冻干制剂
阅读：95发布：2020-05-11
专利汇可以提供冻干制剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及生产多肽组合物的方法，该方法包括：将多肽与挥发性添加剂混合以形成液体混合物和将该液体混合物冻干以获得冻干的多肽组合物。，下面是冻干制剂专利的具体信息内容。
1.制备多肽组合物的方法，其包括：将多肽与挥发性添加剂混合以形成液体混合物，并将该液体混合物冻干以获得冻干的多肽组合物，其中所述液体混合物包含约2%体积的挥发性添加剂，且所述挥发性添加剂为叔丁醇。
2.权利要求1的方法，其中所述多肽为抗原结合多肽。
3.权利要求1的方法，其中所述多肽包括至少两种遗传融合至人血清白蛋白的N-端的GLP-1多肽。
4.权利要求1的方法，其中所述抗原结合多肽选自可溶的受体、抗体、抗体片段、免疫球蛋白单一可变域、Fab、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、闭合构象的多特异性抗体、二硫键连接的scFv和双特异抗体。
5.由权利要求1的方法制备的干燥多肽组合物。
6.权利要求5的多肽组合物，其包括至少两种遗传融合至人血清白蛋白的N-端的GLP-1多肽。
7.制备液体多肽组合物的方法，其包括：获得由权利要求1的方法制备的冻干的多肽，和用足量可药用分散剂重构所述冻干的多肽以生成液体多肽组合物。
8.权利要求7的方法，其中所述多肽为抗原结合多肽。
9.权利要求7的方法，其中所述多肽包括至少两种遗传融合至人血清白蛋白的N-端的GLP-1多肽。
10.权利要求8的方法，其中所述抗原结合多肽选自可溶的受体、抗体、抗体片段、免疫球蛋白单一可变域、Fab、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、闭合构象的多特异性抗体、二硫键连接的scFv和双特异抗体。
11.由权利要求7的方法制备的液体多肽组合物。
12.减少冻干的多肽组合物的重构时间的方法，其包括：
a)将包含所述多肽的液体混合物冻干，其中所述液体混合物包含约2%体积的挥发性添加剂，其中所述挥发性添加剂为叔丁醇，和
b)用对于该冻干的多肽组合物而言足量的可药用分散剂重构该冻干的多肽以生成液体多肽组合物，
其中在挥发性添加剂存在下冻干的多肽重构的时间少于在无挥发性添加剂存在下冻干的相同多肽重构的时间。
13.权利要求12的方法，其中所述多肽为抗原结合多肽。
14.权利要求12的方法，其中所述多肽包括至少两种遗传融合至人血清白蛋白的N-端的GLP-1多肽。
15.权利要求12的方法，其中所述抗原结合多肽选自可溶的受体、抗体、抗体片段、免疫球蛋白单一可变域、Fab、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、闭合构象的多特异性抗体、二硫键连接的scFv和双特异抗体。
16.组合物，其包含：治疗性多肽、缓冲剂、表面活性剂、至少一种赋形剂，和至少一种挥发性添加剂。
17.权利要求16的组合物，其中所述治疗性多肽包括GLP-1或其片段和/或变体。
18.权利要求16的组合物，其中所述治疗性多肽包括至少两种遗传融合至人血清白蛋白的N-端的GLP-1(7-36(A8G))多肽。
19.权利要求16至18任一项的组合物，其中所述治疗性多肽包括SEQ ID NO:1。
20.权利要求16或19的组合物，其中所述缓冲剂为磷酸钠。
21.权利要求16至20任一项的组合物，其中所述表面活性剂为聚山梨酯80。
22.权利要求16至21任一项的组合物，其中所述至少一种赋形剂选自：海藻糖、麦芽糖、蔗糖、甘露糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、甘油和右旋糖。
23.权利要求16至22任一项的组合物，其中所述赋形剂包括海藻糖和甘露醇。
24.权利要求16至23任一项的组合物，其中所述挥发性添加剂为含氧烃。
25.权利要求24的组合物，其中所述含氧烃选自：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、2-丁醇、叔丁醇、戊醇、异戊醇、2-戊醇、3-戊醇、叔戊醇、甲基乙基酮、苯甲醇、乙酸、甲基乙基酮或其组合。
26.权利要求16至25任一项的组合物，其中所述挥发性添加剂选自叔丁醇、乙醇、乙腈、乙酸铵和NH4HCO3或其组合。
27.组合物，其包含：包括SEQ ID NO:1的多肽、磷酸钠、海藻糖、甘露醇、聚山梨酯80和叔丁醇。
28.权利要求16至25任一项的组合物，其中所述挥发性添加剂为叔丁醇且所述叔丁醇存在的量为约2%体积。
冻干制剂
发明领域
[0001] 本发明涉及用于减少冻干的生物分子的重构时间(reconstitution time)的制剂和使用方法。
[0002] 发明背景
[0003] 冻干法是从溶液中除去溶剂以形成固体或粉末的方法，这些固体或粉末在升高的温度比液体稳定和更易于储存。冻干，也被称为冷冻干燥，包括冷冻及后续的升华。生成的冻干的物质可以不冷藏储存，从而减少该物质的储存和运输成本及产品所需的储存空间。其也可减少产品的重量，这同样地减少运输和相关的成本。冻干法尤其用于保存和储存各种生物分子，因为其增加了它们的保存期限。
[0004] 由于化学基团的数目和维持天然折叠对稳定性的依赖性，生物分子比小分子更难通过配制加以稳定。因此，很多商业生物分子为冻干的。通常，冻干法通过以下两方面改善了稳定性：(i)除去水(因为大多数生物化学降解为水解)和(ii)降低了系统整体的流动性(因为侧链和分子的动态运动是化学和物理降解事件发生所必需的)。
[0005] 冻干的生物分子在使用前重构，通常就在其冻干和储存的容器中进行。对于医生和患者而言短的重构时间是优选的。如果冻干的生物分子的重构时间太长，将增加制备时间从而使得难以同时向很多患者给药。此外，很多生物分子设计成患者自助给药。更短的重构时间确保患者在给药前完全地重构了该生物分子，从而改善安全性和有效性。
[0006] 之前减少重构时间的努力主要集中在重构缓冲液的制剂上。与之相反，本发明涉及向用于冻干生物分子的缓冲液的制剂中加入挥发性添加剂。因此，对减少冻干的生物分子重构时间的方法和组合物存在需要。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明涉及生产多肽组合物的方法，其包括将多肽与挥发性添加剂组合以形成液体混合物和将该液体混合物冻干以获得冻干的多肽组合物。
[0009] 本发明还涉及减少冻干的多肽组合物的重构时间的方法，其包括：a)将含有多肽的液体混合物冻干，其中该液体混合物包含挥发性添加剂；和b)用对冻干的多肽组合物而言足量的可药用分散剂重构该冻干的多肽以生成液体多肽组合物，其中在挥发性添加剂存在下冻干的多肽重构的时间少于在无挥发性添加剂下冻干的相同多肽重构的时间。
[0010] 本发明还涉及生产液体多肽组合物的方法，其包括：获得通过本发明的方法生产的冻干的多肽，和用足量可药用分散剂重构该冻干的多肽以生成液体多肽组合物。
[0011] 本发明还涉及适于冻干多肽的制剂。
[0012] 本发明还涉及通过本发明的方法生产的干燥多肽组合物。
[0013] 本发明还涉及通过本发明的方法生产的液体多肽组合物。
[0015] 图1.使用振摇法的亲液物(lyophile)重构时间图。
