脑蛋白水解物及其冻干制剂的生产方法
专利汇可以提供脑蛋白水解物及其冻干制剂的生产方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 是一种脑蛋白 水 解 物及其 冻干制剂 的制备方法，该方法包括取经检验合格的新鲜或冻存健康猪脑，用胶体磨匀浆，收集匀 浆液 ；分别用胃蛋白酶、胰酶水解，收集水解上清液，采用 滤纸 进行过滤，收集滤出液；滤出液上羟基 磷灰石 层析柱进行 吸附 分离纯化，调配肽图，收集目标物，采用对分子截留为8KD的滤膜进行 超滤 ，收集滤出液，进行定氮、 氨 基酸分析，按国家药品监督管理局2000年12月28日颁布的药品标准(编号WS1-XG-25-2000)计算氨基酸用量，添加相应氨基酸配制成浓配液，0.22μm滤膜进行精过滤，即得注射用脑蛋白水解物的原液。还可进一步按冻干制剂 处方 制备成脑蛋白水解物冻干制剂。该方法环保且收率高，成本低。，下面是脑蛋白水解物及其冻干制剂的生产方法专利的具体信息内容。
1、一种脑蛋白水解物的生产方法，该方法包括如下步骤：
(1)取经检验合格的新鲜或冻存健康猪脑，用胶体磨匀浆，收集 匀浆液；
(2)将匀浆液分别用胃蛋白酶、胰酶水解，收集水解上清液，进 行过滤，收集滤出液；
(3)将滤出液用羟基磷灰石层析柱进行吸附分离纯化：羟基磷灰 石层析柱采用淤浆式法装柱，装柱压力为0.5Mpa，装柱后先用 400mmol/L pH6.8磷酸盐缓冲液清洗，再用20mmol/L pH6.8磷酸盐 缓冲液平衡，将上述滤出液上羟基磷灰石层析柱进行吸附，用 20mmol/L pH6.8磷酸盐缓冲液洗脱；
(4)收集目标物，采用对分子截留为8KD的滤膜进行超滤，收集 滤出液，进行肽图、氨基酸分析检验；
(5)按国家药品监督管理局2000年12月28日颁布的编号为 WS1-XG-25-2000药品标准计算氨基酸用量，添加相应氨基酸配制成浓 配液，0.22μm滤膜进行精过滤，即得注射用脑蛋白水解物的原液。
2、一种脑蛋白水解物冻干制剂的生产方法，该方法为：
(1)取经检验合格的新鲜或冻存健康猪脑，用胶体磨匀浆，收集 匀浆液；
(2)将匀浆液分别用胃蛋白酶、胰酶水解，收集水解上清液，进 行过滤，收集滤出液；
(3)将滤出液用羟基磷灰石层析柱进行吸附分离纯化：羟基磷灰 石层析柱采用淤浆式法装柱，装柱压力为0.5Mpa，装柱后先用 400mmol/L pH6.8磷酸盐缓冲液清洗，再用20mmol/L pH6.8磷酸盐 缓冲液平衡，将上述滤出液上羟基磷灰石层析柱进行吸附，用 20mmol/L pH6.8磷酸盐缓冲液洗脱；
(4)收集目标物，采用对分子截留为8KD的滤膜进行超滤，收集 滤出液，进行肽图、氨基酸分析检验；
(5)按国家药品监督管理局2000年12月28日颁布的编号为 WS1-XG-25-2000药品标准计算氨基酸用量，添加相应氨基酸配制成浓 配液，0.22μm滤膜进行精过滤，得注射用脑蛋白水解物的原液；
(6)将注射用脑蛋白水解物原液与赋形剂及溶剂混均，用活性 碳脱色经粗滤和精滤，分装入西林瓶中；
(7)经过冻干处理，得冻干制剂。
3、如权利要求2所述的脑蛋白水解物冻干制剂的生产方法，其特 征在于：所述的赋形剂为甘露醇，溶剂为注射用水，以总氮30g的注 射用脑蛋白水解物原液加240g甘露醇，再加注射用水至4000ml。
4、如权利要求2或3所述的脑蛋白水解物冻干制剂的生产方法， 其特征在于：所述的冻干处理过程为先降温至-38℃，维持3h，然后 抽真空，达到14Pa后，开始升温至5℃，维持10h；再维持真空度14Pa， 升温至15℃，维持15h；进一步维持真空度14Pa，升温至25℃，维 持3h；压塞，恢复大气压，出箱。
技术领域
本发明涉及一种脑蛋白水解物的生产方法，同时还涉及了一种脑 蛋白水解物冻干制剂的生产方法，属于制药领域。
