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具有表面缀合的载药纳米颗粒的CAR T细胞的过继转移及其用途

阅读：306发布：2020-05-11

专利汇可以提供具有表面缀合的载药纳米颗粒的CAR T细胞的过继转移及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文描述了包含免疫效应细胞的组合物，用载有一种或多种活性剂的纳米颗粒或微米颗粒在表面对所述免疫效应细胞进行化学修饰，用于活性剂的受控释放。示例性载药纳米颗粒包括包封A2a受体抑制剂的交联的多层脂质体(cMLV)。修饰的免疫效应细胞还可在表面上呈递一种或多种嵌合抗原受体(CAR)。还提供了使用所述组合物来治疗癌症的方法。，下面是具有表面缀合的载药纳米颗粒的CAR T细胞的过继转移及其用途专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种工程化免疫效应细胞，所述工程化免疫效应细胞包含：
a.免疫效应细胞；以及
b.化学键合至所述免疫效应细胞表面的颗粒，
其中，所述免疫效应细胞含有编码一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸或者表达CAR，以及
其中，所述颗粒包封腺苷A2A受体(A2AR)抑制剂。
2.如权利要求1所述的工程化免疫效应细胞，其中，所述免疫效应细胞包括以下免疫效应细胞中的一种或多种：NK细胞、T细胞、B细胞、肿瘤特异性T淋巴细胞和造血干细胞。
3.如权利要求2所述的工程化免疫效应细胞，其中，所述免疫效应细胞是自体的。
4.如权利要求1所述的工程化免疫效应细胞，其中，所述A2AR抑制剂包括SCH58261、咖啡因、SYN115、FSPTP、ZM241385、PBS-509、ST1535、ST4206、Tozadenant、V81444或伊曲茶碱。
5.如权利要求4所述的工程化免疫效应细胞，其中，所述A2A受体抑制剂为SCH58261。
6.如权利要求1所述的工程化免疫效应细胞，其中，所述颗粒为包含脂质体的纳米颗粒或微米微粒，或者所述颗粒为聚合物颗粒。
7.如权利要求5所述的工程化免疫效应细胞，其中，所述颗粒为交联的多层脂质体(cMLV)。
8.如权利要求1所述的工程化免疫效应细胞，其中，所述免疫效应细胞为T细胞，所述颗粒为cMLV，并且所述A2AR抑制剂为SCH58261。
9.如权利要求1所述的工程化免疫效应细胞，其中，CAR所靶向的抗原为以下抗原中的任一种或多种：
4-1BB、5T4、腺癌抗原、甲胎蛋白、BAFF、B淋巴瘤细胞、C242抗原、CA-125、碳酸酐酶9(CA-IX)、C-MET、CCR4、CD152、CD19、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23(IgE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD4、CD40、CD44 v6、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CEA、CNTO888、CTLA-4、DR5、EGFR、EpCAM、CD3、FAP、纤连蛋白额外结构域-B、叶酸受体1、GD2、GD3神经节苷脂、糖蛋白75、GPNMB、HER2/neu、HGF、人分散因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-I、IgG1、L1-CAM、IL-13、IL-6、胰岛素样生长因子I受体、整合素α5β1、整合素αvβ3、MORAb-009、MS4A1、MUC1、粘蛋白CanAg、N-羟乙酰神经氨酸、NPC-1C、PDGF-Rα、PDL192、磷脂酰丝氨酸、前列腺癌细胞、RANKL、RON、ROR1、SCH 900105、SDC1、SLAMF7、TAG-72、腱生蛋白C、TGF-β2、TGF-β、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2、波形蛋白及它们的组合。
10.一种用于在有需要的受试者中治疗、抑制或降低癌症的严重性或可能性的方法，所述方法包括向所述受试者给予治疗有效量的工程化免疫效应细胞，各工程化免疫效应细胞包含：
a.免疫效应细胞；以及
b.化学键合至所述免疫效应细胞表面的颗粒，
其中，所述免疫效应细胞含有编码一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸或者表达CAR，以及
其中，所述颗粒包封腺苷A2A受体(A2AR)抑制剂。
11.一种用于在有需要的受试者中治疗、抑制或降低疾病的严重性或可能性的方法，所述方法包括向所述受试者给予治疗有效量的工程化免疫效应细胞，各工程化免疫效应细胞包含：
a.免疫效应细胞；以及
b.键合至所述免疫效应细胞表面的交联的多层脂质体(cMLV)，
其中，所述免疫效应细胞含有编码一种或多种CAR的多核苷酸或者表达CAR，以及
其中，所述cMLV包封腺苷A2A受体抑制剂。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述免疫效应细胞包括以下免疫效应细胞中的一种或多种：NK细胞、T细胞、B细胞、肿瘤特异性T淋巴细胞和造血干细胞。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述免疫效应细胞为T细胞，所述颗粒为cMLV，并且所述A2AR抑制剂为SCH58261。
14.如权利要求11所述的方法，其中，所述A2A受体抑制剂包括SCH58261、咖啡因、SYN115、FSPTP、ZM241385、PBS-509、ST1535、ST4206、Tozadenant、V81444或伊曲茶碱。
15.如权利要求11所述的方法，其中，所述A2A受体抑制剂为SCH58261。
16.如权利要求11所述的方法，其中，所述疾病为癌症。
17.如权利要求11所述的方法，其中，所述方法进一步包括向所述受试者给予选自于由以下疗法所组成的组中的现有疗法：化学疗法、放射疗法及它们的组合。
18.如权利要求11所述的方法，其中，将所述现有疗法与所述工程化免疫效应细胞顺序给予或同时给予。
19.如权利要求11所述的方法，其中，CAR所靶向的抗原为以下抗原中的任一种或多种：
4-1BB、5T4、腺癌抗原、甲胎蛋白、BAFF、B淋巴瘤细胞、C242抗原、CA-125、碳酸酐酶9(CA-IX)、C-MET、CCR4、CD152、CD19、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23(IgE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD4、CD40、CD44 v6、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CEA、CNTO888、CTLA-4、DR5、EGFR、EpCAM、CD3、FAP、纤连蛋白额外结构域-B、叶酸受体1、GD2、GD3神经节苷脂、糖蛋白75、GPNMB、HER2/neu、HGF、人分散因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-I、IgG1、L1-CAM、IL-13、IL-6、胰岛素样生长因子I受体、整合素α5β1、整合素αvβ3、MORAb-009、MS4A1、MUC1、粘蛋白CanAg、N-羟乙酰神经氨酸、NPC-1C、PDGF-Rα、PDL192、磷脂酰丝氨酸、前列腺癌细胞、RANKL、RON、ROR1、SCH 900105、SDC1、SLAMF7、TAG-72、腱生蛋白C、TGF-β2、TGF-β、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2、波形蛋白及它们的组合。
20.如权利要求16所述的方法，其中，所述受试者具有预先存在的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或先前已接受CAR-T 细胞疗法。

说明书全文

具有表面缀合的载药纳米颗粒的CAR T细胞的过继转移及其

用途

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2017年3月20日提交的美国临时申请no.62/473,594(以引用的方式在此处将其公开内容整体并入本文)的优先权和权益。

[0003] 关于联邦政府资助的研究或开发的声明

[0004] 本发明是在美国国立卫生研究院授予的Grant No.AI068978和No.EB017206的政府支持下完成的。美国政府拥有本发明的某些权利。

技术领域

[0005] 本发明的各种实施方式提供了用于治疗癌症的组合物和方法。

背景技术

[0006] 本文的所有出版物均以引用的方式并入，其程度如同具体和单独地表明将每个单独的出版物或专利申请以引用的方式并入。以下描述包括可在理解本发明中有用的信息。这并非是对本文提供的任何信息为现有技术或与当前要求保护的发明相关的承认，或对具体地或隐含地引用的任何出版物为现有技术的承认。

[0007] 过继CAR工程化T 细胞疗法已在治疗血源性肿瘤中显示出成功(主要是CD19 CAR在白血病和B细胞淋巴瘤的临床前试验和临床试验中)。尽管有这些有希望的结果，CAR-T细胞疗法针对实体瘤的临床应用是有限的。这些缺点是由于具有血液恶性肿瘤中不存在的独特屏障的肿瘤微环境。

[0008] 与在血流中循环至全身的血液癌症不同，实体瘤具有其自身的复杂肿瘤微环境(TME)，其为免疫疗法提供了特有的屏障。为了有效，免疫细胞必须高效地浸润实体肿瘤块并且具有体内扩增细胞的延长的持久性。TME含有多种促肿瘤发生因子，这些因子既能防止灭癌免疫细胞进入肿瘤区域，又能减弱肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的激活。许多此类免疫抑制机制也能对过继转移的CAR工程化T细胞产生负面影响。

[0009] 事实上，一些研究提供了显示在将CART细胞注射到携带已建立的人实体瘤的免疫缺陷小鼠中后，强免疫抑制环境造成效应物功能的快速丧失(其限制CART细胞的治疗功效)的证据。此种肿瘤诱导的肿瘤浸润T细胞(TIL)的功能减退(hypofunction)是由多种机制引起的。

[0010] 导致肿瘤微环境中CAR T细胞效应物功能逐渐丧失的潜在因素之一是细胞外抑制途径，其由异常增加的细胞外免疫抑制分子浓度触发。

[0011] A2a腺苷受体(A2AR)在活化T细胞表面上表达。A2aR途径由细胞外免疫抑制分子腺苷的异常高浓度触发，据报道其抑制T细胞增殖和IFN-γ分泌。在TME中，细胞外三磷酸腺苷(ATP)响应于组织损伤和细胞应激而释放。细胞外环境中的ATP通过外切核酸酶CD39和CD73(其在缺氧TME中上调)被转化为腺苷。已在多种侵袭性癌症中观察到CD73的过表达(其赋予针对抗肿瘤剂的抗性)。腺苷与A2aR的结合导致TIL中细胞内环AMP(cAMP)的产生增加。细胞内cAMP的升高诱导蛋白激酶A(PKA)的激活和cAMP反应元件结合蛋白(CREB)的磷酸化，其转而通过降低Akt通路的活性以及抑制NF-κB介导的免疫激活而消除T细胞受体(TCR)信号传导和IFN-γ产生。

[0012] 研究已经证明，通过药理学抑制或遗传缺失对A2AR的通路阻断通过增强细胞毒性T细胞功效和体内持久性而显著改善抗肿瘤免疫力。SCH-58261是腺苷受体A2A的强有力的选择性拮抗剂，相比其它腺苷受体具有超过50倍高的对A2A的选择性。尽管具有治疗潜力，但其临床开发受到药物的不佳溶解性和体内PK谱的阻碍。此外，需要将这些直接作用于转移的CAR T细胞的小分子药物维持在高且持续的全身水平以发挥功效。开发能够调节体内药物循环时间以及特异性地和有效地在肿瘤中递送药物并同时将“在靶上但脱离肿瘤(on-target but off tumor)”的副作用最小化的有效载体仍然是具有挑战性的。

[0013] 最近，已实现了重要的进步以将纳米技术用于药物递送，从而增强了数种抗癌药物的治疗功效。与游离药物相比较，载药纳米颗粒通过延长血液循环时间、控制持续的药物释放、减少全身毒性以及经由高渗透性和滞留(EPR)效应增加癌症组织中的药物浓度，可成功地提供具有更好的功效和更少的副作用的靶向递送。

[0014] 然而，EPR效应高度取决于肿瘤的充分血管化。在一些表现出不良血液供应和缺氧的肿瘤中可能完全缺乏血管化。另外，肿瘤内的高间质液压可起到将治疗剂运回至血流的作用。据报道，大多数施用的纳米颗粒(高达95％)在肿瘤以外的器官(包括例如肝、脾和肺)中积聚。因此，纳米颗粒在肿瘤块内的有效递送和分布仍然具有挑战性。

[0015] 大量研究表明，在纳米颗粒上添加靶向部分可显著改善其肿瘤特异性和积聚，但这些靶向策略仍然依赖于纳米颗粒通过血流的被动分布。

[0016] 因此，本发明的一个目的是提供组合物和/或递送系统，其浸润并存留于肿瘤块中以抑制或控制肿瘤块生长，并减小肿瘤尺寸或减少相关症状。

[0017] 本发明的另一目的是提供通过在肿瘤微环境中促进或挽救CAR T细胞效应物功能来治疗患有肿瘤或遭受发展中的肿瘤的受试者的方法。

发明内容

[0018] 结合系统、组合物和方法来描述和说明以下实施方式及其方面，所述系统、组合物和方法意为示例性和说明性的，而非限制范围。

[0019] 提供工程化细胞以增强过继CAR T疗法和其它癌症疗法的功效，其中将载有活性剂的纳米颗粒或微米颗粒化学缀合至细胞表面。在各种实施方式中，待表面工程化(或修饰)的细胞为具有编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸或具有在表面上表达的CAR的免疫效应细胞。通常，与颗粒的表面缀合不改变不具有缀合纳米颗粒的天然CAR T细胞的趋化性驱动的迁移、活力、细胞因子分泌功能或针对肿瘤细胞的细胞毒性。

[0020] 通常，与载药纳米颗粒表面缀合的CAR T细胞迁移并保留在肿瘤深部(例如在抑制性肿瘤微环境中)；并且在其中以受控或持续的时间释放药物。优选地，药物为可降低抑制性肿瘤微环境对T细胞的抑制的可能性或将该抑制逆转的治疗剂或预防剂。

[0021] 用于缀合的示例性纳米颗粒包括脂质体(如交联的多层脂质体)和受控释放聚合物纳米颗粒。取决于掺入的活性剂的溶解度，可选择疏水聚合物或嵌段共聚物(例如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)或它们的共聚物)来形成用于活性剂从中受控释放的纳米颗粒。通常，纳米颗粒以不改变细胞功能但又高至足以递送每细胞的高载量活性剂的比例与每个细胞缀合。例如，每细胞的缀合纳米颗粒数量为400～350、350～300、300～250、250～200、200～150或
150～100。示例性缀合在马来酰亚胺官能化颗粒与具有表面硫醇基团的细胞之间进行。

[0022] 通常，活性剂可为任何小分子化合物、细胞因子、抗体或其抗原结合片段。用于包封、分散或掺入纳米颗粒以及从来自CAR T细胞表面的纳米颗粒中受控释放的示例性活性剂包括改变肿瘤微环境的抑制剂和拮抗剂。在一些实施方式中，所述活性剂为腺苷受体A2a的拮抗剂，例如SCH-58261、咖啡因和ZM241385。在其它实施方式中，所述活性剂可为血管内皮生长因子(VEGF)的拮抗剂或抑制剂或者VEGF受体(VEGFR)的拮抗剂或抑制剂。

[0023] 纳米颗粒或微米颗粒缀合的示例性细胞类型包括“伴侣(chaperone)”细胞(如自然杀伤细胞)和“治疗(therapeutic)细胞”(如肿瘤特异性T淋巴细胞和造血干细胞)。

[0024] 在各种实施方式中，载体细胞与纳米颗粒表面缀合，所述纳米颗粒递送活性剂，其在产生腺苷的侵袭性癌症的微环境中防止、逆转或阻断对内源性T细胞功能的抑制。

[0025] 在一些实施方式中，掺入A2aR特异性拮抗剂SCH-58261的交联的多层脂质体(cMLV)化学缀合至CAR T细胞的表面。首先，我们将腺苷受体A2A的强有力的选择性拮抗剂SCH包封至交联的多层脂质体囊泡(cMLV)药物递送系统中。然后，我们证明了CAR T细胞可共价缀合至携带SCH的纳米颗粒递送系统而不影响该系统的活力或功能。为测试主动靶向递送系统对体内T细胞功能的治疗功效，我们使用人类实体瘤异种移植小鼠模型开发了两种临床前模型，其允许证明两种情况：肿瘤诱导的CAR T细胞功能减退的(1)防止和(2)恢复。

