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一种二硫化钼/银纳米免疫基底材料的制备方法及其可重复免疫检测应用

阅读：879发布：2023-01-09

专利汇可以提供一种二硫化钼/银纳米免疫基底材料的制备方法及其可重复免疫检测应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种二硫化钼/ 银纳米免疫基底材料的制备方法及其可重复免疫检测应用，特点是包括以下步骤：1）二硫化钼纳米材料的制备；2）将二硫化钼纳米材料溶液旋涂在干净硅片上真空干燥后，采用磁控溅射的方法于硅片表面溅射一层Ag纳米颗粒得到二硫化钼/银纳米材料，3）将抗体连接到二硫化钼/银纳米材料上后得到二硫化钼/银纳米免疫基底材料；其免疫检测方法如下：将待测抗原滴加到二硫化钼/银纳米免疫基底材料上孵育后，滴加金纳米棒免疫探针溶液后进行光谱测量，经催化降解后二硫化钼/银纳米材料可实现对癌症标志物的可重复免疫检测，优点是检测限低且可重复循环利用。，下面是一种二硫化钼/银纳米免疫基底材料的制备方法及其可重复免疫检测应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种二硫化钼/银纳米免疫基底材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）二硫化钼纳米材料的制备
将钼酸钠二水合物、硫代乙酰胺和硅钨酸水合物按0.3629-1.0887克：0.33809-
1.01427克：4.0294-12.0882克：25-75毫升的比例加入到去离子水中，搅拌15-25分钟使其混合均匀后，逐滴加入氢氧化钠水溶液调节溶液pH值为7.62后，将上述反应溶液转移至水热反应釜中密封，置于200-240℃下反应22-26小时，待反应釜自然冷却至室温后，过滤得到固体产物，将固体产物依次采用氢氧化钠水溶液、无水乙醇和去离子水洗涤，共重复洗涤1-
3次，再将固体产物置于45-55℃下真空干燥10-14小时得到二硫化钼纳米材料；
（2）二硫化钼/银纳米材料的制备
将步骤（1）得到的二硫化钼纳米材料粉末溶于去离子水中超声1-3分钟使其混合均匀，得到浓度为30毫克/毫升的二硫化钼纳米材料溶液，将二硫化钼纳米材料溶液旋涂在干净硅片上，将其置于45-55℃下真空干燥10-14小时后，采用磁控溅射的方法于硅片表面溅射一层银纳米颗粒，即得到二硫化钼/银纳米材料；
（3）二硫化钼/银纳米免疫基底材料的制备
将0.2毫升含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的PBS混合溶液滴加到1毫克步骤（2）得到的二硫化钼/银纳米材料上后，置于37℃孵育1小时，再用PBS溶液反复冲洗3次；然后滴加20-60微升含癌症标志物抗体的PBS缓冲溶液于2-6℃下孵育10-14小时，再依次用TBS溶液、PBS溶液和去离子水清洗去除多余未反应的抗体后，再滴加10-60微升含牛血清白蛋白的PBS缓冲溶液于室温下反应1小时，清洗去除多余未反应的牛血清白蛋白后，即得到二硫化钼/银纳米免疫基底材料，并置于4℃下储存待用。
2.根据权利要求1所述的一种二硫化钼/银纳米免疫基底材料的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的氢氧化钠水溶液的浓度为1毫摩尔每毫升。
3.根据权利要求1所述的一种二硫化钼/银纳米免疫基底材料的制备方法，其特征在于：步骤（2）中采用的磁控溅射方法，溅射条件为真空度0.3帕，功率50瓦，溅射时间60-140秒。
4.根据权利要求1所述的一种二硫化钼/银纳米免疫基底材料的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述的含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的PBS混合溶液中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为2毫克每毫升，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为1毫克每毫升；所述的含癌症标志物抗体的PBS缓冲溶液中癌症标志物抗体浓度为2毫克/毫升，所述的含牛血清白蛋白的PBS缓冲溶液中牛血清白蛋白的质量百分比为3%。
5.基于权利要求1-4中任一项所述的二硫化钼/银纳米免疫基底材料的癌症标志物的可重复免疫检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）癌症标志物的免疫检测
将20微升含待测癌症标志物抗原的缓冲溶液滴加到权利要求1-4中任一项制得的二硫化钼/银纳米免疫基底材料上，然后置于37℃下孵育2小时，清洗去除多余未反应的待测抗原后，向吸附有待测抗原的二硫化钼/银纳米免疫基底上滴加15微升金纳米棒免疫探针溶液，于37℃下孵育2小时，清洗去除多余未反应的金纳米棒免疫探针，利用拉曼光谱仪对上述免疫反应后得到的金纳米棒免疫探针和二硫化钼/银纳米免疫基底的复合物进行光谱测量，根据癌症标志物抗原浓度与拉曼特征峰强度之间的线性关系，计算得到待测癌症标志物抗原的浓度；
（2）二硫化钼/银纳米材料的回收方法
光谱检测结束后，采用紫外灯照射样品2小时，光催化去除二硫化钼/银纳米免疫基底上的待测抗原和抗体，用磷酸盐缓冲溶液冲洗二硫化钼/银纳米免疫基底，洗去残留的金纳米棒免疫探针，将清洗干净的二硫化钼/银纳米材料再次与癌症标志物抗体结合形成新的二硫化钼/银纳米免疫基底，重复操作步骤（1），即可实现对癌症标志物的可重复免疫检测。
6.根据权利要求5所述的基于二硫化钼/银纳米免疫基底材料的癌症标志物的可重复免疫检测方法，其特征在于所述的金纳米棒免疫探针的制备方法具体如下：将5-20毫升浓度为0.1毫摩尔每毫升的十六烷基三甲基溴化铵水溶液与5-20毫升浓度为0.0005毫摩尔每毫升的氯金酸水溶液混合搅拌后，快速加入0.3-1.2毫升浓度为0.01毫摩尔每毫升的硼氢化钠水溶液，持续搅拌10分钟后，于室温下静置2小时形成金纳米种子水溶液；将47.5-190毫升浓度为0.1毫摩尔每毫升的十六烷基三甲基溴化铵水溶液、0.5-2毫升浓度为0.01毫摩尔每毫升的硝酸银水溶液、2.5-10毫升浓度为0.01毫摩尔每毫升的氯金酸水溶液、0.275-
1.1毫升浓度为0.1毫摩尔每毫升的抗坏血酸水溶液和0.08-0.32毫升上述金纳米种子水溶液混合均匀后，静置反应15小时得到金纳米棒水溶液，通过离心分离将金纳米棒重溶于PBS缓冲溶液中；取1-3毫升金纳米棒的缓冲溶液，向其中加入20-60微升浓度为2毫克/毫升的抗体的PBS缓冲溶液，于4℃下孵育1.5小时，离心洗涤去除多余未反应的抗体后，向其中加入5-20微升质量百分比为3%的牛血清白蛋白的缓冲溶液，在常温下孵育1小时，以封闭金纳米棒未被抗体附着的位点，离心去除多余未反应的牛血清白蛋白后即得到金纳米棒免疫探针，并置于4℃下储存待用。
7.根据权利要求6所述的基于二硫化钼/银纳米免疫基底材料的癌症标志物的可重复免疫检测方法，其特征在于：所述的离心速度为8000-16000转/分钟，离心时间为5-20分钟。
8.根据权利要求6所述的基于二硫化钼/银纳米免疫基底材料的癌症标志物的可重复免疫检测方法，其特征在于：所述的癌症标志物抗原包括前列腺特异性抗原PSA、甲胎蛋白抗原AFP、铁蛋白抗原、糖类抗原CA199和癌胚抗原CEA。

