[0002] 本申请要求下述美国
专利申请的优先权，这些美国专利申请是:2011年2月22日提交的第61/445,414号美国临时专利申请、2011年6月22日提交的第61/500,011号美国临时专利申请、2011年7月11日提交的第61/506,509号美国临时专利申请、2011年7月11日提交的第61/506,514号美国临时专利申请、2011年9月23日提交的第61/538,725号美国临时专利申请、2011年9月23日提交的第61/538,729号美国临时专利申请、2011年9月30日提交的第61/542,147号美国临时专利申请、2011年10月3日提交的第61/542,651号美国临时专利申请和2011年12月19日提交的第61/577,452号美国临时专利申请，上述各临时专利申请的公开内容在此被全部纳入。
[0004] 该项
发明是由美国国家科学基金会授权、政府DBI-0650020号和CBET-0854030号文件拨款资助进行的。美国政府对该发明拥有一部分权利。
技术领域
[0005] 本案涉及一种热分析技术，特别涉及一种基于
微机电系统的热量计及有关制造和应用。
背景技术
[0006] 差示扫描
量热法（DSC）是一种热分析技术，用于测量热活动过程中随着样本
温度变化所产生或所需要的热量。应用于生化系统时，DSC可提供一种免标记方法来确定许多
生物分子相互作用和构象转变的热
力学特性。但是DSC仪器会比较笨重而且需要大量的样本消耗，这就限制了DSC在生物分子鉴定方面的广泛应用。
[0007] 微机电系统（MEMS）是小型的集成装置或系统，是由电力和机械部件结合而成的小型机械装置。MEMS技术建立在制造技术的
基础上来实现小型化、多样性和微
电子技术。
[0008] 目前使用的许多微机电系统（MEMS）热量计提供了固相或气相或基于液滴技术的检测。但是，使用现有的MEMS热量计在明确定义的环境中会很难恰当地操作液体样本。
[0009] 或者，使用流通式和连续式微机电系统（MEMS）热量计结合微
流体室或通道作为
生物反应器。这些装置能提供可控的流体环境，而且容易和生化
热力学研究中用到的其它微流体功能性或热感结构结合使用。然而，由于这些装置受到深刻的
对流热
泄漏的影响（由于连续流动），因而需要大量的样本。
[0010] 此外，由于缺乏集成化加热元件和热敏装置，校准现有微机电系统（MEMS）差示扫描量热（DSC）装置会比较复杂。温度调制式量热法（AC量热法）涉及较短暂周期内温度变化的热量测定。这种温度调整允许生物分子的热松弛，这样通过AC量热法就可以在准平衡条件下探测生物分子相互作用，从而在面对宽频背景噪声时通过调制
频率提取生化反应
信号。但是，这些芯片所包含的一些固态
薄膜和运行参数并不适合溶液相生物分子的特性鉴定。
[0011] 等温滴定量热法（ITC）能测量生化反应中根据反应物摩尔配比所产生或需 要的热量，而且已经用于新药研发和生物
治疗开发等领域。但是，传统ITC仪器结构设计复杂、热反应较慢而且样本和
试剂消耗较大。
发明内容
[0012] 根据本公开主题的一个方面，提供了一个微型装置。所述微型装置包括第一绝热微室，第二绝热微室和一个薄膜基片。所述第一和第二微室可分别作为样本室和基准室。样本室和基准室的体积和构造完全相同，并排放置且各自由薄膜基片
支撑。所述薄膜基片包含一个热电
传感器，所述热电传感器位于样本室和基准室各自的下方，被构成为用于测量样本室和基准室之间的温差。所述薄膜基片也可以包含一个
聚合物膜片，膜片由
玻璃化温度高于150℃且
热分解温度高于250℃的材料制成。
[0013] 在所述微型装置的一些
实施例中，热电式传感器包括一个热电敏感度高于80μV/℃的
热电偶。在其它实施例中，将热电式传感器构造成一个薄层
热电堆，它包含多个异质材料构成的细长
片段，异质材料的相邻片段在其相对端被结合在一起从而形成热电偶接点。例如，异质热电材料可以包含n-型和p-型碲化铋以及n-型和p-型碲化锑。在一个典型实施例中，热电材料是铋化锑（Sb-Bi）。
[0014] 薄膜基片中聚合物膜片材料的拉伸强度高于55MPa且
杨氏模量大于500MPa。例如，聚合物膜片可以由聚酰亚胺、聚对二
甲苯、聚酯和聚四氟乙烯等材料制成，但并不限于这些材料。在一个实施例中，聚合物膜片是由聚酰亚胺制成的。
[0015] 在特定实施例中，微型装置的薄膜基片可以进一步包括：第一微型加热器和第一温度传感器，各自和第一绝热微室下方对齐；以及一个第二微型加热器和一个第二传感器，各自和第二绝热微室下方对齐。在此实施例中，热电传感 器的热电偶接点可以位于第一和第二绝热微室中心附近，分别与第一温度传感器和第二温度传感器呈垂直排列。微型加热器和温度传感器可以由一层薄熔敷金属/