[0026] 通过在两种临床前模型中广泛的体内和体外实验研究，具有缀合的cMLV(其递送SCH-58261)的表面工程化CAR T细胞保留了其迁移至肿瘤部位并且将载药cMLV主动引导至肿瘤部位的能力。此外，CAR T-cMLV(SCH)治疗具有最高的抗肿瘤功效，伴有显著更高的CD3+TIL滞留和更多的体内炎性细胞因子(如IFN-γ)分泌，表明载有SCH的cMLV直接缀合至CAR T细胞显著增加了其治疗效果。

[0027] 在一些实施方式中，所述组合物与免疫检查点抑制剂、免疫调节剂或化学治疗剂中的一种或多种同时或顺序(sequentially)共同给予。附图说明

[0028] 在参考图中对示例性实施方式进行说明。旨在认为本文公开的实施方式和附图为说明性的而非限制性的。

[0029] 图1A根据本发明的各种实施方式描绘了纳米颗粒(cMLV)与CAR T细胞基于马来酰亚胺的稳定缀合的示意图。图1B描绘了示出在不同缀合比例(纳米颗粒与T细胞的比例为5000:1、1000:1、500:1、250:1和100:1)下每个T细胞的缀合纳米颗粒数量的柱状图。数据代表以三个平行实验(triplicate)进行的两次独立实验的平均值±SD。图1C和图1D描绘了流式细胞术分析(图1C)和相应的柱状图(图1D)，其示出了缀合cMLV的CD3+T细胞的百分比(以cMLV:T细胞＝1000:1的缀合比例)。图1E示出了红色通道、绿色通道和合并图像中的与载有DiD的cMLV缀合的CAR T细胞的单细胞共聚焦显微镜图像。这些CAR T细胞在缀合至cMLV(DiD)之前用1μM CFSE标记并用PBS洗涤。使用共聚焦显微镜将CAR T细胞表面的cMLV可视化。比例尺代表10μm(红色：DiD标记的cMLV；绿色：CFSE标记的CAR T细胞)(n＝3，平均值±SD；ns，不显著；*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)。

[0030] 图2A-图2J根据本发明的各种实施方式描绘了cMLV的缀合未改变CAR T细胞功能。图2A和图2B描绘了来自IFN-γ染色测定的流式细胞术分析(图2A)和相应的柱状图表示(图
2B)。对用SKOV3.CD19细胞刺激6小时的未缀合CAR T细胞(CART)或与空cMLV缀合的CAR T细胞(CART.cMLV)进行的用以检测IFN-γ释放的代表性FACS分析。将未转导的CAR-T细胞用作阴性对照。用细胞内染色测量IFN-γ。图2A下排示出了与cMLV缀合或未缀合的CD3+T细胞的IFN-γ分泌。图2C描绘了纳米颗粒缀合不影响针对K562-CD19+靶肿瘤的CAR T细胞细胞毒+
性。图2D描绘了纳米颗粒缀合不影响针对SKOV3-CD19 肿瘤的CAR T细胞细胞毒性。以三个平行实验进行的实验的细胞毒性平均值％±SD。图2E和图2F描绘了侵袭迁移
(transmigration)测定中侵袭迁移的T细胞的百分比(图2E)和数量(图2F)。将未缀合的CAR T细胞(CART)或缀合cMLV的CAR T细胞(CART.cMLV)接种在Transwell上室中，加入或不加入化学引诱物CXCL9至下室。孵育6小时后，收集来自下室的培养基并对CAR-T细胞进行计数。
在图中显示了汇总的统计数据(n＝3，平均值±SD；ns，不显著；*p<0.05、**p<0.01、***p<
0.001)。所有数据代表至少3次独立实验。图2G和图2H描绘了cMLV的缀合未改变用抗人CD3/CD28抗体重新刺激时T细胞的细胞因子分泌(图2G示出了柱状图；图2H示出了相应的流式细+
胞术谱图)。图2I和图2J描绘了cMLV的缀合未改变用K562-CD19 肿瘤细胞重新刺激时T细胞的细胞因子分泌(图2I示出了柱状图；图2J示出了相应的流式细胞术谱图)。以三个平行实验进行的实验的平均值％±SD。

[0031] 图3A和图3B描绘了结合至CAR T细胞的cMLV显示比游离cMLV更有效地浸润至表达抗原的肿瘤。向携带皮下SKOV3.CD19肿瘤的3只NOD/scid/IL2rγ-/-(NSG)小鼠的组静脉内注射与DiD标记的cMLV缀合的1×107个CAR-T细胞(CART.cMLV)、与DiD标记的cMLV共输注(co-infused)的1×107个CAR-T细胞(CART+cMLV)或等同数量的单独的DiD标记的cMLV(cMLV)。在24小时(图3A)和48小时(图3B)后，用剪刀将指定组织取出、称重并浸渍。使用IVIS光谱成像系统对每个器官的特异性DiD组织荧光进行定量，并计算每克组织注射剂量的平均百分比(ID％/g)作为最终读出。示出的数据由两个独立实验的数据合并而成(n＝3，平均值±SD；ns，不显著；*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)。

[0032] 图3C描绘了与游离cMLV相比较，缀合至T细胞的纳米颗粒在肿瘤中表现出更高的积聚。用光学荧光显微镜检测用DiD染料标记的cMLV。用从PBS处理的小鼠采集的器官对荧光强度进行归一化，n＝3。**p<0.01，通过单因素方差分析进行分析。

[0033] 图4A-图4D示出了CAR T细胞输注后48小时肿瘤块内的CART细胞与cMLV(其在CAR T细胞上表面缀合)的共定位的共聚焦显微镜成像的定量结果。图4A和图4B示出了来自CART.cMLV或CART+cMLV组的SKOV3.CD19肿瘤浸润CAR T细胞的密度的点状图(图4A)和柱状图(图4B)。图4C和图4D示出了在肿瘤组织内与cMLV共定位的肿瘤浸润CAR T细胞的百分比的点状图(图4C)和柱状图(图4D)(n＝6，平均值±SD；NS，不显著；*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)。

[0034] 图5A-图5F描绘了在具有SKOV3.CD19肿瘤的动物中与释放SCH58261的cMLV缀合的抗CD19 CAR T细胞免于发展出功能减退。将SKOV3.CD19细胞皮下注射至NSG小鼠的右侧腹部。将小鼠随机分为6组，并经由i.v.注射用指定处理进行处理。图5A为不同处理的靶向体内递送的示意图。图5B描绘了用数显卡尺测量的肿瘤尺寸进展(n＝8，平均值±SD；n/s，不显著；*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)。图5C描绘了使用Kaplan-Meier方法计算的小鼠存活曲线。在指定处理后，收获并消化侧腹部肿瘤，用于离体分析。对肿瘤浸润CAR-T细胞的数量和功能进行评价。图5D描绘了处理后48小时肿瘤中CD3+CD45+T细胞的百分比。图5E描绘了在处理后2天通过用抗hCD3和抗hCD28刺激时肿瘤浸润T细胞的离体IFN-γ分泌。图5F描绘了对处理后2天的肿瘤浸润T细胞中磷酸化CREB表达水平的检测(n＝3，平均值±SD；n/s，不显著；*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)。

[0035] 图5G描绘了与包封SCH58261的cMLV缀合的CART细胞在过继T细胞转移(ACT)后显+ 3 3示出对肿瘤生长的强有力控制。携带已建立的皮下SKOV3-CD19 肿瘤(100mm-150mm)的小鼠在第0天接受PBS、CART、CART-Emp(表示为“Emp”)或CART-SCH(图中表示为“SCH”)输注之一。用游标卡尺测量肿瘤体积，并根据公式(w2×l)/2计算。数据表示在以n＝15进行的体内实验中的平均体积±SD。*p<0.05、**p<0.01，通过单因素方差分析进行分析。

[0036] 图5H-图5K描绘了与包封SCH58261的cMLV缀合的CART细胞在肿瘤和脾中均显示出增加的CD3+CD45+T细胞浸润和增殖。图5H示出了ACT后第2天的TIL分析。图5L示出了ACT后第2天的脾细胞分析。图5J示出了ACT后第14天的TIL分析。图5K示出了ACT后第14天的脾细胞分析。数据代表平均值±SD，n＝5。*p<0.05、**p<0.01以及***p<0.005，通过单因素方差分析进行分析。

[0037] 图5L和图5M描绘了与包封SCH58261的cMLV缀合的CART细胞显示出增加的细胞因子分泌和降低的CREB磷酸化。图5L示出了ACT后第2天的细胞内IFN-γ分泌。图5M示出了ACT后第2天的磷酸化CREB。数据表示MFI±SD，n＝3。*p<0.05、**p<0.01，通过单因素方差分析进行分析。

[0038] 图6A-图6H描绘了与释放SCH58261的cMLV缀合的抗CD19 CAR T细胞能够挽救SKOV3.CD19肿瘤中的功能减退的肿瘤浸润T细胞。图6A是与释放SCH的cMLV缀合的CAR T细胞的靶向体内递送通过挽救肿瘤浸润CART.tEGFR细胞来抑制SKOV3.CD19肿瘤的示意图。图6B是显示i.v.注射后第35天时肿瘤尺寸从基线的变化百分比的瀑布图(n＝6，平均值±SD；
ns，不显著；*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)。图6C是在指定处理后2天肿瘤中CART.tEGFR细胞百分比的代表性FACS图。图6D描绘了在指定处理后2天肿瘤中CD45+T细胞的百分比。图
6E是示出了在指定处理后2天肿瘤中CART.tEGFR细胞百分比的定量图。图6F示出了在指定处理后2天对CART.tEGFR细胞中的Ki-67表达的检测。图6G描绘了在指定处理后2天通过用抗hCD3和抗hCD28刺激时肿瘤浸润CART.tEGFR细胞的离体IFN-γ分泌。用细胞内染色测量IFN-γ释放。图6H描述了在指定处理后2天对CART.tEGFR细胞中磷酸化CREB表达水平的检测(n＝3，平均值±SD；ns，不显著；*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)。所有数据均代表至少两个独立实验。

[0039] 图6I和图6J描绘了与包封SCH58261的cMLV缀合的CART细胞在第10天用第二过继T细胞转移(ACT)进行挽救处理后降低了肿瘤尺寸。图6I示出了实验时间线的示意图。图6J示出了在初始CART输注(第0天)后第10天，携带已建立的皮下SKOV3-CD19+肿瘤(～200mm3)的小鼠接受PBS、CART、CART-Emp或CART-SCH输注。用游标卡尺测量肿瘤体积并根据公式(w2×l)/2计算。数据表示以n＝15进行的体内实验的平均体积±SD，*p<0.05、**p<0.01，通过单因素方差分析进行分析。

[0040] 图6K-图6M描绘了与包封SCH58261的cMLV缀合的CART细胞增加了肿瘤中的T细胞浸润和增殖。图6K示出了第二过继T细胞转移后48小时的CD3+CD45+TIL群百分比。图6M示出了第二过继T细胞转移后48小时CD3+CD45+TIL群的伪彩色图。图6L示出了CD8+/CD4+T细胞比。数据代表以n＝5进行的体内实验的平均体积±SD。*p<0.05、**p<0.01以及***p<0.005，通过单因素方差分析进行分析。

[0041] 图6N和图6O描绘了与包封SCH58261的cMLV缀合的CART细胞挽救了肿瘤驻留T细胞的细胞因子分泌并降低了CREB磷酸化。图6N示出了处理后48小时的细胞内IFN-γ分泌。图6O示出了处理后48小时的磷酸化CREB。数据代表MFI±SD，n＝3。*p<0.05、**p<0.01，通过单因素方差分析进行分析。

[0042] 图7为体内在受体细胞存在下过继转移的缀合cMLV的CAR T细胞的示意图。载有A2AR小分子抑制剂的马来酰亚胺官能化的cMLV经由细胞表面硫醇缀合至CAR-T细胞。

[0043] 图8根据本发明的各种实施方式描绘了“挽救”处理的示意图：与包封药物的cMLV缀合的伴侣CART细胞。

[0044] 图9描绘了抗CD19 CAR在T细胞表面上稳定表达。流式细胞术分析显示在总CD3+T细胞中平均50％的抗CD19 CAR表达。用兔抗HA继以Alex647-抗兔抗体对CAR-T细胞进行染色以进行CAR检测。

[0045] 图10描绘了cMLV的缀合未改变CAR-T细胞功能。IFN-γ+CD3+T细胞(其与DiD标记的cMLV缀合以区分出缀合cMLV的群)的代表性流式细胞术分析。将CART和CART.cMLV(DiD)与SKOV3.CD19共培养6小时，并对细胞内IFN-γ表达进行定量。

[0046] 图11A示出了以APC-抗-hEGFR染色的CART.tEGFR细胞的代表性流式细胞术分析，显示tEGFR在转导后14天在CART.tEGFR细胞的体外培养物中稳定表达。图11B描绘了肿瘤浸润T细胞显示出减少的IFN-γ分泌。在CAR-T细胞疗法后10天，用抗hCD3和抗hCD28离体刺激肿瘤浸润T细胞。用细胞内染色对IFN-γ释放进行测量。阳性对照为接受CAR-T细胞输注的非肿瘤携带小鼠的脾细胞(n＝3，平均值±SD；ns，不显著；*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)。图11C描绘了用数显卡尺测量肿瘤进展。图11D描绘了CART.cMLV(SCH)在处理后48小时显示出肿瘤尺寸显著减小。以柱状图示出各处理组在处理后48小时的汇总统计数据(n＝10，平均值±SD；ns，不显著；*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)。图11E描绘了用SCH处理的小鼠(包括CART+cMLV(SCH)和CART.cMLV(SCH)组)中肿瘤内SCH-58261浓度(μg/g)的HPLC分析。

[0047] 图12描绘了未缀合的cMLV(cMLV)或缀合至CAR-T细胞的cMLV(CART.cMLV)中SCH58261的体外释放率(％)。误差棒表示三个平行实验的平均值的标准偏差。

[0048] 图13描绘了载有SCH58261的cMLV在体外针对SKOV-3人卵巢癌细胞的细胞毒性。误差棒表示三个平行实验的平均值的标准偏差。

具体实施方式

[0049] 本文引用的所有参考文献都以引用的方式以其整体并入，如同进行了完全阐述一样。除非另外定义，本文使用的技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。Allen等,Remington:The Science and Practice of Pharmacy 22nd ed.,Pharmaceutical Press(2012年9月15日)；Hornyak等,Introduction to Nanoscience and Nanotechnology,CRC Press(2008)；Singleton和Sainsbury,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed.,revised ed.,J.Wiley&Sons(New York,NY 2006)；Smith,March's Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure 7th ed.,J.Wiley&Sons(New York,NY 2013)；Singleton,Dictionary of DNA and Genome Technology 3rd ed.,Wiley-Blackwell(2012年11月28日)；以及Green和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor,NY 2012)为本领域技术人员提供了本申请中使用的许多术语的一般性指导。关于如何制备抗体的参考文献，参见ndGreenfield,Antibodies A Laboratory Manual 2 ed.,Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor NY,2013)；和Milstein,Derivation of specific
antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion,
Eur.J.Immunol.1976 Jul,6(7):511-9；Queen和Selick,Humanized immunoglobulins,美国专利No.5,585,089(1996 Dec)；以及Riechmann等,Reshaping human antibodies for therapy,Nature 1988Mar 24,332(6162):323-7。

[0050] 本领域技术人员将认识到许多可用于本发明的实践中的与本文所描述的方法和材料类似或等同的方法和材料。通过与附图(其通过示例的方式说明了本发明的实施方式的各种特征)结合的以下详细描述，本发明的其它特征和优点将变得显而易见。实际上，本发明决不限于所描述的方法和材料。为方便起见，在此收集了本文在说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语。

[0051] 除非另有说明或上下文有所暗示，以下术语和短语包括下面提供的含义。除非另有明确说明或从上下文中显而易见，下面的术语和短语不排除该术语或短语在其所属领域中已获得的含义。提供定义来帮助描述具体实施方式，并不旨在限制所要求保护的发明，因为本发明的范围仅由权利要求限制。除非另外定义，本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