说明书全文

一种二硫化钼/银纳米免疫基底材料的制备方法及其可重复

免疫检测应用

技术领域

[0001] 本发明涉及材料工程及纳米技术领域，尤其是涉及一种二硫化钼/银(MoS2/Ag)纳米免疫基底材料的制备方法及其可重复免疫检测应用。

背景技术

[0002] 由于具有潜伏期长、发现晚和易致死等特点，癌症已严重危害到人类的健康和社会的可持续发展。早发现早治疗已成为癌症诊断治疗的关键，因此，科技和医疗工作者们已把关注的焦点放在癌症早期筛查技术的发展和优化上。基于贵金属纳米材料的表面增强拉曼散射技术，由于具有超高的灵敏度、稳定的重现性和简单的操作方法而受到极大的重视。一种基于表面增强拉曼散射技术的新型免疫分析技术近年来悄然兴起。而半导体材料由于具有化学增强的能力，也能辅助贵金属纳米材料的电磁场增强来进一步增强拉曼信号。同时，半导体材料表面具有的丰富的化学键有利于痕量待测分子的吸附，也可以间接降低拉曼检测极限。特别是很多半导体材料具有光催化活性，可以通过紫外光照产生光生电子和空穴对，分解有机分子，具有实现可重复免疫检测的潜力。一系列半导体材料中，二硫化钼（MoS2）由于具有制备方法简单、形貌多样和光催化活性较强等优势而被广泛采用。因此，将MoS2引入到贵金属拉曼基底中，开发一种基于表面增强拉曼散射技术的新型可重复免疫检测技术将极大地促进癌症标志物的早期筛查和诊断技术的丰富和完善。但是，由于癌症标志物是大分子，不易于被催化分解，而采用化学法合成的银纳米颗粒一般尺寸较不均匀，与MoS2结合比较松散，不利于提高MoS2的催化活性，实现大分子的降解。因此，有必要进一步开发其他的合成技术，将贵金属银纳米颗粒与MoS2结合实现基于表面增强拉曼散射技术可重复免疫检测。

发明内容

[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供一种检测限低且可重复循环利用的二硫化钼/银纳米免疫基底材料的制备方法及其可重复免疫检测应用。

