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蛋白质运输的调节

阅读：615发布：2021-12-15

专利汇可以提供蛋白质运输的调节专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了治疗或改善一种或多种以蛋白质运输受损为特征的病症的化合物和组合物。还提供了以蛋白质运输受损为特征的病症的治疗方法，其包括给予受试者以式I的化合物或其药学可接受的盐或衍生物，或使细胞与式I的化合物或其药学可接受的盐或衍生物接触。，下面是蛋白质运输的调节专利的具体信息内容。

权利要求

1.治疗患有以蛋白质运输受损为特征的病症的受试者的方法，其包括给予受试者有效量的以如下结构式所表示的化合物或其药学可接受的盐：
其中：
m为1或2；
每个X独立地表示N、CH或C(C1-C4烷基)；
1 3
每个X 独立地表示N、NR、CH或C(C1-C4烷基)；
1 5 5 5 5 5 5 1
R 和Z各自独立地为R、C(O)R、COOR、C(O)NRR 或S(O)mR ；或NRZ整体为N＝
5 5
CH-NRR ；
2 3 5 5 5 5 5 5 5 6 5
R 和R 各自独立地为H、卤素、拟卤素、CN、SR、R、OR、OC(O)R、NRR、NRR、COOR、NO2、
5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
C(O)R、C(O)C(O)R、C(O)NRR、S(O)mR、S(O)mNRR、NRC(O)NRR、NRC(O)C(O)R、NRC(O)
5 5 5 5 8 5 5 5 5 5 5 8 5 5 5 5
R、NR(COOR)、NRC(O)R、NRS(O)mNRR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRC(O)C(O)NRR、NRC(O)
5 6 5 5 5 5 5 6 6 6 5
C(O)NRR、P(O)RR、P(O)(NRR)2、P(O)(NRR)2、P(O)(NRR)2、或P(O)(OR)2；
4 5 5 5 5 5 5 6 5 5
R 独立地为H、卤素、拟卤素、CN、SR、OR、OC(O)R、NRR、NRR、COOR、NO2、C(O)R、C(O)
5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
C(O)R、C(O)NRR、S(O)mR、S(O)mNRR、NRC(O)NRR、NRC(O)C(O)R、NRC(O)R、NR(COOR)、
5 8 5 5 5 5 5 5 8 5 5 5 5 5 6
NRC(O)R、NRS(O)mNRR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRC(O)C(O)NRR、或NRC(O)C(O)NRR ；或任选取代的烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基；且
5 6 8
各个R、R 和R 独立地为H或任选取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基，
其中所述疾病不是突触核蛋白病。
2.提高细胞内蛋白质运输的方法，其包括使细胞与有效量的以下结构式所表示的化合物或其药学可接受的盐接触：
其中：
m为1或2；
各个X独立地表示N、CH或C(C1-C4烷基)；
1 3
各个X 独立地表示N、NR、CH或C(C1-C4烷基)；
1 5 5 5 5 5 5 1
R 和Z各自独立地为R、C(O)R、COOR、C(O)NRR 或S(O)mR ；或NRZ整体为N＝
5 5
CH-NRR ；
2 3 5 5 5 5 5 5 5 6 5
R 和R 各自独立地为H、卤素、拟卤素、CN、SR、R、OR、OC(O)R、NRR、NRR、COOR、NO2、
5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
C(O)R、C(O)C(O)R、C(O)NRR、S(O)mR、S(O)mNRR、NRC(O)NRR、NRC(O)C(O)R、NRC(O)
5 5 5 5 8 5 5 5 5 5 5 8 5 5 5 5
R、NR(COOR)、NRC(O)R、NRS(O)mNRR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRC(O)C(O)NRR、NRC(O)
5 6 5 5 5 5 5 6 6 6 5
C(O)NRR、P(O)RR、P(O)(NRR)2、P(O)(NRR)2、P(O)(NRR)2、或P(O)(OR)2；
4 5 5 5 5 5 5 6 5 5
R 独立地为H、卤素、拟卤素、CN、SR、OR、OC(O)R、NRR、NRR、COOR、NO2、C(O)R、C(O)
5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
C(O)R、C(O)NRR、S(O)mR、S(O)mNRR、NRC(O)NRR、NRC(O)C(O)R、NRC(O)R、NR(COOR)、
5 8 5 5 5 5 5 5 8 5 5 5 5 5 6
NRC(O)R、NRS(O)mNRR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRC(O)C(O)NRR、或NRC(O)C(O)NRR ；或任选取代的烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基；且
5 6 8
各个R、R 和R 独立地为H或任选取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基，
其中所述细胞不以突触核蛋白运输受损为特征。
3.治疗患有以蛋白质运输受损为特征的病症的受试者的方法，其包括给予受试者有效量的以如下结构式所表示的化合物或其药学可接受的盐：
其中：
m为1或2；
各个X独立地为N或CH；
1 3
各个X 独立地为N、NR 或CH；
1 5 5 5 5 5 5
R 和Z各自独立地为R、C(O)R、COOR、C(O)NRR 或S(O)mR ；
2 3 5 5 5 5 5 5 5 6 5
R 和R 各自独立地为H、卤素、拟卤素、CN、SR、R、OR、OC(O)R、NRR、NRR、COOR、NO2、
5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
C(O)R、C(O)C(O)R、C(O)NRR、S(O)mR、S(O)mNRR、NRC(O)NRR、NRC(O)C(O)R、NRC(O)
5 5 5 5 8 5 5 5 5 5 5 8 5 5 5 5
R、NR(COOR)、NRC(O)R、NRS(O)mNRR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRC(O)C(O)NRR、NRC(O)
5 6 5 5 5 5 5 6 6 6 5
C(O)NRR、P(O)RR、P(O)(NRR)2、P(O)(NRR)2、P(O)(NRR)2、或P(O)(OR)2；
4 5 5 5 5 5 5 6 5 5
R 独立地为H、卤素、拟卤素、CN、SR、OR、OC(O)R、NRR、NRR、COOR、NO2、C(O)R、C(O)
5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
C(O)R、C(O)NRR、S(O)mR、S(O)mNRR、NRC(O)NRR、NRC(O)C(O)R、NRC(O)R、NR(COOR)、
5 8 5 5 5 5 5 5 8 5 5 5 5 5 6
NRC(O)R、NRS(O)mNRR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRC(O)C(O)NRR、或NRC(O)C(O)NRR ；或任选取代的烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基；且
5 6 8
各个R、R 和R 独立地为H或任选取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基，
其中所述疾病不是突触核蛋白病。
4.提高细胞内蛋白质运输的方法，其包括使细胞与有效量的以下结构式所表示的化合物或其药学可接受的盐接触：
其中：
m为1或2；
各个X独立地为N或CH；
1 3
各个X 独立地为N、NR 或CH；
1 5 5 5 5 5 5
R 和Z各自独立地为R、C(O)R、COOR、C(O)NRR 或S(O)mR ；
2 3 5 5 5 5 5 5 5 6 5
R 和R 各自独立地为H、卤素、拟卤素、CN、SR、R、OR、OC(O)R、NRR、NRR、COOR、NO2、
5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
C(O)R、C(O)C(O)R、C(O)NRR、S(O)mR、S(O)mNRR、NRC(O)NRR、NRC(O)C(O)R、NRC(O)
5 5 5 5 8 5 5 5 5 5 5 8 5 5 5 5
R、NR(COOR)、NRC(O)R、NRS(O)mNRR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRC(O)C(O)NRR、NRC(O)
5 6 5 5 5 5 5 6 6 6 5
C(O)NRR、P(O)RR、P(O)(NRR)2、P(O)(NRR)2、P(O)(NRR)2、或P(O)(OR)2；
4 5 5 5 5 5 5 6 5 5
R 独立地为H、卤素、拟卤素、CN、SR、OR、OC(O)R、NRR、NRR、COOR、NO2、C(O)R、C(O)
5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
C(O)R、C(O)NRR、S(O)mR、S(O)mNRR、NRC(O)NRR、NRC(O)C(O)R、NRC(O)R、NR(COOR)、
5 8 5 5 5 5 5 5 8 5 5 5 5 5 6
NRC(O)R、NRS(O)mNRR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRC(O)C(O)NRR、或NRC(O)C(O)NRR ；或任选取代的烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基；且
5 6 8
各个R、R 和R 独立地为H或任选取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基，
所述细胞不以受损的突触核蛋白运输为特征。
5.权利要求1～4中任一项所述的方法，其中所述化合物由以下结构式表示：
6.权利要求1～5中任一项所述的方法，其中所述化合物由以下结构式表示：
3
7.权利要求1～6中任一项所述的方法，其中R 选自取代或未取代的烷基、环烷基、芳基和芳烷基。
2
8.权利要求1～7中任一项所述的方法，其中R 是氢或卤素，或者任选取代的芳基、杂芳基、芳烷基或芳烯基。
1
9.权利要求1～8中任一项所述的方法，其中R 和Z各自独立地选自：氢，或者取代或未取代的烷基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、卤芳基羰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基和卤芳基磺酰基。
1
10.权利要求1～9中任一项所述的方法，其中R 是H，且Z是H。
1
11.权利要求1～9中任一项所述的方法，其中R 是甲基，且Z是H。
4
12.权利要求1～11中任一项所述的方法，其中R 是H、烷基、环烷基或烷基环烷基。
13.权利要求1～12中任一项所述的方法，其中所述化合物选自在图1A、1B、1C、1D、
1E、1F、2、3A、3B、4A、4B、5A、5B、6、7、8A、8B、8C、9A、9B、9C或9D中说明的化合物。
14.权利要求1～4中任一项所述的方法，其中所述化合物由以下结构式之一表示：
15.权利要求1～4中任一项所述的方法，其中所述化合物由以下结构式之一表示：
1
16.权利要求14或15所述的方法，其中R 是H。
17.权利要求14或15所述的方法，其中：
2
R 为H、卤素、CN、NO2、NH2或C1-C10烷基，所述C1-C10烷基任选被1～3个独立的下述基
5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
团取代：卤素、SR、OR、OC(O)R、NRR、COOR、NO2、CN、C(O)R、OC(O)NRR 或C(O)NRR。
2
18.权利要求17所述的方法，其中R 为H、F、Cl、Br、CF3、CCl3、CN、NO2、NH2或C1-C6烷基。
2
19.权利要求14或15所述的方法，其中R 是芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基，各个均为以下基团取代：
5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
H、卤素、SR、OR、OC(O)R、NRR、COOR、NO2、CN、C(O)R、OC(O)NRR、或C(O)NRR ；或芳基、C1-C10烷基、或C2-C10烯基，所述芳基、C1-C10烷基、或C2-C10烯基任选被1～3个
5 5 5 5 5 5 5 5 5
独立的下述基团取代：芳基、卤素、SR、OR、OC(O)R、NRR、COOR、NO2、CN、C(O)R、OC(O)NRR
5 5
或C(O)NRR。
2
20.权利要求19所述的方法，其中在R 中，任选取代的芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基选自：苯基、萘基、苄基、苯基亚乙基、萘基亚甲基、苯氧基亚甲基、萘氧基亚甲基、吡啶基亚甲基、苯并呋喃基亚甲基、二氢苯并呋喃基亚甲基、苯并二氧杂环戊烯基亚甲基、茚满基亚甲基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、苯并噻吩基和苯并呋喃基。
2
21.权利要求19所述的方法，其中对于R 中芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基的任选取代基是：
H、F、Cl、Br、OH、C1-C6烷氧基、氨基、C1-C6烷基氨基、COOH、COO-C1-C6烷基、NO2、CN、或C(O)-C1-C6烷基；或
C1-C6烷基、C2-C6烯基、或芳基，所述C1-C6烷基、C2-C6烯基、或芳基任选被苯基、F、Cl、Br、C1-C6烷氧基、COOH、COO-C1-C6烷基、NO2或CN取代。
3
22.权利要求19所述的方法，其中R 是：
H、C3-C10环烷基或C2-C10炔基；或
5 5
C1-C10烷基或C2-C10烯基，各个任选被1～3个下述基团取代：卤素、CF3、SR、OR、OC(O)
5 5 5 5 5 5 5 5 5
R、NRR、COOR、NO2、CN、C(O)R、OC(O)NRR 或C(O)NRR。
3
23.权利要求19所述的方法，其中R 为：
5 5 5 5 5
H或C1-C8烷基，其任选为1～3个下述基团取代：卤素、OR、NRR、COOR、C(O)R、C(O)
5 5
NRR、C2-C6烯基、或C2-C6炔基；或
环丙基、环丙基甲基、环丁基、环丁基甲基、环戊基、环戊基甲基、环己基或环己基甲基。
3
24.权利要求17所述的方法，其中R 是芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、杂环基或杂环基烷基，各个均为以下基团取代：
5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
H、烷基、卤素、OR、OC(O)R、NRR、COOR、NO2、CN、C(O)R、OC(O)NRR 或C(O)NRR ；或任选取代的芳基、杂芳基或杂环基。
3
25.权利要求24所述的方法，其中通过R 表示的芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、杂环基或杂环基烷基选自：苄基、吡啶基、吡啶基亚甲基、呋喃基、噻吩基、四氢呋喃基或四氢噻吩基。
3
26.权利要求25所述的方法，其中由R 表示的芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基、杂环基或杂环基烷基的取代基是：
5 5 5 5 5 5
H、F、Cl、Br、SR、OR、NRR、COOR、NO2、CN、C(O)R ；或
C1-C6烷基、C2-C6烯基或芳基，所述C1-C6烷基、C2-C6烯基或芳基任选被苯基、F、Cl、Br、
5 5 5
SR、OR、COOR、NO2或CN取代。
4
27.权利要求1～17中任一项所述的方法，其中R 独立地为芳基；杂芳基；C1-C10烷基或C2-C10烯基，各个基团任选独立地被1-3个下述基团取代：芳基或杂芳基；C2-C10炔基；卤
5 5 5 5 5 5 6 5 5 5
素；卤代烷基；CF3；SR ；OR ；OC(O)R ；NRR ；NRR ；COOR ；NO2；CN；C(O)R ；C(O)C(O)R ；C(O)
5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 8
NRR ；S(O)mR ；S(O)mNRR ；NRC(O)NRR ；NRC(O)C(O)R ；NRC(O)R ；NR(COOR)；NRC(O)R ；
5 5 5 5 5 5 8 5 5 5 5 5 6
NRS(O)mNRR ；NRS(O)mR ；NRS(O)mR ；NRC(O)C(O)NRR ；或NRC(O)C(O)NRR。
4
28.权利要求27所述的方法，其中R 是：
5 5 5 5 5 5 5 5 5
H、OR、OC(O)R、NRR、COOR、NO2、CN、C(O)R、C(O)C(O)R 或C(O)NRR ；或
5 5 5 5 5
C1-C10烷基，其任选被1～3个下述基团取代：卤素、OR、OC(O)R、NRR、COOR、NO2、CN、
5 5 5 5 5
C(O)R、OC(O)NRR 或C(O)NRR。
4
29.权利要求27所述的方法，其中R 是：
H、CF3、CCl3、氨基、C1-C6烷氧基、COOH、COO-C1-C6烷基、OC(O)-C1-C6烷基、苯氧基或烷基苯氧基；或
C1-C6烷基，其任选被下述基团取代：氨基、COOH、COO-C1-C6烷基或OC(O)-C1-C6烷基、或
1～2个C1-C6烷氧基。
4
30.权利要求27所述的方法，其中R 是任选取代的芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基，
4 5 5 5 5 5 5 5
其中在R 中任选的取代基是：卤素、CF3、SR、OR、OC(O)R、NRR、COOR、NO2、CN、C(O)R、
5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
OC(O)NRR、C(O)NRR、N(R)C(O)R、N(R)(COOR)、或S(O)mNRR。
4
31.权利要求30所述的方法，其中由R 表示的芳基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基选自：
苯基、苄基、吡啶基、吡啶基亚甲基、呋喃基、呋喃基亚甲基、噻吩基、噻吩基亚甲基、吡唑基和吡唑基亚甲基。
4
32.权利要求30所述的方法，其中由R 表示的芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基的任选取代基是：
F、Cl、OH、氨基、NO2、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、苯氧基、或烷基苯氧基；或
苯基、咪唑基或吗啉代，其任选被下述基团取代：F、Cl、氨基、NO2、C1-C6烷氧基、或C1-C6烷基。
33.权利要求1～4中任一项所述的方法，其中所述化合物选自在表I中鉴别的化合
物。
34.由下述结构式表示的化合物或其药学可接受的盐：
其中：
m为1或2；
各个X和X1独立地为N、CH或C(C1-C4烷基)；
R1和Z各自独立地为H、R5、C(O)R6、COOR5、C(O)NR6R6或S(O)mR5；或NR1Z整体为N＝CH-NR5R5；
R2为SR9、OR5、OC(O)R5、NR5R5、NR5R6、COOR5、C(O)R5、C(O)H、C(O)C(O)R5、C(O)NR5R5、C(O)NR5R6、C(O)NR6R6、S(O)mR9、S(O)mNR5R5、S(O)mNR5R6、NR5C(O)NR5R5、NR6C(O)NR6R6、NR5C(O)C(O)R5、NR5C(O)C(O)R5、NR5C(O)R5、NR6C(O)R5、NR5(COOR5)、NR6(COOR5)、NR5C(O)R8、NR6C(O)R8、NR5S(O)mNR5R5、NR6S(O)mNR6R6、NR5S(O)mR5、NR6S(O)mR5、NR5S(O)mR8、NR6S(O)mR8、NR5C(O)C(O)NR5R5、NR6C(O)C(O)NR5R6、或NR5C(O)C(O)NR5R6；
R3为R10、COOR5、C(O)R5、C(O)C(O)R5、C(O)NR5R5、C(O)NR5R6、C(O)NR6R6、S(O)mR5、S(O)mNR5R5、S(O)mNR5R6、P(O)R5R5、P(O)(NR5R5)2、P(O)(NR5R6)2、P(O)(NR6R6)2、或P(O)(OR5)2；
R4为H、卤素、拟卤素、CN、SR5、OR5、OC(O)R5、NR5R5、NR5R6、COOR5、NO2、C(O)R5、C(O)C(O)R5、C(O)NR5R5、C(O)NR5R6、C(O)NR6R6、S(O)mR5、S(O)mNR5R5、S(O)mNR5R6、NR5C(O)NR5R5、NR6C(O)NR6R6、NR5C(O)C(O)R5、NR5C(O)C(O)R5、NR5C(O)R5、NR6C(O)R5、NR5(COOR5)、NR6(COOR5)、NR5C(O)R8、NR6C(O)R8、NR5S(O)mNR5R5、NR6S(O)mNR6R6、NR5S(O)mR5、NR6S(O)mR5、NR5S(O)mR8、NR6S(O)mR8、NR5C(O)C(O)NR5R5、NR6C(O)C(O)NR5R6、或NR5C(O)C(O)NR5R6、NR6C(O)C(O)NR5R6、或NR5C(O)C(O)NR5R6、或任选取代的烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基；及
各个R5独立地为任选取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基，各个R6和R8独立地为H或任选取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基，
9
各个R 独立地为任选取代的含有两个或更多个碳的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基，
10
各个R 独立地为任选取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基，不包括任选取代的二氢呋喃-2-基和四氢呋喃-2-基；
其中：
2 5 3
当R 是C(O)R 时，R 不是甲基、2-丙基、环戊基或4-哌啶基；
1 3 4
当各个X和X 是N并且R 是CH3时，R 不是N(CH3)2或S-烷基；
1 4
当Z、R 和R 为H时；
1
各个X和X 为N；
2
R 是被下述基团取代的CO：甲基、苯基、4-溴苯基、4-氯苯基、4-氯苯基、萘-2-基、(3-甲基-5-苯基)噻唑-2-基、4-(哌啶-1-基磺酰基)苯基、噻吩-2-基、或苯并噻
3
唑-2-基时，则R 不是苯基、4-氯苯基或4-甲基苯基；
2 3
R 是CONH2时，则R 不是甲基、苯基或CH2OCH2CH2OH；
2 3
R 是烷氧基时，则R 不是叔丁基；
1
各个X是N；X 是CH；
2
R 是被以下基团在间位取代的苯甲酰基：NH2、NHSO2-(氯取代的苯基)、NHSO2-噻
吩-2-基、NHCONH-(卤素或甲基取代的苯基)、NHCONH-(甲基苄基)、NHCONH-环己基、或
3
NHCO-(氯代苯基)时；则R 不是CH2-环丙基；
3
R 是CH2O-苄基、CH2O-烷基、烷基或烯基，其任选被以下基团取代：羟基、烷氧基、羟基
2
烷基或羟基烷氧基；或任选取代的芳烷基时；则R 不是CONH2；
2
R 是被以下基团取代的S-苯基：NH2、NC(O)O-叔丁基、NC(O)NH-(2-氟苯基)、
3
NS(O)2-(单或二氟苯基)时；则R 不是环戊基；
1
各个X和X 是CH；
3 2
R 是2-(吗啉-1-基)亚乙基时；则R 不是CO-四甲基环丙烷；
3 2
R 是甲基时，则R 不是COH或羧基；
1 3
各个X是N，X 是N或CH，并且R 是4-(4-甲基-哌嗪-1-基)环己基、4-(N-吗啉基)
2
环己基或苯基时，则R 不是CONH-(任选取代的苯基)或N(任选取代的苯基)C(O)(苯基或烷基苯基)；
1 4 1 2
当各个X和X 为N，R 为H或苯基，Z为H或任选取代的苯基，R 为H，且R 为NH-(吡
3
啶基或任选取代的苯基)时，R 不是甲基、羟基烷基、苄基或6-对甲苯基哒嗪-3-基。
35.权利要求34所述的化合物，其中所述化合物以下述结构式表示：
36.权利要求34所述的化合物，其中所述化合物以下述结构式表示：
37.权利要求34所述的化合物，其中所述化合物以下述结构式表示：
38.权利要求34所述的化合物，其中所述化合物以下述结构式表示：
39.权利要求34所述的化合物，其中所述化合物以下述结构式表示：
40.权利要求34所述的化合物，其中所述化合物以下述结构式之一表示：
41.权利要求34所述的化合物，其中所述化合物以下述结构式之一表示：
2 9 3 5 5 5 5 6
42.权利要求34～41中任一项所述的化合物，其中R 为SR、OR、OC(O)R、NRR、NRR、
5 5 5 5 5 6 9 5 5 5 6 5
COOR、C(O)H、C(O)C(O)R、C(O)NRR、C(O)NRR、S(O)mR、S(O)mNRR、S(O)mNRR、NRC(O)
5 5 6 6 6 5 5 5 5 5 5 6 5 5 5
NRR、NRC(O)NRR、NRC(O)C(O)R、NRC(O)C(O)R、NRC(O)R、NRC(O)R、NR(COOR)、
6 5 5 8 6 8 5 5 5 6 6 6 5 5 6 5
NR(COOR)、NRC(O)R、NRC(O)R、NRS(O)mNRR、NRS(O)mNRR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、
5 8 6 8 5 5 5 6 5 6 5 5 6
NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRC(O)C(O)NRR、NRC(O)C(O)NRR、或NRC(O)C(O)NRR。
2 9 5 5 5 5
43.权利要求34～41中任一项所述的化合物，其中R 为SR、OR、OC(O)R、NRR、
5 6 5 5 9 5 5 5 6 5 5 5 6
NRR、COOR、C(O)H、C(O)C(O)R、S(O)mR、S(O)mNRR、S(O)mNRR、NRC(O)NRR、NRC(O)
6 6 5 5 5 5 5 5 6 5 5 5 6 5 5
NRR、NRC(O)C(O)R、NRC(O)C(O)R、NRC(O)R、NRC(O)R、NR(COOR)、NR(COOR)、NRC(O)
8 6 8 5 5 5 6 6 6 5 5 6 5 5 8 6 8
R、NRC(O)R、NRS(O)mNRR、NRS(O)mNRR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、
5 5 5 6 5 6 5 5 6
NRC(O)C(O)NRR、NRC(O)C(O)NRR、或NRC(O)C(O)NRR。
2 5 5 5 6 5
44.权利要求34～41中任一项所述的化合物，其中R 独立地为NRR、NRR、NRC(O)
5 5 6 6 6 5 5 5 5 5 5 6 5 5 5
NRR、NRC(O)NRR、NRC(O)C(O)R、NRC(O)C(O)R、NRC(O)R、NRC(O)R、NR(COOR)、
6 5 5 8 6 8 5 5 5 6 6 6 5 5 6 5
NR(COOR)、NRC(O)R、NRC(O)R、NRS(O)mNRR、NRS(O)mNRR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、
5 8 6 8 5 5 5 6 5 6 5 5 6
NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRC(O)C(O)NRR、NRC(O)C(O)NRR、或NRC(O)C(O)NRR。
2 5
45.权利要求34～41中任一项所述的化合物，其中R 是OR。
5
46.权利要求45所述的化合物，其中R 是任选取代的芳基或杂芳基。
5
47.权利要求45所述的化合物，其中R 是任选取代的烷基、环烷基或杂烷基。
2 9
48.权利要求34～41中任一项所述的化合物，其中R 是SR。
9
49.权利要求48所述的化合物，其中R 是任选取代的芳基或杂芳基。
9
50.权利要求49所述的化合物，其中R 是任选取代的环烷基、杂烷基或具有2个或更
多个碳的烷基。
2 5 5 5 6
51.权利要求34～41中任一项所述的化合物，其中R 是NRR 或NRR。
5
52.权利要求51所述的化合物，其中R 是任选取代的芳基或杂芳基。
5
53.权利要求51所述的化合物，其中R 是任选取代的烷基、环烷基或杂烷基。
2 9 5 5
54.权利要求34～41中任一项所述的化合物，其中R 是S(O)mR、S(O)mNRR、或S(O)
5 6
mNRR。
5
55.权利要求54所述的化合物，其中R 是任选取代的芳基或杂芳基。
5
56.权利要求54所述的化合物，其中R 是任选取代的烷基、环烷基或杂烷基。
9
57.权利要求54所述的化合物，其中R 是任选取代的芳基或杂芳基。
9
58.权利要求54所述的化合物，其中R 是任选取代的环烷基、杂烷基或具有2个或更
多个碳的烷基。
59.在图2、3A、4A、5A、5B、6、或7中的任一幅所说明的化合物。
60.治疗以蛋白质运输受损为特征的病症的方法，包括给予受试者权利要求的34～59中任一项所述的化合物，或使细胞与权利要求的34～59中任一项所述的化合物接触。
61.权利要求1～33或60中任一项所述的方法，其中所述病症是溶酶体贮积症。
62.权利要求61所述的方法，其中所述溶酶体贮积症为法布里病、法韦尔病、戈谢病、GM1-神经节苷脂贮积病、泰-萨克斯病、桑德霍夫病、GM2激活剂病、克拉伯病、异染性脑白质营养不良、尼曼-皮克二氏病(A、B和C型)、胡尔勒病、沙伊病、亨特病、桑菲列普病、莫尔丘病、马-拉病、透明质酸酶缺乏症、天冬氨酰葡糖胺尿症、岩藻糖苷贮积症、甘露糖苷贮积症、欣德勒病、1型唾液酸贮积症、蓬佩病、致密性成骨不全症、蜡样脂褐质沉积症、胆固醇酯贮积症、沃尔曼病、多种硫酸酯酶缺乏症、半乳糖涎酸贮积症、粘多糖症(II、III和IV型)、胱氨酸贮积症、唾液酸贮积症、伴随马-舍综合征的乳糜微粒滞留病、赫曼斯基-普德拉克综合征、切-东二氏综合征、Danon病或Geleophysic发育不良。
63.权利要求1～33或60中任一项所述的方法，其中所述病症的特征在于物质向细胞
腔隙的递送受损。
64.权利要求1～33或60中任一项所述的方法，其中所述病症的特征在于Rab27a突
变或Rab27a的缺陷。
65.权利要求64所述的方法，其中所述病症是格里塞利综合征。
66.权利要求1～33或60中任一项所述的方法，其中所述病症是囊性纤维化。
67.权利要求1～33或60中任一项所述的方法，其中所述病症是以蛋白质运输受损为
特征的囊性纤维化。
68.权利要求1～33或60中任一项所述的方法，其中所述病症是以囊性纤维化跨膜传
导调节蛋白(CFTR)活性受损为特征的囊性纤维化。
69.权利要求1～33或60中任一项所述的方法，其中所述病症是以蛋白质运输受损和
囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)活性受损为特征的囊性纤维化。
70.权利要求1～33或60中任一项所述的方法，其中所述病症是糖尿病类疾病。
71.权利要求70所述的方法，其中所述糖尿病类疾病是糖尿病。
72.权利要求1～33或60中任一项所述的方法，其中所述病症为遗传性肺气肿
(α-1-抗胰蛋白酶缺乏症)、遗传性血色素沉着病、眼皮肤白化病、蛋白质C缺乏、I型遗传性血管性水肿、先天性蔗糖酶异麦芽糖酶缺乏、II型克-纳综合征、拉龙综合征、遗传性髓过氧物酶、原发性甲状腺机能减退症、先天性长QT综合征、甲状腺素结合的球蛋白缺乏、家族性高胆固醇血症、家族性乳糜微粒血症、无β-脂蛋白血症、低血浆脂蛋白a水平、伴有肝受损的遗传性肺气肿、先天性甲状腺功能减退症、成骨不全、遗传性低纤维蛋白原血症、α-1-抗糜蛋白酶缺乏症、肾性尿崩症、垂体神经性尿崩症、夏科-马里-图思综合征、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、IIA型冯·威利布兰德病、结合因子V和VIII缺乏、脊椎骨骺迟缓性发育不良、无脉络膜症、I细胞病、巴藤病、共济失调-毛细血管扩张症、急性成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞样白血病、髓细胞性白血病、ADPKD-常染色体显性多囊性肾病、微绒毛包含病、结节性硬化症、洛氏眼-脑-肾综合征、肌萎缩侧索硬化、骨髓增生异常综合征、裸淋巴细胞综合征、丹吉尔病、家族性肝内胆汁淤积、X-连锁肾上腺脑白质营养不良、斯科特综合征、1型和2型赫曼斯基-普德拉克综合征、泽耳韦格综合征、肢近端型点状软骨发育异常、常染色体隐性原发性高草酸尿症、Mohr Tranebjaerg综合征、脊髓延髓性肌萎缩症、原发性纤毛运动障碍(卡塔格纳综合征)、米-迪综合征、无脑回畸形病、运动神经元病、乌斯赫尔综合征、威斯科特-奥尔德里奇二氏综合征、Optiz综合征、亨廷顿舞蹈病、遗传性胰腺炎、抗磷脂综合征、重叠结缔组织病、舍格伦综合征、僵体综合征、Brugada综合征、费氏先天性肾综合征、杜宾-约翰逊综合征、X-连锁低磷血症、潘德雷德综合征、持续性幼儿型胰岛素过度分泌低血糖症、遗传性球形红细胞增多症、无铜蓝蛋白血症、婴儿型神经元蜡样质脂褐质沉积病、假性软骨发育不全和多重骨骺、斯塔加特样黄斑营养不良、X-连锁夏科-马里-图思病、常染色体显性色素性视网膜炎、Wolcott-Rallison综合征、库欣病、肢带型肌营养不良症、IV型粘多糖病、芬兰型遗传性家族性淀粉样变性、IV型糖原贮积症、肉瘤、慢性骨髓单核细胞性白血病、心肌病、面生殖发育异常、Torsion病、亨廷顿和脊髓小脑性共济失调、遗传性高同型半胱氨酸血症、多发性神经病、下位运动神经元病、色素视网膜炎、血清阴性多关节炎、间质性肺纤维化、雷诺现象、韦格纳肉芽肿病、蛋白尿、CDG-Ia、CDG-Ib、CDG-Ic、CDG-Id、CDG-Ie、CDG-If、CDG-IIa、CDG-IIb、CDG-IIc、CDG-IId、埃勒斯-当洛斯综合征、多发性外生骨疣、格里塞利综合征(1型或2型)或X-连锁非特异性智力发育迟缓。
73.治疗以蛋白质运输受损为特征的病症的方法，包括给予受试者以图3B、4B、8A、8B、
8C、9A、9B、9C、或9D中任一幅所表示的化合物或其药学可接受的盐或衍生物，或使细胞与图3B、4B、8A、8B、8C、9A、9B、9C、或9D中任一幅所表示的化合物或其药学可接受的盐或衍生物接触。
74.权利要求63或73所述的方法，其中所述病症为突触核蛋白病。
75.权利要求74所述的方法，其中所述突触核蛋白病是帕金森氏病、家族性帕金森氏病、路易体疾病、阿尔茨海默病路易体变异型、路易体痴呆、多系统萎缩症或关岛震颤麻痹痴呆综合征。
76.权利要求1～33或63～75中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
77.权利要求1～59中任一项所说明的化合物在制备用于治疗蛋白质运输病症的药物
中的用途，其中所述病症不是突触核蛋白病。
78.权利要求34～59或73中任一项所述的化合物在制备用于治疗蛋白质运输病症的
药物中的用途。
79.蛋白质的制备方法，该方法包括：
在权利要求1～59、73或86中任一项所述的化合物存在时培养细胞；及
纯化由细胞产生的蛋白，
其中与所述化合物不存在时培养细胞相比，在所述化合物存在时培养细胞会得到较高产率的纯化蛋白。
80.权利要求79所述的方法，其中所述蛋白质是由异源核酸编码的重组蛋白质。
81.权利要求79或80所述的方法，其中所述蛋白质是分泌性蛋白质。
82.权利要求79～81中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是糖基化蛋白。
83.权利要求79～82中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是细胞因子、淋巴因子、生长因子或抗体。
84.权利要求79～84中任一项所述的方法，其中所述细胞是昆虫细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞或细菌细胞。
85.权利要求84所述的方法，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
86.由下述结构式表示的化合物或其药学可接受的盐：
其中：
m为1或2；
各个X独立地表示N、CH或C(C1-C4烷基)；
1 3
各个X 独立地表示N、NR、CH或C(C1-C4烷基)；
1 5 5 5 5 5 5 1
R 和Z各自独立地为R、C(O)R、COOR、C(O)NRR 或S(O)mR ；或NRZ整体为N＝
5 5
CH-NRR ；
2
R 为N3-取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基，其可任选被进一步取代；
3 5 5 5 5 5 5 5 6 5
R 独立地为H、卤素、拟卤素、CN、SR、R、OR、OC(O)R、NRR、NRR、COOR、NO2、C(O)
5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
R、C(O)C(O)R、C(O)NRR、S(O)mR、S(O)mNRR、NRC(O)NRR、NRC(O)C(O)R、NRC(O)R、
5 5 5 8 5 5 5 5 5 5 8 5 5 5 5
NR(COOR)、NRC(O)R、NRS(O)mNRR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRC(O)C(O)NRR、NRC(O)
5 6 5 5 5 5 5 6 6 6 5
C(O)NRR、P(O)RR、P(O)(NRR)2、P(O)(NRR)2、P(O)(NRR)2、或P(O)(OR)2；
4 5 5 5 5 5 5 6 5 5
R 独立地为H、卤素、拟卤素、CN、SR、OR、OC(O)R、NRR、NRR、COOR、NO2、C(O)R、C(O)
5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
C(O)R、C(O)NRR、S(O)mR、S(O)mNRR、NRC(O)NRR、NRC(O)C(O)R、NRC(O)R、NR(COOR)、
5 8 5 5 5 5 5 5 8 5 5 5 5 5 6
NRC(O)R、NRS(O)mNRR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRC(O)C(O)NRR、或NRC(O)C(O)NRR ；或任选取代的烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基；且
5 6 8
各个R、R 和R 独立地为H或任选被取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基。
87.药物组合物，其包含权利要求34～59或86中任一项所述的化合物和药学可接受
的盐。