[0016] 图2.使用静置法的亲液物重构时间图。
[0017] 图3.亲液物重构时间与样品编号的关联图。(A)箱线图总结了所有测试的平均重构时间与样品编号的关联。接近零点的箱线边界表示第25百分位数，箱中的线表示中位数，且远离零点的箱线边界表示第75百分位数。箱线上方和下方的须线(误差条线)表示第90百分位数和第10百分位数。低于第10百分位数或高于第90百分位数的极端值以符号标示。(B)所有亲液物重构时间以与样品编号关联来绘制。
[0018] 图4.亲液物重构时间与样品编号的关联图，按分析者和重构方法区分。
[0019] 图5.阿必鲁泰(Albiglutide)的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。
[0020] 图6.比较添加或未添加2%叔丁醇条件下冻干的样品的重构终点的直方图。条表示所有测试的平均数而须线表示所有测试的一个标准偏差，作为与样品类型关联。
[0021] 图7.比较添加或未添加2%叔丁醇条件下冻干的样品的重构终点的直方图。条表示所有测试的平均数而须线表示所有测试的一个标准偏差，作为与样品类型关联。
[0022] 图8.抗-NOGO mAb重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)和抗-NOGO mAb轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
[0023] 图9.抗-TNFR1dAb的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。
[0024] 图10.IL18的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。
[0025] 图11.抗-IL5重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)和抗-IL5轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)。
[0026] 图12.抗-CD20VH域的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)和抗-CD20VL域的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)。
[0027] 发明详述
[0028] 本发明提供了(尤其是)冻干制剂。本发明还提供了(尤其是)冻干制剂的制备方法和使用方法。发明人发现当向多肽的冻干制剂中加入挥发性添加剂时，该冻干的多肽的重构时间减少。本发明还涉及通过本发明的方法生产的干燥多肽组合物。
[0029] 本发明提供了可用于生产多肽组合物的许多方法、试剂和化合物，其包括将多肽和挥发性添加剂组合以形成液体混合物和将该液体组合物冻干以获得冻干的多肽组合物。
[0030] 本文提供了用于由液体溶液冻干多肽的方法和包含由这样冻干的液体溶液获得的冻干的多肽的产品。在一些实施方案中，该挥发性添加剂溶解在含有多肽的水性溶液中并冻干以生成含有冻干的多肽的固体组合物。在一些实施方案中，这些含有冻干的多肽的固体组合物稳定并适于储存，例如适于长时间储存。这种储存可在环境条件下、可在受控的温度下、可在受控的湿度下，或其它条件或条件的组合下；且可储存在密封的容器(例如，带有可移除盖子的瓶或罐、管、囊、囊片、小瓶、注射器、双筒注射器或其它容器)中，且可在惰性气体(例如，氮气、氩气、氦气或其它惰性气体)下的密封容器中，或在其中含或不含其它元素或化合物的其它容器中。
[0031] 应当理解，本发明不限于具体的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，其当然可以变化。还应当理解，本文所用的术语仅为描述具体的实施方案，而不是为了限制。如本说明书及所附权利要求书中使用的，除非内容明确另有所指，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括所指事物的复数形式。因此，例如，提及“多肽”包括两种或多种多肽的组合等。
[0032] 当涉及可测量值如量、持续时间等时，本文所用的“约”是指涵盖从特定数值的±20%或±10%的变体(包括±5%、±1%和±0.1%)，这样的变体适于施行所公开的方法。
[0033] 除非另有所指，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。尽管任何与本文所述的方法和材料相似或相当的方法和材料可用于本发明测试的实践中，但优选的材料和方法如本文所述。在描述和请求本发明中，将用到以下术语。
[0034] 本文所鉴定的所有“氨基酸”残基为天然的L-构型。与标准多肽命名一致，氨基酸残基的缩写如下表所示。
[0035]1个字母 3个字母 氨基酸
Y Tyr L-酪氨酸
G Gly L-甘氨酸
F Phe L-苯丙氨酸
M Met L-甲硫氨酸
A Ala L-丙氨酸
S Ser L-丝氨酸
I Ile L-异亮氨酸
L Leu 亮氨酸
T Thr L-苏氨酸
V Val L-缬氨酸
P Pro L-脯氨酸
K Lys L-赖氨酸
H His L-组氨酸
Q Gin L-谷氨酰胺
E Glu L-谷氨酸
W Trp L-色氨酸
R Arg L-精氨酸
D Asp L-天冬氨酸
N Asn L-天冬酰胺
C Cys L-半胱氨酸
Y Tyr L-酪氨酸
G Gly L-甘氨酸
F Phe L-苯丙氨酸
M Met L-甲硫氨酸
A Ala L-丙氨酸
S Ser L-丝氨酸
I Ile L-异亮氨酸
L Leu 亮氨酸
T Thr L-苏氨酸
V Val L-缬氨酸
P Pro L-脯氨酸
K Lys L-赖氨酸
H His L-组氨酸
Q Gin L-谷氨酰胺
E Glu L-谷氨酸
W Trp L-色氨酸
R Arg L-精氨酸
D Asp L-天冬氨酸
N Asn L-天冬酰胺
C Cys L-半胱氨酸
[0036] 应当注意所有的氨基酸残基序列在本文通过从左至右的方向为从氨基端至羧基端的常规方向的式子表示。
[0037] 在一些实施方案中，挥发性添加剂为有机溶剂。在一项实施方案中，该有机溶剂包括低级含氧烃(oxyhydrocarbon)、低级卤代烃、低级卤代含氧烃、低级硫代含氧烃(sulfoxyhydrocarbon)、低级环烃或其组合。在一项实施方案中，该低级含氧烃为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、2-丁醇、叔丁醇、戊醇、异戊醇、2-戊醇、3-戊醇、叔戊醇、甲基乙基酮、苯甲醇、乙酸、甲基乙基酮或其组合。
[0040] “低级”指的是本文所述的化学化合物涉及具有1至8个碳原子的那些化合物。
[0041] “低级链烷醇”是指饱和的C1-C8烷基，其可为支链或直链的，具有1至4个羟基。示例性的具有1个羟基的低级链烷醇包括但不限于，甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、2-丁醇、叔丁醇、戊醇、异戊醇、2-戊醇、3-戊醇、叔戊醇等。
