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激光烧蚀系统

阅读：413发布：2020-05-11

专利汇可以提供激光烧蚀系统专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及用于使用激光烧蚀成像质量细胞计数法和质谱法来分析样品的方法和设备。本发明提供方法和设备，其中单独的烧蚀羽流被有区别地捕获并快速传输到电离系统，后面是通过质谱法进行的分析。传输导管可用于将烧蚀羽流传递到电离系统。传输导管可以包括不对称锥体。传输导管可以是锥形的。流牺牲系统可适于将鞘流的一部分从牺牲出口转出，而包含烧蚀羽流的鞘流的核心进入电离系统。，下面是激光烧蚀系统专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种装置，包括：
(i)激光烧蚀系统，其适于从样品产生样品材料的羽流；
(ii)电离系统，其适于接收由所述激光烧蚀系统从所述样品中去除的材料，并电离所述材料以形成元素离子；
(iii)质谱仪，其从所述电离系统接收元素离子并分析所述元素离子，
其中所述激光烧蚀系统和所述电离系统通过传输导管耦合在一起，所述传输导管适于将包含烧蚀样品材料的羽流的气体流从所述激光烧蚀系统传送到所述电离系统，并且其中所述传输导管的在所述激光烧蚀系统内的入口包括不对称样品锥体，在所述锥体的窄端处有孔。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述不对称样品锥体适于在所述样品的表面处产生非零速度，这有助于从所述激光烧蚀系统的烧蚀腔室中洗出羽流材料。
3.根据权利要求1或2所述的装置，其中所述不对称样品锥体是截锥体。
4.根据任一前述权利要求所述的装置，其中所述不对称锥体包括适于在所述锥体的轴处沿着所述样品的表面产生非零矢量气体流的一个凹口或一系列凹口。
5.根据任一前述权利要求所述的装置，其中所述不对称锥体包括适于在所述锥体的轴处沿着所述样品的表面产生非零矢量气体流的一个或更多个孔口。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的装置，其中所述凹口和/或孔口的边缘被平滑、弄圆或去角。
7.根据任一前述权利要求所述的装置，其中所述样品锥体可操作地靠近所述样品定位。
8.根据任一前述权利要求所述的装置，其中所述孔的直径a)是可调节的；b)依尺寸被制造成当烧蚀羽流传入所述传输导管时防止对所述烧蚀羽流的扰动；和/或c)大约等于所述烧蚀羽流的横截面直径。
9.根据任一前述权利要求所述的装置，其中所述孔的直径在大约100μm至1mm之间，例如大约200μm至900μm、大约300μm至800μm、大约500μm至700μm、大约500μm或大约700μm。
10.一种装置，包括：
(i)激光烧蚀系统，其适于从样品产生样品材料的羽流；
(ii)电离系统，其适于接收由所述激光烧蚀系统从所述样品中去除的材料，并电离所述材料以形成元素离子；
(iii)质谱仪，其从所述电离系统接收元素离子并分析所述元素离子，
其中所述激光烧蚀系统和所述电离系统通过传输导管耦合在一起，所述传输导管适于将包含烧蚀样品材料的羽流的气体流从所述激光烧蚀系统传送到所述电离系统，其中所述传输导管的内表面包括沿着它从入口到出口的长度的至少一部分的锥形。
11.根据权利要求1-9中的任一项所述的装置，其中所述传输导管的内表面包括沿着它从入口到出口的长度的至少一部分的锥形。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的装置，其中所述锥形在到所述传输导管的电离系统入口的50mm内开始，例如在所述电离系统入口的40mm内、30mm内、20mm内、15mm内、
10mm内、5mm内、4mm内、3mm内、2mm内或1mm内开始。
13.根据权利要求10-12中的任一项所述的装置，其中所述锥形在所述电离系统入口的下游1-2mm处开始。
14.根据权利要求10-13中的任一项所述的装置，其中所述锥形呈至少5度例如至少10度、至少15度、至少20度、至少25度或30度或更大、甚至例如60度的角度。
15.根据权利要求10-14中的任一项所述的装置，其中所述锥形呈小于40度例如小于30度、小于25度、小于20度、小于15度、小于10度、小于8度、小于5度、小于4度、小于3度、小于2度、1度或小于1度的角度。
16.根据权利要求10-15中的任一项所述的装置，其中所述锥形的长度为至少5mm，例如至少10mm、至少20mm、至少30mm、至少40mm或至少50mm或至少100mm。
17.根据权利要求10-16中的任一项所述的装置，其中所述锥形的长度小于10mm，例如小于5mm、小于4mm、小于3mm、小于2mm或1mm或更小。
18.根据权利要求10-17中的任一项所述的装置，所述锥形将所述传输导管的内径减小了小于5倍，例如4倍或更小、3倍或更小或2倍或更小。
19.根据权利要求10-18中的任一项所述的装置，在所述锥形之后的所述传输导管的内径窄于2mm，例如窄于1.5mm、窄于1.25mm、窄于1mm、窄于900μm、窄于800μm、窄于700μm、窄于
600μm或窄于500μm。
20.根据权利要求10-19中的任一项所述的装置，其中在所述锥形之后的所述传输导管的内径依尺寸被制造成在以每分钟4升流动的氦气下产生低于4000的雷诺数。
21.根据权利要求10-20中的任一项所述的装置，其中进入和离开所述锥形的过渡部分具有适于抑制湍流的开始的平滑边缘。
22.一种装置，包括：
(i)激光烧蚀系统，其适于从样品产生样品材料的羽流；
(ii)电离系统，其适于接收由所述激光烧蚀系统从所述样品中去除的材料，并电离所述材料以形成元素离子；
(iii)质谱仪，其从所述电离系统接收元素离子并分析所述元素离子，
其中所述激光烧蚀系统和所述电离系统通过传输导管和流牺牲系统耦合在一起，其中所述传输导管适于将包含烧蚀样品材料的羽流的气体流从所述激光烧蚀系统中的入口传送到所述流牺牲系统中的出口，
其中所述流牺牲系统包括腔室，所述腔室包括：
(a)所述传输导管的出口；
(b)电离系统入口，其定位成接收来自所述传输导管出口的样品材料并将所述样品材料引入到所述电离系统内；以及
(c)牺牲流出口，
其中所述流牺牲系统适于通过将进入所述流牺牲系统的气体流中的一些引导出所述牺牲流出口，来与通过所述传输导管进入所述流牺牲系统的气体流相比减少通过所述电离系统入口进入所述电离系统的气体流。
23.根据权利要求1-21中的任一项所述的装置，其中所述激光烧蚀系统和所述电离系统通过传输导管和流牺牲系统耦合在一起，其中所述传输导管适于将包含烧蚀样品材料的羽流的气体流从所述激光烧蚀系统中的入口传送到所述流牺牲系统中的出口，
其中所述流牺牲系统包括腔室，所述腔室包括：
(a)所述传输导管的出口；
(b)电离系统入口，其定位成接收来自所述传输导管出口的样品材料并将所述样品材料引入到所述电离系统内；以及
(c)牺牲流出口，
其中所述流牺牲系统适于通过将进入所述流牺牲系统的气体流中的一些引导出所述牺牲流出口，来与通过所述传输导管进入所述流牺牲系统的气体流相比减少通过所述电离系统入口进入所述电离系统的气体流。
24.根据权利要求22或权利要求23所述的装置，其中所述传输导管的在所述流牺牲系统中的出口是喇叭状的。
25.根据权利要求22-24中的任一项所述的装置，其中所述电离系统入口与所述传输导管的出口同轴地定位。
26.根据权利要求22-25中的任一项所述的装置，其中在任何锥形之后的所述传输导管的内径与所述电离系统的入口的内径之比小于2:1，例如1.5:1或1:1。
27.根据权利要求22-26中的任一项所述的装置，其中所述电离系统的入口的内径是
1mm或小于1mm，例如800μm或更小、例如600μm或更小、500μm或更小或400μm或更小的内径。
28.根据权利要求22-27中的任一项所述的装置，其中进入扩口内的过渡部分具有适于抑制湍流的开始的平滑边缘。
29.根据权利要求22-28中的任一项所述的装置，其中所述流牺牲系统包括附接到所述牺牲流出口的泵。
30.根据权利要求29所述的装置，其中所述流牺牲系统的所述泵还包括适于控制通过所述牺牲流出口的气体流的限流器，在一些实施例中，所述流牺牲系统包括适于控制所述限流器的质量流控制器。
31.根据权利要求22-30中的任一项所述的装置，其中气体净化系统连接到所述流牺牲系统的所述牺牲流出口。
32.根据权利要求22-31中的任一项所述的装置，其中所述电离系统入口包括在所述入口周围的同心管，所述同心管适于引入气体作为在来自所述流牺牲系统的流周围的鞘流。

说明书全文

激光烧蚀系统

技术领域

[0001] 本发明涉及用于激光烧蚀以进行细胞分析的装置和方法。

[0002] 发明背景

[0003] 与质谱法结合的激光烧蚀可用于对生物样品(诸如细胞、组织等)成像(成像质谱法IMS)。可以用元素标签/标记原子来标记样品，从而实现成像质量细胞计数法(mass cytometry)(IMC)。每个激光脉冲从样品产生可以从烧蚀发生的地方传输到电离系统和质量分析器的烧蚀材料的羽流(plume)。然后，从样品上的每个位置处的激光脉冲获取的信息可以用于基于其被分析的内容来对样品进行成像。然而，这种技术在它单独地分辨从样品上的每个激光烧蚀脉冲产生的烧蚀材料的每个离散羽流的能力方面有局限性。

[0004] 发明的简要概述

[0005] 在本发明中，发明人设计了现有的基于激光烧蚀的成像质量细胞计数器和成像质谱仪的许多改进。特别是，这些改进涉及将从样品烧蚀的样品材料的羽流传输到成像质谱仪或质量细胞计数器的电离和分析样品材料的部件所花费的传输时间最小化的修改。

[0006] 本发明的装置例如成像质谱仪或成像质量细胞计数器通常包括三个部件。第一部件是用于从样品产生蒸汽状和颗粒状材料的羽流以用于分析的激光烧蚀系统。在烧蚀样品材料的羽流中的原子(包括如下所讨论的任何可检测的标记原子)能够被质谱仪部件(MS部件——第三部件)检测到之前，样品必须被原子化和电离(样品材料的某种电离可能在烧蚀时发生，但是空间电荷效应在电荷可被检测到之前导致电荷的中和，因此该装置需要单独的电离部件)。因此，该装置包括第二部件，该第二部件是电离原子以形成元素离子以使它们能够由MS部件基于质量/电荷比来检测的电离系统。在激光烧蚀系统和电离系统之间是适于将激光烧蚀系统与电离系统耦合的传输导管；该传输导管具有位于激光烧蚀系统内的入口，该入口被配置用于在烧蚀羽流产生时捕获烧蚀羽流，并且将所捕获的烧蚀羽流传输到电离系统(在某些情况下，例如在电离系统是电感耦合等离子体(ICP)的情况下，传输导管是通过中央喷射器管来将样品直接引入到ICP炬(torch)内的同一导管，以及在这种情况下传输导管可以被称为喷射器)。因此在操作中，样品被带入装置内，被烧蚀以产生蒸汽状/颗粒状材料，其被电离系统电离，并且样品的离子被传递到MS部件中。虽然MS部件可以检测到许多离子，但这些离子中的大部分将是自然地构成样品的原子的离子。在一些应用中，例如在地质或考古应用中的例如矿物的分析中，这可能就足够了。

[0007] 在一些情况下，例如当分析生物样品时，样品的天然元素组成可能不是适当地提供信息的。这是因为通常所有的蛋白质和核酸都由相同的主要组成原子组成，且因此虽然可能辨别含有蛋白质/核酸的区域和不含这种蛋白质或核酸材料的区域，但一般不可能区分开特定的蛋白质和所有其他蛋白质。然而，通过用在正常条件下被分析的材料中不存在的或者至少不以相当大的数量存在的原子(例如某些过渡金属原子，例如稀土金属；为了进一步的细节，参见下面关于标记的章节)来标记样品，可以确定颗粒样品的具体特性。与IHC和FISH一样，可检测的标记可以附着到在样品上或中的特定目标(例如在载玻片上的固定细胞或组织样品)，特别是通过亲和性试剂例如以在样品上或中的分子作为目标的抗体或核酸的使用。为了检测电离标记，使用MS部件，因为它将检测来自在样品中天然存在的原子的离子。通过将检测到的信号与产生这些信号的激光烧蚀的已知位置相联系，可以构建存在于每个位置处的原子——天然元素组成和任何标记原子——的图像(见例如Hutchinson等人(2005年)的Anal.Biochem.346:225-33、Seuma等人(2008年)的Proteomics 8:3775-84、Giesen等人(2011年)的Anal.Chem.83:8177-83和Giesen等人(2014年)的Nature Methods.11:417–422)。该技术允许并行地分析许多标记，这是在生物样品的分析中的一大优势。