说明书全文

蛋白质运输的调节

技术领域

[0001] 本发明涉及调节蛋白质运输和治疗或预防以蛋白质运输受损为特征的病症的化合物和方法。

[0002] 发明背景

[0003] 以蛋白质运输受损为特征的病症很多，包括遗传病例如亨廷顿病、泰-萨克斯病、家族性高胆固醇血症和囊性纤维化。与这些疾病相关的基因突变常导致蛋白质的错误折叠和/或保留在内质网中。因此，这些蛋白质常过早降解。

[0004] 细胞(例如，在组织中)不能表达足够量的重要蛋白质例如酶，可导致病症状态，所述疾病状态在蛋白质运输病症中的表现和严重程度不同。例如，囊性纤维化几乎可影响整个机体，导致进行性残疾和早逝。呼吸困难是最常见的症状，并且是由频繁的肺部感染引起的，所述肺部感染可通过抗生素和其它药物治疗。囊性纤维化对身体其它部分的作用可导致许多其它症状，包括鼻窦感染、发育不全、腹泻和不育。囊性纤维化，如同许多以蛋白质运输受损为特征的其它疾病一样，若不治疗则会致命。

[0005] 其他蛋白质运输病症包括例如：α-突触核蛋白介导的病症或其中涉及α-突触核蛋白纤维形成的病症，包括但不局限于：帕金森氏疾病(Parkinson’sdisease)、路易体痴呆(dementia with Lewy body)、多系统萎缩症(multiplesystem atrophy)和阿尔茨海默病路易体变异型(the Lewy body variant ofAlzheimer’s disease)。

[0006] 例如，帕金森氏病是神经变性疾病，其病理特征为胞质内路易体的存在(Lewy in Handbuch der Neurologie，M.Lewandowski，ed.，Springer，Berlin，pp.920-933，1912；Pollanen等人，J.Neuropath.Exp.Neurol.52：183-191，1993)，路易体的主要成分是由α-突触核蛋白组成的原纤维(Spillantini等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：
6469-6473，1998；Arai等人，Neurosci.Lett.259：83-86，1999)，α-突触核蛋白是140个氨基酸的蛋白质(Ueda等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：11282-11286，1993)。已描述了导致家族性早发帕金森氏病的α-突触核蛋白中的两个显性突变，表明路易体在帕金森氏病和相关疾病中的神经元变性中在机理上发挥作用(Polymeropoulos等人，Science
276：2045-2047，1997；Kruger等人，Nature Genet.18：106-108，1998；Zarranz等人，Ann.Neurol.55：164-173，2004)。α-突触核蛋白基因的三倍体和双倍体突变与帕金森氏病的早发相关(Singleton等人，Science 302：841，2003；Chartier-Harlin等人.Lancet364：
1167-1169，2004；Ibanez等人，Lancet 364：1169-1171，2004)。体外研究已表明重组的α-突触核蛋白的确可形成路易体样原纤维(Conway等人，NatureMed.4：1318-1320，
1998；Hashimoto 等人，Brain Res.799：301-306，1998；Nahri 等人，J.Biol.Chem.274：
9843-9846，1999)。帕金森氏病相关的α-突触核蛋白突变加速这种聚集过程，表明这种体外研究与帕金森氏病发病机制有相关性。α-突触核蛋白聚集和原纤维形成满足了成核依赖的聚合过程的标准(Wood等人，J.Biol.Chem.274：19509-19512，1999)。在此方面，α-突触核蛋白原纤维形成与阿尔茨海默病的β-淀粉样蛋白(Aβ)原纤维形成相似。α-突触核蛋白的重组蛋白和非-Aβ成分(又称NAC)(是α-突触核蛋白的35个氨基酸的多肽片段)，当在37℃时孵育时，均具有形成原纤维的能力，并且淀粉样蛋白染色阳性，例如刚果红染色(当在偏振光下观察时，表现出红/绿双光折射)和硫磺素S染色(表现出阳性荧光)(Hashimoto等人，Brain Res.799：301-306，1998；Ueda等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA
90：11282-11286，1993)。

[0007] 突触核蛋白(synuclein)为一族包括α-、β-和γ-突触核蛋白的小突触前神经元蛋白，其中仅α-突触核蛋白聚集与几种神经疾病相关(Ian等人，ClinicalNeurosc.Res.1：445-455，2001；Trojanowski和Lee，Neurotoxicology23：457-460，2002)。从一些观测中揭示了突触核蛋白(且尤其是α-突触核蛋白)在许多神经变性和/或淀粉样蛋白病的病因学中的作用。病理学上，将α-突触核蛋白确定为路易体的主要成分，帕金森氏病的标志内含物，且其片段已从不同神经疾病、阿尔茨海默病的淀粉样斑中分离出。生物化学上，重组的α-突触核蛋白表现出形成淀粉样蛋白样原纤维，再现了从患有路易体痴呆、帕金森氏病和多系统萎缩的患者分离出的α-突触核蛋白的超微结构特征。而且，在α-突触核蛋白基因中的突变的鉴定(虽然仅在少数家族性帕金森氏病病例中)证明突触核蛋白病理学和神经变性病之间的明确的联系。α-突触核蛋白与疾病谱，例如帕金森氏病、路易体痴呆、多系统萎缩和阿尔茨海默病的路易体变型的普遍相关，导致这些疾病被分类到涵盖性术语“突触核蛋白病(synucleinopathy)”下。

[0008] α-突触核蛋白的纤维化和聚集被认为在PD中的神经元功能障碍和多巴胺能神经元死亡中发挥重要作用。在α-突触核蛋白中的突变或野生型α-突触核蛋白的基因组三倍体(导致其过表达)导致一些罕见家族形式的帕金森氏病。体外和体内模型表明野生型α-突触核蛋白的过表达诱导神经细胞死亡。参见，例如Polymersopoulos，等人(1997)Science 276(5321)：2045-7，Kruger，等人(1998)Nat Genet.18(2)：106-8，Singleton，等人(2003)Science302(5646)：841，Miller，等人(2004)Neurology 62(10)：1835-8，Hashimoto，等人(2003)Ann N Y Acad Sci.991：171-88，Lo Bianco，等人(2002)Proc Natl AcadSci U S A.99(16)：10813-8，Lee，等人(2002)Proc Natl Acad Sci U S A.99(13)：8968-73，Masliah，等人(2000)Science 287(5456)：1265-9，Auluck，等人(2002)Science
295(5556)：865-8，Oluwatosin-Chigbu等人(2003)BiochemBiophys Res Commun 309(3)：
679-84，Klucken等人，2004)J Biol Chem.279(24)：25497-502。保护神经元免受α-突触核蛋白的毒性作用是治疗帕金森氏病和其他突触核蛋白病例如路易体痴呆的有前景的策略。

[0009] 因此，为了治疗由蛋白质运输介导的疾病和病症，例如囊性纤维化和帕金森氏病，需要拯救蛋白质运输的化合物和组合物。

发明内容

[0010] 本文提供了化合物和包含这些化合物的组合物，以及使用这些化合物来拯救蛋白质运输受损的方法。还提供了治疗或改善与蛋白质运输受损相关的病症的一种或多种症状的方法。所述病症包括例如囊性纤维化。

[0011] 所描述的任何化合物在治疗或改善与蛋白质运输受损相关的病症的一种或多种症状中的用途也在本文考虑的范围内。此外，所描述的任何化合物用于制备治疗与蛋白质运输受损相关的病症的药物的用途也在本文考虑的范围内。治疗患有以蛋白质运输受损为特征的病症的受试者的方法，其包括给予受试者以有效量的如下结构式所表示的化合物或其药学可接受的盐：

[0012]

[0013] 其中所述疾病不是突触核蛋白病。

[0014] 提高细胞中蛋白质运输的方法包括使细胞与有效量的以上述结构式表示的化合物或其药学可接受的盐接触，其中所述细胞不以突触核蛋白运输受损为特征。

[0015] 治疗以蛋白质运输受损为特征的病症的方法，包括将化合物或其药学可接受的盐向受试者给药或与细胞接触，其中所述化合物以上述结构式表示，并且所述病症不是突触核蛋白病。

[0016] 在上述方法的各个实施方案中，在以上述结构式表示的化合物中：

[0017] m为1或2；

[0018] 各个X独立地表示N、CH或C(C1-C4烷基)；

[0019] 各个X1独立地表示N、NR3、CH或C(C1-C4烷基)；

[0020] R1和Z各自独立地为R5、C(O)R5、COOR5、C(O)NR5R5或S(O)mR5；或NR1Z整体为N＝5 5
CH-NRR ；

[0021] R2和R3各自独立地为H、卤素、拟卤素、CN、SR5、R5、OR5、OC(O)R5、NR5R5、NR5R6、5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
COOR、NO2、C(O)R、C(O)C(O)R、C(O)NRR、S(O)mR、S(O)mNRR、NRC(O)NRR、NRC(O)C(O)R、
5 5 5 5 5 8 5 5 5 5 5 5 8 5 5 5
NRC(O)R、NR(COOR)、NRC(O)R、NRS(O)mNRR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRC(O)C(O)NRR、
5 5 6 5 5 5 5 5 6 6 6 5
NRC(O)C(O)NRR、P(O)RR、P(O)(NRR)2、P(O)(NRR)2、P(O)(NRR)2、或P(O)(OR)2；

[0022] R4独立地为H、卤素、拟卤素、CN、SR5、OR5、OC(O)R5、NR5R5、NR5R6、COOR5、NO2、C(O)5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
R、C(O)C(O)R、C(O)NRR、S(O)mR、S(O)mNRR、NRC(O)NRR、NRC(O)C(O)R、NRC(O)R、
5 5 5 8 5 5 5 5 5 5 8 5 5 5 5
NR(COOR)、NRC(O)R、NRS(O)mNRR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRC(O)C(O)NRR、或NRC(O)
5 6
C(O)NRR ；或任选取代的烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基；且

[0023] 各个R5、R6和R8独立地为H或任选被取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基。

[0024] 在上述方法的一些实施方案中，在以上述结构式表示的化合物中：

[0025] m为1或2；

[0026] 各个X独立地为N或CH；

[0027] 各个X1独立地为N、NR3或CH；

[0028] R1和Z各自独立地为R5、C(O)R5、COOR5、C(O)NR5R5或S(O)mR5；

[0029] R2和R3各自独立地为H、卤素、拟卤素、CN、SR5、R5、OR5、OC(O)R5、NR5R5、NR5R6、5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
COOR、NO2、C(O)R、C(O)C(O)R、C(O)NRR、S(O)mR、S(O)mNRR、NRC(O)NRR、NRC(O)C(O)R、
5 5 5 5 5 8 5 5 5 5 5 5 8 5 5 5
NRC(O)R、NR(COOR)、NRC(O)R、NRS(O)mNRR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRC(O)C(O)NRR、
5 5 6 5 5 5 5 5 6 6 6 5
NRC(O)C(O)NRR、P(O)RR、P(O)(NRR)2、P(O)(NRR)2、P(O)(NRR)2、或P(O)(OR)2；

[0030] R4独立地为H、卤素、拟卤素、CN、SR5、OR5、OC(O)R5、NR5R5、NR5R6、COOR5、NO2、C(O)5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
R、C(O)C(O)R、C(O)NRR、S(O)mR、S(O)mNRR、NRC(O)NRR、NRC(O)C(O)R、NRC(O)R、
5 5 5 8 5 5 5 5 5 5 8 5 5 5 5
NR(COOR)、NRC(O)R、NRS(O)mNRR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRC(O)C(O)NRR、或NRC(O)
5 6
C(O)NRR ；或任选取代的烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基；且

[0031] 各个R5、R6和R8独立地为H或任选被取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基。

