型匹配对照染色。样品在BD FACS aria上使用DIVA软件(BD Biosciences)分析。假设正态，HLA-A2表达通过比较MFIHLA-A2和MFI同型对照的单尾双样本t-检验来给出，其中MFI是平均荧光9强度。对于p-值＜0.05(显著水平)，细胞定义为HLA-A2+。表达的倍数(the fold of expression)定义为MFIHLA-A2/MFI同型对照。
[0310] 树突细胞(DC)
[0311] 从PBMC中通过在富含10％人AB血清的RPMI-1640中在37℃在培养皿上粘附60min产生DC。粘附的单核细胞在添加了10％人AB血清的RPMI-1640培养基中在IL-4(1000U/ml)和GM-CSF(800U/ml)的存在下培养6天。通过加入IL-1β(2ng/ml)、IL-6(1000U/ml)、TNF-α(10ng/ml)和PGE2(1μg/ml)使DC成熟。
[0312] 抗原特异性T细胞培养物和克隆的建立
[0313] 来自癌症患者的PBL使用照射的(25Gy)、IDO5-负载的自体DC(PBL∶DC比率＝6 5
3×10 ∶3×10)和3μg/ml β2m、20U/ml IL-12(PeproTech)和40U/ml IL-7(PeproTech)刺激。培养物每10天用照射的自体DC(2×)刺激，然后用照射的PBL(2×)刺激。在每次用DC刺激后加入20U/ml IL-12(PeproTech)和40U/ml IL-7(PeproTech)，并且在每次用
51
PBL刺激后加入40U/ml IL-2(PeproTech)。1月后，在标准 Cr-释放测定中检测生长培养
6
物对IDO5的特异性。来自特定培养物的PBL在10/ml照射的(25Gy)IDO5负载的PBL和
120U/ml IL-2(PeproTech)的存在下通过有限稀释进行克隆。每3-4天，加入50μl新鲜
4
培养基，使含有的IL-2的终浓度为120U/ml。使用IDO5负载的PBL(5×10 细胞/孔)和
120U/ml IL-2扩增生长的克隆。扩增后，克隆在标准51Cr-释放测定中检测特异性和细胞毒性潜力。
3×10 ∶3×10)和3μg/ml β2m、20U/ml IL-12(PeproTech)和40U/ml IL-7(PeproTech)刺激。培养物每10天用照射的自体DC(2×)刺激，然后用照射的PBL(2×)刺激。在每次用DC刺激后加入20U/ml IL-12(PeproTech)和40U/ml IL-7(PeproTech)，并且在每次用
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PBL刺激后加入40U/ml IL-2(PeproTech)。1月后，在标准 Cr-释放测定中检测生长培养
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物对IDO5的特异性。来自特定培养物的PBL在10/ml照射的(25Gy)IDO5负载的PBL和
120U/ml IL-2(PeproTech)的存在下通过有限稀释进行克隆。每3-4天，加入50μl新鲜
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培养基，使含有的IL-2的终浓度为120U/ml。使用IDO5负载的PBL(5×10 细胞/孔)和
120U/ml IL-2扩增生长的克隆。扩增后，克隆在标准51Cr-释放测定中检测特异性和细胞毒性潜力。
[0314] 细胞毒性测完
[0315] 如他处所述35进行用于CTL介导的细胞毒性的常规51Cr-释放测定。靶细胞为T2-细胞，体外产生的自体未成熟和成熟DC，同种异体HLA-A2阳性未成熟和成熟DC，自体离体的分离的单核细胞，T细胞和B细胞(使用CD14+、CD3+或CD19+微珠(MACS)分离的)，自然杀伤细胞靶细胞系K562，离体富集的HLA-A2阳性AML-母细胞(使用CD19+和CD3+微珠(MACS)分离自AML患者的骨髓)，HLA-A2阳性乳腺癌细胞系CAMA-1和MDA-MB-231，HLA-A2阳性结肠癌细胞系HCT-116和SW480(所有均可在美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)(ATCC)获得)和HLA-A2阳性黑色素瘤细胞系FM55M(来自36