[0042] 示例性的“低级酮”包括但不限于，丙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、甲基异丙基酮、甲基丁基酮、甲基异丁基酮、甲基2-丁基酮、甲基叔丁基酮、二乙基酮、乙基丙基酮、乙基异丙基酮、乙基丁基酮、乙基异丁基酮、乙基叔丁基酮等。
[0043] 示例性的“低级羧酸”包括但不限于，甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸等。
[0044] 示例性的“低级羧酸酯”包括但不限于，乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯、乙酸2-丁酯、乙酸叔丁酯等。
[0045] 示例性的“低级碳酸酯”包括但不限于，碳酸二甲酯、碳酸甲基乙基酯、碳酸甲基丙基酯、碳酸甲基异丙基酯、碳酸甲基丁基酯、碳酸甲基异丁基酯、碳酸甲基2-丁基酯、碳酸甲基叔丁基酯、碳酸二乙酯、碳酸乙基丙基酯、碳酸乙基异丙基酯、碳酸乙基丁基酯、碳酸乙基异丁基酯、碳酸乙基叔丁基酯等。
[0046] 本文涉及的“低级卤代烃”是指拥有烃基和卤原子、具有1至8个碳原子和1至4个卤原子的化合物。优选地，该卤原子为氯、氟和溴。最优选地，该卤原子为氯原子。示例性低级卤代烃包括但不限于，氯甲烷、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳等。
[0047] “低级卤代含氧烃”是指本文所定义的含氧烃进一步被1至4个卤原子取代。示例性卤代含氧烃包括但不限于，六氟丙酮。
[0048] “低级硫代含氧烃”是指本文所定义的含氧烃还含有硫原子。示例性的低级硫代含氧烃包括但不限于，二甲基亚砜(DMSO)和二甲基砜。
[0049] “低级环烃”是指环化的烃基，例如，3-至8-元烃环。示例性环烃包括但不限于，环己烷。
[0050] 本文替换使用的“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指氨基酸残基的聚合物。多肽可以是天然(组织衍生的)起源的、重组的或由原核或真核细胞制品天然表达的，或者是经由合成方法化学生产的。该术语适用于氨基酸聚合物（其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物），也适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般的化学结构不同的结构，但作用的方式与天然存在的氨基酸类似的化学化合物。科学和专利文献充分地描述了非天然残基。一些示例性的用作天然氨基酸残基模拟物的非天然组合物和指导如下所述。芳香族氨基酸的模拟物可通过由以下替代而生成：例如D-或L-萘基丙氨酸(naphylalanine)；D-或L-苯基甘氨酸；D-或L-2噻吩基丙氨酸(thieneylalanine)；D-或L-1,-2,3-,或4-芘基丙氨酸(pyreneylalanine)；D-或L-3噻吩基丙氨酸(thieneylalanine)；D-或L-(2-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(3-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(2-吡嗪基)-丙氨酸；D-或L-(4-异丙基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯丙氨酸；D-对-氟-苯丙氨酸；D-或L-对-联苯基苯丙氨酸；K-或L-对-甲氧基-联苯基苯丙氨酸；D-或L-2-吲哚(烷基)丙氨酸；和D-或L-烷基丙氨酸，其中烷基可以为取代或未取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、sec-isotyl、异戊基，或非酸性氨基酸。非天然氨基酸的芳香族环包括，例如噻唑基、噻吩基(thiophenyl)、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基，和吡啶基芳香族环。
[0051] 本文所用的“肽”包括作为本文具体举例说明的那些肽的保守变体的肽。本文所用的“保守变体”表示使用另一生物学上相似的残基替代氨基酸残基。保守变体的实例包括但不限于，一个疏水性残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个疏水残基，或一个极性残基取代另一个极性残基，如精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、或谷氨酰胺取代天冬酰胺等。可互相取代的中性亲水性氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸。“保守变体”还包括使用取代的氨基酸代替未取代的母体氨基酸，条件是取代的多肽的抗体也与未取代的多肽起免疫反应。这样的保守取代在本发明的肽的种类的定义之内。本文所用的“阳离子的”是指在pH7.4时具有净正电荷的任何肽。肽的生物活性可通过本领域技术人员已知的和本文所述的标准方法测定。
[0052] 当关于蛋白质使用“重组”时，表示该蛋白质已通过引入异源核酸或蛋白质或者改变天然核酸或蛋白质进行修饰。
[0053] 所用的“重构时间”及其类似术语是指冻干的分子被溶解和/或混悬在液体形式中所需的时间。例如，重构时间包括但不限于在冻干后，干燥的多肽颗粒变为混悬在水中或缓冲液中所需的时间。因此，“减少”重构时间和其类似术语是指在第一种配方和/或条件下干燥的多肽混悬在液体中比在第二种配方和/或条件下干燥的相同的多肽混悬在相同的液体中需要更少的时间。
[0054] 本发明还涉及用于减少冻干的多肽组合物的重构时间的方法，其包括：a)将含有多肽的液体混合物冻干，其中该液体混合物包含挥发性添加剂；和b)用对于冻干的多肽组合物而言足量的可药用分散剂将冻干的多肽重构以生成液体多肽组合物，其中在挥发性添加剂存在下冻干的多肽重构的时间少于在无挥发性添加剂存在下冻干的相同多肽重构的时间。
[0055] 本发明还涉及用于生产液体多肽组合物的方法，其包括：获得通过本发明的方法生产的冻干的多肽，和用足量可药用分散剂重构该冻干的多肽以生成液体多肽组合物。本发明还涉及通过本发明的方法生产的液体多肽组合物。
[0056] 在一些示例性实施方案中，一旦与足量的可药用分散剂接触，该冻干的多肽容易地重构。例如，在一些实施方案中，将冻干的多肽与分散剂混合，例如，摇荡约5秒，然后静置约5至约30分钟，以生成液体多肽组合物。该分散剂优选为无菌水或“注射用水”(WFI)。该液体多肽可进一步用等渗盐水或其它赋形剂稀释以在给药前产生所需的浓度。根据本发明，“赋形剂”包括但不限于，稳定剂，例如，人血清白蛋白(hsa)、牛血清白蛋白(bsa)、α-酪蛋白、球蛋白、α-乳白蛋白、LDH、溶菌酶、肌红蛋白、卵白蛋白、RNase A；缓冲剂，例如，柠檬酸、HEPES、组氨酸、乙酸钾、柠檬酸钾、磷酸二氢钾(KH2PO4)、乙酸钠、碳酸氢钠、柠檬酸钠、磷酸钠(NaH2PO4)、Tris碱和Tris-HCl；氨基酸/代谢产物，例如甘氨酸、丙氨酸(α-丙氨酸、β-丙氨酸)、精氨酸、甜菜碱、亮氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸、脯氨酸、4-羟基脯氨酸、肌氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、冠瘿氨基酸(opines)(丙氨亚氨基酸(alanopine)、章鱼碱、N-羟甲基-L-丙氨酸(strombine))，和三甲基胺N-氧化物(TMAO)；