[0032] 在一些实施方案中，R2独立地为H、卤素、拟卤素、(CH2)n-Y或(CH＝CH)n-Y，其中Y可以为未取代的或取代的芳基、杂芳基、烷基或环烷基。在多个实施方案中，Y的取代基独立地选自：卤素、拟卤素、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、NO2、烷氧基、芳氧基、芳基烷氧基、CF3、5 6 5 6 6 6 6 6 5 6 5 6
OCF3、CN、NRR、NRCOR、(CH2)nOR、SR、CO2H、CO2R、CONRR、COR 和SO2NRR。在一些实施
3
方案中，R 独立地为取代的或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、(CH2)n-环烷
4 5 6 5 6
基或金刚烷基。在一些实施方案中，R 独立地为H、NH2、NRR、NRCOR 或未取代的或取代的
1 5 6
烷基或芳基。R、Z、R 和R 可独立地选自：H、未取代的或取代的烷基、芳烷基、芳基、烷芳基
7 7 8 8
或环烷基、COR° (其中R° 为未取代的或取代的烷基或芳基)、SO2R° (其中R° 为芳基或取代的芳基)和(CH2)n-环烷基(其中环烷基可被取代)。在一些实施方案中，X独立地是CH或N。

[0033] 在一些实施方案中，化合物以下列结构式表示，其中R3独立地为任选取代的烷基、环烷基、烷氧基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基：

[0034]

[0035] 在一些实施方案中，化合物由下列结构式之一表示：

[0036]

[0037] 在多个实施方案中，R1和Z各自独立地选自：氢、或取代的或未取代的烷基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、卤代芳基羰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基和卤代芳基磺酰基。在一些实施方案中，R1独立地为H且Z为H。在一些实施方案中，R1独立地为甲基且Z为H。在某些实施方案中，R1是H。

[0038] 在多个实施方案中，R2独立地为氢、卤素或任选取代的芳基、杂芳基、芳烷基或芳烯基。在一些实施方案中，R2独立地为H、卤素、CN、NO2、NH2或任选被1-3个独立的下述基团取代的C1-C10烷基：卤素、SR5、OR5、OC(O)R5、NR5R5、COOR5、NO2、CN、C(O)R5、OC(O)NR5R5或C(O)NR5R5。在某些实施方案中，R2独立地为H、F、Cl、Br、CF3、CCl3、CN、NO2、NH2或C1-C6烷基。在多个实施方案中，R2独立地为芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基，各个基团独立地被5 5 5 5 5 5 5 5 5
下述基团取代：H、卤素、SR、OR、OC(O)R、NRR、COOR、NO2、CN、C(O)R、OC(O)NRR 或C(O)
5 5
NRR ；或芳基、C1-C10烷基或C2-C10烯基，各个基团任选被1-3个独立的下述基团取代：芳基、
5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2
卤素、SR、OR、OC(O)R、NRR、COOR、NO2、CN、C(O)R、OC(O)NRR 或C(O)NRR。例如在R中，任选被取代的芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基可独立地选自：苯基、萘基、苄基、苯基亚乙基、萘基亚甲基、苯氧基亚甲基、萘氧基亚甲基、吡啶基亚甲基、苯并呋喃基亚甲基、二氢苯并呋喃基亚甲基、苯并二氧杂环戊烯基亚甲基、茚满基亚甲基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、
2
苯并噻吩基和苯并呋喃基。对于R 中芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基的任选取代基可以独立地为：H、F、Cl、Br、OH、C1-C6烷氧基、氨基、C1-C6烷基氨基、COOH、COO-C1-C6烷基、NO2、CN或C(O)-C1-C6烷基；或C1-C6烷基、C2-C6烯基或芳基，其任选被下述基团取代：苯基、F、Cl、Br、C1-C6烷氧基、COOH、COO-C1-C6烷基、NO2或CN。

[0039] 在一些实施方案中，R3独立地选自取代或未取代的烷基、环烷基、芳基和芳烷基。3
在多个实施方案中，R 独立地为H、C3-C10环烷基、或C2-C10炔基；或C1-C10烷基或C2-C10烯
5 5 5 5 5 5
基，各个基团任选被1-3个下述基团取代：卤素、CF3、SR、OR、OC(O)R、NRR、COOR、NO2、CN、
5 5 5 5 5 3
C(O)R、OC(O)NRR、或C(O)NRR。在一些实施方案中，R 独立地为H、C1-C8烷基，其任选被
5 5 5 5 5 5 5
1-3个下述基团取代：卤素、OR、NRR、COOR、C(O)R、C(O)NRR、C2-C6烯基或C2-C6炔基；或环丙基、环丙基甲基、环丁基、环丁基甲基、环戊基、环戊基甲基、环己基或环己基甲基。在多
3
个实施方案中，R 独立地为芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、杂环基或杂环基烷基，各个基
5 5 5 5 5 5 5 5
团被下述基团取代：H、烷基、卤素、OR、OC(O)R、NRR、COOR、NO2、CN、C(O)R、OC(O)NRR 或
5 5 3
C(O)NRR ；或任选被取代的芳基、杂芳基或杂环基。例如通过R 表示的芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、杂环基或杂环基烷基可独立地选自：苄基、吡啶基、吡啶基亚甲基、呋喃基、噻
3
吩基、四氢呋喃基或四氢噻吩基。在某些实施方案中，对于R 表示的芳基、杂芳基、芳烷基、
5 5 5 5 5
杂芳烷基、杂环基或杂环基烷基的取代基可以独立地为：H、F、Cl、Br、SR、OR、NRR、COOR、
5
NO2、CN、C(O)R ；或C1-C6烷基、C2-C6烯基或芳基，其任选被下述基团取代：苯基、F、Cl、Br、
5 5 5
SR、OR、COOR、NO2或CN。

[0040] 在一些实施方案中，R4独立地为H、烷基、环烷基或烷基环烷基。在多个实施方案4
中，R 独立地为芳基；杂芳基；C1-C10烷基或C2-C10烯基，各个基团任选独立地被1-3个下
5 5 5 5 5
述基团取代：芳基、或杂芳基；C2-C10炔基；卤素；卤代烷基；CF3；SR ；OR ；OC(O)R ；NRR ；
5 6 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
NRR ；COOR ；NO2；CN；C(O)R ；C(O)C(O)R ；C(O)NRR ；S(O)mR ；S(O)mNRR ；NRC(O)NRR ；
5 5 5 5 5 5 5 8 5 5 5 5 5 5 8
NRC(O)C(O)R ；NRC(O)R ；NR(COOR)；NRC(O)R ；NRS(O)mNRR ；NRS(O)mR ；NRS(O)mR ；
5 5 5 5 5 6 4 5 5
NRC(O)C(O)NRR ；或NRC(O)C(O)NRR。在一些实施方案中，R 独立地为：H、OR、OC(O)R、
5 5 5 5 5 5 5
NRR、COOR、NO2、CN、C(O)R、C(O)C(O)R、或C(O)NRR ；或C1-C10烷基，其任选被1-3个下述
5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
基团取代：卤素、OR、OC(O)R、NRR、COOR、NO2、CN、C(O)R、OC(O)NRR 或C(O)NRR。在某些
4
实施方案中，R 独立地为H、CF3、CCl3、氨基、C1-C6烷氧基、COOH、COO-C1-C6烷基、OC(O)-C1-C6烷基、苯氧基，或烷基苯氧基；或C1-C6烷基，其任选被下述基团取代：氨基、COOH、COO-C1-C6
4
烷基或OC(O)-C1-C6烷基、或1个或2个C1-C6烷氧基。在一些实施方案中，R 独立地为任
5 5
选取代的芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基，其中任选的取代基可包括：卤素、CF3、SR、OR、
5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
OC(O)R、NRR、COOR、NO2、CN、C(O)R、OC(O)NRR、C(O)NRR、N(R)C(O)R、N(R)(COOR)或
5 5 4
S(O)mNRR。例如通过R 表示的芳基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基可独立地选自：苯基、苄基、吡啶基、吡啶基亚甲基、呋喃基、呋喃基亚甲基、噻吩基、噻吩基亚甲基、吡唑基和吡唑基亚
4
甲基。在多个实施方案中，由R 表示的芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基的任选的取代基独立地为：F、Cl、OH、氨基、NO2、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、苯氧基、或烷基苯氧基；或苯基、咪唑基、或吗啉代，其任选被下述基团取代：F、Cl、氨基、NO2、C1-C6烷氧基、或C1-C6烷基。

[0041] 在某些实施方案中，化合物选自在图1A、1B、1C、1D、1E、1F、2、3A、3B、4A、4B、5A、5B、6、7、8A、8B、8C、9A、9B、9C、或9D中说明的化合物。在某些实施方案中，化合物选自在表I中说明的化合物。

[0042] 在多个实施方案中，化合物是由下述结构式所表示或其药学可接受的盐：

[0043]

[0044] 在多个实施方案中，化合物由下列结构式之一表示：

[0045]

[0046]

[0047] 在多个实施方案中，在上述结构式中：

[0048] m为1或2；

[0049] 各个X和X1独立地为N、CH或C(C1-C4烷基)；

[0050] R1和Z各自独立地为H、R5、C(O)R6、COOR5、C(O)NR6R6或S(O)mR5；或NR1Z整体为N5 5
＝CH-NRR ；

[0051] R2为SR9、OR5、OC(O)R5、NR5R5、NR5R6、COOR5、C(O)R5、C(O)H、C(O)C(O)R5、C(O)NR5R5、5 6 6 6 9 5 5 5 6 5 5 5 6 6 6 5
C(O)NRR、C(O)NRR、S(O)mR、S(O)mNRR、S(O)mNRR、NRC(O)NRR、NRC(O)NRR、NRC(O)
5 5 5 5 5 6 5 5 5 6 5 5 8 6
C(O)R、NRC(O)C(O)R、NRC(O)R、NRC(O)R、NR(COOR)、NR(COOR)、NRC(O)R、NRC(O)
8 5 5 5 6 6 6 5 5 6 5 5 8 6 8 5
R、NRS(O)mNRR、NRS(O)mNRR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRC(O)C(O)
5 5 6 5 6 5 5 6
NRR、NRC(O)C(O)NRR、或NRC(O)C(O)NRR ；

[0052] R3为R10、COOR5、C(O)R5、C(O)C(O)R5、C(O)NR5R5、C(O)NR5R6、C(O)NR6R6、S(O)mR5、S(O)5 5 5 6 5 5 5 5 5 6 6 6 5
mNRR、S(O)mNRR、P(O)RR、P(O)(NRR)2、P(O)(NRR)2、P(O)(NRR)2、或P(O)(OR)2；

[0053] R4为H、卤素、拟卤素、CN、SR5、OR5、OC(O)R5、NR5R5、NR5R6、COOR5、NO2、C(O)R5、C(O)5 5 5 5 6 6 6 5 5 5 5 6 5 5 5
C(O)R、C(O)NRR、C(O)NRR、C(O)NRR、S(O)mR、S(O)mNRR、S(O)mNRR、NRC(O)NRR、
6 6 6 5 5 5 5 5 5 6 5 5 5 6 5
NRC(O)NRR、NRC(O)C(O)R、NRC(O)C(O)R、NRC(O)R、NRC(O)R、NR(COOR)、NR(COOR)、
5 8 6 8 5 5 5 6 6 6 5 5 6 5 5 8
NRC(O)R、NRC(O)R、NRS(O)mNRR、NRS(O)mNRR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、
6 8 5 5 5 6 5 6 5 5 6 6 5 6
NRS(O)mR、NRC(O)C(O)NRR、NRC(O)C(O)NRR、或NRC(O)C(O)NRR、NRC(O)C(O)NRR、或
5 5 6
NRC(O)C(O)NRR、或任选取代的烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基；且

[0054] 各个R5独立地为任选取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基，

[0055] 各个R6和R8独立地为H或任选取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基，

[0056] 各个R9独立地为任选取代的含有两个或更多个碳的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基，且

[0057] 各个R10独立地为任选取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基，不包括任选取代的二氢呋喃-2-基和四氢呋喃-2-基。

[0058] 在多个实施方案中，在上述结构式中：

[0059] m为1或2；

[0060] 各个X独立地表示N、CH或C(C1-C4烷基)；

[0061] 各个X1独立地表示N、NR3、CH或C(C1-C4烷基)；

[0062] R1和Z各自独立地为R5、C(O)R5、COOR5、C(O)NR5R5或S(O)mR5；或NR1Z整体为N＝5 5
CH-NRR ；

[0063] R2为N3-取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基，其可任选被进一步取代；

[0064] R3独立地为H、卤素、拟卤素、CN、SR5、R5、OR5、OC(O)R5、NR5R5、NR5R6、COOR5、NO2、5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
C(O)R、C(O)C(O)R、C(O)NRR、S(O)mR、S(O)mNRR、NRC(O)NRR、NRC(O)C(O)R、NRC(O)
5 5 5 5 8 5 5 5 5 5 5 8 5 5 5 5
R、NR(COOR)、NRC(O)R、NRS(O)mNRR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRC(O)C(O)NRR、NRC(O)
5 6 5 5 5 5 5 6 6 6 5
C(O)NRR、P(O)RR、P(O)(NRR)2、P(O)(NRR)2、P(O)(NRR)2、或P(O)(OR)2；

[0065] R4独立地为H、卤素、拟卤素、CN、SR5、OR5、OC(O)R5、NR5R5、NR5R6、COOR5、NO2、C(O)5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
R、C(O)C(O)R、C(O)NRR、S(O)mR、S(O)mNRR、NRC(O)NRR、NRC(O)C(O)R、NRC(O)R、
5 5 5 8 5 5 5 5 5 5 8 5 5 5 5
NR(COOR)、NRC(O)R、NRS(O)mNRR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRC(O)C(O)NRR、或NRC(O)
5 6
C(O)NRR ；或任选取代的烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基；且

[0066] 各个R5、R6和R8独立地为H或任选被取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基。

[0067] 在多个实施方案中，上述化合物满足下面的条件：

[0068] 当R2是C(O)R5时，则R3不是甲基、2-丙基、环戊基或4-哌啶基；

[0069] 当各个X和X1是N并且R3是CH3时，则R4不是N(CH3)2或S-烷基；

[0070] 当Z、R1和R4为H；各个X和X1为N；R2为以下基团取代的CO：甲基、苯基、4-溴苯基、4-氯苯基、4-氯苯基、萘-2-基、(3-甲基-5-苯基)噻唑-2-基、4-(哌啶-1-基磺酰3
基)苯基、噻吩-2-基、或苯并噻唑-2-基时，则R 不是苯基、4-氯苯基或4-甲基苯基；

[0071] 当Z、R1和R4为H；各个X和X1为N；R2为CONH2时，则R3不是甲基、苯基或CH2OCH2CH2OH；

[0072] 当Z、R1和R4为H；各个X和X1为N；R2为烷氧基时，则R3不是叔丁基。

[0073] 当Z、R1和R4为H；各个X为N；X1为CH；R2为被以下基团在间位取代的苯甲酰基：NH2、NHSO2-(氯取代的苯基)、NHSO2-噻吩-2-基、NHCONH-(卤素或甲基取代的苯基)、3
NHCONH-(甲基苄基)、NHCONH-环己基、或NHCO-(氯代苯基)时；则R 不是CH2-环丙基；

[0074] 当Z、R1和R4为H；各个X为N；X1为CH；R3为CH2O-苄基、CH2O-烷基、烷基或烯基，其任选为以下基团取代：羟基、烷氧基、羟基烷基或羟基烷氧基；或任选取代的芳烷基时；2
则R 不是CONH2；

[0075] 当Z、R1和R4为H；各个X为N；X1为CH；R2为被以下基团取代的S-苯基：NH2、NC(O)3
O-叔丁基、NC(O)NH-(2-氟苯基)、NS(O)2-(单或二氟苯基)时；则R 不是环戊基；

[0076] 当Z、R1和R4为H；各个X和X1为CH；R3为2-(吗啉-1-基)亚乙基时；则R2不是CO-四甲基环丙烷；

[0077] 当Z、R1和R4为H；各个X和X1为CH；R3为甲基时，则R2不是COH或羧基；

[0078] 当Z、R1和R4为H；各个X为N；各个X1为N或CH，并且R3为4-(4-甲基-哌2
嗪-1-基)环己基、4-(N-吗啉基)环己基或苯基时，则R 不是CONH-(任选取代的苯基)或N(任选取代的苯基)C(O)(苯基或烷基苯基)；且

[0079] 当各个X和X1为N，R4为H或苯基，Z为H或任选取代的苯基，R1为H，且R2为NH-(吡3
啶基或任选取代的苯基)时，则R 不是甲基、羟基烷基、苄基或6-对甲苯基哒嗪-3-基。

[0080] 在一些实施方案中，上述化合物满足一个或多个下列条件：

[0081] 当R2为C(O)R5时，则R3不是甲基、2-丙基、环戊基或4-哌啶基；或在一些实施方3
案中，R 不是烷基或哌啶基；

[0082] 当各个X和X1为N并且R3是烷基时，则R4不是N(烷基)2或S-烷基；

[0083] 当Z、R1和R4为H；各个X和X1为N；R2为COR5或CONH2时，则R3不是甲基、3
CH2OCH2CH2OH，或任选烷基化或卤化的苯基；或在一些实施方案中，R 不是烷基、羟基烷氧基烷基或任选烷基化或卤化的苯基；

[0084] 当Z、R1和R4为H；各个X和X1为N；R2为烷氧基时，则R3不是叔丁基。

[0085] 当Z、R1和R4为H；各个X为N；X1为CH；R2是取代的苯甲酰基时；则R3不是烷基-环烷基；

[0086] 当Z、R1和R4为H；各个X为N；X1为CH；R3是任选取代的烷基或烯基时；则R2不是CONH2；

[0087] 当Z、R1和R4为H；各个X为N；X1为CH；R2为S-(取代的苯基)时，则R3不是环烷基；

[0088] 当Z、R1和R4为H时；各个X和X1为CH；

[0089] R3为烷基或吗啉基亚乙基时；则R2不是CO-环烷基、COH或羧基；

[0090] 当Z、R1和R4为H；各个X为N；X1为N或CH；并且R3为苯基或环烷基时，则R2不5 5 5
是CONHR 或NRC(O)R ；

[0091] 当各个X和X1为N，R4为H或苯基，Z为H或任选取代的苯基，R1为H，且R2为NH-(任3
选取代的苯基或吡啶基)时，则R 不是甲基、羟基烷基、苄基或6-对甲苯基哒嗪-3-基。

[0092] 在多个实施方案中，本发明化合物排除了一个或多个选自图1A、1B、1C、1D、1E、1F、3B、4B、8A、8B、8C、9A、9B、9C、或9D中的化合物。

[0093] 在多个实施方案中，化合物在图2、3A、4A、5A、5B、6或7中说明。在某些实施方案中，排除了一个或多个在图2、3A、4A、5A、5B、6或7中说明的化合物。在一些实施方案中，化合物选自表I。

[0094] 在多个实施方案中，R2独立地为SR9、OR5、OC(O)R5、NR5R5、NR5R6、COOR5、C(O)H、C(O)5 5 5 5 6 9 5 5 5 6 5 5 5 6 6 6
C(O)R、C(O)NRR、C(O)NRR、S(O)mR、S(O)mNRR、S(O)mNRR、NRC(O)NRR、NRC(O)NRR、
5 5 5 5 5 5 6 5 5 5 6 5 5 8
NRC(O)C(O)R、NRC(O)C(O)R、NRC(O)R、NRC(O)R、NR(COOR)、NR(COOR)、NRC(O)R、
6 8 5 5 5 6 6 6 5 5 6 5 5 8 6 8
NRC(O)R、NRS(O)mNRR、NRS(O)mNRR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、
5 5 5 6 5 6 5 5 6 2
NRC(O)C(O)NRR、NRC(O)C(O)NRR、或NRC(O)C(O)NRR。在某些实施方案中，R 独立
9 5 5 5 5 5 6 5 5 9 5 5
地为SR、OR、OC(O)R、NRR、NRR、COOR、C(O)H、C(O)C(O)R、S(O)mR、S(O)mNRR、S(O)
5 6 5 5 5 6 6 6 5 5 5 5 5 5 6 5
mNRR、NRC(O)NRR、NRC(O)NRR、NRC(O)C(O)R、NRC(O)C(O)R、NRC(O)R、NRC(O)R、
5 5 6 5 5 8 6 8 5 5 5 6 6 6 5 5
NR(COOR)、NR(COOR)、NRC(O)R、NRC(O)R、NRS(O)mNRR、NRS(O)mNRR、NRS(O)mR、
6 5 5 8 6 8 5 5 5 6 5 6 5
NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRC(O)C(O)NRR、NRC(O)C(O)NRR、或 NRC(O)C(O)
5 6 2 5 5 5 6 5 5 5 6 6 6 5
NRR。在一些实施方案中，R 独立地为NRR、NRR、NRC(O)NRR、NRC(O)NRR、NRC(O)
5 5 5 5 5 6 5 5 5 6 5 5 8 6
C(O)R、NRC(O)C(O)R、NRC(O)R、NRC(O)R、NR(COOR)、NR(COOR)、NRC(O)R、NRC(O)
8 5 5 5 6 6 6 5 5 6 5 5 8 6 8 5
R、NRS(O)mNRR、NRS(O)mNRR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRS(O)mR、NRC(O)C(O)
5 5 6 5 6 5 5 6
NRR、NRC(O)C(O)NRR、或NRC(O)C(O)NRR。

[0095] 在多个实施方案中，R2独立地为OR5。在一些实施方案中，R2独立地为SR9。在某2 5 5 5 6 2 9
些实施方案中，R 独立地为NRR 或NRR。在特定的实施方案中，R 独立地为S(O)mR、S(O)
5 5 5 6 5
mNRR 或S(O)mNRR。在多个实施方案中，R 独立地为任选取代的芳基或杂芳基，或在一些
9
实施方案中，为任选取代的烷基、环烷基或杂烷基。在多个实施方案中，R 可独立地包括任选取代的芳基或杂芳基，或在一些实施方案中，为任选取代的环烷基、杂烷基或具有2个或更多个碳的烷基。

[0096] 治疗以蛋白质运输受损为特征的病症的方法，其包括给予受试者以上述实施方案的任一化合物或使细胞与该化合物接触。

[0097] 在多个实施方案中，病症为溶酶体贮积症(lysosomal storage disorder)。在一些实施方案中，所述溶酶体贮积症为法布里病(Fabry disease)、法韦尔病(Farber disease)、戈谢病(Gaucher disease)、GM1-神经节苷脂贮积病(GM1-gangliosidosis)、泰-萨克斯病(Tay-Sachs disease)、桑德霍夫病(Sandhoffdisease)、GM2激活剂病(GM2 activator disease)、克拉伯病(Krabbe disease)、异染性脑白质营养不良(metachromatic leukodystrophy)、尼曼-皮克二氏病(A、B和C型)(Niemann-Pick disease(types A，B，and C))、胡尔勒病(Hurlerdisease)、沙伊病(Scheie disease)、亨特病(Hunter disease)、桑菲列普病(Sanfilippo disease)、莫尔丘病(Morquio disease)、马-拉病(Maroteaux-Lamydisease)、透明质酸酶缺乏症(hyaluronidase deficiency)、天冬氨酰葡糖胺尿症(aspartylglucosaminuria)、岩藻糖苷贮积症(fucosidosis)、甘露糖苷贮积症(mannosidosis)、欣德勒病(Schindler disease)、1型唾液酸贮积症(sialidosis type1)、蓬佩病(Pompe disease)、致密性成骨不全症(Pycnodysostosis)、蜡样脂褐质沉积症(ceroid lipofuscinosis)、胆固醇酯贮积症(cholesterol ester storagedisease)、沃尔曼病(Wolman disease)、多种硫酸酯酶缺乏症(Multiple sulfatase)、半乳糖涎酸贮积症(galactosialidosis)、粘多糖症(II、III和IV型)(mucolipidosis(types II，III，and IV))、胱氨酸贮积症(cystinosis)、唾液酸贮积症(sialic acidstorage disorder)、伴随马-舍综合征的乳糜微粒滞留病(chylomicron retentiondisease with syndrome)、赫曼斯基-普德拉克综合征
(Hermansky-Pudlak syndrome)、切-东二氏综合征(Chediak-Higashi syndrome)、Danon病(Danon disease)或Geleophysic发育不良(Geleophysic dysplasia)。在一些实施方案中，所述疾病的特征在于物质向细胞腔隙的递送受损。溶酶体贮积症综述于例如Wilcox(2004)J.Pediatr.144：S3-S14中。

