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用于快速鉴定与特定化学靶点结合的核酸的装置

阅读：304发布：2022-04-28

专利汇可以提供用于快速鉴定与特定化学靶点结合的核酸的装置专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及微流体芯片以及它们在SELEX中的使用。所述微流体芯片优选的包括具有含靶点的高表面积材料的反应室。一种优选的高表面积材料是溶胶-凝胶衍生材料。本发明还描述了制作微流体芯片的方法，以及使用这些装置针对靶点筛选核酸适体的方法。，下面是用于快速鉴定与特定化学靶点结合的核酸的装置专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种微流体装置，包括：
包括在输入口和输出口之间延伸的一条或者多条流体通道的基底，
位于所述一条或者多条流体通道中的分子结合区，其中，分子结合区包括靶点分子；以及
邻近分子结合区的加热元件。
2.如权利要求1所述的微流体装置，其中，所述加热元件包括位于基底表面的电极。
3.如权利要求1所述的微流体装置，其中，所述基底包括玻璃、硼硅酸玻璃、玻璃陶瓷以及高分子材料的一种或多种。
4.如权利要求3所述的微流体装置，其中，所述基底是玻璃或硼硅酸玻璃底座和高分子材料盖的组合，它们共同限定了所述一条或者多条流体通道。
5.如权利要求1所述的微流体装置，其还包括包裹所述加热元件的高分子材料涂层，从而使液体流过流体通道时不会直接与所述加热元件接触。
6.如权利要求1所述的微流体装置，其中，所述分子结合区是在所述高分子材料涂层上形成。
7.如权利要求6所述的微流体装置，其中，所述高分子材料涂层为聚(甲基)丙烯酸酯。
8.如权利要求1所述的微流体装置，其中，所述分子结合区包括具有所述靶点分子的高表面积材料。
9.如权利要求8所述的微流体装置，其中，所述高表面积材料为溶胶-凝胶衍生产物，水凝胶衍生产物，高分子刷衍生产物，硝化纤维素膜包裹产物，或者基于树状聚合物的产物。
10.如权利要求1所述的微流体装置，其中，所述分子结合区包括所述一条或者多条流体通道的表面，这些流体通道包括一种或者多种联接分子，能够使所述靶点分子附着至所述区域内的表面。
11.如权利要求1所述的微流体装置，其中，所述靶点分子是蛋白质或多肽，糖类，脂类，制药剂，有机非制药试剂，或者高分子复合物。
12.如权利要求1所述的微流体装置，其还包括至少一个位于所述输入口和输出口之间并且与所述一条或者多条流体通道流体连接的微室，以及基本位于与所述加热元件邻近的所述微室内的溶胶-凝胶材料。
13.如权利要求12所述的微流体装置，其中，所述至少一个微室包括两个或者更多微室。
14.如权利要求13所述的微流体装置，其中，所述两个或者多个微室包括相同的靶点分子。
15.如权利要求13所述的微流体装置，其中，所述两个或者多个微室包括不同的靶点分子。
16.如权利要求1所述的微流体装置，其还包括与输入口连通的多端口耦合装置。
17.如权利要求16所述的微流体装置，其还包括一个或者多个和所述多端口耦合装置连通的储液池，所述一个或者多个储液池各自含有洗涤缓冲液、封阻缓冲液、结合缓冲液或含有核酸分子群体的溶液。
18.一种筛选与一个或者多个靶点分子结合的核酸适体的方法，包括：
提供如权利要求1-17任一所述的微流体装置；以及
在核酸分子与靶点分子能够有效特异结合的条件下，将核酸分子群体导入至微流体装置中；
从微流体装置中基本去除所有不与靶点分子特异结合的核酸分子；
使所述加热元件加热，致使与靶点分子特异结合的核酸分子变性；以及
回收与靶点分子特异结合的核酸分子，这些回收获得的核酸分子即是筛选出的特异结合至靶点分子的核酸适体。
19.如权利要求18所述的方法，其中，所述核酸适体包括RNA核酸适体，所述方法还包括：
对筛选出的核酸适体群体进行逆转录扩增。
20.如权利要求19所述的方法，还包括：
对经扩增的核酸适体群体进行纯化和测序。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述回收，所述逆转录扩增，所述纯化，和/或所述测序是在一个或多个与所述微流体装置流体联通的独立的流体装置中进行的。
22.如权利要求18所述的方法，其中，所述的导入、去除、加热以及回收均是自动化进行的。
23.表1-8中所识别出的核酸适体，除SEQ ID NOS：24，70，和81这几个核酸适体以外。
24.一种筛选与一种或者多种靶点分子结合的核酸适体的方法，包括：
提供微流体装置，其包括：
包括在输入口和输出口之间延伸的一条或者多条流体通道的基底，以及
位于所述一条或者多条流体通道中的一个或者多个分子结合区，其中，所述一个或者多个分子结合区每个含有一种靶点分子；
在核酸分子能够有效特异结合至所述一种或者多种靶点分子的条件下，将核酸分子群体导入所述微流体装置中；
从微流体装置中基本去除所有不与所述靶点分子特异结合的核酸分子；
使特异结合至所述靶点分子的核酸分子变性；以及
回收与所述靶点分子特异结合的核酸分子，这些回收获得的核酸分子是筛选出的能够结合至所述靶点分子的核酸适体。
25.如权利要求24所述的方法，其中，所述一个或者多个分子结合区包括两个或者更多个分子结合区。
26.如权利要求25所述的方法，其中，所述两个或者多个分子结合区被安置于不同的位置。
27.如权利要求26所述的方法，其中，所述两个或者多个分子结合区含有相同的靶点分子。
28.如权利要求26所述的方法，其中，所述两个或者多个分子结合区含有不同的靶点分子。
29.如权利要求24所述的方法，其中，所述一个或者多个分子结合区含有分子复合物，该分子复合物包括两种或者更多靶点分子。
30.如权利要求24所述的方法，其中，所述变性过通过化学方法实现。
31.如权利要求24所述的方法，其中，所述变性是通过对特异结合至靶点分子的核酸分子进行局部加热实现。
32.如权利要求24所述的方法，其中，对所述一个或者多个分子结合区每一个的所述变性和回收是分别进行的。
33.如权利要求24所述的方法，其中，所述核酸适体包括RNA核酸适体，该方法还包括：
对筛选出的核酸适体群体进行逆转录扩增。
34.如权利要求33所述的方法，还包括：
对所述经扩增的核酸适体群体进行纯化和测序。
35.如权利要求34所述的方法，其中，所述回收，所述逆转录扩增，所述纯化，和/或所述测序是在一个或多个与所述微流体装置流体联通的单独流体装置中进行的。
36.如权利要求24所述的方法，其中，所述导入、去除、加热以及回收均是自动化进行的。
37.一种制作微流体SELEX装置的方法，包括：
把一种包含靶点分子的溶胶-凝胶材料涂在第一构件的表面上，并使溶剂挥发，从而形成含有所述靶点分子的多孔基质；以及
将第二构件封在所述第一构件上，使得该第一和第二构件一起形成具有输入口、输出口以及该输入口和输出口之间的至少一个微流体通道的微流体装置，其中，所述多孔基质与所述至少一个微流体通道流体连通。
38.如权利要求37所述的方法，还包括，在所述涂溶胶-凝胶材料之前：
在所述第一构件上设置电极，并使用高分子涂层包被该电极，从而形成涂溶胶-凝胶材料的表面。
39.如权利要求38所述的方法，其中，所述电极是金属电极。
40.如权利要求38所述的方法，其中，所述设置电极包括：
在所述第一构件上涂一层图案化的光刻胶层；
在所述光刻胶层上沉积金属；
将所述第一构件暴露于电子束蒸发器中，以在第一构件上没有光刻胶层的区域形成金属层；以及
去除所述光刻胶层。
41.如权利要求38所述的方法，其中，所述高分子材料是聚(甲基)丙烯酸酯。
42.如权利要求37所述的方法，其中，所述第一构件由玻璃、硼硅酸玻璃、玻璃陶瓷或者高分子材料形成，所述第二构件由高分子材料形成。
43.如权利要求37所述的方法，其中，所述第二构件包括浮雕图案，使得在所述封合时形成所述输入口、输出口以及至少一条微流体通道。
44.一种包括如权利要求1所述的微流体装置的试剂盒。
45.如权利要求44所述的试剂盒，其还包括一个或者多个核酸分子随机池，洗涤缓冲液，结合缓冲液，封阻缓冲液，进行逆转录、PCR和/或转录所需的试剂，以及实施所述的微流体SELEX过程的说明书。

说明书全文

用于快速鉴定与特定化学靶点结合的核酸的装置

[0001] 本申请要求2008年8月15日提交的美国临时专利申请第61/089,291号的优先权，其全部内容在此参考并入。

[0002] 本发明在政府资助下完成，合同号为美国国家科学基金会ECS-9731293和ECS-9876771。政府拥有本发明的某些权利。

技术领域

[0003] 本发明是有关快速鉴定与生物靶点和化学靶点特异结合的核酸的装置和方法。

背景技术

[0004] SELEX(指数富集配体系统进化)过程是一种进化的体外组合化学过程，用于从含多种寡聚核苷酸的核酸池中识别出与某个配体或靶点相结合的核酸适体。SELEX是用于在特定的可控的结合条件下从随机池中分离核酸适体的优秀系统。SELEX技术为产生与指定配体或靶点紧密特异结合的单链DNA或RNA寡聚核苷酸提供了另一途径(Tuerk et al.，Science 249：505-510(1990)；Ellington A.，Curr Biol 4：427-429(1994)；Ellington et al.，Nature346：818-822(1990))。目前SELEX实验已被开发用于研究核酸的功能与结构，而识别出的核酸适体已成为分子诊断、分子识别、分子生物学以及分子进化研究的重要工具(Uphoff et al.，Curr Opin Struct Biol 6：281-288(1996))。

[0005] 在SELEX过程中，核酸适体的筛选是通过反复进行相继的靶点结合、去除未结合的寡聚核苷酸、洗脱、扩增和纯化筛选出的寡聚核苷酸这些步骤而实现富集。SELEX涉及两个过程的多轮重复：(i)使用亲和技术将高亲和性的核酸适体从低亲和性核酸适体中分离或筛选出来，以及(ii)使用聚合酶链式反应(PCR)扩增所筛选出的核酸适体。核酸适体一般是在SELEX过程的分离步骤中，使用亲和筛选技术，从大量的随机DNA或RNA序15
列池或库(≥10 种序列)中筛选得到。被称为“核酸适体”的单链DNA或RNA是人工合成的特定寡聚核苷酸，它们能以高亲和力和特异性与非核酸靶点分子结合(Jenison et al.，Science 263：1425(1994)；Patel et al.，J Mol Biol 272：645-664(1997)；Clark et al.，Electrophoresis 23：1335-1340(2002))。鉴于核酸适体独特的性质，它们对于推动从亲和分离到疾病的诊断与治疗，如癌症和病毒感染的诊断和治疗，的自然科学和生命科学的多个领域的革新有良好的前景(Tang et al.，Anal Chem 79：4900-4907(2007)；
Gopinath，S.，Archives of Virology 152：2137-57(2007))。

[0006] 相对于抗体，核酸适体具有很多优势。它们更小，更稳定，能够化学合成，以及能够未检测使用荧光标记同时不影响他们的亲和力。与抗体的研发不同，它们针对毒性靶点(当用于抗体生成)或针对低免疫原性或无免疫原性的靶点的开发是可行的(Mann et al.，Biochem Biophy Res Comm 338：1928-1934(2005))。此外，由于它们便捷的制备过程和广泛的用途，它们能够作为验证胞内和胞外靶点的有力工具(Gopinath，S.，Anal Bioanal Chem.387：171-182(2007))。一组核酸适体还可以用于选择性的干扰某个“轴心”蛋白的部分的连接(Shi et al.，Proc Nat’l Acad Sci USA 104：3742-3746(2007))。

[0007] 微流体装置是指使用微米尺度的通道操作非常小量体积(～10-9-10-18升)液体的系统。对小量体积的操作通过减少扩散时间提供了高速的化学反应，并在输运、交换和安置化学试剂到指定位置这些方面对获取的样本本液体提供了精确的控制。通过微加工技术，微流体装置还能够在单个芯片中整合流体元件如微泵、微阀、微加热器等等，从而使所有化学过程在芯片能自动完成。由于这些因素，微流体装置被广泛的应用于化学、生物学、药学和工程学领域，以实现高速和高通量的样本分析(Whitesides，G.，Nature 442：368-373(2006))。

[0008] 在实际应用中，传统SELEX系统重复工作多且耗时，不适用于进行高通量筛选。虽然SELEX技术本身已充分成熟，但其相对低的通量阻碍了需要大量不同核酸适体的研究，如针对生物标记识别的蛋白质组学研究。提高SELEX核酸适体产生速度和筛选能力的一种途径是过程的自动化和微型化。近来，用于快速和高通量分析的宏观技术的微型化方面已取得了进展。小型化的优势包括1)样本消耗小，2)能进行高通量分析，3)自足体系，4)交叉污染减少，以及5)多功能整合(Gopinath，S，Anal Bioanal Chem.387：171-182(2007))。用于分离特定RNA核酸适体的SELEX技术可实现自动化，从而显著的减少分离和扩增能以高亲和力与特定目标靶点分子结合的寡聚核苷酸序列所需要的时间。近来，一些微流体实验流程已被用于开发更快的SELEX过程，显著地将SELEX产生核酸适体的时间从几个月/周缩短至几天(Hybarger，et al.，Anal Bioanal Chem 384：191-198(2006)；Windbichler，et al.，Nat.Protoc.1：637-640(2006)；Eulberg，et al.，Nucleic Acids Research 33：
e45(2005))。SELEX技术的大多数进展，旨在提高筛选的效率(Bunka et al.，Nat Rev Micro 4：588-596(2006))。但是，这些研究并没有采用微型化的或多路的核酸适体筛选。