[0052] 如本文所使用的术语“包含/包括(comprising/comprises)”用于提及在实施方式中有用的组合物、方法及它们各自的组成部分，仍对包含未指明的要素(无论是否有用)保持开放。本领域技术人员将理解，总体而言，本文使用的术语通常旨在作为“开放性”术语(例如，术语“包括(including)”应解释为“包括但不限于”、术语“具有”应解释为“至少具有”、术语“包括(includes)”应解释为“包括但不限于”等)。

[0053] 除非另有说明，在描述本申请的具体实施方式的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用的术语“一个/一种(a/an)”和“该/所述”以及类似的用法可被解释为涵盖单数和复数两者。本文中对数值范围的列举仅旨在用作分别提及落入该范围内的每个单独的值的速记方法。除非本文另有指定，将每个单独的值并入说明书，如同其在本文中被单独列举一样。除非本文另有指定或上下文有明显矛盾，本文所述的所有方法均能够以任意合适的顺序进行。针对本文的某些实施方式提供的任意的和所有的实例或示例性语言(例如“如”)的使用仅旨在更好地说明本申请，而非对另外要求保护的本申请的范围构成限制。缩写“例如(e.g.)”衍生自拉丁文“exempli gratia”，在本文中用于指定非限制性实例。因此，缩写“e.g.”与“例如(for example)”是同义词。不应将说明书中的任何语言解释为指定对申请的实践必要的任何未要求保护的要素。

[0054] 如本文所使用的术语“约”指可测量的值(如量、持续时间等)，并且涵盖给定值的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或±0.1％的变化。

[0055] 本文所使用的“嵌合抗原受体”或“CAR/CARs”指将抗原特异性移植至细胞(例如T细胞，如初始 T细胞、中枢记忆T细胞、效应记忆T细胞或它们的组合)上的工程化受体。CAR也称为人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体。在各种实施方式中，CAR为重组多肽，其包含抗原特异性结构域(ASD)、铰链区(HR)、跨膜结构域(TMD)、共刺激结构域(CSD)和细胞内信号传导结构域(ISD)。

[0056] “效应物功能”指分化细胞的特化功能。T细胞的效应物功能例如可为细胞溶解/细胞毒性活性或辅助活性(包括细胞因子的分泌)。

[0057] 如本文所使用的“基因修饰细胞”、“重定向细胞”、“基因工程化细胞”或“修饰细胞”指表达CAR的细胞。

[0058] 如本文所使用的“基因修饰细胞所靶向的疾病”涵盖通过本发明的基因修饰细胞以任何方式参与任何疾病的任何细胞的靶向，而不考虑所述基因修饰细胞靶向疾病细胞还是健康细胞来实现治疗上有益的结果。基因修饰细胞包括但不限于基因修饰T细胞、NK细胞、造血干细胞、多能胚胎干细胞或胚胎干细胞。基因修饰细胞包含交联的多层脂质体(CMLV，其包封A2A受体抑制剂)以及编码一种或多种CAR的多核苷酸。可被靶向的抗原的实例包括但不限于在B细胞上表达的抗原；在癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞肿瘤和胚细胞瘤上表达的抗原；在各种免疫细胞上表达的抗原；以及在与各种血液疾病、自身免疫疾病和/或炎性疾病相关的细胞上表达的抗原。可被靶向的其它抗原对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且可被本发明的CAR连同其替代实施方式靶向。

[0059] 本文所使用的“免疫细胞”指哺乳动物免疫系统的细胞，包括但不限于抗原呈递细胞、B细胞、嗜碱性粒细胞、细胞毒性T细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、粒细胞、辅助T细胞、白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞、记忆细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、吞噬细胞、浆细胞和T细胞。

[0060] 如本文所使用的“免疫应答”指免疫(immunities)，包括但不限于先天免疫、体液免疫、细胞免疫、免疫、炎症应答、获得性(适应性)免疫、自身免疫和/或过度活跃的免疫。

[0061] 如本文所使用的“CD4淋巴细胞”指表达CD4的淋巴细胞，即CD4+淋巴细胞。CD4淋巴细胞可为表达CD4的T细胞。

[0062] 术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中是可互换的并且同义地使用。实例包括但不限于初始T细胞、中枢记忆T细胞、效应记忆T细胞或它们的组合。

[0063] 如本文所使用的术语“抗体”指具有Fc(可结晶的片段)区域或Fc区域的FcRn结合片段(在本文中称为“Fc片段”或“Fc结构域”)的单克隆或多克隆抗原结合片段或完整的免疫球蛋白。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割产生抗原结合片段。抗原结合片段尤其包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dAb、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、单结构域抗体、嵌合抗体、双抗体(diabodies)以及多肽(该多肽含有足以向该多肽赋予特异性抗原结合的免疫球蛋白的至少一部分)。Fc结构域包含有助于两类或三类抗体的两条重链的部分。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促切割(例如木瓜蛋白酶切割)或经由完整抗体的化学切割来产生Fc结构域。

[0064] 如本文所使用的“治疗剂”指用于例如治疗、抑制、预防、减轻疾病作用、降低疾病严重性、降低发展出疾病的可能性、减缓疾病进展和/或治愈疾病的药剂。治疗剂所靶向的疾病包括但不限于传染病、癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞肿瘤、胚细胞瘤、在各种免疫细胞上表达的抗原以及在与各种血液疾病和/或炎性疾病相关的细胞上表达的抗原。

[0065] “癌症”和“癌性的”指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。术语“癌症”意在包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，而不考虑组织病理学类型或侵袭阶段。实体瘤的实例包括各种器官系统的恶性肿瘤(例如肉瘤、腺癌和癌)，如影响肝、肺、乳腺、淋巴、胃肠(例如结肠)、泌尿生殖道(例如肾、尿路上皮细胞)、前列腺和咽的实体瘤。腺癌包括恶性肿瘤，如多数结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌和食道癌。在一个实施方式中，癌症为黑色素瘤，例如晚期黑色素瘤。使用本发明的方法和组合物也可治疗或预防上述癌症的转移性病变。可治疗的其它癌症的实例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童实体瘤、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘生物(neoplasm)、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管新生、脊髓轴(spinal axis)肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的癌症)以及所述癌症的组合。

[0066] 如本文所使用的“多核苷酸”包括但不限于DNA、RNA、cDNA(互补DNA)、mRNA(信使RNA)、rRNA(核糖体RNA)、shRNA(小发夹RNA)、snRNA(小核RNA)、snoRNA(短核仁RNA)、miRNA(微小RNA)、基因组DNA、合成DNA、合成RNA和/或tRNA。

[0067] 术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中是可互换的并且同义地使用。实例包括但不限于初始T细胞、中枢记忆T细胞、效应记忆T细胞或它们的组合。

[0068] 如本文所使用的术语“给予/给药/施用”指通过导致药剂至少部分定位在期望部位的方法或途径将本文公开的药剂置于受试者中。

[0069] “有益结果”可包括但决不限于减弱或缓和疾病病情的严重性、防止疾病病情恶化、治愈疾病病情、防止疾病病情发展、降低患者发展出疾病病情的机会以及延长患者的寿命或预期寿命。作为非限制性实例，“有益结果”或“期望结果”可为一种或多种症状的缓和、缺陷程度的缩减、癌症进展的稳定(即不恶化)状态、转移或侵袭的延迟或减缓以及与癌症相关的症状的改善或减弱。

[0070] 如本文所使用的术语“治疗(treat/treatment/treating)”或“改善”指治疗性治疗，其中目的是逆转、缓和、改善、抑制、减缓或停止与疾病或病症有关的病情的进展或严重性。术语“治疗”包括减轻或缓和病情、疾病或病症(例如癌症)的至少一种副作用或症状。如果一种或多种症状或临床标志物减少，则治疗是大体上“有效的”。或者，如果疾病进展减少或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，还包括在无治疗的情况下预期会出现的症状的进展或恶化的中止(或至少减缓)。有益或期望的临床结果包括但不限于可检测或不可检测的一种或多种症状的缓和、缺陷程度的缩减、疾病的稳定(即不恶化)状态、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或减弱以及缓解(无论部分还是全部)。术语疾病的“治疗”还包括提供疾病的症状或副作用的缓和(包括姑息治疗)。在一些实施方式中，癌症的治疗包括减小肿瘤体积、减少癌细胞数量、抑制癌症转移、增加预期寿命、降低癌细胞增殖、降低癌细胞存活或改善与癌性病情相关的各种生理症状。

[0071] 如本文所使用的“病情(conditions)”和“疾病病情”可包括癌症、肿瘤或传染病。在示例性实施方式中，病情包括但决不限于任何形式的恶性赘生细胞增殖性(malignant neoplastic cell proliferative)病症或疾病。在示例性实施方式中，病情包括以下病情中的任一种或多种：肾癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、成胶质细胞瘤、肺癌、结肠癌或膀胱癌。

[0072] 如本文所使用的术语“有效量”或“治疗有效量”指用以减少疾病或病症的至少一种或更多症状的包含本文公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的药物组合物的量，并涉及用以提供期望效果的药理组合物的足够量。如本文所使用的短语“治疗有效量”是指以适用于任何医学治疗的合理的收益/风险比治疗病症的组合物的足够量。

[0073] 治疗上或预防上显著的症状减少为例如与对照或未治疗的受试者或者给予本文所述的寡肽之前的受试者状态相比较，在测量的参数中至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约
100％、至少约125％、至少约150％或更多的减少。测量的或可测量的参数包括临床上可检测的疾病标志物(例如生物标志物升高或降低的水平)以及与糖尿病的症状或标志物的临床上接受的量表相关的参数。然而，应理解的是，本文公开的组合物和制剂的每日总用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。所需的确切量将根据诸如所治疗疾病的类型以及受试者的性别、年龄和体重等因素而变化。

[0074] 如本文所使用的“哺乳动物”指哺乳动物(Mammalia)纲的任何成员，包括但不限于人和非人灵长类动物(如黑猩猩以及其它猿和猴物种)；农场动物(如牛、绵羊、猪、山羊和马)；家养哺乳动物(如犬和猫)；实验室动物(包括啮齿动物，如小鼠、大鼠和豚鼠)等。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，成年受试者和新生受试者以及胎儿(无论雄性/男性或雌性/女性)都旨在包括在该术语的范围内。

[0075] 如本文所使用的“颗粒”指各种尺寸和任何形状的微粒物质。如本领域技术人员根据本文公开的教导将能够理解的，合适的粒度可基于以下因素而变化：用于制造颗粒的材料；其中携带的活性剂或治疗剂；以及与免疫效应细胞缀合所涉及的官能团和化学过程。例如，颗粒可为具有1nm～1,000nm的平均直径的纳米颗粒，或具有大于1μm但比颗粒缀合的免疫效应细胞小约至少一个数量级的平均直径的微米颗粒。例如，在一些实施方式中，颗粒的直径为约1nm～约1000nm、或约25nm～约750nm、或约50nm～约500nm、或约100nm～约300nm。在一些实施方式中，平均粒度可为约1nm、约10nm、约50nm、约100nm、约150nm、约200nm、约
250nm、约300nm、约350nm、约400nm、约450nm、约500nm、约550nm、约600nm、约650nm、约
700nm、约750nm、约800nm、约850nm、约900nm、约950nm、或约1000nm、或约2,000nm、或约5,
000nm、或约6,000nm、或约10,000nm。在一些实施方式中，如这些术语在本文中所定义的，颗粒可为纳米颗粒或微米颗粒。颗粒可全部为纳米颗粒、全部为微米颗粒或为纳米颗粒和微米颗粒的组合。在一些实施方式中，颗粒为脂质体。在其它实施方式中，颗粒为由可生物相容的和/或可生物降解的聚合物形成的聚合物颗粒。在一些实施方式中，颗粒含有核。在一些实施方式中，颗粒含有涂层(coating)。

[0076] 如本文所使用的“可生物降解的聚合物”可含有合成聚合物，但也可使用天然聚合物。聚合物可为例如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚苯乙烯或它们的组合。聚苯乙烯例如可用羧基修饰。可生物降解的聚合物的其它实例包括聚(羟基酸)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚酐、聚原酸酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基(polyalkylenes)、聚乙烯、聚丙烯、聚亚烷基二醇、聚(乙二醇)、聚环氧烷烃、聚(环氧乙烷)、聚对苯二甲酸亚烷基酯、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚(氯乙烯)、聚乙烯吡咯烷酮、聚硅氧烷、聚(乙烯醇)、聚(醋酸乙烯酯)、聚氨酯、聚氨酯的共聚物、衍生化纤维素、烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、纤维素乙酸酯、纤维素丙酸酯、纤维素乙酸丁酸酯、纤维素乙酸邻苯二甲酸酯、羧乙基纤维素、纤维素三乙酸酯、纤维素硫酸钠盐、丙烯酸的聚合物、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸的共聚物、甲基丙烯酸的衍生物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯基酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯)、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、聚(丙交酯-共-己内酯)的共聚物、聚(丙交酯-共-己内酯)的共混物、聚(氰基丙烯酸异丁酯)、聚(2-羟乙基-L-谷氨酰胺)，以及任何前述聚合物中的一种或多种的组合、共聚物和/或混合物。此外，如本领域普通技术人员将理解的，上面列为“可生物相容的”的一些聚合物也可被认为是可生物降解的，无论其是否包括在上面的代表性可生物降解聚合物的列表中。如本文所使用的“衍生物”包括具有化学基团的取代、添加以及本领域技术人员常规进行的其它修饰的聚合物。

[0077] 用于表达嵌合抗原受体(CAR)的基因修饰细胞毒性T细胞的过继T细胞转移已成为有前途的免疫治疗方法。多项研究者的研究表明，CAR细胞的过继转移在B细胞血液恶性肿瘤患者中是成功的，但对于实体瘤治疗仍处于开发的早期阶段。过继T细胞疗法的一个限制因素是使肿瘤浸润T细胞(TIL)功能失活的抑制性肿瘤微环境。该肿瘤微环境含有高浓度的TIL抑制分子(如腺苷)，其被CD4 T细胞和CD8 T细胞的细胞表面上表达的A2A受体摄取。腺苷是通过在肿瘤细胞和调节性T细胞的表面上表达的CD39和CD73由细胞外ATP生成的。本发明人已证明，与包封A2A受体抑制剂的交联的多层脂质体囊泡(cMLV)缀合的CAR T细胞的共同递送防止了肿瘤微环境中CAR T细胞效应物功能的降低并且有效地限制了肿瘤生长。本发明人进一步研究了CAR T细胞作为包封药物的cMLV的伴侣以挽救驻留于肿瘤中的功能减退的T细胞的应用。在该体内研究中，本发明人显示了“挽救”系统能够在处理后48小时内减小肿瘤尺寸、恢复TIL功能以及增加肿瘤浸润CD3+T细胞。

[0078] 提供了其中将载有活性剂的颗粒化学缀合至细胞表面的工程化细胞。在各种实施方式中，所述工程化细胞为工程化免疫效应细胞(例如CAR T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、造血干细胞或肿瘤特异性T淋巴细胞)。在各种实施方式中，包封活性剂的纳米颗粒或微米颗粒化学键合至细胞表面。颗粒可为交联的多层脂质体(cMLV)或聚合物颗粒。

[0079] 在一些实施方式中，工程化免疫效应细胞为表面缀合有cMLV的表达CAR的T细胞(CAR T细胞)，其中，cMLV包封A2aR抑制剂。在其它实施方式中，工程化免疫效应细胞为含有编码一种或多种CAR的多核苷酸的T细胞，所述T细胞在表面与cMLV缀合，其中，cMLV包封A2a受体抑制剂。在一些实施方式中，A2a受体抑制剂为SCH58261。

[0080] 通常，纳米颗粒以不改变细胞功能但又高至足以递送每细胞的高载量活性剂的比例与每个细胞缀合。例如，每细胞的缀合纳米颗粒数量为400～350、350～300、300～250、250～200、200～150或150～100。