[0098] 在一些实施方案中，以蛋白质运输受损为特征的疾病为囊性纤维化。囊性纤维化的特征可在于蛋白质运输受损、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)活性受损，或在于蛋白质运输受损且CFTR活性受损。

[0099] 在一些实施方案中，以蛋白质运输受损为特征的疾病为糖尿病类疾病(disbetes)，例如，糖尿病(diabetes mellitus)。在一些实施方案中，以蛋白质运输受损为特征的疾病不是糖尿病类疾病，例如，糖尿病。

[0100] 在一些实施方案中，以蛋白质运输受损为特征的疾病的特征在于物质向细胞腔隙的递送受损。

[0101] 在一些实施方案中，以蛋白质运输受损为特征的疾病的特征在于Rab27a突变或Rab27a 缺陷。该病症可以是，例如格里塞利综合征(Griscellisyndrome)。

[0102] 在多个实施方案中，该病症是突触核蛋白病。所述突触核蛋白病可以是帕金森氏病、家族性帕金森氏病、路易体疾病、阿尔茨海默病路易体变异型、路易体痴呆、多系统萎缩症或关岛震颤麻痹痴呆综合征。

[0103] 突触核蛋白为一族包括α-、β-和γ-突触核蛋白的小突触前神经元蛋白，其中只有α-突触核蛋白聚集体与一些神经疾病有关(Ian等人，ClinicalNeurosc.Res.1：445-455，2001；Trojanowski和Lee，Neurotoxicology23：457-460，2002)。从一些观测中揭示了突触核蛋白(且尤其是α-突触核蛋白)在许多神经变性和/或淀粉样蛋白病的病因学中的作用。病理学上，将α-突触核蛋白确定为路易体的主要成分，帕金森氏病的标志内含物，且其片段已从不同神经疾病、阿尔茨海默病的淀粉样斑中分离出。生物化学上，重组的α-突触核蛋白表现出形成淀粉样原纤维，其再现了从患有伴随路易体痴呆、帕金森氏病和多系统萎缩症的患者中分离的α-突触核蛋白的超微结构特征。而且，在α-突触核蛋白基因中的突变的鉴定(虽然仅在少数家族性帕金森氏病病例中)证明突触核蛋白病理学和神经变性病之间的明确的联系。在例如帕金森氏病、路易体痴呆(dementia with Lewy bodies)、多系统萎缩症和阿尔茨海默病的路易体变异型的疾病谱中通常涉及α-突触核蛋白，已经导致这些疾病分类到涵盖性的术语“突触核蛋白病”下。在一些实施方案中，所述以蛋白质运输受损为特征的疾病不是突触核蛋白病。

[0104] 在多个实施方案中，所述以蛋白质运输受损为特征的疾病为遗传性肺气肿(hereditary emphysema)、α-1- 抗胰蛋白酶缺乏症 (α-1-antitrypsin deficiency)、遗传性血色素沉着病(hereditary hemochromatosis)、眼皮肤白化病(oculocutaneous albinism)、蛋白质C缺乏(protein C deficiency)、I型遗传性血管性水肿(type I hereditary angioedema)、先天性蔗糖酶异麦芽糖酶缺乏(congenital sucrase-isomaltase deficiency)、II型克- 纳综合征 (Crigler-Najjar typeII)、拉龙综合征(Laron syndrome)、遗传性髓过氧物酶(hereditaryMyeloperoxidase)、原发性甲状腺机能减退症(primary hypothyroidism)、先天性长QT综合征(congenital long QT syndrome)、甲状腺素结合的球蛋白缺乏(thyroxine binding globulin deficiency)、家族性高胆固醇血症(familialhypercholesterolemia)、家族性乳糜微粒血症(familial chylomicronemia)、无β-脂蛋白血症(abeta-lipoproteinema)、低血浆脂蛋白a水平(low plasmalipoprotein a levels)、伴有肝受损的遗传性
肺气肿(hereditary emphysema withliver injury)、先天性甲状腺功能减退症
(congenital hypothyroidism)、成骨不全(osteogenesis imperfecta)、遗传性低纤维蛋白原血症(hereditaryhypofibrinogenemia)、α-1-抗糜蛋白酶缺乏症(α-1-antichymotrypsindeficiency)、肾性尿崩症(nephrogenic diabetes insipidus)、垂体神经性尿崩症(neurohypophyseal diabetes insipidus)、夏科-马里-图思综合征(Charcot-Marie-Tooth syndrome)、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(PelizaeusMerzbacher disease)、IIA型冯·威利布兰德病(von Willebrand disease type IIA)、结合因子V和VIII缺乏(combined factors V and VIII deficiency)、脊椎骨骺迟缓性发育不良(spondylo-epiphyseal dysplasia tarda)、无脉络膜症(choroideremia)、I细胞病(I cell disease)、巴藤病(Batten disease)、共济失调-毛细血管扩张症(ataxia telangiectasias)、急性成淋巴细胞性白血病(acutelymphoblastic leukemia)、急性髓细胞样白血病(acute myeloid leukemia)、髓细胞性白血病(myeloid leukemia)、ADPKD-常染色体显性多囊性肾病(ADPKD-autosomal dominant polycystic kidney disease)、微绒毛包含病(microvillus inclusion disease)、结节性硬化症(tuberous sclerosis)、洛氏眼-脑-肾综合征(oculocerebro-renal syndrome of Lowe)、肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)、骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndrome)、裸淋巴细胞综合征(Bare lymphocyte syndrome)、丹吉尔病(Tangierdisease)、家族性肝内胆汁淤积(familial intrahepatic cholestasis)、X-连锁肾上腺脑白质营养不良(X-linked adreno-leukodystrophy)、斯科特综合征(Scottsyndrome)、1型和2型赫曼斯基-普德拉克综合征(Hermansky-Pudlak syndrometypes 1 and 2)、
泽耳韦格综合征(Zellweger syndrome)、肢近端型点状软骨发育异常(rhizomelic chondrodysplasia puncta)、常染色体隐性原发性高草酸尿症(autosomal recessive primary hyperoxaluria)、Mohr Tranebjaerg综合征 (MohrTranebjaerg syndrome)、脊髓延髓性肌萎缩症(spinal and bullar muscularatrophy)、原发性纤毛运动障碍(卡塔格纳综合征)(primary ciliary diskenesia(Kartagener’s syndrome))、米-迪综合征(Miller Dieker syndrome)、无脑回畸形病(lissencephaly)、运动
神经元病(motor neuron disease)、乌斯赫尔综合征(Usher’s syndrome)、威斯科特-奥尔德里奇二氏综合征(Wiskott-Aldrichsyndrome)、Optiz综合征(Optiz
syndrome)、亨廷顿舞蹈病(Huntington’sdisease)、遗传性胰腺炎(hereditary pancreatitis)、抗磷脂综合征(anti-phospholipid syndrome)、重叠结缔组织病(overlap connective tissuedisease)、舍格伦综合征( syndrome)、
僵体综合征(stiff-mansyndrome)、Brugada 综合征(Brugada syndrome)、费氏先天性肾综合征(Finnishcongenital nephritic syndrome)、杜宾-约翰逊综合征
(Dubin-Johnsonsyndrome)、X-连锁低磷血症 (X-linked hypophosphosphatemia)、潘德雷德综合征(Pendred syndrome)、持续性幼儿型胰岛素过度分泌低血糖症
(persistenthyperinsulinemic hypoglycemia of infancy)、遗传性球形红细胞增多症(hereditary spherocytosis)、无铜蓝蛋白血症(aceruloplasminemia)、婴儿型神经元蜡样质脂褐质沉积病(infantile neuronal ceroid lipofuscinosis)、假性软骨发育不全和多重骨骺(pseudoachondroplasia and multiple epiphyseal)、斯塔加特样黄斑营养不良(Stargardt-like macular dystrophy)、X-连锁夏科-马里-图思病(X-linked Charcot-Marie-Tooth disease)、常染色体显性色素性视网膜炎(autosomal dominant retinitis pigmentosa)、Wolcott-Rallison综合征(Wolcott-Rallison syndrome)、库欣病(Cushing’s disease)、肢带型肌营养不良症(limb-girdle muscular dystrophy)、IV型粘多糖病(mucoploy-saccharidosistype IV)、芬兰型遗传性家族性淀粉样变性(Finnish hereditary familialamyloidosis)、IV型糖原贮积症(安德森病)(Glycogen storage disease type IV(Andersen’s disease))、肉瘤(sarcoma)、慢性骨髓单核细胞性白血病(chronicmyelomonocytic leukemia)、心肌病(cardiomyopathy)、面生殖发育异常(faciogenital dysplasia)、Torsion病(Torsion disease)、亨廷顿和脊髓小脑性共济失调(Huntington and spinocerebellar ataxias)、遗传性高同型半胱氨酸血症(hereditary hyperhomosyteinemia)、多发性神经病(polyneuropathy)、下位运动神经元病(lower motor neuron disease)、色素视网膜炎(pigmented retinitis)、血清阴性多关节炎(seronegative polyarthritis)、间质性肺纤维化(interstitialpulmonary fibrosis)、雷诺现象(Raynaud’s phenomenon)、韦格纳肉芽肿病 (Wegner’s granulomatosis)、蛋白尿 (preoteinuria)、CDG-Ia、CDG-Ib、CDG-Ic、CDG-Id、CDG-Ie、CDG-If、CDG-IIa、CDG-IIb、CDG-IIc、CDG-IId、埃勒斯-当洛斯综合征(Ehlers-Danlos syndrome)、多发性外生骨疣(multipleexostoses)、格里塞利综合征(Griscelli syndrome，1型或2型)或X-连锁非特异性智力发育迟缓(X-linked non-specific mental retardation)。以蛋白质运输受损为特征的病症综述于Aridor等人(2000)Traffic 1：
836-51和Aridor等人(2002)Traffic 3：781-90中。

[0105] 治疗以蛋白质运输受损为特征的病症的方法，其包括将图3B、4B、8A、8B、8C、9A、9B、9C或9D中任何一个所表示的化合物或其药学可接受的盐或衍生物给药于受试者或者与细胞进行接触。

[0106] 这些化合物也包括化合物的中性或非盐形式，例如在所要求保护的化合物和在附图、表I或实施例中所公开的具体化合物的中性或非盐形式。

[0107] 本文也提供了本文所述的化合物的药学可接受的衍生物，包括其盐、酯、烯醇醚、烯醇酯、溶剂合物、水合物和前药。药学可接受的盐包括，但不限于胺盐，例如但不限制于N，N′-二苄基亚乙基二胺、氯普鲁卡因、胆碱、氨、二乙醇胺和其它羟基烷基胺、亚乙基二胺、N-甲基葡萄糖胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙基胺、1-对氯苄基-2-吡咯烷-1′-基甲基苯并咪唑、二乙基胺和其它烷基胺、哌嗪和三(羟基甲基)氨基甲烷；碱金属盐，例如但不限制于锂、钾和钠；碱土金属盐，例如但不限制于钡、钙和镁；过渡金属盐，例如但不限制于锌，铝，和其它金属盐，例如但不限制于磷酸二氢钠和磷酸氢二钠；且包括但不限制于无机酸盐，例如但不限制于盐酸盐和硫酸盐；和有机酸盐，例如但不限制于乙酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、丁酸盐、戊酸盐和富马酸盐。

[0108] 本发明还提供了含有任何本文所述的化合物和药学可接受的载体的药物组合物。在一种实施方案中，配制该药物组合物用于单剂量给药。

[0109] 根据本文所述的方法治疗的受试者可以是人或其它哺乳动物，如小鼠、大鼠、牛、猪、狗、猫和猴。

[0110] 本发明也提供了制备蛋白质的方法，该方法包括下述步骤：在本文所述的化合物存在下(如表I中所述的化合物)培养细胞；纯化细胞产生的蛋白质，其中在所述化合物存在下培养细胞与该化合物不存在下培养细胞相比，导致产生了更多纯化的蛋白质。该蛋白质可以为异源核酸编码的重组蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质为分泌性蛋白和/或糖基化的蛋白质。例如，该蛋白质可以为细胞因子、淋巴因子、生长因子或抗体。用于蛋白质制备方法中的细胞可以为，例如昆虫细胞、哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)、真菌细胞或细菌细胞。

[0111] 在实施该方法时，给予有效量的所述化合物或包含治疗有效浓度的所述化合物的组合物。

[0112] 提供的制品包含包装物质、本文提供的用于治疗或改善蛋白质运输病症的一种或多种症状的化合物或组合物、以及说明所述化合物和组合物用于治疗或改善蛋白质运输病症的一种或多种症状的标签。

[0113] 在所附的附图和下述说明书中详细描述了本发明的一种或多种实施方案。通过说明书和附图以及权利要求书，本发明的其他特点、目的、和优点将是明显的。

附图说明

[0114] 图1a和1b描述了本文说明的某些化合物例如根据式I的化合物的结构。

[0115] 图1c和1d描述了某些化合物的结构。

[0116] 图1e描述了一些游离碱化合物的结构。

[0117] 图1f描述了一些作为盐酸盐的化合物的结构。

[0118] 图2描述了某些化合物的结构。

[0119] 图3A和3B描述了某些化合物的结构。

[0120] 图4A和4B描述了某些化合物的结构。

[0121] 图5A和5B描述了某些化合物的结构。

[0122] 图6描述了某些化合物的结构。

[0123] 图7描述了某些化合物的结构。

[0124] 图8A～8C描述了某些化合物的结构。

[0125] 图9A～9D描述了某些化合物的结构。

[0126] 图10A和11A显示了化合物25和5(见表1中的化合物结构)分别在从0～10μM的不同浓度下的Ypt1-ts蛋白质印迹数据与浓度的关系。

[0127] 图10B和11B是来自10A和11A的光密度数据曲线。

[0128] 发明详述

[0129] A.定义

[0130] 除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语为本发明所属领域技术人员通常理解的含义。虽然与本文所述的相似或等价的方法和材料可以用于本发明的实际应用或检测，但下述内容描述了优选的方法和材料。所有的专利、申请、公开的申请和其它出版物在此整个引入作为参考。当本文所用的术语具有多个含义时，除另有说明采用其常用含义。而且，所述材料、方法和实施例仅是示例性的而不是为了限制。

[0131] 本文也提供了治疗或改善蛋白质运输病症的一种或多种症状的方法。所述疾病包括例如囊性纤维化。

[0132] 在一些实施方案中，所述以蛋白质运输受损为特征的疾病为糖尿病类疾病，例如，糖尿病。

[0133] 在一些实施方案中，所述以蛋白质运输受损为特征的疾病为突触核蛋白病。突触核蛋白病的实例包括帕金森氏病、路易体病、阿尔茨海默病的路易体变异型、路易体的痴呆、多系统萎缩症或关岛震颤麻痹痴呆综合征。

[0134] 本文所用的α-突触核蛋白指结构相关蛋白家族中的一种，这类蛋白主要在中枢神经系统中表达。聚集的α-突触核蛋白形成脑损伤，所述脑损伤是一些神经变性疾病(突触核蛋白病症)的标志。对于α-突触核蛋白的基因(称作SNCA)，在染色体4q21上。一种形式的遗传帕金森氏病是由于SNCA中的突变。另一种形式的遗传帕金森氏病是由于SNCA的三倍体化。突触核蛋白是小、突触前神经蛋白家族，由α-、β-和γ-突触核蛋白组成，其中仅α-突触核蛋白聚集与几种神经疾病相关(Ian等人，Clinical Neurosc.Res.1：
445-455，2001；Trojanowski和Lee，Neurotoxicology 23：457-460，2002)。从一些观测中揭示了突触核蛋白(且尤其是α-突触核蛋白)在许多神经变性和/或淀粉样蛋白病的病因学中的作用。病理学上，确定α-突触核蛋白是路易体的主要成分，帕金森氏病的标志内含物，且其片段从不同神经疾病、阿尔茨海默病的淀粉样斑中分离。生物化学上，重组的α-突触核蛋白表现出形成淀粉样原纤维，其再现了从患有伴随路易体痴呆、帕金森氏病和多系统萎缩症的患者中分离的α-突触核蛋白的超微结构特征。而且，在α-突触核蛋白基因中的突变的鉴定(虽然仅在少数家族性帕金森氏病病例中)证明突触核蛋白病和神经变性病之间的明确的联系。α-突触核蛋白与疾病谱，例如帕金森氏病、路易体痴呆、多系统萎缩和阿尔茨海默病的路易体变型中的普遍相关，导致这些疾病被分类涵盖性的术语“突触核蛋白病症”下。

[0135] 在一些实施方案中，所述以蛋白质运输受损为特征的疾病不是突触核蛋白病。

[0136] 在一些实施方案中，所述以蛋白质运输受损为特征的疾病为溶酶体贮积症(lysosomal storage disorder)，如法布里病、法韦尔病、戈谢病、GM1-神经节苷脂贮积病、泰-萨克斯病、桑德霍夫病、GM2激活剂病、克拉伯病、异染性脑白质营养不良、尼曼-皮克二氏病(A、B和C型)、胡尔勒病、沙伊病、亨特病、桑菲列普病、莫尔丘病、马-拉病、透明质酸酶缺乏症、天冬氨酰葡糖胺尿症、岩藻糖苷贮积症、甘露糖苷贮积症、欣德勒病、1型唾液酸贮积症、蓬佩病、致密性成骨不全症、蜡样脂褐质沉积症、胆固醇酯贮积症、沃尔曼病、多种硫酸酯酶缺乏症、半乳糖涎酸贮积症、粘多糖症(II、III和IV型)、胱氨酸贮积症、唾液酸贮积症、伴随马-舍综合征的乳糜微粒滞留病、赫曼斯基-普德拉克综合征、切-东二氏综合征、Danon病或Geleophysic发育不良。溶酶体贮积症综述于，例如Wilcox(2004)J.Pediatr.144：S3-S14中。

[0137] 在一些实施方案中，以蛋白质运输受损为特征的疾病的特征在于物质向细胞腔隙的递送受损。

[0138] 在一些实施方案中，以蛋白质运输受损为特征的疾病的特征在于Rab27a突变或Rab27a缺陷。该病症可以是，例如格里塞利综合征(Griscellisyndrome)。

[0139] 在一些实施方案中，所述以蛋白质运输受损为特征的疾病为遗传性肺气肿、遗传性血色素沉着病、眼皮肤白化病、蛋白质C缺乏、I型遗传性血管性水肿、先天性蔗糖酶异麦芽糖酶缺乏、II型克-纳综合征、拉龙综合征、遗传性髓过氧物酶(hereditary Myeloperoxidase)、原发性甲状腺机能减退症、先天性长QT综合征、甲状腺素结合球蛋白缺乏、家族性高胆固醇血症、家族性乳糜微粒血症、无β-脂蛋白血症、低血浆脂蛋白a水平、伴有肝受损的遗传性肺气肿、先天性甲状腺功能减退症、成骨不全、遗传性低纤维蛋白原血症、α-1-抗糜蛋白酶缺乏症、肾性尿崩症、垂体神经性尿崩症、夏科-马里-图思综合征、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、IIA型冯·威利布兰德病、结合因子V和VIII缺乏、脊椎骨骺迟缓性发育不良、无脉络膜症、I细胞病、巴藤病、共济失调-毛细血管扩张症、急性成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞样白血病、髓细胞性白血病、ADPKD-常染色体显性多囊性肾病、微绒毛包含病、结节性硬化症、洛氏眼-脑-肾综合征、肌萎缩侧索硬化、骨髓增生异常综合征、裸淋巴细胞综合征、丹吉尔病、家族性肝内胆汁淤积、X-连锁肾上腺脑白质营养不良、斯科特综合征、1型和2型赫曼斯基-普德拉克综合征、泽耳韦格综合征、肢近端型点状软骨发育异常、常染色体隐性原发性高草酸尿症、Mohr Tranebjaerg综合征、脊髓延髓性肌萎缩症、原发性纤毛运动障碍(卡塔格纳综合征)、米-迪综合征、无脑回畸形病、运动神经元病、乌斯赫尔综合征、威斯科特-奥尔德里奇二氏综合征、Optiz综合征、亨廷顿舞蹈病、遗传性胰腺炎、抗磷脂综合征、重叠结缔组织病、舍格伦综合征、僵体综合征、Brugada综合征、费氏先天性肾综合征、杜宾-约翰逊综合征、X-连锁低磷血症、潘德雷德综合征、持续性幼儿型胰岛素过度分泌低血糖症、遗传性球形红细胞增多症、无铜蓝蛋白血症、婴儿型神经元蜡样质脂褐质沉积病、假性软骨发育不全和多重骨骺、斯塔加特样黄斑营养不良(Stargardt-like maculardystrophy)、X-连锁夏科-马里-图思病、常染色体显性色素性视网膜炎、Wolcott-Rallison综合征、库欣病、肢带型肌营养不良症、IV型粘多糖病(mucoploy-saccharidosis type IV)、芬兰型遗传性家族性淀粉样变性、IV型糖原贮积症(安德森病)、肉瘤、慢性骨髓单核细胞性白血病、心肌病、面生殖发育异常、Torsion病、亨廷顿和脊髓小脑性共济失调、遗传性高同型半胱氨酸血症、多发性神经病、下位运动神经元病、色素视网膜炎、血清阴性多关节炎、间质性肺纤维化、雷诺现象、韦格纳肉芽肿病、蛋白尿(preoteinuria)、CDG-Ia、CDG-Ib、CDG-Ic、CDG-Id、CDG-Ie、CDG-If、CDG-IIa、CDG-IIb、CDG-IIc、CDG-IId、埃勒斯-当洛斯综合征、多发性外生骨疣、格里塞利综合征(1型或2型)或X-连锁非特异性智力发育迟缓。以蛋白质运输受损为特征的病症综述于Aridor等人(2000)Traffic 1：836-51和Aridor等人(2002)Traffic 3：781-90中。

[0140] 本文所用的化合物的药学可接受衍生物包括其盐、酯、烯醇醚、烯醇酯、缩醛、缩酮、原酸酯、半缩醛、半缩酮、酸、碱、溶剂合物、水合物或前药。这些衍生物可以由本领域技术人员使用对于这些衍生化已知的方法方便地制备。制备的化合物可以给药至动物或人，而基本上不会产生毒性作用，且具有药学活性或为前药。

[0141] 药学可接受的酯包括，但不局限于：羧酸基团的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、环烷基和杂环基酯，包括但不局限于：羧酸、磷酸、次膦酸、磺酸、亚磺酸和硼酸。

[0142] 药学可接受的烯醇醚包括但不局限于：式C＝C(OR)的衍生物，其中R为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、环烷基或杂环基。

[0143] 药学可接受的烯醇酯包括，但不局限于：式C＝C(OC(O)R)的衍生物，其中R为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、环烷基或杂环基。药学可接受的溶剂合物和水合物为化合物与一个或多个溶剂或水分子，或1至约100，或1至约10，或1至约2、3或4个溶剂或水分子的复合物。