[0009] SELEX的过程还具有标准化的潜力，如果系统能整合至基于芯片的微流体环境内，将会在快速分析、减少成本和高通量分析这些方面提供显著的优势。这样的优势已在基于芯片的酶分析(Hadd et al.，Anal Chem 69：3407-3412(1997)；Joseph W.，Electrophoresis 23：713-718(2002)) 和免疫分析 (Wang et al.，Anal Chem 73：5323-5327(2001)；Sato et al.，Anal Chem 73：1213-1218(2001))中得到了证明。

[0010] 传统SELEX筛选技术还存在一些缺陷。传统筛选过程的一个缺陷是所筛选出的核酸适体对结合至固定支持物而非溶液中自由的靶点分子具有亲和性。进化的SELEX过程所筛选出的核酸适体是结合至与靶点类似的分子(即，它的膜结合衍生物)，而不是集中于对期望的靶点有亲和力的核酸适体。有报道指出筛选出的结合至cAMP的核酸适体实际上对C8位点修饰的cAMP类似物具有更高的亲和力，该位点是靶点附着在固定支持物上的位点(Koizumi et al.，Biochem.39：8983-8992(2000))。这样，固定支持物的影响在针对更小的配体筛选核酸适体时会被放大，这是由于更小配体只有有限数量的功能位点能与核酸适体相互作用，并且将配体附着至固定支持物上则进一步减少了这些功能位点的有效性。

[0011] 固定支持物本身还会引出其他的问题。有报道表明传统SELEX中以自由靶点溶液把有效序列从柱上去除的清洗步骤可能忽略对靶点有很高亲和力的核酸适体(Klug et al.，Mol.Biol.Rep.，1994；20：97-107(1994))。主要的问题是动力学偏向，这将使那些具有非常强相互作用的序列几乎不可能被轻易地从色谱柱上洗脱下来。对靶点具有高亲和力的序列无法轻易从亲和柱上洗脱下来。当使用自由的未结合靶点洗脱对结合的(固定)靶点具有高度特异性的核酸适体时也会出现这样的情况。因此，将很难从筛选柱上回收那些具有皮摩尔级别或者低解离常数的序列。

[0012] 本发明所针对的是解决本领域中所存在的这些以及其他不足。

发明内容

[0013] 本发明的一方面是有关一种微流体装置，它包括具有一个或多个在输入口和输出口之间延伸的流体通道的基底，位于一个或多个流体通道中的分子结合区，其中，该分子结合区含有靶点分子，以及邻接分子结合区的加热元件。优选的，该分子结合区包括具有靶点分子的高表面积材料。本发明也披露了包括这些装置的试剂盒。

[0014] 本发明的第二个方面是有关筛选与一个或多个靶点分子结合的核酸适体的方法。该方法包括提供上述微流体装置，以及在核酸分子能够与靶点分子有效且特异地结合的条件下，向微流体装置中导入一群核酸分子。本方法进一步包括从该微流体装置中基本移除所有与靶点分子非特异结合的核酸分子，对加热元件加热以使特异结合至靶点分子的核酸分子变性，并回收与靶点分子特异结合的核酸分子。这些回收得到的核酸分子是筛选出的针对它们所结合的靶点分子的核酸适体。

[0015] 本发明的第三个方面是有关筛选与一个或多个靶点分子结合的核酸适体的方法。该方法包括提供具有一个或者多个两端具有输入和输出口的流体通道的基底，所述一个或者多个流体通道中具有一个或者多个分子结合区，其中，这一个或者多个分子结合区的每一个都含有靶点分子。该方法进一步包括在能够使核酸分子与靶点分子特异结合的条件下将一群核酸分子引入微流体装置中，从微流体装置中基本去除所有与靶点分子非特异结合的核酸分子，使特异结合至靶点分子的核酸分子变性，以及回收与靶点分子特异结合的核酸分子。这些回收的核酸分子是筛选出的针对它们所结合的靶点分子的核酸适体。

[0016] 本发明的第四个方面涉及表1-8中所识别出的一个或多个核酸适体(除序列SEQ ID NOS：24，70，和81以外)。

[0017] 本发明的第五个方面涉及制作本发明所述微流体SELEX装置的方法。该方法包括把包含靶点分子的溶胶-凝胶材料涂在第一主体构件的表面上，并使溶剂挥发，从而形成含有靶点分子的多孔基质；然后以第二构件把第一构件密封，使得第一和第二构件一起形成具有输入口，输出口，以及至少一个位于输入输出口之间的微流体通道的微流体装置，其中，多孔基质与至少一个微流体通道流体连接。

[0018] 本发明所描述的微流体SELEX芯片具有许多显著的优势，对SELEX的结果有实质性的改善。在一优选的实施方式中，一个显著的优势是是用了纳米多孔溶胶-凝胶材料，它在微流体装置的一个或者多个微流体室中用于固定靶点蛋白，为核酸适体库与靶点蛋白的竞争性结合提供了支持。使用了局部热源以选择性地洗脱结合至靶点蛋白的特异高亲和力核酸适体。溶胶-凝胶材料能够固定蛋白质的特性使得该材料能够作为小型化装置的优秀候选材料，因为溶胶-凝胶材料不需要使用亲和捕获标签或重组蛋白，从而能够在不需要任何连结剂存在的条件下捕获天然状态的蛋白(Gill I.，Chemistry of Materials 13：3404-3421(2001)，该文献作为参考并且其全文被并入本文)。这克服了传统SELEX只能针对结合的靶点筛选核酸适体的局限性。这也降低了强力结合的核酸适体序列无法从靶点上被洗脱的动力学陷阱的可能性。由于从将结合的核酸适体和未结合的核酸适体区分或者分离在SELEX过程中是关键而且通常是限速的一个步骤，本法明的微流体系统是更快而且更有效率的替代技术。

[0019] 本发明还能够进行高通量的，甚至多通路的筛选和表征与靶点特异结合的核酸适体。该微流体装置可进行串行的或者平行的分析，在提高通量的同时减少分析时间、样本本量以及成本。本发明还披露了优化的核酸适体分离方法的实验步骤。

[0020] 本发明所提供的实施例展示了使用本发明的基于溶胶-凝胶的微流体SELEX系统，即SELEX芯片系统，针对TATA结合蛋白的核酸适体的筛选(“TBP”Yokomori et al.，Genes & Dev.8：2313-2323(1994)，该文献作为参考并且其全文被并入本文)。这些结果证明了TBP核酸适体能够使用SELEX芯片系统有效的分离，证实了该装置对于支持高通量SELEX方法的实用价值。本发明的微流体SELEX系统通过减少用于产生高亲和性核酸适体的筛选循环次数，极大地提高了筛选效率达50％。使用微流体SELEX系统产生的高亲和TBP核酸适体与之前使用传统滤膜结合SELEX方法产生的核酸适体具有一致性或同源性，证明了微流体SELEX系统的高效性和有效性。

[0021] 最后，利用单芯片和自动化SELEX体系的结合，本发明的微流体SELEX系统能用于筛选多个不同靶点分子的核酸适体。这能够极大的增强识别选择性的针对一个或者多个目标靶点的新核酸适体分子的能力。附图说明

[0022] 图1A是SELEX微流体芯片的直观示意图，图1B是展示沉积于芯片电极上的溶胶-凝胶的相对位置的放大的示意图。所示溶胶-凝胶的直径约为300μm。图1C是SELEX微流体芯片(分解的)以及向SELEX微流体芯片输送液体的系统的示意图。该微型芯片中的液体流动方向是从阴性对照溶胶-凝胶(N)至点4。收集核酸适体的顺序则和流向相反(从4至3至2，1，然后N)，这样避免了缓冲液流过其他电极产生不需要的加热。

[0023] 图2是展示SELEX微流体芯片制作过程的示意图。

[0024] 图3A-B展示了微流体SELEX过程以及微流体芯片。图3A展示了使用以溶胶-凝胶制作的微流体芯片进行核酸适体筛选的过程。简要的来说，通过毛细管将随机的RNA核酸适体池、试剂和缓冲液输运至芯片。具有特异结合亲和力的核酸适体会被位于微流体装置微室中溶胶-凝胶微滴中的靶点蛋白所捕获(也称为分子结合区)。五组溶胶-凝胶微滴均匀的点在微流体通道中(N是阴性对照；1具有滞留的酵母TATA结合蛋白(TBP)；2具有酵母转录因子IIA(TFIIA)；3具有酵母转录因子IIB(TFIIB)；4具有人热休克因子1(HSF1))。微滴之间的距离保持在1cm，以防止其他加热电极可能产生的不需要的加热。结合至每个靶点的核酸适体通过各自的铝制微加热器按照顺序加热洗脱。图3B展示了微加工制作的溶胶-凝胶芯片。该实施方式包括具有有一组铝电极和PDMS盖的玻璃片，盖和玻璃片共同限定了具有5个独立微室的微流体通道。压印在PDMS盖上的微流体部分包括170μm深和
300μm宽的微通道，和5个边长为1mm的六边形微室。单个溶胶-凝胶微滴的典型体积为
7nl左右，并且每个微滴内部的纳米多孔结构能够容纳30fmol蛋白。该装置中设计了五个六边形微室，用于孵化和反应。该六边形微室的容积，以及微室间连接通道的容积分别为
0.22μl和0.41μl。微流体芯片的最终尺寸为75mm×25mm×5mm。

[0025] 图4展示了溶胶-凝胶扫描电镜的(SEM)照片。可观察到两种不同类型的微孔。大孔组的直径位于大约100至大约200nm之间。小孔组直径为大约20至大约30nm之间。
这些微孔均匀的分布于溶胶凝胶的表面。图中所示比例尺为1μm。

[0026] 图5A-D展示了位于铝电极上的溶胶-凝胶点的荧光强度。溶胶-凝胶点中使用SYBR-Green I标记的dsDNA(100bp，1nM)通过各自的电极进行加热变性。绘制了电极在各种功率下荧光强度随时间的变化以及指数衰减模型(红线)。每幅图配有溶胶-凝胶点每e隔20秒的一系列显微照片。1 点是根据每幅图的荧光强度计算得到，以获得适宜的时间和功率。图5A为100mW，39.5秒；图5B为424mW，7.4秒；图5C为536mW，3.3秒，图5D为
645mW，1.8秒。

[0027] 图6A-B图示了TATADNA与TBP的结合。图6A是强度-时间图。对于TATA DNA与内嵌TBP的溶胶-凝胶的结合，强度-时间图符合指数衰减模型。电极的功率设置为450mW。得到的强度衰减半衰期为6.4秒。相信强度的减弱是由于核酸适体从固定的靶点蛋白上释放出来。图6B展示了溶胶-凝胶结合了以Cy-3标记的TATA DNA以及随后洗脱的明场显微照片。

[0028] 图7A-D展示了收集到的RNA凝胶电泳条带照片。为使得RNA在凝胶电泳中可被观察到，该RNA使用其相应引物进行了逆转录并以PCR扩增。制备了4种具有不同RNA浓度的样本(图7A为2.6pmole，图7B为13pmole，图7C为77pmole，图7D为130pmole)。图中条带的顺序是M(分子标记-梯状DNA)、N(阴性对照)、1、2、3和4。阴性条带和其他条带相比几乎没有信号或者信号很弱。分子标记表明凝胶中所表达的条带大小正确。这意味着核酸适体与靶点如溶胶-凝胶中的蛋白，发生了特异结合，而不是与溶胶-凝胶本身发生了非特异性结合。

[0029] 图8A-B展示了收集到的含有不同RNA浓度的样本间的条带强度比较。图8A展示了标准分子标记(M通道)以及收集到的核酸适体(通道N、50、30、5)的电泳图谱。通道N是阴性对照的溶胶-凝胶。核酸适体的起始量为3.56μg(图中以50表示)、2.14μg(30)和356ng(5)。条带强度使用Matlab程序计算。该强度与筛选中核酸适体的量成正比。阴性对照的条带强度几乎和背景相同。图8B图形化地展示了条带强度。

[0030] 图9展示了从多通路溶胶-凝胶芯片中收集的RNA的电泳迁移阻滞分析(EMSA)结果。测试了收集到的核酸适体对其靶点蛋白的亲和性。所有收集到的RNA使用放射性同32
位素标签P 标记。然后这些RNA以0nM、50nM靶点蛋白(TBP和TFIIB)孵化。EMSA测试表明RNA核酸适体仅针对靶点蛋白表现出特异亲和性：#12只与TBP结合，而#4仅与TFIIB结合，反之则不行。

[0031] 图10A-C展示了体外筛选循环效率的提高。图10A展示了采用微流体SELEX芯片通过传统的SELEX循环4(G4)、5(G5)和6(G6)获得了RNA池的三种新产物(G5’、G6’和15
G7’)。传统SELEX筛选TFIIB的起始池为2×10 条序列。图10B展示了来自微流体SELEX
32
芯片的P 标记的RNA池(G6’和G7’)的电泳迁移阻滞实验(EMSA)。该实验采用逐步提高的TFIIB浓度(0、2.5、12.5、62.5nM)。图10C展示了EMSA结果，其中，核酸适体(G7’)不能与TBP或TFIIA结合，但与TFIIB的结合具有高亲和力。所有使用的蛋白浓度均为200nM。

[0032] 图11展示了微流体SELEX过程与传统SELEX过程的比较。在11轮使用滤膜结合的传统SELEX过程后分离出一些TBP的核酸适体。而本发明的微流体SELEX方法比传统的SELEX方法需要更少的循环数。微流体SELEX在传统的滤柱SELEX进行两轮后进行。滤膜结合产物被转化为RNA并注入微流体装置中。本研究是针对TBP(TATA结合蛋白)的微流体SELEX。TBP核酸适体(ms3、ms4、ms5和ms6)在每轮SELEX后进行测序，他们的序列列于下文的表1-4中。这些实验证实了，本发明的微流体SELEX装置能够保持和富集特异结合至靶点蛋白核酸适体，在该例中是TBP。和传统的SELEX核酸适体相比，从微流体SELEX中筛选出的核酸适体能分为2组(匹配的，和新筛选出的核酸适体)。