[0004] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种二硫化钼/银纳米免疫基底材料的制备方法，包括以下步骤：（1）二硫化钼纳米材料的制备
将钼酸钠二水合物、硫代乙酰胺和硅钨酸水合物按0.3629-1.0887克：0.33809-
1.01427克：4.0294-12.0882克：25-75毫升的比例加入到去离子水中，搅拌15-25分钟使其混合均匀后，逐滴加入氢氧化钠水溶液调节溶液pH值为7.62后，将上述反应溶液转移至水热反应釜中密封，置于200-240℃下反应22-26小时，待反应釜自然冷却至室温后，过滤得到固体产物，将固体产物依次采用氢氧化钠水溶液、无水乙醇和去离子水洗涤，共重复洗涤1-
3次，再将固体产物置于45-55℃下真空干燥10-14小时得到二硫化钼纳米材料；
（2）二硫化钼/银纳米材料的制备
将步骤（1）得到的二硫化钼纳米材料粉末溶于去离子水中超声1-3分钟使其混合均匀，得到浓度为30毫克/毫升的二硫化钼纳米材料溶液，将二硫化钼纳米材料溶液旋涂在干净硅片上，将其置于45-55℃下真空干燥10-14小时后，采用磁控溅射的方法于硅片表面溅射一层银纳米颗粒，即得到二硫化钼/银纳米材料；
（3）二硫化钼/银纳米免疫基底材料的制备
将0.2毫升含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的PBS混合溶液滴加到1毫克步骤（2）得到的二硫化钼/银纳米材料上后，置于37℃孵育1小时，再用PBS溶液反复冲洗3次；然后滴加20-60微升含癌症标志物抗体的PBS缓冲溶液于2-6℃下孵育10-14小时，再依次用TBS溶液、PBS溶液和去离子水清洗去除多余未反应的抗体后，再滴加10-60微升含牛血清白蛋白的PBS缓冲溶液于室温下反应1小时，清洗去除多余未反应的牛血清白蛋白后，即得到二硫化钼/银纳米免疫基底材料，并置于4℃下储存待用。

[0005] 步骤（1）中所述的氢氧化钠水溶液的浓度为1毫摩尔每毫升。

[0006] 步骤（2）中采用的磁控溅射方法，溅射条件为真空度0.3帕，功率50瓦，溅射时间60-140秒。

[0007] 步骤（3）中所述的含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的PBS混合溶液中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为2毫克每毫升，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为1毫克每毫升；所述的含癌症标志物抗体的PBS缓冲溶液中癌症标志物抗体浓度为2毫克/毫升，所述的含牛血清白蛋白的PBS缓冲溶液中牛血清白蛋白的质量百分比为3%。

[0008] 上述二硫化钼/银纳米免疫基底材料的癌症标志物的可重复免疫检测方法，其特征在于包括以下步骤：（1）癌症标志物的免疫检测
将20微升含待测癌症标志物抗原的缓冲溶液滴加到权利要求1-4中任一项制得的二硫化钼/银纳米免疫基底材料上，然后置于37℃下孵育2小时，清洗去除多余未反应的待测抗原后，向吸附有待测抗原的二硫化钼/银纳米免疫基底上滴加15微升金纳米棒免疫探针溶液，于37℃下孵育2小时，清洗去除多余未反应的金纳米棒免疫探针，利用拉曼光谱仪对上述免疫反应后得到的金纳米棒免疫探针和二硫化钼/银纳米免疫基底的复合物进行光谱测量，根据癌症标志物抗原浓度与拉曼特征峰强度之间的线性关系，计算得到待测癌症标志物抗原的浓度；
（2）二硫化钼/银纳米材料的回收方法
光谱检测结束后，采用紫外灯照射样品2小时，光催化去除二硫化钼/银纳米免疫基底上的待测抗原和抗体，用磷酸盐缓冲溶液冲洗二硫化钼/银纳米免疫基底，洗去残留的金纳米棒免疫探针，将清洗干净的二硫化钼/银纳米材料再次与癌症标志物抗体结合形成新的二硫化钼/银纳米免疫基底，重复操作步骤（1），即可实现对癌症标志物的可重复免疫检测。

[0009] 所述的金纳米棒免疫探针的制备方法具体如下：将5-20毫升浓度为0.1毫摩尔每毫升的十六烷基三甲基溴化铵水溶液与5-20毫升浓度为0.0005毫摩尔每毫升的氯金酸水溶液混合搅拌后，快速加入0.3-1.2毫升浓度为0.01毫摩尔每毫升的硼氢化钠水溶液，持续搅拌10分钟后，于室温下静置2小时形成金纳米种子水溶液；将47.5-190毫升浓度为0.1毫摩尔每毫升的十六烷基三甲基溴化铵水溶液、0.5-2毫升浓度为0.01毫摩尔每毫升的硝酸银水溶液、2.5-10毫升浓度为0.01毫摩尔每毫升的氯金酸水溶液、0.275-1.1毫升浓度为0.1毫摩尔每毫升的抗坏血酸水溶液和0.08-0.32毫升上述金纳米种子水溶液混合均匀后，静置反应15小时得到金纳米棒水溶液，通过离心分离将金纳米棒重溶于PBS缓冲溶液中；取
1-3毫升金纳米棒的缓冲溶液，向其中加入20-60微升浓度为2毫克/毫升的抗体的PBS缓冲溶液，于4℃下孵育1.5小时，离心洗涤去除多余未反应的抗体后，向其中加入5-20微升质量百分比为3%的牛血清白蛋白的缓冲溶液，在常温下孵育1小时，以封闭金纳米棒未被抗体附着的位点，离心去除多余未反应的牛血清白蛋白后即得到金纳米棒免疫探针，并置于4℃下储存待用。