背景技术
脑蛋白水解物在国内又称脑活素，早于20世纪90年代初，国内 学者便对其工艺、质量、药理药效及临床应用进行了研究，发表了大 量的文章。
中国发明专利文献CN01130523.1公开了一种“脑蛋白水解物注 射液生产工艺”，其内容是：新鲜猪脑去除表面的粘膜及血渍等，加 2倍体积的水匀浆，用双层纱布过滤，滤液先用胃蛋白酶水解，用盐 酸调pH到1.5～1.6，水浴温度40～45℃，时间为6～8小时，再用 氢氧化钠调pH到7.6～7.7，加胰酶(胰酶先溶解于0.02N的氯化钙 溶液中于4℃下活化30分钟)水解，40～45℃水浴水解4～6小时， 得到水解液，加盐酸调pH值2.5～3.0，-20～10℃下静置10～30小 时；在室温条件下，用双层纱布过滤，再加入1/2体积的水，加氢氧 化钠调pH值到中性，用孔径为0.5～1.0um的微孔滤膜过滤澄清，取 澄清液，依次用截流分子量为7万和1万的超滤膜超滤，得到的超滤 液再用截流分子量为1000的超滤膜进行浓缩，得到的浓缩液加热到 100℃沸腾15分钟，然后迅速冷却到25℃以下，再依次经过0.5～1um 孔径的微孔滤膜和截流分子量为7万和1万的超滤膜，得到的超滤液 再经121℃蒸汽灭菌30分钟得到的除菌溶液称为脑蛋折水解的混合 多肽、氨基酸溶液精制品；根据所需药液量，按国家药品监督管理局 2000年12月28日颁布的药品标准(编号WS1-XG-25-2000)计算需 要添加的氨基酸用量，与上述溶液配制成浓配液，然后稀配装针成成 品药液，经121℃蒸汽灭菌30分钟成无菌制剂。其缺点是：(1)料 液多次经过0.5～1um孔径的微孔滤膜和截流分子量为7万和1万的 超滤膜，得到的超滤液，使操作比较烦琐，生产周期长，生产过程中 容易受微生物污染。(2)使用超滤膜进行超滤浓缩回收率低：该工艺 采用截流分子量为1000的超滤膜进行浓缩，因脑蛋白水解物的有效 活性成分为小分子多肽，在超滤浓缩过程中会有不同程度的透过丢 失，收率大大降低。
2000年，余李碧等在《氨基酸和生物资源》发表了“脑蛋白粉 的制备及其酶解方法的研究”，其内容为：取鲜猪脑去膜、去血块洗 净，按1∶5(w/v)加入生理盐水匀浆，再按1∶10(w/v)加入冰冻 丙酮搅拌提取2小时，静置分层后纱布过滤，共提取4次。滤块用乙 醚按1∶10(w/v)提取2次，过滤，滤块干燥，脑粉按1∶20(w/v) 加蒸馏水溶解，煮沸30min，于47±0.5℃平衡，用NaOH调pH8.0， 加胰酶水解30h，用HCl调pH6.0，煮沸40min，稍冷，过滤，滤液 煮沸、冷却、4℃存放过夜。布氏漏斗抽滤，收集滤液，浴温58～ 69℃减压浓缩至原体积的1/3，煮沸、冷却、4℃存放24h。抽滤得滤 液，补加无热源水至原体积、6％白陶土和0.6％活性炭，调pH4.4～ 4.6，煮沸1h，趁热抽滤得滤液。调pH7.0，煮沸，冷却、4℃存放 24h以上。后用G6无菌过滤，收集滤出液，立即超滤，收集截留分子 量1万以下液体，无菌分装、热原试验、质检。其缺点是：(1)生产 周期长，设备投资大，生产效率低；在pH8.0、47±0.5℃条件下胰 酶水解30h，生产周期长，容易受微生物污染，难于保证药品质量； 只用胰酶水解，水解并不完全，而且固液难于分离，生产过程中损耗 大；使用减压浓缩步骤，生产效率低，不利于对药品质量的控制。(2)、 使用大量的有机化学溶剂，丙酮和乙醚的沸点极低，是易燃、易爆、 有毒的危险化学品，乙醚还被用作麻醉剂，使用大量的丙酮和乙醚先 将脑蛋白沉淀出来制成脑蛋白粉，此步骤非常危险，必须在防爆车间 内生产，操作烦琐，污染环境，危害生产操作人员的身体健康。
发明内容
本发明采用如下技术方案：一种脑蛋白水解物的生产方法，该方 法包括如下步骤：
(1)取经检验合格的新鲜或冻存健康猪脑，用胶体磨匀浆，收集 匀浆液；