[0008] 关于基于激光烧蚀的成像的过程的限制是烧蚀材料的羽流可多么快地从激光烧蚀系统传输到电离系统和检测器。这是因为当烧蚀材料的羽流通过烧蚀产生时，材料的那个羽流仅由于扩散而在气相中随着时间的过去而继续膨胀。因此，从烧蚀的时间点到材料被电离的时间点的持续时间越长意味着在电离系统中以及最终在检测器中的每个烧蚀羽流的瞬态更长，因为羽流的更多扩散将出现。这个延长的检测时间具有两个后果之一：(i)羽流被产生的速率(即，在激光烧蚀系统中的激光点火的速率)必须降低以保持羽流的离散分析，或者(ii)必须接受，从离散烧蚀激光脉冲产生的羽流将开始重叠(这在重叠变大时可能降低图像的质量，因为不再可能将由质谱仪检测到的离子精确地分配到样品上的特定烧蚀位置；因此，重叠的可接受的程度随成像应用而变化)。

[0009] 发明人现在在IMS和IMC装置工程设计方面取得了进步，以改进它们对样品的分析的使用。

[0010] 发明人的改进涉及对将激光烧蚀系统与电离系统耦合的传输导管(或在电离系统为ICP的情况下的喷射器)的修改。这些改进包括在激光烧蚀系统中的传输导管(例如喷射器)的入口处的修改、对传输导管(例如喷射器)本身的修改以及在电离系统端部处的传输导管的出口处的修改。

[0011] 因此，本发明提供了一种装置，其包括：

[0012] (i)激光烧蚀系统，其适于从样品产生样品材料的羽流；

[0013] (ii)电离系统，其适于接收由激光烧蚀系统从样品中去除的材料，并电离所述材料以形成元素离子；

[0014] (iii)质谱仪，其从所述电离系统接收元素离子并分析所述元素离子，

[0015] 其中激光烧蚀系统和电离系统通过传输导管耦合在一起，该传输导管适于将包含烧蚀样品材料的羽流的气体流从激光烧蚀系统传送到电离系统，并且其中在激光烧蚀系统内的传输导管的入口包括不对称样品锥体，在该锥体的窄端处有孔。

[0016] 本发明还提供了一种装置，其包括：

[0017] (i)激光烧蚀系统，其适于从样品产生样品材料的羽流；

[0018] (ii)电离系统，其适于接收由激光烧蚀系统从样品中去除的材料，并电离所述材料以形成元素离子；

[0019] (iii)质谱仪，其从所述电离系统接收元素离子并分析所述元素离子，

[0020] 其中激光烧蚀系统和电离系统通过传输导管耦合在一起，该传输导管适于将包含烧蚀样品材料的羽流的气体流从激光烧蚀系统传送到电离系统，其中传输导管的内表面包括沿着它从(在激光烧蚀系统端部处的)入口到(在电离系统端部处的)出口的长度的至少一部分的锥形。

[0021] 本发明还提供了一种装置，其包括：

[0022] (i)激光烧蚀系统，其适于从样品产生样品材料的羽流；

[0023] (ii)电离系统，其适于接收由激光烧蚀系统从样品中去除的材料，并电离所述材料以形成元素离子；

[0024] (iii)质谱仪，其从所述电离系统接收元素离子并分析所述元素离子，

[0025] 其中激光烧蚀系统和电离系统通过传输导管和流牺牲系统耦合在一起，

[0026] 其中传输导管适于将包含烧蚀样品材料的羽流的气体流从激光烧蚀系统中的入口输送到流牺牲系统中的出口，

[0027] 其中流牺牲系统包括腔室，该腔室包括：

[0028] (a)传输导管的出口；

[0029] (b)电离系统入口，其定位成接收来自传输导管出口的样品材料并将样品材料引入到电离系统内；以及

[0030] (c)牺牲流出口，

[0031] 其中流牺牲系统适于通过将进入流牺牲系统的一些气体流引导出牺牲流出口，来与通过传输导管进入流牺牲系统的气体流相比减少通过电离系统入口进入电离系统的气体流，以及

[0032] 其中在流牺牲系统中的传输导管的出口可选地是喇叭状的。

[0033] 附图简述

[0034] 本领域中的技术人员将理解，下面描述的附图仅为了说明目的。附图并不意欲以任何方式限制申请人的教导的范围。

[0035] 图1是激光烧蚀质量细胞计数器的示意图。

[0036] 图2是图1的激光烧蚀系统的实施例的图解图，其示出了通过被配置为将羽流传输到喷射器中的孔对激光烧蚀羽流的采样。

[0037] 图3A是在羽流被直接采样到喷射器中的情况下的类似于图2的替代配置的视图。图3B是该配置的锥形导管实施例的视图。

[0038] 图4和图5是图1的激光烧蚀系统的另外的各种实施例的图解图，其示出了在喷射器内的激光烧蚀羽流的产生和采样。

[0039] 图6是类似于图2的替代配置的视图，但是示出了垂直于羽流形成被引导以引导用于传输到喷射器中的羽流的“动力冲洗”流。

[0040] 图7A示出了在研究中的样品从顶侧由激光辐射照射的配置。图7B是该配置的实施例的视图，其中样品锥体是非对称的。图7C是该配置的锥形传输导管实施例的视图。

[0041] 图8A示出了一个实施例，其中鞘流(sheath flow)的一部分作为牺牲流被丢弃，而包含捕获流和羽流材料的鞘流的核心进入到电离系统的管(例如喷射器)。图8B示出了一个实施例，其中传输导管的内径和电离系统的入口是相似的，并且传输导管在流牺牲系统中的它的出口处向外张开。图8C示出了图8B实施例的修改，其中流牺牲系统适于引起从传输导管进入ICP电离系统的入口内的流的比例的更大的减小。为了将流速增加到最佳值用于将样品引入到ICP等离子体内，引入补偿流(补偿流包括与离开流牺牲系统中的传输导管出口的传输流不同的气体成分)。图8D示出了包括补偿流气体的入口的ICP等离子炬的图。

[0042] 图9示出了一种布置，其中羽流被采样到穿过物镜的喷射器中。

[0043] 图10示出了一种布置，其中羽流被采样到穿过物镜和反射镜的喷射器中。

[0044] 各种实施例的详细描述

[0045] 应当理解，除非上下文另有明确指示，否则结合参考各种元件的当前教导使用的短语“a(一个)”或“an(一个)”包括“一个或多个”或“至少一个”。

[0046] 本发明涉及与电感耦合等离子体质谱法(LA-ICP-MS)组合的激光烧蚀。描述了用于测量生物材料中的内源性元素并且最近用于通过检测元素标记抗体来成像的LA-ICP-MS。参见例如通过引用并入本文的Antonov,A.和Bandura,D.的2012年的美国专利公开2012/0061561；Seuma等人的“Combination of immunohistochemistry and laser ablation ICP mass spectrometry for imaging of cancer biomarkers”(2008,Proteomics8:3775-3784)；Hutchinson等人的“Imaging and spatial distribution ofβ-amyloid peptide and metal ions in Alzheimer’s plaques by laser ablation–inductively coupled plasma–mass spectrometry”(Analytical biochemistry 2005,
346.2:225-233)；Becker等人的“Laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry(LA-ICP-MS)in elemental imaging of biological tissues and in proteomics”(2007,Journal of Analytical Atomic Spectrometry22.7:736-744)；Binet等人的“Detection and characterization of zinc-and cadmium-binding proteins in Escherichia coli by gel electrophoresis and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry”(Analytical Biochemistry 2003,318:30-38)；
Quinn等人的“Simultaneous determination of proteins using an element-tagged immunoassay coupled with ICP-MS detection Journal of Analytical Atomic Spectrometry”(2002,17:892-96)；Sharma等人的“Sesbania drummondii cell cultures:
ICP-MS determination of the accumulation of Pb and Cu Microchemical Journal”(2005,81:163-69)；以及Giesen等人的“Multiplexed immunohistochemical detection of tumor markers in breast cancer tissue using laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry”(2011,Anal.Chem.83:8177–8183)，其中每个通过引用被并入本文。

[0047] 本发明提供了激光烧蚀质量细胞计数分析的方法和用于执行该方法的装置，在该方法中激光束的脉冲被引导到样品，用于为每个脉冲产生样品的羽流；针对每个脉冲有区别地捕获每个羽流；将每个有区别地捕获的羽流传输到电离系统；以及在电离系统中电离每个有区别地捕获和传输的羽流，并产生用于质量分析的离子。在各种实施例中，该装置具有用于从样品产生烧蚀羽流的激光烧蚀系统和适于将激光烧蚀系统与装置的电离系统耦合的传输导管。在一些实施例中，传输导管可具有位于激光烧蚀系统内的入口，使得该入口可被配置为在烧蚀羽流产生时捕获烧蚀羽流。气体入口可以耦合到传输导管的入口，用于使气体在其间通过，以将所捕获的烧蚀羽流传输到电离系统中。在电离系统是ICP的情况下，如果导管的输出直接在ICP的等离子体中，则传输导管可以被称为喷射器。激光烧蚀系统、电离系统和质谱仪部件在下面单独地更详细地被讨论。如上面所提到的，本发明的焦点是对将激光烧蚀系统连接到电离系统的传输导管的修改。

[0048] 传输导管

[0049] 传输导管在激光烧蚀系统和电离系统之间形成链路，并允许由激光烧蚀系统产生的样品材料的羽流从激光烧蚀系统运输到电离系统。传输导管的一部分(或全部)可以例如通过钻穿合适的材料来形成，以产生用于运送羽流的内腔(例如，具有圆形、矩形或其它横截面的内腔)。传输导管有时具有在0.2mm至3mm的范围内的内径。在一些实施例中，传输导管的内径沿它的长度变化。例如，传输导管可以在一端处是锥形的。传输导管有时具有在1厘米到100厘米的范围内的长度。在一些实施例中，长度不超过10厘米(例如1-10厘米)、不超过5厘米(例如1-5厘米)或不超过3厘米(例如0.1-3厘米)。在一些实施例中，传输导管内腔沿着从烧蚀系统到电离系统的整个距离或几乎整个距离是直的。在一些实施例中，传输导管内腔在整个距离内不是直的，并且改变定向。例如，传输导管可以逐渐转动90度。这种配置允许由在激光烧蚀系统中的样品的烧蚀产生的羽流最初在垂直平面内移动而在传输导管入口处的轴将直直地指向上，并在它接近电离系统(例如，通常水平地定向以利用对流冷却的ICP炬)时水平地移动。在一些实施例中，传输导管在离入口孔至少0.1厘米、至少0.5厘米或至少1厘米的距离内是直的，羽流通过入口孔进入或形成。在一些实施例中，传输导管适于最小化将材料从激光烧蚀系统传输到电离系统所花费的时间。

[0050] 样品锥体入口

[0051] 传输导管包括在激光烧蚀系统中的入口，其接收从激光烧蚀系统中的样品烧蚀的样品材料，并将它传输到电离系统。在一些实例中，激光烧蚀系统入口是沿着传输导管到电离系统的所有气体流的源(例如参见图3和图10)。在一些实例中，从激光烧蚀系统接收材料的激光烧蚀系统入口是导管的壁中的孔，第二“传输”气体沿着该导管从单独的传输流入口流动(如例如在WO2014146724和WO2014147260中所公开的)。在这个实例中，传输气体形成相当大的比例，且在许多实例中，大部分气体流到电离系统。图7A示出了该设计的实施例。在这里，激光束通过物镜穿过传输导管的烧蚀系统入口聚焦到可移动目标上，以产生用于分析的样品材料的羽流。激光烧蚀系统的烧蚀腔室包含气体入口(腔室的左手侧)。使气体通过该入口流入腔室内在锥体处产生从腔室出来的气体流，激光辐射穿过锥体以烧蚀在可移动台上的样品。这个气体流捕获烧蚀材料的羽流，并在它向上流过锥体(在该实施例中，锥体是传输导管的激光烧蚀系统入口)并从烧蚀腔室出来进入在腔室上方经过的导管时夹带它。该导管也有从单独的传输流入口流到它内的气体(图的左手侧，由传输流箭头指示)。
包括传输流入口、激光烧蚀系统入口并且开始传输导管的部件也可以被称为流动池(如在WO2014146724和WO2014147260中的)，传输导管朝着电离系统传送烧蚀样品材料。