IPD-ESTDAB数据库，在www.ebi.ac.uk/cgi-bin/ipd/estdab/处获得 )。使用HLA特异
37
性mAb W6/32(2μg/100μl)阻断溶解 。在一些测定中，癌细胞用100U/ml IFN-γ处理2天。
IPD-ESTDAB数据库，在www.ebi.ac.uk/cgi-bin/ipd/estdab/处获得 )。使用HLA特异
37
性mAb W6/32(2μg/100μl)阻断溶解 。在一些测定中，癌细胞用100U/ml IFN-γ处理2天。
[0316] AML母细胞的富集
[0317] 我们分别使用CD19+和CD3+微珠(MACS)从AML患者的骨髓中清除B细胞和T细51
胞。在标准 Cr释放测定中使用高度富集的AML-母细胞(CD3-，CD19-)作为靶细胞。
胞。在标准 Cr释放测定中使用高度富集的AML-母细胞(CD3-，CD19-)作为靶细胞。
[0318] 在癌细胞中IDO的下调
[0319] 人SW480用 所 示 的 获 自SuperArray 的 短 发 夹 RNA(ShRNA)质 粒 使 用FuGene6(Roche)根据生产厂商的说明书转染。细胞直接在LSB缓冲液(Sigma)中溶解。LSB溶胞产物煮沸5min并且负载在1O％预制蛋白凝胶(BioRad)上。蛋白质通过半干转移法(semidry transfer method)电转移至PVDF膜(Millipore Corporation)并且用所示的抗体根据生产厂商的说明书进行检测。印迹使用获自Amersham的ECL系统和CCD照相机(LAS-1000，Fujifilm)显影。使用下列的抗体：抗-Cdk7(MO-1)(Santa Cruz)和抗-IDO(Millipore Corporation)。
[0320] IDO-衍生的HLA-A2-限制性T-细胞表位
[0321] 使用基于主要HLA-A2特异性锚定残基的算法选择11个IDO-衍生肽并且随后合16
成 。使用ELISPOT IFN-γ分泌测定，然后我们检验了来自癌症患者和健康个体的外周血T细胞的针对这些IDO-衍生肽的特异性T细胞应答的存在。此方式以前已经证明非常有
17-19
效地用于鉴定癌症患者中肿瘤特异性细胞毒性T-淋巴细胞(CTL) 。因此，来自HLA-A2阳性、晚期癌症患者(乳腺癌、黑色素瘤和肾细胞癌)的外周血淋巴细胞(PBL)在通过
17，20
ELISPOT检测之前在体外用不同的肽刺激1次。如所述 ，选择此步骤来扩大ELISPOT的灵敏度。检测针对IDO2(IDO164-172；FLVSLLVEI)、IDO6(IDO 320-328；VLSKGDGL)和尤其是IDO5(IDO199-207；ALLEIASCL)的ELISPOT反应(图1)。作为对照，我们检验了来自健康个体的PBL的针对这三种IDO衍生肽的反应性。在任一个健康对照中，没有检测到针对任一种IDO衍生肽的自发反应。使用“NCBI数据库”对这些肽的氨基酸序列进行BLAST搜索，显示这些基序仅在IDO蛋白中是占优势的。
成 。使用ELISPOT IFN-γ分泌测定，然后我们检验了来自癌症患者和健康个体的外周血T细胞的针对这些IDO-衍生肽的特异性T细胞应答的存在。此方式以前已经证明非常有
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效地用于鉴定癌症患者中肿瘤特异性细胞毒性T-淋巴细胞(CTL) 。因此，来自HLA-A2阳性、晚期癌症患者(乳腺癌、黑色素瘤和肾细胞癌)的外周血淋巴细胞(PBL)在通过