合金或浸渍于薄膜基片中的金属/合金制成。微型加热器可对微室进行均匀加热。在一些实施例中，使用聚二甲基
硅氧烷（PDMS）制成的围墙来界定微型装置。微型装置的薄膜基片顶层由PDMS和制成聚合物膜片的材料混合而成。在一些实施例中，微型装置进一步包括第一引入通道和第二引入通道。可配置的各自第一引入通道和第二引入通道便于对流过通道的溶液进行被动混沌混合。例如，第一和/或第二引入通道会包括一个蛇形部分，还会包括多个内部隆起，这些隆起足以在流过第一或第二引入通道的溶液中产生
涡流。根据本公开主题的另一个方面，提供了一种确定被分析物热性能的方法。样本室中包括一种含有被分析物的样本物质，基准室中包括一种不含有被分析物的标准物质。在预定的温度扫描速率下对封闭微型装置的
隔热外壳加热。通过测量样本室和基准室之间的温差来确定被分析物的热性能。
[0016] 在此方法的一些实施例中，通过绝热外壳的加热过程可得到较短暂周期内的热力变化。假定短周期调制加热用到的微型装置内的微型加热器能够产生较短周期内的热力变化，就可以使用一个
波形发射器控制临时加热调制。
[0017] 根据本公开主题的又一方面，提供了一种确定至少两种物质间发生反应时所涉及热量的办法。在样本室中提供一种包括第一种物质和第二种物质的样本溶液，在基准室中提供一种参考溶液。使绝热外壳封闭的微型装置维持常温状态。根据样本室和基准室之间测量的温差，确定设定温度下的第一种物质和第二种物质发生反应时涉及的热量。
[0018] 第一种物质和第二种物质间的反应可以是化学反应或物理结合，例如配位体-
蛋白质结合。绝热外壳的温度会发生变化，因此可以确定不同温度下反应涉 及的热量。同样，两种物质的浓度比率也会发生变化，因此可以根据不同浓度比率下测得的热量确定反应计量。使用上述引入通道将样本溶液和/或参考溶液分别注入各室内，就会产生被动混合。
附图说明
[0019] 图1a-1c是根据本公开主题的某些实施例描画的微型装置原理图，1a为俯视图，1b为等距视图，1c为截面图。
[0020] 图2a-2e是根据本公开主题的某些实施例描画的微型装置
制造过程。
[0021] 图3是根据本公开主题而阐述的AC差示扫描量热法的原理图。
[0022] 图4a和4b是根据本公开主题某些实施例（与等温滴定量热法相关的内容）的微型装置原理图。
[0023] 图5是根据本公开主题的一个实施例制造的微型装置图片，其中：（a）聚二甲基硅氧烷(PDMS)防护结构和气隙；（b）固体基片；（c）嵌入薄膜基片的热电堆、集成微型加热器和温度传感器；以及（d）热电堆接点。
[0024] 图6a是根据本公开主题的某些实施例，使用微型装置作为热量测定试验装置的原理图。
[0025] 图6b是依据本公开主题的某些实施例，显示了定制的温度可控绝热外壳对比绝热外壳原理的详细说明。
[0026] 图7是依据本公开主题的某些实施例，显示微型装置热电堆
输出电压对热电堆热接点和冷接点间恒定温差的反应。
[0027] 图8是依据本公开主题的某些实施例，显示微型装置对其两室之间恒定功率差的稳态响应（以热电堆输出电压为依据）。
[0028] 图9是依据本公开主题的某些实施例，显示微型装置对于
梯级功率差的瞬 态响应。
[0029] 图10是依据本公开主题的某些实施例，显示溶菌酶变性过程中温度扫描所示的作为温度函数的微型装置的输出。
[0030] 图11a和11b是依据本公开主题的某些实施例，使用微型装置测量并参照溶菌酶变性温度的局部
比热容图（11a）和摩尔
焓变化图（11b）。
[0031] 图12a和12b是依据本公开主题的某些实施例（10a）显示的微型装置输出图；以及不同温度扫描速率下，根据溶菌酶变性温度得出的摩尔焓变化图。
[0032] 图13是依据本公开主题的某些实施例，显示用AC-差示扫描量热法（DSC）进行测量的实验装置原理图。
[0033] 图14是依据本公开主题的某些实施例，显示微型装置热电堆输出电压对其热接点和冷接点间恒定温差的响应图。
[0034] 图15是依据本公开主题的某些实施例，显示微型装置对其两室之间恒定功率差的稳态反应（就热电堆输出电压而言）。
[0035] 图16是依据本公开主题的某些实施例，显示微型装置对于梯级功率差的瞬态响应。
[0036] 图17是依据本公开主题的某些实施例，显示微型装置中热电堆电压（减去基线）的频率依存性，其中样本室注满溶菌酶（20mg/mL），基准室注满0.1M甘
氨酸-
盐酸缓冲液（pH=2.5）。
[0037] 图18a和18b是依据本公开主题的某些实施例，参照不同溶菌酶浓度及AC调制频率下的溶菌酶变性温度，显示了热电堆电压的振幅变化（18a）和