[0010] 所述的离心速度为8000-16000转/分钟，离心时间为5-20分钟。

[0011] 所述的癌症标志物抗原包括前列腺特异性抗原PSA、甲胎蛋白抗原AFP、铁蛋白抗原、糖类抗原CA199和癌胚抗原CEA。

[0012] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明公开了一种二硫化钼/银纳米免疫基底材料的制备方法及其可重复免疫检测应用。这种可重复免疫检测技术将极大地降低免疫检测的成本，有利于其被应用于癌症的临床检测之中。

[0013] 本发明中，二硫化钼纳米材料具有粗糙的表面结构，能够促进银纳米颗粒表面电磁场的激发，获得较高的拉曼信号增强效率。同时，二硫化钼纳米材料具有较大的比表面积，有较高的光催化活性。其光催化机理为在紫外光照下，由于光子的能量大于二硫化钼禁带宽度，其价带上的电子（e-）吸收光子能量被激发到导带上，同时在价带上留下空穴（h+）。当二硫化钼存在表面缺陷或者合适的俘获剂时，电子和空穴的复合得到抑制，就会在二硫化钼表面发生氧化-还原反应。价带空穴是良好的氧化剂，能够与二硫化钼表面吸附的H2O分子或反应溶液中溶解的OH-结合形成氧化性很活波的羟基自由基（•OH）。而导带电子是良好的还原剂，通过与二硫化钼表面吸附的或反应溶液中溶解的O2进行一系列中间反应，最终也可以形成氧化性很活波的羟基自由基（•OH）和超氧离子自由基（•O2-）。羟基自由基（•OH）和超氧离子自由基（•O2-）能够把各种有机物（包括癌胚抗原CEA这种蛋白多糖复合物）氧化成CO2、H2O等无机小分子，而且因为他们的氧化能力强，能够确保氧化反应一般不停留在中间步骤，不产生中间产物。同时，二硫化钼表面通过磁控溅射覆盖了大量Ag纳米颗粒，当有外界光照时，其表面电子会被激发形成局域表面等离激元共振，这些激发的电子一部分可以通过电荷传递过程到达Ag纳米颗粒附近的二硫化钼导带之中，导带之中增多的电子会显著促进二硫化钼对癌胚抗原CEA的催化降解能力。在催化降解后，通过适当清洗，二硫化钼/银纳米材料还能被回收利用，重新与新的待测抗原结合进行检测，实现一种循环免疫检测。同时，Ag纳米颗粒的局域增强电磁场可以显著增强拉曼标记分子的拉曼信号，有利于实现癌胚抗原CEA的高灵敏度高特异性的表面增强拉曼散射基免疫检测，此外，二硫化钼粗糙的表面也有利于待测分子的吸附，实现拉曼信号的增强和分子的光催化降解。二硫化钼纳米材料表面的银纳米颗粒采用磁控溅射法涂覆，方法简单，不会引入其他污染物。最后，采用具有尖端结构的各向异性金纳米棒作为免疫探针，其尖端处聚集的表面电荷形成的高密度局域电磁场能进一步放大拉曼信号，获得较高的免疫检测灵敏度。因此，采用本发明的对癌症标志物的可重复免疫检测方法经过近9次循环免疫检测能够获得极低的检测极限，对癌胚抗原CEA的检测限达到100飞克每毫升。
附图说明

[0014] 图1为本发明实施例1中制备的二硫化钼纳米材料的扫描电子显微镜照片；图2为本发明实施例1中制备的二硫化钼/银纳米的扫描电子显微镜照片；
图3为采用PVP化学还原法在实施例1制备的二硫化钼纳米材料表面涂覆Ag颗粒制备的二硫化钼/银纳米材料的扫描电子显微镜照片；
图4为本发明实施例1中制备的金纳米棒免疫探针材料的扫描电子显微镜照片；
图5为本发明实施例中制备的二硫化钼/银纳米可重复免疫基底材料和金纳米棒免疫探针材料通过和待测抗原（浓度为0.2毫克每毫升）进行免疫反应之后对基底进行拉曼检测得到的拉曼光谱图以及紫外光照催化后对基底进行拉曼检测所得到的拉曼光谱图；
图6为利用PVP化学还原法在实施例1制备的二硫化钼纳米材料表面涂覆Ag颗粒制备的二硫化钼/银纳米材料和金纳米棒免疫探针材料通过和待测抗原（浓度为0.2毫克每毫升）进行免疫反应之后对基底进行拉曼检测得到的拉曼光谱图以及紫外光照催化后对基底进行拉曼检测所得到的拉曼光谱图；
图7为本发明实施例1中制备的二硫化钼/银纳米可重复免疫基底材料和金纳米棒免疫探针材料通过依次和不同浓度的待测抗原（浓度为10毫克每毫升至100飞克每毫升）进行免疫反应之后对基底进行拉曼检测得到的拉曼光谱图；
图8为本发明实施例1中制备的二硫化钼/银纳米可重复免疫基底材料和金纳米棒免疫探针材料进行循环免疫反应过程中的拉曼检测结果；
图9为本发明实施例2中制备的二硫化钼/银纳米可重复免疫基底材料和金纳米棒免疫探针材料进行循环免疫反应过程中的拉曼检测结果；
图10为本发明实施例3中制备的二硫化钼/银纳米可重复免疫基底材料和金纳米棒免疫探针材料进行循环免疫反应过程中的拉曼检测结果。