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ELISPOT检测之前在体外用不同的肽刺激1次。如所述 ，选择此步骤来扩大ELISPOT的灵敏度。检测针对IDO2(IDO164-172；FLVSLLVEI)、IDO6(IDO 320-328；VLSKGDGL)和尤其是IDO5(IDO199-207；ALLEIASCL)的ELISPOT反应(图1)。作为对照，我们检验了来自健康个体的PBL的针对这三种IDO衍生肽的反应性。在任一个健康对照中，没有检测到针对任一种IDO衍生肽的自发反应。使用“NCBI数据库”对这些肽的氨基酸序列进行BLAST搜索，显示这些基序仅在IDO蛋白中是占优势的。
[0322] 实施例2
[0323] (材料和方法如实施例1中所述)
[0324] 在癌症患者检测IDO-反应性HLA-A2-限制性T细胞
[0325] 通 过 装 配 测 定，通 过 与HLA-A2高 亲 和 性 阳 性 对 照 表 位 —— 即HIV-1pol476-484(ILKEPVHGV)比较，检验免疫原性最明显的IDO-衍生肽——即，IDO5——与HLA-A2的亲和力(图2a)。值得注意的是，IDO5结合的HLA-A2甚至比高亲和性对照表位更好。IDO5与HLA-A2的高结合亲和力使我们能够制备稳定的HLA-A2/IDO5四聚体，其用来通过流式细胞术检测IDO-反应性CTL。此分析清楚地证实在HLA-A2阳性癌症患者的血液中IDO5-反应性CD8T细胞的存在(图2)。图2b图示说明了在肾细胞癌患者中在使用用作对照的HIV四聚体-复合物体外刺激后IDO5特异性T细胞应答的实例。在通过体外刺激显著地增加IDO-反应性T细胞的频率的同时，在选择的患者中IDO-反应性T细胞可以容易地离体检测到(图2c)：在体外刺激后具有最强应答的三名患者中，各自的反应性也在离体条件下检测。总之，分析来自7名HLA-A2阳性健康个体和11名HLA-A2阳性患者的PBL，表明在癌症患者中体外刺激后全部CD8+T细胞的IDO反应性细胞的平均频率为0.03％，相比之下，健康供体为0.001％(图2c)。
[0326] 在任一健康供体中均没有检测到IDO-反应性T细胞(图2b)。IDO-反应性T细胞的离体染色显示天然存在的IDO5-特异性T细胞具有CD45RA-CD28+中枢/效应器记忆(34)表型 。IDO四聚体门控细胞的此离体表型染色的实例显示在图2d中。作为比较，样品用同型匹配对照染色。下一步，我们通过四聚体染色检验了在来自HLA-A2+黑色素瘤和头颈部癌症患者的IL-2处理的TIL培养物中IDO-特异性T细胞的存在。如图2e中所图示，IDO5-特异性T细胞可以容易地在TIL中被检测到。总之，5名分析的患者中的4名可检测到IDO5-特异性T细胞。同样地，在ELISPOT中可以检测到来自黑色素瘤和头颈部癌症患者的TIL培养物中的IDO5-特异性T细胞(数据未显示)。为了控制HLA-A2/IDO5四聚体的特异性，我们染色了IDO5-特异性T-细胞克隆。HLA-A2/IDO5四聚体确实有效地染色IDO5-特异性T-细胞克隆，而T-细胞克隆不被对照HLAA2/HIV四聚体染色(图2f)。
[0327] 实施例3
[0328] (材料和方法如实施例1中所述)
[0329] IDO特异性T-细胞的功能能力
[0330] 鉴定了患者针对IDO肽的宿主应答后，我们使用来自这些患者的PBL在体外产生针对此肽的CTL大批培养物。PBL通过自体IDO5-脉冲的DC刺激。在4轮刺激后，在标准51Cr释放测定中检测肽特异性。来自这些大批培养物的细胞溶解用IDO肽脉冲的TAP-缺陷型T2-细胞。为了更详细地分析IDO特异性T细胞的溶解能力，通过有限稀释克隆法从这些大批培养物建立CTL克隆。在短暂的扩增期后，在标准51Cr释放测定中分析生长的克隆的特异性。在显示IDO特异性溶解能力的33个T细胞克隆中，选择4个克隆用于进一步扩增，因为它们具有较优的生长速率。代表性的T细胞克隆绘制在图3a中：T-细胞克隆RBS35有效地杀死IDO5-脉冲的T2-细胞，而不含肽的T2-细胞不被溶解(图3a)。
[0331] 实施例4