相位变化（18b）。
[0038] 图19是依据本公开主题的某些实施例，参照不同溶菌酶浓度及AC调制频率下的溶菌酶变性温度，显示了溶菌酶比
热容图。
[0039] 图20是依据本公开主题的某些实施例，显示了利用微型装置时，通过DC-差示扫描量热法（DSC）和AC-DSC在溶菌酶变性过程中所测的比热容对比图。
[0040] 图21是依据本公开主题的某些实施例，使用微型装置进行等温滴定量热的特定要素图。
[0041] 图22是依据本公开主题的某些实施例，显示了等温滴定量热实验装置的原理图。
[0042] 图23a和23b是依据本公开主题的某些实施例，显示微型装置用于等温滴定量热时的校准结果：对梯级功率差的瞬态响应（23a）和对恒定功率差的静态响应（23b）。
[0043] 图24是依据本公开主题的某些实施例，引入5mM18-C-6和4mM氯化钡（BaCl2）（各0.5μL）后以及用去离子
水滴定（为清晰起见，以4μV偏移量绘图）5mM18-C-6后微型装置的时间分辨输出图。
[0044] 图25a和25b是依据本公开主题的某些实施例，在连续注入一系列摩尔浓度后，用等温滴定量热法测量5mM18-C-6和氯化钡（BaCl2）结合时的微型装置输出图（25a）；以及根据摩尔浓度算出的18-C-6和BaCl2结合热量。拟合曲线是以位点结合模型为基础的。
[0045] 图26是依据本公开主题的某些实施例，按照微型装置输出的计算结果，得出18-C-6和BaCl2在23℃和35℃下按照摩尔浓度结合时所产生的生化热量。
具体实施方式
[0046] 根据本公开主题的一个方面，提供了一个微型装置。此微型装置包括第一绝热微室、第二绝热微室和一个薄膜基片。所述第一和第二微室也分别称为样本室和基准室。样本室和基准室的体积和构造是完全相同的，并排放置且各自 由薄膜基片支撑。所述薄膜基片包含一个热电传感器，所述热电传感器位于样本室和基准室各自的下面，用于测量样本室和基准室之间的温差。
[0047] 图1a-1c给出了本公开主题中微型装置的详细说明。所述微型装置也称作微机电系统差示扫描量热（MEMS DSC）装置。微型装置100包括两个完全相同的微室110和120，它们可以容纳样本物质和标准物质以进行热量测定。为了便于参考，这里的微室在此分别被称为样本室和基准室，统称为“量热室”或简称为“室”。样本室和基准室通过微流体通道各自连接一个入口（111，121）和一个出口（112，122）。量热室防护结构可以由适合精密加工且绝热的任何材料制成。在特定实施例中，选择聚二甲基硅氧烷（PDMS）作为量热室制造材料，因为它便于制造和
包装且
生物相容性好。气腔为量热室提供额外的隔热保护。
[0048] 两种量热室均由薄膜基片（150）支撑。薄膜基片（150）和量热室周围的气腔（130）共同隔热以便进行灵敏的热量测定。薄膜（150）可以包括许多聚合层或膜片（151，152，153）。第151、152和153层膜片结合成图1c所示状态，但是为了说明将其显示为图1b所示的分开状态。第151和152层由绝热性能较好的材料制成，这种材料还应具有热
稳定性和机械稳定性来承受反复热量测定时的热循环。在特定实施例中，聚合物膜片由玻璃化温度高于150℃且热分解温度高于250℃的材料制成。例如，这些材料可以是聚酰亚胺、聚对二甲苯、聚酯和聚四氟乙烯等。聚合物膜片的拉伸强度应高于55MPa且/或杨氏模量大于
500MPa。在特定实施例中，选用聚酰亚胺作为膜片材料因为其良好的机械
刚度（杨氏模量：
2.5GPa）和
热稳定性（玻璃化温度：285℃）。
[0049] 为了改善防护材料和薄膜基片间的粘合力，使用材料层151和/或152的混合物（例如聚酰亚胺/聚二甲基硅氧烷(PDMS)混合物）制成一个界
面层153。薄膜基片可以支撑在另一个固体基片（160）上（例如
硅片）。为了改善绝热，可 以除去薄膜基片底部下面（相当于量热室各自的横截面）的固体膜片，这样位于量热室下面的薄膜基片部分就不会
接触固体基片（即，它只接触空气，通常认为这是最好的绝热）。
[0050] 可以将热电传感器以涂层、嵌入或其它方式包含在薄膜基片中来测量两个量热室中的温差。例如，聚合物层（152和153）之间可包含一个热电堆（170）薄层。如图1b和1c所示，热电堆可包含多个不同材质的细长片段，且不同材质的相邻片段的对端连接在一起，从而形成热电偶接点（171和172）。各量热室下面的热电偶接点与量热室中
心轴对齐。热电堆材料可包含许多不同的成对金属，如铋化锑（Sb-Bi），或其它具有较高
热电效应的成对金属，如n-型和p-型碲化铋以及n-型和p-型碲化锑。例如，热电传感器各个热电偶的热电灵敏度高于80μV/℃。在个别实施例中，选择锑（