具体实施方式

[0015] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

[0016] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例中使用的拉曼光谱检测仪BWS415购自美国必达泰克公司（B&W Tek Inc.）。以下实施例中采用的抗原是癌胚抗原CEA和抗体是癌胚抗体，但不仅限于癌胚抗原CEA，还可以为前列腺特异性抗原PSA、甲胎蛋白抗原AFP、铁蛋白抗原和糖类抗原CA199等。

[0017] 实施例1一种二硫化钼/银（MoS2/Ag）纳米免疫基底材料的制备及其可重复免疫检测应用，包括以下步骤：
1、二硫化钼/银纳米可重复免疫基底材料的制备：将0.3629克钼酸钠二水合物、
0.33809克硫代乙酰胺和4.0294克硅钨酸水合物依次加入25毫升去离子水中，搅拌20分钟使其混合均匀，向混合溶液中逐滴加入氢氧化钠水溶液（浓度为1毫摩尔每毫升）调节溶液pH值为7.62。之后，将上述反应溶液转移至100毫升水热反应釜中密封，置于220℃下反应24小时。待反应釜自然冷却至室温后，过滤得到固体产物，将固体产物依次采用氢氧化钠水溶液（浓度为1毫摩尔每毫升）、无水乙醇和去离子水洗涤，重复洗涤2次。再将固体产物置于50℃下真空干燥12小时得到二硫化钼纳米材料。称取30毫克二硫化钼纳米材料粉末将其溶入
1毫升去离子水中超声2分钟使其混合均匀，然后把上述溶液旋涂在干净硅片上，将其置于
50℃下真空干燥12小时。之后，采用磁控溅射（溅射条件为真空度0.3帕，功率50瓦，溅射时间60秒）的方法于其表面溅射一层Ag纳米颗粒，即得二硫化钼/银纳米材料。将含有0.4毫克
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.2毫克N-羟基琥珀酰亚胺的PBS混合溶液
0.2毫升滴加到1毫克二硫化钼/银纳米材料上，将其置于37℃孵育1小时后，用PBS溶液反复冲洗三次。滴加20微升含癌症标志物抗体的PBS缓冲溶液（癌症标志物抗体浓度为2毫克/毫升）于4℃下孵育12小时。用TBS、PBS和去离子水清洗去除多余未反应的抗体后，再滴加10微升含牛血清白蛋白的PBS缓冲溶液（牛血清白蛋白质量百分比为3%）于室温下反应1小时，以封闭二硫化钼/银纳米材料上未被抗体附着的位点，清洗去除多余未反应的牛血清白蛋白后，即得到二硫化钼/银纳米可重复免疫基底材料，并置于4℃下储存待用。

[0018] 2、金纳米棒免疫探针材料的制备：将5毫升十六烷基三甲基溴化铵水溶液（浓度为0.1毫摩尔每毫升）与5毫升氯金酸水溶液（浓度为0.0005毫摩尔每毫升）混合搅拌后，快速加入0.3毫升硼氢化钠水溶液（浓度为0.01毫摩尔每毫升），持续搅拌10分钟后，把上述溶液于室温下静置2小时形成金纳米种子水溶液。将47.5毫升十六烷基三甲基溴化铵水溶液（浓度为0.1毫摩尔每毫升）、0.5毫升硝酸银水溶液（浓度为0.01毫摩尔每毫升）、2.5毫升氯金酸水溶液（浓度为0.01毫摩尔每毫升）、0.275毫升抗坏血酸水溶液（浓度为0.1毫摩尔每毫升）和0.08毫升上述金纳米种子水溶液混合均匀后，静置反应15小时得到金纳米棒水溶液。
通过离心分离将金纳米棒重溶于PBS缓冲溶液中。取1毫升金纳米棒的缓冲溶液，向其中加入20微升抗体的PBS缓冲溶液（浓度为2毫克/毫升）于4℃下孵育1.5小时。离心洗涤去除多余未反应的抗体后，向其中加入5微升牛血清白蛋白的缓冲溶液（质量百分比为3%），在常温下孵育1小时，以封闭金纳米棒未被抗体附着的位点，离心去除多余未反应的牛血清白蛋白后即得到金纳米棒免疫探针，并置于4℃下储存待用，其中离心速度为8000-16000转/分钟，离心时间为5-20分钟。

[0019] 3、上述两种材料之间的高特异性免疫反应和可重复免疫检测：向步骤1制得的二硫化钼/银纳米可重复免疫基底材料上滴加20微升含待测癌症标志物抗原的缓冲溶液，并将其置于37℃下孵育2小时，使抗原和抗体之间的免疫反应充分进行。清洗去除多余未反应的待测抗原。之后，向吸附有待测抗原的二硫化钼/银纳米可重复免疫基底上滴加15微升步骤2制得的金纳米棒免疫探针溶液，于37℃下孵育2小时。清洗去除多余未反应的金纳米棒免疫探针。利用拉曼光谱仪对上述免疫反应后得到的免疫探针和基底的复合物进行光谱测量可检测待测抗原。光谱检测后，采用紫外灯照射样品2小时，光催化去除待测抗原和抗体，用磷酸盐缓冲溶液冲洗基底表面洗去残留的金纳米棒，留下干净的二硫化钼/银纳米材料。干净的二硫化钼/银纳米材料可再次与抗体结合形成新的免疫基底重复上述免疫反应、检测及催化降解过程，这一过程重复进行，实现可重复的免疫检测。