[0144] 本发明中也包括所公开化合物的药学可接受的盐。这些所公开的化合物具有一个或多个足够酸性的质子，其能与适合的有机或无机碱反应形成碱加成盐。当化合物具有与氧、氮或硫原子相连的氢原子时，认为所述化合物也包括其盐，其中该氢原子与适合的有机或无机碱反应形成碱加成盐。碱加成盐包括从无机碱例如铵或碱金属或碱土金属氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等衍生的，从有机碱例如醇盐、烷基酰胺、烷基和芳基胺等衍生的碱加成盐。因此这些用于制备本发明的盐的碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾等。

[0145] 例如，所公开化合物药学可接受的盐可包括所公开化合物与1当量适合的碱反应形成单价盐(即，所述化合物具有单个负电荷，其通过药学可接受的相反的阳离子，例如单价阳离子平衡)或与2当量适合的碱形成二价盐(例如，所述化合物具有2个电子的负电荷，其通过2个药学可接受的相反的阳离子，例如，2个药学可接受单价阳离子或单个药学可接受二价阳离子平衡)。“药学可接受”是指适合向受试者给药的阳离子。实例包括碱金+ + + 2+ 2+ 2+属阳离子，例如但不限于Li、Na、K ；碱土金属阳离子，例如但不局限于Ba 、Mg 、Ca ；过
2+ +
渡金属阳离子，例如但不局限于Zn 和其它金属盐；和NR4，其中各个R独立地为氢、任选被取代的脂肪族基团(例如，羟基烷基、氨基烷基、或铵烷基)或任选被取代的芳基，或两个R基团一起形成任选被取代的非-芳香杂环，其任选与芳环稠合。例如，盐可以通过与胺形成，所述胺包括但不局限于N，N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、氨、二乙醇胺和其它羟基烷基胺、乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙基胺、1-对氯苄基-2-吡咯烷-1′-基甲基-苯并咪唑、二乙胺和其它烷基胺、哌嗪和三(羟基甲基)氨基甲烷。在一+ + + + +
些实施方案中，所述药学可接受的阳离子为Li、Na、K、NH3(C2H5OH) 或N(CH3)3(C2H5OH)。

[0146] 具有足够碱性基团(例如胺)的所公开化合物的药学可接受的盐，可以通过所公开化合物与有机或无机酸反应形成酸加成盐而形成。通常用于与具有碱性基团的化合物形成酸加成盐的酸包括无机酸例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸等，和有机酸例如对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸等。这些盐的实例包括硝酸盐、硼酸盐、三氟乙酸盐、硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、丁酸盐、戊酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸、丁二酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1，4-二酸盐、己炔-1，6-二酸盐、抗坏血酸盐、水杨酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯基乙酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、乙醇酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、扁桃酸盐等。在一些实施方案中，所公开化合物与下述物质形成药学可接受：HCl、HF、HBr、HI、三氟乙酸或硫酸。尤其在一些实施方案中，所公开化合物与硫酸形成药学可接受的盐。

[0147] 多个实施方案涉及本文所述化合物的药学可接受的盐，其分别相对于化合物的游离碱。在一些实施方案中，药学可接受的盐为盐酸盐。

[0148] 本发明也包括药学可接受的溶剂合物。本文所用的术语″溶剂合物″指本发明的化合物或其盐进一步包括化学计量或非化学计量的溶剂，例如，水或有机溶剂，它们通过非共价分子内力结合。

[0149] 本文所用的治疗指任何方式，其中病症的一种或多种症状得到改善或以其它方式得到有利的改变。治疗也包括本文化合物和组合物的任何药物用途，例如治疗其中涉及蛋白质运输的病症的用途。治疗包括对患有蛋白质运输病症的受试者进行治疗性给药，其中该所述治疗可防止、阻止、延缓、停止、降低或中断蛋白质运输疾病的病因、发病率或症状。治疗也包括对具有患上蛋白质运输病症风险的受试者或蛋白质运输病症或症状发生恶化风险的受试者进行预防性给药。预防性给药所述化合物会降低患上蛋白质病症的风险，或蛋白质运输病症恶化的风险，其中该预防性给药会防止、阻止、延缓、停止、降低或中断上述风险的病因、发病率或症状。本文所用的通过给药特定的化合物或药物组合物而改善特定病症的症状是指任何减轻，永久的或暂时的，持续的或瞬时的，所述减轻归因于给药所述组合物或者与给药所述化合物有关。

[0150] 本文所用的IC50是指实现最大作用的50％抑制时具体检测化合物的量、浓度或剂量。

[0151] 本文所用的EC50是指导致剂量依赖响应为特定作用的50％最大表达的特定检测化合物的剂量、浓度或量，所述响应由特定检测化合物引起、引发或产生，例如在所述作用的测试中对CFTR(囊性纤维化跨膜传导调节蛋白)活性的调节。

[0152] 本文所用的最低拯救浓度(Minimum Rescue Concentration，MRC)是在观察到细胞生长或细胞活力恢复高于背景时化合物的最低浓度，观察到的细胞生长或细胞活力恢复高于背景作为由特定检测化合物引起、引发或产生的特定响应。例如，在细胞毒性环境下，例如在α-突触核蛋白诱导的细胞毒性中，可以拯救细胞活力或生长。而且，例如可以在温度敏感突变体存在时在限制性温度下测量细胞活力或生长。

[0153] 本文所用的前药是指一种化合物，其在体内给药后，通过一个或多个步骤或过程代谢或其它方式转化而代谢为生物学、药学或治疗活性形式的化合物。为了制备前药，修饰药学活性化合物使得活性化合物将通过代谢过程再次产生。可以设计前药以改变药物代谢稳定性或转运特性，以掩蔽副作用或毒性，以改善药物的味道，或以改变药物的其它特性或性质。根据体内药效学过程和药物代谢的知识，本领域技术人员在知晓药学活性化合物时，便能够设计该化合物的前药(参见，例如，Nogrady(1985)Medicinal Chemistry ABiochemical Approach，Oxford University Press，New York，第388-392页)。

[0154] 应该理解本文提供的化合物可以包含手性中心。这些手性中心可以为(R)或(S)构型，或可以为其混合物。因此，本文提供的化合物可以为对映体纯，或为立体异构或非对映异构混合物。在氨基酸残基的情况中，这些残基可以为L-或D-型。对于天然存在的氨基酸残基的构型通常为L。当没有特定指出时，残基为L型。本文所用的术语″氨基酸″是指α-氨基酸，其为外消旋体，或D-或L-构型。氨基酸符号前面的的符号″d″(例如，dAla、dSer、dVal等)是指氨基酸的D-异构体。氨基酸符号前面的符号″dl″(例如，dlPip)指氨基酸的L-和D-异构体的混合物。应该理解本文提供的化合物的手性中心在体内可能产生差向异构化。这样，本领域技术人员将认识到对于在体内产生差向异构化的化合物来说，给药(R)形式的化合物与给药(S)形式的化合物是相同的。

[0155] 本文所用的基本上纯是指足够的同质化(homogeneous)，使得当通过本领域技术人员用于检测杂质的标准分析方法(例如薄层色谱法(TLC)、凝胶电泳、高效液相色谱法(HPLC)和质谱(MS))检测时没有明显可检测的杂质，或指足够纯使得进一步纯化不能明显改变物质的物理和化学性质，例如酶和生物活性。纯化化合物以制备基本上化学纯的化合物的方法对于本领域技术人员是已知的。然而基本上化学纯的化合物可以为立体异构体的混合物。在这种情况中，进一步纯化可能提高该化合物的比活性。

[0156] 本文所用的“烷基”、“烯基”和“炔基”碳链，如果没有说明，则含有1～20个碳，或1或2～16个碳，并且在多个实施方案中为直链、支链或环状，或在一些实施方案中，为直链或支链。2～20个碳的烯基碳链，在一些实施方案中，含有1～8个双键，且2～16个碳的烯基碳链，在一些实施方案中，含有1～5个双键。2～20个碳的炔基碳链，在一些实施方案中，含有1-8个叁键，且2～16个碳的炔基碳链，在一些实施方案中，含有1～5个叁键。本文中示例性的烷基、烯基和炔基包括，但不局限于，甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、正丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、新戊基、叔-戊基、异己基、烯丙基(丙烯基)和炔丙基(丙炔基)。本文所用的低级烷基、低级烯基和低级炔基是指具有从约1或约2个碳至约6个碳的碳链。本文所用的″alk(en)(yn)yl″是指含有至少一个双键和至少一个叁键的烷基。

[0157] 本文所用的″环烷基″是指饱和单-或多-环体系，在一些实施方案中包含3～10个碳原子，在另一些实施方案中包含3～6个碳原子；环烯基和环炔基是指单-或多环体系，其分别包括至少一个双键和至少一个叁键。在一些实施方案中，环烯基和环炔基可以含有3～10个碳原子，对于环烯基，在另一些的实施方案中含有4～7个碳原子，而对于环炔基，在另外的实施方案中含有8～10个碳原子。环烷基、环烯基和环炔基的环体系可以包括一个环或2个或更多个环，它们以稠合、桥接或螺合方式连接在一起。″环alk(en)(yn)yl″是指含有至少一个双键和至少一个叁键的环烷基。

[0158] 本文所用的″芳基″是指任选被取代的含有6～19个碳原子的芳香单环或多环基团。“芳基”的实例包括苯基、联苯基等。芳基也包括稠合多环芳环体系，例如萘基、四氢萘基、芘基、蒽基、9，10-二氢蒽基、芴基、茚基、茚满基等，其中碳环芳环与一个或多个其它芳基、环烷基或脂肪族环稠合。

[0159] 本文所用的″杂芳基″是指任选被取代的单环或多环芳环体系，在某些实施方案中为约5至约15元环，其中环系统中的一个或多个原子，在多个实施方案中为1～4个，在一些实施方案中为1～3个环系统中的原子为杂原子，包括但不局限于，氮、氧或硫。杂芳基可任选与苯环稠合。杂芳基的实例包括任选被取代的吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、吡喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、1，2，3-三唑基、1，2，4-三唑基、四唑基、噻吩基、噻唑基、异噻唑基、呋喃基、噁唑基、异噁唑基等。杂芳基也包括稠合的多环芳环体系，其中杂芳环与一个或多个其它杂芳基、芳基、杂环基、环烷基或脂肪族环稠合，例如，任选被取代的喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、萘啶基、吡啶并嘧啶基、苯并噻吩基、苯并噻唑、苯并异噻唑基、噻吩并吡啶基、噻唑并吡啶基、异噻唑并吡啶基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、呋喃并吡啶基、噁唑并吡啶基、异噁唑并吡啶基、吲哚基、异吲哚基、苯并咪唑基、苯并吡唑基、吡咯并吡啶基、异吡咯并吡啶基、咪唑并吡啶基、吡唑并吡啶基等。

[0160] 作为本文取代基引入的任何环可以通过环中的任何可取代的原子结合。

[0161] 本文所用的″杂芳鎓″为在一个或多个杂原子上带有正电荷的杂芳基。

[0162] 本文所用的″杂环基″是指任选被取代的单环或多环非芳环体系，在多个实施方案中，为3～10元环，在另一个实施方案中，为4～7元环，在另一个实施方案中为5～6元环，其中在环体系中一个或多个，在一些实施方案中为1～4个，在某些实施方案中为1～3个原子为杂原子，包括但不局限于，氮、氧或硫。杂环基的实例包括噁唑啉基、噻唑啉基、噁唑烷基、噻唑烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩、吗啉代、硫吗啉代、吡咯烷基、哌嗪基、哌啶基、噻唑烷基等。在一些实施方案中，其中杂原子为氮，该氮任选被下述基团取代：烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、环烷基、杂环基、环烷基烷基、杂环基烷基、酰基、胍基，或该氮可以被季铵化形成铵，其中取代基如上所述选择。

[0163] 本文所用的“孤对电子”，当涉及氮原子上的取代变量时，指该取代变量表示相应氮的路易斯结构电子对，且没有取代官能团与所指位置结合。

[0164] 本文所用的″芳烷基″是指烷基，其中该烷基的一个氢原子被芳基替代。

[0165] 本文所用的″杂芳烷基″是指烷基，其中该烷基的一个氢原子被杂芳基替代。

[0166] 本文所用的″卤″、″卤素″或″卤代″指F、Cl、Br或I。

[0167] 本文所用的拟卤化物或拟卤素基团为卤化物的生物电子等排体或行为与卤化物基本上相似的基团。这些化合物可以以与卤素相同的方式使用或处理。拟卤化物包括但不局限于，氰化物、氰酸盐(酯)、硫氰酸盐(酯)、硒氰酸盐(酯)、三氟甲氧基和叠氮化物。

[0168] 本文所用的″卤代烷基″指烷基，其中一个或多个氢原子被卤素替代。该基团包括但不局限于，氯甲基、三氟甲基和1-氯-2-氟乙基。

[0169] 本文所用的″卤代烷氧基″指RO-，其中R为卤代烷基。

[0170] 本文所用的″亚磺酰基″或″亚硫酰基″指-S(O)-。本文所用的″磺酰基″或″硫酰基″指-S(O)2-。本文所用的″磺基″是指-S(O)2O-。

[0171] 本文所用的″羧基″是指二价基团，-C(O)O-。

[0172] 本文所用的″氨基羰基″是指-C(O)NH2。

[0173] 本文所用的″烷基氨基羰基″是指-C(O)NHR，其中R为烷基，包括低级烷基。本文所用的″二烷基氨基羰基″是指-C(O)NR′R，其中R′和R独立地为烷基，包括低级烷基；″羧酰胺(carboxamide)″是指式-NR′COR基团，其中R′和R独立地为烷基，包括低级烷基。

[0174] 本文所用的″二芳基氨基羰基″是指-C(O)NRR′，其中R和R′独立地选自芳基，包括低级芳基，例如苯基。

[0175] 本文所用的″芳基烷基氨基羰基″是指-C(O)NRR′，其中R和R′中的一个为芳基，包括低级芳基，例如苯基，且R和R′中的另一个为烷基，包括低级烷基。

[0176] 本文所用的″芳基氨基羰基″是指-C(O)NHR，其中R为芳基，包括低级芳基，例如苯基。

[0177] 本文所用的″羟基羰基″是指-COOH。

[0178] 本文所用的″烷氧基羰基″是指-C(O)OR，其中R为烷基，包括低级烷基。

[0179] 本文所用的″芳氧基羰基″是指-C(O)OR，其中R为芳基，包括低级芳基，例如苯基。

[0180] 本文所用的“杂芳氧基羰基”是指-C(O)OR，其中R为杂芳基，包括低级杂芳基，例如吡啶基。

[0181] 本文所用的″烷氧基″和″烷硫基″是指RO-和RS-，其中R为烷基，包括低级烷基。

[0182] 本文所用的″芳氧基″和″芳硫基″是指RO-和RS-，其中R为芳基，包括低级芳基，例如苯基。

[0183] 本文所用的″亚烷基″是指直链、支链或环状，在一些实施方案中为直链或支链的，二价脂肪族烃基，在多个实施方案中具有1至约20个碳原子，在另一个实施方案中，具有1～12个碳。在另一个实施方案中，亚烷基包括低级亚烷基。在亚烷基中可以任选插入一个或多个氧、硫，包括S(＝O)和S(＝O)2基团，或取代的或未取代的氮原子，包+括-NR-和-NRR-基团，其中氮取代基为烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基或COR′，其中R′为烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、-OY或-NYY，其中Y为氢、烷基、芳基、杂芳基、环烷基或杂环基。亚烷基包括，但不局限于，亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚丙基(-(CH2)3-)、亚甲基二氧基(-O-CH2-O-)、亚乙基二氧基(-O-(CH2)2-O-)。术语″低级亚烷基″是指具有1～6个碳的亚烷基。在一些实施方案中，亚烷基为低级亚烷基，包括1～3个碳原子的亚烷基。

[0184] 本文所用的″氮杂亚烷基″是指-(CRR)n-NR-(CRR)m-，其中n和m各自独立地为0～4的整数。本文所用的″氧杂亚烷基″是指-(CRR)n-O-(CRR)m-，其中n和m各自独立地为0～4的整数。本文所用的″硫杂亚烷基″是指-(CRR)n-S-(CRR)m-、-(CRR)n-S(＝O)-(CRR)m-和-(CRR)n-S(＝O)2-(CRR)m-，其中n和m各自独立地为0～4的整数。

[0185] 本文所用的″亚烯基″是指直链、支链或环状，在多个实施方案中为直链或支链的二价脂肪族烃基，在一些实施方案中具有2至约20个碳原子和至少一个双键，在其它实施方案中为1～12个碳。在另一些实施方案中，亚烯基包括低级亚烯基。在亚烯基中可以任选插入一个和多个氧、硫或取代的或未取代的氮原子，其中氮的取代基为烷基。亚烯基包括，但不局限于，-CH＝CH-CH＝CH-和-CH＝CH-CH2-。术语″低级亚烯基″是指具有2～6个碳的亚烯基。在一些实施方案中，亚烯基为低级亚烯基，包括3～4个碳原子的亚烯基。

[0186] 本文所用的″亚炔基″是指直链、支链或环状，在一些实施方案中为直链或支链的二价脂肪族烃基，在多个实施方案中具有2至约20个碳原子和至少一个叁键，在另一个实施方案中，为1～12个碳。在另一个实施方案中，亚炔基包括低级亚炔基。在亚炔基中可以任选插入一个和多个氧、硫或取代的或未取代的氮原子，其中氮的取代基为烷基。亚炔基，包括但不局限于，-C≡C-C≡C-、-C≡C-和-C≡C-CH2-。术语″低级亚炔基″是指具有2-6个碳的亚炔基。在一些实施方案中，亚炔基为低级亚炔基，包括3-4个碳原子的亚炔基。

[0187] 本文所用的″alk(en)(yn)ylene″是指直链、支链或环状，在一些实施方案中为直链或支链的二价脂肪族烃基，在多个实施方案中具有2至约20个碳原子和至少一个叁键和至少一个双键；在另一个实施方案中，为1～12个碳。在另一些实施方案中，alk(en)(yn)ylene包括低级alk(en)(yn)ylene。alk(en)(yn)ylene中可以任选插入一个或多个氧、硫或取代的或未取代的氮原子，其中氮的取代基为烷基。Alk(en)(yn)ylene包括但不局限于，-C＝C-(CH2)n-C≡C-，其中n为1或2。术语″低级alk(en)(yn)ylene″是指具有最多6个碳的alk(en)(yn)ylene。在一些实施方案中，alk(en)(yn)ylene具有约4个碳原子。

[0188] 本文所用的″亚环烷基″是指二价饱和单-或多环体系，在一些实施方案中为3～10个碳原子，在其它实施方案中为3～6个碳原子；亚环烯基和亚环炔基是指二价单-或多环体系，其分别包括至少一个双键和至少一个叁键。在一些实施方案中，亚环烯基和亚环炔基可含有3～10个碳原子，对于亚环烯基，在一些实施方案中含有4～7个碳原子，且对于亚环炔基，在一些实施方案中含有8～10个碳原子。亚环烷基、亚环烯基和亚环炔基的环体系可以包含一个环或2个或更多个环，它们可以以稠合、桥接或螺合方式结合在一起。″环alk(en)(yn)ylene″是指包括至少一个双键和至少一个叁键的亚环烷基。

[0189] 本文所用的″亚芳基″是指单环或多环，在一些实施方案中为单环，二价芳香基团，在多个实施方案中具有5至约20个碳原子和至少一个芳环，在另一个实施方案中，为5～12个碳。在另一些实施方案中，亚芳基包括低级亚芳基。亚芳基包括，但不局限于，1，
2-、1，3-和1，4-亚苯基。术语″低级亚芳基″是指具有6个碳的亚芳基。

[0190] 本文所用的″亚杂芳基″是指二价单环或多环芳环体系，在多个实施方案中，环中具有约5至约15个原子，其中环体系中的一个或多个，在一些实施方案中1-3个原子为杂原子(即非碳元素)，包括但不局限于，氮、氧或硫。术语“低级亚杂芳基”是指在环中具有5或6个原子的亚杂芳基。

[0191] 本文所用的″亚杂环基″是指二价单环或多环非芳香环体系，在一些实施方案中为3～10元，在多个实施方案中为4～7元，在另一个实施方案中，为5～6元，其中环体系中的一个或多个，包括1～3个原子为杂原子(即非碳元素)，包括但不局限于，氮、氧或硫。

[0192] 本文所用的″烷叉基″是指二价基团，例如＝CR′R″，其与另一个基团的一个原子相邻，形成双键。烷叉基包括，但不局限于，甲叉基(＝CH2)和乙叉基(＝CHCH3)。本文所用的″芳基烷叉基″是指烷叉基，其中R′或R″为芳基。″环烷叉基″为其中R′和R″相连形成碳环。″杂环叉基″为其中R′和R″中的至少一个在链中含有杂原子，且R′和R″相连形成杂环。

[0193] 本文所用的″酰氨基″是指二价基团-C(O)NH-。″硫代酰氨基″是指二价基团-C(S)NH-。″氧基酰氨基″是指二价基团-OC(O)NH-。″硫基酰氨基″是指二价基团-SC(O)NH-。″二硫酰氨基″是指二价基团-SC(S)NH-。″脲基″是指二价基团-HNC(O)NH-。″硫脲基″是指二价基团-HNC(S)NH-。

[0194] 本文所用的″氨基脲″是指-NHC(O)NHNH-。″羧酰肼基(Carbazate)″是指二价基团-OC(O)NHNH-。″异硫代羧酰肼基″是指二价基团-SC(O)NHNH-。″硫代羧酰肼基″是指二价基团-OC(S)NHNH-。″磺酰基肼基″是指二价基团-SO2NHNH-。″酰肼基″是指二价基团-C(O)NHNH-。″偶氮基″是指二价基团-N＝N-。″肼基″是指二价基团-NH-NH-。

[0195] 本文所用的″取代的烷基″、″取代的烯基″、″取代的炔基″、″取代的环烷基″、″取代的环烯基″、″取代的环炔基″、″取代的芳基″、″取代的杂芳基″、″取代的杂环基″、″取代的亚烷基″、″取代的亚烯基″、″取代的亚炔基″、″取代的亚环烷基″、″取代的亚环烯基″、″取代的亚环炔基″、″取代的亚芳基″、″取代的亚杂芳基″和″取代的亚杂环基″是指烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂环基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、亚芳基、亚杂芳基和亚杂环基分别被一个或多个，在一些实施方案中被1、2、3或4个取代基取代，其中所述取代基如本文“任选取代”的定义。

[0196] 对于任何上述基团(例如，烷基、环烷基、脂肪族、脂肪族环、亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基、杂亚烯基、杂亚炔基、杂环基、芳基和杂芳基)的可取代原子的适合的任选的取代基为那些基本上不干扰所公开化合物药学活性的取代基。“可取代的原子”为具有一个或多个可用价键或电荷以与取代基形成一个或多个相应共价键或离子键的原子。例如，具有一个可用效价的碳原子(例如，-C(-H)＝)可以形成单键，得到烷基(例如，-C(-烷基)＝)，具有两个可用效价的碳原子(例如，-C(H2)-)可以形成一个或两个单键，得到一个或两个取代基(例如，-C(烷基)(H)-、C(烷基)(Br))-)，或形成双键得到一个取代基(例如，-C(＝O)-)等。本文考虑的取代仅包括形成稳定化合物的取代。在一些实施方案中，某些合适的任选取代基可进一步被相应的合适任选取代基取代。在一些实施方案中，合适的任选取代基未被进一步取代。