塞贝克系数：43μV/K）和铋（塞贝克系数：-79μV/K）作为热电堆材料，因为它们的热电灵敏度较高且易于制造。
[0051] 薄膜基片可进一步包含两套微型加热器（180）和温度传感器（190），它们分别与两个量热室（110，120）的下端对齐。温度传感器（190）可监控量热室的实时温度，微型加热器（180）可给量热室加热从而为量热校准提供稳定的功率差。微型加热器（180）和温度传感器（190）均可嵌入薄膜，但垂直方向应与热电堆（170）远离并隔绝。例如，它们可以嵌入材料层151和152之间。温度传感器和微型加热器（185）的接触垫（195）可以延伸到量热室防护结构外进行外部电气连接。虽然图1b和1c显示在同一层上，但是微型加热器（180）和温度传感器（190）也可位于不同层。对于精确热敏，尤其是装置校准时，热电堆接点（171，172）可以和温度传感器（190）对齐。微型加热器（180）可对量热室进行均匀加热，例如量热室底部下面的曲径模式。微型加热器的材料可以从各种金属或金属合金中选择，如铬/金（Cr/Au）。
[0052] 在一个实施例中，通过下述步骤制造图1a-c所示的微型装置。即，提供一个固体基片（160）如硅片。将聚合物膜片（151）如聚酰亚胺薄膜涂敷在固体基片上，如
旋涂（图2a）。用四甲基
氢氧化铵（TMAH）在固体基片背面对应于量热室的
位置上蚀刻一对型腔（165）。聚合物膜片
固化后，通过金属或金属合金（如铬/金）的热
蒸发来形成微型加热器（180）和温度传感器（190）。然后将另一个聚合膜片（152）涂在微型加热器和温度传感器（图2b）上。随后，使用一个标准的剥离程序进行热电传感器（170）（如一个热电堆）的热蒸发和形成图案。之后，热电传感器就被另一个聚合层（153）涂敷（例如一层包含聚酰亚胺-聚二甲基硅氧烷（PDMS）的混合物）（图2c）。这时，制作量热室防护结构（140），例如在薄膜基片上面使用微成型技术用PDMS制作，从而形成量热室（图2d）。微流体结构例如连接量热室与进口和出口（121/122）的微通道也是可以制作的（图2e）。接着，除去薄膜背面的残留硅层（图2e）后，就形成了量热室各自下面的独立薄膜基片部分。
[0053] 根据本公开主题的另一方面，给出了一种确定被分析物热性能的方法。这个方法给出了一个上述的微型装置，提供了微型装置的绝热外壳；在第一微室中载入含有被分析物的样本物质；在第二微室中载入不含被分析物的标准物质；在预定的温度扫描速率下对绝热外壳加热；基于第一微室和第二微室之间测量得出的温差确定被分析物的热性能。在下述例子中进一步描述了微型装置和使用微型装置进行热量测定的方法。应理解，包含了下述特定要素的微型装置可以用于需要微型装置的试验方法中，反之亦然。
[0054] 在上述方法的一些实施例中，加热绝热外壳时将短暂周期变化或AC调制加热引入标准和样本物质，如图3所示。这会引起温度调整，并允许生物分子的热松弛以及在宽频背景噪声下简单地通过调制频率提取生化反应信号。此外， 使用微型装置中薄膜基片包含的微型加热器可实现温度调整，它是由能够提供不同频率、量级和芯片加热中其它参数的波形发射器控制的。
[0055] 根据本公开主题的另一方面，提供了一种确定至少两种物质反应时所涉及热量的办法。这种方法包括：提供上述微机电系统差示扫描量热（MEMS DSC）装置；提供一个封闭微型装置的绝热外壳；将样本溶液注入第一绝热微室，样本溶液由第一种物质和第二种物质混合而成；将参考溶液注入第二绝热微室，参考溶液可包含第一种物质和第二种物质中的一种或二者都不包括；基于测量样本室和基准室得出的温差，确定第一种物质和第二种物质反应时涉及的热量。测量时保持绝热外壳（用于封闭微型装置）温度不变。因此，这种方法也被称为等温滴定量热法（ITC）。两种物质的反应可以是化学反应或物理结合。因此，这两种物质可以是相互反应的化学药品、生物分子或其它分子，可以是受体配位作用、蛋白-酶、酸
碱中和等，两种物质的反应可以生成或吸收可测热量。
[0056] 图4是微型装置的部件分解图示，该装置尤其适用于等温滴定量热（ITC）。微型装置（400）包括样本室（410）和基准室（420），二者都位于薄膜基片（450）上；基片包括一个用于测量热扫描过程中样本室和基准室温差的热电堆（470）。为了便于第一种和第二种物质的混合（A和B），微型装置的样本室和基准室（410，420）各自包含引入通道（430，440）。每个引入通道有两个进口（431，432；441，442）。每个引入通道可以对流过通道的溶液进行被动混沌混合。例如，引入通道（430，440）包括一个蛇形结构的部分，如图4a和4b的图示所示。此外，引入通道（430，440）可包括多个内部隆起（434，444），它们足以使流过通道的溶液产生涡流。例如，引入通道的顶部可包括人字形隆起，如图4a所示。