[0033] 图12A-B展示了使用溶胶-凝胶阵列芯片进行的核酸适体结合分析。图12A展示了分析的设计，如图所示，PMMA包被的96孔芯片的每个孔中点有TBP的溶胶-凝胶点以及阳性对照(P)和阴性对照(N)。ms-6轮的核酸适体池使用Cy-3末端标记。图12B展示了新筛选出的核酸适体各自的结合活性。结合活性是利用溶胶-凝胶点的荧光强度计算获得的。作为阴性对照，在不含核酸适体的情况下进行结合分析，并且在TBP微滴位置处测得信号强度。ms-6.4、ms-6.16和ms-6.38属于I组(星号标记的匹配组核酸适体)；所有其他的核酸适体都是新筛选出的。

[0034] 图13A-B展示了荧光检测以及核酸适体与TBP的结合亲和力。单个核酸适体(ms-6.12、ms-6.15、ms-6.16、ms-6.18、ms-6.24以及ms-6.26)与TBP的结合亲和力使用溶胶-凝胶芯片分析测量。在一个孔中，点有5种类型的具有不同蛋白浓度(从0至400nM)的溶胶-凝胶微滴。一个微滴的平均体积为50nl左右。图13A展示了不同浓度TBP在各微滴位置的分布，以及在这些点观察到的荧光强度。六种TBP核酸适体被加入每个孔后，经分析得到结果信号。如图13B所示，结合亲和力(Kd)通过点强度的平均值测量得到。所有的分析重复进行。核酸适体的Kd值为：ms-6.12≈2.7nM；ms-6.15≈13.2nM；ms-6.16≈8.3nM；ms-6.18≈4.5nM；ms-6.24≈92.53nM；以及ms-6.26≈10.56nM。

[0035] 图14A-F展示了核酸适体序列M折叠产生的二级结构。括号中为核酸适体结构的最低自由能。图14A展示了核酸适体ms-6.12(ΔG＝-18.5)(SEQ ID NO：68)，图14B展示了核酸适体ms-6.15(ΔG＝-13.9)(SEQ ID NO：69)，图14C展示了核酸适体ms-6.16(ΔG＝-33.7)(SEQ ID NO：70)，图14D展示了核酸适体ms-6.18(ΔG＝-28.23)(SEQ ID NO：72)，图14E展示了核酸适体ms-6.24(ΔG＝-20.80)(SEQ ID NO：74)，图14F展示了核酸适体ms-6.26(ΔG＝-20.60)(SEQ ID NO：75)。每个核酸适体由99个核苷酸(nt)构成，它含有中心50个核苷酸的可变区(大写字母表示)，两侧的5’末端和3’末端为49个核苷酸的固定引物结合区(小写字母表示)(SEQ ID NO：82)。

[0036] 图15示意性地展示了96室多通路微流体SELEX芯片示意图，其包括含有气动阀控制器和2个泵的PDMS泵-阀系统。

具体实施方式

[0037] 本发明的一方面涉及微流体装置，利用经改进的SELEX过程，该微流体装置可用于对核酸适体池进行高通量的筛选。该微流体装置优选的实施方式还克服了传统SELEX的一些缺陷，提高了核酸适体筛选的效率，确保了所筛选的核酸适体是结合至未修饰的靶点分子。

[0038] 该微流体装置包括具有在输入和输出口之间延伸的一个或多个流体通道的基底，在这一个或多个流体通道中的分子结合区，其中，该分子结合区含有靶点分子，以及邻接分子结合区的加热元件。

[0039] 该微流体装置包括一些分散部件的组合，非限定性实例如，流体通道、毛细管、接头、微室、涂层以及加热元件，当它们以合适的方式搭配或连接在一起时，就构成了本发明的微流体装置。该微流体装置优选的，但并非必需的，包含顶部、底部和内部，其中的一个或多个部分基本限定了该装置的的通道和微室。

[0040] 在一个实施方式中，底部是结构基本平坦的固相基底，其上表面基本是平整的。多种基底材料可用于形成底部。该基底材料应基于它们与已有微加工技术的兼容性来选用，这些技术如，光蚀刻技术、湿式化学蚀刻技术、激光烧蚀技术、空气磨蚀技术、注射成型技术、模压加工技术以及其他技术。该基底材料通常还应兼容微流体装置可能面临的所有条件范围，包括极端的pH值、温度、盐浓度和/或电场的施加。

[0041] 优选的基底材料包括但不限于，玻璃、硼硅酸玻璃、玻璃陶瓷、高分子材料、半导体材料以及它们的组合。在一些优选的方面，该基底材料可包括通常采用微加工技术的半导体产业所使用的相关材料，包括如，硅基基底如玻璃，石英，硅或多晶硅，以及其他基底材料，如砷化镓等诸如此类材料。如果使用的是半导体材料，通常需要提供绝缘包被或绝缘涂层，例如，二氧化硅或氮化硅，覆盖于基底材料之上，特别是施加了电场的时候。

[0042] 高分子材料的实例包括但不限于，塑料，如聚甲基丙烯酸甲脂(PMMA)、聚碳酸脂、聚四氟乙烯(TEFLONTM)、聚氯乙烯(PVC)、聚二甲硅氧烷(PDMS)、以及聚砜。也可以使用其他塑料。采用已知的成型工艺，如注射成型法、模压加工或冲压工艺，或通过在模具中使多聚物前体材料发生聚合，就能够利用微加工制得的母版制造获得这样的基底。这样的高分子基底材料已被公认具有易于制造、低成本和可抛性的特性，并且通常它们对极端的反应条件通常具有惰性。这些高分子材料可以包括经处理的表面，例如，衍生或包被的表面，以增强他们在微流体系统中的效用，或例如，提供增强的流体导向。

[0043] 理想情况下，用于构建内部的至少部分界定微流体通道的材料，也应具有生物相容性和抗生物吸附性。因为该装置的活性表面积只有几平方微米，用于形成内部的材料应当既可以实现具有小横断面的通道(在大约宽2-3μm，长约1-2μm的尺度)的构建，也可以实现具有大横断面的通道(在大约25至大约500μm的宽度和/或高度的尺度，更优选的为大约50至大约300μm尺度)的构建。一些已有的广泛用于制作流体通道的材料，能够满足这些基本的需求。

[0044] 它们能够分为两种类别：基于玻璃的类别，如玻璃、硼硅酸玻璃、石英等等(Ymeti et al.，Biosens.Bioelectron.20：1417-1421(2005)，该文献作为参考并且其全文被并入本文)；以及基于高分子聚合物的材料如聚酰亚胺、光刻胶、SU-8负光刻胶、聚二甲硅氧烷(“PDMS”)，有机硅橡胶PDMS(McDonald et al.，Electrophoresis 21：27-40(2000)，该文献作为参考并且其全文被并入本文)、液晶聚合物、特氟隆等等。

[0045] 虽然玻璃材料具有相当好的化学和力学恢复力，它们昂贵的成本以及精细的制作过程使它们在这类应用中很少被用到。而相对的，高分子材料被人们广泛的用于流体学应用。此外，它们的使用所涉及的构建技术，如粘合、成型、模压、熔态加工以及印迹技术均是成熟的技术(Mijatovic et al.，Lab on a Chip 5：492-500(2005)，该文献作为参考并且其全文被并入本文)。基于高分子材料的微流体系统的另一项优势是使用相同材料制作的阀和泵能够容易的进行系统集成(Unger et al.，Science 288：113-116(2000)，该文献作为参考并且其全文被并入本文)。

[0046] PDMS和SU-8光刻胶作为构建微流体系统的原材料已有丰富的研究支持。它们两者都是光透明的，它们的力学和化学性质相当不同。SU-8比PDMS更硬(Blanco et al.，J Micromechanics Microengineering 16：1006-1016(2006)，该文献作为参考并且其全文被并入本文)，因此这两种材料的构建技术是不同的。PDMS还易受到壁变形的影响，这取决于通道的长宽比(Delamarche et al.，Adv.Materials 9：741-746(1997)，该文献作为参考并且其全文被并入本文)。根据所要进行的应用，他们的化学性质是一个重要的考虑方面。它们在聚合之后都拥有疏水的表面，这能够使得蛋白质被吸附到PDMS壁上，以及在小横断面的情况下能够填充通道。PDMS和SU-8二者的表面都可以表面活性剂或等离子处理，变得具有亲水性(Nordstrom et al.，J Micromechanics Microengineering 14：1614-1617(2004)，该文献作为参考并且其全文被并入本文)。SU-8的成分还可以在其聚合构建为亲水性之前进行修饰(Chen and Lee，J Micromechanics Microengineering 17：
1978-1984(2007)，该文献作为参考并且其全文被并入本文)。非特异性的结合对通道表面的污染是任何一种微流体应用显然要考虑的一个问题。据说SU-8不易受到这个问题的影响，但需要指明的是已有的化学处理方法能够提高PDMS性能(Lee and Langmuir 21：
11957-11962(2004)，该文献作为参考并且其全文被并入本文)。

[0047] 基底材料还可以是玻璃或硼硅酸玻璃底，以及高分子盖的组合，它们共同限定了一条或者多条流体通道。微流体装置的通道和/或微室通常是通过上述微加工技术在基底的上表面或者高分子盖的下表面形成微米级的小槽或凹入来制作。接着，微流体装置顶部的下表面覆盖并粘合至底部基底的表面，该顶部通常包括另一平整的基底，在这两个部件的界面位置密封装置的通道和/或微室(内部)。顶部与底部的粘合可根据基底材料的天然性质，使用多种已知方法进行。例如，在使用玻璃基底时，可使用热粘合技术，该技术通过提高温度和压力以使得装置的顶部与底部粘合。高分子基底可使用类似的技术粘合，但所使用的温度通常较低以防止基底材料发生过度的熔化。其它方法也可以用于粘合装置的高分子材料部分，包括声波焊接技术或使用粘合剂，例如，紫外线固化的粘合剂。

[0048] 加热元件可使用任意热和电的良导体来制作。根据一个优选的实施方式，该加热元件是由能够经受严厉的或者持续的化学和流体环境改变的金属制成，这样的环境如极端的pH值、温度、盐浓度以及电场的施加。用于制作加热元件的材料的膨胀和收缩性质应与基底材料的相应性质兼容，这样膨胀使其从基底脱离或者导致其他微流体装置中复杂情况。这样金属的非限定性实例实例包括铝、银、金、铂、铜以及合金。

[0049] 在一些实施方式中，本发明的微流体装置还包括包裹加热元件的导热涂层，这样，在液体通过流体通道时不会直接与加热元件接触。这种做法能够防止加热元件的金属部分被暴露于严厉的化学环境而遭到腐蚀。优选的涂层材料包括但不限于玻璃、硼硅酸玻璃、玻璃陶瓷以及高分子材料。用于此目的的一种优选的高分子涂层是聚(甲基)丙烯酸酯或者聚氨酯丙烯酸酯涂层材料。

[0050] 本发明的微流体芯片在其物理尺寸上并不受限制，它们可以具有适用于任意特定应用的尺寸。为了与当前实验室的装置兼容，外部尺寸为标准的显微镜玻片尺寸更小的尺寸的微流体芯片比较容易制作。其他的微流体芯片尺寸也可定制为适应仪器使用的标准尺寸，例如质谱仪的样本室，或者培养箱的样本室。本发明的微流体芯片的微室可以是任意形状，如矩形、正方形、椭圆形、圆形或者多边形。微流体芯片中的微室或者通道的底部可以是方形、圆形、V型或者U型。微室底部的形状在特定芯片中并不需要一致，它们可以根据芯片上进行的特定SELEX的需要而变化。本发明的微流体芯片的微室可以是任意的宽度与深度比。本发明的微流体芯片中的微室(孔)以及通道可以具有与所需要使用的样本容积所兼容的任意容积或直径。该微室(孔)或者通道可以用作储液室、混合室、或者化学或生物反应进行的地方。

[0051] 本发明的微流体装置优选的包括至少一个微室，位于输入口和输出口之间，并与一条或者多条流体通道流体连接。优选的，分子结合区被包含于至少一个微室中。

[0052] 在一个实施方式中，该微流体装置的每条通道含有2个或多个微室。这2个或多个微室的每一个可含有相同的靶点分子，或者这2个或者多个微室可含有不同的靶点分子。因此，加载了多个靶点的装置能够用于对多个靶点进行并行的SELEX。该实施方式提供含有
2个或者多个紧密分布的微室，其中具有含靶点的溶胶-凝胶材料，从而对核酸适体的筛选能够并行进行，这克服了SELEX筛选一次针对一个靶点的局限性。这使得能够同时筛选多个靶点的核酸适体。

[0053] 如其相应的实例所证明的，该实施方式的一种形式是在单个通道中含有5个微室，能够平行的针对四种不同的分子靶点进行4个并行的SELEX筛选，其中一个微室作为对照组。其他的多通道形式也可以进行，包括但不限于，24通道、96通道、120通道、240通道以及更高通道数量。这些更高的SELEX多通道筛选方案可使用单个流体通道或者多个流体通道进行。当使用多个流体通道时，不同的通道可用在，例如，利用本发明的微流体SELEX程序的不同筛选轮次。

[0054] 在本发明的一个优选的实施方式中，分子结合区具有含靶点分子的高表面积材料。这种高表面积材料用于容纳或捕获靶点分子，从而使靶点分子能够在保持天然状态的条件下有效地与核酸适体结合。即是，该靶点分子优选的不经任何可能影响到其表面结合位点可用性的化学修饰。分子结合区优选地包含于微流体芯片的一个或者多个微室内。对于高表面积材料，该材料应具有丰富的多孔结构能够使核酸分子扩散至材料的微孔中，与其中所含有的靶点分子进行接触以及进行可能的特异性结合。