[0052] 传输流完成至少三个任务：它在电离系统的方向上冲送(flush)进入传输导管的羽流，并阻止羽流材料接触传输导管的侧壁；它在样品表面上形成“保护区”，并确保烧蚀羽流在受控气氛下实现；以及它增加在传输导管中的流速。在一些实施例中，捕获气体的粘度低于主要传输气体的粘度。这有助于将捕获气体中的样品材料的羽流限制在传输导管的中心中，并使在激光烧蚀系统的下游的样品材料的羽流的扩散最小化(因为在流的中心中，输送速率是更恒定的和几乎无变化的)。气体可以是例如但不限于氩气、氙气、氦气、氮气或这些的混合物。在一些实施例中，传输气体是氩气。氩气特别适合于在羽流到达传输导管的壁之前阻止羽流的扩散(并且它也促进在电离系统是基于氩气的ICP的装置中的提高的仪器灵敏度)。捕获气体优选地为氦气。然而，捕获气体可由其他气体代替或包含其他气体(例如，氢气、氮气或水蒸气)。在25℃下，氩气具有22.6μPas的粘度，而氦气具有19.8μPas的粘度。在一些实施例中，捕获气体是氦气，以及传输气体是氦气。

[0053] 如在图7A中的样品锥体的使用最小化在目标和包括传输气体流的导管之间的距离。由于捕获气体在锥体点处流动过的减小的距离，这也导致在较少的湍流情况下样品材料的改进的捕获和所以导致烧蚀样品材料的羽流的减少的扩展。因此，传输导管的入口是在样品锥体的顶端处的孔。锥体突出到烧蚀腔室内。

[0054] 在图7B中示出了样品锥体的修改。在这里，样品锥体是不对称的。当锥体是对称的时，来自所有方向的气体流都是对称的，使得总气体流在样品锥体的轴处沿着样品的表面为零(被中和)。通过使锥体变成不对称的，产生了沿着样品表面的非零速度，这有助于从激光烧蚀系统的烧蚀腔室中洗出羽流材料。图7B示出了锥体的不对称性，该锥体将从激光烧蚀系统进入传输导管的捕获气体流投射在与传输导管中的传输流相同的方向上。该图还示出了不对称性如何影响在输送气体流中的捕获气体流的气体流连同在捕获流内的所捕获的羽流的投影流线。因此，在一些实施例中，传输导管的样品锥体是非对称的。非对称样品锥体适于在样品锥体的轴处在样品表面上引起非零矢量气体流。

[0055] 因此，本发明提供了一种装置，其包括：

[0056] (i)激光烧蚀系统，其适于从样品产生样品材料的羽流；

[0057] (ii)电离系统，其适于接收由激光烧蚀系统从样品中去除的材料，并电离所述材料以形成元素离子；

[0058] (iii)质谱仪，其从所述电离系统接收元素离子并分析所述元素离子，

[0059] 其中激光烧蚀系统和电离系统通过传输导管耦合在一起，该传输导管适于将包含烧蚀样品材料的羽流的气体流从激光烧蚀系统输送到电离系统，并且其中在激光烧蚀系统内的传输导管的入口是不对称的样品锥体，在锥体的窄端有孔。有时，在激光烧蚀系统内的入口是不对称的，并在非水平(例如垂直或垂直于样品的表面)方向上突出到激光烧蚀系统的烧蚀腔室中(其中不对称样品锥体是这种入口的一个例子)。不对称入口例如不对称样品锥体适于使得较高的捕获流在入口的一侧上进入入口。

[0060] 图7B示出了锥体，其是不对称的，因为锥体的一侧比另一侧更靠近目标而突出。在三维中，这代表一个锥体，其中顶端以与锥体的底部成一角度(即不平行)被截去。因此，在一些实施例中，不对称样品锥体是截锥体。

[0061] 在实践中，可以采用引起在锥体的轴处沿着样品的表面的非零矢量气体流的样品锥体的任何修改。因此，在一些实施例中，不对称锥体包括适于在锥体的轴处沿着样品的表面产生非零矢量气体流的一个凹口或一系列凹口。在一些实施例中，不对称锥体包括在锥体的侧面中的孔口，该孔口适于在锥体的轴处沿着样品的表面产生非零矢量气体流。该孔口将使在锥体周围的气体流不平衡，从而再次在目标处在锥体的轴处沿着样品的表面产生非零矢量气体流。在一些实例中，锥体的侧面可以包括多个一个孔口，例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或多于十个孔口。在一些实施例中，样品锥体可以包括一个或更多个凹口和一个或更多个孔口。在一些实施例中，凹口和/或孔口的边缘被平滑、弄圆或去角，以便防止或最小化湍流。

[0062] 锥体的不对称性的不同定向将适合于不同的情况，取决于捕获和传输气体及其流量的选择，并且对于每个定向适当地识别气体的组合和流量是在技术人员的能力范围内的。在一些实施例中，如图7B所示，不对称性从与传输流相同的源方向提供增加的捕获流(换句话说，捕获流方向与运输流一致)。当捕获流与运输流更加一致时，这可帮助将捕获流的流线放置在传输流的中间中，而没有过多的湍流。因此在一些实施例中，不对称入口例如不对称样品锥体被适合于使得捕获流的流线被定向成一个角度(即，不是在垂直于样品的表面的直角下)。

[0063] 另一种不对称性是由两个椭圆半部分形成的锥体，这两个椭圆半部分共享共同的高度(z)和一个底部直径(x直径)，但区别在于另一个底部(y直径)(或一个椭圆半部分和一个圆形半部分)。

[0064] 如在本发明中所使用的，所有上述调整可以存在于单个不对称样品锥体中。例如，锥体可以不对称地被截去并且由两个不同的椭圆锥体半部分形成，锥体可以不对称地被截平并且包括一个或更多个孔口，等等。

[0065] 因此，样品锥体适于捕获从激光烧蚀系统中的样品烧蚀的材料的羽流的全部或部分。样品锥体例如通过操纵在激光烧蚀系统内的可移动样品载体托盘上的样品来可操作地定位在样品附近，如下面更详细描述的。如上面所提到的，烧蚀样品材料的羽流通过在样品锥体的窄端处的孔进入传输导管。在一些实施例中，孔的直径a)是可调整的；b)依尺寸被制造成当烧蚀羽流传入传输导管时防止对烧蚀羽流的扰动；和/或c)大约等于烧蚀羽流的横截面直径。在一些实施例中，孔的直径在大约100μm至1mm之间。例如，孔的直径在大约200μm至900μm、例如300μm至800μm之间。在一些实施例中，孔的直径在大约500μm至700μm之间。在一些实施例中，孔的直径为大约500μm。在一些实施例中，孔的直径为大约700μm。

[0066] 锥形导管

[0067] 在具有较小内径的管中，相同流量的气体以更高的速度移动。因此，通过使用具有较小内径的管，在气体流中携带的烧蚀样品材料的羽流可以以给定的流量被更快地运输越过限定的距离(例如，在传输导管中从激光烧蚀系统到电离系统)。在单独羽流可以多么快地被分析方面的关键因素之一是在从羽流通过烧蚀产生的时间一直到它的组分离子被检测为装置的质谱仪组分(在检测器处的瞬态时间)的时间期间多少羽流被扩散。因此，通过使用狭窄的传输导管，在烧蚀和检测之间的时间减少，从而意味着扩散减少，因为扩散可发生的时间很少，最终结果是在检测器处的每个烧蚀羽流的瞬态时间减少。较低的瞬态时间意味着每单位时间可以产生和分析更多的羽流，从而产生更高质量的图像和/或更快地产生图像。

[0068] 因此，本发明还提供了一种装置，其包括：

[0069] (i)激光烧蚀系统，其适于从样品产生样品材料的羽流；

[0070] (ii)电离系统，其适于接收由激光烧蚀系统从样品中去除的材料，并电离所述材料以形成元素离子；

[0071] (iii)质谱仪，其从所述电离系统接收元素离子并分析所述元素离子，

[0072] 其中激光烧蚀系统和电离系统通过传输导管耦合在一起，该传输导管适于将包含烧蚀样品材料的羽流的气体流从激光烧蚀系统输送到电离系统，其中传输导管的内表面包括沿着它从(在激光烧蚀系统端部处)入口到(在电离系统端部处)出口的长度的至少一部分的锥形。

[0073] 该锥形可以包括沿着传输导管的长度的所述部分传输导管的内径的逐渐变化(即，管的内径是被截取的横截面，它沿着该部分从该部分的端部朝着(在激光烧蚀系统端部处的)入口到(在电离系统端部处的)出口而减小)。如图3B和图7C所示，对传输导管的逐渐变细的修改适用于本文所述的装置的所有实施例，无论它们是否包括在传输导管的电离系统入口端部处的直接喷射器入口、样品锥体或任何其他结构。参照图3B，导管的靠近烧蚀发生的地方的区域具有相对宽的内径。在逐渐变细之前的导管的较大体积便于限制由烧蚀产生的材料。当烧蚀颗粒从烧蚀斑飞出时，它们以高速行进。气体中的摩擦使这些颗粒减慢，但是羽流仍然可以在亚毫米到毫米尺度上扩展。允许到壁的足够的距离有助于将羽流限制在流的中心附近。

[0074] 因为宽内径截面只能是短的(大约1-2mm)，所以它对总瞬态时间没有显著贡献，假定羽流在传输导管的具有较窄内径的较长部分中花费更多时间。因此，较大的内径部分用于捕获烧蚀产物，而较小的内径导管用于将这些颗粒快速运输到电离系统。

[0075] 图7C示出了这个改进对包括在传输导管的电离系统入口处的样品锥体的装置的应用。如上所述，导管包括更宽的内径截面和降至更窄的内径导管的锥形，这导致烧蚀羽流到电离系统的更短的传输时间和最终对在质谱仪处的每个羽流的更短的瞬态时间。在烧蚀后接收材料的羽流的样品锥体附近的传输导管的部分具有宽的内径，并且如前面一样足够宽以包含足够的气体来阻止由样品的烧蚀产生的羽流材料撞击导管的侧面，并且在从传输流入口穿过流动池的传输流内夹带烧蚀样品材料。在许多情况下，该宽的部分将是具有样品锥体的整体部件，且因此内径的广度(例如大约2mm)也便于制造。

[0076] 在一些实施例中，锥形在传输导管的电离系统入口的50mm内开始。在一些实施例中，锥形在电离系统入口的40mm内、例如在电离系统入口的30mm内、20mm内、15mm内或10mm内开始。在一些实施例中，锥形在电离系统入口的下游5mm内、4mm内、3mm内、2mm内或1mm内开始。在一些实施例中，锥形在电离系统入口的下游1-2mm处开始。

[0077] 可以使在大内径部分和小内径区域之间的锥形变得足够平缓，以避免湍流的发生。例如，锥形可以呈至少5度的角度。在一些实施例中，锥形的角度可以是至少10度，例如至少15度、至少20度、至少25度或30度或更大，甚至例如60度。在一些实施例中，锥形呈小于40度例如小于30度、小于25度、小于20度、小于15度或小于10度的角度。在一些实施例中，锥形呈小于8度例如小于5度、小于4度、小于3度、小于2度或小于1度的角度。在一些实施例中，锥形的角度在10度和30度之间。在一些实施例中，锥形的角度可以沿着锥形的长度增加或减少。

[0078] 在一些实施例中，锥形的长度为至少5mm，例如至少10mm、至少20mm、至少30mm、至少40mm或至少50mm或至少100mm。在一些实施例中，锥形的长度小于10mm，例如小于5mm、小于4mm、小于3mm、小于2mm或1mm或更小。

[0079] 传输导管内径在导管的输入端处可以是x毫米(mm)，但它在输出端附近可以向下逐渐变细5倍至x/5mm(例如，在输入端处为4mm，而在输出端处为800μm)。在一些实施例中，锥形将传输导管的内径减小了小于5倍，例如4倍或更小、3倍或更小或2倍或更小。内径是穿过导管的最长横截面的度量。例如，如果导管是圆形的，则内径仅仅是圆的直径，但是如果导管是矩形的，则它是对角线。在一些实施例中，在锥形之后的导管的内径窄于2mm，例如窄于1.5mm、窄于1.25mm、窄于1mm、窄于900μm、窄于800μm、窄于700μm、窄于600μm或500μm或更窄。在一些实施例中，在锥形之后的导管的内径为400μm或更窄、300μm或更窄、200μm或更窄或100μm或更窄。