表面活性剂，例如聚山梨酯20和聚山梨酯80，以及泊洛沙姆407；脂肪酸，例如磷脂酰胆碱、乙醇胺和乙酰基色氨酸酯(acethyltryptophanate)；聚合物，例如聚乙二醇(PEG)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)10、24、40；低分子量赋形剂，例如阿拉伯糖、纤维二糖、乙二醇、果糖、岩藻糖、半乳糖、甘油/丙三醇、葡萄糖、肌醇(innositol)、乳糖、甘露醇、麦芽糖、麦芽三糖、甘露糖、蜜二糖、2-甲基-2,4-戊二醇、辛酮糖、丙二醇、棉子糖、核糖、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖、木糖醇和木糖；和高分子量赋形剂，例如纤维素、β-环糊精、右旋糖酐(10kd)、右旋糖酐(40kd)、右旋糖酐(70kd)、聚蔗糖、明胶、羟丙基甲基纤维素、羟乙基淀粉、麦芽糊精、甲基纤维素、PEG(6kd)、聚葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)k15(10kd)、PVP(40kd)、PVP k30(40kd)、PVP k90(1000kd)、葡聚糖凝胶G200和淀粉；抗氧化剂，例如，抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫代甘油、巯基乙酸、硫代山梨糖醇、和谷胱甘肽；还原剂，例如盐酸半胱氨酸、二硫苏糖醇和其它硫醇或噻吩(thiophene)；螯合剂，例如EDTA、EGTA、谷氨酸和天冬氨酸；无机
2+ 2+ 2+ 2+
盐/金属，例如Ca 、Ni 、Mg 、Mn 、Na2SO4、(NH4)2SO4、Na2HPO4/NaH2PO4、K2HPO4/KH2PO4、MgSO4和NaF；有机盐，例如乙酸钠、聚乙烯钠、辛酸钠(Na caprylate或Na octanoate)、丙酸盐(proprionate)、乳酸盐、琥珀酸盐和柠檬酸盐；有机溶剂，例如乙腈、二甲基亚砜(DMSO)和乙醇。
表面活性剂，例如聚山梨酯20和聚山梨酯80，以及泊洛沙姆407；脂肪酸，例如磷脂酰胆碱、乙醇胺和乙酰基色氨酸酯(acethyltryptophanate)；聚合物，例如聚乙二醇(PEG)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)10、24、40；低分子量赋形剂，例如阿拉伯糖、纤维二糖、乙二醇、果糖、岩藻糖、半乳糖、甘油/丙三醇、葡萄糖、肌醇(innositol)、乳糖、甘露醇、麦芽糖、麦芽三糖、甘露糖、蜜二糖、2-甲基-2,4-戊二醇、辛酮糖、丙二醇、棉子糖、核糖、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖、木糖醇和木糖；和高分子量赋形剂，例如纤维素、β-环糊精、右旋糖酐(10kd)、右旋糖酐(40kd)、右旋糖酐(70kd)、聚蔗糖、明胶、羟丙基甲基纤维素、羟乙基淀粉、麦芽糊精、甲基纤维素、PEG(6kd)、聚葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)k15(10kd)、PVP(40kd)、PVP k30(40kd)、PVP k90(1000kd)、葡聚糖凝胶G200和淀粉；抗氧化剂，例如，抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫代甘油、巯基乙酸、硫代山梨糖醇、和谷胱甘肽；还原剂，例如盐酸半胱氨酸、二硫苏糖醇和其它硫醇或噻吩(thiophene)；螯合剂，例如EDTA、EGTA、谷氨酸和天冬氨酸；无机
2+ 2+ 2+ 2+
盐/金属，例如Ca 、Ni 、Mg 、Mn 、Na2SO4、(NH4)2SO4、Na2HPO4/NaH2PO4、K2HPO4/KH2PO4、MgSO4和NaF；有机盐，例如乙酸钠、聚乙烯钠、辛酸钠(Na caprylate或Na octanoate)、丙酸盐(proprionate)、乳酸盐、琥珀酸盐和柠檬酸盐；有机溶剂，例如乙腈、二甲基亚砜(DMSO)和乙醇。
[0058] 术语“表面张力”是指表面下的分子对表面/空气界面的分子施加的吸引力，是由于液体的高分子浓度相对气体的低分子浓度而引起。具有低表面张力值的液体，如非极性液体，比水更容易流动。通常，表面张力值以牛/米或达因/厘米表示。
[0059] 本文涉及的“动态表面张力”是指表面/空气界面和对表面/表面界面的动态界面张力。有多种可选的方法测量动态表面张力，例如，捕泡表面张力计(captive bubble surface tensionometry)或搏动气泡表面张力计(pulsating bubble surface tensionometry)。
[0060] 术语“粘度”指的是流体在规定温度表现的对流动的内部阻力；是切应力与剪切速率之比。如果1达因/平方厘米的力导致两个面积为1平方厘米且相距1厘米的平行液体表面以1cm/s的速度相对运动，则液体具有1泊的粘度。1泊=100厘泊。
[0061] 当涉及表观粘度，应当理解粘度值取决于进行测量的条件，如所采用的温度、剪切速率和切应力。表观粘度定义为切应力与应用的剪切速率之比。有多种可选的方法测量表观粘度。例如，粘度可通过合适的锥和板、平行板或其它类型的粘度计或流变仪测试。
[0062] 本发明还涉及适于冻干多肽的制剂。在一些实施方案中，液体混合物包含从约0.1%体积至约10%体积的挥发性添加剂、从约0.25%体积至约5%体积的挥发性添加剂、或约2%体积的挥发性添加剂。在一项实施方案中，该制剂包含约10mM磷酸钠，pH7.2，约
117mM海藻糖、约153mM甘露醇、和约0.01%(重量/体积)聚山梨酯80。在另一项实施方案中，该制剂包含26mM组氨酸、150mM海藻糖、0.02%聚山梨酯80(PS80)，pH6.0。在一些实施方案中，该多肽包含阿必鲁泰(SEQ ID NO:1)。在其它实施方案中，该多肽包括IL18(SEQ ID NO:6)。在一项实施方案中，本发明涉及液体制剂，其包含约2%叔丁醇。在一项实施方案中，该液体制剂包含约2%叔丁醇，约10mM磷酸钠，pH7.2，约117mM海藻糖、约153mM甘露醇和约0.01%(重量/体积)聚山梨酯80。在另一项实施方案中，该制剂包含约2%叔丁醇、约26mM组氨酸，pH6.0，约150mM海藻糖和约0.02%聚山梨酯80(PS80)。
117mM海藻糖、约153mM甘露醇、和约0.01%(重量/体积)聚山梨酯80。在另一项实施方案中，该制剂包含26mM组氨酸、150mM海藻糖、0.02%聚山梨酯80(PS80)，pH6.0。在一些实施方案中，该多肽包含阿必鲁泰(SEQ ID NO:1)。在其它实施方案中，该多肽包括IL18(SEQ ID NO:6)。在一项实施方案中，本发明涉及液体制剂，其包含约2%叔丁醇。在一项实施方案中，该液体制剂包含约2%叔丁醇，约10mM磷酸钠，pH7.2，约117mM海藻糖、约153mM甘露醇和约0.01%(重量/体积)聚山梨酯80。在另一项实施方案中，该制剂包含约2%叔丁醇、约26mM组氨酸，pH6.0，约150mM海藻糖和约0.02%聚山梨酯80(PS80)。