(2)将匀浆液分别用胃蛋白酶、胰酶水解，收集水解上清液，进 行过滤，收集滤出液；
(3)将滤出液用羟基磷灰石层析柱进行吸附分离纯化：羟基磷灰 石层析柱采用淤浆式法装柱，装柱压力为0.5Mpa，装柱后先用 400mmol/L pH6.8磷酸盐缓冲液清洗，再用20mmol/L pH6.8磷酸盐 缓冲液平衡，将上述滤出液上羟基磷灰石层析柱进行吸附，用 20mmol/L pH6.8磷酸盐缓冲液洗脱；
(4)收集目标物，采用对分子截留为8KD的滤膜进行超滤，收集 滤出液，进行肽图、氨基酸分析检验；
(5)按国家药品监督管理局2000年12月28日颁布的编号为 WS1-XG-25-2000药品标准计算氨基酸用量，添加相应氨基酸配制成浓 配液，0.22μm滤膜进行精过滤，即得注射用脑蛋白水解物的原液。
本发明还提供了一种脑蛋白水解物冻干制剂的生产方法，该方法 为：
(1)取经检验合格的新鲜或冻存健康猪脑，用胶体磨匀浆，收集 匀浆液；
(2)将匀浆液分别用胃蛋白酶、胰酶水解，收集水解上清液，进 行过滤，收集滤出液；
(3)将滤出液用羟基磷灰石层析柱进行吸附分离纯化：羟基磷灰 石层析柱采用淤浆式法装柱，装柱压力为0.5Mpa，装柱后先用 400mmol/L pH6.8磷酸盐缓冲液清洗，再用20mmol/L pH6.8磷酸盐 缓冲液平衡，将上述滤出液上羟基磷灰石层析柱进行吸附，用 20mmol/L pH6.8磷酸盐缓冲液洗脱；
(4)收集目标物，采用对分子截留为8KD的滤膜进行超滤，收集 滤出液，进行肽图、氨基酸分析检验；
(5)按国家药品监督管理局2000年12月28日颁布的编号为 WS1-XG-25-2000药品标准计算氨基酸用量，添加相应氨基酸配制成浓 配液，0.22μm滤膜进行精过滤，得注射用脑蛋白水解物的原液；
(6)将注射用脑蛋白水解物原液与赋形剂及溶剂混均，用活性 碳脱色经粗滤和精滤，分装入西林瓶中；
(7)经过冻干处理，得冻干制剂。
本发明的这种脑蛋白水解物的生产方法，具有如下优点：
1、不使用丙酮、乙醚等化学危险品制备脑蛋白粉，新鲜或冻存 猪脑直接经双酶酶解等生产工艺提取脑蛋白水解物，具安全无污染、 少投入生产设备、减少生产环节等优点。
2、双酶水解脑组织匀浆液，采用抽取、残渣离心获得上清液， 经过滤、上羟基磷灰石层析柱吸附分离纯化，超滤等生产工艺，水解 完全，可除去杂蛋白和大分子杂质，使HPLC杂质峰面积小于5％，达 到现有工艺的分离效果。
3、采用双酶酶解，抽取、残渣离心获得上清液，经过滤、上羟 基磷灰石层析柱吸附分离纯化，超滤等生产工艺，优点是生产步骤、 周期大大缩短、收率提高、生产成本降低、生产环境要求降低、操作 简便，减少了药品受微生物污染、变质的机会。该工艺稳定可靠，符 合GMP要求。
附图说明
图1为注射用脑蛋白水解物冻干曲线。
图2为脑蛋白水解物注射液鉴别图谱。
图3为注射用脑蛋白水解物鉴别图谱。
具体实施方式
实施例1、注射用脑蛋白水解物(原液)的生产
取经检验合格的新鲜或冻存健康猪脑100.0kg，去除结缔组织及 碎骨等非脑组织物，用注射用水洗净，沥干，先用绞肉机绞成碎块， 用调节刻度至200目的胶体磨磨细，收集匀浆液，加入150.0kg(1.5 倍重)的注射用水搅匀。将浆液加温至42℃±2℃，用4.5％盐酸调 pH至1.5～1.7，按每kg浆液加入10g胃蛋白酶的比例(1％)，加入 2.5kg胃蛋白酶，维持pH1.5～1.7、42℃±2℃的条件水解8小时。 用5M NaOH将胃蛋白酶水解浆液调pH至7.1～7.3，按每kg浆液加 入10g胰酶的比例(1％)，加入2.5kg胰酶，搅匀后，维持在pH 7.5～ 7.7、42℃±2℃水解4小时，酶解结束后加热升温至100℃，保温15 分钟后，降温至30℃以下。用4.5％盐酸调pH2.8～3.0，静置过夜。 