[0081] 本文还提供了用于在有需要的受试者中治疗、抑制和/或降低疾病的严重性或可能性的方法。所述方法包括向受试者给予治疗有效量的包含免疫效应细胞的组合物(所述免疫效应细胞包含包封A2A受体抑制剂的交联的多层脂质体(cMLV))，从而在受试者中治疗、抑制和/或降低疾病的严重性或可能性。在一些实施方式中，免疫效应细胞包括NK细胞、T细胞(包括表达CAR的T细胞)、肿瘤特异性T淋巴细胞和/或造血干细胞。在各种实施方式中，免疫效应细胞含有编码CAR的多核苷酸。在一些实施方式中，A2A受体抑制剂为SCH58261、咖啡因或ZM241385。在一些实施方式中，所述疾病与组合物中的CAR所靶向的抗原相关。

[0082] 本文提供了用于在有需要的受试者中治疗、抑制、降低癌症转移的严重性和/或可能性的方法。所述方法包括向受试者给予治疗有效量的包含免疫效应细胞的组合物(所述免疫效应细胞包含包封A2a受体抑制剂的交联的多层脂质体(cMLV))，从而在受试者中治疗、抑制、降低癌症转移的严重性和/或可能性。在一些实施方式中，A2A受体抑制剂为SCH58261、咖啡因、SYN115、FSPTP、ZM241385、PBS-509、ST1535、ST4206、Tozadenant、V81444或伊曲茶碱(Istradefylline)。

[0083] 在各种实施方式中，需要以上任何治疗方法的受试者为具有预先存在的TIL或先前已接受CAR-T细胞疗法的受试者。

[0084] 在各种实施方式中，在将组合物给予受试者之后，任何以上方法进一步具有以下一个或多个特征：与对照组(如未给予的受试者、给予缺乏表面缀合纳米颗粒或活性剂的免疫效应细胞的受试者、给予与纳米颗粒表面缀合但无A2aR抑制剂的免疫效应细胞的受试者、给予免疫效应细胞和甚至包封A2aR抑制剂的纳米颗粒的受试者、或给予与掺入A2aR抑制剂的纳米颗粒表面缀合的免疫效应细胞之前的受试者)相比较，肿瘤中的浸润T细胞的平均密度为0.20个细胞/mm2～0.25个细胞/mm2、0.25个细胞/mm2～0.30个细胞/mm2、0.30个细胞/mm2～0.35个细胞/mm2、0.35个细胞/mm2～0.40个细胞/mm2或更高；肿瘤尺寸减小约10％、20％、30％、40％、50％、60％或更高；以及肿瘤中的总T细胞群为至少5％、6％、7％、
8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或更高。

[0085] 在各种实施方式中，在上述任何方法中严重性或可能性待治疗、抑制或降低的疾病包括癌症，并且在一些实施方式中包括表达CD73的肿瘤。

[0086] 在各种实施方式中，CAR所靶向的抗原包括但不限于以下抗原中的任一种或多种：4-1BB、5T4、腺癌抗原、甲胎蛋白、BAFF、B淋巴瘤细胞、C242抗原、CA-125、碳酸酐酶9(CA-IX)、C-MET、CCR4、CD152、CD19、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23(IgE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD4、CD40、CD44 v6、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CEA、CNTO888、CTLA-4、DR5、EGFR、EpCAM、CD3、FAP、纤连蛋白额外结构域-B(fibronectin extra domain-B)、叶酸受体1、GD2、GD3神经节苷脂、糖蛋白75、GPNMB、HER2/neu、HGF、人分散因子受体激酶(human scatter factor receptor kinase)、IGF-1受体、IGF-I、IgG1、L1-CAM、IL-13、IL-6、胰岛素样生长因子I受体、整合素α5β1、整合素αvβ3、MORAb-009、MS4A1、MUC1、粘蛋白CanAg、N-羟乙酰神经氨酸、NPC-1C、PDGF-Rα、PDL192、磷脂酰丝氨酸、前列腺癌细胞、RANKL、RON、ROR1、SCH
900105、SDC1、SLAMF7、TAG-72、腱生蛋白C(tenascin C)、TGF-β2、TGF-β、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2或波形蛋白(vimentin)。对癌症而言具有特异性的其它抗原对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且可与本发明的替代实施方式结合使用。

[0087] 在一些实施方式中，本文所述的治疗方法进一步包括顺序或同时向受试者给予现有疗法。现有癌症治疗的实例包括但不限于主动监测、观察、手术干预、化学疗法、免疫疗法、放射疗法(例如外照射、立体定向放射外科手术(伽玛刀)和分次立体定向放射疗法(FSR))、局灶疗法、全身疗法、疫苗疗法、病毒疗法、分子靶向疗法或它们的组合。

[0088] 化学治疗剂的实例包括但不限于结合白蛋白的紫杉醇(nab-紫杉醇)、放线菌素、阿利维A酸、全反式视黄酸、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、贝伐单抗、贝沙托汀(Bexatotene)、博来霉素、硼替佐米、卡铂、卡培他滨、西妥昔单抗、顺铂、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星(Doxorubicin)、表柔比星、埃博霉素、厄洛替尼、依托泊苷、氟尿嘧啶、吉非替尼、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊马替尼、伊匹单抗(Ipilimumab)、伊立替康、氮芥(Mechlorethamine)、美法仑、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥瑞珠单抗、奥法木单抗、奥沙利铂、紫杉醇、帕尼单抗(Panitumab)、培美曲塞、利妥昔单抗、Tafluposide、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、维甲酸(Tretinoin)、戊柔比星、维罗非尼(Vemurafenib)、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、伏立诺他、罗米地辛、5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤(6-MP)、克拉屈滨、氯法拉滨、氟尿苷、氟达拉滨、喷司他丁、丝裂霉素、伊沙匹隆、雌莫司汀或它们的组合。

[0089] 在各种实施方式中，A2a受体抑制剂的治疗有效量为以下治疗有效量中的任一种或多种：约0.01μg/kg/天～0.05μg/kg/天、0.05μg/kg/天～0.1μg/kg/天、0.1μg/kg/天～0.5μg/kg/天、0.5μg/kg/天～5μg/kg天、5μg/kg/天～10μg/kg/天、10μg/kg/天～20μg/kg/天、20μg/kg/天～50μg/kg/天、50μg/kg/天～100μg/kg/天、100μg/kg/天～150μg/kg/天、
150μg/kg/天～200μg/kg/天、200μg/kg/天～250μg/kg/天、250μg/kg/天～300μg/kg/天、
300μg/kg/天～350μg/kg/天、350μg/kg/天～400μg/kg/天、400μg/kg/天～500μg/kg/天、
500μg/kg/天～600μg/kg/天、600μg/kg/天～700μg/kg/天、700μg/kg/天～800μg/kg/天、
800μg/kg/天～900μg/kg/天、900μg/kg/天～1000μg/kg/天、0.01mg/kg/天～0.05mg/kg/天、0.05mg/kg/天～0.1mg/kg/天、0.1mg/kg/天～0.5mg/kg/天、0.5mg/kg/天～1mg/kg/天、
1mg/kg/天～5mg/kg/天、5mg/kg/天～10mg/kg/天、10mg/kg/天～15mg/kg/天、15mg/kg/天～20mg/kg/天、20mg/kg/天～50mg/kg/天、50mg/kg/天～100mg/kg/天、100mg/kg/天～
200mg/kg/天、200mg/kg/天～300mg/kg/天、300mg/kg/天～400mg/kg/天、400mg/kg/天～
500mg/kg/天、500mg/kg/天～600mg/kg/天、600mg/kg/天～700mg/kg/天、700mg/kg/天～
800mg/kg/天、800mg/kg/天～900mg/kg/天、900mg/kg/天～1000mg/kg/天或它们的组合。本文所描述的A2A受体的有效量的典型剂量可在使用已知治疗化合物的制造商推荐的范围内，并且也可如通过体外应答或动物模型中的应答所指示给本领域技术人员的那样。通常可将此类剂量减少达约一个数量级的浓度或量而不丧失相关的生物活性。实际剂量可取决于医生的判断、患者的状况以及治疗方法的有效性，所述治疗方法的有效性基于例如相关的培养细胞或组织培养的组织样品(如经活检的恶性肿瘤)的体外应答性或在适当的动物模型中观察到的应答。

[0090] 当指定“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗有效量”时，待给予的本发明组合物的精确量可由医生在考虑患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤尺寸、感染或转移程度以及病情的个体差异的情况下确定。通常可以说，本文所述的包含免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)的药物组合物能够以104个细胞/kg体重～109个细胞/kg体重的剂量给予，在一些情况下能够以105个细胞/kg体重～106个细胞/kg体重的剂量给予(包括这些范围内的所有整数值)。T细胞组合物也能够以这些剂量多次给予。可通过使用输注技术给予细胞。

[0091] 在某些方面，可期望将本文所述的包含免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)的组合物给予受试者，然后随后重新抽取(redraw)血液(或进行单采血液成分术)，根据本发明从中将免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)激活，并用这些经激活和扩增的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)对患者重新输注。该过程可每隔数周多次进行。在某些方面，可从10cc～400cc的抽取的血液将免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)激活。在某些方面，从20cc、30cc、
40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的抽取的血液将免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)激活。

[0092] 在各种实施方式中，可将本文所述的包含交联的多层脂质体(CMLV，其包封A2A受体抑制剂)和编码一种或多种CAR的多核苷酸的本发明组合物以每天一次(SID/QD)、每天两次(BID)、每天三次(TID)、每天四次(QID)或更高的频率给予，以向受试者给予有效量的组合物，其中，所述有效量为本文所述剂量中的任一种或多种。

[0093] 药物组合物

[0094] 在各种实施方式中，本发明提供药物组合物。所述药物组合物包含免疫效应细胞，所述免疫效应细胞包含包封A2A受体抑制剂的交联的多层脂质体(cMLV)。在一些实施方式中，所述免疫效应细胞包括NK细胞、T细胞(包括表达CAR的T细胞)、肿瘤特异性T淋巴细胞和/或造血干细胞。在一些实施方式中，所述A2A受体抑制剂为SCH58261、咖啡因或ZM241385。

[0095] 根据本发明的药物组合物可含有任何药学上可接受的赋形剂。“药学上可接受的赋形剂”意为在制备通常安全、无毒和期望的药物组合物中有用的赋形剂，并且包括对于兽医学用途以及对于人类制药用途而言可接受的赋形剂。此类赋形剂可为固体、液体、半固体，或在气溶胶组合物的情况下可为气态的。赋形剂的实例包括但不限于淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、着色剂、脱模剂、包被剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂、抗氧化剂、增塑剂、胶凝剂、增稠剂、硬化剂、凝固剂、悬浮剂、表面活性剂、保湿剂、载体、稳定剂及它们的组合。

[0096] 在各种实施方式中，根据本发明的药物组合物可被配制为用于经由任何给予途径递送。“给予途径”可指本领域已知的任何给予途径，包括但不限于气溶胶、经鼻、经口、经粘膜、透皮、肠胃外或肠内。“肠胃外”指通常与注射相关的给予途径，包括眶内、输注、动脉内、囊内、心内、皮内、肌肉内、腹膜内、肺内、脊柱内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、囊下、皮下、经粘膜或经气管。经由肠胃外途径，组合物可处于用于输注或用于注射的溶液或悬浮液的形式，或者作为冻干粉末。经由肠胃外途径，组合物可处于用于输注或用于注射的溶液或悬浮液的形式。经由肠内途径，药物组合物可处于允许受控释放的片剂、凝胶胶囊、糖衣片剂、糖浆、悬浮液、溶液、粉末、颗粒、乳液、微球或纳米球或脂质囊泡或聚合物囊泡的形式。通常，通过注射给予组合物。用于此类给予的方法是本领域技术人员已知的。

[0097] 根据本发明的药物组合物可含有任何药学上可接受的载体。如本文所使用的“药学上可接受的载体”指药学上可接受的材料、组合物或媒介物(vehicle)，其涉及将感兴趣的化合物从身体的一个组织、器官或部分携带或运输到身体的另一组织、器官或部分。例如，载体可为液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料或它们的组合。载体的每种组分必须为“药学上可接受的”，因为其必须与制剂的其它成分相容。载体也必须适合用于与任何可能与之接触的组织或器官接触，这意味着其必须不能携带毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或任何其它过度超过其治疗益处的并发症的风险。

[0098] 还可将根据本发明的药物组合物包封、压片或者制备成乳液或糖浆，用于口服给予。可加入药学上可接受的固体载体或液体载体以增强或稳定组合物或促进组合物的制备。液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、甘油、盐水、醇和水。固体载体包括淀粉、乳糖、硫酸钙、二水合物、石膏粉、硬脂酸镁或硬脂酸、滑石、果胶、阿拉伯胶、琼脂或明胶。载体还可包括单独或含蜡的持续释放材料，如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。

[0099] 按照常规药学技术制造药物制剂，对于片剂形式根据需要涉及研磨、混合、制粒和压制；或对于硬明胶胶囊形式涉及研磨、混合和填充。当使用液体载体时，制剂将处于糖浆、酏剂、乳液或者水性或非水性悬浮液的形式。可直接口服或填充至软明胶胶囊来给予此类液体制剂。

[0100] 可将根据本发明的药物组合物以治疗有效量递送。精确的治疗有效量是在给定受试者的治疗功效方面将产生最有效结果的组合物的量。该量将依赖于多种因素而变化，所述因素包括但不限于治疗化合物的特征(包括活性、药代动力学、药效学以及生物利用度)、受试者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体状况、对给定剂量的应答性以及药物类型)、制剂中药学上可接受的载体的性质以及给予途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验确定治疗有效量，例如通过对受试者对给予化合物的应答进行监测并相应地调整剂量。有关其它指导，请参阅Remington：The Science and Practice of Pharmacy(Gennaro ed.，第20版，Williams&Wilkins PA，美国)(2000)。

[0101] 在向患者给予前，可将助剂(formulants)添加至rAAV载体、用rAAV载体转染的细胞或用转染细胞调制的上清液。液体制剂可能是优选的。例如，此类助剂可包括油、聚合物、维生素、碳水化合物、氨基酸、盐、缓冲剂、白蛋白、表面活性剂、膨松剂(bulking agent)或它们的组合。

[0102] 碳水化合物助剂包括糖或糖醇，如单糖、二糖或多糖或水溶性葡聚糖。糖类或葡聚糖可包括果糖、右旋糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、葡聚糖、普鲁兰多糖、糊精、α和β环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素或它们的混合物。“糖醇”定义为具有-OH基团的C4～C8烃，包括半乳糖醇、肌醇、甘露糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘油和阿拉伯糖醇。可单独使用或组合使用上述这些糖或糖醇。只要糖或糖醇可溶于含水制剂中，对使用量无固定限制。在一个实施方式中，糖或糖醇浓度为1.0w/v％～7.0w/v％，更优选2.0w/v％～6.0w/v％。

[0103] 氨基酸助剂包括左旋(L)形式的肉毒碱、精氨酸和甜菜碱；但也可加入其它氨基酸。

[0104] 在一些实施方式中，作为助剂的聚合物包括具有2,000～3,000的平均分子量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，或具有3,000～5,000的平均分子量的聚乙二醇(PEG)。

[0105] 还优选在组合物中使用缓冲剂以使冻干前或复溶后溶液中的pH改变最小化。可使用大多数的任何生理缓冲液，包括但不限于柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐和谷氨酸盐缓冲液或它们的混合物。在一些实施方式中，浓度为0.01摩尔～0.3摩尔。在EP No.270,799和EP No.268,110中示出了可加入至制剂中的表面活性剂。

[0106] 用于增加循环半衰期的另一药物递送系统是脂质体。Gabizon等,Cancer Research(1982)42:4734；Cafiso,Biochem Biophys Acta(1981)649:129；以及Szoka,Ann Rev Biophys Eng(1980)9:467中讨论了制备脂质体递送系统的方法。其它药物递送系统是本领域已知的，并且在例如Poznansky等,DRUG DELIVERY SYSTEMS(R.L.Juliano,ed.,Oxford,N.Y.1980),pp.253-315；M.L.Poznansky,Pharm Revs(1984)36:277中进行了描述。