[0055] 该高表面积材料可以是溶胶-凝胶衍生产物(Reetz et al.，Biotech Bioeng 49：527-534(1996)；Frenkel-Mullerad，et al.，J Amer Chem Soc 127：8077-8081(2005)，这些文献在此被全文并入参考)，水凝胶衍生产物，如那些使用聚丙烯酰胺或聚乙二醇形成的产物(Xu et al.，Polymer Bulletin 58(1)：53-63(2007)；Gurevitch et al.，JALA 6(4)：
87-91(2001)；Lueking et al.，Molecular & Cellular Proteomics 2：1342-1349(2003)，这些文献在此被全文并入参考)，聚合物刷衍生产物(Wittemann et al.，Analytical Chem.76(10)：2813-2819(2004)，该文献作为参考并且其全文被并入本文)，硝化纤维素膜包产物，或基于树状高分子的产物(Pathak et al.，Langmuir 20(15)：6075-6079(2004)，该文献作为参考并且其全文被并入本文)。在这些材料当中，优选使用溶胶-凝胶衍生材料。

[0056] 使用溶胶-凝胶材料捕获靶点分子的一个优势是不需要使用联接物或标签来固定靶点分子。在溶胶-凝胶中封装靶点分子是十分有利的，因为溶胶-凝胶材料能够很容易实现微型化。相比其他可用的捕获方法，如膜封装法，该方法要可靠得多，并且更加简易。此外，在玻璃溶胶-凝胶材料中进行捕获还能够使用简单的测光方法对很多酶反应进行光学监测。获得这样的溶胶-凝胶材料的方法在以下参考文献中有详述，Wright et al.，“Sol-Gel Materials：Chemistry and Applications，”CRC Press(2000)；Pierre，A.，“Introduction to Sol-Gel Processing(The International Series in Sol-Gel Processing：Technology & Applications)，”Springer(1998)；Brinker et al.，“Sol-Gel Science：The Physics and Chemistry of Sol-Gel Processing，”Academic Press(1990)，这些文献在此被全文并入参考。

[0057] 溶胶-凝胶过程是一种湿化学过程，可用于制作陶瓷或者玻璃材料。一般来说，溶胶-凝胶过程涉及体系从液体“溶胶”(主要是胶体)到固体“凝胶”相态的转化。通过应用溶胶-凝胶过程，可以制作各种形式的陶瓷或者玻璃材料：超细或者球形粉末，薄膜涂层，陶瓷纤维，微孔无机膜，单片陶瓷和玻璃，或者超多孔气凝胶材料。本发明所需要的是溶胶-凝胶与加热元件保持邻接，即在一个或者多个微室中，涂层和单片结构是优选的。

[0058] 用于制备“溶胶”的起始材料通常是无机金属盐或者金属有机化合物如金属烷基氧化物，包括但不限于，含有硅、铝、钛及其组合的金属烷基氧化物。也可以使用其他金属氧化物。在典型的溶胶-凝胶过程中，前体经过一系列的水解反应和聚合反应以形成胶质悬浮液，或称为“溶胶”。进一步对该“溶胶”进行操作以去除溶剂，从而能够制做出上述类型的不同形式的陶瓷材料。

[0059] 溶胶-凝胶过程提供了相对温和的途径以固定生物分子如蛋白质，其被限制于不断生长的共价凝胶网络中，而不是通过化学修饰粘附到无机材料上(Gill，et al.，Annals of the New York Academy of Sciences 799：697-700(1996)，Gill et al.，Trends in Biotechnology 18：282-296(2000)，这些文献在此被全文并入参考)。很多研究详述了使用各式各样的溶胶-凝胶衍生纳米复合材料封装多种生物制品，包括酶、抗体、调控蛋白、膜结合受体、核酸适体、甚至整个细胞(Reetz et al.，Biotech Bioeng 49：527-534(1996)，Frenkel-Mullerad，et al.，J Amer Chem Soc 127：8077-8081(2005)，这些文献在此被全文并入参考)。

[0060] 关于稳定性，溶胶-凝胶捕获的蛋白质通常展示出提高了的对热变性和化学变性的抗性，并且其储存和操作的稳定性可以超过几个月甚至更长(Kim，et al.，J Biomat Sci16：1521-1535(2005)，Pastor et al.，JPhy Chem 111：11603-11610(2007)，这些文献在此被全文并入参考)。此外，Kim等人研发的溶胶凝胶基质的双纳米多孔材料(Analytical Chem78(21)：7392-7396(2006)，在此被全文并入参考)可使得分子如核酸适体能够进行扩散，而保持靶点分子(蛋白质或化学品)仍然被固定在孔洞中。这是溶胶-凝胶材料最大的优势之一，其使得溶胶-凝胶材料能够应用于SELEX方法。

[0061] 在一个实施方式中，分子结合区(例如，内嵌靶点的溶胶-凝胶)在高分子涂层上形成。该高分子涂层可以是聚(甲基)丙烯酸酯或PMMA(Kwon et al.，Clinical Chemistry54(2)：424-428(2008)，该文献作为参考并且其全文被并入本文)。该分子涂层物理隔离了溶胶-凝胶材料(及嵌于其内的靶点分子)与邻接的加热电极，从而避免了直接对靶点分子进行加热。

[0062] 在本发明的另一实施方式中，分子结合区可包括一个或多个流体通道或者一个或多个微室的表面，其中，通过联接分子以结合至该表面的一种或多种靶点分子修饰了该表面。微流体阵列可以形成于，例如，表面平坦的玻璃或者硼硅酸玻璃片上。靶点蛋白或者其他靶点分子共价或者非共价的结合在这种固相载体的平整表面上。所述靶点能够直接与固相载体的平整表面结合，或者通过联接分子或化合物附着至该平整表面。所述联接物可以是任何衍生于固相载体表面的分子或化合物，以便于靶点附着至固相载体的表面。该联接物可以共价或非共价的将靶点结合至固相载体的表面。此外，该联接物可以是无机的或者有机的分子。该联接分子可以进行标准的玻璃耦合化学反应。优选的联接物的一个实例是含自由氨基的化合物。

[0063] 本发明的靶点蛋白以及其他靶点分子也可以结合至位于并被保持在一个或者多个微室中的基底(例如，微珠)上。基底的实例包括但不限于，硝化纤维素颗粒、玻璃珠、塑料珠、磁性颗粒以及乳胶颗粒。优选的，靶点分子通过公知的操作流程共价地附着至基底。

[0064] 本发明的微流体SELEX流程可用于筛选对各种靶点表现出所期望的亲和力的核酸适体。例如，可识别与大分子靶点结合的核酸适体，如蛋白质的核酸适体。大分子靶点的实例包括但不限于，IgE、Lrp大肠杆菌metJ蛋白、弹性蛋白酶、人免疫缺陷病毒逆转录酶(HIV-RT)、凝血酶、T4DNA聚合酶、以及L-选择素。还可以识别与小分子靶点结合的核酸适体，例如，针对多肽，氨基酸或其他生物小分子靶点的核酸适体。小分子靶点的实例包括但不限于，ATP、L-精氨酸、卡那霉素、青紫霉素、新霉素、烟酰胺(NAD)、N-甲基中卟啉(NMM)、茶碱、妥布霉素、D-色氨酸、L-缬氨酸、维生素B12、D-丝氨酸、L-丝氨酸、γ-氨基丁酸(y-ABA)以及有机染料。也可识别与高分子结合的核酸适体，这些高分子的非限定性实例有，病毒，如人细胞巨化病毒(HCMV)，细菌，真核细胞，细胞器以及纳米颗粒。广义上来讲，适宜作为靶点的生物材料包括但不限于蛋白质或多肽、糖类、脂类、制药剂、有机非制药剂或者高分子复合物。糖类、多糖、底物、代谢产物、过渡态类似物、辅助因子、药物分子、染料、养分、脂质体也可用作靶点分子，只要它们能够被固定于微流体装置中，优选的为固定于多孔的溶胶-凝胶基质中。本领域的技术人员能够容易使用可作为本发明的靶点的生物材料增补该靶点清单。此外，可以根据需要，以能够检测到的取代基，如离子、配体、有光学活性的化合物或通常被用于标记生物学或化学化合物的成分，来标记或修饰该生物材料。

[0065] 图1A-B和图2展示了微流体装置10的一个优选的实施方式。该微流体装置10在玻璃基底12上形成，其上方固定有PDMS盖14。基底12和盖14共同限定了在输入口18和输出口20之间形成的微流体通道16。该通道的特征在于在沿长度方向上间隔地分布有5个微室22。每一微室22均位于加热电极24之上，电极24位于装置两边的电接点26之间。在该实施方式中，加热电极24通过聚甲基丙烯酸脂涂层28(参见图2)与微室物理隔离。在把PDMS盖14固定至基底12以前，含有目的靶点分子的溶胶-凝胶材料30被沉积于一个或者多个微室22中，优选的位置为直接位于加热电极24之上或者与其邻接(参见图1B)。如以上所述，以对应的微室22可以有效地限制靶点分子。

[0066] 根据图2所示，装置10的制作可以通过如下过程进行，首先将一个或多个电极24(以及它们的接点26)图案化至基底12清洁后的表面。然后，在整个表面上旋涂聚甲基丙烯酸脂高分子材料，用硅遮掩(在高分子涂布的电极之上)，然后包被的基底通过蚀刻以去除遮掩处以外的高分子材料。该高分子涂层28有效的隔离了加热电极24和微流体装置中将形成微室22的位置。蚀刻完成之后，可以进行含目的靶点分子的溶胶-凝胶的生成，并将溶胶-凝胶悬浮液沉积于高分子层28之上。在溶胶-凝胶材料沉积完成之后，使溶剂挥发或将装置放于合适的条件下使其干燥，从而形成溶胶-凝胶点30。之后，基底12掩盖上图案化的PDMS盖14以形成微流体装置10。

[0067] 该微流体装置10将与微流体SELEX系统40组合使用，它的一个实施方式如图1C所示。所述系统40包括核酸适体群体42(其可以是前几轮SELEX筛选出的核酸适体的富集的池或者尚未通过SELEX筛选的核酸分子随机群体)、洗涤缓冲液44、封阻缓冲液46以及结合缓冲液48的储液池。储液池可以通过多端口偶联装置与50和液体管线52实现连接，通过装置10的输入口按序将材料导入。与输出口连接的是液体管线54，根据需要其可通过阀和多端口偶联装置与一个或者多个收集容器56连接。优选的，每个容器是用于接收装置中单个微室所洗脱下来的核酸适体群体，即是，特异的针对某个特定靶点分子的核酸适体。如图1C所示，例如，阴性对照室和1-4室都对应有收集容器。对阀门进行适当的开与关操作能够引导洗脱的核酸适体群体从特定的微室流入相应的容器中。

[0068] 可以泵手动地控制各种液体在装置10中的流入和流出，可通过对相应电极通电手动地控制加热元件的操作。或者，可以利用编程的操作系统来自动控制装置10中液体的流入和流出，以及加热元件的操作，该操作系统可控制一个或者多个泵以及一个或者多个阀的时序，这些泵和阀分别调控核酸适体池、洗涤缓冲液、封阻缓冲液和/或结合缓冲液输入装置，该操作系统也可控制加热元件为洗脱结合的核酸适体以及随后将它们收集至对应的收集容器而进行的加热操作的时序。

[0069] 由于SELEX过程具有高度的连续性，优选的，各种与微流体芯片相关的系统为自动化系统，并且有易于编程和修改的配套的计算机软件。本发明的微流体系统的计算机可控制系统的进程，并接收信号进行解释。例如，该计算机能够控制从储存容器中获取SELEX循环所需的样本或分析物的机器人子系统。该计算机能够控制样本站以指定的吸取配方中的样本和试剂至微流体装置中的顺序。可使用本领域公知的计算机接口通过计算机在微流体装置上施加压力差和电势，从而控制泵和阀装置以调控试剂流入和流出系统。该计算机可以是独立的子系统，其可以是作为多功能分析仪器的整合部分，或者是模块化的子系统中独立的计算机。

[0070] 控制过程和解释探测器探测信号的计算机系统可以是本领域所知的任意计算机系统。该计算机还包含软件程序，例如，可用于关联、分析和评估一个或者多个核酸适体是否存在的探测器探测信号，评估探测器探测信号以定量核酸适体，检测和评估功率水平以计算加热元件散发的热量和加热元件处的温度，分析熔解性，计算核酸适体紫外吸收从而进行核酸适体的设计和筛选。该计算机可与一个或者多个控制液体流入和流出的阀门，各种微流体芯片中的加热元件控制器，流速控制器，进行功能通信，以控制芯片或者探测器中流体的流速和方向。该计算机还可以控制电源电路，控制机械驱动器，通过通信线路接受信息，储存信息，解释探测器探测信号，计算相关性等等。

[0071] 本发明中的系统可包括，例如，数字计算机，其含有录入了数据集和指令集的软件系统，以实施本文所述的多种分析方法。该计算机可以是含合适操作系统和控制软件的个人电脑，或整合在系统中的简单的逻辑装置，如集成电路或具有存储装置的处理器。解释探测器探测信号的软件是现有的，或者可以由掌握标准编程语言如Visualbasic、Fortran、Basic、Java等等的技术人员容易构建。

[0072] 虽然图1C中所示系统40仅包括具有单个核酸适体库源的单个芯片库，本领域的技术人员应该知道本发明的系统可修改以适用于多通路SELEX程序，在一个或者多个芯片中筛选一个或者多个靶点的2个或者多个核酸适体库。这能够提供多种核酸适体-靶点组合的结果。多通路SELEX系统可包括，例如，具有含一个或者多个靶点的一个或者多个反应室的微流体装置，两个或者多个库流至这一个或者多个反应室中以接触靶点，以及一个或者多个探测器、测序仪或分析仪器，用于探测由靶点和核酸适体库接触所产生的信号。所获得的信号可被评估，以确定样本本中是否存在核酸适体及其序列，或对样本中的核酸适体进行定量。该系统对于分析靶点/核酸适体组合的阵列是很有帮助的。