[0197] 例如，对于可取代的碳原子适合的任选的取代基包括-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-NO2、-a a a a a a a a aN3、-OR、-C(O)R、-OC(O)R、-C(O)OR、-SR、-C(S)R、-OC(S)R、-C(S)OR、-C(O)SR、-C(S)a a a a a a a b a b a b a b a b
SR、-S(O)R、-SO2R、-SO3R、-OSO2R、-OSO3R、-PO2RR、-OPO2RR、-PO3RR、-OPO3RR、-N(RRa b a b c a c a a b a b
)、-C(O)N(RR)、-C(O)NRNRSO2R、-C(O)NRSO2R、-C(O)NRCN、-SO2N(RR)、-SO2N(RR)、-NRc a c a c a b c a b d c a b a a b
C(O)R、-NRC(O)OR、-NRC(O)N(RR)、-C(NR)-N(RR)、-NR-C(NR)-N(RR)、-NRN(RR)、-c a b a a b a a a
CR ＝CRR、-C≡CR、＝O、＝S、＝CRR、＝NR、＝NOR、＝NNR、任选被取代的烷基、任选被取代的环烷基、任选被取代的脂肪族、任选被取代的脂肪族环、任选被取代的杂环基、任a d
选被取代的苄基、任选被取代的芳基和任选被取代的杂芳基，其中R-R 各自独立地为-H或任选被取代的脂肪族、任选被取代的脂肪族环、任选被取代的杂环基、任选被取代的苄基、a b
任选被取代的芳基、或任选被取代的杂芳基或-N(RR)一起形成任选被取代的杂环基。在某些实施方案中，＝O被排除作为合适的任选取代基。

[0198] 对于氮原子(对于其它原子具有两个共价键)适合的取代基包括例如，任选被取代的烷基、任选被取代的环烷基、任选被取代的脂肪族、任选被取代的脂肪族环、任选被取代的杂环基、任选被取代的苄基、任选被取代的芳基、任
a a a a a
选被取代的杂芳基、-CN、-NO2、-OR、-C(O)R、-OC(O)R、-C(O)OR、-SR、-S(O)a a a a b a b a b c a c a
R、-SO2R、-SO3R、-N(RR)、-C(O)N(RR)、-C(O)NRNRSO2R、-C(O)NRSO2R、-C(O)NRCN、-Sa b a b c a c a c a b
O2N(RR)、-SO2N(RR)、-NRC(O)R、-NRC(O)OR、-NRC(O)N(RR)等。

[0199] 含氮基团，例如，杂芳基或非芳香杂环基可被氧取代形成N-氧化物，例如，吡啶基N-氧化物、哌啶基N-氧化物等。例如，在多个实施方案中，在含氮杂环基或杂芳基中的环氮原子可被取代形成N-氧化物。

[0200] 具有3个与其它原子结合的共价键的氮原子的适合取代基包括-OH、烷基和烷氧基(优选C1-6烷基和烷氧基)。对于具有3个与其它环原子结合的共价键的被取代的环氮原子带有正电荷，其通过相应于药学可接受的盐中的相反的阴离子平衡，所述药学可接受的盐例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、氢碘酸盐、甲酸盐、乙酸盐等。在下述适合的药理学可接受的盐部分中提供了其它适合的相反阴离子的实例。

[0201] 也应该理解一些所公开化合物可以以不同的立体异构体(例如，非对映异构体和对映异构体)得到，且本发明包括所公开化合物的所有异构体形式和外消旋混合物，和用纯的异构体或其混合物(包括外消旋混合物)治疗受试者的方法。立体异构体可以使用任何适合的的方法，例如色谱法进行分离和拆分。

[0202] 应该理解，一些所公开化合物可以以互变异构体存在或表示为互变异构体。互变异构体为通过氢原子或质子迁移结合相邻单键和双键的变换相互转化的化合物。在溶液中，其中可能互变异构化，可以达到互变异构体的化学平衡。互变异构体的确切比例依赖于多种因素，包括温度、溶剂和pH。

[0203] 当没有说明任何给定的取代基(例如卤代烷基)的数量时，则可能有一个或多个取代基存在，多至化学上尽可能的取代基的数量。例如“卤代烷基”可包括一个或多个相同或不同的卤素，例如氟代甲基、三氟甲基、氟二氯甲基等。

[0204] 除非另有说明，对于任何保护基、氨基酸和其它化合物，本文所用的缩写与通常使用的可识别的缩写，或与IUPAC-IUB Commission on BiochemicalNomenclature(参见，(1972)Biochem.11：942-944)一致。

[0205] B.化合物

[0206] 用于本文提供的组合物和方法中的本文提供的化合物表现出抗蛋白质运输介导的疾病和病症的活性。在多个实施方案中，这些化合物可以治疗或改善与蛋白质运输介导的疾病和病症相关的一种或多种症状。

[0207] C.化合物的制备

[0208] 在本文提供的组合物和方法中使用的化合物可以来自市售(例如，Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)，可以通过对于本领域技术人员已知的方法制备，或可以通过本文所述(下述部分和实施例部分)的方法制备。本领域技术人员将能够通过常规修饰方法使用适合的起始物质制备本文所用的所有化合物。

[0209] 本文提供的一些化合物可以通过下述合成途径制备。例如，方案1～28指出了许多以各种基团(例如R和Ar基团)对双环母核(例如吡唑并嘧啶)进行一般取代的方法。

[0210] 方案1

[0211] (方法A)

[0212]

[0213] 方案2

[0214] (方法B)

[0215]

[0216] 方案3

[0217] (方法C)

[0218]

[0219] 方案4

[0220] (方法D)

[0221]

[0222] 方案5

[0223] (方法E)

[0224]

[0225] 方案6

[0226] (方法F)

[0227]

[0228]

[0229] 方案7

[0230] (方法G)

[0231]

[0232] 方案8说明了3-卤素取代的双环系统，例如所示的3-碘代吡咯并嘧啶，的合成方法。虽然实施所述的方案8的Mitsunobu型反应并没有使用保护基团，但是其他反应可受益于对4-氨基基团的保护，例如使用本领域已知的合适的氨基保护基团和合适的对氨基进行保护和脱保护策略，例如在T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，2nd Ed.，JohnWiley and Sons(1991)中所描述的，将其全部教导引入本文作为参考。例如，合适的氨基保护基团包括苄氧基羰基、叔丁氧基羰基、叔丁基、苄基和芴基甲氧基羰基(Fmoc)。

[0233] 方案8

[0234] (方法H)

[0235]

[0236] 方案9说明了可用于制备多个本发明化合物的氨基保护的化合物的合成方法。随后可对该化合物进行脱保护。

[0237] 方案9

[0238] (方法I)

[0239]

[0240] 方案10～15描述了多种在本发明化合物的1-N位引入取代基的方法，或用于制备本发明化合物的中间体：

[0241] 方案10

[0242] (方法J)

[0243]

[0244] 对于用于进行方案10中所说明的转化的反应的说明，参见例如Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，17(14)，4075-4079；2007；Journal ofMedicinal Chemistry，50(1)，10-20；2007；Bioorganic & Medicinal Chemistry，14(4)，1078-1088；2006；及PCT Int.Appl.，2007012953，2007年2月1日。将上述文献的所有教导引入本文作为参考。

[0245] 方案11

[0246] (方法K)

[0247]

[0248] 对于用于进行方案11中所述的转化的反应的说明，见Tetrahedron，31(6)，587-91；1975，将其全部教导引入本文作为参考。

[0249] 方案12

[0250] (方法L)

[0251]

[0252] 对于用于进行方案12中所述的转化的反应的说明，见例如Journal oftheChemical Society，Perkin Transactions 1：Organic and Bio-Organic
Chemistry(1972-1999)，(11)，2795-802；1979，将其全部教导引入本文作为参考。

[0253] 方案13

[0254] (方法M)

[0255]

[0256] 对于用于进行方案13中所述的转化的反应的说明，参见例如Journal ofOrganic Chemistry，53(4)，794-9；1988，将其全部教导引入本文作为参考。

[0257] 方案14

[0258] (方法N)

[0259]

[0260] 对于用于进行方案14中所述的转化的反应的说明，参见例如OrganicLetters，5(11)，1899-1902；2003，将其全部教导引入本文作为参考。

[0261] 方案15

[0262] (方法O)

[0263]

[0264] 对于用于进行方案15中所述的转化的反应的说明，见例如Journal ofOrganic Chemistry，54(7)，1664-8；1989，将其全部教导引入本文作为参考。

[0265] 在方案10～15中说明的方法可适用于其他的起始化合物。参见例如Journal of Heterocyclic Chemistry(1969)，6(2)，207-13，将其全部教导引入本文作为参考，起始物质诸如5-卤素-4-氨基-吡咯并[2，3-d]嘧啶，例如已知的5-溴-4-氨基-吡咯并[2，3-d]嘧啶：

[0266]

[0267] 可以使用的起始物质例如3-溴-4-硝基-吲哚(Albany Molecular Research，Albany，NY)和3-溴-4-硝基-吲唑(参见Journal of Heterocyclic Chemistry(1979)，16(8)，1599-603)，将其全部教导引入本文作为参考。

[0268]

[0269] 在例如上述的化合物中，硝基可以根据本领域已知的方法还原成氨基。也可参见例如在方案5和6中描述的方法。

[0270] 方案16说明了在3位以磺酰胺进行衍生化的方法，该方法通过用氯磺酸处理例如在方案16中所示的未取代的合适保护的起始物质，再用胺处理。

[0271] 方案16

[0272] (方法P)

[0273]

[0274] 参见例如Asian Journal of Chemistry，17(2)，980-984；2005和Tetrahedron，62(8)，1699-1707；2006，将其全部教导引入本文作为参考。

[0275] 本发明的某些化合物可以从如在方案17和18中所示的式1的化合物开始制备，其中X是氧或氮。

[0276]

[0277] 方案17

[0278] (方法Q)

[0279]

[0280] 方案18

[0281] (方法R)

[0282]

[0283] 缩合可提供如式2结构所示的期望的吡唑，其在上述方法中可用作起始物质。参见例如WO 1998014449、WO 1998014450和WO 1996031510，将其全部教导引入本文作为参考。

[0284] 另外，多种化合物可以由在方案19中的式III结构所表示的3-卤代起始物质，使用金属催化的偶联方法合成。

[0285] 方案19

[0286] (方法S)

[0287]

[0288] 这些方法包括例如Ullman偶联，例如由Buchwald和Hartwig独立开发的钯和/或铜。这些偶联方法例如JACS 2006，128，8742-8743，JACS 2007，129，3490-3491，和Topic in Current Chemistry 2002，219，131-209，AngewanteChemie Int.Engl.Ed.2006 454321-4326，将其全部教导引入本文作为参考。在这些方法的一些应用中，有用的是使用合适的羟基或氨基保护基团，这些保护基团可由R′和R″表示。当R′和R″是合适的保护基团时，如本文所述脱保护可得到可被进一步衍生化的中间体，参见例如综述文章Angew.Chem.Int.Ed.Eng.2003，42，5400-5451，将其全部教导引入本文作为参考。

[0289] 如在方案20中描述的硫醚类似物可使用如下方法来完成构建：以硫醇、N-甲基吗啉和碘化铜在合适的溶剂中在高温下处理相应的3-卤素(例如碘)取代的化合物。通过氧化可得到相应的亚砜和砜类似物。参见例如WO 2004056830，将其全部教导引入本文作为参考。

[0290] 方案20

[0291] (方法T)

[0292]

[0293] 在方法T的第一步骤中，也可以分离到二聚体，例如化合物457：

[0294]

[0295] 如在Heterocycles(Southwick，P.，Dhawan，B.，1975，11，1999)和J.Chem.Soc.，Perkin Trans 1(Hanefeld，U.et al.，1996，1545)中所述，将其全部教导引入本文作为参考，可通过吡咯或吡唑与合适的腈或脒(方案21)缩合在6位引入取代基。

[0296] 方案21

[0297] (方法U)

[0298]

[0299] 方案22描述了一种经关键的甲醇中间体制备各种3-取代的吡唑并[3，4-d]嘧啶的方法。如在J.Chem.Soc.，Perkin Trans 1(Hanefeld，U.et al.，1996，1545)中所述，将其全部教导引入本文作为参考，合成始于保护的酰氯和丙二腈，再制备烯醇醚，该烯醇醚与合适的肼反应得到取代的吡唑。环化得到吡唑并[3，4-d]嘧啶，在脱除保护(例如苄基)得到甲醇中间体。该甲醇中间体可被氧化形成甲酰基衍生物，其通过与亲核试剂例如格氏试剂反应得到醇，该醇又可通过本领域技术人员熟知的方法还原成相应的烷基类似物。本领域技术人员将理解的是例如所述甲醇衍生物、甲酰基衍生物、或醇的中间体也可用作许多新颖的化合物的前体。

[0300] 方案22

[0301] (方法V)

[0302]

[0303] 在3位有烷氧基和芳氧基取代的化合物的另一种构建方法(方案23)始于保护的醇与四氰乙烯的缩合，如J.Amer.Chem.Soc.(Middleton，W.J.，Engelhardt，V.A.，1958，80，2788)所述，将其全部教导引入本文作为参考。与合适的肼环化得到吡唑，再形成嘧啶环，从而提供了得到保护的3-羟基化合物。(本领域技术人员将理解的是始于期望的醇而不是保护的醇会直接得到最终化合物)。脱除保护后，再烷基化或芳基化，得到期望的化合物。

[0304] 方案23

[0305] (方法W)

[0306]

[0307] N-1位杂环取代基衍生化可通过在方案24中所示的方法完成。脱除N杂环已有的保护基，在通过例如还原性烷基化进行烷基化，或通过在J.Org.Chem.(Ahmed，F.A-M.，et al.，1996，61，3849)和Advanced Organic Chemistry(Smith，M.B.，March J.，Wiley，2001，p 501-511)中说明的方法芳基化得到期望的衍生物，将两文献的全部教导引入本文作为参考。

[0308] 方案24

[0309] (方法X)

[0310]

[0311] 方案25简要地说明了C-2取代的吡唑并[2，3-d]嘧啶的制备方法。当R4表示氢时，该方法制备了C-2未取代的吡咯并[2，3-d]嘧啶。该方法始于合适取代的苯乙酮衍生的卤化物(X＝卤素)，其通过与胺发生亲核置换得到氨基-酮化合物，该化合物可以以盐(例如盐酸盐、氢溴酸盐等)或游离碱形式分离。使氨基-酮化合物与丙二腈，在碱(例如甲醇钠、氢化钠、氢氧化钾等)存在时，在有水或无水有机溶剂(例如甲醇、乙醇、四氢呋喃、二氧杂环己烷、甲苯等)中反应得到2-氨基-3-氰基吡咯衍生物，如在Bioorg.Med.Chem.Lett.(Dropinski，J.F.，2005，15，5035)和J.Chem.Soc.(Darroll，J.et al.，1960，82，131)中所述，将其全部教导引入本文作为参考。与甲酰胺进行环化得到取代的吡咯并[2，3-d]嘧啶化合物。

[0312] 方案25

[0313] (方法Y)

[0314]

[0315] 在N-1位具有各种取代基的吡咯并[2，3-d]嘧啶的构建方法(方案26)始于六亚甲基-四胺与卤代苯乙酮的缩合，如在Bioorg.Med.Chem.Lett.(Wilder，L.et al.，2001，11，1849和Altmann，E.et al.，2001，11，853)中所述，将其全部教导引入本文作为参考。
以例如乙酰基保护，再进行两次环化反应得到未取代的吡咯并[2，3-d]嘧啶。例如通过烷基化、酰基化、磺酰基化和芳基化的衍生化可通过本领域技术人员已知的方法进行，如在Bioorg.Med.Chem.Lett.(Altman，E.等，2001，11，853；Dropinski，J.F.等，2005，15，5035；
及Arnold，L.D.等，2000，10，2167)中所述。

[0316] 方案26

[0317] (方法Z)

[0318]

[0319] C-4氨基的衍生化可通过以衍生试剂(例如烷基、芳基或酰基卤化物)在合适的条件下处理化合物完成，如在Advanced Organic Chemistry(Smith，M.B.，March J.，Wiley，2001，p 501-511)和J.Org.Chem.(Bio，M.M.等，2004，69，6257)中所说明的，将其全部教导引入本文作为参考。在第二步中可引入与首先引入的基团相同或不同的第二基团。

[0320] 方案27

[0321] (方法AA)

[0322]

[0323] 一些吡咯并[2，3-d]嘧啶可从C-3卤代的前体方便地构建，如在方案28中所示。该方法适于未取代的吡咯并[2，3-d]嘧啶的卤化，再通过常规的方法进行N-1衍生化，常规的方法例如卤化物或含有良好离去基团(例如甲磺酸酯(mesylate)、甲苯磺酸酯(tosylate)等)的另一化合物的亲电烷基化。随后卤化物与芳基硼酸(或酯)、有机锌化合物、有机锡化合物或格氏试剂进行过渡金属催化偶联，而形成了3-芳基取代的吡咯并[2，3-d]嘧啶。根据常规的方法，金属催化偶联卤化物与取代的苯酚、噻吩或苯胺衍生物得到吡咯并[2，3-d]嘧啶的C-3杂原子连接的芳香族衍生物(Y＝O，S，NR)，如Angewand.Chem.(Burgos，C.H.等，2006，45，4321)，Org.Lett.(Ma，D.，Cai，Q.，2003，5，3799和Buck，E.等，
2002，4，1623)中所说明的，将其全部教导引入本文作为参考。

[0324] 方案28

[0325] (方法BB)

[0326]

[0327] 通过上述方案制备的具体化合物的合成也在实施例中指出。表I显示了化合物的编号、结构、测量的熔点、质谱(API-ES)和合成方法。

[0328]

[0329]

[0330]

[0331]

[0332]

[0333]

[0334]

[0335]

[0336]

[0337]

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[0365]

[0366]

[0367]

[0368]

[0369]

[0370]

[0371]

[0372] 此外，在合成全部范围的公开化合物中使用的合成化学官能团的转换在本领域是已知的，并且包括例如在R.Larock，Comprehensive OrganicTransformations，VCH Publishers(1989)；L.Fieser和M.Fieser，Fieser andFieser′s reagents for organic Synthesis，John Wiley和Sons(1994)；以及L.Paquette，ed.，Encyclopedia of reagents for organic Synthesis，John Wiley和Sons(1995)中所描述的。这些文件的全部教导引入本文作为参考。例如从上述合成开始，可制备具有例如-OH的取代基的终产物。适当的将-OH基团转换为另一种公开的取代基例如卤素的技术是已知的。例如，-OH可转换为-Cl，例如使用氯化试剂，例如亚硫酰氯或N-氯代琥珀酰亚胺，任选组合使用紫外线照射。

[0373] 对于在合成所公开的化合物中，适当的保护基团和使用保护基团进行保护和脱保护官能团的策略在本领域是已知的，并且包括例如在T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第2版，John Wiley和Sons(1991)中所描述的，其全部教导在此引用作为参考。例如，适当的羟基保护基团包括但不局限于取代的甲基醚类(例如，甲氧基甲基、苄氧基甲基)、取代的乙基醚类(例如，乙氧基甲基、乙氧基乙基)、苄基醚类(苄基、硝基苄基、卤代苄基)、硅基醚类(例如，三甲基硅基)、酯等。适当胺保护基团的实例包括苄氧基羰基、叔-丁氧基羰基、叔丁基、苄基和芴基甲氧羰基(Fmoc)。适当的巯基保护基团包括苄基、叔丁基、乙酰基、甲氧基甲基等。

[0374] 本文描述的反应可在对特殊反应中的试剂和产物适当的任何溶剂中进行。适当的溶剂可促进预期反应，但不与反应试剂或产物反应。适当的溶剂可包括，例如：醚溶剂，例如乙醚或四氢呋喃；酮溶剂例如丙酮、甲基乙基酮或乙酸乙酯；卤代溶剂例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳或三氯乙烷；芳香族溶剂例如苯、甲苯、二甲苯、或吡啶；极性非质子性有机溶剂例如乙腈、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、六甲基磷酰胺、硝基甲烷、硝基苯等；极性质子性溶剂例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇、四乙二醇等；非极性烃类例如戊烷、己烷、环己烷、环戊烷、庚烷、辛烷等；碱性胺溶剂例如吡啶、三乙胺等；和其他本领域已知的溶剂。

[0375] 对水敏感的反应或试剂可在无水条件下处理。对氧敏感的反应或试剂可在惰性气氛下处理，例如氮气、氦气、氖气、氩气等。对光敏感的反应或试剂可在黑暗中或用适当的滤过照明中处理。

[0376] 对温度敏感的反应或试剂，例如对高温敏感的试剂或放热的反应可在温度控制条件下进行。例如，强烈放热的反应可在冷却至较低温度时进行。

[0377] 没有强烈放热的反应可在较高温度下进行，从而促进目标反应，例如通过加热至反应溶剂的回流温度。反应也可在微波辐射条件下进行。例如在各个方法实施方案中，第一和第二试剂在微波辐射条件下一起反应。

[0378] 反应也可在大气压下、相对于大气压的减压条件、或相对于大气压的升压条件下进行。例如，还原反应可在氢气升压伴随氢化催化剂存在条件下进行。

[0379] 反应可按试剂的化学计量比，或一种或多种试剂过量的条件下进行。例如，在方案3方法C的最后一步中，第一个反应物，有机卤素3-溴-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺，可按对以ArB(OH)2表示的芳基硼酸反应物的摩尔比约为20∶1、10∶1、5∶1、
2.5∶1、2∶1、1.5∶1、1.3∶1、1.2∶1、1.1∶1、1∶1、0.91∶1、0.83∶1、0.77∶1、
0.67∶1、0.5∶1、0.4∶1、0.2∶1、0.1∶1或0.5∶1使用。通常，第一个反应物可按对第二反应物的摩尔比约为5∶1、2.5∶1、2∶1、1.5∶1、1.3∶1、1.2∶1、1.1∶1、
1∶1、0.91∶1、0.83∶1、0.77∶1、0.67∶1、0.5∶1、0.4∶1使用。在一些实施方案中，第一个反应物可按对第二反应物的摩尔比约为1.5∶1、1.3∶1、1.2∶1、1.1∶1、
1∶1、0.91∶1、0.83∶1、0.77∶1或0.67∶1使用。更优选地，第一个反应物可按对第二反应物的摩尔比在约在1.1∶1和0.9∶1之间，通常约1∶1使用。在这种或其他反应中的其他试剂可以以相同或不同比例使用。

[0380] D.药物组合物的制剂

[0381] 本文提供的药物组合物含有治疗有效量的一种或多种本文提供的化合物以及药学可接受的载体，所述化合物可用于治疗或改善与蛋白质运输相关的病症或其中涉及蛋白质运输的病症的一种或多种症状。适合于本文提供的化合物给药的药学载体包括任何本领域技术人员已知的适于特殊给药方式的载体。

[0382] 而且，化合物可作为组合物中的单个药学活性成分进行配制，或可以与其它活性成分组合。

[0383] 所述组合物含有一种或多种本文提供的化合物。在多个实施方案中，将化合物配制为适合的药物制剂，如对于口服给药的溶液、混悬剂、片剂、分散片剂、九剂、胶囊、散剂、持续释放的制剂或酏剂，或对于胃肠外给药的无菌溶液或混悬剂，以及透皮贴片制剂和干粉吸入剂。在多个实施方案中，使用本领域已知的技术和方法将上述化合物配制为药物组合物(参见例如AnselIntroduction to Pharmaceutical Dosage Forms，第4版，1985，126)。

[0384] 在组合物中，一种或多种有效浓度的化合物或其药学可接受衍生物与适当的药物载体混合。化合物可在制剂前衍生为如上所述对应的盐、酯、烯醇醚或酯、缩醛、缩酮、原酸酯、半缩醛、半缩酮、酸、碱、溶剂合物、水合物或前药。组合物中的化合物的浓度对于给药后递送的量是有效的，该量可治疗或改善与蛋白质运输受损相关的或其中涉及蛋白质运输的病症的一种或多种症状。