[0080] 窄内径截面的直径受到与湍流的开始相对应的直径的限制。可以针对圆管和已知流量计算雷诺数。一般来说，高于4000的雷诺数将指示湍流，且因此应该被避免。高于2000的雷诺数将指示过渡流(在非湍流和湍流之间)，且因此也可希望被避免。对于气体的给定质量流，雷诺数与导管的直径成反比。因此，在一些实施例中，传输导管的窄内径截面的内径窄于2mm，例如窄于1.5mm、窄于1.25mm、窄于1mm，但是大于在导管中的以每分钟4升的氦气流具有大于4000的雷诺数时的直径。

[0081] 在传输导管的恒定直径部分和锥形之间的过渡部分中的粗糙或甚至成角度的边缘可能引起气体流中的湍流。因此，在一些实施例中，进入和离开锥形的过渡部分应该具有适于抑制湍流的开始的平滑边缘。例如，边缘可以被弄圆和/或去角。

[0082] 包括锥形导管的装置还可以包括样品锥体(可选地不对称的)。如技术人员将理解的，锥形导管可用在使用替代的传输导管布置的本文所述的任何装置中，如例如在图2-10中所示的和如在本文的下面的章节中详细讨论的。

[0083] 牺牲流

[0084] 在较高流量下，在导管中出现湍流的风险增加。这在传输导管具有小内径(例如1mm)的情况下尤其如此。然而，本发明人已经发现，如果使用轻气体例如氦气或氢气而不是传统上用作传输气体流的氩气，则有可能在具有小内径的传输导管中实现高速传输(高达且超过300m/s)。在某些实施例中，使用主要包括氦气或氢气的气体的混合物。

[0085] 高速传输在它可使烧蚀样品材料的羽流通过电离系统而没有可接受水平的电离出现的限度内产生了问题。电离水平可能下降，因为冷却气体的增加的流量降低在炬的端部处的等离子体的温度。如果样品材料的羽流没有被电离到合适的水平，则信息从烧蚀样品材料丢失——因为它的组分(包括任何标记原子/元素标签)不能由质谱仪检测到。例如，样品在ICP电离系统中可能那么快地通过炬的端部处的等离子体，以至于等离子体离子没有足够的时间来作用于样品材料上以电离它。发明人已经发现，由在窄内径传输导管中的高流量、高速传输引起的这个问题可以通过在传输导管的出口处引入流牺牲系统来解决。流牺牲系统适于接收来自传输导管的气体流，并且仅使该流的一部分(包括烧蚀样品材料的任何羽流的气体流的中心部分)向前进入通向电离系统的喷射器内。为了便于在流牺牲系统中来自传输导管的气体的分散，传输导管出口可以向外张开。

[0086] 流牺牲系统定位成靠近电离系统，使得从流牺牲系统通向电离系统的管(例如喷射器)的长度很短(例如～1cm长；与通常具有约数十厘米(例如～50cm)的长度的传输导管的长度比较)。因此，在从流牺牲系统通向电离系统的管内的较低气体速度不显著影响总传输时间，因为整个运输系统的相对较慢部分短得多。

[0087] 因此，本发明提供了一种装置，其包括：

[0088] (i)激光烧蚀系统，其适于从样品产生样品材料的羽流；

[0089] (ii)电离系统，其适于接收由激光烧蚀系统从样品中去除的材料并电离所述材料以形成元素离子；

[0090] (iii)质谱仪，其从所述电离系统接收元素离子并分析所述元素离子，

[0091] 其中激光烧蚀系统和电离系统通过传输导管和流牺牲系统耦合在一起，

[0092] 其中传输导管适于将包含烧蚀样品材料的羽流的气体流从激光烧蚀系统中的入口传送到流牺牲系统中的出口，

[0093] 其中流牺牲系统包括腔室，该腔室包括：

[0094] (a)传输导管的出口；

[0095] (b)电离系统入口，其定位成接收来自传输导管出口的样品材料并将样品材料引入到电离系统内；以及

[0096] (c)牺牲流出口，

[0097] 其中流牺牲系统适于通过将进入流牺牲系统的一些气体流引导出牺牲流出口，来与通过传输导管进入流牺牲系统的气体流相比，减少通过电离系统入口进入电离系统的气体流，以及

[0098] 其中在流牺牲系统中的传输导管的出口可选地是喇叭状的。

[0099] 在一些实施例中，电离系统入口与传输导管的出口同轴地定位(因为沿着导管传输的样品材料的羽流将被夹带在传输流的中心内)，以最大化材料从传输导管、通过流牺牲系统到电离系统入口以及所以到电离系统的喷射器的传输。在一些实施例中，传输导管的内径与电离系统的入口的内径之比小于2:1，例如1.5:1或1:1。在一些实施例中，传输导管的内径与电离系统的喷射器的内径之比小于2:1，例如1.5:1或1:1。在一些实施例中，电离系统的喷射器(或电离系统的入口)的内径大于传输导管的内径。例如，在一些实施例中，传输导管的内径与电离系统的入口的内径之比小于1:1，例如1:1.5或1:2。在一些实施例中，传输导管的内径与电离系统的喷射器的内径之比小于1:1，例如1:1.5或1:2。

[0100] 在大多数布置中，显著增加从流牺牲系统通到电离系统的管(例如喷射器)的直径作为以体积流量降低气体的速度的方式是不合乎需要的或者在一些情况下是不可能的。例如，在电离系统是ICP的情况下，来自流牺牲系统的导管在ICP炬的中心中形成喷射器管。当使用较宽内径喷射器时，存在信号质量的降低，因为烧蚀样品材料的羽流不能如此精确地被注入等离子体的中心(其是等离子体的最热的和所以最有效地电离的部分)内。强烈偏好是针对1mm内径或甚至更窄(例如，800μm或更小例如600μm或更小、500μm或更小或400μm或更小的内径)的喷射器。其他电离技术依赖于将在三维空间中的相对小的体积内电离的材料(因为电离的必要的能量密度可以只在小体积内实现)，且因此具有更宽内径的导管意味着穿过导管的很多样品材料在能量密度足以电离样品材料所处的区域之外。因此，从流牺牲系统进入电离系统内的窄直径管也用在具有非ICP电离系统的装置中。如上面所提到的，如果样品材料的羽流没有被电离到合适的水平，则信息从烧蚀样品材料丢失——因为它的组分(包括任何标记原子/元素标签)不能由质谱仪检测到。

[0101] 在传输导管的恒定直径部分和在出口处的扩口(flare)之间的过渡部分中的粗糙或甚至成角度的边缘可能引起气体流中的湍流。因此，在一些实施例中，进入扩口内的过渡部分应该具有适于抑制湍流的开始的平滑边缘。例如，边缘可以被弄圆。

[0102] 泵送可用于帮助确保在牺牲流和进入电离系统的入口内的流之间的期望分流比。因此，在一些实施例中，流牺牲系统包括附接到牺牲流出口的泵。可控限流器可以被添加到泵以控制牺牲流。因此，在一些实施例中，流牺牲系统的泵还包括适于控制通过牺牲流出口的气体流的限流器。在一些实施例中，流牺牲系统包括适于控制限流器的质量流控制器。

[0103] 当使用昂贵的气体时，从牺牲流出口泵送出的气体可以利用已知的气体净化方法被净化并被再循环回到同一系统内。氦气特别适合作为如上面所提到的运输气体，但它是昂贵的；因此，减少系统中的氦气的损失是有利的(即，当氦气进入电离系统内并被电离时)。流牺牲系统将氦气流分成近轴向流和牺牲流。牺牲流可以被净化并在系统中被再循环，而近轴向流(携带来自烧蚀羽流的夹带颗粒的流的中心部分)将被传到电离系统(例如ICP炬的等离子体)内。为了回收，来自近轴向流的氦气将被丢失。因此，在一些实施例中，气体净化系统连接到流牺牲系统的牺牲流出口。在一些实施例中，气体净化系统提供例如通过到激光烧蚀系统的烧蚀腔室内的入口和/或通过在传输导管中的入口流到装置内的气体的一部分(即，它用作捕获流和/或构成大部分传输流的气体——由在图7的左手侧上的箭头指示)。

[0104] 设置的进一步改进在图8C中被提供，并且是在电离系统是ICP的装置中的流牺牲系统的特定优化。如前面一样，较大的传输流率沿传输导管向下被发送，并且只有该流的中心部分被允许成为将进入ICP炬的等离子体的喷射器流的一部分。通常，氦气将被用作传输流，因为如上面所提到的，它的特性非常适合于羽流材料在长导管上的高速运输(即，对于相同的流速(与氩气相比)触发湍流的机会较小)。即使合并使来自牺牲流的氦气再循环的气体净化系统，继续通过流牺牲系统进入电离系统内的氦气的近轴向流也丢失。

[0105] 然而，在图8B的设置中的传入电离系统入口内的近轴向流的进一步减少可能对在电感耦合等离子体中的电离采样效率产生负面后果。图8C中的装置提供了对这个问题的解决方案。在这里，添加较没有价值的气体例如氩气的另一流以补偿在ICP炬的喷射器中的流。可以调节喷射器流以优化电离采样效率。氩气通常用于在电感耦合等离子体中形成中心通道，且因此可以被添加到喷射器流，如图8C所示。因此，从传输导管出口传送到电离系统入口内的近轴向流被选择为足够小，但不是那么小以至于羽流瞬变被显著影响。选择氩气的补偿流以在电感耦合等离子体中提供最佳电离条件。因此，在一些实施例中，流牺牲系统适于将传入电离系统入口(例如ICP炬电离系统的喷射器)内的气体流减少到低于1Lpm，例如0.5Lpm或更小、0.4Lpm或更小、0.3Lpm或更小或0.2Lpm或更小。在一些实施例中，ICP喷射器包括第二入口，气体可以流到该第二入口内以补偿在喷射器中的流量。在一些实施例中，第二入口包括围绕附接到电离系统入口的喷射器的同心管，该同心管引入补偿气体作为在来自流牺牲系统的含样品气体流周围的鞘流。如图8D所示，这个补偿流入口不同于也设置在支撑等离子体的中间和外部同心管中的氩气流。这个喷射器也可以被称为双同心喷射器。因此，在一个方面中，本发明提供了根据图8D的喷射器，其包括双同心部分。

[0106] 如上所述，包括流牺牲系统的装置还可以包括样品锥体(可选地不对称的)或锥形导管。在一些实施例中，如上所述，该装置包括流牺牲系统、样品锥体(可选地不对称的)和锥形导管。如技术人员将理解的，流牺牲系统可用在使用替代的传输导管布置的本文所述的任何装置中，如例如在图2-10中所示的和如在本文中下面的章节中详细讨论的。

[0107] 激光烧蚀系统

[0108] 也被称为“烧蚀单元”的激光烧蚀系统在烧蚀期间容纳样品。一般，烧蚀单元包括激光透明窗口以允许激光能量射到样品。可选地，烧蚀单元包括保持待分析的样品的台。在一些实施例中，台可在x-y或x-y-z维度上移动。在本文的附图和示例中，激光烧蚀系统有时被显示为开放式布置。然而，这种配置仅用于说明，并且将认识到，存在用于防止来自周围环境的污染或渗透的某种形式的合适外壳。例如，配置有气体入口和/或光学端口的腔室可以布置在激光烧蚀系统周围，以提供适于捕获和传输烧蚀羽流以用于质量分析的封闭环境(例如，图7)。气体入口和光学端口被定位成使得激光束的定向、样品、羽流膨胀和传输导管适合于本文公开的方法和设备。将认识到，烧蚀单元通常是气密的(除了所设计的出口和端口以外)。

[0109] 根据本发明的用于激光烧蚀的激光器通常分为三类：飞秒脉冲激光器、深UV脉冲激光器和具有被选择用于在烧蚀材料中的高吸收的波长的脉冲激光器(“波长选择性激光器”)。深UV和波长特定激光器将可能以纳秒或皮秒脉冲操作。每一类激光器都有其缺点和好处，且可以根据特定的应用来被选择。在一些实施例中，激光器是被配置为以在10和10000Hz之间的脉冲速率操作的飞秒脉冲激光器。飞秒激光器是已知的(参见例如Jhanis等人的“Rapid bulk analysis using femtosecond laser ablation inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry”(J.Anal.At.Spectrom.,2012,27:1405-
1412)。