[0057] 下列实例进一步阐述了所公开的微型装置及相关制造和使用方法，但不能 认为这是对公开主题范围的任何形式的限制。
[0058] 实例1：微型装置的制造
[0059] 该例子说明了微型装置的制作步骤，大体遵循上文所述步骤和图2。尤其是一个6-μm厚的聚酰亚胺膜旋涂在硅片上（预涂了
二氧化硅）。用四甲基氢氧化铵（TMAH）在硅片背面对应于量热室的位置蚀刻出一个大约50μm厚的剩余晶
片层。固化聚酰亚胺，一个铬/金薄膜（5/200μm）就通
过热蒸发沉积在聚酰亚胺层上。将第二个聚酰亚胺层涂在微型加热器和温度传感器上。然后，通过标准剥离程序进行碲和铋薄膜（0.5和1.2μm）的热蒸发和复制，通过标准剥离程序形成一个50-接点热电堆。进一步将一层聚酰亚胺和聚二甲基硅氧烷（PDMS）混合物涂在热电堆上。量热室防护结构是利用PDMS通过微成型技术在薄膜基片上制成的，从而形成量热室。各量热室都是圆柱形，体积为1μL（直径：2.5mm，高度：
200μm），中心距间隔4mm。使用二氟化氙（XeF2）气相等相性蚀刻清除薄膜基片背面晶片上的残留硅层。集成
电阻式微型加热器的各自标称电阻为40Ω，温度传感器的各自标称电阻为55Ω。图5所示为PDMS防护结构和固体热基片，以及热电堆显微照片和嵌入薄膜基片的集成微型加热器和温度传感器。
[0060] 实例2：热量测定
[0061] 这个实例中，校准根据例1制造的微型装置并用其测量特定生物分子的热力学性质，例如蛋白变性时的热力学。
[0062] A.原理
[0063] 差示扫描量热法（DSC）可测量不同的热容量，即样本物质和标准物质对 于温度的热容量差。对样本物质和标准物质进行相同的温度扫描，即它们的温度以预定速率在研究范围内变化时，热诱导的样本分子活动（放热或者吸热）会引起样本物质和标准物质之间的轻微温差（即温度差异）。检测这个温差来反咉功率差
[0064] ΔP=Ps-Pr(1)
[0065] 其中Ps和Pr分别是样本物质和标准物质产生的热功率。因此，热功率差为[0066] ΔCp=Cps-Cpr(2)
[0067] 其中Cps和Cpr分别是样本物质和标准物质的热容量，可以确定为：
[0068] (3)
[0069] 其中 是样本物质和标准物质在可控温度下的时间变化率，U是热电传感器（用于探测温差）输出，S是装置敏感度，即单位热功率差产生的输出电压。因此，通过分析热容量差可以确定样本材料的基本热力学性质。
[0070] B.装置校准
[0071] 为了测量两个量热室的温差，首先需要校准热电堆，这样热电堆产生的电压就可以直接转化为温差。按图6a所示校准微机电系统（MEMS）差示扫描量热（DSC）装置。芯片上的微型加热器由直流电源（安捷伦科技E3631A）供电，可以在量热室产生一个恒定的热功率差；温度传感器通过一个数字式万用表（安捷伦科技34410A）读数来监控量热室温度。使用纳伏计（安捷伦科技34420A）测量热电堆输出电压，该电压与量热室温差成正比。用个人电脑上的LabVIEW程序自动控制MEMS DSC装置和热电测量时的温度。
[0072] 定制的温度控热隔热外壳（200）内封装有微机电系统差示扫描量热（MEMS DSC）装置（100），隔热外壳包含的多个金属隔断环绕着一个金属台，上面放有MEME DSC装置（图6b）。提供样本溶液和参考溶液的温度扫描以及封装装置对于环境的绝热性，使测量噪声最小化。装置台下有多个帕尔帖装置（Melcor UT15-12-40-F2），通过电源（安捷伦科技E3631A）为装置增加或减少热量。根据芯片上温度传感器的反馈，通过调整帕尔帖装置的电压使用闭合
电路控制样本室和基准室的温度，例如一个比例-积分-微分（PID）
算法。
[0073] 校准装置时，向样本室和基准室中注入0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液（ph=2.5），这也是随后蛋白质变性测量时使用的缓冲液。激活样本室下面的微型加热器，使其产生一个已知且恒定的功率差，并保持基准室下面的微型加热器关闭。使用温度传感器测量热电堆冷接头和热接头处的温度。根据时间测量装置的输出，即热电堆输出电压，得出对热功率差的静态和瞬态响应。