[0063] 本文所用的“治疗性蛋白质”指的是(例如)研究者或临床医生所寻找的、可向哺乳动物给药以引出组织、系统、动物或人类的生物学或医学应答的任何蛋白质和/或多肽。治疗性蛋白质可引出多于一种生物学或医学应答。而术语“治疗有效量”是指与未接受该量的相应的受试者相比，导致(但不限于)疾病、病症或副作用痊愈、预防或减轻，或者疾病或病症进展速率降低的任何量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量以及在患者中有效地引起增强或有助于第二种药物的治疗作用的生理功能的量。
[0064] 一方面，本发明涉及组合物，其包含：治疗性多肽、缓冲剂、表面活性剂、至少一种赋形剂和至少一种挥发性添加剂。在一项实施方案中，该治疗性多肽包括GLP-1或其片段和/或其变体。在一项实施方案中，该治疗性多肽包括至少两种遗传融合至人血清白蛋白的N-端的GLP-1(7-36(A8G))多肽。在一项实施方案中，该治疗性多肽包括SEQ ID NO:1。在一项实施方案中，该治疗性蛋白质包括GLP-1激动剂。在一项实施方案中，该治疗性蛋白质包括人血清白蛋白。
[0065] 一方面，本发明涉及本发明权利要求的任一种组合物在制备包含SEQ ID NO:1的药物中的用途。
[0066] 在一项实施方案中，该缓冲剂为磷酸钠。在一项实施方案中，该缓冲剂为组氨酸。在一项实施方案中，该表面活性剂为聚山梨酯80。在一项实施方案中，该至少一种赋形剂选自：海藻糖、麦芽糖、蔗糖、甘露糖、乳糖、甘露醇、山梨糖醇、甘油和右旋糖。在一项实施方案中，该赋形剂包括海藻糖和甘露醇。
[0067] 本文所用的“GLP-1激动剂”是指能够刺激胰岛素产生和/或具有至少一种GLP-1活性的任何化合物或组合物，包括但不限于，肠促胰岛素激素和/或其片段、其变体和/或其缀合物和肠促胰岛素模拟物和/或其片段、其变体和/或其缀合物。
[0068] 本文所用的“肠促胰岛素激素”是指增强胰岛素分泌或者升高胰岛素水平的任何激素。肠促胰岛素激素的一个实例为GLP-1。GLP-1是响应食物进食由肠L细胞分泌的肠促胰岛素。在健康的个体中，GLP-1在调节进食后血糖水平中起着重要作用，其通过刺激胰腺分泌葡萄糖依赖型胰岛素引起外周葡萄糖吸收增加。GLP-1还抑制胰高血糖素的分泌，导致肝葡萄糖排出量减少。此外，GLP-1推迟了胃排空时间且减慢了小肠运动性从而延缓了食物吸收。GLP-1通过刺激涉及葡萄糖依赖型胰岛素分泌的基因的转录和通过促进β-细胞再生而促进持续的β-细胞功能(competence)(Meier,et al.Biodrugs2003;17(2):93-102)。
[0069] 本文所用的“GLP-1活性”是指一种或多种天然存在的人GLP-1的活性，包括但不限于，降低血液和/或血浆葡糖糖、刺激葡萄糖依赖型胰岛素分泌或者升高胰岛素水平、抑制胰高血糖素分泌、降低果糖胺、增加对大脑的葡萄糖递送和代谢、推迟胃排空并促进β-细胞功能和/或新生。任何这些活性或其它与GLP活性相关的活性可直接或间接由具有GLP-1活性的组合物或GLP-1激动剂引起。举例而言，具有GLP-1活性的组合物可直接或间接刺激葡萄糖依赖型胰岛素的产生，而胰岛素产生的刺激可间接降低哺乳动物中血浆葡萄糖水平。
[0070] 本文所用的“肠促胰岛素模拟物”是能够增强胰岛素分泌或者升高胰岛素水平的化合物。肠促胰岛素模拟物也许能够在哺乳动物中刺激胰岛素分泌、增加β细胞新生、抑制β细胞凋亡、抑制胰高血糖素分泌、推迟胃排空和诱发饱腹感。肠促胰岛素模拟物可包括但不限于，任何具有GLP-1活性的多肽，包括但不限于，艾塞那肽3和艾塞那肽4，包括其任何片段和/或变体和/或缀合物。
[0071] 本文所用的“缀合物”或“缀合”或其类似术语指的是两个分子彼此连接。例如第一多肽可共价或非共价连接至第二多肽。第一多肽可通过化学连接基共价连接或可遗传融合至第二多肽，其中该第一和第二多肽共有一个共同的多肽主链。
[0072] 当用于提及多肽时，本文所用的“片段”是具有与所述整个天然存在的多肽的氨基酸序列的部分相同但不是全部的氨基酸序列的多肽。片段可以是独立式的(free-standing)或者包含在更大的多肽中，在单个更大的多肽中它们作为单一连续的区域形成一部分或区域。举例而言，天然存在的GLP-1的片段包括天然存在的氨基酸1至36的氨基酸7至36。而且，多肽的片段还可以是该天然存在的部分序列的变体。例如，包括天然存在的GLP-1的氨基酸7-30的GLP-1的片段还可以是在其部分序列中具有氨基酸置换的变体。
[0073] 本文所用的术语“变体”，是分别不同于参照多核苷酸或多肽，但保留了基本特性的多核苷酸或多肽。多核苷酸的典型的变体与另一种参照多核苷酸的不同在于核苷酸序列。变体的核苷酸序列的变化可能改变或可能不改变由参照多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸变化可在由参照序列编码的多肽中导致如下文所讨论的氨基酸置换、插入、删除、融合和平截。多肽的典型的变体与另一种参照多肽的不同在于氨基酸序列。通常，不同是有限的以至于参照多肽和变体的序列总体上非常相似且在很多区域相同。变体和参照多肽在氨基酸序列的不同可为一个或多个置换、插入、删除的任意组合。置换的或插入的氨基酸残基可能是或可能不是由遗传密码编码的。多核苷酸或多肽的变体可以是天然存在的，如等位变体，或可以是天然不存在的变体。多核苷酸和多肽的非天然存在的变体可以是通过诱变技术或通过直接合成制造的。变体还可包括但不限于具有一个或多个其氨基酸侧基的化学修饰的多肽或其片段。化学修饰包括但不限于，添加化学部分、创造新键和除去化学部分。氨基酸侧基的修饰包括但不限于，赖氨酸-ε-氨基的酰化，精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N-烷基化，谷氨酸或天冬氨酸羧酸基的烷基化，和谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰胺化。末端氨基的修饰包括但不限于，脱氨基、N-低级烷基、N-二-低级烷基和N-酰基修饰。末端羧基的修饰包括但不限于，酰胺、低级烷基酰胺、二烷基酰胺和低级烷基酯修饰。此外，一个或多个侧基或端基，可被一般水平的蛋白质化学家已知的保护基保护。
[0074] 在本发明的一项实施方案中，该多肽为GLP-1多肽。“GLP-1多肽”包括但不限于GLP-1或其片段、其变体和/或其缀合物。本发明的GLP-1片段和/或变体和/或缀合物通常具有至少一种GLP-1活性。GLP-1或其片段、其变体和/或其缀合物可包含人血清白蛋白。人血清白蛋白可与GLP-1或其片段和/或其变体缀合。人血清白蛋白可在注射前与肠促胰岛素激素(如GLP-1)和/或肠促胰岛素模拟物(如艾塞那肽3和艾塞那肽4)和/或其
片段和/或其变体通过化学连接基缀合，或可在体内化学连接至天然存在的人血清白蛋白(见例如，美国专利6,593,295和美国专利6,329,336，本文整体引入作为参考)。或者，人血清白蛋白可遗传融合至GLP-1和/或其片段和/或其变体或其它GLP-1激动剂如艾塞那肽