[0073] 本发明的微流体芯片可与各种样本操作站进行液体接触。这些样本操作站可以是，例如，自动取样仪，如在环形托盘上载有多个核酸适体库的旋转样本架，通过按序或随机旋转使一个或者多个移液器对齐库容器。该移液器能装于驱动臂上，通过驱动臂将移液管伸入样本中取样或输运。微流体芯片也可以与洗脱收集器连接，洗脱收集器可以是，例如，自动收集器。这些收集器在SELEX过程中可收集来自各微室中洗脱的液体。样本站也可以保持装载有一个或者多个样本或洗脱液的微孔板。该样本站能够以X-Y平面移动方式平移微孔板使得板中任一样本孔对齐移液管。

[0074] 在该系统的很多实施方式中，样本或者试剂的容积非常小，例如，很多分子库的典型容积。从这样的库或者洗脱的核酸适体中取样，例如，在微孔板或者微阵列载片上取样，通常是由机器人系统完成，它能够精确地把移液器枪头定位在微量样本中。在库成员是脱水形式的实施方式中，能够很方便的以移液器中注入少量的溶剂以溶解样本并输入至本发明中的微流体装置中。

[0075] 本发明的方法是有关使用微流体芯片的改进的SELEX方法。SELEX是组合化学的“演化”的方法，它通过体外筛选以鉴定与特定靶点具有高亲和力的RNA或DNA序列(Joyce，Gene，82：83-87(1989)；Ellington et al.，Nature 346：818-822(1990)；Tuerk et al.，Science，1990；249：505-510(1990)，这些文献在此被全文并入参考)。一些文献描述了SELEX过程 (Joyce，Curr.Opin.Struct.Biol.，4：331-336(1994)；Lorsch et al.，Acc.Chem.Res.，29：103-110(1996)；Forst，J.Biotech.，64：101-118(1998)；Klug et al.，Mol.Biol.Rep.，20：97-107(1994)；美国专利案5,270,163，5,475,096和5,707,796to Gold et al.，这些文献和专利在此被全文并入参考)。该过程使用能区分高亲和力结合物和低亲和力结合物的技术将功能性的高亲和力分子从随机的DNA或RNA池中分离出来。这些对靶点具有高亲和力的功能序列已用作为针对特定生物受体的药物，或者用作生物医学分析或成像的诊断试剂。

[0076] 传统SELEX的一般过程涉及随机DNA序列池(大约≥1014-1015不同的序列)的筛选。通常DNA被转录为比DNA更有功效的RNA。RNA池随后通过含有结合至固相的靶点分子的微室。对固定的靶点分子具有亲和力的RNA被保留在固相上。对靶点分子没有亲和力或具有弱亲和力的RNA被洗脱。结合的RNA随后通过使用含有自由配体的溶液从固相上洗脱，或通过改变结合条件洗脱。洗脱的RNA分子然后进行逆转录，所得到的DNA进行PCR扩增。重复多次以后，这样的筛选循环去除了池中非活性的RNA，仅保留了对靶点分子具有特异性和高亲和力的序列。这种SELEX技术已被成功的应用于针对各种靶点分子筛选具有亲和力的分子(Wiegand et al.，J.Immun.，1996；157：221-230(1996)；Huizenga et al.，Biochem.，1995；34：656-665(1995)，这些文献在此被全文并入参考)。

[0077] 本发明的微流体SELEX筛选过程通过使用微流体芯片，从候选核酸混合物中识别靶点分子的核酸配体。这样的候选核酸混合物也可称为“库”、“组合库”、“随机组合库”、“组合池”、“随机池”或“随机DNA池”。例如，在一个要进行筛选的候选核酸混合物中，每个核酸序列可以具有随机区，以及其两边的引物特异区。随机核苷酸的数量可以是任意长度，但通常其长度是10至80个核苷酸，更优选的为20-60个核苷酸。引物特异区也可以是使其发挥引物作用的任意尺寸，但通常其长度为10-40个核苷酸，优选地为约15-30个核苷酸。无论如何，随机区的核苷酸长度可以容易的按照需要增减。类似的，两端的引物序列可以根据PCR所需条件进行修饰。此外，可挑选库中所用的引物序列以减小PCR反应中引物-引物相互作用或引物二聚体的形成。设计的引物可以是各种熔解温度；设计引物的方法为本领域所公知。

[0078] 这样的池含有对靶点分子具亲和力的核酸分子以及对靶点分子不具亲和力的核酸分子。候选核酸分子混合物可是单链DNA或单链RNA的随机池。用于微流体SELEX的库也可与传统SELEX所用的DNA或RNA随机池相似(He et al.，J Mol Biol 255：55-66(1996)；Bock et al.，Nature 355：564-566(1992)，这些文献在此被全文并入参考)。另外，微流体SELEX过程所使用的的池可以是通过传统SELEX过程筛选过一轮或者多轮的部分筛选的池。

[0079] 请参图3A，微流体SELEX过程是有关筛选与一种或者多种靶点分子结合的核酸适体。该方法包括在允许核酸分子与靶点分子有效地特异地结合的条件下将核酸群体导入至微流体装置中。该方法进一步包括从该微流体装置中基本去除所有不与靶点分子特异结合的核酸分子，然后对加热元件加热以使与靶点分子特异结合的核酸分子(即，核酸适体)变性，然后回收与靶点分子特异结合的核酸分子。这些回收的核酸分子是筛选出的针对它们所结合的靶点分子的核酸适体。

[0080] 该过程可重复任意次数。例如，所产生的与靶点结合的核酸分子的富集群体可逆转录(根据需要)，扩增，然后(i)进行克隆和测序，或者(ii)转录形成与靶点结合的核酸的富集的池，其可再通过加载了相同靶点分子的微流体SELEX装置；或者两种操作都实施。

[0081] 本发明的微流体SELEX过程产生了一类称为核酸适体的产物，每一个核酸适体都具有独一无二的序列。本文中所使用的“核酸适体”是能够与靶点化合物或分子特异结合的核酸配体。但“核酸适体”这个术语并不能衡量核酸与靶点的亲和力。本发明的目的是将对靶点具有高亲和力的核酸适体从低亲和力核酸适体池中筛选出来。这样，核酸适体针对靶点具有高结合亲和力，并具有分子识别的特性。筛选出的核酸适体可以进行克隆和测序，从而能够大量生产单个分离的和纯化的核酸适体。

[0082] 在本发明的一个实施方式中，核酸适体由RNA形成，该方法进一步包括对筛选出的核酸适体群体进行逆转录扩增。通过微流体SELEX过程获得的筛选出的RNA核酸适体可使用本领域常用的逆转录技术逆转录成为DNA。逆转录是将单链RNA序列转化为单链DNA序列的酶学方法。用于逆转录的酶被称为RNA依赖型DNA聚合酶(Gelfand的美国专利第5,322,770号以及第5,641,864号，Hayashizaki的美国专利第6,013,488号，这些专利在此被全文并入参考)。

[0083] 在本发明的另一实施方式中，核酸适体由DNA形成，在这种情况下，核酸适体的富集池可根据需要直接进行扩增、克隆和测序，并重新导入通过载有相同靶点分子的微流体SELEX装置中。

[0084] 该方法可进一步包括对经扩增的核酸适体群体进行纯化和测序。通过微流体SELEX过程所得到核酸适体进行扩增后仍是对靶点分子具有类似的结合亲和力的核酸适体序列的混合物。这些不同可能很小(例如，核酸适体的不同位置具有相似的序列)或展示完全不同的结合机制(结合至靶点分子的不同位点)。克隆和测序可用于表征单个核酸适体，以及鉴定结合基序。本领域技术人员所知的各种克隆和测序的流程都可用于表征单个核酸适体。

[0085] 该微流体装置可设计为具有微室以及与含有靶点分子的微室流体接触的通道，这样，核酸适体和试剂进行混合后能够进入微室与靶点分子接触以形成反应混合物，其可产生或者不产生特定信号。含靶点的微室可与微流体装置中的其他含有试剂的微室流体接触，或者优选的与试剂或者核酸适体库池流体接触，或者与液体操作站流体接触，该操作站能够串行地或并行地接收或输运多个试剂、反应物或产物。

[0086] 试剂可以是任意SELEX过程中有用的组分，例如，能够与核酸适体或靶点分子相互作用的化学试剂或生物分子，能够控制反应条件的化学试剂或生物分子，或者能够产生可探测信号的化学试剂或生物分子。试剂通常是溶液中的一种或者多种分子，或者固定于微流体芯片上的一种或多种分子，它们能够流动以与微室中的靶点接触，或者与核酸适体或者核酸适体池接触。例如，试剂可以是洗涤缓冲液、结合缓冲液或者封阻缓冲液。其他试剂包括发色团，它能与靶点反应提供改变的光学信号。系统中的试剂还可包括附着至介质(如，凝胶或固相载体)的分子，它们能够与靶点或核酸适体相互作用。例如，该试剂可以是固相载体上的亲和分子。不止一种试剂能参与可探测信号的生成。本发明系统中所用的典型试剂包括，例如，位点特异试剂、PCR引物、标记的配体、发色团、抗体、荧光基团、酶、荧光共振能量转移(FRET)探针、分子信标、放射性核素和/或类似的试剂。

[0087] 微流体装置中靶点分子与特定试剂和核酸适体是在微室内进行接触的。这些微室也可被配置成提供为提供由靶点和核酸适体接触而产生的可探测信号所必需的条件，或提供将特异的或更高亲和力的核酸适体和非特异的或更低亲和力的核酸适体区分开的条件。核酸适体对靶点分子的亲和力取决于各个靶点的特性、反应条件以及所用的核酸适体池。
例如，反应室能够受到力的作用以引导液体流动，具有可控的温度以进行结合和洗脱，具有足够的长度以在流动中提供充分的孵育时间，具有固相载体以保持或者捕获反应成分，保持筛选介质和/或类似功能。该装置可具有单个反应室或者多个反应室。

[0088] 反应室还可以是，例如，温控循环仪扩增室，能够在微室中存在反应混合物时按照可编程的温度控制方案使得微室温度进行多次循环。温控循环室中的扩增反应是典型的聚合酶链式反应(PCR)，以扩增样本中稀有的或者稀释的核酸序列，从而使它们能够被检测或测序。目前已有很多高通量的进行PCR和其他扩增反应的方法，例如，在微流体装置中进行扩增反应的方法，以及在装置中探测和分析扩增的核酸的方法(Knapp等的美国专利第6,444,461号、第6,406,893号、第6,391,622号，Kopf-Sill等的美国专利第6,303,343号，Nagle等的美国专利第6,171,850号，Loewy等的美国专利第5,939,291号，Wilding等的美国专利第5,955,029号，Chow等的美国专利第5,965,410号，Zhang et al.Anal Chem.71：
1138-1145(1999)，这些文献在此被全文并入参考)。

[0089] 在一些情况下，反应室也可以作为各种试剂的孵育室和/或混和器，例如，供化学试剂或生物分子特定地与靶点反应以产生结合构象。在其他情况下，反应室可含有选择性介质形式的试剂。选择性介质可是本领域所公知的介质，如，尺寸选择性介质(例如，尺寸排除介质或电泳凝胶)，等电聚焦(IEF)技术所使用的两性电解质缓冲液，离子交换介质，亲和介质(例如，凝集素树脂、附着至固相载体的抗体、金属离子树脂等等)，疏水作用树脂，螯合树脂和/或类似介质。例如，使样本与尺寸排除介质试剂接触能够将目标核酸适体同其他成分分开，从而在预定的保留时间后的吸收信号可被解读，以确定样本中是否存在核酸，或者确定核酸的量。

[0090] 微流体装置还可包括可被探测器监测的探测区，探测器探测器探测信号，这些信号如，靶点与核酸适体接触产生的信号，与样本分析物反应后的试剂所产生的信号，可探测信号的消失(例如，样本分析物的量不足以产生探测器敏感度能识别的信号，从而认为该分析物不存在)，与样本分析物的量相关的信号幅度和/或类似的信号。探测区可以是与传感器功能性接触的一个或者多个通道、微室区域或者微室。例如，探测区可以包括传感器，如pH电极、电导仪电极。探测区可包括一个或者多个对特定波长的光具有通透性的微室，使得光信号，例如，吸收、荧光发射、化学发光等能够被探测到。探测器可以位于微流体装置中，或者与该装置相近，处于接收样本与试剂接触后产生信号的方向。探测器可包括，例如，核酸测序仪、荧光计、电荷耦合装置、激光器、光电倍增管、分光光度计、扫描探测器、显微镜或者Galvo 扫描仪。从试剂与样本相互作用探测到的信号可以是，例如，光波长的吸收、光发射、放射性、导电率、光的折射等等。信号的特征，如幅度、频率、持续时间、计数等等可以被探测到。

[0091] 探测器可以从探测区探测信号，该区域以物理尺寸描述，如发出信号的探测点、线、面或容积。在很多实施方式中，探测器监视的探测区基本上是从反应通道流出的反应混合物流经的通道上的点。在其他的实施方式中，该探测器可以在反应混合物流动时或者停止时，沿着通道的长度方向扫描探测区。在又一些实施方式中，该探测器可扫描表面或容积的图像以获得试剂和样本相互作用所产生的信号。例如，探测器可以同时成像多个并行的通道，这些通道含有来自多个分析的反应混合物，从而能够同时探测多个不同分析的结果。

[0092] 该探测器能够发送表达接收到的结果信号特征的探测器信号。例如，探测器可以与输出装置进行通信，如模拟的或数字的计量器，其显示与结果信号强度成比例的值。该探测器可以通过数据传输线与计算机通信，以传输模拟的或者数字的探测器信号，对信号进行显示、储存、评估、关联等操作。