[0110] 飞秒激光器允许实质上所有材料的激光烧蚀，激光烧蚀的唯一先决条件是足够的功率密度。这可以在光束被紧密聚焦到例如1微米直径并且在持续时间上短(及时被聚焦)时甚至用相对低的脉冲能量来实现。深UV激光器还可以烧蚀一大类材料，因为大多数常用材料吸收深UV 光子。波长选择性激光烧蚀可以利用具有以在基板材料中的吸收为目标的特定激光波长的激光器。波长特定激光器的一个好处可以是激光器和光学系统的成本和简单性，尽管基板材料的光谱更有限。合适的激光器可以具有不同的操作原理，诸如例如固态激光器(例如Nd:YAG激光器)、受激准分子激光器、光纤激光器和OPO激光器。

[0111] 飞秒激光辐射的一个有用特性是它只在阈值功率密度被达到的情况下被吸收。因此，会聚的飞秒激光辐射可以穿过材料的较厚部分而不被吸收或造成任何损坏，而且还正好在聚焦出现于的表面处烧蚀相同的材料。然后，当样品层被烧蚀时，焦点可以在材料内部逐渐移动。纳秒激光脉冲可能被基板部分地吸收，但仍可对烧蚀起作用，因为在焦点处的能量密度将是最高的(只要它对烧蚀是足够的)。

[0112] 以这种方式产生的信号的空间分辨率取决于两个主要因素：(i)当信号在被烧蚀的总面积上被积分时的激光的斑点尺寸；以及(ii)相对于羽流被产生的速度的羽流可被分析的速度，以避免来自连续羽流的信号的重叠，如上面讨论的。被称为斑点尺寸的距离对应于光束的最长内部尺寸，例如，对于圆形光束，它是直径2μm的光束，而对于方形光束，它对应于在相对的角之间的对角线的长度)。激光脉冲可以使用孔来成形，使用光束均化器均化(如果需要)，例如使用物镜被聚焦，以产生期望的斑点尺寸。一般，斑点尺寸为100μm或更小，例如50μm或更小、25μm或更小、20μm或更小、15μm或更小或10μm或者小于10μm。示例性斑点尺寸包括在0.10-3μm(例如，约0.3μm)、1-5μm(例如，约3μm)、1-10μm(例如，约1、约2、约3、约4或约5μm)、小于10μm和小于5μm的范围内的直径(或其它形状的相等尺寸的烧蚀区域)。在特定实施例中，激光系统被配置成以足够聚焦的激光脉冲操作，以烧蚀在大约1μm的数量级例如100nm至1μm的样品区域。

[0113] 为了分析单独的细胞，在激光烧蚀系统中的激光具有不大于这些细胞的斑点尺寸。该尺寸将取决于样品中的特定细胞，但通常激光斑点将因此具有小于4μm例如在0.1-4μm、0.25-3μm或0.4-2μm的范围内的直径。因此，激光斑点可以具有约3μm或更小、约2μm或更小、约1μm或更小、约0.5μm或小于0.5μm(例如约400nm或更小、约300nm或更小、约200nm或更小、约100nm或小于100nm)的直径。为了在亚细胞分辨率下分析细胞，本发明使用不大于这些细胞的激光斑点尺寸，并且更特别地，使用可以以亚细胞分辨率烧蚀材料的激光斑点尺寸。有时，例如在细胞分散在载玻片上，在细胞之间有空间的情况下可以使用大于细胞的尺寸的斑点尺寸来执行单个细胞分析。在这里，可以使用更大的斑点尺寸并实现单细胞表征，因为在感兴趣细胞周围的额外烧蚀区域不包括额外的细胞。因此，可以根据被分析的细胞的尺寸来适当地选择所使用的特定斑点尺寸。在生物样品中，细胞很少都具有相同的尺寸，且因此如果亚细胞分辨率成像是需要的，则烧蚀斑点尺寸应该小于最小的细胞，如果恒定的斑点尺寸在整个烧蚀过程中被保持的话。可以使用较宽激光束和近场光学器件的缩小来实现小斑点尺寸。1μm的激光斑点直径对应于1μm的激光焦点(即，在光束的焦点处的激光束的直径)，但是由于能量在目标上的空间分布(例如高斯光束形状)以及总激光能量相对于烧蚀阈值能量的变化，激光焦点可以变化+20％或更多。例如，使用25μm直径的激光束且使此遭受25倍缩小到组织样品上将给出具有1μm直径的斑点尺寸。

[0114] 在这个小尺度上的烧蚀产生非常少量的羽流材料，其又确保羽流的尺寸保持小。较小的羽流更可能停留在捕获流的中间中，而不接触烧蚀单元或传输导管的壁。在1微米尺度上的烧蚀也意味着在烧蚀表面和羽流膨胀减慢并被周围气体支配的区域之间的距离非常短。这个距离可以范围从几微米到几百微米。在本发明的一些版本中，捕获流存在于羽流停止膨胀的地方。因此，为了说明而非限制，几个附图示出在烧蚀表面和捕获流被显示为约
100微米的区域之间的距离。

[0115] 尽管在1微米(或更小)尺度上的烧蚀对于某些应用(例如成像)是有利的，但是当更大的烧蚀斑点例如在约5至约35微米直径的范围内例如在范围5至15微米、10至20微米、15至25微米、20至30微米和25至35微米内的烧蚀斑点被产生时，本发明的方法和仪器也是有用的。在大烧蚀斑点被产生的一些应用中，仅捕获羽流材料的一部分。

[0116] 在一些实施例中，激光器位于烧蚀腔室外部，且激光束(激光能量)例如通过光学窗口进入烧蚀腔室。如在本文所使用的，激光束可被描述为从表面(例如，激光透镜或反射镜)发射，该表面可被定向以将光束引导到特定位置或位置的图案。为了容易描述本发明，定向光束可以被认为具有特定的定向；光束的定向可以指与光束对准并延伸到实际光束之外的假想线(例如，当光束射到不透明表面时)。如从上下文中将明显的，对激光束的定向或位置的提及有时指在激光器在使用中时的无动力激光系统的光束将产生的定向或位置。

[0117] 为了组织样品的快速分析，需要高频率例如大于20Hz的烧蚀(即，每秒20次以上的烧蚀，每秒给出20以上的羽流)。在一些实施例中，由激光器进行的烧蚀的频率为至少40Hz，例如至少50Hz或至少100Hz。在一些实施例中，由激光器进行的烧蚀的频率在范围40-2000Hz内、在范围40-1500Hz内、在范围40-500Hz内、在范围40-200Hz内、在范围40-150Hz内或在范围75-150Hz内。大于40Hz的烧蚀频率允许在合理的时间中实现一般组织样品的成像。激光脉冲可以被指向样品上的一个斑点(假设在该斑点处的材料的完全烧蚀)并且仍然被单独地分辨的频率确定图像的像素可以多么快地被得到。因此，如果在某一点处烧蚀材料所需的激光脉冲的持续时间意味着每秒只有少于5个脉冲可被指向样品，那么在1μm的斑点尺寸的烧蚀的情况下研究1mm x 1mm面积所花费的时间将超过两天。在40Hz的速率的情况下，这将是大约6-7小时，脉冲频率的进一步增加分析时间会进一步减少。在这些频率下，如果希望单独地分辨每个烧蚀羽流，仪器必须能够足够快速地分析烧蚀材料，以避免在连续烧蚀之间的大量信号重叠。优选地是，源自连续羽流的信号之间的重叠在强度上<10％(更优选地<5％，并且理想地<2％)。分析羽流所需的时间将取决于烧蚀腔室的洗出时间(washout time)(见下面的烧蚀腔室章节)、样品材料的羽流到和通过电离系统的渡越时间(上面讨论了到电离系统的运输的优化)以及分析电离材料所花费的时间。每个激光脉冲可以与在随后构建的样品的图像上的像素相关，如下面更详细讨论的。

[0118] 烧蚀腔室

[0119] 具有短洗出时间(例如100ms或更短)的烧蚀腔室对供本发明的装置和方法使用是有利的。具有长洗出时间的单元将限制图像可被生成的速度或者将导致在源自连续样品斑点的信号之间的重叠(例如，Kindness等人(2003)Clin Chem 49:1916-23，其具有超过10秒的信号持续时间)。因此，来自激光烧蚀单元的样品材料的羽流的洗出时间是在不增加总扫描时间的情况下实现高分辨率的关键限制因素。具有<100ms的洗出时间的烧蚀腔室是本领域中已知的。例如，Gurevich& ((2007)J.Anal.At.Spectrom.,22:1043-1050)公开了具有低于100ms的洗出时间的烧蚀腔室。在参考文献Wang等人((2013)
Anal.Chem.85:10107-16)中公开了烧蚀腔室(也参见参考文献WO 2014/146724)，其具有
30ms或更小的洗出时间，从而允许高烧蚀频率(例如高于20Hz)并因此允许快速分析。在参考文献WO 2014/127034中公开了另一个这样的烧蚀腔室。在该文档中的烧蚀腔室包括被配置成可操作地靠近目标布置的样品捕获单元(这里描述的样品捕获单元是传输导管入口修改的例子，其可以与如上所述的传输导管的锥形和流牺牲修改组合)，该样品捕获单元包括：具有在捕获单元的表面中形成的开口的捕获腔，其中该捕获腔被配置成通过该开口接收从激光烧蚀部位喷射或产生的目标材料；和导向壁，其被暴露在捕获腔内并被配置成将捕获腔内的运载气体流从入口引导到出口，使得在捕获腔内接收的目标材料的至少一部分可作为样品传输到出口中。在参考文献WO2014/127034的烧蚀腔室中的捕获腔的体积小于
1cm3，并且可以低于0.005cm3。有时烧蚀腔室具有25ms或更短例如20ms或10ms或更短的洗出时间。传输导管的样品锥体入口例如不对称的样品锥体也可以帮助减少烧蚀腔室的洗出时间，并且是这里讨论的捕获单元的替代方案。

[0120] 电离系统

[0121] 可以通过多种技术来电离样品材料。ICP的使用适用于IMS和IMC分析。ICP是一种等离子体源，其中能量由电磁感应所产生的电流提供。一般，等离子体源基于氩气。例如，电离系统可以包括ICP炬。使用在电离系统中的ICP的IMC在例如Giesen等人((2014)Nature Methods.11:417–422)和Wang等人((2013)Anal.Chem.85:10107-16)中被报告。

[0122] 电离系统因此从激光采样系统接收样品材料，并将它转换成元素离子，用于由质谱仪检测。如果样品材料没有原子化(例如，样品材料的羽流仍然在分子的形式中或者甚至是颗粒材料的气溶胶)，那么电离系统起作用来将材料分解成元素离子，作为电离过程的一部分。

[0123] 质谱仪

[0124] 如上面所提到的，该装置的第三部件是质谱仪。用于在本发明中使用的质量分析器可以根据操作者的需要或特定应用来选择。示例性类型的质量分析器包括四极、飞行时间(TOF)、磁性扇区、高分辨率、基于单或多收集器的质谱仪。

[0125] 分析电离材料所花费的时间将取决于用于离子的检测的质量分析器/质谱仪的类型。例如，使用法拉第杯的仪器对于分析快速信号可能太慢，但并非所有分析都将需要信号的快速分析，且因此技术人员将能够适当地选择质谱仪或质量分析仪。总的来说，期望的分析速度(和因此烧蚀羽流可以以其被询问的频率)以及复用的程度(同时/准同时被监测的原子的数量)将指示应被使用的质量分析器的类型(或相反地，质量分析器的选择将决定可被实现的速度和复用)。

[0126] 通常，飞行时间质谱仪用于记录具有从快速激光烧蚀设置预期的渡越持续时间的快速瞬态事件。

[0127] TOF检测器可以准同时地记录在单个样品中的多个质量。虽然TOF质量分析器通常由于处理在TOF加速器和飞行管中的空间电荷的效应所需的折衷而对于原子分析是不受欢迎的，但是该技术的有效性可以通过仅使用它来检测范围的子集而提高。例如，在质量细胞计数法和成像质量细胞计数法中，范围可以被选择，仅使得来自用于标记生物样品中的目标分子的标记原子的离子被检测到，以及所以其他原子(例如具有低于80的原子质量的原子)可以被去除。这导致不那么密集的离子束，其富集于(例如)80-210道尔顿区域中的质量，其可被更有效地操纵和聚集，从而促进TOF检测并利用TOF的高光谱扫描率。因此，可通过组合TOF检测与选择在样品中不常见的标记原子以及理想地使质量高于在未标记样品中所见的质量例如通过使用较高质量过渡元素来实现快速分析。可在Tanner等人的Cancer Immunol Immunother((2013)62:955–965)和美国专利7479630中找到关于质量细胞计数法的另外的细节以及在Giesen等人((2014)Nature Methods.11:417–422)中找到关于成像质量细胞计数法的另外的细节。