[0074] 在不同温差下校准微机电系统差示扫描量热（MEMS DSC）装置内的热电堆敏感度，该温差是（通过样本室下面的微型加热器对芯片加热时）热电堆冷热接点间的温差。热电堆差动电压与温差（图7）呈现极高的线性关系，显示了50-接点热电堆的热电敏感度总值6.3mV/℃。得出各铋化锑热电偶的塞贝克系数为125μV/K。此外，根据不同功率差校正MEMS DSC装置的静态响应，并再次观察到极高的线性关系，得出一个比较接近的响应率常数S=4.0mV/mW（图8）。同时也观察到装置输出中一个近似40nV的噪声均方值（RMS），用它来确定功率差中的基线噪声。这与热功率差测量中大约10nW的探测范围一致。
[0075] 为了描述微机电系统差示扫描量热（MEMS DSC）装置的瞬态响应特征，最初向量热室施加一个130μW的梯级功率差，装置输出达到平衡时撤去。发现施加功率差后，对应的热电堆（图9）输出电压随时间呈指数增长，随着功率 差的撤去而衰减。将实验数据代入一阶指数增长和衰减函数，算出热时间常数大约为2.0s。
[0076] C.热量测定
[0077] 通过对研究范围内的温度扫描，使用校准的微型装置进行生物分子差示扫描量热（DSC）测量，测量时该装置的样本室和基准室分别注满生物标本和缓冲溶液。温度传感器用于监控量热室温度，得出装置的实时输出来计算生物分子的热功率。DSC测量前，测量温度扫描过程中的装置输出（即热电堆输出电压不存在输入功率差）基线，测量时两个量热室均需注满缓冲溶液。用内置
真空室对生物标本和缓冲溶液抽真空，用微量吸液管计量并使用注射
泵注入溶液（New Era
注射泵系统，NE1000）。
[0078] 使用校准的微机电系统差示扫描量热（MEMS DSC）装置描绘蛋白质变性特征，这是一种普通型的生物分子构象转变。在时间变化率为6℃/min、温度为10-90℃且
能量消耗低于25W时，使用隔热外壳对MEMS DSC装置进行温度扫描。用0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液（ph=2.5）中的溶菌酶进行验证。监控装置输出时，向样本室和基准室中分别注满溶菌酶和缓冲液并在25-75℃的温度范围及5℃/min的恒速下进行扫描。
[0079] 参照温度并通过基线减法校正后，测量蛋白质浓度在1-20mg/mL（图10）变化时的热电堆输出功率。观察到装置输出在特定温度范围内呈现最小的浓度依存性，反映了蛋白质变性过程的吸热性质。尤其是对1mg/mL溶菌酶变性过程的检测，代表了在先前报道的微机电系统差示扫描量热（MEMS DSC）装置基础上的巨大进步。
[0080] 此外，利用校准的装置敏感度（4.0mV/mW），通过差动电压测量（图10）计算出量热室之间的热容量差；从而得出溶菌酶变性过程中的热力学特性，例 如局部比热容（c）（图11a）、摩尔焓的总体变化（ΔH）（即每摩尔溶菌酶的热焓）和解链温度（Tm被定义为摩尔焓变化达到50%ΔH时的温度）（图11b）。虽然不同蛋白质浓度下的装置输出振幅不同，但它们均符合蛋白质变性过程中有关热力学性质的估计。特别是c轮廓通常不受蛋白质浓度的影响，确定ΔH始终为450kJ/mol左右且对应的解链温度Tm大约为55℃。这些结果与公开数据非常吻合，作为代表的溶菌酶在ΔH=377-439kJ/mol和Tm=55-58.9℃范围内，证实了公开的微机电系统差示扫描量热（MEMS DSC）装置在生物分子特性描述方面的潜在用途，极大减少了实践中不同蛋白质浓度下的样本消耗。
[0081] 同时研究了温度扫描速率对等差扫描量热（DSC）的影响。将20mg/mL溶菌酶溶入0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液（ph=2.5）中，发现不同温度扫描速率下的溶菌酶变性在1-6℃/min范围内变化。热电堆输出电压（重新通过基线减法校正）与上述同等温度范围内蛋白质变性呈现一致性下降，而振幅随着温度扫描速率增长。这与较高热通量在
相变时产生的较高吸热量一致。
[0082] 然后使用这些数据计算摩尔焓的变化（图12b）。随着温度扫描速率的增加，虽然观察到装置输出有轻微变化（图12a），但是发现蛋白质变性过程中的相关热力学性质始终不变，这是在ΔH标准差大约为50kJ/mo（即ΔH平均值±5%）且Tm标准差小于1℃（图12b）时得出的。特别的是，温度扫描为1-5℃/min时，Tm值基本保持不变。这证实使用公开的微机电系统差示扫描量热（MEMSDSC）装置的测量一致性，说明5℃/min的温度扫描速率已经足以测量溶菌酶的变性过程。
[0083] 实例3：AC-差示扫描量热（DSC）测量
[0084] 该实例阐述了进行AC-DSC测量的方法，如上文所述是建立在已公开的微型 装置的基础上。这种微机电系统（MEMS）AC-DSC方法能够使低丰度生物分子的测量具有更高的准确性，与该装置用于溶菌酶变性的AC-DSC测量相同。