[0093] 虽然在以上展示的实施例中是使用加热元件来变性与靶点分子结合的核酸。在本发明的另一替换实施方式中，该微流体装置可以加以改造以去除加热元件，而是使用含有高度严格的洗涤试剂的储液池代替，这些洗涤试剂能够有效的使核酸适体发生化学变性。变性是通过使用一些外在的压力或者化学试剂，如强碱性试剂或者离液剂如甲酰胺、胍盐或者尿素，使核酸失去三级结构和二级结构的过程。核酸如DNA或RNA的变性通常在高温下也会发生。在二级结构层面上，变性是双链分解为两条单链。当两条链之间的氢键破裂时就会发生。在三级结构层面上，RNA各个位点间的相互作用，如氢键结合，可以被变性剂干扰。

[0094] 本发明的方法可以使得在一个或者多个独立的流体装置上进行回收、逆转录、扩增、纯化和/或测序，这些流体装置与本发明的微流体装置通过流体连接。这些装置可以是，例如，温控循环仪扩增室、色谱分析室、温育室、亲和捕获室、序列探测室或者进行类似任务的装置。这些微室还可包括探测区或连接至探测区以探测例如，测序反应所产生的信号。所产生的信号可以使用任何合适的探测器探测。探测器可以串行的或并行的方式分别探测来自两个或者多个反应室的信号。所产生的提供关于核酸适体或者靶点或者其他分析物的信息的信号可以是，例如，由与样本核酸适体反应的试剂所产生的可探测信号，或者由核酸适体与靶点结合所产生的信号，可探测信号的缺失，和/或与结合至靶点的核酸适体的量相关的信号幅度。探测器可以是，例如，荧光计、电荷耦合装置、激光器、酶、酶底物、光电倍增管、分光光度计、扫描探测器、显微镜、Galvo扫描仪、质谱仪、液相色谱-质谱仪、高压液相色谱(HPLC)或者其他色谱检测方法，和/或类似的探测器。

[0095] 本发明的核酸适体是分析化学的有力工具，对于各种诊断分析均有帮助，并且能对很多研究领域提供直接的帮助，包括生物医学和健康研究。例如，提高了的结合效率和/或提高了的结合选择性对于开发作用于特定生物受体的核酸适体的药物非常有利。提高了结合效率和选择性的核酸适体能够提高药物学活性，并具有更少的副作用。改良的核酸适体还能够为开发诊断分析提供帮助，这些分析的探测往往受限于结合亲和力。改良的核酸适体还能够作为诊断标志物用于许多领域，例如，用于医学分析，体内成像和生物传感器。选择性的提高也有益于定量复杂基质中存在的靶点。核酸适体可开发用于其他基于核酸适体的分析，如对分析物的分析。已有技术已经描述了各种核酸适体的用途，本发明所披露的方法能够扩展到这样的应用中(German et al.Anal.Chem.，70：4540-4545(1998)；Jhaveri et al.，J.Amer.Chem.Soc.，122：2469-2473(2000)；Lee et al.，Anal.Biochem.，
282：142-146(2000)；Bruno et al.，Biosens.Bioelec.，14：457-464(1999)；Blank et al.，J.Biol.Chem.，279：16464-16468(2001)；Stojanovic et al.，J.Am.Chem.Soc.，123：
4928-4931(2001)，这些文献在此被全文并入参考)。

[0096] 本发明的微流体SELEX过程还可用于开发诊断分析用于神经方向的化合物--如神经肽或小分子神经递质，如谷氨酸盐和锌离子。基于核酸适体的诊断分析还可实现神经肽分析，其通常在体内以皮摩尔浓度存在。核酸适体可作为药物使用，可以通过筛选对特定生物受体具有亲和力的分子而设计(Osborne et al.，Chem.Rev.，97：349-370(1997)；Brody et al.，Rev.Mol.Biotech.，74：5-13(2000)；White et al.，J.Clin.Invest.，106：
929-934(2000)，这些文献在此被全文并入参考)。这样的核酸适体药物可用于修饰生物学信号通路或清除靶点病原，如病毒或癌变细胞。例如，结合至IgE的核酸适体能抑制免疫反应，对治疗过敏反应和哮喘有用(Wiegand et al.，J.Immun.，1996；157：221-230(1996)，该文献作为参考并且其全文被并入本文)。本发明的SELEX方法也可用于筛选那些不仅结合至靶点分子，还具有催化剂功能的RNA或DNA(Lorsch et al.，Acc.Chem.Res.，29：
103-110(1996)，该文献作为参考并且其全文被并入本文)。本发明的核酸适体包括含经修饰的核苷酸，该核苷酸赋予了该核酸配体改良的特性，如提高了体内的稳定性或提高了输运的特性。这种修饰的实例包括但不限于，核糖和/或磷酸盐和/或碱基位点所进行的化学取代。

[0097] 本发明的另一方面涉及试剂盒，该试剂盒包括本发明的微流体装置或芯片，以及可选地包括一个或多个随机核酸分子池、洗脱缓冲液、结合缓冲液、封阻缓冲液，进行逆转录、PCR和/或转录的试剂，以及实施本发明的微流体SELEX过程的说明。本发明的微流体装置或芯片可在试剂盒中以完全组装好的形式提供，这种情况下，该装置的不同微室中预装了一种或者多种靶点分子。作为替换方案，该微流体装置或芯片还可以以未组装的形式提供，在这种情况下，试剂盒还可包含固定靶点分子的试剂，优选用于形成高表面积的材料的试剂(例如，溶胶-凝胶试剂)，和实施固定靶点分子和组装该装置或芯片的说明。实施例

[0098] 本发明将通过下述实施例进一步阐明，这些实施例旨在作为本发明的示例。

[0099] 实施例1-8的材料和方法

[0100] 化学试剂和材料。SU-8 2075和PMMA A11购于Microchem(Newton，MA)。载玻片购于VWR(Batavia，IL)。用于多芯片制作的直径为4英尺的硼硅酸晶圆购于Corning (Corning，NY)。重组酵母TATA结合蛋白(TBP)和酵母TFIIB(转录因子IIB)蛋白根据文献制备(Fan et al.，Proc Nat’l Acad Sci USA 101：6934-6939(2004)，该文献作为参考并且其全文被并入本文)。SDS-PAGE凝胶电泳被用于确证这些蛋白的表达情况。为了制备SDS-PAGE凝胶，把2ml 30％的丙烯酰胺混合物、1.25ml的1.5M Tris缓冲液(pH8.8)、1.7ml的去离子水、100μl的10％SDS和100μl的10％APS进行混合，从而使丙烯酰胺凝胶的最终浓度为12％。用于PDMS制作的硅树脂184硅氧烷橡胶试剂盒购于Dow Corning公司(Midland，MI)。所有的毛细管用品，包括留尔洛克(lure lock)、毛细管和连接器购于Upchurch Scientific(Oak Harbor，WA)。用于注入RNA核酸适体的50μl和25μl注射器购于Hamilton(Reno，NV)。推送缓冲液至微流体装置的注射器(1ml和3ml)购于Aria Medical(San Antonio，TX)。

[0101] 蛋白质制备：根据标准的His-标记蛋白纯化方法，从BL21-DE3细胞中纯化His-标记的全长酵母TBP(TATA结合蛋白)、TFIIB(转录因子II)以及hHSF1(人热休克转录因子1)使用(Fan et al.，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 101：6934-6939(2004)；Sevilimedu et al.，Nucleic Acids Res.36：3118-3127(2008)；Zhao et al.，Nucleic Acids Res.34：3755-3761(2006)，这些文献在此被全文并入参考)。对于酵母TFIIA(转录因子IIA)，重组蛋白的纯化使用了S.Hahn的方法(Fred Hutchinson Cancer Research Center，Seattle)，其中，亚基Toa1和Toa2分别在大肠杆菌中表达，在8M尿素中变性，通过透析去除尿素后组合和复性(Hahn et al.，Cell，58：1173-1181(1989)，该文献作为参考并且其全文被并入本文)。透析膜(MW 10,000)根据生产商说明制备。经纯化的靶点蛋白部分在4℃下，1L透析缓冲液(20mM Tris-HCl，50mM KCl，和10％甘油，pH8.0)中透析过夜。这些蛋白的表达和纯化使用SDS-PAGE确证。

[0102] 实施例1用于芯片上SELEX的微流体装置的制作

[0103] 如图1A-B所展示类型的微流体芯片包括具有微流体通道或微室的PDMS(聚二甲硅氧烷，Dow Corning，MI)盖；以及具有一组铝电极的玻璃或硼硅酸玻璃载片。硅树脂184试剂盒提供了用于制作PDMS盖的固化剂和硅橡胶本体。固化剂和橡胶本体的比率(1∶10w/w)能得到具有优良性能和弹性的PDMS盖。混合固化剂和橡胶本体，并对混合物除气处理后，将该混合物浇灌至预制的SU-8(SU-8 2075，Microchem)母模上。该SU-8母模是在1mm厚的硅晶圆上使用常用的光刻技术获得。压印在PDMS盖上的微流体部分为170μm深和300μm宽的微通道和五个边长为1mm的六边形微室或微孔。PDMS盖的厚度为大约
5mm(见图3B)。

[0104] 选用铝做为加热器金属，因为其延展性使得可以沉积获得无应力的微米级厚的层。虽然采用了普通载玻片和4英尺硼酸玻璃晶圆都曾被可用作沉积铝的基底材料(大量的电极组件可以导入至硼硅酸晶片上)，在此，用于芯片上SELEX的装置使用了图案化有5个电极组件的普通载玻片。该玻璃载片使用RCA清洁方法清洗。该RCA清洁方法包括第一步，使用1∶1∶5的NH4OH、H2O2和H2O溶液于75℃下进行清洗；第二步，使用1∶1∶6的HCl、H2O2和H2O溶液在75℃下清洗。该方法清除了玻璃载片表面的有机物污染。该玻璃载片随后使用光刻胶覆盖。使用标准的光蚀刻技术图案化光刻胶层。随后，铝被沉积至光刻胶层的表面。使用电子束蒸发器，(Evaporator-CHA MARK 50)获得了总厚度为1.2μm的铝层。沉积之后，光刻胶使用掀离溶剂(Microposit 1165，Microchem)N-甲基吡咯烷酮处理超过24小时逐渐去除。获得的电极可作为局部的热源，用以从蛋白结合阵列中被选中的元件上释放结合的核酸适体。如图2所示。

[0105] 将铝电极沉积至玻璃载片表面之后，使用标准的光蚀刻技术以及利用Plasm Therm 72(Qualtx Technology Inc.，TX)的反应离子蚀刻工艺把1.4μm厚的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)层图案化。同样参见图2所示。

[0106] 粘合PDMS盖之前，含靶点蛋白的溶胶-凝胶混合物被沉积于图案化的PMMA表面的铝电极之上(图1B和2)。溶胶-凝胶材料参照已有文献中的方法制备(Kim，et al.，J.Biomat.Sci.16：1521-1535(2005)，该文献在此全部引用以作参考)，仅对其进行了细微的修改。

[0107] 对于以下实施例2-4中的装置，溶胶-凝胶中仅载入TBP。对于下文实施例5中的装置，溶胶-凝胶中仅载入TFIIB。

[0108] 对于实施例6中的装置，使用针型点样器(Stealth Solid pin，SNS6)把含有蛋白yTBP、yTFIIA、yTFIIB和hHSF1的溶胶-凝胶微滴分别点在单个铝电极加热器的中心。载有这四种蛋白的溶胶-凝胶位于微室1-4，如图3A中所示。第五个微室N作为阴性对照，并未载入蛋白。凝胶过程中，该芯片置于潮湿的腔中(～80％湿度)超过12小时。图案化的PMMA层增强了溶胶凝胶网络与表面的附着力；此外，它保护了铝层在电接触时不会受到电化学的腐蚀。硅酸溶胶-凝胶网络的点直径为大约300μm，所产生的典型容积为大约7nl。

[0109] 凝胶过程完成以后，利用掀离沉积工艺在溶胶凝胶点的表面沉积导电的金层(20nm左右)。该过程使用了电子束蒸发器(Evaporator-CHA MARK 50)。然后对溶胶-凝胶点的表面使用扫描电镜(Zeiss Ultra，Carl Zeiss，Germany)进行观察。

[0110] 可观察到两种不同类型的孔。小尺寸的孔直径为大约20-30nm，大尺寸的孔洞直径大小为100-200nm(图4)。这些均匀分布于整个溶胶-凝胶表面的孔，作为通向固定在内部的蛋白的分子通道。五组溶胶-凝胶均匀地沿着微流体通道点样。

[0111] 溶胶-凝胶间的距离，根据微室和电极的位置，保持在1cm，以防止其他电极对缓冲液进行不需要的加热。为进行孵育和反应，溶胶-凝胶附近布置了六边形的微室。该六边形微室以及微室间连接通道的容积分别为0.22μl和0.41μl。

[0112] 当溶胶-凝胶处于凝胶过程中时，PDMS被浇铸至SU-8母模上。在进行粘合之前，使用PDMS细胞培养孔及其塑料盖(Culture well，Grace Bio-Lab)覆盖溶胶-凝胶点，以防止其受到氧等离子体的损伤。玻璃基底和PDMS盖在氧等离子处理下进行粘合。图2展示了详细的微型芯片制作步骤的示意图。完成的微流体装置以及实验系统如图1A-C和3B所示。微流体芯片的最终尺寸为75mm×25mm×5mm。