[0128] 上述传输导管修改可应用于的在使用中的装置和本发明的附加变型

[0129] 本发明的装置可用于生物样品的分析或成像，该生物样品可在透明基板上。在成像实施例中，通常激光器可以以连续的一连串脉冲或指向被称为“感兴趣斑点”或“烧蚀的位置或区”的样品的不同位置的脉冲群操作。脉冲可以被引导到在设定图案例如用于二维成像的光栅中的斑点。可替代地，可以烧蚀在不同位置处的多个单独的斑点(例如，对应于单独的细胞)。在一些实施例中，激光器发射产生来自同一像素(即在目标上的同一位置)的羽流的脉冲群。由脉冲群内的单独脉冲产生的烧蚀羽流预期融合成一个羽流，并以这样的方式在仪器内行进，使得它们将不同于由另一个像素产生的羽流。为了区分开单独的像素，在脉冲群之间的持续时间(像素询问，其可以是仅仅一个脉冲或100个脉冲)被保持在由来自单独像素的离子信号(在检测器处)的时间扩展所确定的某个限制之上。

[0130] 根据当前教导，质量分析器可以有区别地分析每个单独的样品羽流。在一个方面中，该设备被配置成使得羽流在烧蚀单元(烧蚀系统)和传输导管中的扩展小于在电离系统和质量分析器中出现的扩展。在一个方面中，可以通过在羽流到电离系统的累积渡越时间内的时间段内将每个烧蚀的羽流传输到电离系统和由质量分析器进行的离子检测来有区别地分析羽流。这可以通过以下方式来完成：经由气体流捕获每个样品羽流并在这样的传输配置下使得在传输时间段(即烧蚀羽流从烧蚀部位到等离子体的传输)期间的羽流展宽(broading)和在离子渡越时间段(即离子从等离子体到质量分析器的传输)期间的羽流展宽之间的比等于或小于1。

[0131] 通常，样品颗粒尺寸限制——对于其，电离系统(例如ICP)可以为了分析检测的目的而有效地蒸发和电离——在大约10μm或更小的数量级上。由在1微米尺度下的激光烧蚀产生的颗粒低于1微米，且非常适合于ICP离子源。对于离散颗粒分析(例如可以使用Fluidigm Canada有限公司的仪器来被执行)，这些颗粒可被电离和分析地检测的一般速率可以是当颗粒被蒸发和电离时在等离子体中的样品的渡越时间的累积展宽或扩展以及在ICP和它的由质量分析器进行的检测之间的离子的渡越时间展宽或扩展的函数。通常，累积时间展宽或扩展可以是大约200μs持续时间的数量级。因此，对于在空间上分离的10μm或更小的颗粒，可以通过在大约200μs的时间段内将每个颗粒传输到电离系统(例如ICP)来实现对每个不同颗粒的分析。在一些实施例中，颗粒在小于200μs或小于150μs内被传输到电离系统(例如ICP)。因此，在生物样品的成像可以通过激光烧蚀来执行的样品引入系统中，激光系统可以被配置成在有足够聚焦的激光脉冲的情况下操作，以烧蚀在大约1μm的数量级的样品区域，例如飞秒脉冲激光器的应用。利用这种配置，由每个激光脉冲形成的烧蚀羽流可以包括具有通常约1μm或更小的尺寸的样品颗粒。在如本文所述的某些条件下，这些颗粒可以被捕获和传输以满足如所需的传输时间段，且随后每个不同的羽流可以被电离系统有效地蒸发和电离。

[0132] 此外，当以连续的脉冲序列操作激光器时，例如跨样品表面进行光栅化以进行二维成像的情况下，每个羽流的区别性以及在每个后续羽流之间的空间间隔可以被保持在羽流的形成区和电离系统离子源中的蒸发和电离点之间。例如，当羽流被运送通过导管(例如图1中所示的喷射器管)时，羽流中的颗粒可以在它进入电离系统(例如ICP的等离子体)之前在径向方向上向外扩展和膨胀。在羽流中产生的颗粒的扩展可以在颗粒形成时和当颗粒在渡越到电离系统期间发展时取决于它的扩散系数、载气流的速度分布图以及颗粒密度的分布。例如，1μm的飞秒激光烧蚀斑点尺寸可以产生羽流，该羽流在它的渡越期间进一步扩展之前具有大约100μm或更小的初始横截面直径。羽流的扩展的程度也可以是烧蚀颗粒的尺寸的函数；较大的颗粒倾向于具有较低的扩散扩展，但是具有较高的动量，由于接触传输导管/喷射器管的内壁而导致潜在的损失。因此，希望最小化羽流扩展和/或在足够的时间内将羽流传输到电离系统，以在扩展的程度呈现任何挑战性效应之前蒸发和电离。

[0133] 因此，在各种实施例中，通过在本文和附图中描述的示例性布置，可以实现用于烧蚀1μm样品斑点并有效地运输羽流使得扩展被保持在传输导管/喷射器管的内径内的激光器的使用。

[0134] 对于给定的激光烧蚀系统和给定的样品，烧蚀羽流在激光烧蚀之后膨胀，直到它们达到被称为“采样体积”的特征体积为止。将系统配置为最小化采样体积并增加气体流远离采样体积而传送羽流的速度是合乎需要的。小采样体积和快速气体流的组合减少了到传输导管/喷射器中的羽流传输的时间扩展。在当任一维度上的羽流膨胀的速度明显(～10倍)低于周围气体介质的声速时的时刻，采样体积可以由羽流的包络(envelope)描述。在没有限制的情况下，示例性采样体积可以在范围10-6mm3–10mm3内。采样体积常常在范围0.001mm3-1mm3内。捕获流(在存在的情况下)流入采样体积的至少一部分内，并将羽流的至少一部分传送到传输导管/喷射器中，随后羽流可以被传输流运输到电离系统(例如ICP)。
当捕获流进入采样体积时捕获流的速度相当大(例如，>1m/s、>10m/s、>100m/s或>500m/s)是合乎需要的。在一些实施例中，当捕获流进入采样体积时它的速度可以通过测量(例如通过传输导管/喷射器孔)进入传输导管/喷射器内的捕获流的速度来估计。在一些实施例中，这个所测量的速度>1m/s、>10m/s、>100m/s或>500m/s。与本发明相反，如果羽流没有被迅速冲走，它将继续膨胀和扩散，不合意地填充整个烧蚀单元。

[0135] 在一个方面中，本发明提供了一种激光烧蚀配置，其中激光束指向目标。在一个实施例中，目标包括基板和设置在基板上的样品。在一个实施例中，基板是透明的，并且目标是透明的目标。

[0136] 在一个方面中，本发明提供了一种用于“穿透目标”烧蚀的激光烧蚀配置(下面在图2但不限于图2的上下文中被讨论)。在这种配置中，激光束的脉冲被引导穿过透明目标，并且样品羽流(“烧蚀羽流”或“羽流”)在到传输导管/喷射器中的光束的下游形成。也参见图3-5。由于光学元件(窗口、物镜等)从羽流的笔直路径的去除，穿透目标照射对优化渡越时间展宽是有利的。在一个方面中，本发明提供了一种激光烧蚀系统，其包括：(a)能够产生激光照明的激光器；(b)激光烧蚀单元(或激光烧蚀系统)，透明目标可被引入到该激光烧蚀单元内，以及具有开口的传输导管/喷射器，烧蚀羽流可通过该开口进入，其中激光照明源自在透明目标的一侧上的表面，且传输导管/喷射器开口在另一侧上。在包括例子的整个本公开中描述了在系统中可包括的其他特征。

[0137] 在图1中，激光烧蚀质量细胞计数器包括激光烧蚀系统，其可以连接到喷射器，例如由石英或其它通常合适的材料制成的管，并被安装用于将样品输送到也被称为ICP炬的电感耦合等离子体(ICP)源。ICP炬的等离子体可以蒸发和电离样品，以形成可以被质量分析器接收的离子。

[0138] 在根据图2的各种实施例中，可以通过使用被格式化为与透明目标兼容的样品来为了激光烧蚀而配置感兴趣样品。样品可以放置在透明基板上，合并到透明基板中，或者可以被形成为透明目标。合适的激光透明基板可以包括玻璃、塑料、石英和其他材料。通常，基板实质上是平面的或平坦的。在一些实施例中，基板是弯曲的。在某些实施例中，基板为从0.1mm到高达3mm厚。在一些实施例中，基板被编码(参见例如通过引用被并入本文的Antonov,A.和Bandura,D.的2012年的美国专利公开2012/0061561)。在这种配置中，激光束的脉冲被引导穿过透明目标，并且样品羽流(“烧蚀羽流”或“羽流”)在到传输导管/喷射器中的光束的下游形成。

[0139] 传输导管可具有被配置成捕获烧蚀羽流的入口；例如被形成为如图2所示的具有小开口或孔的样品锥体的入口。在这种配置中，样品锥体可以位于羽流被形成于的区域或区附近。例如，样品锥体的开口可以定位成距透明目标10μm至1000μm，例如远离透明目标约100μm。因此，烧蚀羽流可以至少部分地在锥体的扩展区域内产生和形成。在一些实施例中，孔的直径和/或间距的尺寸(包括角度)是可调节的，以允许在各种条件下的优化。例如，在具有在100μm的尺度中的横截面直径的羽流的情况下，孔的直径可以在有足够的间隙的情况下以100μm的数量级依尺寸被制造，以当羽流经过时防止对羽流的扰动。

[0140] 传输导管可以继续在采样锥体的下游，以用于在这样的配置中接收烧蚀羽流，以便鼓励羽流的移动并根据激光脉冲来保持每个后续羽流的空间区别性。因此，可以引入气体流来帮助引导羽流通过采样锥体的孔，以便有区别地捕获(捕获流)每个羽流，同时额外的气体流可以被引入到传输导管/喷射器，用于将每个有区别地捕获的羽流传输(传输流或鞘流)到电离系统。传输流或鞘流的另一个功能是防止在羽流中产生的颗粒接触传输导管/喷射器的壁。气体可以是例如但不限于氩气、氙气、氦气、氮气或这些的混合物。在一些实施例中，气体是氩气。捕获流气体和传输流气体可以是相同的或不同的。

[0141] 选择或确定适合于本发明的气体流量是在由本公开指导的本领域中的普通技术人员的能力范围内的。通过传输导管的总流量通常由电离源(例如ICP电离源)的要求规定。激光烧蚀设置需要提供将匹配这些要求的流。例如，在图2以及示出各种配置的其他图中，传输导管通常被描述为具有1mm内径，结合大约1升/分钟的累积气体流量(0.1升/分钟捕获流量加上0.9升/分钟传输流)。预期的是，较小或较大直径的传输导管以及相应地被选择的气体流量可以应用于呈现有类似预期结果的各种几何结构。用于在传输导管内保持非湍流气体动力学以便保持每个单独烧蚀羽流的区别性的条件是合乎需要的。

[0142] 如本文所述的，给定元件的特定配置(例如，气体入口位置、孔、传输导管特性和其他元件的特定配置)，选择捕获和传输流率，以导致在羽流在电离系统和它的由质量分析器进行的检测之间的累积渡越时间内的时间段内每个烧蚀羽流到电离系统(例如ICP)的传输。这可以通过以下方式实现：经由气体流捕获每个样品羽流且在这样的传输配置下使得在传输时间段期间的羽流展宽和在离子渡越时间段期间的展宽之间的比等于或小于1。也就是说，渡越信号的时间展宽(或时间扩展)是重要的。ICP-MS设备(例如Fluidigm Canada有限公司的 ICP-TOF仪器)的特征在于信号的固有展宽。在激光烧蚀的情况下，与在ICP-MS本身上的时间扩展相比，喷射单个羽流的动作可以或可以不是快的。在电离前羽流的扩展取决于激光烧蚀系统和尤其是烧蚀腔室和传输导管的设计。激光烧蚀系统和传输导管不使原始烧蚀羽流扩展得比剩余仪器的固有展宽更多是合乎需要的。这个条件确保在由烧蚀羽流产生的检测信号中的尖峰与可能对所选择的仪器的尖峰一样尖锐(在时间上)。如果羽流的扩展比在例如ICP-MS系统中的扩展长得多，那么来自单个脉冲的激光烧蚀的事件将在检测器处出现得宽得多。但是，如果在激光烧蚀部分中的扩展小于仪器扩展，则总扩展将由仪器扩展主导。因此，人们可以使用校准珠(calibration bead)来测量仪器扩展，且然后测量来自单个激光脉冲的总扩展，并比较这两个数字。如果来自激光烧蚀的扩展小于来自仪器的扩展，那么总扩展将比仪器扩展小2倍。