[0107] 在制备液体药物组合物后，可将其冻干以防止降解以及保持无菌。用于冻干液体组合物的方法是本领域普通技术人员已知的。可在刚要使用之前用无菌稀释剂(例如林格氏溶液、蒸馏水或无菌盐水)对组合物进行复溶，所述无菌稀释剂可包含另外的成分。复溶后，使用本领域技术人员已知的方法向受试者给予组合物。

[0108] 实施例

[0109] 以下实施例不旨在将权利要求的范围限制于本发明，而是旨在作为某些实施方式的示例。本领域技术人员想到的示例性方法的任何变化均旨在落入本发明的范围内。

[0110] 实施例1

[0111] 实验方法

[0112] 材料

[0113] 人卵巢癌细胞系SKOV3细胞系和人慢性髓性白血病细胞系K562细胞系从ATCC获得，并维持在含有10％热灭活FBS的RPMI-1640中。通过用FUW-CD19慢病毒对亲代K562和SKOV3细胞进行转导并通过荧光激活细胞分选(FACS)对CD19+细胞进行分选，生成CD19+K562和CD19+SKOV3细胞。SCH58261购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。所有脂质均购自NOF公司(日本)：1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-(10-rac-甘油)(DOPG)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酰胺(马来酰亚胺-头基脂(maleimide-headgroup lipid)，MPB-PE)。

[0114] 雌性6-10周龄NOD/scid/IL2rγ-/-(NSG)小鼠购自The Jackson laboratory(Bar Harbor，ME)。在南加州大学(Los Angeles，CA，美国)的动物设施中，将所有小鼠饲养在特定病原体减少的条件下。按照美国国立卫生研究院和南加州大学设定的关于动物护理和使用的指南进行所有实验。

[0115] 抗hCD19质粒构建体的生成

[0116] 构建FUW慢病毒载体以表达HA标记的抗CD19第二代CAR蛋白。抗CD19单链可变片段(scFv)序列由Carl June(专利号US 2013/0287748 A1，2013)开发。该序列由IDT DNA进行了密码子优化和构建，其后续为人CD8铰链区(aa 138-184)。使用PCR将抗CD19/CD8铰链基因区段与人CD28的跨膜结构域和细胞内结构域(aa 153-220)以及人CD3ζ的细胞内结构域(aa 52-164)组合。将HA标签插入抗CD19 scFv上游(序列：tacccatacgatgttccagattacgct)以允许标记表达CAR的细胞。还将Kozac序列和人CD8前导序列插入CAR构建体上游。为制造慢病毒载体，使用Gibson组装将该序列插入慢病毒质粒FUW中的人泛素蛋白-C启动子下游。

[0117] 病毒产生

[0118] 通过使用标准磷酸钙沉淀方法瞬时转染293T细胞来制造慢病毒载体。一旦细胞达到80％-90％的汇合度，将293T细胞接种在15cm板中并在14-18小时后转染。将40μg FUW-CAR质粒与包装质粒pMDLg/pRRE和pRSV-Rev以及pVSVg包膜质粒各20μg组合，以用于转染。转染细胞4小时后，除去培养基，用PBS洗涤细胞，并加入新培养基。转染后48小时收获病毒上清液。

[0119] 用于过继转移和慢病毒转导的T细胞的制备

[0120] 将来自健康供体的解冻的外周血单核细胞(PBMC)在含有X-vivo15无血清培养基(Lonza)、5％(vol/vol)GemCell人血清抗体AB(Gemini bio-products，West Sacramento CA)、1％(vol/vol)Glutamax-100x(Gibco Life Technologies)、10mM HEPES缓冲液(Corning)、1％(vol/vol)青霉素/链霉素(Corning)和12.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸(Sigma)的T细胞培养基(TCM)中培养。培养物补充有10ng/mL人IL-2。使用Dynabeads CD3/CD28珠T细胞扩增器(每个细胞3珠；Invitrogen)以10e+6个细胞/mL的密度激活PBMC，并在激活后2天用慢病毒转导。在离体扩增期间，补充培养基，并将T细胞密度维持在0.5×106个细胞/mL～1×106个细胞/mL。扩增转导细胞并在激活后第13天将其收获。

[0121] T细胞表面上受体表达的检测

[0122] 用PBS洗涤HA标记的CD19scFv-28-ζCAR-T细胞，并用兔抗HA抗体继以Alex647缀合的抗兔抗体染色以进行CAR检测。用APC缀合的抗人EGFR对逆转录病毒转导的细胞染色以进行tEGFR检测。使用MACS Quant流式细胞术分析仪(Miltenyi Biotec，Inc.，San Diego，CA)对受体表达进行分析。

[0123] 纳米颗粒的合成

[0124] 基于Joo等(2013)报道的常规脱水-重新水化方法制备脂质体。为将SCH-58261包封至cMLV中，将有机溶剂中的1mg SCH与脂质混合物混合以形成干燥的薄脂质膜。为了用DiD亲脂性染料标记脂质体颗粒，将DiD染料以0.01:1的比例(DiD:脂质)加入氯仿中的脂质混合物中。在真空下干燥过夜以形成干燥脂质膜之前，由在氯仿中混合并在氩气下蒸发的1.5μmol脂质(DOPC:DOPG:MPE-PE＝40:10:50)制备交联的多层脂质体。将脂质膜在pH 7.0的10mM Bis-Tris丙烷中重新水化。通过每10分钟剧烈涡旋(进行1h)将脂质(有或无SCH58261)混合后，对其进行4个循环的15秒超声处理(Misonix Microson XL2000，Fanningdale，NY)，并在每个循环后以1分钟的间隔静置于冰上。加入终浓度10mM的MgCl2以诱导二价触发的囊泡融合(divalent-triggered vesicle fusion)。多层囊泡(cMLV)的交联通过在37℃下以1.5mM的终浓度加入二硫苏糖醇(DTT，Sigma-Aldrich)1h进行。通过以
14,000g离心4分钟收集交联的多层囊泡，并用PBS洗涤两次。在先前的研究中，通过低温电子显微镜进行并确认囊泡的多层结构的形态学分析。通过动态光散射(Wyatt Technology，Santa Barbara，CA)测量cMLV的流体动力学尺寸。在进行分析前，将颗粒悬浮在经过滤的水中、涡旋并超声处理。有关小分子负载效率以及释放动力学的详细信息包含在补充方法中。

[0125] 纳米颗粒与细胞的缀合以及原位PEG化

[0126] 基于Stephan等(2010)中提供的方法进行纳米颗粒与细胞的化学缀合。我们将10×106个细胞/mL重悬于无血清的X-vivo 15培养基(Lonza)中。然后，将等体积的纳米颗粒以不同的纳米颗粒与T细胞的缀合比例重悬于无核酸酶的水中，并在37℃下孵育。每10分钟将细胞和纳米颗粒混合，总持续时间为30分钟。在PBS洗涤以从细胞中分离未结合的纳米颗粒后，我们在37℃下在TCM中将每mL 10×106个细胞与1mg ml-1硫醇封端的2-kDa PEG孵育30分钟，以淬灭细胞结合颗粒上残留的马来酰亚胺基团。我们进行了两次PBS洗涤以除去未结合的PEG。

[0127] 为对细胞结合的颗粒进行定量，在缀合之前用脂质样荧光染料1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚二碳菁(DiD)对颗粒进行荧光标记，并用流式细胞仪和荧光酶标仪对颗粒进行荧光检测。使用共聚焦显微镜进一步将DiD标记的cMLV和CFSE标记的CAR-T细胞的表面缀合可视化。

[0128] 细胞毒性测定

[0129] 按照先前在Kochenderfer等(2009)中所描述的，进行改进版本的细胞毒性测定。将SKOV3细胞和K562细胞(非靶标)以1.5×106个细胞/mL的浓度悬浮于TCM中，并用荧光染料5-(和-6)-{[(4-氯甲基)苯甲酰基]氨基}四甲基罗丹明(CMTMR)(Invitrogen)以5μM的浓度进行染色。将细胞混合并在37℃下孵育30分钟。洗涤细胞，重悬于TCM中并在37℃下孵育
60分钟。然后，将细胞洗涤两次并重悬于TCM中。将靶细胞(SKOV3-CD19+细胞和K562-CD19+细胞)以1×106个细胞/mL悬浮于PBS+0.1％BSA中，并用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)(Invitrogen)以1μM的浓度进行染色。将细胞在37℃孵育10分钟，并通过在室温下加入与细胞悬浮液的体积相等的体积的FBS 2分钟来终止标记反应。将细胞洗涤并重悬于TCM中。

[0130] 洗涤未转导的PBMC和CAR T细胞(效应细胞)并以5×106个细胞/mL悬浮于TCM中。将缀合cMLV和未缀合cMLV的CAR T细胞的细胞毒性与用作阴性对照的未转导的PBMC的细胞毒性进行比较。

[0131] 将培养物在无菌96孔圆底板(Corning)中以20:1、10:1、5:1和1:1的T细胞:靶细胞(即效应物:靶标，E:T)比例设置为三个平行实验。每个培养含有50,000个SKOV3(非靶标)细胞和50,000个SKOV3-CD19+(靶标)细胞。混合后，将培养物以1000rpm离心30秒以压紧细胞，然后在37℃孵育4小时。孵育后立即按制造商的建议加入7AAD(7-氨基-放线菌素D)(BD Pharminogen)。通过流式细胞术对荧光进行分析。细胞的细胞毒性计算为[CFSE+7AAD+细胞/(CFSE+7AAD-+CFSE+7AAD+)细胞]。

[0132] 侵袭迁移测定(Transmigration assay)

[0133] 在直径24mm、孔径3μm的Transwell板(Costar)中进行T细胞侵袭迁移测定。将缀合cMLV和未缀合cMLV的CAR T细胞(0.5×106个/孔)铺设在上部孔中，并将TCM加入下部孔中。将T细胞化学引诱物CXCL-9(0.1mg/ml，Preprotech)加至下部孔。在37℃孵育6小时后，对已迁移至下室中的T细胞进行计数。

[0134] 预防研究的体内异种移植实验

[0135] 如上所述，将SKOV3.CD19肿瘤植入NSG小鼠中。在建立肿瘤后，将小鼠随机分配到各个处理组。使用卡尺测量肿瘤生长并使用公式(宽度2×长度)/2进行计算。在处理后第2天和第14天处死每组的3只小鼠。收获来自每只小鼠的肿瘤和脾，用于进一步的离体分析。

[0136] 对应于图5G，将PBS溶液中总计3×106个SKOV3-CD19+细胞注射至NOD/scid/IL2rγ-/-(NSG)小鼠侧腹部中。在建立肿瘤(100mm3-150mm3)后，将小鼠随机分配并接受以下处理：(i)盐水或PBS、(ii)CAR T细胞、(iii)缀合至空cMLV的CAR T细胞以及(iv)缀合至载有SCH58261的cMLV的CAR T细胞。在所有CAR T细胞处理组小鼠中，向小鼠输注5×106个CAR T细胞(50％转导)。使用卡尺监测和测量肿瘤，并使用公式(宽度2×长度)/2计算肿瘤体积。在过继CAR T细胞转移后第2天和第14天处死每组的5只小鼠。收获并处理来自每只小鼠的肿瘤、脾和血液。将肿瘤和脾进行显微切割并通过70μm尼龙网。将脾和血液样品中的红细胞裂解。将来自单细胞悬浮液的总计0.5×106个细胞置于圆底96孔板(Coming)中，并用抗人CD45、CD3、CD4和CD8抗体进行染色，以评估过继转移的CAR T细胞的浸润量。

[0137] 挽救研究的体内异种移植实验

[0138] 如上所述，将SKOV3.CD19肿瘤植入NSG小鼠中。在建立肿瘤后，向所有小鼠注射3×106个CART.tEGFR细胞。在初始过继CAR-T细胞转移后10天，将小鼠随机分配以接受以下处理：(1)PBS、(2)CAR-T细胞、(3)缀合至空cMLV的CAR-T细胞(CART.cMLV)、(4)CAR-T细胞和cMLV(SCH)的混合物(CART+cMLV(SCH))以及(5)缀合至载有SCH的cMLV的CAR-T细胞
6
(CART.cMLV(SCH))。向每只小鼠注射2.5×10个CAR阳性T细胞。对于用未缀合的cMLV处理的小鼠，将109个载药cMLV与CAR-T细胞共同输注。在第二过继T细胞转移后48小时处死小鼠。收获脾和肿瘤用于离体测定。

[0139] 对应于图10A和图10B，将PBS溶液中总计3×106个SKOV3-CD19+细胞注射至NOD/3 3
scid/IL2rγ-/-(NSG)小鼠侧腹部中。在建立肿瘤(100mm-150mm)后，向所有小鼠注射20×
106个CAR T细胞。在初始过继CART细胞转移后10天，将小鼠随机分配并接受以下处理：(i)盐水或PBS、(ii)CAR T细胞、(iii)缀合至空cMLV的CAR T细胞以及(iv)缀合至载有SCH58261的cMLV的CAR T细胞。在所有CAR T细胞处理组小鼠中，向小鼠输注5×106个CAR T细胞(50％转导)。在第二过继T细胞转移后48小时处死小鼠。收获脾和肿瘤用于离体测定。
为评估T细胞浸润程度，将肿瘤和脾进行显微切割并通过70μm尼龙网。将来自单细胞悬浮液的总计0.5×106个细胞置于圆底96孔板(Corning)中，并用抗人CD45、CD3、CD4和CD8抗体进行染色，以评估过继转移的CAR T细胞的浸润量。

[0140] 离体TIL分析

[0141] 进行3项分析：CAR-T细胞中的(1)抗CD3/抗CD28诱导的细胞内IFN-γ细胞因子染色、(2)磷酸-CREB以及(3)Ki-67表达。对于细胞内IFN-γ染色，用人CD3/CD28抗体和10ng/mL布雷菲德菌素A对总计0.5×106个细胞进行刺激。将培养物在37℃下在96孔圆底板中孵育6小时。使用荧光团缀合的人CD3、CD45、CD4和CD8抗体用于免疫染色。根据制造商的说明使用Cytofix/Cytoperm溶液(BD Bioscience)对细胞膜进行透化并进行细胞内染色。

[0142] 对于细胞内磷酸-CREB染色，用4％多聚甲醛(PFA)固定细胞，然后在冰上在甲醇中进行30分钟透化。然后将细胞用Alexa488缀合的抗人磷酸化CREB在4℃下染色30分钟。使用Miltenyi Biotec(Auburn，CA)的仪器进行流式细胞术分析。

[0143] 对于Ki-67染色，以80％乙醇将用荧光团缀合的人CD3、CD45和EGFR染色的细胞固定，并在-20℃孵育48小时。用染色缓冲液(含有1％FBS、0.09％NaN3的PBS)将细胞洗涤两7
次，以200×g离心10分钟并重悬至10个细胞/mL的浓度。然后将细胞用抗Ki-67抗体在室温下于黑暗中染色30分钟，用染色缓冲液洗涤两次，以200×g离心5分钟，并通过流式细胞术进行分析。

[0144] 对应于图5L和图5M，在两种不同测定中进行功能分析：TIL中的(i)通过细胞内细胞因子染色测定的CD3和CD28诱导的IFN-γ表达、(ii)磷酸化CREB表达。将来自单细胞悬浮液的总计0.5×106个细胞置于圆底96孔板中，并用OKT3、抗人CD28抗体和10ng/mL布雷菲德菌素进行刺激。将培养物在37℃下孵育6小时。孵育后，用抗人CD3、CD45和CD8抗体对细胞进行标记。然后在4℃下将细胞在100μl Cytofix/Cytoperm溶液(BD Bioscience)中进行20分钟透化，用Perm/Wash缓冲液(BD Bioscience)洗涤，并在4℃下用PE缀合的抗人IFN-γ进行染色30分钟。使用BD Biosciences的FACSort仪器进行流式细胞术分析。