[0385] 在多个实施方案中，配制该组合物为单一剂量给药。为配制组合物，将一定重量份的化合物以有效浓度溶解、混悬、分散或混合入所选的载体中，使得所治疗的病况得以缓解或一种或多种症状得以改善。

[0386] 在药学可接受载体中包括的活性化合物的量足够产生治疗有用作用，对治疗患者没有不期望的副作用。治疗有效浓度可通过在本文描述的体外和体内系统中检测化合物经验确定(见，例如，实施例1)和通过美国专利申请号10/826,157，2004年4月16日提交，和美国专利申请公开号2003/0073610中所述确定，再从其推测人使用剂量。

[0387] 在药物组合物中活性化合物的浓度依赖于活性化合物的吸收、失活和排泄率，化合物的物理化学特性，疗程剂量和给药量，以及本领域技术人员已知的其他因素。例如，递送量足够改善本文所描述的与蛋白质运输有关的或其中涉及蛋白质运输的病症的一种或多种症状。

[0388] 在多个实施方案中，治疗有效的剂量应该产生活性成分的血清浓度为约0.1ng/ml至约50～100μg/ml。在另一个实施方案中，药物组合物应该提供的剂量为约0.001mg至约2000mg化合物每千克体重每天。制备的药物剂量单位形式为约0.01mg、0.1mg或1mg至约500mg、1000mg或2000mg，且在多个实施方案中为约10mg至约500mg活性成分或主要成分的组合每剂量单位形式。

[0389] 给药活性成分可以一次进行或以间隔的时间多次小剂量给药。应该理解治疗的精确剂量和持续时间依赖所要治疗的疾病，且使用已知的检测方法或通过从体内或体外检测数据推测而经验地确定。应该注意浓度和剂量的值也可以根据待减轻的病症的严重程度而改变。将进一步理解的是对于任何特定的受试者，特定的给药方法应该根据个体需要和给药或指导给药组合物的人的专业判断而随时间调整，且本文所述的浓度范围仅是示例性的且不是为了限制要求保护的组合物的范围或应用。

[0390] 在其中化合物呈现不足的溶解性的情况下，可以使用增溶化合物的方法。这些方法是本领域技术人员已知的，且包括，但不限于，使用共溶剂，如二甲亚砜(DMSO)；使用表面活性剂，如TWEEN ；或溶于碳酸氢钠水溶液中。在配制有效的药物组合物时，也可以使用化合物的衍生物，如化合物的前药。

[0391] 混合或加入化合物后，所得混合物可以为溶液、混悬液、乳液等。所得混合物的形式依赖于许多因素，包括打算的给药方式和化合物在所选载体或溶媒中的溶解度。有效浓度足以改善要治疗的疾病、病症或病况的症状且可以经验的确定。

[0392] 对于向人和动物给药，以单位剂型提供药物组合物，如片剂、胶囊、丸剂、散剂、颗粒剂、无菌胃肠外溶液或混悬剂，和口服溶液或混悬剂，和含有适合量的化合物或其药学可接受的衍生物的油-水乳剂。在多个实施方案中，以单位剂量形式或多剂量形式配制和给药药物治疗活性化合物及其衍生物。如本领域是已知的，本文所用的单位剂量形式是指用于人和动物受试者的物理离散的单位和被单个包装。每个单位剂量含有预定量的治疗活性化合物(其足以产生所需的治疗效果)，以及所需的药物载体、溶媒或稀释剂。单位剂量形式的实例包括安瓿和注射剂和单个包装的片剂或胶囊。单位剂量形式可以以其部分或加倍给药。多剂量形式为多个包装在单个容器中的相同单位剂量形式，以分离的单位剂量形式给药。多剂量形式的实例包括药水瓶、药片或胶囊瓶、或品脱或加仑瓶。因此，多剂量形式为多个在包装中不分离的单位剂量。

[0393] 液体药物给药的组合物，可以例如，通过将上述定义的活性化合物，和任选药物佐剂溶解、分散或混合到载体中，所述载体例如，水、盐水、葡萄糖水溶液、甘油、乙二醇、乙醇等，由此形成溶液或混悬液。如果需要，待给药的药物组合物也可以含有少量的无毒辅助物质，如润湿剂、乳化剂、助溶剂、pH缓冲剂等，例如，乙酸盐、柠檬酸钠、环糊精衍生物、去水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、三乙醇胺油酸酯和其它这类试剂。

[0394] 制备这些剂型的实际方法是已知的，或对于本领域技术人员是明显的；例如，参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，第15版，1975。

[0395] 可以制备含有0.005％至100％活性成分和由无毒载体组成平衡成分的剂型或组合物。制备这些组合物的方法对于本领域技术人员是已知的。关注的组合物可含有0.001％～100％活性成分，在一个实施方案中为0.1～95％，在另多个实施方案中为75～
85％。

[0396] 1.用于口服给药的组合物

[0397] 口服药物剂型为固体、凝胶或液体。固体剂型为片剂、胶囊、颗粒剂和整装散剂。口服片剂的类型包括压制片剂、咀嚼锭剂和包衣肠溶衣、糖衣或膜衣的片剂。胶囊可以为硬或软明胶胶囊，而颗粒剂和散剂可以以非泡腾或泡腾形式与其它本领域技术人员已知的成分混合提供。

[0398] a.用于口服给药的固体组合物

[0399] 在某些实施方案中，所述制剂为固体剂型，在多个实施方案中，为胶囊或片剂。片剂、丸剂、胶囊、含片等可以含有一种或多种下述成分或相似性质的化合物：粘合剂；润滑剂；稀释剂；助流剂；崩解剂；着色剂；甜味剂；香味剂；润湿剂；催吐包衣；和膜包衣。粘合剂的实例包括微晶纤维素、西黄蓍胶、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶溶液、糖蜜、聚乙烯吡咯烷、聚维酮、交联聚维酮、蔗糖和淀粉糊。润滑剂包括滑石粉、淀粉、硬脂酸镁或硬脂酸钙、石松(lycopodium)和硬脂酸。稀释剂包括，例如，乳糖、蔗糖、淀粉、高岭土、盐、甘露醇和磷酸氢钙。助流剂包括，但不限于，胶体二氧化硅。崩解剂包括交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、海藻酸、玉米淀粉、土豆淀粉、膨润土、甲基纤维素、琼脂和羧甲基纤维素。着色剂包括，例如，任何批准上市的水溶性FD和C染料，其混合物；和水不溶性的混悬于水合氧化铝的FD和C染料。甜味剂包括蔗糖、乳糖、甘露醇和人造甜味剂如糖精和任何量的喷雾干燥的矫味剂。香味剂包括从植物(如水果)中提取的天然香味剂和产生舒适的感觉的合成混合物，如，但不限制于薄荷和水杨酸甲酯。润湿剂包括丙二醇单硬脂酸酯、去水山梨糖醇单油酸酯、二甘醇单硬脂酸酯和聚氧乙烯月桂醚。催吐包衣包括脂肪酸、脂肪、蜡、虫胶、氨基化的虫胶和醋酸邻苯二甲酸纤维素。膜包衣包括羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙二醇4000和醋酸邻苯二甲酸纤维素。

[0400] 化合物，或其药学可接受的衍生物可以在组合物中提供，该组合物保护化合物不与胃的酸环境接触。例如，组合物可以配制在肠溶衣中，其在胃中保持完整且在小肠中释放活性化合物。组合物也可以与抗酸剂或其它这类成分组合配制。

[0401] 当剂量单位形式为胶囊时，除上述物料外它可含有液体载体，如脂肪油。而且，剂量单位形式可以含有多种其它改变剂量单位物理形式的物料，例如，糖和其它肠溶试剂的包衣。化合物也可以作为酏剂、混悬剂、糖浆剂、薄片(wafer)、喷洒剂、咀嚼胶等的成分给药。除活性化合物外，糖浆剂可含有作为甜味剂的蔗糖和一些防腐剂、染料和着色剂、和矫味剂。

[0402] 活性物质也可以与其它不损害所需作用的活性物质混合，或与补充所需作用的物质混合，如抗酸剂、H2阻断剂、和利尿剂。活性成分为本文所述的化合物或其药学可接受的衍生物。可以包括较高浓度，最多约98重量％的活性成分。

[0403] 在所有实施方案中，片剂和胶囊制剂可以通过本领域技术人员已知的方法包衣以改变或保持活性成分的溶出。因此，例如，它们可以用常规肠可消化的包衣来包衣，如水杨酸苯酯、蜡和醋酸邻苯二甲酸纤维素。

[0404] b.用于口服的液体组合物

[0405] 液体口服剂型包括水溶液、乳剂、混悬剂、从非泡腾颗粒重构的溶液和/或混悬剂、和从泡腾颗粒重构的泡腾制剂。水溶液包括，例如，酏剂和糖浆剂。乳剂为水包油或油包水。

[0406] 酏剂是澄清的、加甜的含水酒精制剂。在酏剂中使用的药学可接受的载体包括溶剂。糖浆剂为浓缩的糖(例如，蔗糖)水溶液，且可以含有防腐剂。乳剂为二相体系，其中一种液体以小球形式分散到另一种液体。乳剂中使用的药学可接受的载体为非水液体、乳化剂和防腐剂。混悬剂使用药学可接受的助悬剂和防腐剂。待重构为液体口服剂型的非泡腾颗粒中使用的药学可接受的物质包括稀释剂、甜味剂和润湿剂。待重构为液体口服剂型的泡腾颗粒中使用的药学可接受的物质包括有机酸和二氧化碳源。在所有上述剂型中使用着色剂和香味剂。

[0407] 溶剂包括甘油、山梨糖醇、乙醇和糖浆。防腐剂的实例包括甘油、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、苯甲酸钠和酒精。在乳剂中使用的非水液体的实例包括矿物油和棉子油。乳化剂的实例包括明胶、阿拉伯胶、西黄蓍胶、膨润土和表面活性剂，如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯。助悬剂包括羧甲基纤维素钠、果胶、西黄蓍胶、硅酸镁铝(Veegum)和阿拉伯胶。甜味剂包括蔗糖、糖浆剂、甘油和人造甜味剂，如糖精。润湿剂包括丙二醇单硬脂酸酯、去水山梨糖醇单油酸酯、二甘醇单月桂酸酯和聚氧乙烯月桂醚。有机酸包括柠檬酸和酒石酸。二氧化碳源包括碳酸氢钠和碳酸钠。着色剂包括任何批准上市的水溶性FD和C染料及其混合物。香味剂包括从植物(如水果)中提取的天然矫味剂，和产生好的味道感觉的化合物的合成混合物。

[0408] 对于固体剂型，在多个实施方案中，在例如碳酸丙烯(propylenecarbonate)、植物油或甘油三酯中的溶液或混悬液包裹在明胶胶囊中。这些溶液，及其制备和胶囊化公开于美国专利4,328,245；4,409,239；和4,410,545中。对于液体剂型，为了对于给药方便测量，例如，在聚乙二醇中的溶液可以用足量的药学可接受的液体载体(如水)稀释。

[0409] 或者，液体或半固体口服制剂可以通过将活性化合物或盐溶解或分散到植物油、乙二醇、甘油三酯、丙二醇酯(如碳酸丙烯)和其它这类载体中而制备，并将这些溶液或混悬液包裹在硬或软明胶胶囊壳中。其它有用的制剂包括美国专利RE28,819和4,358,603中所述的那些。简而言之，这些制剂包括，但不限于，含有本文提供的化合物的那些制剂，二烷基化的单-或多-亚烷基二醇，包括但不限制于，1，2-二甲氧基甲烷、二甘醇二甲醚、三甘醇二甲醚、四甘醇二甲醚、聚乙二醇-350-二甲基醚、聚乙二醇-550-二甲基醚、聚乙二醇-750-二甲基醚，其中350、550和750是指聚乙二醇近似的平均分子量；和一种或多种抗氧化剂，如丁基化的羟基甲苯(BHT)、丁基化的羟基苯甲醚(BHA)、没食子酸丙酯、维生素E、对苯二酚、羟基香豆素、乙醇胺、卵磷脂、脑磷脂、抗坏血酸、苹果酸、山梨糖醇、磷酸、硫代二丙酸及其酯、和二硫代氨基甲酸酯。

[0410] 其它制剂包括但不限于，含醇水溶液包括药学可接受的缩醛。在这些制剂中使用的醇为任何具有一个或多个羟基的药学可接受的与水混溶的溶剂，包括但不限制于，丙二醇和乙醇。缩醛包括，但不限于，低级烷基醛的二(低级烷基)缩醛，如乙醛缩二乙醇(acetaldehyde diethyl acetal)。

[0411] 2.注射剂、溶液和乳剂

[0412] 在多个实施方案中，本文也考虑胃肠外给药，其特征为注射，如皮下、肌内或静脉内。注射剂可以常规形式制备，作为液体溶液或混悬剂，适合注射前液体形式的溶液或混悬液的固体形式，或乳剂。注射剂、溶液和乳剂也含有一种或多种赋形剂。适合的赋形剂为，例如，水、盐水、葡萄糖、甘油或乙醇。而且，如果需要，待给药的药物组合物也可以含有少量无毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、增溶剂和其它这类试剂，例如，乙酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺和环糊精。

[0413] 本文也考虑了缓释或持续释放体系的植入使得维持一定的剂量水平(参见，例如美国专利3,710,795)。简而言之，将本文提供的化合物分散到惰性基质中，如聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸丁酯、增塑或未增塑的聚氯乙烯、增塑的尼龙、增塑的聚对苯二甲酸乙二酯、天然橡胶、聚异戊二烯、聚异丁烯、聚丁二烯、聚乙烯、亚乙基-乙酸乙烯共聚物、硅酮橡胶、聚二甲基硅氧烷、硅酮碳酸酯共聚物、亲水聚合物如丙烯酸酯和甲基丙烯酸的水凝胶、胶原、交联聚乙烯醇和交联的部分水解的聚醋酸乙烯酯，该基质被外层聚合物膜包裹，所述聚合物膜如聚乙烯、聚丙烯、亚乙基/亚丙基共聚物、亚乙基/丙烯酸乙酯共聚物、亚乙基/乙酸乙烯共聚物、硅酮橡胶、聚二甲基硅氧烷、氯丁橡胶、氯化的聚乙烯、聚氯乙烯、氯乙烯与乙酸乙烯的共聚物、偏二氯乙烯、亚乙基和亚丙基、离子聚合物聚对苯二酸乙烯酯、丁基橡胶表氯醇橡胶、亚乙基/乙烯醇共聚物、亚乙基/乙酸乙烯/乙烯醇三聚物和亚乙基/乙烯基氧基乙醇共聚物，该基质不溶于体液。化合物在控制释放速度的步骤中通过外部聚合物膜扩散。在这些胃肠外组合物中含有的活性化合物的百分比极大地依赖于其特定的性质，以及化合物的活性和受试者的需要。

[0414] 组合物的胃肠外给药包括静脉、皮下和肌内给药。胃肠外给药的制剂包括准备用于注射的无菌溶液、准备在使用前与溶剂混合的无菌干燥的可溶物质如冻干粉末(包括皮下注射用片剂)、准备用于注射的无菌混悬剂、准备在使用前与溶媒混合的无菌干燥不溶物质和无菌乳剂。溶液可以是水溶液或非水溶液。

[0415] 如果静脉给药，适合的载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲的盐水(PBS)、和含有增稠剂和增溶剂的溶液，如葡萄糖、聚乙二醇、和聚丙二醇及其混合物。

[0416] 胃肠外制剂中使用的药学可接受的载体包括水性溶媒、非水溶媒、抗菌剂、等渗试剂、缓冲剂、抗氧化剂、局麻剂、助悬和分散剂、乳化剂、遮蔽或螯合剂和其它药学可接受的物质。

[0417] 水性溶媒的实例包括氯化钠注射液、林格注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液、葡萄糖和乳酸盐林格注射液。非水胃肠外溶媒包括植物源的不挥发油、棉子油、玉米油、麻油和花生油。抑制细菌和真菌浓缩物中的抗菌剂必须加入到包装在多剂量容器中的胃肠外制剂中，所述抗菌剂包括苯酚或甲酚、汞剂、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗试剂包括氯化钠和葡萄糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括亚硫酸氢钠(sodium bisulfate)。局麻剂包括普鲁卡因盐酸盐。助悬和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙甲纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨酯80(TWEEN 80)。金属离子的掩蔽或螯合剂包括EDTA。对于水可混溶的溶媒，药物载体也包括乙醇、聚乙二醇和丙二醇；和用于调节pH的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。

[0418] 调节药物活性化合物的浓度使得注射剂提供有效量以提供所需的药理学作用。如在本领域是已知的，使用的剂量依赖于患者或动物的年龄、体重和病况。

[0419] 单位剂量的胃肠外制剂包装在安瓿、小瓶或有针的注射器中。如本领域是已知和已使用的，所有胃肠外给药的制剂必须是无菌的。

[0420] 示例性地，含有活性化合物的无菌水溶液的静脉或动脉内输注是有效的给药方式。另一个实施方案是含有视需要的可注射活性物质的无菌水性或油性溶液或混悬剂以产生所需的药理学作用。

[0421] 将注射剂设计为局部或全身给药。在多个实施方案中，配制治疗有效剂量使所含浓度为至少约0.1％w/w至约90％w/w或更多，在一些实施方案中向被治疗的组织给药多于1％w/w的活性化合物。

[0422] 化合物可以以微粒化或其它适合的形式混悬，或可以衍生化以产生更易溶的活性产物或产生前药。所得混合物的形式依赖于许多因素，包括打算的给药方式和化合物在所选载体或溶媒中的溶解度。有效浓度足以改善病况的症状，且可以被经验地确定。

[0423] 3.冻干粉末

[0424] 本文也关注冻干粉末，其可以重构作为溶液、乳剂和其它混合物给药。它们也可以重构和配制为固体或凝胶。

[0425] 通过将本文提供的化合物或其药学可接受的衍生物溶解在适合的溶剂中而制备无菌冻干粉末。所述溶剂可以含有提高粉末或从粉末制备的重构溶液的稳定性的赋形剂或其它药理学成分。可以使用的赋形剂包括，但不限于，葡萄糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其它适合的试剂。所述溶剂也可以含有缓冲剂，如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或其它本领域技术人员已知的缓冲剂，在多个实施方案中，约为中性pH。随后，无菌过滤溶液，然后在本领域技术人员已知的标准条件下冻干得到所需制剂。在多个实施方案中，将所得溶液均分到用于冻干的小瓶中。每个小瓶将含有单一剂量或多剂量的化合物。冻干粉末可以在适合的条件下储存，如在约4℃至室温。

[0426] 用于注射的冻干粉末与水的重构提供了用于胃肠外给药的制剂。为了重构，将冻干粉末加入到无菌水或其它适合的载体中。精确的量依赖于所选的化合物。该量可以被经验地确定。

[0427] 4.局部给药

[0428] 制备局部混合物，如对于局部和全身给药所述。所得混合物可以是溶液、混悬剂、乳剂等，且可以配制为乳膏、凝胶、软膏、乳剂、溶液、酏剂、洗剂、混悬剂、酊剂、糊剂、泡沫剂、气雾剂、冲洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带、皮肤贴片或任何适合局部给药的制剂。

[0429] 化合物或其药学可接受的衍生物可以配制为用于局部应用的气雾剂，如通过吸入(参见例如美国专利4,044,126、4,414,209和4,364,923，它们描述了用于递送甾体的气雾剂，用于治疗炎症疾病，尤其是哮喘)。这些用于向呼吸道给药的制剂可以为气雾剂或用于喷雾的溶液，或用于吸入的微细粉末，单独或与惰性载体(如乳糖)组合。在这种情况下，在多个实施方案中，该制剂的颗粒将具有小于50微米的直径，在多个实施方案中小于10微米。

[0430] 化合物可以配制用于部分或局部使用，如对于皮肤和粘膜的局部使用，如用于眼，以凝胶、乳膏和洗剂的形式，且用于施用到眼或用于脑池内或脊柱内施用。局部给药被考虑用于透皮递送且也用于向眼或粘膜给药，或用于吸入治疗。可以单独给药活性化合物的鼻部溶液或与其它药学可接受的赋形剂组合给药。

[0431] 这些溶液，尤其是打算眼用的溶液，可以与适合的盐配制为0.01％-10％等渗溶液，pH约为5-7。

[0432] 5.对于其它给药途径的组合物

[0433] 本文也考虑了其它给药途径，如包括离子电渗和电泳设备的透皮贴片，和直肠给药。

[0434] 包括离子电渗和电泳设备的透皮贴片是本领域技术人员已知的。例如，这些贴片描述于美国专利6,267,983、6,261,595、6,256,533、6,167,301、6,024,975、6,010715、5,985,317、5,983,134、5,948,433和5,860,957中。

[0435] 例如，用于直肠给药的药物剂型为直肠栓剂、用于全身作用的为胶囊和片剂。本文所用的直肠栓剂是指插入到直肠的固体，该固体在体温下融化或软化释放一种或多种药理或治疗活性成分。在直肠栓剂中使用的药学可接受的物质为基质或溶媒和提高熔点的试剂。基质的实例包括可可脂(可可豆油)、甘油-明胶、碳蜡(聚乙二醇)和适合的脂肪酸单-、二和三甘油酯的混合物。可以使用多种基质的组合。提高栓剂熔点的试剂包括鲸蜡和蜡。直肠栓剂可以通过压制方法或模制制备。在多个实施方案中，直肠栓剂的重量为约2至3mg。

[0436] 用于直肠给药的片剂和胶囊使用与口服给药的制剂相同的药学可接受的物质和方法制备。

[0437] 6.靶向制剂

[0438] 本文提供的化合物或其药学可接受的衍生物也可以配制为靶向于特定在治疗的受试者的组织、受体或身体其它区域。许多靶向方法是本领域技术人员公知的。本文考虑所有这些靶向方法用于即用组合物(instantcompositions)中。靶向方法的非限制性实例参见，例如美国专利6,316,652、6,274,552、6,271,359、6,253,872、6,139,865、6,131,570、6,120,751、6,071,495、6,060,082、6,048,736、6,039,975、6,004,534、5,985,307、
5,972,366、5,900,252、5,840,674、5,759,542和5,709,874。

[0439] 在多个实施方案中，脂质体混悬剂，包括靶向组织的脂质体，如靶向肿瘤的脂质体，也可以适合作为药学可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备。例如，脂质体制剂可以如美国专利4,522,811中所述的方法制备。简而言之，脂质体，如多层小囊泡(MLV′s)可以通过干燥卵磷脂酰基胆碱和脑磷脂酰基丝氨酸(7∶3摩尔比)到烧瓶内侧上而成形。加入本文提供的化合物在没有二价阳离子的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的溶液，且振荡烧瓶直到脂质膜分散。洗涤所得小囊泡以移除未包裹的化合物，通过离心沉淀，然后再悬于PBS中。

[0440] 7.制品

[0441] 化合物或药学可接受衍生物可包装为制品(articles of maufacture)，所述制品包含包装材料、本文提供的化合物或药学可接受衍生物，所述包装物质中的化合物或药学可接受衍生物可有效调节蛋白质运输，或用于治疗或改善涉及蛋白质运输的病症的一种或多种症状，以及说明化合物或组合物或其药学可接受衍生物的标签，而这些化合物或组合物或其药学可接受衍生物用于调节调节蛋白质运输，或用于治疗或改善涉及蛋白质运输的病症的一种或多种症状。

[0442] 本文提供的制品包含包装材料。用于包装药物产品的包装材料对于本领域技术人员是已知的。见，例如美国专利号5,323,907、5,052,558和5,033,252。药物包装材料的实例包括，但不局限于泡罩包装、瓶子、导管、吸入器、泵、袋子、小瓶、容器、注射器、瓶子和任何适于所选制剂和预期给药方式和治疗的包装物质。本文提供的化合物和组合物的大量制剂被考虑作为任何涉及蛋白质运输的病症的多种治疗，作为这些症状或病因的调节剂或作用剂。