[0332] (材料和方法如实施例1中所述)
[0333] IDO-特异性T细胞杀死肿瘤靶标
[0334] 通过细胞内蛋白染色然后通过FACS分析检验许多癌细胞系和DC的IDO表达21。为此，结肠癌细胞系SW480、黑色素瘤细胞系FM55、乳腺癌细胞系CAMA-1和MDA-MB231、直接富集的AML-母细胞和成熟DC均为IDO阳性。仅结肠癌细胞系HCT-116和未成熟DC为IDO阴性。此外，癌细胞系的IFN-γ处理增加IDO表达。
[0335] IDO染色的代表性实例图示在图4中的直方图中。
[0336] 重要的是，T细胞克隆RBS35不仅以高功效杀死肽脉冲的T2-细胞，而且还杀死HLA-A2+、IDO+结肠癌细胞系SW480(图3b)。相比之下，RBS35不溶解HLA-A2+/IDO-结肠癌细胞系HCT-116(图3b)。通过使用HLA特异性mAbW6/32阻断HLA-I类，完全地消除了SW480靶细胞的溶解，证实了RBS35的HLA-限制性(图3b)。类似地，RBS35杀死HLA-A2+/IDO+黑色素瘤细胞系FM55M(图3c)。使用IDO(10μM)肽脉冲的未标记T2-细胞的冷靶向抑制测定证实了杀死作用的HLA-A2/肽特异性：加入冷(未标记)IDO5-脉冲的T2-细胞完全地消除了FM55M黑色素瘤细胞的杀死，而加入不含肽的冷T2-细胞对FM55M的杀死没有影响(图3c)。加入用不相关肽(HIV-1 pol476-484)脉冲的冷T2-细胞对FM55M的杀死也没有影响(图7a)。没有观察到针对NK-细胞靶细胞系K562的细胞毒性(图7a)。
[0337] 此外，我们检测了RBS35溶解从AML患者的骨髓直接离体富集的人HLA-A2+AML-母细胞的能力。为此目的，我们从HLA-A2+AML患者的骨髓中清除了T细胞(CD3+)和B细胞51
(CD19+)；随后高度富集的AML-母细胞(CD3-，CD19-)用作 Cr释放测定中的靶细胞。如图3d中所示，RBS35以HLA依赖性的方式有效地溶解白血病细胞。我们从6名患者(5名HLA-A2+患者和1名HLA-A2-患者)中富集了AML母细胞，并且所有这些细胞表达IDO(数据未显示)。RBS35以HLA依赖性的方式有效地溶解HLA-A2+白血病细胞，而HLA-A2-白血病细胞不被溶解(图7b)。
(CD19+)；随后高度富集的AML-母细胞(CD3-，CD19-)用作 Cr释放测定中的靶细胞。如图3d中所示，RBS35以HLA依赖性的方式有效地溶解白血病细胞。我们从6名患者(5名HLA-A2+患者和1名HLA-A2-患者)中富集了AML母细胞，并且所有这些细胞表达IDO(数据未显示)。RBS35以HLA依赖性的方式有效地溶解HLA-A2+白血病细胞，而HLA-A2-白血病细胞不被溶解(图7b)。
[0338] 为了说明RBS35导致肿瘤靶标的代表性杀死，多克隆IDO5-特异性大批培养物以及三种其他的T细胞克隆(RBS26，RBS31，RBS46)导致的SW480的杀死显示在图7c和图7d中。类似于RBS35，这些克隆(RBS26，RBS31，RBS46)中的任一种均不溶解HLA-A2+/IDO-结肠癌细胞系HCT-116(图7d)。
[0339] 最后，我们检验了HLA-A2+乳腺癌细胞系CAMA-1和MDA-MB-231的杀死。CAMA-1细胞系被RBS35杀死(图5a)，而MDA-MB-231不被RBS35识别(图5b)。INF-γ处理增加两种细胞系中的IDO表达。与此一致，INF-γ处理增加RBS35导致的CAMA-1的杀死，并且引入了对MDA-MB-231细胞的杀死作用(图5)。
[0340] 另外，我们显示多克隆IDO5-特异性大批培养物和RBS35克隆导致的杀死作用的确是IDO-特异性的。因此，使用IDO shRNA，我们使人SW480结肠癌细胞系中的IDO蛋白表达下调并且由此挽救了这些肿瘤细胞以免被杀死(图5c)。此下调通过细胞内蛋白染色而显现。这些染色证实IDO ShRNA的使用降低了细胞中IDO蛋白表达的水平(图5d)。随51