3和艾塞那肽4和/或其片段和/或其变体。以下PCT申请提供了GLP-1和其片段和/或其变体与人血清白蛋白遗传融合的实例：WO2003/060071、WO2003/59934、WO2005/003296、WO2005/077042(本文整体引入作为参考)。
片段和/或其变体通过化学连接基缀合，或可在体内化学连接至天然存在的人血清白蛋白(见例如，美国专利6,593,295和美国专利6,329,336，本文整体引入作为参考)。或者，人血清白蛋白可遗传融合至GLP-1和/或其片段和/或其变体或其它GLP-1激动剂如艾塞那肽
3和艾塞那肽4和/或其片段和/或其变体。以下PCT申请提供了GLP-1和其片段和/或其变体与人血清白蛋白遗传融合的实例：WO2003/060071、WO2003/59934、WO2005/003296、WO2005/077042(本文整体引入作为参考)。
[0075] 具有GLP-1活性的多肽可包含至少一个人GLP-1的片段和/或变体。人GLP-1的两种天然存在的片段如SEQ ID NO:2中所表示。
[0076]
[0077] 其中：37位 的Xaa为Gly(下 文称 为“GLP-1(7-37)”)或-NH2(下文 称 为“GLP-1(7-36)”)。GLP-1片段可包括但不限于包括人GLP-1的氨基酸7至36(GLP-1(7-36))的GLP-1分子或者由人GLP-1的氨基酸7至36(GLP-1(7-36))组成的GLP-1分子。GLP-1或其片段的变体可包括但不限于，在野生型GLP-1或在如SEQ ID NO.:2所示的GLP-1的天然存在的片段中的一个、两个、三个、四个、五个或更多氨基酸置换。GLP-1的变体或GLP-1的片段可包括但不限于丙氨酸残基类似物置换为野生型GLP-1的丙氨酸8，该丙氨酸突变成甘氨酸(下文称为“A8G”)(见例如，美国专利5,545,618公开的突变体，本文整体引入作为参考)。
[0078] 在一些方面，至少一个GLP-1的片段和变体包括GLP-1(7-36(A8G))并遗传融合至人血清白蛋白。在另一实施方案中，本发明的多肽包括一个、两个、三个、四个、五个，或更多串联取向的GLP-1分子和/或其片段和/或其变体，该GLP-1分子和/或其片段和/或其变体融合至人血清白蛋白或其变体的N端或C端。其它实施方案具有这样的融合至白蛋白或其变体的N或C端的A8G多肽。两个融合至人血清白蛋白的N端的串联取向的GLP-1(7-36)(A8G)片段和/或变体的实例包括如图3所示的SEQ ID NO:1。在另一方面，至少一个GLP-1的片段和变体包括至少两个串联且遗传融合至人血清白蛋白的GLP-1(7-36(A8G))。在一方面，至少两个GLP-1(7-36(A8G))在人血清白蛋白的N-端遗传融合。至少一个具有GLP-1活性的多肽可包括SEQ ID No.:1。
[0079] GLP-1(7-37)的 变 体 可 表 示 为 例 如Glu22-GLP-1(7-37)OH，其 被 称 为GLP-1变体，其中在GLP-1(7-37)OH的22位上通常存在的甘氨酸被谷氨酸所代替；8 22
Val-Glu -GLP-1(7-37)OH被指定为一种GLP-1化合物，其中在GLP-1(7-37)OH的8位通常存在的丙氨酸和22位通常存在的甘氨酸分别被缬氨酸和谷氨酸代替。GLP-1的变体的实例包括但不限于以下：
Val-Glu -GLP-1(7-37)OH被指定为一种GLP-1化合物，其中在GLP-1(7-37)OH的8位通常存在的丙氨酸和22位通常存在的甘氨酸分别被缬氨酸和谷氨酸代替。GLP-1的变体的实例包括但不限于以下：
[0080]
[0081]
[0082] GLP-1的变体还可包括但不限于，具有一个或多个氨基酸侧基经化学修饰的GLP-1或GLP-1片段。化学修饰包括但不限于，添加化学部分、创造新键和除去化学部分。氨基酸侧基的修饰包括但不限于，赖氨酸-ε-氨基的酰化，精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N-烷基化，谷氨酸或天冬氨酸羧酸基的烷基化，和谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰胺化。末端氨基的修饰包括但不限于，脱氨基、N-低级烷基、N-二-低级烷基和N-酰基修饰。末端羧基的修饰包括但不限于，酰胺、低级烷基酰胺、二烷基酰胺和低级烷基酯修饰。此外，一个或多个侧基或端基，可被一般水平的蛋白质化学家已知的保护基保护。
[0083] GLP-1片段或变体还可包括其中一个或多个氨基酸被添加至片段或变体的GLP-1(7-37)OH的N-端和/或C-端的多肽。在氨基酸被添加至N-端或C-端的GLP-1中，氨基酸以与GLP-1(7-37)OH中相应的氨基酸相同的编号表示。例如，通过添加两个氨基酸至GLP-1(7-37)OH的N-端获得的GLP-1化合物的N-端氨基酸在5位；而通过添加一个氨基酸至GLP-1(7-37)OH的C-端获得的GLP-1化合物的C-端氨基酸在38位。因此，在这两种GLP-1化合物中，如同在GLP-1(7-37)OH中，12位由苯丙氨酸占据而22位由甘氨酸占据。具有氨基酸添加至N-端的GLP-1的氨基酸1-6可与GLP-1(7-37)OH的相应位置的氨基酸相同或者是GLP-1(7-37)OH的相应位置的氨基酸的保守置换。具有氨基酸添加至C-端的GLP-1的氨基酸38-45可与胰高血糖素或艾塞那肽-4的相应位置的氨基酸相同或者是胰高血糖素或艾塞那肽-4的相应位置的氨基酸的保守置换。
[0084] 阿必鲁泰是GLP-1的新型类似物，其通过遗传融合作为二聚体的肽的DDP-IV抵抗形式至人白蛋白而合成，其提供了长效的GLP-1活性，半衰期为约5至7天。阿比鲁泰的主要氨基酸序列为SEQ ID NO.:1。
[0085] 在本发明的另一方面中，向人给药包含至少一种具有GLP-1活性的多肽的组合物从一天一次至每月一次，且可以一天一次、每两天一次、每三天一次、每七天一次、每十四天一次、每四周一次和/或每月一次给药。在另一方面中，向人给药第一剂量和第二剂量的包含至少一种具有GLP-1活性的多肽的组合物。该第一剂量和第二剂量可以相同或不同。每一剂量的至少一种具有GLP-1活性的多肽可包含约0.25μg至约1000mg的该至少一种具有GLP-1活性的多肽。剂量可包括但不限于，0.25μg、0.25mg、1mg、3mg、6mg、16mg、24mg、48mg、60mg、80mg、104mg、20mg、400mg、800mg，最多达约1000mg的该最少一种具有GLP-1活性的多肽。
[0086] 在一项实施方案中，本发明的组合物包含约15mg、30mg、50mg或100mg的SEQ ID NO:1。
[0087] 在另一项实施方案中，该多肽为抗原结合多肽。在一项实施方案中，该抗原结合多肽选自可溶性受体、抗体、抗体片段、免疫球蛋白单一可变域、Fab、F(ab’)2、Fv、二硫键(disulphide)连接的Fv、scFv、闭合构象的多特异性抗体、二硫键连接的scFv或双特异抗体。
[0088] 本文所用的术语“抗原结合多肽”指的是能够结合至抗原的抗体、抗体片段和其它蛋白质构造。