[0113] 实施例2加热电极的设计和表征

[0114] 如上所述，所述微流体芯片内集成有五组加热电极。这些电极包括两个电极区供探针台使用，以及一个窄电阻区用于产生热量。电极的总电阻根据其厚度为大约2＜5Ω。为表征加热电极，在变化的条件下对含有TBP和TATA DNA并且熔解温度为81.5℃的溶胶-凝胶进行加热。酵母TATA结合蛋白(TBP)和TATADNA区被用作蛋白-核酸适体对，因为TBP是一个已知的测试系统。TBP识别大多数重要的真核生物核心启动子基序，即TATA元素。TBP是所有酵母中RNA聚合酶转录所必不可少的。在制备溶胶-凝胶时，向混合物中掺TM
入了TBP，以及嵌入SYBR Green I(Invitrogen，Molecular Probes)染料标记的TATADNA。
TATA DNA的熔解温度通过使用定量PCR仪进行测定。完全凝胶之后，利用Keithley2400电源电表(Cleveland，OH)对电极通电，从而对其中结合缓冲液流速为90μL/min的微流体室内的溶胶-凝胶进行加热，其中，该电表可产生的最大功率为22W。加热的效果在荧光显微镜下同步观测。IP-Lab软件用于在5分钟的时间内连续拍摄30张荧光照片。每个溶胶-凝胶点的荧光强度使用Matlab设计的程序进行分析。

[0115] 如图5A-D所示，对电极施加了各种电压。相应的溶胶-凝胶的荧光照片附在每幅图上。单独地确定了电极能够在2分钟内使PBS缓冲液微滴(＜10μl)沸腾。基于此，100mW、424mW、536mW、645mW的电源功率被分别加载于单个溶胶-凝胶。在电源输运相应功率的时候，进行连续的荧光拍照(照片间间隔20秒)，并对每个照片的强度和时间做图。这些荧光强度的趋势表现出遵循指数衰减模型。因此，这些数据被拟合至如下模型：

[0116] I＝IB+I0e-t/τ

[0117] 其中I是溶胶凝胶的强度，IB是非特异性结合至溶胶-凝胶的荧光分子的强度，I0是溶胶-凝胶初始的强度，τ表示强度的半衰期。所有四幅图片表明获得的数据之间具有2
很好的一致性，并且以很高的相关性拟合至以上方程所表示的模型(R ＜0.9853、0.9905、
0.9969、0.9976，对应功率100、424、536、645mW)。对于功率100mW、424mW、536mW以及645mW，强度衰减的半衰期为分别为39.4秒左右、7.4秒左右、3.4秒左右和1.8秒左右。这些结果表明当电极上的功率超过400mW时，铝电极把溶胶-凝胶加热到高于TATADNA的熔解温度(81.5℃)。

[0118] 实施例3固定蛋白和核酸间的相互作用的可视化

[0119] 使用PDMS盖封闭含TBP的溶胶-凝胶。封装之后，通过连接主通道的一端与注射泵(泵11，Harvard Apparatus，Holliston，MA)，以PBS缓冲液(结合缓冲液)充分清洗通道。预清洗步骤完成后，以含25mM Tris-Cl(pH 8)、100mM NaCl、25mM KCl和10mMMgCl2以及5％脱脂牛奶的1X结合缓冲液封阻硅酸凝胶点1小时。封阻缓冲液作为反应混合物中的非特异性竞争结合物，有助于具有高亲和力的分子的筛选。然后合成的TATA DNA互补链，其核酸序列为5’-Cy3-GGGAA TTCGG GCTAT AAAAG GGGGA TCCGG-3’(SEQ ID NO：1)和5’-CCGGA TCCCC CTTTT ATAGC CCGAA TTCCC-3’(200pmole)(SEQ ID NO：2)，在退火缓冲液(20mM Tris-Cl(pH 7.5)，10mM MgCl2，和50mM NaCl)中混合，使终容积为50μl，在95℃下孵育5分钟，然后缓慢降温至室温。Cy-3，一种青色素染料，常用于测量双链DNA的熔解温度。该Cy-3标记的TATADNA被导入微流体室中，然后使DNA孵育2小时。然后使用洗涤缓冲液进行清洗步骤。结合之后，固定的TBP蛋白与Cy-3标记的TATA DNA的相互作用通过荧光显微镜监测。

[0120] Cy-3标记的TATA DNA对TBP具有高亲和力，类似于传统方法筛选出的核酸适体。TATA DNA与TBP的结合分析在溶胶-凝胶微流体芯片中进行。在该实验中，凝胶过程仅在溶胶-凝胶中固定了TBP。25μl反应容积内的200pmole TATA DNA被导入至微流体微室中。测得的TATA DNA的熔解温度为72℃。经过2小时温育，整个微流体通道和微室使用此前使用的洗涤缓冲液充分清洗，在流速15μl/min条件下清洗30分钟。除阴性对照溶胶-凝胶以外的溶胶-凝胶荧光强度使用荧光显微镜检测(图6)。结果表明TATA DNA确实与溶胶凝胶中固定的蛋白质发生了结合。如图5A-D所示，溶胶-凝胶的强度随时间推移指数级衰减。因此，可认为当通入电源时，TATADNA从其靶点蛋白，TBP上释放出来。因为获得的数据同样符合实施例2中的方程，强度衰减的半衰期可在功率450mW，6.4±1.55秒时被提取获得，虽然和前一实验相比，使用了不同的成分(TATADNA-Cy3+TBP)，但该值仍然是可以接受的。该结果表明核酸适体能够被微流体装置中溶胶凝胶网络中的靶点蛋白所捕获，然后当环境温度超过核酸适体的熔解温度时，被自由释放出来。此外，核酸适体的捕获与释放可以通过使用微流体装置精确控制。

[0121] 实施例4验证选择性洗脱中的RNA核酸适体

[0122] 根据实施例2和3的结果，可预计到当以足够高的功率把溶胶-凝胶基质加热到高于嵌入的生物分子的变形温度时，结合至固定蛋白的RNA核酸适体将被洗脱。为验证RNA核酸适体与靶点蛋白结合，而不是非特异性的结合至溶胶-凝胶基质，四个固定有TBP的溶胶-凝胶和一个空白阴性对照组溶胶-凝胶被点在微流体装置中。干扰TBP与TATA DNA结合的1型RNA核酸适体被选用作为反应样本，因为它们对TBP具有高亲和力。图7A-D中，电泳图证实了1)结合的核酸适体成功的从溶胶-凝胶中释放出来。标准梯状DNA标记表明每个溶胶-凝胶的条带对应了RNA核酸适体条带的大小(＜100bp)；2)由于在空白溶胶-凝胶(阴性对照)中并未检测到条带信号或信号相当弱，说明RNA核酸适体主要不是结合于溶胶-凝胶基质而是结合至TBP；3)在指定PCR循环中能够检测出核酸适体的浓度极限是大约2.6pmole至13pmole。图8A-B比较了同一块琼脂糖凝胶中来自每个样本的条带强度。条带的强度与注入的RNA核酸适体成正比。这是证明RNA结合至溶胶-凝胶网络中的靶点蛋白的有力证据。

[0123] 实施例5SELEX循环效率测试

[0124] 为研究微流体SELEX芯片筛选时的循环效率，对它在不同阶段从RNA池中筛选核酸适体的能力进行了测试。以往的经验表明，TFIIB和筛选出的核酸适体池之间的主要结合亲和性在第8轮(G8)SELEX过程中首次展现。作为比较，微流体SELEX过程从针对TFIIB的已知的G4、G5和G6轮RNA核酸适体池开始。这些RNA池是用传统的SELEX滤膜结合分析15
从起始池(＜2×10 个序列)得来。体外筛选实验的一个循环使用TFIIB蛋白作为靶点进行，该蛋白固定在微流体装置中的四个溶胶-凝胶中。在反应微室经过1小时温育后，加热洗脱，并进行转录，每轮(G4、G5和G6)的产物标记为G5’、G6’和G7’。这些产物对TFIIB的亲和力使用EMSA测试。实验结果如图9-10所示。图中显示，在G6’和G7’而不是G5’产物中，RNA池与TFIIB表现出了亲和力(图10B)。G7’RNA池比G6’表现出更高的亲和力。
因此，微流体SELEX芯片与传统的滤膜结合分析相比具有更好的筛选效率(提前了2个循环)。该产物确实结合至TFIIB而不是其他蛋白的现象是来自以三种不同蛋白进行的EMSA测试(图10C)。选用TFIIA和TBP是因为TFIIB是聚合酶II转录机的组件，它与DNA、TBP和TFIIA形成四联复合物。虽然这三种蛋白相互间联系非常紧密，G7’产物仅表现出针对TFIIB的亲和力。这说明这一次循环的微流体SELEX产物特异性结合至TFIIB。

[0125] 实施例6使用微流体片上SELEX装置针对体外筛选多个靶点蛋白的核酸适体[0126] 整体的实验设计如图2的示意图所示。使用四种不同核酸适体浓度进行四个独立的实验(四种靶点蛋白)。如实施例1所述，五个溶胶-凝胶微滴均匀地沿着微流体通道点样。每个溶胶-凝胶微滴能够捕获大约30fmole蛋白，从而一个微流体装置中固定了总共120fmole蛋白(四种蛋白)。

[0127] 起始池中含有～1015个不同的RNA分子。该核酸池中的成员的结构包括中心50bp长的随机区，两侧具有两个含5’-T7启动子的恒定区，便于PCR扩增(参见图14A-F)。前两个循环的筛选和扩增使用传统的硝化纤维素滤膜结合分析，按照之前所描述的进行(Yokomori et al.，Genes & Dev 8：2313-2323(1994)；Fan et al.，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 101：6934-6939(2004)；Sevilimedu et al.，Nucleic Acids Res 36：
3118-3127(2008)，这些文献在此被全文并入参考)。每个RNA-蛋白混合物在1X结合缓冲液(12mM HEPES pH 7.9、150-200mM NaCl、1-10mM Mg Cl2、1mM DTT)中温育，使用硝化纤维素滤膜分离，结合的RNA通过使用苯酚抽提回收，并进行扩增以得到下轮循环所使用的富集的池。如图11所示。

[0128] 第二轮循环完成以后，使用实施例1中的微流体SELEX平台进行了四轮循环体外筛选和扩增。在注射反应样本至微流体装置以前，微通道和反应室使用结合缓冲液浸润并封阻1小时以防止核酸适体与溶胶-凝胶或微流体装置可能的非特异性结合。然后，25μl的反应样本被注入该装置中，在室温下温育2小时。3.46μl的反应容积内的大约
1.2pmoleRNA被导入至微流体微室中。

[0129] 在这些芯片中，所有的反应和洗涤步骤使用注射泵进行。温育和洗涤完成后，使用Keithley 2400电源电表(Cleveland，OH)对电极通电，以加热结合缓冲液流速90μl/min的微流体室中的溶胶-凝胶微滴。最佳的电源功率(1.5V，450mW)被加载于铝电极作用2分钟以进行加热洗脱，从hHSF1液滴开始(微室4，接近输出口)到TBP液滴(微室1)再到阴性对照(微室N，接近输入口)。含有这些溶胶-凝胶点的微室的相对位置关系如图3A所示。按照这个顺序进行加热能够避免不希望的热效应作用于随后的微室中。

[0130] 每个洗脱的RNA核酸适体如传统SELEX一样进行回收，逆转录为cDNA，扩增，然后转录为RNA核酸适体(图3A)。逆转录反应使用逆转录试剂盒(Invitrogen，CA)进行。得到的cDNA直接进行PCR反应(15个循环)。正向引物和反向引物的序列是：

[0131] Forward(SEQ ID NO：3)

[0132] 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGAGAATTCAACTGCCATCTA-3’

[0133] Reverse(SEQ ID NO：4)

[0134] 5’-ACCGAGTCCAGAAGCTTGTAGT-3’

[0135] PCR产物的条带大小(～100bp)使用含8M尿素的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。每种PCR产物使用QIAquick PCR Purification试剂盒(Qiagen，Germany)进行纯化，然后使用MEGAshortscript试剂盒(Ambion，USA)转化为RNA核酸适体。针对TBP、TFIIA、TFIIB和hHSF1的等摩尔RNA核酸适体被导入微流体芯片中进行下一筛选步骤(图3A)。

[0136] 前面的实例已证实核酸适体能够特异性结合至它们相应的蛋白靶点，并且能够通过微加热选择性的洗脱。基于这样的片上SELEX方法，利用酵母TBP实施第一个蛋白SELEX，其之前已使用传统的滤膜结合SELEX方法筛选过核酸适体。如图3A所示，TBP蛋白以及其他3个蛋白(TFIIA、TFIIB、和hHSF1)还有一个阴性对照(不含蛋白)被固定，以在没有负SELEX步骤的条件下获得高度特异性的核酸适体。相对于传统的SELEX(Jenison et al.，Science(New York，N.Y.)263：1425-1429(1994)，该文献作为参考并且其全文被并入本文)，这还减少了所需要的循环的数量。

[0137] 为获得高亲和力和特异性的核酸适体，在传统的宏观规模SELEX中，加入了全套15
核酸适体池(大约10 个序列，～1.7nM)。与蛋白相比，这使用了更多的量的池，因为竞争能够提高池中核酸适体的选择性。因此，用于SELEX的微流体装置应能够容纳至少1.7pM的靶点蛋白(比池小1000倍)。然而，SELEX微流体装置在每个7nl的溶胶-凝胶液滴中仅能够容纳30fmol(0.6ng)的TBP蛋白，因此，可固定总量为120fmol的蛋白，如图3B所示。在微流体装置或基于芯片的微型分析中，固定的靶点蛋白量少(大约小14倍)会造成问题，因为它失去了池的复杂性。因此，在微流体SELEX的起始轮，使用了滤膜结合的SELEX方法，在得到核酸适体的富集的池以后，再使用微流体SELEX获取特异的以及各种的核酸适体。应知道，当使用更大的多通路装置时，能够直接筛选随机核酸池，而不需要先进行传统的SELEX。