[0020] 图1显示出本实施例中制备的二硫化钼纳米材料的扫描电子显微镜照片。从图1中可以看出，所制备的二硫化钼纳米材料具有枝状粗糙表面。

[0021] 图2显示出本实施例中制备的二硫化钼/银纳米材料的扫描电子显微镜照片，从图2可以看出，所制备的二硫化钼纳米材料表面涂覆了一层均匀致密的Ag纳米颗粒，其与二硫化钼纳米材料结合紧密。

[0022] 图3显示出采用PVP化学还原法在二硫化钼纳米材料表面涂覆Ag颗粒制备的二硫化钼/银纳米材料的扫描电子显微镜照片，从图3可以看出，所制备的二硫化钼纳米材料表面涂覆的Ag纳米颗粒尺寸较大且分布不均匀，其与二硫化钼纳米材料呈现混合状态，结合松散。

[0023] 图4显示出本实施例中制备的金纳米棒免疫探针材料的扫描电子显微镜照片，从图4可以看出，所制备的金纳米棒长径比为3.2-1.9。

[0024] 图5为利用本实施例中制备的二硫化钼/银纳米可重复免疫基底材料和金纳米棒免疫探针材料通过和待测抗原（浓度为0.2毫克每毫升）进行免疫反应之后对基底进行拉曼检测得到的拉曼光谱图以及紫外光照催化后对基底进行拉曼检测所得到的拉曼光谱图。从图5可以看出，催化前，可以检测到标记分子较强拉曼特征谱，其在1587cm-1处的拉曼信号强度达到20025。催化后，只测得很弱的拉曼光谱，证明抗原抗体已经被催化降解完全。这主要是由于采用采用磁控溅射法涂覆的Ag颗粒与二硫化钼纳米材料结合较为紧密且分布均匀，有利于对Ag和二硫化钼之间的电荷传递过程的促进效果，进而显著增强二硫化钼的光催化活性，实现肿瘤标志物这类大分子的催化降解。

[0025] 图6为利用PVP化学还原法在二硫化钼纳米材料表面涂覆Ag颗粒制备的二硫化钼/银纳米材料和金纳米棒免疫探针材料通过和待测抗原（浓度为0.2毫克每毫升）进行免疫反应之后对基底进行拉曼检测得到的拉曼光谱图以及紫外光照催化后对基底进行拉曼检测所得到的拉曼光谱图。从图6可以看出，催化前，可以检测到标记分子较强拉曼特征谱。催化后，拉曼光谱强度有一定下降，但是并没有消失，证明抗原抗体没有被催化降解。这主要是由于采用PVP化学还原法涂覆的Ag颗粒在二硫化钼纳米材料外表面包覆的较为松散且分布不均匀，不利于实现对Ag和二硫化钼之间的电荷传递过程的促进，无法增强二硫化钼的光催化活性，也就不能实现肿瘤标志物这类大分子的催化降解。

[0026] 图7为利用本实施例中制备的二硫化钼/银纳米可重复免疫基底材料和金纳米棒免疫探针材料通过依次和不同浓度的待测抗原（浓度为10毫克每毫升至100飞克每毫升）进行免疫反应之后对基底进行拉曼检测得到的拉曼光谱图。从图7可以看出，当随着待测抗原浓度的降低，标记分子的拉曼特征谱强度逐渐降低，直到待测抗原的浓度降低到100飞克每毫升时，标记分子的拉曼特征峰相对于背景信号依然很明显，这一浓度即为本方案对待测抗原的检测极限。每次免疫反应并进行拉曼检测后都进行在外光照催化再进行免疫反应。

[0027] 图8为利用本实施例中制备的二硫化钼/银纳米可重复免疫基底材料和金纳米棒免疫探针材料进行循环免疫反应过程中的拉曼检测结果（以拉曼谱中频移为1587cm-1波数的特征峰强度随待测抗原浓度的变化图为例）。通过拟合可见，当待测抗原的浓度从100飞克每毫升变化到10微克每毫升时，拉曼特征峰强度随浓度为线性变化。拟合结果显示，这一变化趋势符合Y = 27458.6+2676.7X这一线性方程式，拟合度为0.992。检测极限为100飞克每毫升。