后，转染的细胞用作 Cr-释放测定中的靶细胞。用IDO ShRNA转染的癌细胞不被多克隆IDO-特异性大批培养物识别，而用不相关对照ShRNA转染的细胞被杀死，如图5c中所示。
后，转染的细胞用作 Cr-释放测定中的靶细胞。用IDO ShRNA转染的癌细胞不被多克隆IDO-特异性大批培养物识别，而用不相关对照ShRNA转染的细胞被杀死，如图5c中所示。
[0341] 实施例5
[0342] (材料和方法如实施例1中所述)
[0343] 通过IDO-特异性T细胞杀死免疫活性细胞
[0344] IDO表达不限于肿瘤和肿瘤基质细胞，而还可以在免疫细胞中被诱导。因此，作为下一个和甚至更为重要的步骤，我们设法解决表达IDO的DC是否也易于被IDO-反应性CTL杀死的问题。为了测试此观点，我们从已经产生CTL克隆的相同供体产生了自体DC；通过22
加入由IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE222组成的标准成熟混合物使DC成熟 。RBS35有效地杀死成熟的DC。相比，自体未成熟IDO-DC不被RBS35杀死(图6a)。而且，我们检验了RBS35对来自HLA-A2+供体的IDO+成熟DC以及IDO-未成熟DC的识别。同种异体成熟的DC被RBS35杀死，而来自相同供体的IDO-未成熟DC不被杀死(图6b)。
加入由IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE222组成的标准成熟混合物使DC成熟 。RBS35有效地杀死成熟的DC。相比，自体未成熟IDO-DC不被RBS35杀死(图6a)。而且，我们检验了RBS35对来自HLA-A2+供体的IDO+成熟DC以及IDO-未成熟DC的识别。同种异体成熟的DC被RBS35杀死，而来自相同供体的IDO-未成熟DC不被杀死(图6b)。
[0345] 在图6c中，图示了mDC表达IDO，与iDC相反。下一步，我们检测了RBS35溶解自体单核细胞、T细胞和B细胞的能力。为此目的，我们从IDO+PBMC直接离体分离了CD14+单核细胞、CD3+T细胞和CD19+B细胞。分离的细胞随后用作51Cr-释放测定中的靶细胞。自体CD14+单核细胞、CD3+T细胞和CD19+B细胞不被RBS35溶解(图6d)。
[0346] 最后，我们建立了一个体外模型以检验是否IDO-特异性T细胞通过清除表达IDO的抑制性细胞来增强免疫应答。因此，PBMC的培养物用IFN-γ处理以增加含有和不含有自体IDO特异性T细胞的培养物中的免疫活性以及IDO表达。5天后，我们检验了培养物中针对来自EBV BMLF1280-288(GLCTLVAML)的HLA-A2限制性优势免疫表位的免疫反应性。尽管在培养物中总细胞数是相同的，但在含有IDO-特异性T细胞的培养物中针对EBV肽的反应性较高(图6e)。下一步，我们仔细检查了IDO特异性T细胞的加入是否将免疫反应
4
性增加到允许在ELISPOT中仅使用远低于正常检测限的10PBMC对EBV反应进行检测的程度。事实上，我们可以甚至在此低浓度的PBMC下检测到明显的EBV反应(图6e)。如期望的那样，我们在此低细胞浓度下在不含IDO-特异性T细胞的培养物中检测不到任何EBV反应(图6e)。
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性增加到允许在ELISPOT中仅使用远低于正常检测限的10PBMC对EBV反应进行检测的程度。事实上，我们可以甚至在此低浓度的PBMC下检测到明显的EBV反应(图6e)。如期望的那样，我们在此低细胞浓度下在不含IDO-特异性T细胞的培养物中检测不到任何EBV反应(图6e)。
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2，3-双加氧酶直接激活成熟Tregs).J Clin Invest 117：2570-2582，2007
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