[0138] 如图11所示，TBP核酸适体筛选使用微流体SELEX进行，其结果与传统的滤膜结合SELEX(Fan et al.，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 101：6934-6939(2004)，该文献作为参考并且其全文被并入本文)进行了比较。在进行了初始的两轮滤膜结合SELEX后，进行了四轮连续的微流体SELEX。在酵母TBP的传统SELEX中，TBP的核酸适体可以在11个SELEX循环后获得，还需要进行几轮额外的负筛选循环。这些实例中，仅经过三个微流体SELEX循环就得到了高特异性和强亲和力的核酸适体，甚至不用进行负SELEX筛选。所得到的核酸适体群体与上述实施例5中的报道的相当。由于TBP靶点蛋白被固定于第一位置，以含有TFIIA(位置2)、TFIIB(位置3)和hHSF1(位置4)的溶胶-凝胶液滴作为竞争结合物以及不含蛋白的溶胶-凝胶液滴(N)，所以没有必要添加额外的负筛选SELEX步骤。这进一步减少了微流体SELEX的循环数，并提高了所筛选的核酸适体的特异性(图3A)。

[0139] 利用第6轮(ms-6)最后筛选出的池，获得了38个核酸适体，并对其进行了测序。这些序列属于20个克隆，这些克隆的序列在下文表5中列出。基于利用序列对比，从微流体SELEX分离获得的核酸适体序列之间的比较，其中，该微流体SELEX是利用此前以传统滤膜结合筛选获得的序列(Fan et al.，Proc.Nat’l.Acad.Sci.101：6934-6939(2004)，在此被全文并入参考)，结果表明它们具有100％同源性(aptTBP-#17/ms-6.16和aptTBP-#1/ms-6.38)以及98％同源性(aptTBP#13/ms-6.4)，分别列入组I中，而新分离出的核酸适体列入组II中。除了ms-6.7，这些克隆间并没有共同的保守序列。微流体SELEX中丰度最高的序列(38个中有8个)ms6-#4是此前研究中分离出的高亲和力的核酸适体(仅一个碱基对不匹配)(Fan et al.，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 101：6934-6939(2004)，该文献作为参考并且其全文被并入本文)。这些结果表明使用微流体SELEX能够成功的分离核酸适体。

[0140] 实施例7使用基于溶胶-凝胶的阵列芯片进行蛋白质-核酸适体结合分析[0141] 进一步研究了微流体SELEX实验中TBP核酸适体的富集步骤。针对TBP，对每轮的核酸适体池(ms-3、ms-4和ms-5)进行了收集，然后克隆和测序。序列在下文表1-4中列出。意外的是，核酸适体(TBP apt#1)在第三个循环(微流体SELEX第一轮)之后就能被筛选出。此外，在第一轮片上微流体SELEX中观察到的三种核酸适体类型，ms-3(ms-3.1、ms-3.2以及ms-3.25)，拥有超过60％的共同序列(50中的31nt)。对于克隆ms-3.1，它在分离出的23条序列中出现了4次。此外，克隆ms-3.3与ms-4.20、ms-5.4、ms-6.38和aptTBP-#1完全重叠。一段ms-3.15和ms-3.23所共有的七核苷酸长度的片段具有高度的保守性，在测序数据中被广泛观察到。因此，使用微流体SELEX，甚至在第一轮循环后就能够获得高亲和力的核酸适体。

[0142] 为进一步研究微流体SELEX新分离出的核酸适体的结合活性，核酸适体分别使用Cy-3标记。针对TBP筛选出的核酸适体个体首先使用MEGAshortscript试剂盒(Ambion，USA)进行转录。简单地说，在PCR扩增构建核酸适体的DNA后，1μg扩增的模板根据制造商的使用说明进行体外转录。之后，核酸适体使用末端脱氧核苷转移酶(TdT)标记上Cy3-dUTP。RNA核酸适体(1nmol)在含有2nmol Cy3-dUTP(E-biogen，Korea)、20单位TdT(Fermentas)、200mM二甲胂酸钾、25mM Tris/HCl(pH 6.6)、0.25mg/ml牛血清白蛋白、5mM CoCl2和0.5mM三磷酸脱氧核苷酸，终体积为20μl的反应液中，在37℃下温育4小时。
其中加入了10单位RNA酶抑制剂(Boehringer Mannheim)。反应通过添加EDTA终止。标记的RNA使用苯酚/氯仿/异戊醇处理抽提，并在0.3M醋酸钠的浓度下利用乙醇沉淀进行回收。

[0143] RNA池与TBP的结合使用溶胶-凝胶芯片分析测试。在96孔板(SPL，韩国)的8个孔中，点入六个重复的样本以及阴性对照组(无蛋白)和阳性对照组(Cy-3标记的蛋白)。溶胶-凝胶蛋白芯片点样方法参照已有文献中的方法(Kim et al.，Anal Chem 78：
7392-7396(2006)，该文献作为参考并且其全文被并入本文)。小孔使用100μl PBS溶液浸润并使用封阻缓冲液(含有20μg/ml tRNA的结合缓冲液)温育2小时。洗涤之后，每个小孔中的Cy-3标记的核酸适体(使用TdT酶标记)温育2小时，然后进行3次15分钟的洗涤。使用96孔荧光扫描仪和对应的软件程序(FLA-5100 and Multi-gauge，Fuji Japan)
2
对完成的点样板芯片孔进行扫描和分析。从每个点的信号强度(LAU/mm)中减去背景信号强度后进行分析。

[0144] 通过溶胶-凝胶微滴(图12A)的荧光强度计算出单个序列的结合活性。结果如图12B所示。一些ms-6核酸适体相比之前使用传统滤膜结合筛选出的核酸适体在与TBP蛋白特异性结合方面表现更好(图12B)。有意思的是，核酸适体ms-6.16比核酸适体ms-6.4表现出更高的结合活性。当比较TBap-t#7和TBPapt-#13的解离常数，这个结果是合理的(Fan et al.，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 101：6934-6939(2004)，该文献作为参考并且其全文被并入本文)。这些结果共同证实了微流体装置能够富集核酸适体，甚至是在第一轮筛选之后。

[0145]

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[0147]

[0148]

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[0150]

[0151] 实施例8筛选出的核酸适体的结合亲和力(Kd)测量

[0152] 为进行结合亲和力分析，制备了五种不同浓度的TBP(0至800nM)，含有蛋白的溶胶-凝胶混合物被点至96孔板的表面。这些溶胶-凝胶参照制造商的说明使用非接触式点样机器(sciFLEXARRAYER，Scienion)进行点样。单个点的容积为50nl左右，所筛选出的核酸适体使用末端标记法标记。每个核酸适体(200pmole)使用1X结合缓冲液(12mM HEPES pH 7.9、150mM NaCl、1mM MgCl2、1mM DTT)在室温下温育1小时。在使用以0.2％Tween20处理的1X结合缓冲液清洗三次以后，使用FLA-5100扫描仪对样本点进行扫描和分析。通过对结合的核酸适体的荧光强度和TBP浓度做散点图，再以下面的方程利用Sigmaplot 10.0软件把数据点拟合至非线性回归分析，计算出解离常数(Kd)：

[0153] y＝(Bmax·RNA aptamer)/(Kd+ssDNA)

[0154] 其中，y是饱和度，Bmax是最大荧光活性的数值，Kd是解离常数。

[0155] 为进行结合亲和力计算，选用了溶胶-凝胶阵列中荧光活性最高的六个核酸适体(ms-6.12、12、16、18、24和26)。使用了上述非接触式点样仪进行点样。已使用过针型点样系统分析计算Kd，但在低浓度范围内没有获得能够分辨的信号。该现象与检测容积，单个点中的蛋白数量，以及探测材料的敏感度有关。如图13A-B所示，提高了10倍量的溶胶凝胶进行点样，未产生点间交叉污染。这些微滴能够容纳足量的靶点蛋白(0至800nM)，以用于Cy-3标记的核酸适体的结合亲和力测量。

[0156] 所有核酸适体的解离常数(Kd)均为较低的纳摩尔范围，除了ms-6.24以外[ms-6.12的Kd为2.7nM；ms-6.15的Kd为13.2nM；ms-6.16的Kd为8.3nM；ms-6.18的Kd为4.5nM；ms-6.24的Kd为92.53nM；ms-6.26的Kd为10.56nM]。如上文中序列比较部分所述，ms-6.16对应于之前筛选出的TBP核酸适体#17。对于#17，其结合亲和力是使用EMSA测量的，其Kd的范围是大约3-10nM。有意思的是，在这里所描述的溶胶-凝胶芯片分析中，ms-6.16的Kd是～8nM。此外，ms6.12表现出最高的亲和力，该分析中其Kd为2.7nM。该结果与结合活性测试具有些许的联系(图12B)。

[0157] 核酸适体的二级结构模型使用Mfold程序预测，最稳定的预测折叠模型如图14所示。六个核酸适体之间没有发现明显的序列或者二级结构上的相似性。

[0158] 实施例9 识别筛选出的TFIIA、TFIIB和hHSF1特异的核酸适体

[0159] 实施例6中的四通路筛选过程还提供了特异结合至TFIIA、TFIIB和hHSF1的核酸适体群体。第六轮筛选后对这些核酸适体群体进行了测序，测序结果列于下文中的表6-8中。

[0160]

[0161]

[0162]

[0163] 对实施例1-9的讨论

[0164] 在所有的SELEX方法中，首要的目的是获取结合至特定蛋白，通常是蛋白的核酸适体。核酸适体可以是结合至不同蛋白结构域的配体，结合至酶活性位点和底物结合中心的配体等等。但是，因为靶点生物分子易于因加热或溶剂而变性，在SELEX实验中靶点的稳定性是重要的问题。溶胶-凝胶技术已被证明适用于以具有生物活性的形式固定靶点分子，并为靶点化合物提供高表面密度。此外，溶胶-凝胶过程拥有巨大的应用潜力，如免疫学试剂盒、药物输运系统以及生物传感器(Fouque et al.，Biosensors & Bioelectronics22：2151-2157(2007)，该文献作为参考并且其全文被并入本文)。这些溶胶-凝胶最重要的优势之一是能够形成纳米尺度的孔。在溶胶-凝胶表面观察到两种不同类型的孔(数据未展示)。这些均匀地分布于整个溶胶-凝胶表面的孔，作为通向被固定在内的蛋白的分子通道。这就是说，溶胶凝胶基质的纳米多孔结构允许一些分子如核酸适体进行扩散，但它却能保持靶点分子、生物分子固定在孔中。

[0165] 基于这点，本文描述了使用溶胶-凝胶片上SELEX装置筛选核酸适体的策略。测试了针对TBP的核算适体筛选，其中，TBP是聚合酶II转录机的要素。在芯片SELEX上固定了TBP以及TFIIA、TFIIB和hHSF1作为竞争结合物。传统方法和微流体SELEX方法筛选出的TBP核酸适体间的吻合证明使用微流体装置进行体外筛选蛋白或可能的小分子靶点的核酸适体的有效性。在TBP核酸适体筛选中，微流体SELEX通过减少6个循环次数提高了筛选的效率。而传统的结合分析获得高亲和力的TBP核酸适体池需要11个循环。此外，在微流体SELEX的第一个循环就能够筛选出核酸适体，并且不需要负筛选循环。通过控制点的体积，微室空间修改，用微泵使微流体芯片中的核酸适体库无限循环，以及连接其他微量分离服务，能够容易的为固定更大的蛋白对微流体SELEX进行修改和测试。

[0166] 目前，随着由PCR仪和用于把试剂移至多个工作站的机械操作臂的发展，微流体SELEX过程已实现了自动化(Cox et al.，Bioorg Med Chem 9：2525-2531(2001)，Zhang et al.，Nucleic Acids Symposium Series 219-220(2000)，这些文献在此被全文并入参考)。除了平台的开发，SELEX装置还有一点有吸引力的特点是可以移植微型化的平台。Hybarger等人报道了基于微管/微阀的“一体化”自动SELEX装置(Hybarger et al.，Anal Bioanal Chem 384：191-198(2006)，该文献作为参考并且其全文被并入本文)。SELEX仍然被认为是针对单个靶点的方法。但在这里，引入了多通路SELEX的方法。针对TFIIA、TFIIB和hHSF1的核酸适体与TBP核酸适体同时进行了测序和分析，以比较四种不同蛋白的每种核酸适体组间的序列。有一个序列在TFIIA、TFIIB和hHSF1三组中共同存在(SEQ ID NO：84，见表
6-8)。一些序列在微流体SELEX循环过程中得到了富集。理论上讲，根据微流体系统的容量，大量的蛋白能够同时固定在该系统中。此外，很多蛋白在筛选其他核酸适体时，能够相互间作为竞争结合物。通过竞争结合，只有那些对特定蛋白具有高结合亲和力的核酸适体在多轮体外筛选循环后能够存留下来。

[0167] 实施例10设计能操作96室格式的微流体装置

[0168] 96孔格式使得能够构建针对多至96个不同靶点实施多通路SELEX筛选的微流体芯片和系统。该系统的设计如图15所示，每个微室邻接有微加热器元件，并包括一对输入口和一对输出口以使液体流入流出每个微室。一个输入口和一个输出口用于洗脱和回收筛选出的核酸适体群体。液体流动的控制通过使用PDMS泵-阀系统调节，其包括一个气动阀控制器和两个泵。该装置将被构建并用于独立的实验，以筛选随机核酸适体群体或经过传统SELEX预先筛选过两轮以后的核酸适体群体。

[0169] 虽然优选的实施方式在本文中已阐明和描述，但相关领域的技术人员能够很容易的对其作出各种修改、添加、替换等等，而不与本发明的精神所背驰，这些改动因此应在本发明的保护范围以内，并在以下的权利要求中限定。此外，处理元件或序列，或者数字、字母或其他名称的使用，并不旨在限定权利要求，除非在权利要求中特别指明。本发明还旨在涵盖任何特征的组合，虽然它们在文中被分别描述。除非明确地将它们的组合排除在外。

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