[0143] 特征仪器时间展宽可以例如使用标记的细胞或校准珠在实验上被测量。在单个珠进入质量细胞计数器(例如 ICP-TOF仪器)的任何时间，珠经历在等离子体中的蒸发和电离，且然后通过质量分析器，直到它的信号到达检测器为止。瞬态事件被检测并用于记录关于特定珠的信息，例如瞬态信号的宽度(其表示来自单个事件的时间扩展)和从ICP源开始发生并在检测器处结束的扩展的值。

[0144] 在一些实施例中，该设备被配置为针对在样品和质量分析器的离子检测器之间限定的路径允许在10和1000微秒之间的时间扩展。

[0145] 一般捕获流量在0.1至1Lpm的范围内。最佳捕获流量可以在实验上被确定，但是通常在该范围的下端(例如，大约0.1Lpm)处。一般传输流量在0.1至1Lpm的范围内。最佳传输流量可以在实验上被确定，但是通常在该范围的上端(例如，大约0.9Lpm)处。在一些实施例中，捕获流量低于传输流量。在一些情况下，传输流量可以是0，例如，如果捕获流量大约为1Lpm。传输流量常常在0.4-1Lpm的范围内(例如，0.4、0.6、0.8或1Lpm)。

[0146] 为了说明，在图2中所示的配置中，为了通过采样锥体捕获羽流而供应的气体的流量可以是大约0.1升/分钟，而大约0.9升/分钟的传输流可以通过1mm内径的传输导管/喷射器管。气体流及其引入定向可以为了每个烧蚀羽流的有效捕获和传输被优化，使得每个羽流保持它的区别性。

[0147] 在根据图3的各种实施例中，可以省略图2的采样锥体，使得开端式传输导管/喷射器可代替孔而被定位。在这种配置中，供应气体的每分钟大约1升的累积流量可以被以这样的方式引入，以便能够有区别地捕获每个烧蚀羽流并将其直接传输到传输导管/喷射器中。在一些实施例中，在透明目标的表面和传输导管/喷射器入口之间的距离为500μm或更小，例如小于约200μm、小于约100μm或小于约50μm。在图3的配置中，没有单独的捕获流和传输流。替代地，单个气体流引导羽流通过孔，并朝向电离系统(例如ICP)传输有区别地捕获的羽流。在这种布置中，气体流常常在每分钟0.2升至每分钟2升的范围内。

[0148] 在各种实施例中，烧蚀羽流可直接在传输导管/喷射器管内形成，它的形成方向被定向在如图4和图5中所指示的横向方向上。利用根据图2描述的类似透明目标配置，每个烧蚀羽流可以被气体流(大约每分钟1升)捕获，并被抽到电离系统(例如ICP)的下游。因为图4中所示的透明目标相对于传输导管/喷射器管在固定位置上，每个烧蚀斑点的位置可以被改变以提供扫描能力。例如，入射激光束烧蚀可以移动到遍及静止样品的各种感兴趣斑点，或者以光栅图案移动以提供更大的成像能力。通常，在光栅操作中，当烧蚀位置根据设定的图案变化时，脉冲激光器连续地操作。可替代地，在各种实施例中，激光束可以保持静止，而目标可以被配置为移动以提供用于烧蚀的不同斑点，如图5所示。

[0149] 在根据图6的各种实施例中，激光束可以被引导从与样品相同的一侧入射到目标上。在这个实例中，样品可以放置在基板上，且激光束的每个脉冲可以产生在入射激光的方向上膨胀的烧蚀羽流。激光辐射可能大约垂直于基板，或者可以以其它角度被定向，这将导致烧蚀斑点被拉伸(例如，椭圆形而不是圆形)。对激光辐射角的限制是辐射本身会聚在锥体中。将光束聚焦到1微米尺度需要锥角是相当宽的(常常被表示为在高数值孔径下操作)。这意味着激光束的显著倾斜可能影响将激光聚焦到紧密斑点的能力。

[0150] 图6示出了“动力冲洗”的使用。“动力冲洗”气体流可以被引导到羽流被形成于的区附近(例如，在离该区大约100μm距离处)。来自“动力冲洗”的气体流可以将烧蚀羽流强制或者将羽流重定向到传输导管/喷射器管的入口端，当每个羽流被形成或产生时有效地捕获它。利用根据以上例子所述的类似配置，喷射器管可以被提供有气体流(在该图示中约为每分钟0.9升)，以捕获羽流并将羽流朝向电离系统(例如ICP)传输。例如在各种实施例中，“动力冲洗”流可以用通过窄喷嘴(例如在直径上是约100μm)输送的气体流(约0.1升/分钟)来实现，以产生适于将每个随后烧蚀羽流重定向到传输导管/喷射器管中的气体射流。动力冲洗气体流的源(例如喷嘴)可以被称为“气体入口”，因为它是朝着羽流的动力冲洗气体流的入口。可替代地，动力冲洗气体流的源可以被称为“端口”。例如，“动力冲洗”气体流可以从在离激光烧蚀斑点(羽流的形成区)50μm至200μm的距离处的喷嘴中出现。将明显的是，如在这个上下文中所使用的，“喷嘴”并不指任何特定的结构，而是指动力冲洗气体从中出现的出口。如图6所示，动力冲洗喷嘴的直径小于传输导管/喷射器的内径(或等效横截面尺寸)。例如，喷嘴的直径可以是传输导管/喷射器的直径的10％至50％。在一些实施例中，动力冲洗将羽流引导到锥形传输导管/喷射器入口中。

[0151] 图7示出了一个实施例，其中所研究的样品从顶侧由激光辐射照射。激光辐射被物镜聚焦，然后穿过光学窗口，且最后通过锥形导管进入密封烧蚀腔室。导管的圆锥形状允许激光辐射传到目标，同时提供用于使捕获气体离开腔室的导管。捕获气体携带烧蚀羽流的内容物，且然后与鞘流合并。通过选择气体通道的尺寸和流量，可以确保捕获流被鞘流包围，并且来自烧蚀羽流的堵塞物(plug)停留在传输导管/喷射器流的轴附近。羽流的这一位置促进在减小的时间扩展的情况下的羽流的快速传输。

[0152] 图8示出了与图7的配置类似的配置，并且示出了更强的鞘流可以用于包围在流的中心中具有羽流材料的流。图8示出了鞘流的一部分作为牺牲流被丢弃，而包含捕获流和羽流材料的鞘流的核心进入将该流供应到ICP中的短导管。

[0153] 图8中所示的利用牺牲流的技术可以应用于上述其它配置。在这样的实施例中，传输导管/喷射器可以被认为具有两个具有不同内径的部分。牺牲流配置的主要好处是捕获流和羽流材料停留在管的中心附近，其中气体流的速度分布图几乎是平坦的，即捕获羽流的不同部分以相似的速度前进。

[0154] 图9示出了激光束照射在样品的顶部上的另一个实施例。在这里，羽流被采样到与目标大致垂直地布置的采样导管中。羽流材料被捕获流包围，捕获流也充当鞘流。

[0155] 在图9中的羽流的捕获的气体动力学类似于图3的气体动力学，其中穿透目标照射被使用。因为图9中的激光辐射也定位成垂直于目标(如同气体导管一样)，物镜和光学窗口具有气体导管的开口。在穿过物镜后，导管被弯曲以将样品从光路带走并将它移动到电离系统内。

[0156] 图10示出了一种布置，其中激光烧蚀和羽流采样类似于图9中所示的实施例。然而，为了避免在下游进一步弯曲气体导管，代替地使用反射镜来使激光辐射弯曲。在这里，光学窗口、物镜长度和反射镜都具有用于使传送捕获气体和羽流材料的气体导管通过的开口。

[0157] 虽然本教导是结合各种实施例被描述，但是意图不是本教导被限制到这样的实施例。相反，如本领域中的技术人员将认识到的，本教导包括各种替代方案、修改和等效形式。例如，在图中示出的各种例子中，传输导管/喷射器管通常被描述为具有1mm内径，结合大约
1升/分钟(0.1加0.9升/分钟)的累积气体流量。预期较小或较大直径的传输导管/喷射器以及相应地被选择的气体流量可以应用于呈现有类似预期结果的各种几何结构。然而，用于在喷射器管内保持非湍流或几乎非湍流的气体动力学以便保持每个单独烧蚀羽流的区别性的条件可能是合乎需要的。

[0158] 此外，在升高的激光脉冲速率的一些实例中，在如上面所讨论的累积渡越时间扩展内多于一个的烧蚀羽流可以被不同地捕获并被传输到电离系统(例如ICP)。例如，在10kHz的重复速率下，脉冲激光可以在200μs内产生两个烧蚀羽流，其随后可以被传输到ICP用于电离。从两个离散羽流产生的离子可以作为离子的单个离散包由质量分析器分析。因此，当激光器保持在同一烧蚀斑点处时或者当激光在连续斑点的轨迹上的移动速率小于重复速率时，烧蚀羽流和随后的离子可以提供在同一烧蚀斑点处的累积质量分析或者分别提供沿着轨迹的平均质量分布。应该注意，可以采用高达几MHz的激光重复速率，产生代表许多激光脉冲的平均值的信号。激光也可以以脉冲串被发射，以在单独的采样位置(或像素)之间提供数据流中的间隙。

[0159] 将理解，本发明的方法和设备可以供多种类型的样品例如生物样品中的任一个使用。在一种方法中，样品是细胞材料，例如组织切片、细胞单层、细胞制备等。样品可以是高达100微米厚的薄切片生物组织、毫米厚度的数量级的组织样品或未切片的组织样品。在一个例子中，可以使用薄组织切片(例如石蜡包埋切片)。为了说明，一些组织切片具有10纳米至10微米的厚度。在一些情况下，样品是一组细胞或者来自一组细胞的一个或更多个选定细胞。参见例如通过引用被并入本文的Antonov,A.和Bandura,D.的2012年的美国专利公开2012/0061561。

[0160] 构建图像

[0161] IMS和IMC可以为羽流中的多个标记原子/元素标签提供信号。羽流中的标记的检测揭示了它的同源目标在烧蚀的位置(或者相应地，材料块的解吸的位置)处的存在。通过在样品的表面上的已知空间位置处生成一系列羽流，MS信号揭示在样品上的标记的位置，并且因此信号可用于构建样品的图像。通过用可区别的标记来标记多个目标，可能使标记原子的位置与同源目标的位置相关联，所以本发明可构建复杂图像，达到远超过使用现有技术可实现的那些复用水平的复用水平。例如，可使用来自Kylebank Software的GRAPHIS包，但也可使用诸如TERAPLOT、ImageJ和CellProfiler的其它包。使用来自诸如MALDI-MSI的技术的MS数据的成像在本领域中是已知的，例如Robichaud等人((2013)J Am Soc Mass Spectrom 24(5):718-21)公开了“MSiReader”界面以在Matlab平台上查看和分析MS成像文件，并且还有用于以全空间和光谱分辨率对2D和3D MSI数据集的快速数据探索和可视化的仪器，例如“Datacube Explorer”程序。

[0162] 样品

[0163] 本发明提供对样品成像的方法。所有种类的样品——包括合金、地质样品和考古样品——可以由方法分析。也可以分析生物样品。这样的样品包括多个细胞，多个这些细胞可以遭受IMS和/或IMC，以便提供在样品中的这些细胞的图像。通常，本发明可用于分析现在通过IHC技术来研究的但利用适合于由IMC检测的标记的组织样品。

[0164] 可以分析任何合适的组织样品。例如，组织可以是上皮组织、肌肉组织、神经组织等以及其组合。出于诊断或预后目的，组织可来自肿瘤。在一些实施例中，样品可来自已知的组织，但样品是否包含肿瘤细胞可为未知的。成像可揭示指示肿瘤的存在的目标的存在，因此促进诊断。组织样品可包括乳腺癌组织(例如，人类乳腺癌组织或人类乳腺上皮组织(HMLE))。组织样品可以包括福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织，可以是冷冻组织，或者可以是包埋在合适树脂中的组织。可从任何活的多细胞有机体(但将通常是人类)获得组织。