[0085] A.原理
[0086] AC-DSC可以监控热容量差，即样本和标准物质之间的热容量差异，这是通过使用具有
温度控制功能的绝热外壳，在恒速下改变物质温度实现的。并伴随一个短暂的周期性变化，在样本和标准物质（图3）上施加相同的AC调制热量。通过测量温差（即样本物质和标准物质间的温度差异）得出热容量差值。
[0087] B.微型装置制造、系统设置和校准
[0088] 按照图1所示，利用微型装置进行AC-DSC测量，并根据例1所述步骤制造微型装置。微型装置其它参数，包括量热室尺寸和体积、聚酰亚胺薄膜厚度以及微型加热器和温度传感器特性等均和例1中的微型装置参数相同。该例子中使用的铋化锑热电堆包括100个接点而非例1中的50个接点。
[0089] DSC测量系统的构造与实例2相同。微型装置也是放在内置绝热外壳中。通过商业用温度
控制器（Lakeshore331）执行比例-积分-微分（PID）算法，在闭合回路中控制绝热外壳内的样本温度。芯片上的微型加热器由直流电源（安捷伦E3631A）供电，以产生恒定的功率输入差。对于调制热量，施加一个由波形发生器（安捷伦33220A）产生的方波交流电压（图13）。通过数字式万用表(安捷伦34410A）使用温度传感器探测各个量热室内的实时温度。校准装置时，使用纳伏计（安捷伦34420A）测量热电堆的输出电压。进行AC-DSC测量时，使用
锁定
放大器（斯坦福研究体系SR830）测量热电堆电压的振幅和相位，该放大器在相同的波形发生器AC调制方波中提到过。使用LabVIEW程序进行AC-DSC测量是完全自动的。
[0090] 微机电系统（MEMS）的DC性能校准方法本质上与例2描述的一样。测 量装置的输出基线时（即温度扫描过程中热电堆电压不出现功率输入差），需要向两个量热室中注满缓冲溶液。在装置的调制频率依存性和AC-DSC测量校准中，向样本室注满生物标本溶液，基准室注满缓冲溶液。使用内置
真空泵对生物标本和缓冲溶液抽真空，然后用微量吸液管将它们引入装置的量热室中。
[0091] 首先校准微机电系统（MEMS）内的热电堆，结果显示100-接点热电堆的敏感度为13.0mV/℃（图14），对应的塞贝克系数（依据铋化锑的热电接点）大约为130μV/℃。然后测量装置对功率差常数的静态响应，它与DC响应率8.0mV/mW（图15）呈现极高的线性关系。这些结果与例2中50-接点铋化锑热电堆的校准结果一致。此外，还确定了装置的瞬态响应。向注满空气或注满0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液（ph=2.5）的两个量热室加载梯级功率差（0.32或1.30mW）。这些测量结果显示在图16中。用一个一阶指数增长表示热电堆电压对时间的依存性。向量热室中注满空气时，得出热时间常数为0.8s。注满缓冲溶液时，得出热时间常数为2.0s。这些值不受所施加功率差的影响，且小于传统的AC热量测定。
[0092] 此外，研究了装置的调制频率依存性对所施加功率差的响应。为了更好地模拟蛋白质变性过程中AC-DSC测量的应用，向样本室注满溶菌酶（20mg/mL，溶入0.1M甘氨酸-盐
酸溶液，pH2.5）作为样本，向基准室注满甘氨酸-盐酸缓冲液。保持量热室恒温（25，35或45℃），然后用AC加热（电压振幅：1V）。经过基线减法校正后，热电堆电压振幅对调制频率的依存性显示在图17中。可以看出热电堆电压在所有调制频率下几乎都随温度增长，可以用蛋白质热容量的温度依存性来解释这个现象。而且在0.5-20Hz（图17）的调制
频率范围内装置输出（及由此产生的敏感度）最大，建议通过选择调制频率减少向周围环境的热损耗。因此，在蛋白质变性过程的热量测定中使用了该范围的调制频率， 详细说明见下文。
[0093] C.AC-差示扫描量热（DSC）测量
[0094] 上述校准的微机电系统（MEMS）AC-DSC装置用于测量蛋白质变性时的热性能。用不同浓度（10和20mg/mL，溶于0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液，pH2.5）的溶菌酶为例，在速率为5℃/mim、固定频率（1，5或10Hz）且加热电源振幅为3.5V的AC调制中，量热室温度在25-82℃范围内变化。AC调制加热产生的周期性温度变化幅度大约为0.2℃。