[0089] 在一项实施方案中，该抗原结合多肽为抗-NOGO mAb。在一项实施方案中，该抗原结合多肽包括SEQ ID NO:3的重链和SEQ ID NO:4的轻链。
[0090] 在一项实施方案中，该抗原结合多肽为抗-IL5mAb。在一项实施方案中，该抗原结合多肽包括SEQ ID NO:7的重链和SEQ ID NO:8的轻链。
[0091] 在一项实施方案中，该抗原结合多肽为抗-CD20mAb。在一项实施方案中，该抗原结合多肽包括SEQ ID NO:9的重链可变区和SEQ ID NO:10的轻链可变区。在一项实施方案中，该抗原结合多肽为免疫球蛋白单一可变域。在一项实施方案中，该免疫球蛋白单一可变域为抗-TNFR1dAb。在一项实施方案中，该免疫球蛋白单一可变域包括SEQ ID NO:5。
[0092] 术语Fv、Fc、Fd、Fab，或F(ab)2使用其标准含义(参见，例如Harlow等人,Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,(1988))。
[0093] “嵌合抗体”指的是一种基因工程抗体，其含有来自供体抗体的天然存在的可变区(轻链和重链)以及来自受体抗体的轻链和重链恒定区。
[0094] “人源化抗体”指的是一种基因工程抗体，其CDR源自非人供体免疫球蛋白，而该分子的剩余的源自免疫球蛋白的部分来自一种(或多种)人免疫球蛋白。此外，可改变框架支持残基(framework support residues)以保持结合亲和力(见例如Queen 等 人 ,Proc.Natl.Acad Sci USA,86:10029-10032(1989),Hodgson 等 人 ,Bio/Technology,9:421(1991))。合适的人受体抗体可以通过与供体抗体的核苷酸和氨基酸序列的同源而选自常规数据库，例如KABAT.RTM.数据库、Los Alamos数据库和Swiss Protein数据库。特征在于与供体抗体的框架区的同源(在氨基酸基础上)的人抗体可能适于为供体CDR的插入提供重链恒定区和/或重链可变框架区。能够提供轻链恒定或可变框架区的合适的受体抗体可以类似的方式选择。应当注意，受体抗体的重链和轻链不要求源自同一受体抗体。现有技术描述了生产这样的人源化抗体的若干种方法—见例如EP-A-0239400和EP-A-054951。
[0095] 术语“供体抗体”指的是一种抗体(单克隆和/或重组的)，其将其可变区、CDR或其它功能片段或其类似物的氨基酸序列贡献给第一免疫球蛋白配偶体，从而提供改变的免疫球蛋白编码区并生成表达的改变的抗体，该抗体具有抗原特异性和该供体抗体的中和活性特征。
[0096] 术语“受体抗体”指的是与该供体抗体异源的抗体(单克隆和/或重组的)，其将编码其重链和/或轻链框架区和/或其重链和/或轻链恒定区的全部(或任何部分，但在一些实施方案中全部)氨基酸序列贡献给第一免疫球蛋白配偶体。在一些实施方案中，人抗体为受体抗体。
[0097] “CDR”定义为抗体的互补决定区的氨基酸序列，其为免疫球蛋白重链和轻链的高变区。参见，例如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,4th Ed.,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)。在免疫球蛋白的可变部分有三个重链和三个轻链CDR(或CDR区)。因此，本文所用的“CDR”指的是所有三个重链CDR或所有三个轻链CDR(或如果适宜，所有的重链和所有的轻链CDR二者)。抗体的结构和蛋白质折叠可能意味着其它残基被认为是抗原结合区的部分，且这可被技术人员理解。参见，例如Chothia等人,(1989)Conformations of immunoglobulin hypervariable regions;Nature342,p877-883。
[0098] 本文所用的术语“域”指的是一种折叠的蛋白质结构，其具有独立于该蛋白质其它部分的三级结构。通常，域是蛋白质离散功能特性形成的原因，且在很多情况中，域可以被添加、除去或转移至其它蛋白质而不会失去该蛋白质剩余部分和/或域的功能。“抗体单一可变域”是折叠的多肽域，其包含抗体可变域的序列特征。因此，它包括完全的抗体可变域和修饰的可变域，例如，其中一个或多个环被以下所代替：不是抗体可变域特征的序列，或已被平截的抗体可变域或者包含N-端或C-端延伸的抗体可变域，以及保留至少全长域的结合活性和特异性的可变域的折叠的片段。
[0099] 短语“免疫球蛋白单一可变域”指的是不依赖不同的V区或域而特异结合抗原或表位的抗体可变域(VH,VHH,V)。免疫球蛋白单一可变域可与其它不同的可变区或可变域以一种形式(例如同型多体或异型多体)存在，其中其它区或域不是该单一免疫球蛋白可变域抗原结合所必需的(例如，其中该免疫球蛋白单一可变域结合抗原不依赖于另外的可变域)。本文所用的术语“域抗体”或“dAb”与能够结合至抗原的“免疫球蛋白单一可变域”是相同的。免疫球蛋白单一可变域可以是人抗体可变域，但也包括来自其它物种如啮齿动物(例如，WO00/29004所公开的)、铰口鲨和骆驼科的VHH dAb(纳米体)的单一抗体可变域。骆驼科VHH是来自包括普通骆驼、美洲驼、羊驼、单峰骆驼和原驼物种的免疫球蛋白单一可变域多肽，其产生天然缺乏轻链的重链抗体。这样的VHH域可根据本领域可用的标准技术人源化，而且根据本发明这样的域仍被认为是“域抗体”。本文所用的"VH包括骆驼科VHH域。NARV是另一种类型的免疫球蛋白单一可变域，其在包括铰口鲨的软骨鱼中被鉴定。这些域也被称为新型抗原受体可变区(通常简写成V(NAR)或NARV)。更多详情参见Mol.Immunol.44,656-665(2006)和US20050043519A。
[0100] 术语“表位结合域”指的是不依赖于不同的V区或域特异地结合抗原或表位的域，这可以是域抗体(dAb)，例如人、骆驼科或鲨鱼免疫球蛋白单一可变域。
[0101] 如本文所用，术语“抗原结合位点”指的是能够特异地结合至抗原的蛋白质上的位点，这可以是单一域，例如表位结合域，或者它可以是可在标准抗体上找到的成对的VH/VL域。在本发明的一些方面中，单链Fv(ScFv)域可提供抗原结合位点。
[0102] 本文所用的术语“mAbdAb”和“dAbmAb”指的是本发明的抗原结合蛋白。这两个术语可替换使用，并具有本文所用的相同含义。实施例
[0103] 可通过以下非限制性实施例进一步理解本发明。
[0104] 实施例1—在叔丁醇、乙醇、乙腈、乙酸铵或NH4HCO3存在下阿必鲁泰的冻干[0105] 根据表1所述的分析制备基质制备用于冻干的阿必鲁泰样品。通过以下制备亲液物：在含有适宜浓度的叔丁醇、乙醇和乙腈(1、5和10%重量/体积)，适宜浓度的乙酸铵和NH4HCO3(100mM和250mM)的小瓶(2mL13mm)中将含有50mg阿必鲁泰于10mM磷酸钠(pH7.2)中的溶液、117mM海藻糖、153mM甘露醇、0.01%(重量/体积)聚山梨酯80的0.750mL溶液冻干。
[0106] 表1.阿必鲁泰的条件与样品编号的关联
[0107]
[0108] 样品使用LyoStar冷冻干燥机在以下循环条件下冻干：
[0109]
[0110] 实施例2—冻干的阿必鲁泰的重构