[0028] 实施例2一种二硫化钼/银纳米免疫基底材料的制备及其可重复免疫检测应用,包括以下步骤：
1、二硫化钼/银纳米可重复免疫基底材料的制备：将0.7258克钼酸钠二水合物、
0.67617克硫代乙酰胺和8.0588克硅钨酸水合物依次加入50毫升去离子水中，搅拌15分钟使其混合均匀。向混合溶液中逐滴加入氢氧化钠水溶液（浓度为1毫摩尔每毫升）调节溶液pH值为7.62。之后，将上述反应溶液转移至100毫升水热反应釜中密封，置于200℃下反应26小时。待反应釜自然冷却至室温后，过滤得到固体产物，将固体产物依次采用氢氧化钠水溶液（浓度为1毫摩尔每毫升）、无水乙醇和去离子水洗涤，该过程重复洗涤三次，再将固体产物置于45℃下真空干燥14小时得到二硫化钼纳米材料。称取30毫克二硫化钼纳米材料粉末将其溶入1毫升去离子水中超声1分钟使其混合均匀，然后把上述溶液旋涂在干净硅片上，将其置于45℃下真空干燥14小时。之后，采用磁控溅射（溅射条件为真空度0.3帕，功率50瓦，溅射时间60-140秒）的方法于其表面溅射一层银纳米颗粒，即得二硫化钼/银纳米材料。
将含有0.4毫克1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.2毫克N-羟基琥珀酰亚胺的PBS混合溶液0.2毫升滴加到1毫克二硫化钼/银纳米材料上后，将其置于37℃孵育1小时后，用PBS溶液反复冲洗三次。滴加40微升含癌症标志物抗体的PBS缓冲溶液（浓度为2毫克/毫升）于2℃下孵育14小时。用TBS、PBS和去离子水清洗去除多余未反应的抗体后，再滴加30微升含牛血清白蛋白的PBS缓冲溶液（质量百分比为3%）于室温下反应1小时，以封闭二硫化钼/银纳米材料上未被抗体附着的位点。清洗去除多余未反应的牛血清白蛋白后即得到二硫化钼/银纳米可重复免疫基底材料，并置于4℃下储存待用。

[0029] 2、金纳米棒免疫探针材料的制备：将10毫升十六烷基三甲基溴化铵水溶液（浓度为0.1毫摩尔每毫升）与10毫升氯金酸水溶液（浓度为0.0005毫摩尔每毫升）混合搅拌后，快速加入0.6毫升硼氢化钠水溶液（浓度为0.01毫摩尔每毫升），持续搅拌10分钟后，把上述溶液于室温下静置2小时形成金纳米种子水溶液。将95毫升十六烷基三甲基溴化铵水溶液（浓度为0.1毫摩尔每毫升）、0.5毫升硝酸银水溶液（浓度为0.01毫摩尔每毫升）、5毫升氯金酸水溶液（浓度为0.01毫摩尔每毫升）、0.55毫升抗坏血酸水溶液（浓度为0.1毫摩尔每毫升）和0.16毫升上述金纳米种子水溶液混合均匀后，静置反应15小时得到金纳米棒水溶液。通过离心分离将金纳米棒重溶于PBS缓冲溶液中。取2毫升金纳米棒的缓冲溶液，向其中加入40微升含癌症标志物抗体的PBS缓冲溶液（浓度为2毫克/毫升）于4℃下孵育1.5小时。离心洗涤去除多余未反应的抗体后，向其中加入10微升牛血清白蛋白的缓冲溶液（质量百分比为3%），在常温下孵育1小时，以封闭金纳米棒未被抗体附着的位点，离心去除多余未反应的牛血清白蛋白后即得到金纳米棒免疫探针，并置于4℃下储存待用，其中离心速度为8000-
16000转/分钟，离心时间为5-20分钟。

[0030] 3、上述两种材料之间的高特异性免疫反应和可重复免疫检测：向步骤1制得的二硫化钼/银纳米可重复免疫基底材料上滴加20微升含待测癌症标志物抗原的缓冲溶液，并将其置于37℃下孵育2小时，使抗原和抗体之间的免疫反应充分进行。清洗去除多余未反应的待测抗原。之后，向吸附有待测抗原的二硫化钼/银纳米可重复免疫基底上滴加15微升步骤2制得的金纳米棒免疫探针溶液，于37℃下孵育2小时，清洗去除多余未反应的金纳米棒免疫探针。利用拉曼光谱仪对上述免疫反应后得到的免疫探针和基底的复合物进行光谱测量可检测待测抗原。光谱检测后，采用紫外灯照射样品2小时，光催化去除待测抗原和抗体，用磷酸盐缓冲溶液冲洗基底表面洗去残留的金纳米棒，留下干净的二硫化钼/银纳米材料。干净的二硫化钼/银纳米材料可再次与抗体结合形成新的免疫基底重复上述免疫反应、检测及催化降解过程，这一过程重复进行，实现可重复的免疫检测。

[0031] 图9为利用本实施例中制备的二硫化钼/银纳米可重复免疫基底材料和金纳米棒免疫探针材料进行循环免疫反应过程中的拉曼检测结果（以拉曼谱中频移为1587cm-1波数的特征峰强度随待测抗原浓度的变化图为例）。通过拟合可见，当待测抗原的浓度从100飞克每毫升变化到10微克每毫升时，拉曼特征峰强度随浓度为线性变化。拟合结果显示，这一变化趋势符合Y = 26493.1 + 2614.4X这一线性方程式，拟合度为0.986。检测极限为100飞克每毫升。