[0095] 经测量热电堆电压振幅（图18a）（经基线减法校正后）在变性过程中的减小具有浓度依存性，这与蛋白质变性的吸热特性一致。此外，虽然不同溶菌酶浓度下的热电堆电压振幅不同，但是整个变性过程中热电堆电压（图18b）的相位变化完全相同，在采用一个二级蛋白质变性模型时它仍保持原来状态和变性状态。况且，热电堆电压的振幅和相位变化随着调制频率呈现清晰变化，这是由于装置对AC加热的非同步热响应引起的。但是，在特定的蛋白质浓度下，不同的调制频率时的热电堆电压的振幅和相位变化曲线形状几乎是一模一样的，表现出基于微机电系统（MEMS）的AC-DSC测量所选频率的适合性。
[0096] 发现溶菌酶变性过程中的表面解链温度（Tm）（即装置输出的相位变化达到峰值时的温度）在55-58℃范围内（图18），这取决于调制频率。同时，利用热电堆电压振幅（图19）可以计算出蛋白质对于温度的比热容（c）。可以发现，尽管在变性过程中再次出现一个由调制频率诱发的轻微变化，但是c的轮廓形状并未受到调制频率的影响。此外，在各调制频率下，计算出的c值并没有因为蛋白质浓度不同（图19）而呈现较大差别，表明AC-DSC测量是准确的。蛋白质原始状态和变性状态下的比热容（Δc）也有所不同，不考虑调制频率时计算出该值为3.0kJ/mol·K。这些结果与DC-DSC鉴定中确定的结果一致。对比 使用了相同微机电系统（MEMS）装置却未采用温度调制的DC-DSC测量（图20），AC-DSC可提供更低的噪声等级和更好的测量准确性。因此，这使低浓度下鉴定生物分子的相互作用具有潜在可能性。
[0097] 实例4：基于微机电系统（MEMS）的等温滴定量热法（ITC）
[0098] 这个例子阐述了利用此处公开的微型装置，进行等温滴定量热测量的方法。
[0099] A.原理
[0100] 考虑一个溶液相的生物化学反应 其中A和B是反应物（例如一个配位体，一个样本），C是产物。反应伴随热焓变化ΔH。在等温滴定量热法（ITC）中，滴定反应物或按照已知等分将反应物连续添加到样本中，同时测量反应热。然后使用该数据确定反应的热力学性质，包括平衡结合常数tKB=[C]/[A][B]（方括号表示各物质的浓度）、化学计量N=n1/n2和热焓变化（ΔH）。
[0101] B.装置设置和校准
[0102] 使用图4所示的微机电系统（MEMS）等温滴定量热（ITC）装置。简言之，装置整合了两个相同的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微室（各1μL），各自位于独立的聚酰亚胺薄膜基片上，由气腔环绕实现绝热。微室集成有一个铋化锑热电堆，并通过引入通道连接
接口。该通道包含一个被动混沌混合，在弯曲的通道顶部有人字形隆起来产生乱流，其中包括所接入液体流的混合。所用MEMS-ITC装置的一些特性显示在图21中。将ITC测量中的两个反应物（为了说明方便下文称为配位体和样本）放入装置，先在引入通道混合后进入样本量热室并在这里完成反应。同时，将样本和洁净缓冲液（无配合基）引入装置，在进入基准量热室之前进行混合。使用集成热电堆测量量热室的温差并利用测 量结果确定反应中的热功率，从而计算热力学反应参数。将装置放在一个低噪声且温度可控的隔热外壳中（图22）来测量热电堆输出。引入样本和配位体时会用到注射泵。校准实验表明，装置的热时间常数为1.5s，具有线性静态热响应（响应率为4.9mV/mW）特性（图23）。
[0103] C.等温滴定量热法（ITC）测量
[0104] 该装置用于一个模型反应系统（含有18-C-6和氯化钡（BaCl2））的等温滴定量热法（ITC）测量。在无明显延时的情况下注入5mM BaCl2和4mM18-C-6各0.5μL后（表明反应物充分混合），时间分辨装置输出了反应特有的尖峰脉冲（图24）。利用滴定使摩尔比率（BaCl2/18-C-6）从0.1向2变化，即：向(1)0.1，(2)0.4，(3)0.8，(4)1.0，(5)1.2，(6)1.6，(7)2.0的变化。减去基线值后，装置输出证实尖峰脉冲与滴定反应一致并形成了键合等温线（图25）。ITC测量是在23℃和35℃进行的（图26），得出的等温线用于计算KB和ΔH，它们随着温度而降低（见下文表1）。这些结果证实：使用所公开的微机电系统（MEMS）ITC装置测得的样本浓度接近传统的仪器（ca.1mM），但其体积仅为传统仪器尺寸减少了约三个数量级。
[0105] 表1.与温度相关的热力学特性：18-C-6和BaCl2在两个温
[0106] 度下结合的化学计量（N）、结合力（KB）和热焓变化（H）
[0107]
[0108] 此处说明仅用于阐述公开主题的原理。考虑到相关示范作用，所述实施例中的许多
修改和变动对于技艺熟练者是显而易见的。还应注意，文中选用的语言主要是考虑到可读性和指导性，而非用于描述或限制相关发明主题。因此， 这方面的公开内容旨在“说明”而非“限定”公开主题的范围。