[0165] 组织样品将通常是例如具有在2-10μm的范围内例如在4-6μm之间的厚度的切片。也可以分析小于2μm厚度例如小于1μm、小于500nm、小于250nm或甚至100nm或更小的样品。
较薄的组织样品将由于由稍后的脉冲烧蚀的样品的体积的减少而产生较低的信号，但是切片越薄，越多的切片就可以从组织样品产生，这在通过对多个切片成像的3D成像方面提供好处。用于制备这种切片的技术从IHC的领域是众所周知的，例如使用显微镜用薄片切片机，包括脱水步骤，包括包埋等。因此，组织可以被化学地固定，且然后切片可以在期望平面内被制备。冷冻切片或激光捕获显微切割还可用于制备组织样品。样品可被透化，例如以允许用于细胞内目标的标记的试剂(参见上文)。

[0166] 待分析的组织样品的尺寸将类似于当前IHC方法，尽管最大尺寸将由激光烧蚀装置并且特别是由可装入烧蚀腔室内的样品的尺寸规定。高达5mm x 5mm的尺寸为典型的，但更小的样品(例如，1mm x 1mm)也是有用的(这些尺寸指切片的尺寸，而不是它的厚度)。

[0167] 组织样品的标记

[0168] 在一些实施例中，如上所述，本发明的装置和方法检测已经被添加到样品的原子(即，其通常不存在)。这种原子被称为标记原子(因此标记原子代表元素标签)。样品通常是包括细胞的生物样品，且标记原子用于标记在细胞中/在细胞表面上的目标分子。在一些实施例中，实现不止一个标记原子的同时检测，允许多重标记检测(例如，至少3、4、5、10、20、30、32、40、50或甚至100个不同的标记原子)。通过用不同的标记原子来标记不同的目标，确定在单个细胞上的多个目标的存在是可能的。

[0169] 可与本发明一起使用的标记原子包括任何种类，其可由MS检测并且实质上不存在于未标记的样品。因此例如，12C原子作为标记原子将是不合适的，因为它们是天然地丰富的，而11C在理论上可以被使用，因为它为不天然地出现的人造同位素。然而，在优选实施例中，标记原子为过渡金属，诸如稀土金属(15号镧系元素，加上钪和钇)。这些17种元素提供可容易地被MS区分的许多不同的同位素。多种这些元素以富集同位素的形式可得到，例如，钐具有6种稳定同位素，并且钕具有7种稳定同位素，其中全部以富集方式可得到。15号镧系元素提供具有非冗余唯一质量的至少37种同位素。适于用作标记原子的元素的例子包括镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钷(Pm)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、镥(Lu)、钪(Sc)和钇(Y)。除了稀土金属之外，其他金属原子例如金(Au)、铂(Pt)、铱(Ir)、铑(Rh)、铋(Bi)等也适合于由MS检测。放射性同位素的使用不是优选的，因为它们处理起来不太方便并且不稳定，例如Pm不是在镧系元素当中的优选的标记原子。

[0170] 为了便于TOF分析(参见上文)，使用具有在范围80-250内(例如在范围80-210内或在范围100-200内)的原子质量的标记原子是有用的。该范围包括全部的镧系元素，但排除Sc和Y。100-200的范围通过使用不同的标记原子来允许理论101-丛(plex)分析，同时允许本发明利用TOF MS的高光谱扫描速率。如上面所提及的，通过选择其质量位于在未标记样品中所看到的那些之上的窗口中的标记原子(例如，在100-200的范围内)，TOF检测可用于提供在生物上显著的水平处的快速分析。

[0171] 标记样品通常要求标记原子附着到特定结合对(sbp)的一个成员。这个所标记的sbp与样品接触，使得它可与sbp的另一个成员(目标sbp成员)(如果它存在)交互作用，从而将标记原子定位到样品中的目标分子。然后，本发明的方法在标记原子由质量细胞计数器分析时检测在颗粒上的标记原子的存在。稀土金属和其他标记原子可以通过已知的技术被结合到sbp成员，例如Brückner等人((2013)Anal.Chem.86:585-91)描述了镧系元素原子到寡核苷酸探针的附着以用于MS检测，Gao&Yu((2007)Biosensor Bioelectronics 22:933-40)描述了钌用于标记寡核苷酸，以及Fluidigm Canada出售MaxParTM金属标记试剂盒，其可用于将超过30个不同的标记原子结合到蛋白质(包括抗体)。

[0172] 各种数目的标记原子可附着到单个sbp成员，并且当更多标记原子附着到任何sbp成员时，可实现更大的灵敏度。例如，大于10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个标记原子可附着到sbp成员。例如，可使用包含多个单体单元的单分散性聚合物以形成元素标签，每-6个包含诸如DTPA的螯合剂。例如，DTPA结合具有大约10 M的离解常数的3+镧系离子[Tanner等人，Cancer Immunol Immunother(2013)62:955–965]。这些聚合物可以终止于硫醇反应性基团(例如马来酰亚胺)，其可以用于附着到sbp成员。例如，硫醇反应性基团可结合到抗体的Fc区。其他功能性基团也可用于这些聚合物的结合，例如，胺反应性基团例如N-羟基琥珀酰亚胺酯，或者针对羧基或针对抗体的糖基化是反应性的基团。任何数目的聚合物可结合到每个sbp成员。可使用的聚合物的特定例子包括直链(“X8”)聚合物或第三代树突状(“DN3”)聚合物，这两者都作为MaxParTM试剂是可得到的。金属纳米颗粒的使用还可用于增加标记中原子的数目。

[0173] 如上面所提及的，标记原子附着到sbp成员，并且这个所标记的sbp成员与样品接触，其中它可发现目标sbp成员(如果存在的话)，从而形成所标记的sbp。所标记的sbp成员可包括适合于附着到标记原子且然后适合于根据本发明的检测的任何化学结构。

[0174] 一般来说，本发明的方法可基于任何sbp，其已经被已知用于在确定样品中的目标分子的存在时(例如，如在IHC中或荧光原位杂交FISH中被使用)或基于荧光的流式细胞计数法中使用，但与样品接触的sbp成员将携带通过MS可检测的标记原子。因此，可容易地通过使用可用的流式细胞计数法试剂、仅仅通过修改先前已经用于例如修改FISH探针以携带可由MS检测的标记来实现本发明。

[0175] Sbp可包括以下项中的任一项：核酸双链体；抗体/抗原复合物；受体/配体对；或适体/目标对。因此，标记原子可附着到核酸探针，其然后与样品接触，使得探针可在其中与补充的核酸杂交，例如以形成DNA/DNA双链体、DNA/RNA双链体或RNA/RNA双链体。类似地，标记原子可附着到抗体，其然后与样品接触，使得它可结合到它的抗原。标记原子可附着到配体，其然后与样品接触，使得它可结合到它的受体。标记原子可附着到适体配体，其然后与样品接触，使得它可结合到它的目标。因此，所标记的sbp成员可用于检测在样品中的多种目标分子，包括DNA序列、RNA序列、蛋白质、糖、脂质或代谢物。

[0176] 在一般实施例中，所标记的sbp成员为抗体。可以通过将结合分子的一个或更多个标记原子结合到抗体来实现抗体的标记(例如，使用如以上所描述的MaxParTM结合试剂盒)。抗体的目标分子被称为它的抗原，且可以是蛋白质、碳水化合物、核酸等。识别对质量细胞计数法有用的细胞蛋白质的抗体已经对IHC用途是广泛可用的，并且通过使用标记原子而不是当前标记技术(例如，荧光)，这些已知的抗体可容易地适合于在本发明的方法中使用，但有增加复用能力的益处。与本发明一起使用的抗体可识别在细胞表面上的目标或在细胞内的目标。抗体可识别多种目标，例如，它们可特别地识别单独的蛋白质，或者可识别共享公共表位的多个相关蛋白质，或者可识别在蛋白质上的特定转录后修饰(例如，以区分开在感兴趣蛋白质上的酪氨酸和磷酸-酪氨酸，以区分开赖氨酸和乙酰基-赖氨酸，以检测泛素化，等等)。在结合到它的目标之后，结合到抗体的标记原子可被检测以揭示在样品中的该目标的存在。

[0177] 标记的sbp成员将通常直接与样品中的目标sbp成员相互作用。然而，在一些实施例中，所标记的sbp成员与目标sbp成员间接地交互作用是可能的，例如，以夹心测定(sandwich assay)的方式，第一抗体可结合到目标sbp成员，并且所标记的第二抗体可然后结合到第一抗体。然而，本发明通常依赖于直接交互作用，因为这可更容易地实现并允许更高的复用。然而，在两种情况下，样品与可结合到样品中的目标sbp成员的sbp成员接触，并且在稍后阶段，检测附着到目标sbp成员的标记。

[0178] 本发明的一个特征是其检测在样品中的多个(例如，10个或更多个以及甚至高达100个或更多个)不同目标sbp成员例如检测样品中多个不同的蛋白质和/或多个不同的核酸序列的能力。为了允许这些目标sbp成员的区别检测，它们各自的sbp成员应携带不同的标记原子，使得它们的信号可由MS区分。例如，在检测十种不同蛋白质的情况下，可使用十种不同的抗体(每个特定于不同的目标蛋白质)，其每个携带唯一的标记，使得可区分来自不同抗体的信号。在一些实施例中，针对单个目标使用多个不同的抗体(例如，其识别在同一蛋白质上的不同表位)是合乎需要的。

[0179] 如果使用多于一个标记抗体，那么抗体应具有针对它们各自的抗原的类似亲和性是优选的，因为这帮助确保在通过MS检测的标记原子的数量和目标抗原的丰度之间的关系将跨不同的sbp更加一致(特别在高扫描频率下)。

[0180] 如果目标sbp成员位于细胞内，则通常将有必要在样品与标记接触之前或期间渗透细胞膜。例如，当目标为DNA序列但所标记的sbp成员不能透过活细胞的膜时，可固定和透化样品的细胞。标记的sbp成员可然后进入细胞并与目标sbp成员形成sbp。

[0181] 通常，本发明的方法将检测至少一个细胞内目标和至少一个细胞表面目标。然而，在一些实施例中，本发明可用于检测多个细胞表面目标同时忽略细胞内目标。总的来说，目标的选择将由从该方法期望的信息确定。

[0182] 样品的标记并不完全依赖于sbp。在一些实例中，经典染料可用于突出显示组织上的期望特征。在许多情况下，用于显微术的染料含有在天然细胞状态中是罕见的元素。因此，在对组织染色的过程中，它变得富含有由本文所述的装置和方法可读的特定元素。

[0183] 因此，在一些实施例中，上面所述的分析的方法包括用至少一个标记原子来标记样品的步骤。然后可以使用上述方法来检测该原子。

[0184] 常规

[0185] 术语“包括(comprising)”包括“包括(including)”以及“组成”，例如“包括”X的组成物可以完全由X组成，或者可以包括另外的东西，例如X+Y。

[0186] 关于数值x的术语“大约”是可选的，并且意味着例如x+10％。

[0187] 词“实质上”不排除“完全”，例如“实质上没有”Y的组成物可以完全没有Y。在必要的场合，词“实质上”可以从本发明的定义中省略。

[0188] 尽管为了清楚和理解的目的稍微详细地描述了前述发明，但是相关领域中的技术人员将认识到，一旦他们熟悉了本公开，就可以做出在形式和细节上的各种改变而不偏离在所附权利要求中的本发明的真实范围。因此，本发明不限于上面阐述的方法或结构的确切部件或细节。除了在过程本身中必要的或固有的程度上之外，并不预期或暗示在本公开(包括附图)中描述的方法或过程的步骤或阶段的特定顺序。在许多情况下，过程步骤的顺序可以改变而不改变所述方法的目的、效果或意义。这里引用的所有出版物和专利文件都通过引用被并入本文，就好像每个这样的出版物或文件都被特别和单独地指示为通过引用被并入本文一样。出版物和专利文件(专利、所公开的专利申请和未公开的专利申请)的引用并不意欲承认任何此类文件都是相关的现有技术，它也不构成关于这些文件的内容或日期的任何承认。

标题	发布/更新时间	阅读量
激光烧蚀微区分析中的一种聚焦装置	2020-05-13	120
激光烧蚀用的扫描方法	2020-05-11	954
第二表面激光烧蚀	2020-05-11	527
一种利用激光液相烧蚀系统进行激光液相烧蚀试验的方法	2020-05-12	408
激光烧蚀单元	2020-05-11	1110
激光烧蚀系统	2020-05-11	413
激光烧蚀抗蚀剂	2020-05-11	595
用于烧蚀激光标记的标签结构	2020-05-12	828
激光烧蚀装置和方法	2020-05-11	458
激光皮肤烧蚀器和皮肤烧蚀	2020-05-11	568

激光烧蚀系统

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