[0145] 体内荧光共聚焦成像和体内生物分布研究

[0146] 对于体内纳米颗粒生物分布研究，使用异种移植肿瘤模型。为建立肿瘤，将PBS溶液中的SKOV3.CD19细胞皮下注射至NOD/scid/IL2Rγ-/-(NSG)小鼠侧腹部中。将DiD标记的cMLV(cMLV)、与DiD标记的cMLV混合的CD19 CART细胞(5×106)(CART+cMLV)、与DiD标记的cMLV表面缀合的CD19 CAR-T细胞(5×106)(CART.cMLV)或PBS静脉内注射至携带肿瘤的小鼠内。24小时和48小时后，用剪刀将指定组织取出、称重并浸渍。由对分组不知情的USC成像中心的科学家使用Xenogen IVIS光谱成像系统对每个器官的DiD特异性组织荧光(Abs 644nm，Em 665nm)进行定量，并计算每克组织注射剂量的百分比(ID％/g)。

[0147] 对应于图3C，将表面缀合有DiD标记的纳米颗粒的CD19+CAR T细胞(10×106)静脉内注射至携带SKOV3 CD19+肿瘤的NOD/scid/IL2rγ-/-(NSG)小鼠中。48小时后，用剪刀将指定组织取出、称重并浸渍。我们使用荧光光学成像系统对每个器官的特异性DiD组织荧光进行定量，并计算荧光信号与背景的比例作为最终读出。

[0148] 对于体内共聚焦成像，使用配备有60×/1.49 Apo TIRF油物镜和Cascade II：512 EMCCD照相机(Photometrics，Tucson，AZ，美国)的Nikon eclipse Ti-E显微镜在Yokogawa转盘共聚焦扫描仪系统(Solamere Technology Group，Salt Lake City，UT)上获得荧光图像。使用AOTF(声光可调谐滤波器)控制的激光合并系统(Solamere Technology Group Inc.)在以下每条激光线上提供照明功率：491nm、561nm和640nm固态激光(每种激光50mW)。为标记脂质体颗粒，将DiD亲脂性染料以0.01:1(DiD:脂质)的比例加入至氯仿中的脂质混合物，并在氩气下蒸发脂质混合物中的有机溶剂，以将DiD染料掺入囊泡的脂质双层中。

[0149] 肿瘤部位积聚的纳米颗粒的定量

[0150] 如上所述，将SKOV3.CD19肿瘤植入NSG小鼠中，并将CFSE标记的CAR-T细胞和DiD标记的cMLV注射至携带肿瘤的小鼠中。在指定的时间将肿瘤切除、固定、冷冻、进行冰冻切片并固定至载玻片上。使用Zeiss 700共聚焦激光扫描显微镜(倒置)(Carl Zeiss，Germany)对CFSE标记的CAR-T细胞和DiD标记的cMLV的荧光进行可视化。使用Zeiss Zen显微镜软件进行定量分析。

[0151] 将肿瘤切除、固定、冷冻、进行冰冻切片并固定至载玻片上。

[0152] 离体肿瘤内PTX浓度测量

[0153] 如先前所详述的，使用高效液相色谱(HPLC)对冷冻肿瘤组织中的PTX浓度进行定量(35)。简言之，将解冻的肿瘤组织在乙酸乙酯中进行匀浆，向每个样品中加入已知浓度的对照药物作为内标。将样品离心并将有机层转移至干净管中。在氩气流下将有机层蒸发并在稀释的乙腈中重新水化。在HPLC上运行样品后，对峰高进行分析以确定肿瘤内SCH浓度。

[0154] 统计

[0155] 用学生t检验确定两组之间的差异。用单因素方差分析(ANOVA)确定3组或更多组之间的差异。

[0156] 体外药物包封和释放曲线

[0157] 通过C-18RP-HPLC色谱(Backman)测定包封在cMLV(SCH)中的SCH的量。通过加入水和乙腈将cMLV(SCH)悬浮液稀释至0.5ml的总体积。通过加入5ml叔丁基甲基醚以及通过涡旋1分钟将样品混合来完成SCH的提取。然后将混合物离心并将有机层转移至玻璃管中，并在氩气下蒸干。使用缓冲液A(95％水、5％乙腈)使干燥的有机层重新水化。为确定SCH浓度，将1ml溶液注入C18柱中，并在392nm处检测SCH(流速1ml/min)。通过每天从在37℃下在含有10％胎牛血清(FBS)的培养基中孵育的cMLV中移除释放的培养基，并用新鲜培养基将其替换来研究SCH从cMLV释放的释放动力学。每天对移除的培养基的SCH荧光进行定量(通过HPLC)。为在细胞缀合之前和之后获得SCH从cMLV释放的释放动力学，每天在37℃下将cMLV(SCH)和CART.cMLV(SCH)在含有10％FBS的培养基中孵育并离心，并用新鲜培养基重悬浮。
每天通过HPLC从收获的培养基中对SCH进行定量。

[0158] 实施例2

[0159] 纳米颗粒稳定附着至细胞表面

[0160] 为提高CAR工程化T细胞疗法的功效，我们使用CAR-T细胞作为伴侣以携带载有SCH-58261(一种可抑制TME中免疫抑制机制的药物)的纳米颗粒。为在T细胞上表达CAR，用慢病毒载体对激活的人PBMC进行转导，以递送由CD28和CD3ζ细胞内信号传导结构域所组成的抗CD19 CAR。表面CAR表达的FACS分析显示50％的转导效率(图9)。

[0161] 合成的cMLV纳米颗粒经由脂质双层表面上存在的硫醇反应性马来酰亚胺头基稳定偶联至存在于细胞表面上的还原的硫醇基团。根据先前的报道，在T细胞、B细胞和造血干细胞(HSC)表面上检测到高水平的游离硫醇。缀合以两步进行。首先，将具有马来酰亚胺官能化脂质的cMLV和CAR-T细胞进行共孵育以允许cMLV偶联至细胞表面上的游离硫醇。在初始偶联反应后，缀合细胞经历原位聚乙二醇化以淬灭残留的反应基团(图1A)。为确定每个T细胞可缀合的最大颗粒数，我们进行了纳米颗粒的连续稀释以在不同比例(5000:1、1000:1、500:1、250:1和100:1)下进行缀合。在1000:1的比例下，cMLV的缀合达到饱和点，导致每个细胞为平均287±49个表面结合的纳米颗粒(图1B和表1)。

[0162] 纳米颗粒在T细胞群上的平均缀合效率为55.9％(图1C和图1D)。此外，CART.cMLV的单细胞成像和三维重建证明了纳米颗粒分布在细胞表面上的数个簇中(图1E)。

[0163] 表1：在不同缀合比例下每个T细胞的缀合纳米颗粒(cMLV)数量

[0164]缀合比例 5000:1 1000:1 500:1 250:1 100:1
每个细胞的cMLV数量 315±48 287±49 132±27 7±0 0±0

[0165] 与纳米颗粒缀合的CAR-T细胞维持T细胞效应物功能

[0166] 我们接下来试图测试表面结合的cMLV是否可影响CAR-T细胞的关键细胞功能，如细胞的细胞因子分泌、细胞毒性和迁移。将有和无cMLV缀合的CART细胞与SKOV3.CD19或K562.CD19靶细胞进行4小时共培养。用SKOV3.CD19靶细胞刺激的CART和CART.cMLV分别诱导了17.05±0.07％和19.15±1.63％的IFN-γ+T细胞群，表明CART和CART.cMLV都能够以相似的效率分泌IFN-γ(图2A和图2B)。当以DiD染料标记cMLV时，有和无表面缀合的cMLV的两种细胞均分泌IFN-γ(图10)。此外，cMLV的表面缀合未降低针对SKOV3.CD19细胞(图2D)或K562.CD19细胞(图2C)的CAR-T细胞的细胞毒性。最后，我们对CAR-T细胞的体外侵袭迁移能力进行了评价。类似百分比的缀合和未缀合的细胞迁移至transwell共培养系统的下室，表明CART.cMLV细胞维持了其侵袭迁移能力(图2E、图2F)。因此，cMLV的细胞表面缀合不妨碍对靶细胞的识别、IFN-γ分泌、细胞的细胞毒性或迁移。

[0167] 与CAR-T细胞的缀合增强cMLV的肿瘤定位和全身循环

[0168] 为确定cMLV与CAR T细胞的缀合是否可改善纳米颗粒积聚至肿瘤部位，我们通过合成含有DiD染料的cMLV进行了生物分布测定。将单独的DiD标记的cMLV(cMLV(DiD))、与CAR-T细胞混合的DiD标记的cMLV(CART+cMLV(DiD))或与CAR-T细胞缀合的DiD标记的cMLV(CART.cMLV(DiD))静脉内注射至携带SKOV3.CD19肿瘤的NSG小鼠中，并在不同器官中对DiD标记的cMLV的积聚进行监测。在24小时，与cMLV组和CART+cMLV组相比较，CART.cMLV(DiD)组在肿瘤(p<0.001)、脾(p<0.001)、淋巴结(p<0.01)和肺(p<0.01)中检测到显著更高的cMLV积聚。在任何组织中未观察到cMLV(DiD)组和CART+cMLV(DiD)组之间cMLV积聚的显著差异。另外，在24小时任何组中的循环血液中未检测到DiD信号的显著差异(图3A)。在48小时，与cMLV(DiD)组和CART+cMLV(DiD)组二者相比较，CART.cMLV(DiD)显示出在血液(p<0.05)、肿瘤(p<0.05)、脾(p<0.05)和肺(p<0.05)中更高的cMLV积聚(图3B)。值得注意的是，与24小时(p<0.05)和48小时(p<0.001)的cMLV(DiD)组和CART+cMLV(DiD)组二者相比较，CAR-T细胞与cMLV的缀合导致肝中显著降低的cMLV积聚。

[0169] 将脂质体在输注前缀合至CAR T细胞或作为游离脂质体输注。48小时后，将小鼠处死并将器官(即肿瘤、肝、脾、血液、肾、肺、心脏和淋巴结)分离以进行光学显微镜检查。结果显示，在每个器官(除肿瘤之外，在肿瘤中，与游离脂质体相比较，缀合至CAR T细胞的脂质体显示了显著更高的归巢)中，游离脂质体和缀合脂质体的归巢之间差异不显著(图3C)。这证实了我们的假设，即cMLV与CAR T细胞的缀合将增强脂质体的肿瘤定位。

[0170] 表面缀合的cMLV在肿瘤块内与CAR-T细胞共定位

[0171] 我们接下来通过用缀合或未缀合cMLV的荧光标记的CAR-T细胞处理的SKOV3.CD19肿瘤组织学切片的共聚焦成像来对载体CAR-T细胞的肿瘤浸润性质进行评价。代表性共聚焦图像证明cMLV的表面缀合未阻碍肿瘤内CAR-T细胞迁移。CART.cMLV和CART+cMLV都具有类似的T细胞浸润(图4A、图4B)。经CART.cMLV和CART+cMLV处理的肿瘤中CAR-T细胞的密度分别为0.26±0.1个细胞/mm2和0.35±0.2个细胞/mm2。然而，仅在以CART.cMLV处理的肿瘤内观察到CAR-T细胞和cMLV的共定位。与经CART+cMLV处理的肿瘤中未检测到共定位相比较，经CART.cMLV处理的肿瘤中的共定位百分比为78.57±26.7％(图4C、图4D)。这些结果表明cMLV与CAR-T细胞的缀合能够增加递送至肿瘤的cMLV的量，而不会阻碍T细胞的迁移。

[0172] 与包封A2aR拮抗剂的纳米颗粒缀合的CAR-T细胞在体内显示改善的抗肿瘤应答[0173] 为测试A2a受体(A2aR)的药理学抑制是否会防止富含腺苷的TME中的CAR-T细胞功能减退，我们对体内T细胞浸润和肿瘤生长进行了监测。如图5A所示，将携带SKOV3.CD19肿瘤的小鼠分为6个不同的组。所有处理组中的动物均显示了肿瘤进展。当与PBS处理组相比较时，CART、CART.cMLV、CART+cMLV(SCH)和CART.cMLV(SCH)处理组从ACT后第2天至第17天显示了统计学显著的肿瘤生长控制(图5B和表2)。与其它处理组相比较，CART.cMLV(SCH)处理证明了最显著的肿瘤生长抑制，导致ACT后所有天数测量的肿瘤显著更小(图5B)。因此，与CART(p<0.0001，log-rank检验)、CART.cMLV(p<0.0001，log-rank检验)以及CART+cMLV(SCH)(p＝0.0008，log-rank检验)处理组相比较，CART.cMLV(SCH)处理显著改善了小鼠存活。CART、CART.cMLV、CART+cMLV(SCH)和CART.cMLV(SCH)分别具有处理后22天、22天、24天和36天的中位存活期(median survival)(图5C)。PBS处理和cMLV处理均具有22天的中位存活期。与PBS组和cMLV组相比较，仅有CART.cMLV(SCH)处理显著改善了中位存活期(对于PBS，p＝0.0003；对于cMLV，p＝0.0002；log-rank检验)。

[0174] 表2.与PBS对照相比较在每个时间点的肿瘤生长曲线的统计分析

[0175]

[0176] 为探究SCH如何影响肿瘤浸润T细胞，我们分析了T细胞植入和功能性(engraftment and functionality)。在处理后第2天对肿瘤中的CD3+和CD45+T细胞植入进行评价。与CART(15.06±1.2％，p＝0.0134)、CART.cMLV(15.36±1.9％，p＝0.0139)和CART+cMLV(SCH)(16.93±0.6％，p＝0.0157)处理组相比较，CART.cMLV(SCH)具有更高的T细胞植入(52.96±15.5％)(图5D)。此外，我们对体内暴露于富含腺苷的免疫抑制性TME的肿瘤浸润T细胞的功能性进行了评价。与CART(MFI＝335.8±91.2，p＝0.0023)、CART.cMLV(MFI＝307.57±53.6，p＝0.0004)和CART+cMLV(SCH)(611.52±26.21，p＝0.0118)处理组相比较，CART.cMLV(SCH)处理组在CD45+T细胞中显示了显著更高的细胞内IFN-γ表达(MFI＝
744.24±45.3)。与CART(p＝0.0073)和CART.cMLV(p＝0.0009)处理相比较，游离cMLV(SCH)处理组CART+cMLV(SCH)也导致增加的IFN-γ表达，但这一水平低于在CART.cMLV(SCH)处理中观察到的水平(图5E)。

[0177] 为确定肿瘤浸润T细胞的功能保留是否至少部分是A2a受体阻断的结果，我们对分离的T细胞上A2aR下游的磷酸化CREB水平进行了测试。我们的数据显示，与从CART+cMLV(SCH)处理组和CART.cMLV(SCH)处理组收获的T细胞相比较，来自CART处理组和CART.cMLV处理组的CD45+T细胞具有显著更高的磷酸化CREB，表明从表面工程化CAR-T细胞释放的SCH可阻断由TME中的腺苷介导的A2a受体信号传导。值得注意的是，与CART+cMLV(SCH)相比较，CART.cMLV(SCH)导致较低的磷酸化CREB(p<0.0001)(图5F)。总之，与游离cMLV(SCH)处理相比较，cMLV(SCH)与CAR-T细胞的缀合显著延长了肿瘤生长抑制，表明了阻断A2a受体途径和防止CAR-T细胞功能减退的更高效率。