[0032] 实施例3一种二硫化钼/银纳米免疫基底材料的制备及其可重复免疫检测应用，包括以下步骤：
1、二硫化钼/银纳米可重复免疫基底材料的制备：将1.0887克钼酸钠二水合物、
1.01427克硫代乙酰胺和12.0882克硅钨酸水合物依次加入75毫升去离子水中，搅拌25分钟使其混合均匀。向混合溶液中逐滴加入氢氧化钠水溶液（浓度为1毫摩尔每毫升）调节溶液pH值为7.62。之后，将上述反应溶液转移至100毫升水热反应釜中密封，置于260℃下反应22小时。待反应釜自然冷却至室温后，过滤得到固体产物，将固体产物依次采用氢氧化钠水溶液（浓度为1毫摩尔每毫升）、无水乙醇和去离子水洗涤，再将固体产物置于55℃下真空干燥
10小时得到二硫化钼纳米材料。称取30毫克二硫化钼纳米材料粉末将其溶入1毫升去离子水中超声3分钟使其混合均匀，然后把上述溶液旋涂在干净硅片上，将其置于55℃下真空干燥10小时。之后，采用磁控溅射（溅射条件为真空度0.3帕，功率50瓦，溅射时间60-140秒）的方法于其表面溅射一层Ag纳米颗粒，既得二硫化钼/银纳米材料。将含有0.4毫克1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.2毫克N-羟基琥珀酰亚胺的PBS混合溶液0.2毫升滴加到1毫克二硫化钼/银纳米材料上后，将其置于37℃孵育1小时后，用PBS溶液反复冲洗三次。滴加60微升含癌症标志物抗体的PBS缓冲溶液（浓度为2毫克/毫升）于6℃下孵育10小时。用TBS、PBS和去离子水清洗去除多余未反应的抗体后，再滴加60微升含牛血清白蛋白的PBS缓冲溶液（质量百分比为3%）于室温下反应1小时，以封闭二硫化钼/银纳米材料上未被抗体附着的位点。清洗去除多余未反应的牛血清白蛋白后即得到二硫化钼/银纳米可重复免疫基底材料，并置于4℃下储存待用。

[0033] 2、金纳米棒免疫探针材料的制备：将20毫升十六烷基三甲基溴化铵水溶液（浓度为0.1毫摩尔每毫升）与20毫升氯金酸水溶液（浓度为0.0005毫摩尔每毫升）混合搅拌后，快速加入1.2毫升硼氢化钠水溶液（浓度为0.01毫摩尔每毫升），持续搅拌10分钟后，把上述溶液于室温下静置2小时形成金纳米种子水溶液。将190毫升十六烷基三甲基溴化铵水溶液（浓度为0.1毫摩尔每毫升）、2毫升硝酸银水溶液（浓度为0.01毫摩尔每毫升）、10毫升氯金酸水溶液（浓度为0.01毫摩尔每毫升）、1.1毫升抗坏血酸水溶液（浓度为0.1毫摩尔每毫升）和0.32毫升上述金纳米种子水溶液混合均匀后，静置反应15小时得到金纳米棒水溶液。通过离心分离将金纳米棒重溶于PBS缓冲溶液中。取3毫升金纳米棒的缓冲溶液，向其中加入60微升抗体的PBS缓冲溶液（浓度为2毫克/毫升）于4℃下孵育1.5小时。离心洗涤去除多余未反应的抗体后，向其中加入20微升牛血清白蛋白的缓冲溶液（质量百分比为3%），在常温下孵育1小时，以封闭金纳米棒未被抗体附着的位点。离心去除多余未反应的牛血清白蛋白后即得到金纳米棒免疫探针，并置于4℃下储存待用，其中离心速度为8000-16000转/分钟，离心时间为5-20分钟。

[0034] 3、上述两种材料之间的高特异性免疫反应和可重复免疫检测：向步骤1制得的二硫化钼/银纳米可重复免疫基底材料上滴加20微升含待测抗原的缓冲溶液，并将其置于37°C下孵育2小时，使抗原和抗体之间的免疫反应充分进行。清洗去除多余未反应的待测抗原。之后，向吸附有待测抗原的二硫化钼/银纳米可重复免疫基底上滴加15微升步骤2制得的金纳米棒免疫探针溶液，于37℃下孵育2小时，清洗去除多余未反应的金纳米棒免疫探针。利用拉曼光谱仪对上述免疫反应后得到的免疫探针和基底的复合物进行光谱测量可检测待测抗原。光谱检测后，采用紫外灯照射样品2小时，光催化去除待测抗原和抗体，用磷酸盐缓冲溶液冲洗基底表面洗去残留的金纳米棒，留下干净的二硫化钼/银纳米材料。干净的二硫化钼/银纳米材料可再次与抗体结合形成新的免疫基底重复上述免疫反应、检测及催化降解过程，这一过程重复进行，实现可重复的免疫检测。

[0035] 图10为利用本实施例中制备的二硫化钼/银纳米可重复免疫基底材料和金纳米棒免疫探针材料进行循环免疫反应过程中的拉曼检测结果（以拉曼谱中频移为1587cm-1的特征峰强度随待测抗原浓度的变化图为例）。通过拟合可见，当待测抗原的浓度从100飞克每毫升变化到10微克每毫升时，拉曼特征峰强度随浓度为线性变化。拟合结果显示，这一变化趋势符合Y = 27613.7+2705.0X这一线性方程式，拟合度为0.989。检测极限为100飞克每毫升。

[0036] 上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

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