抽滤得上清液176.0kg，残渣用离心机离心，收集上清液的53.0kg， 合并上清液，共229.0kg，进行粗过滤，收集滤出液得227.0kg，用 5M NaOH调pH至6.8～7.0，备用。用注射用水将羟基磷灰石调成糊 状，采用淤浆式法装柱，装柱压力0.5Mpa。装柱后先用400mmol/L pH6.8磷酸盐缓冲液清洗，再用20mmol/L pH6.8磷酸盐缓冲液平衡， 将上述滤出液上羟基磷灰石层析柱进行吸附，用20mmol/L pH6.8磷 酸盐缓冲液洗脱。收集目标物得285.0kg，用对分子截留为8K的滤 膜进行超滤，收集滤出液得274.0kg，进行肽图、氨基酸检验。按国 家药品监督管理局2000年12月28日颁布的药品标准(编号 WS1-XG-25-2000)计算氨基酸用量，添加相应氨基酸配制成浓配液， 0.22μm滤膜进行精过滤，即得注射用脑蛋白水解物的原液292.0kg。 该原液可按冻干制剂处方制备成品。
在100Kg投料量情况下，得到的脑蛋白水解物原液总氮量为 5069.12g，高于现有技术2636.48g，表明收率约提高了约93％。
实施例2、注射用脑蛋白水解物冻干剂的生产方法
(1)原辅料的准备
在10000级洁净区内，将全检合格的脑蛋白水解物原液和甘露醇 按处方量加入配液罐中，加入注射用水至刻度，充分搅拌混匀，按液 体量0.2％加入活性碳，搅拌脱色20分钟，0.45um膜粗滤，再经0.22um 膜精滤，测其含量，送入100级分装间，待用。
处方为：脑蛋白水解物原液 约相当于总氮30.0g
甘露醇 240g
注射用水加至 4000.0ml
分装成1000瓶
处方中，脑蛋白水解物原液为主药，甘露醇为赋型剂，注射用水 为溶剂。
(2)包装材料的准备
①西林瓶的准备
7ml西林瓶经超声波清洗后，接着分别用去离子水、注射用水洗 涤，再用洁净压缩空气吹干，最后在0.5小时内通过温度达280-300 ℃的隧道烘箱灭菌和去除热原，待用。
②丁基胶塞的准备
丁基胶塞先分别用去离子水洗净，接着用注射用水反复漂洗，然 后在121℃条件下湿热灭菌20分钟，之后，真空抽尽水蒸气，冷凉， 待用。
③铝盖的准备
铝盖经纯化水清洗后，在120℃条件下干热150分钟，待用。
(3)分装，半压塞
分装调试机器正常后，将经洗净烘干灭菌冷凉的空瓶送入分装间， 根据含量确定分装体积，按注射剂分装规程进行分装，半压塞。
(4)冻干
将分装好样品的7ml西林瓶送入冻干箱中，按图1所示的注射用 脑蛋白水解物特定的冻干曲线进行冻干操作，冻干结束后，将胶塞完 全压入西林瓶中。
冻干过程为：1、分装后，降温至-38℃，维持3h；2、抽真空， 达到14Pa后，开始升温至5℃，维持10h；3、维持真空度14Pa，升 温至15℃，维持15h；4、维持真空度14Pa，升温至25℃，维持3h； 5、压塞，恢复大气压，出箱。6、冻干全过程约需34h。
(5)轧盖
将冻干完毕的半成品进行轧盖，同时取样全检。
(6)目检
轧盖的同时，进行目检，剔除外观不合格品。
(7)贴签
将目检合格的半成品按贴签操作规程粘贴瓶签。
(8)外包装
贴签结束，产品全检合格后，装小盒，中盒、大箱，然后入库。
(9)鉴别图谱
采用仪器型号为SPD-10Avp LC-10Atvp，检测器类型为紫外，检测 波长为280nm，柱型号为TSK-GEL G2000SWxl，柱温为30℃，进样量为 10ul，流量为0.5ml/min。标准品脑蛋白水解物注射液(施普善)的 鉴别图谱分析图谱见图1，分析结果见表1
表1标准品脑蛋白水解物注射液分析结果
注射用脑蛋白水解物冻干制剂的鉴别图谱如图2所示，分析结果见表2
表2注射用脑蛋白水解物冻干制剂分析结果
通过图1与图2对比及表1与表2对比可知，注射用脑蛋白水解物冻 干制剂与与标准样品的色谱图基本一致，符合标准。
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