[0178] 对应于图5G，用经工程化以过表达CD19靶标的卵巢癌细胞(SKOV3-CD19+)对小鼠进行接种。一旦肿瘤达到100mm3-150mm3，将5×106个CAR T细胞(未缀合或与cMLV缀合或与载有小分子抑制剂的cMLV缀合)经由尾静脉注射过继转移。用PBS处理携带肿瘤的阴性对照小鼠。在整个实验期间，阴性对照未显示对肿瘤生长的任何控制。CART组和CART-Emp组在过继转移后的前7天内显示出轻微控制，但在第7天后生长进展与阴性对照组一样快。值得注意的是，实验组CART-SCH在整个实验中显示了显著的肿瘤生长控制。在过继转移后第14天，CART-SCH的肿瘤尺寸为265±43mm3。PBS、CART和CART-Emp第14天的平均肿瘤尺寸分别为859(±245)mm3、759(±263)mm3和649(±48)mm3(图5G)。

[0179] 在过继T细胞转移后第2天和第14天对T淋巴细胞向肿瘤和脾的植入进行评价。在过继转移后第2天，在肿瘤和脾中均检测到CD3+CD45+T细胞。CART-SCH(5.37％±0.52)具有显著高于CART(2.98％±0.46)和CART-Emp(3.26％±0.51)的T细胞植入(图5H)。另一方面，脾中的T细胞植入在CART组(0.03％±0.03)、CART-Emp组(0.13％±0.02)和CART-SCH组+ +(0.22％±0.06)之间未显示任何显著差异(图5I)。在过继转移后第14天，CD3CD45T细胞在肿瘤和脾中仍均存在。CART-SCH(8.16％±0.62)具有显著高于CART(5.0％±0.45)和CART-Emp(5.26％±0.39)的T细胞植入(图5J)。在过继转移后第14天，与CART(5.29％±0.75)和CART-Emp(5.27％±0.32)相比较，用CART-SCH处理的小鼠脾中的T细胞植入显著更高(10.35％±1.6)(图5K)。

[0180] 为在T细胞浸润至肿瘤后立即对其功能性进行评价，我们进行了离体TIL再刺激测定，以对暴露于高腺苷免疫抑制微环境后T细胞效应物功能的降低进行评价。将效应物功能与阳性对照(接受每只小鼠5×106个细胞的过继T细胞转移的非肿瘤携带小鼠的脾细胞)进行比较。在过继转移后第2天，用抗人CD3/CD28刺激实验组(PBS、CART、CART-Emp和CART-SCH)的TIL和阳性对照的脾细胞，并针对细胞内IFN-γ细胞因子分泌而染色。值得注意的是，在过继细胞转移后48小时，与阳性对照相比较，所有实验组的TIL均已显示功能下降。与CART(MFI 612±20)和CART-Emp(MFI 788±138)处理组相比较，接受CART-SCH处理的组的TIL具有显著更高的细胞内IFN-γ分泌(MFI 3733±781)(图5L)。

[0181] 为确定TIL功能的保留是否是由于用小分子抑制剂SCH阻断了A2A受体，我们检测了环AMP响应元件结合蛋白(CREB)的细胞内磷酸化水平。腺苷与A2AR的结合激活G蛋白偶联受体，这导致cAMP(其为cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)的上游信号传导元件)积累。PKA在其基础状态下作为成对的调节亚基(R)和催化亚基(C)的非活性异四聚体存在于细胞质中。cAMP的上调释放C亚基，其被动扩散至核中并在丝氨酸残基133处磷酸化CREB。因此，遇到腺苷的T淋巴细胞将具有上调的cAMP，其进一步诱导CREB磷酸化。相反，用拮抗剂成功阻断A2A受体将防止cAMP的细胞内积聚，其导致较低的CREB磷酸化。我们的数据显示了，与CAR-SCH处理组的TIL相比较，CAR处理组和CAR-Emp处理组的TIL具有显著更高的磷酸化CREB(图5M)。

[0182] 与包封A2aR拮抗剂的纳米颗粒缀合的CAR-T细胞能够在体内挽救功能减退的肿瘤驻留T细胞

[0183] 虽然肿瘤浸润CAR-T细胞可迁移至肿瘤块中，但在进入富含腺苷的肿瘤微环境后其倾向于逐渐丧失肿瘤杀伤和炎性细胞因子分泌能力。我们假设通过用SCH阻断A2aR信号传导，功能减退的肿瘤驻留T细胞可恢复其效应物功能。为证明我们的缀合系统在该应用中的潜力，我们通过将表达截短的表皮生长因子受体(tEGFR)的CD19 CAR-T细胞初始静脉内输注至携带肿瘤的小鼠中，建立了在TME中具有功能减退的肿瘤驻留CAR-T细胞的体内模型(图11A)；这些CAR-T细胞被命名为CART.tEGFR。使用EGFR表面标志物来追踪功能减退的肿瘤驻留CAR-T细胞的初始群，使我们能够将其与随后的缺乏EGFR的表面工程化CAR-T细胞处理剂量区分开来。在初始CART.tEGFR细胞转移后10天，将挽救处理输注至5个不同组的小鼠(图6A)。

[0184] 处理后2天，接受CART.cMLV(SCH)处理的6只携带肿瘤的小鼠中的5只显示肿瘤尺寸减小超过50％，1只小鼠显示减小44％。CART+cMLV(SCH)联合处理组在6只小鼠中的2只中显示肿瘤尺寸减小超过25％。接受CART或CART.cMLV的携带肿瘤的小鼠的肿瘤尺寸无显著降低，接受PBS处理的携带肿瘤的小鼠显示了肿瘤尺寸的整体增加(图6B、图11C和图11D)。从肿瘤中将肿瘤浸润T细胞(包括CAR阳性细胞)分离，用于进一步离体分析。如图6D所示，CART.cMLV(SCH)处理导致10.79±0.3％的总T细胞群，其显著高于所有其它处理组(CART、CART.cMLV和CART+cMLV(SCH)，p<0.001)。

[0185] 我们进一步研究了这些处理对初始的功能减退的CART.tEGFR细胞的影响。用CART、CART.cMLV和CART+cMLV(SCH)处理的肿瘤分别具有25.65±2.8％、25.35±0.5％和28.90±3.1％的肿瘤内CART.tEGFR，而经CART.cMLV(SCH)处理的肿瘤具有63.08±5.8％的CART.tEGFR细胞，显著高于所有其它组(p<0.001)(图6C和图6E)。通过Ki-67表达对CAR-T细胞增殖进行了评估。与以下其它处理组相比较，CART.cMLV(SCH)显示了显著更高的Ki-67表达水平(MFI＝3442.4±272.3)：CART(MFI＝1066.1±253.5，p＝0.0004)、CART.cMLV(MFI＝
1162.5±129.5，p＝0.0002)和CART+cMLV(SCH)(MFI＝1044.32±224.8，p＝0.0003)(图
6F)。

[0186] 接下来，我们对这种以CART为伴侣的药物在恢复功能减退的CART.tEGFR群的炎性功能中的能力进行了评价。CART.cMLV(SCH)处理组显示了比CART、CART.cMLV或CART+cMLV(SCH)组显著更高的CART.tEGFR细胞中的IFN-γ分泌(p<0.001)(图6G)。对CART.tEGFR细胞中pCREB表达水平的评价显示，与CART、CART.cMLV和CART+cMLV(SCH)处理组相比较，CART.cMLV(SCH)处理显著降低了CART.tEGFR细胞群中的pCREB水平(p<0.001)(图6H)。总之，此总体性证据表明，表面工程化CART系统可将A2AR的小分子抑制剂有效递送至TME，从而在体内挽救功能减退的肿瘤驻留T细胞。

[0187] 对应于图8，在肿瘤微环境中已存在TIL的情况下，为了挽救TIL功能减退，我们利用与cMLV缀合的CART细胞作为递送系统以在肿瘤微环境中释放A2AR拮抗剂(根据图8的方案)。如我们先前所示(图5L和图5M)，TIL在进入富含腺苷的肿瘤微环境后几乎立即具有降低的功能性。虽然它们仍植入肿瘤内，但已丧失了其细胞毒性、增殖能力和炎性细胞因子分泌。虽然不希望受任何特定理论的束缚，通过用小分子抑制剂干扰腺苷-A2AR激活，我们假设功能减退的TIL将恢复其效应物功能(如细胞毒性、增殖和炎性细胞因子分泌)。为证明CART-cMLV缀合系统在该应用中的潜力，我们用SKOV3-CD19+接种NSG小鼠并用15×106个CAR T细胞处理所有携带肿瘤的小鼠。CAR T细胞的初始过继转移的目的是在肿瘤微环境中建立功能减退的TIL。尽管在T细胞浸润至肿瘤部位后功能性几乎立即下降，我们允许在10天后进行第二过继细胞转移以及不同处理-即PBS、CART、CART-Emp和CART-SCH(每只小鼠5×106个细胞)。处理后48小时处死小鼠以对TIL效应物功能进行分析(图6I)。

[0188] 含有A2A受体拮抗剂(SCH58261)的cMLV与初始过继转移的CAR T细胞的缀合能够在处理后48小时内通过促进TIL增殖和改善效应T细胞功能而诱导肿瘤尺寸减小。与未经处理的携带肿瘤的小鼠相比较，初始过继CAR T细胞转移(在第0天，如图6I所示)未显著控制肿瘤生长(图6J)。值得注意的是，在第二过继CAR T细胞疗法后48小时，接受CART-SCH的携带肿瘤的小鼠显示了与处理前相比较肿瘤尺寸1/2倍的减小(图6J)。接受CART或CART-Emp的携带肿瘤的小鼠在过继细胞转移后48小时显示肿瘤尺寸非显著性减小；并且，在第二轮处理中接受PBS的携带肿瘤的小鼠显示了肿瘤尺寸的增加(图6J)。总体而言，在第二输注中仅在用CART-SCH处理的组中观察到肿瘤尺寸的显著减小。

[0189] 我们进一步研究了第二细胞输注处理对肿瘤中CD3+CD45+T淋巴细胞群的影响。用抗人CD3和CD45抗体对从肿瘤组织分离的细胞离体进行染色。用CART-SCH处理的小鼠肿瘤显示在肿瘤中39.27％(±6.57)的T细胞植入，其为在CART和CART-Emp处理组的肿瘤中发现的T细胞百分比(分别为19.04％(±8.63)和17.82％(±8.31))的两倍(图6K)。在第二轮处理中仅接受PBS的组仍具有T细胞植入(6.09％±1.68)，但该百分比低于接受第二轮CART输注的其它组(图6K和图6M)。此外，我们测定了来自各组的T淋巴细胞中的CD8与CD4的比例，发现用CART-SCH处理诱导了高CD8/CD4比例(1.24±0.05)或偏向CD8的T细胞群。相反，PBS、CART和CART-Emp处理导致偏向CD4的群，其CD8/CD4比例分别为0.427±0.15、0.56±0.17和0.49±0.08(图6L)。

[0190] 接着，在离体测定中对TIL的效应物功能进行评估，其中用CD3/CD28抗体重新刺激T淋巴细胞以诱导炎性细胞因子分泌，并检测细胞内IFN-γ表达。使用接受CART细胞输注的无肿瘤小鼠的脾细胞作为阳性对照。与CART和CART-Emp相比较，CART-SCH处理组显示了显著更高的IFN-γ分泌，但与阳性对照相比较，每组的TIL均显示了功能下降(图6N)。

[0191] 还进行了对T淋巴细胞中磷酸化CREB的评价，以确定小分子抑制剂干扰A2A受体活性。使用来自PBS处理组的TIL作为阴性对照(因为这些T淋巴细胞显示功能减退的特征)，其中T细胞具有受抑制的效应物功能。来自PBS组的这些功能减退的TIL显示了高度磷酸化的CREB。与CART处理组和阴性对照组二者相比较，用CART-SCH处理显著降低了磷酸化CREB水平(图6O)。使用cMLV-CART缀合系统以递送A2A受体的小分子抑制剂对在体内挽救功能减退的TIL是有效的。干扰经由A2A受体的腺苷激活恢复了T细胞效应物功能(例如肿瘤细胞杀伤(细胞毒性)和炎性细胞因子分泌)，这导致肿瘤尺寸减小和T淋巴细胞增殖。

[0192] 尽管实验已显示了相当多变的成功，对癌症的过继免疫疗法已在很长时间内受到关注。William Coley报道了首个表明免疫系统具有抗肿瘤作用的观察结果，其在19世纪90年代检测到严重细菌感染后肉瘤的消退。进行了研究以探究利用患者自身免疫系统抵抗疾病的可能性和程序，但成功是不可预测且零星的。CAR特异性T细胞对于临床开发已受到异常关注。在临床试验(其中将表达CAR的T细胞输注至患有B细胞恶性肿瘤、神经母细胞瘤和肉瘤的成人和小儿患者中)中证实了此方法的潜力。CAR T细胞疗法的成功限于血源性癌症。为改进先前的治疗方法，策略之一是全身输注佐剂以维持和增强过继输注的CAR T细胞的功能。

[0193] 与佐剂的联合疗法造成了多种并发症，如佐剂本身的有效性和伴随佐剂显示任何效果所需的高给予剂量而来的毒性。例如，IL-2输注是用于增强抗肿瘤免疫力的广泛研究的方法之一。每项研究都试图找到合适的给予途径、剂量和给予频率。Thompson等(1987)证明了静脉内给予和皮下给予时IL-2处理在处理后均未导致肿瘤消退，并且实际上减少了PBMC计数的数量。除无效外，还观察到副作用或毒性。患者表现出剂量限制性症状(如发烧、低血压和流感样症状)[29]。全身输液的毒性是研究者一直在研究以将其避免或将其最小化的一个主要问题。

[0194] 在过去十年中，脂质体或其它纳米颗粒(例如聚合物纳米颗粒)作为药物载体的利用已成为癌症疗法中有吸引力的递送方法。脂质体的合成已成为多种药物(例如高度疏水的多柔比星和紫杉醇)包封程序中的常见实践。脂质体的主要缺陷是其在引起化学治疗药物快速突发释放的血清成分存在下的不稳定性，由此限制了其用于化学治疗剂递送的效用。为改进传统的脂质体合成，Moon等(2011)和Joo等(2013)开发了合成交联的多层脂质体(cMLV)的方法，cMLV可降低全身毒性并提高治疗效果。此外，为增强纳米颗粒向特定肿瘤部位的递送，Stephan等(2010)证明了脂质体纳米颗粒与小鼠脾细胞和造血干细胞(HSC)表面的缀合在体外和体内均是稳定的，不引起免疫原性也不降低效应T细胞功能。

[0195] cMLV与CAR修饰的淋巴细胞或肿瘤特异性淋巴细胞的缀合是增强这些纳米颗粒的肿瘤特异性归巢的有效方法，并因此降低了由全身输注化学治疗药物和佐剂引起的毒性。已对结合细胞的纳米颗粒递送系统进行了多种应用测试。首先，它被用作抗肿瘤T细胞的靶向细胞因子支持物。使纳米颗粒负载促进体内T细胞增殖的IL-15和IL-21。该系统能够在7天的时间内释放生物活性细胞因子，并因此能够促进完全的肿瘤清除。在相同研究中，Stephen等(2010)还通过将GSK-3β小分子抑制剂封装为治疗性货物(cargo)以增强供体HSC的再增殖来对该系统继续进行测试。第三研究由Huang等(2015)进行，使纳米颗粒负载拓扑异构酶I毒物SN38并缀合至小鼠淋巴细胞以治疗淋巴结中的淋巴瘤。

[0196] 在本文中，我们证明了货物药物、蛋白质或肽未对治疗细胞产生毒性。在各种实施方式中，我们排除了其它人通常使用的一般而言用以消除肿瘤和组织的化学治疗药物的递送。

[0197] 基于Stephen等(2010)开发的纳米颗粒-细胞表面缀合的程序，我们开创了CAR工程化人PBMC作为具有缀合至表面的纳米颗粒的治疗细胞的应用。该纳米颗粒包封A2a受体的小分子抑制剂(例如SCH 58261，其高度疏水并且通常不适合全身输注)。我们的体外XTT测定显示，SCH 58261对PBMC或肿瘤细胞(SKOV3-CD19+)均无细胞毒性作用。因此，SCH 58261是用于说明该T细胞-纳米颗粒货物系统通过在同一单元中共同递送治疗细胞和佐剂而用于增强CAR T细胞疗法这一目的的优点的合适的药物。与阻断A2aR途径的其它组合物或系统(例如以CRISPR/Cas系统或受体siRNA敲减进行基因工程化的CAR-T细胞)相比较，本公开的组合物和方法的主要优点是药物影响内源性T细胞和循环CAR-T细胞以及载体CAR-T细胞本身的能力。