[0111] 使用0.675ml注射用水(WFI)经1ml注射器和25G(5/8”)针头(结核菌素注射器，Becton-Dickinson#309626)穿过冻干的瓶瓶塞重构亲液物。将0.675ml体积校正干燥组分的体积后，最终体积为0.75ml。重构使用“振摇法”或“静置法”进行。对于振摇法，将样品摇荡10秒，然后静止15秒。对于静置法，将样品前后振荡5秒，然后静置。当在瓶中无粒子可见时，认为样品已经重构。两种重构方法的结果如表1、图1和2所示。
[0112] 实施例3—在叔丁醇存在下阿必鲁泰的冻干
[0113] 根据表1所述的分析制备基质制备用于冻干的阿必鲁泰样品。通过以下制备亲液物：在含有适宜浓度的叔丁醇(34至202mM或0.25至2%重量/体积)的小瓶(2mL13mm)中将含有50mg阿必鲁泰于10mM磷酸钠(pH7.2)中的溶液、117mM海藻糖、153mM甘露醇、0.01%(重量/体积)聚山梨酯80的0.750mL溶液冻干。
[0114] 表2.阿必鲁泰条件与样品编号的关联
[0115]样品# 6种条件： 瓶数/条件100mg/mL BDS的体积(mL)
1 阿必鲁泰对照 52 45.0(0.75mL/瓶)
2 2%叔丁醇 42 37.5(0.76mL/瓶)
3 1.5%叔丁醇 42 37.5(0.76mL/瓶)
4 1%叔丁醇 52 45.0(0.76mL/瓶)
5 0.5%叔丁醇 42 37.5(0.75mL/瓶)
6 0.25%叔丁醇 42 37.5(0.75mL/瓶)
1 阿必鲁泰对照 52 45.0(0.75mL/瓶)
2 2%叔丁醇 42 37.5(0.76mL/瓶)
3 1.5%叔丁醇 42 37.5(0.76mL/瓶)
4 1%叔丁醇 52 45.0(0.76mL/瓶)
5 0.5%叔丁醇 42 37.5(0.75mL/瓶)
6 0.25%叔丁醇 42 37.5(0.75mL/瓶)
[0116] 使用Lyostar冷冻干燥机在以下循环条件下冻干样品：
[0117]
[0118] 实施例4—冻干的阿必鲁泰的重构
[0119] 使用0.675ml注射用水(WFI)经1ml注射器和25G(5/8”)针头(结核菌素注射器，Becton-Dickinson#309626)穿过冻干的瓶瓶塞重构亲液物。0.675ml体积校正干燥组分的体积后，最终体积为0.75ml。重构使用“静置法”进行(加水后立即轻轻混合，然后让小瓶静置)。基于分析者(三个不同的进行重构步骤的人)和移液法(pipetting method)，加水的进行有四种变化：
[0120] 分析者1：经注射器穿过瓶塞重构。
[0121] 分析者2：经注射器穿过瓶塞重构。
[0122] 分析者3：经注射器穿过瓶塞重构。
[0123] 分析者1：经传统的P1000Rainin移液法重构。
[0124] 个体的重构时间如表4所总结和如图3所表示。冻干前加入叔丁醇对所得的重构时间终点值有明显影响。对照样品仅在制剂缓冲液存在下(没有挥发性添加剂)冻干且所得时间平均为t=17.87(±2.94)分钟(n=26)；高值和低值分别为t=12.25分钟和t=26.53分钟。0.25%叔丁醇样品事实上等于对照样品，其重构终点平均时间为t=19.35(±4.08)分钟(n=20)；高值和低值分别为t=12.42分钟和t=28.9分钟。
[0125] 在叔丁醇浓度为0.5%或以上，重构速率明显加速，且终点值随叔丁醇浓度的增加而降低。在0.5%叔丁醇条件下，所有结果的平均重构时间终点约为对照组的65%，且t=11.84(±2.94)分钟(n=19)；高值和低值分别为t=0.58分钟和t=17.93分钟。注意，在0.5%组一个样品得到的结果>37分钟。在该情况中，亲液物粘附在溶剂弯液面以上的小瓶侧壁上，不能进入溶液，因此将该数据点从平均值计算中排除。
[0126] 比较1%叔丁醇、1.5%叔丁醇和2%叔丁醇组，在重构时间上显著加速，终点为：1%叔丁醇t=7.71(±2.44)分钟(n=30)、1.5%叔丁醇t=7.16(±2.65)分钟(n=20)，和2%叔丁醇t=4.74(±1.75)分钟(n=20)。高和低重构终点值为：1%叔丁醇t=1.37分钟和t=11.67分钟、1.5%叔丁醇t=3.90分钟和t=15.50分钟，和2%叔丁醇t=2.75分钟和t=9.25分钟。这些范围值暗示，目前推荐的制剂缓冲液中的阿必鲁泰的重构时间(30分钟)是在制剂缓冲液中存在2%叔丁醇冻干时阿必鲁泰的重构时间(约10分钟)的3倍。总而言之，2%叔丁醇样品的重构速度是1%叔丁醇样品的约1.5倍，且是对照样品组的～3.75倍。
[0127] 表4.阿必鲁泰亲液物的平均重构时间终点，根据样品类型分组。
[0128]
[0129] 亲液物重构时间的结果也按分析者区分，且比较涉及将注射用水穿过瓶塞注射的方法(注射器)对比打开瓶且经由Rainin移液管分配的传统方法，如表4中所总结和图4中所图解。重构时间终点在各样品组的分布表示变异性的主要来源，其中个体分析者和/或重构方法对各样品类型的平均值或标准差有最小的影响。除了0.5%叔丁醇(样品5)和0.25%叔丁醇(样品6)，其与其它样品相比，表现出平均重构时间和标准差有更宽的变异性。
[0130] 实施例5—冻干的mAbs、dAbs和IL18的重构
[0131] 抗-NOGO mAb(SEQ ID NOS:3和4)、抗-TNFR1dAb(SEQ ID NO:5)、IL18(SEQ ID NO:6)、抗-IL5(SEQ ID NO:7和8)以及抗-CD20(可变域SEQ ID NO:9和10)在制剂中浓缩成以下所示的浓度，且然后在2mL小瓶中冻干，其中该制剂包括26mM组氨酸,150mM海藻糖、0.02%聚山梨酯80(PS80),pH6.0,体积为约0.75mL。
[0132] 79.3mg抗-IL5mAb
[0133] 77.9mg抗-NOGO mAb
[0134] 78.2mg抗-CD20mAb
[0135] 29.1mg抗-TNFR1dAb
[0136] 19.0mg IL-18
[0137] 使用0.675ml注射用水(WFI)经1ml注射器和25G(5/8”)针头(结核菌素注射器，Becton-Dickinson#309626)穿过冻干的瓶瓶塞重构亲液物。0.675ml体积校正干燥组分的体积后，最终体积为0.75ml。重构使用“静置法”进行(加水后立即轻轻混合，然后让小瓶静置)。加水由三个不同的分析者(三个不同的进行重构步骤的人)经注射器穿过瓶塞进行。
[0138] 个体的重构时间如表5中所总结、如图6和7所图解。
[0139] 在所有测试的5种蛋白质中，在冻干过程中添加了2%叔丁醇的那些蛋白质的重构时间快于对照组。这不仅对于所测试的mAbs是明显的，对于所测试的小分子也可观察到；抗-TNFR1dAb和IL-18看来在叔丁醇存在下也具有更快的重构时间。
[0140] 表5.
[0141] 注：记录时间分钟M(秒/60)
[0142]
[0143] 本领域技术人员仅使用常规实验方法将认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的多种等价方案。这样的等价方案既定包含在随后的权利要求中。本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的全部内容在此引入作为参考。
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