[0198] 在体外，我们证明了cMLV纳米颗粒可稳定地缀合至CAR-T细胞表面，同时保持其以持续方式释放所负载的药物的能力并且不破坏CAR-T细胞效应物功能。

[0199] 纳米颗粒成功地缀合在人PBMC表面上。Stephan等(2010)先前的研究表明，能够将140(±30)个约200nm的纳米颗粒稳定缀合至具有7.6μm的平均直径的小鼠脾细胞表面。另一方面，激活的PBMC能够以1000:1的纳米颗粒与T细胞的缀合反应比在表面上稳定缀合多至280(±30)个，并且随着我们将反应比增加至5000:1而不再增加。这归因于激活的PBMC的较大尺寸(其平均直径为10μm)。该缀合量不干扰效应T细胞功能，如T细胞迁移、细胞因子分泌和细胞的细胞毒性。根据我们的计算，每个缀合纳米颗粒的T细胞能够包封28ng SCH
58261，其中一半量将在缀合后的前48小时中释放。该量高于在Huang等(2015)中报道的每个缀合纳米颗粒的小鼠脾细胞包封的GSK-3β抑制剂SN-38的药物量(～0.4pg)。尽管其剂量高，载药纳米颗粒的缀合未显示针对T细胞的毒性，也未降低T细胞的效应物功能。

[0200] 我们的生物分布研究进一步显示了CAR-T细胞通过在体内将载药纳米颗粒主动引导至肿瘤部位(这一事件由CAR-T细胞通过肿瘤相关的趋化因子吸引而迁移至肿瘤块中的能力驱动)来增强治疗药物的功效。总体而言，CART.cMLV(DiD)在24小时和48小时在肿瘤部位均具有最高的颗粒积聚，再次强调了细胞介导的递送的重要性。此外，cMLV(DiD)和CART+cMLV(DiD)均导致肝(脂质体纳米颗粒通常在此被Kupffer细胞和内皮细胞从系统中清除)中显著更高的cMLV积聚，而CART.cMLV(DiD)则显示了肝中显著降低的cMLV积聚，在淋巴组织(如淋巴结)、脾和肺中则观察到增加的水平。这些数据提供了由于肝对纳米颗粒的清除降低而使得结合CAR-T细胞的纳米颗粒可比游离纳米颗粒在循环中保留更长的时间的证据。

[0201] cMLV与CAR T细胞的缀合允许纳米颗粒更有效地定位在肿瘤处。我们证明了与未缀合的纳米颗粒相比较，缀合的cMLV在肿瘤组织中具有显著更高的积聚。纳米颗粒的共同缺点是它们依赖于肿瘤微环境中血管的高渗透性和滞留效应(EPR)。这些血管以有缺陷的内皮细胞形成，其具有将纳米颗粒捕获在无适当淋巴引流的肿瘤基质中的分散的孔。因此，以纳米颗粒进行的癌症治疗利用此特性将癌症化学治疗剂递送至肿瘤微环境。然而，因此，肿瘤团块(bulk)(在此最为缺氧且不利于免疫监视)往往具有低血管化(其导致不良的疾病预后)的限制仍然存在。此外，EPR效应为异质性的，并且可能在一些肿瘤中完全缺乏，使纳米颗粒治疗无效。另一方面，CAR T细胞因其具有先天的迁移能力而不依赖于EPR效应，因此能够将缀合的货物递送至肿瘤块内。关于其它治疗上相关的组织(即肝、脾、肾、肺、心脏、淋巴结和血液)，尽管游离脂质体在除脾和肿瘤外的其它位置显示了略高的归巢，游离脂质体和结合CAR T细胞的脂质体之间无浸润量的显著差异。此外，如先前在Stephen等(2010)中报道的，我们的结果表明了脂质体的缀合没有减少脂质体向肝的浸润。

[0202] 为对TME内功能减退的T细胞实现最大药物作用，载药纳米颗粒必须能够到达肿瘤块内深部的免疫细胞。在此方面，由于肿瘤内T细胞在TME内递送药物的固有移动性(29、44)，CART.cMLV药物递送系统促进了肿瘤块内CAR-T细胞和纳米颗粒的共定位。共聚焦显微图像显示了来自CART.cMLV组的cMLV能够渗透至肿瘤深部并与CAR-T细胞共定位。cMLV的此种最大肿瘤内定位可为促成CART.cMLV(SCH)疗法的更高效力的主要因素。

[0203] 含有SCH 58261的cMLV与CAR T细胞的缀合在体内显著改善了肿瘤浸润及其细胞毒性。CART细胞和缀合至空脂质体的CART细胞在体内显示了针对肿瘤细胞的有限的细胞毒性。尽管在肿瘤微环境中检测到了T细胞，在小鼠接受过继CART和CART-Emp细胞转移后肿瘤生长未被抑制。离体功能测定显示，与CART-SCH相比较，CART和CART-Emp细胞组的TIL具有显著更低的炎性细胞因子(IFN-γ)分泌。在过继转移后48小时，用抗人CD3/CD28对TIL的离体重新刺激显示了CART细胞的效应物功能在肿瘤浸润后很快丧失。Moon等(2014)先前的研究观察到肿瘤微环境对T细胞功能减退的类似影响。据报道，细胞的细胞毒性从过继细胞转移后第5天开始下降并持续减少至第39天，尽管TIL增殖仍继续。在这里我们还观察到，在过继T细胞转移后第2天至第14天，所有组中肿瘤中TIL的百分比增加，尽管肿瘤尺寸继续增加。对A2a受体下游的信号传导途径的进一步分析显示，在经CART和CART-Emp处理的组中CREB高度磷酸化，而在经CART-SCH处理的肿瘤中检测到显著更少的磷酸化CREB。这表明SCH 58261在肿瘤浸润CAR T细胞上抑制经由A2a受体的腺苷信号传导，因此，与未经处理的CART细胞相比较，肿瘤浸润CART细胞在体内显示出更优异的肿瘤生长抑制和增殖。

[0204] 靶向肿瘤的CART.cMLV(SCH)治疗系统在防止缀合纳米颗粒的CAR-T细胞的功能减退方面是有效的。与无缀合药物的组相比较，用CART.cMLV(SCH)处理的组显示了显著的肿瘤生长抑制。预防性CART.cMLV(SCH)处理显示了伴有低CREB磷酸化的T细胞的高肿瘤植入，表明了导致增加的T细胞增殖的A2aR阻断的机制重要性。我们的如下观察支持了此结论：与其它组相比较，CART.cMLV(SCH)具有更高百分比的肿瘤浸润T细胞和增加的IFN-γ产生。然而应该注意的是，我们最成功的处理组中IFN-γ的最高水平仍然显著低于从无肿瘤小鼠中分离的对照T细胞，表明除A2aR信号传导外，CAR-T细胞还可在该SKOV3肿瘤模型中暴露于免疫抑制的其它机制。

[0205] 除结合细胞的药物载体cMLV在预防治疗性CART细胞功能减退中的作用外，本文研究了CART细胞仅作为伴侣细胞以将cMLV包封的药物货物递送至肿瘤驻留T细胞，作为恢复功能减退的TIL的“挽救”任务。对于该应用，我们的结果显示含有SCH 58261的cMLV与伴侣CAR T细胞的缀合能够刺激驻留在肿瘤中的CAR T细胞的增殖并增加其细胞毒性。据报道，由于免疫抑制性肿瘤微环境，这些肿瘤驻留CAR T细胞是功能减退的并且具有降低的细胞毒性。在此情况下，药物货物针对伴侣CART细胞和肿瘤驻留T细胞这二者。

[0206] 与我们的预防性研究(其中治疗性CART-SCH能够控制肿瘤生长)不同，伴侣CART-SCH能够在过继CART细胞转移后前48小时内大幅降低肿瘤尺寸。此种显著降低可归因于A2a受体的阻断，其因此诱导肿瘤驻留T细胞的增殖并增加其效应物功能。未接受第二“挽救”输注的PBS对照组显示了在初始CART输注后第10天有平均6％的T细胞驻留在肿瘤中。用CART或CART-Emp进行的第二“挽救”输注使TIL群分别略微增加至19.2％和18.3％。值得注意的是，用CART-SCH进行的“挽救”输注使T细胞群增加至来自收获的肿瘤的总细胞数的39.3％。来自CART-SCH挽救处理组的TIL显示了偏向CD8+的T细胞群，这在经CART或CART-Emp处理的组中未观察到。据报道CD8+群对肿瘤微环境中的IFN-γ水平更敏感。高IFN-γ分泌显著增强CD8+T细胞增殖，而对CD4+T细胞群影响较小。与这些观察结果一致，从CART-SCH组收获的TIL在用抗人CD3/CD28进行离体重新刺激时表达更多IFN-γ。最后，对磷酸化CREB水平的进一步分析表明，CART-SCH显著降低了收获的TIL的pCREB。

[0207] 该挽救处理反映了其中患者具有预先存在的TIL或先前已接受CAR-T细胞疗法的临床环境。与其它处理组相比较，CART.cMLV(SCH)处理导致在离体重新刺激后初始的功能减退的CART.tEGFR细胞群中显著更高的IFN-γ分泌。可能是由于A2aR介导的T细胞增殖抑制的解除，与其它组相比较，在CART.cMLV(SCH)处理组中CART.tEGFR群也显示了较低的磷酸化CREB和显著更高的细胞数。我们还证实了SKOV3.CD19细胞不直接受SCH影响，表明SKOV3.CD19肿瘤减小主要是通过SCH对肿瘤浸润CAR-T细胞的作用来实现。此外，CART.cMLV(SCH)处理后肿瘤负荷的立即减少很可能是通过由CART.tEGFR细胞群诱导的细胞毒性的恢复引起的。这得到了以下事实的支持：1)在我们的预防性研究中，相同剂量下的单独的CART.cMLV(SCH)处理只能抑制而不能减少肿瘤生长；2)由立即输注的T细胞介导的肿瘤尺寸减小需要5-6天，这比我们在本研究中观察到的2天长。

[0208] SCH 58261破坏A2a受体信号传导的应用表现为一种在体内逆转功能减退的TIL(特别是在具有高CD39和CD73表达的实体瘤的情况下)的非常有前途的方法。

[0209] 该递送平台非常灵活，并可应用于其它药物、细胞因子、抗体或它们的任何组合。使用不同治疗细胞(如肿瘤特异性T淋巴细胞和造血干细胞(HSC))作为靶向递送媒介物或使用其它“伴侣”细胞(如自然杀伤(NK)细胞)可显著提高细胞因子和小分子抑制剂的治疗效果。此外，免疫调节药物可与免疫检查点阻断(如抗PD-1)联合递送，以进一步促进抗肿瘤免疫力。例如，组合物可在结合至细胞表面的纳米颗粒中掺入VEGF和EGFR的小分子抑制剂，并将组合物与αPD1和αPD-L1一起给予。

[0210] 通过用纳米颗粒对CAR-T细胞表面工程化而进行的细胞介导的药物递送不仅使对载体细胞的受控药物作用成为可能，而且还允许主动靶向感兴趣的组织。通过使用CAR-T细胞作为伴侣，我们能够将纳米颗粒有效地定位于有利于T细胞归巢的特定组织(包括肿瘤、脾、肺和淋巴结)中。也可将此种将CAR-T细胞免疫疗法与A2aR小分子拮抗剂结合的方法应用于各种类型的癌症，如乳腺癌、前列腺癌、脑癌和白血病。据报道，这些癌症表达与不良预后有关的CD73。总的来说，这是可潜在地提高实体瘤疗法的功效和特异性的有前途的平台。

[0211] 上述各种方法和技术提供了实施本申请的多种方式。当然，应理解的是，根据本文描述的任何具体实施方式并不是必须要能够实现所描述的所有目标或优点。因此，例如，本领域技术人员将认识到能够以实现或优化本文所教导的一个优点或一组优点的方式执行所述方法，而不必实现本文所教导或建议的其它目的或优点。本文提到了各种替代方式。应理解，一些优选实施方式特定包括一个、另一个或几个特征，而其它优选实施方式特定排除一个、另一个或几个特征，而其它优选实施方式通过包含一个、另一个或几个有利特征来弱化(mitigate)特定特征。

[0212] 此外，本领域技术人员将认识到来自不同实施方式的各种特征的适用性。类似地，本领域普通技术人员能够以各种组合采用上面讨论的各种要素、特征和步骤以及每个这样的要素、特征或步骤的其它已知等同物，从而根据本文所描述的原理来执行方法。在各种要素、特征和步骤中，在不同实施方式中，将特别包括一些要素、特征和步骤，并将特别排除其它要素、特征和步骤。

[0213] 尽管已在某些实施方式和实施例的上下文中公开了本申请，但本领域技术人员将理解，本申请的实施方式延伸超出所具体公开的实施方式并延伸到其它替代实施方式和/或其用途、修改以及等同物。

[0214] 本文描述了本申请的优选实施方式，包括发明人已知的用于实施本申请的最佳方式。在阅读前面的描述后，对那些优选实施方式的变化对于本领域普通技术人员来说将变得显而易见。预期本领域技术人员能够适当采用此类变化，并且本申请能够以不同于本文具体描述的方式实施。因此，本申请的许多实施方式包括适用法律所允许的本文所附权利要求中所列举主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有指定或上下文有明显矛盾，否则本申请涵盖上述要素处于其所有可能变化的任何组合。

[0215] 本文引用的所有专利、专利申请、专利申请公开以及其它材料(如文章、书籍、说明书、出版物、文件、物品和/或类似物)(除与其相关的任何审查文件历史、与本文件不一致或相冲突的任何审查文件历史或对于现在或以后与本文件相关的权利要求的最宽范围可能具有限制性影响的任何审查文件历史外)在此出于所有目的通过该引用而整体并入本文。举例来说，如果在与任何并入的材料相关联的术语的描述、定义和/或使用以及与本文件相关联的术语的描述、定义和/或使用之间存在任何不一致或冲突，以本文件中术语的描述、定义和/或使用为准。

[0216] 应理解，本文公开的本申请的实施方式对本申请的实施方式的原理是说明性的。可采用的其它修改可在本申请的范围内。因此，作为实例而非限制，可根据本文的教导利用本申请的实施方式的替代配置。因此，本申请的实施方式不精确地限于所示出和描述的实施方式。

[0217] 以上在具体实施方式中描述了本发明的各种实施方式。虽然这些描述直接描述了以上实施方式，但应该理解本领域技术人员可想到对本文示出和描述的具体实施方式的修改和/或变化。落入该描述的范围内的任何此类修改或变化也旨在包括在其中。除非特别指出，否则发明人的意图是向说明书和权利要求中的词语和短语给予对于适用领域中的普通技术人员而言普通和习惯的含义。

[0218] 已呈现了申请人在提交本申请时已知的本发明的各种实施方式的前述描述，并且旨在用于说明和描述的目的。本说明书并非旨在穷举本发明或将本发明限制于所公开的精确形式，并且，根据上述教导进行许多修改和变化是可能的。所描述的实施方式用于解释本发明的原理及其实际应用，并且使得本领域的其它技术人员能够在各种实施方式中利用本发明(且以适合于预期的特定用途的各种修改)。因此，本发明旨在不限于为实施本发明而公开的具体实施方式。

[0219] 虽然已示出和描述了本发明的具体实施方式，但对于本领域技术人员将显而易见的是，基于本文的教导，可在不脱离本发明及其更广泛的方面的情况下进行改变和修改；因此，所附权利要求在其范围内涵盖在本发明的真实精神和范围内的所有此类改变和修改。

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