[0443] 8.缓释制剂

[0444] 本文也提供了持续释放制剂以高循环浓度(在10-9和10-4M之间)向理想靶点(即大脑或全身器官，例如肺)递送化合物。在治疗囊性纤维化的某些实施方案中，可维持化合-7物的循环浓度，例如高达10 M。该浓度的化合物可以在患者系统性地循环，或在许多实施方案中，存在于期望的靶器官中，或在某些实施方案中，位于特定的组织、细胞、病变等中，例如在期望的靶器官中。

[0445] 要理解的是，在一定时间内维持化合物水平是需要的，且该水平可以由本领域技术人员简单地确定。在多个实施方案中，可以给予缓释制剂使得在48至96小时血清中治-8 -6疗化合物的一定水平维持在10 至10 M。

[0446] 该持续和/或定时(timed)释放的制剂可以通过本领域技术人员公知的递送设备的持续释放工具制备，如描述于美国专利3,845,770；3,916,899；3,536,809；3,598,123；4,008,719；4,710,384；5,674,533；5,059,595；5,591,767；5,120,548；5,073,543；
5,639,476；5,354,556和5,733,566中的设备，这些公开内容在此引入作为参考。这些药物组合物可以用于提供缓慢或持续释放一种或多种活性化合物，例如，使用羟丙甲纤维素、其它聚合物基质、凝胶、渗透膜、渗透体系、多层包衣、微粒、脂质体、微球等。本领域技术人员已知的适合的持续释放制剂(包括本文所述的那些)可以根据本文提供的药物组合物的使用方便地选择。因此，本文考虑了适合口服给药的单一单位剂型，如但不限制于，片剂、胶囊、软胶囊、小胶囊、粉末等，它们适合用于持续释放。

[0447] 在多个实施方案中，持续释放的制剂含有活性化合物如，但不限制于微晶纤维素、麦芽糊精、乙基纤维素和硬脂酸镁。如上所述，本文考虑了所有已知的与所公开的化合物的性质相容的胶囊化方法。持续释放的制剂通过包衣颗粒胶囊化，或通过本文提供的药物组合物颗粒与可变厚度的缓慢溶解的聚合物胶囊化，或通过微囊化。在多个实施方案中，用可变厚度(如约1微米至200微米)的包衣材料胶囊化持续释放的制剂，使得药物组合物在向哺乳动物给药约48小时至约72小时后溶解。在另多个实施方案中，包衣材料为食品添加剂。

[0448] 在其它实施方案中，持续释放的制剂为基质溶解设备，其通过将药物与缓慢溶解的聚合物载体压制成片而制备。在多个实施方案中，包衣的颗粒具有的粒径为约0.1至约300微米，如美国专利4,710,384和5,354,556所述，将其全部内容引入本文作为参考。每个颗粒为微基质形式，其中活性成分均匀地分布在聚合物中。

[0449] 本文公开了持续释放制剂，如美国专利4,710,384所述，将其全部引入作为参考，该制剂在包衣中具有相对高百分比的增塑剂，使得提供足够的柔性在压制期间基本上防止断裂。增塑剂的特定的量根据包衣的性质和所用的特定增塑剂改变。该量可以通过检测形成的片剂的释放特性经验性的方便的确定。如果药物释放太快，那么使用更多的增塑剂。释放特性也依赖于包衣的厚度。当使用基本量的增塑剂时，包衣的持续释放能力降低。因此，包衣的厚度可以稍微增加以补偿增塑剂的量的增加。通常，在该实施方案中的增塑剂将以包衣中持续释放物质的约15至30％的量存在，在多个实施方案中为20至25％，且包衣的量将为活性物质重量的10至25％，且在另多个实施方案中，为活性物质重量的15至20％。可以向包衣中掺入任何常规药学可接受的增塑剂。

[0450] 本文提供的化合物可以配制为持续和/或定时释放的制剂。所有持续释放的药物产品具有的通常的目的是与非持续释放的类似物相比提高药物疗效。理想地，在药物治疗中最佳设计的持续释放制剂的用途的特征在于使用最少的药物治愈或控制疾病。持续释放的制剂的优点可以包括：1)组合物的延长的活性，2)降低剂量频率，和3)增加患者顺应性。而且，持续释放制剂可以用于影响发作时间或其它特点，如组合物的血液浓度，且因此能够影响副作用的发生。

[0451] 设计本文提供的持续释放的制剂以初始提供一定量的治疗组合物，其迅速产生所需的治疗效果，且逐渐和持续释放其它量的组合物以在延长的时间内维持产生治疗作用的水平。为了在身体中保持一定水平，治疗组合物必须从剂型中以一定速率释放，新释放的组合物将代替被代谢和从身体排泄的组合物。

[0452] 活性成分的持续释放可以被多种诱导因素影响，例如pH、温度、酶、水或其它生理条件或化合物。

[0453] 可以适合的配制口服给药的制剂以得到控释的活性化合物。在多个实施方案中，将化合物配制为分开的微粒的控释粉末，其可以以液体形式方便地配制。持续释放的粉末包含含有活性成分和任选含至少一种无毒聚合物的赋形剂的颗粒。

[0454] 粉末可以分散或混悬于液体溶媒中，且在有用的时间内将维持其释放特点。这些分散剂或混悬剂同时具有化学稳定性和溶解速度稳定性。该粉末可以含有含聚合物的赋形剂，其可以是可溶的、不溶的、可渗透的、不可渗透的或生物可降解的。所述聚合物可以是聚合物或共聚物。所述聚合物可以为天然或合成的聚合物。天然的聚合物包括多肽(如玉蜀黍蛋白)、多糖(如纤维素)、和海藻酸。示例性的合成的聚合物包括，但不限制于，美国专利5,354,556，第3栏，第33-45行所述的那些，其全部在此引入作为参考。尤其适合的组合物包括，但不限制于，美国专利5,354,556，第3栏第46行至第4栏第8行所述的那些，其全部在此引入作为参考。

[0455] 可以配制本文提供的持续释放的组合物用于胃肠外给药，例如通过肌内注射或皮下组织和各种体腔和透皮设备植入。在多个实施方案中，将肌内注射剂配制为水性或油性混悬剂。在水性混悬剂，持续释放作用是部分由于当复合后活性化合物的溶解度降低或溶出速度降低。对于油性混悬剂和溶液使用相似的方法，其中通过将活性化合物分离出油而进入到周围水性介质中而确定活性化合物的释放速度。只有油性可溶且具有所需的分配特性的活性化合物是适合的。可以用于肌内注射的油包括，但不限于，麻油、橄榄油、花生油、玉米油、杏仁油、大豆油、棉子油和蓖麻油。

[0456] 在一定时间(几天至几年)产生持续释放的高度发展形式的药物递送将带有药物的聚合物设备植入到皮下或多种体腔中。在植入中使用的聚合物材料(其必须是生物相容的和无毒的)包括，但不限于，水凝胶、硅酮、聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、或生物可降解的聚合物。

[0457] E.化合物的活性评价

[0458] 可在本文描述的实验中测定作为蛋白质运输调节剂的化合物的活性，所述实验ts评价化合物拯救蛋白质运输受损的能力。例如，可使用酵母突变细胞系ypt1 ，确定从突变YPT1等位基因的致死表型拯救细胞的化合物(参见，例如，Examples和Schmitt等人(1988)Cell 53：635-47)。可测量活性，例如，在全酵母细胞测定中使用384孔筛选方法和光密度测量。

[0459] 表A详细列出了酵母基因YPT1和SAR1的人同源基因。如本文所述，表现出蛋白质运输所需蛋白(例如表A中的蛋白质)表达或活性减少的细胞(例如哺乳动物细胞或酵母细胞)可用于筛选具有从蛋白质运输缺陷拯救细胞的能力的候选药物。

[0460] 表A：酵母基因YPT1和SAR1的人类的对应物

[0461]酵母基人类基因名称 DNA编号蛋白质编号
因名称 (人类基因) (人类基因)
YPT1 Rab1a NM_004161 NP_004152.1
Rab1b NM_030981 NP_112243.1
Rab8b NM_016530 NP_057614.1
Rab8a NM_005370 NP_005361.2
Rab10 NM_016131 NP_057215.2
Rab13 NM_002870 NP_002861.1
Rab35 NM_006861 NP_006852.1
Rab11b NM_004218 NP_004209.1
Rab30 NM_014488 NP_055303.2
Rab11a NM_004663 NP_004654.1
Rab3a NM_002866 NP_002857.1
Rab3c NM_138453 NP_612462.1
Rab3d NM_004283 NP_004274.1
Rab3b NM_002867 NP_002858.2
Rab2 NM_002865 NP_002856.1
Rab43 NM_198490 NP_940892.1
Rab4a NM_004578 NP_004569.2
Rab2b NM_032846 NP_116235.2
Rab4b NM_016154 NP_057238.2
Rab25 NM_020387 NP_065120.1
Rab14 NM_016322 NP_057406.2
Rab37 NM_001006638 NP_001006639.1
Rab18 NM_021252 NP_067075.1
Rab5b NM_002868 NP_002859.1
Rab33a NM_004794 NP_004785.1
Rab26 NM_014353 NP_055168.2
Rab5a NM_004162 NP_004153.2
Rab19b NM_001008749 NP_001008749.1
Rab5c NM_201434 NP_958842.1
Rab33b NM_031296 NP_112586.1
Rab39b NM_171998 NP_741995.1
Rab39 NM_017516 NP_059986.1
Rab31 NM_006868 NP_006859.2
Rab15 NM_198686 NP_941959.1
Rab40c NM_021168 NP_066991.2
Rab27b NM_004163 NP_004154.2
酵母基人类基因名称 DNA编号蛋白质编号
因名称 (人类基因) (人类基因)
Rab22a NM_020673 NP_065724.1
Rab6b NM_016577 NP_057661.2
Rab40b NM_006822 NP_006813.1
Rasef NM_152573 NP_689786.2
Rab21 NM_014999 NP_055814.1
Rab27a NM_183236 NP_899059.1
Loc286526 NM_001031834 NP_001027004.1
Rab40a NM_080879 NP_543155.2
Rab6a NM_198896 NP_942599.1
Rab17 NM_022449 NP_071894.1
Rab6c NM_032144 NP_115520.1
Rab7 NM_004637 NP_004628.4
Rab9a NM_004251 NP_004242.1
Rab711 NM_003929 NP_003920.1
Rab9b NM_016370 NP_057454.1
Rab34 NM_031934 NP_114140.2
Rab7b NM_177403 NP_796377.2
Rab41 NM_001032726 NP_001027898.1
Rab23 NM_183227 NP_899050.1
Rab32 NM_006834 NP_006825.1
Rab38 NM_022337 NP_071732
Rab36 NM_004914 NP_004905
Rab28 NM_001017979 NP_001017979
Rab20 NM_017817 NP_060287
Rab12 NM_001025300 NP_001020471
SAR1 Sar1a NM_020150 NP_064535
Sar1b NM_001033503 NP_001028675
SEC23 Sec23a NM_006364.2 NP_006355.2
Sec23b NM_006363.4 NP_006354

[0462]

[0463] 此外，化合物的有效性可在上述测试方式之前(首先)、同时或其后，通过监测，例如(i)调节(例如改善)运输缺陷蛋白的稳定性，(ii)调节(例如改善)运输缺陷蛋白的适当的、生理的运输，(iii)调节(例如恢复)运输缺陷蛋白的一种或多种功能进行评价。例如，在一些情况下，蛋白质(例如蛋白突变，例如ΔF508 CFTR)过早降解。因此，所述化合物调节蛋白质运输的有效性可通过在化合物存在时对比无化合物时监测蛋白质的稳定性来确定。例如，表达运输缺陷蛋白的细胞(例如内源性表达或表达外源性转基因编码运输缺陷蛋白，例如ΔF508 CFTR)可在化合物存在或无化合物时培养至少1小时(例如，至少2小时、至少4小时、至少6小时、至少8小时，至少12小时、至少16小时、至少24小时、至少36小时、或至少48小时)。细胞裂解物可由不同细胞群制备，混悬在Laemmli缓冲液中(有或无还原剂)并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。使用特异性识别运输缺陷蛋白(例如CFTR)的抗体，通过蛋白质印迹或点印迹技术测定在化合物存在或无化合物时蛋白质的量。在化合物存在时对比无化合物时运输缺陷蛋白量的增加说明化合物调节(例如稳定)运输缺陷蛋白(Vij等人(2006)J.Biol.Chem.281(25)：
17369-17378)。当蛋白质的修饰状态(例如糖基化或磷酰化)说明稳定性增加时，蛋白质修饰状态的改变也可用于确定是否化合物稳定了运输缺陷蛋白。例如，糖基化的CFTR(例如，ΔF508 CFTR)的量可在化合物存在或无化合物时评价。蛋白质的糖基化形式的增加表明化合物稳定CFTR(例如，ΔF508 CFTR)。

[0464] 可以理解的是这种实验的常规改变可用于监测任何运输缺陷蛋白。此外，也可在化合物存在或无化合物时监测蛋白质的稳定状态水平(例如，蛋白质转换或降解率)(例如，见Van Goor等人(2006)Am.J.Physiol.Lung.CellMol.Physiol.290：L1117-L1130)。

[0465] 确定运输缺陷蛋白调节的另一种方法是原位染色方法(in situ staining)。例如，当蛋白质(例如，ΔF508 CFTR或G601S-hERG)在到达细胞表面前过早降解时，可以以蛋白质的细胞表面表达量的变化(例如增加)确定化合物调节运输缺陷蛋白的有效性。因此，在化合物存在时在细胞表面的蛋白表达对比无化合物时表面表达量的增加说明化合物调节(例如稳定)运输缺陷蛋白。免疫染色方法是本领域技术人员众所周知的，并且包括其中细胞仍存活(例如，活细胞例如哺乳动物细胞的共聚焦显微镜观察)或固定细胞的染色(例如，免疫组织化学)的实施方案。细胞可附在固体支持物上(例如，组织培养皿或多聚赖氨酸涂被的玻璃片)或可加至溶液中(例如用于荧光辅助细胞分选(FACS)分析)。对细胞使用(例如，给药、运输、接触)运输缺陷蛋白特异性的一抗(primary antibody)。
一抗本身可用可检测的标记进行标记(例如，不同颜色的荧光团(例如，罗丹明、德克萨斯红、FITC、绿色荧光蛋白、Cy3、Cy5))。或者，第二种试剂，例如二抗，可被可检测地标记而一抗未标记。一抗也可与结合对的第一个成员(例如，生物素或链霉亲合素)结合，并且结合对的第二个成员被可检测地标记。合适的显微镜(例如共聚焦显微镜)与合适的滤光片的使用可确定在指定细胞中标记的抗体的位置。来自细胞表面的可检测标记信号的增加表明更多的蛋白在细胞表面表达。当然，可以理解这种方法可用于定位于细胞的其它隔室(compartment)(例如，细胞器例如核、溶酶体、内质网、高尔基体或线粒体)的运输缺陷蛋白。使用另一种抗体或染料确定另一种已知定位于感兴趣的指定隔室的对照蛋白是有用的。通常，第二种蛋白使用与感兴趣的运输缺陷蛋白不同的可检测标记进行标记。之后通过前面所述的方法确定两种标记的位置。当两种蛋白的位置分别确定时(即，通过抗体结合确定细胞中它们分别的可检测标记的位置)，如果发现它们占据相同位置，称两种蛋白为共定位(co-localize)，并因此运输缺陷蛋白定位在合适的细胞位置(即，当两种蛋白在无化合物时共定位，但在化合物存在时没有共定位，这说明化合物抑制两种蛋白之间的相互作用)。这种方法的实例描述在例如Morello等人(2000)J.Clin.Invest.105(7)：887-895和Liu等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(26)：15824-15829中。任选的，可使用例如多聚甲醛或甲醛固定细胞，并使用去污剂(例如Triton-X100)透化细胞。

[0466] 化合物调节运输缺陷蛋白的有效性也可通过监测运输缺陷蛋白活性的增加评价。例如，ΔF508 CFTR是PKA调节的氯通道，并因此可通过例如对福斯高林(forskolin)响应的膜电位的增加或cAMP介导的氯外流诱导的增加确定CFTR蛋白稳定性的增加(见，例如 Vij 等人(2006)J.Biol.Chem.281(25)：17369-17378 和Van Goor 等人 (2006)Am.J.Physiol.Lung.Cell Mol.Physiol.290：L1117-L1130)。α-半乳糖苷酶A，法布里病中的运输缺陷蛋白，是代谢特定脂质的酶。因此，可通过评价在化合物存在时对比无化合物时α-半乳糖苷酶的细胞活性确定化合物调节α-半乳糖苷酶A的有效性。化合物存在时对比无化合物时活性的增加说明化合物调节(例如，稳定)α-半乳糖苷酶A蛋白。监测细胞中α-半乳糖苷酶A活性的方法可在例如Ioannou等人(1998)Biochem.J.332：789-797中发现。监测除CFTR和α-半乳糖苷酶A外，为以蛋白质运输受损为特征的各个疾病成因的运输缺陷蛋白在体外和体内的酶活性的方法在本领域是已知的。

[0467] 蛋白质运输(例如，内质网-介导的蛋白质运输)也可使用体外(无细胞)方法检测和测定。因此，化合物调节例如运输缺陷蛋白或蛋白质运输的各个步骤(例如COPII囊泡的形成或停靠(docking))的有效性可使用这种体外方法确定。用于检测或测定内质网介导的蛋白质运输的合适的体外方法描述在例如Rexach等人(1991)J Cell Biol.114(2)：219-229；Segev(1991)Science 252(5012)：1553-1556；Balch等人(1984)Cell 39(2 Pt
1)：405-416；Wattenberg(1991)J Electron Microsc Tech 17(2)：150-164；Beckers 等人(1989)J.Cell Biol.108(4)：1245-1256；和Moreau等人(1991)J Biol.Chem 266(7)：
4322-4328中，其内容在本文完整引用作为参考。例如，感兴趣的蛋白从内质网至高尔基体
35
的转运可被检测或测定。首先，标记细胞内的受体蛋白，例如使用 S-甲硫氨酸通过代谢标记蛋白，或通过表达细胞内蛋白的可检测标记形式(包括感兴趣的蛋白和绿色荧光蛋白的融合蛋白)。可从包含标记蛋白的细胞获得包含内质网的“供体”膜部分。可从不包含标记蛋白的细胞制备包含高尔基体的“受体”膜部分。标记蛋白的转运通过翻译后修饰完成。
报告子蛋白通常是糖蛋白，其糖链在内质网至高尔基体的转运期间被修饰。受体和供体部分混合并与需要的辅助因子一起孵育。通过标记蛋白翻译后修饰形式的增加监测转运。用于检测翻译后修饰的标记蛋白的方法在本文中描述，并包括蛋白质印迹、点印迹、凝集素结合和对糖苷酶的易感性。当可检测标记是荧光或发光标记时，可使用荧光计或光度计。当可检测标记是放射性标记时(见下)，可使用闪烁计数器、X-射线片或辐射仪。可以理解蛋白质不需要可被检测标记。最初出现在供体部分(例如，特异在供体细胞群中表达的蛋白质)，但不出现在受体部分的蛋白质可使用例如蛋白印迹技术辨别。

[0468] 用于检测蛋白质运输(例如，内质网-介导的蛋白质运输)的体外方法也可包括测定囊泡出芽、脱壳、束缚(tethering)或停靠或与高尔基体的融合(见例如Rexach等人，supra，和Bonifacino等人(2004)Cell 116：153-166)。

[0469] 为确定是否化合物调节蛋白质从内质网至高尔基体的体外转运(例如蛋白质从内质网至高尔基体转运的任何步骤)，可使化合物与受体部分、供体部分或两者在孵育之前或期间接触。在制备膜部分之前，化合物可加入至供体或受体细胞群。如本文所述(见，例如实施例)，抑制蛋白酶体的化合物(例如，蛋白酶体表达或活性)也可通过本文所述的实验(例如ypt1ts突变实验)进行筛选以确定是否化合物拯救内质网-介导的转运。检测和/或测定蛋白酶体活性的体内和体外(基于细胞)的方法在本领域是已知的，并在例如Chuhan等人(2006)Br.J.Cancer 95(8)：961-965；Rubin等人(1998)EMBO J.17(17)：4909-4919；Glickman等人(1999)Mol.Biol.Rep.26(1-2)：21-8；和Grimes等人(2005)Int.J.Oncol.27(4)：1047-1052中描述。确定是否候选化合物抑制蛋白酶体，例如蛋白酶体活性的体外方法可包括候选化合物与离体的蛋白酶体复合物接触，并测定与候选化合物接触的离体的蛋白酶体活性。与化合物接触的蛋白酶体的活性对比无化合物时蛋白酶体活性的降低说明候选化合物抑制蛋白酶体的体外活性。确定是否候选化合物抑制蛋白酶体的体内方法可包括，例如候选化合物与细胞接触，并测定细胞中蛋白酶体的活性。例如，测定细胞中已知通过蛋白酶体降解的蛋白质的转换(turnover)。与化合物接触的细胞中的蛋白酶体活性对比无化合物接触的细胞中的蛋白酶体活性的下降说明候选化合物抑制蛋白酶体的体内活性。蛋白酶体抑制剂的实例包括，例如MG132、MG15、LLnL、ALLnL、bortezomib/PS-341/Velcade 、NPI-0052、epoxomicin和乳胞素(lactacystin)(Myung等人(2001)Med.Res.Reviews 21(4)：245-273；Montagut 等人 (2006)Clin Transl Oncol.8(5)：
313-317；和Chuhan等人(2006)Br.J.Cancer 95(8)：961-965)。

[0470] 例如，可在标准测定中测量对α-突触核蛋白毒性的调节(见例如美国专利申请10/826,157，于2004年4月16日提交；美国专利申请2003/0073610；及实施例)。可在整体酵母细胞实验中使用384-孔筛选方法和光密度测定来测量活性。人α-突触核蛋白在酵母中的表达通过拷贝数依赖方式(见，例如Outeiro，等人(2003)Science 302(5651)：
1772-5)抑制生长。一个拷贝的α-syn::GFP的表达对于生长没有影响，而两个拷贝导致完全抑制。生长的停止伴随α-syn::GFP定位的改变。在具有一个拷贝的细胞中，α-syn::GFP与质膜以高度选择性方式相关。当表达加倍时，α-突触核蛋白迁移至细胞质，在细胞质中形成与患病神经元中的路易体相似的大包涵体。

[0471] 本文提供的这些化合物可在此测试中筛选具有α-突触核蛋白毒性拯救活性的化合物。简言之，在384-孔板中的人源化的细胞株在诱导α-突触核蛋白表达的条件下暴露于化合物。在孵育24或/和48小时后，测量细胞生长。抑制毒性的化合物将使细胞恢复生长，并检测浊度的增加(OD600)。

[0472] 可使用其他的实验来筛选化合物，以评价它们调节α-突触核蛋白毒性的能力。这些实验包括，例如在人神经胶质细胞中(见，例如McLean等人(2004)Biochem Biophys Res Commun.321(3)：665-69)或在蠕虫或原代神经元中(见例如Cooper等人(2006)Science 313(5785)：324-8和补充材料)筛选调节α-突触核蛋白诱导的毒性的化合物。

[0473] F.蛋白质的制备方法

[0474] 本文所述的的化合物增强内质网-介导的转运，并因此可在增强细胞中蛋白质产生的方法中使用。由本方法产生的蛋白质可为天然的，或非天然的蛋白质。蛋白质可由细胞自然产生(例如，没有任何细胞的基因操作)、可通过异源核酸导入细胞编码产生，或可通过插入或激活调节编码蛋白质基因的表达后由细胞产生。

[0475] “异源性核酸”指通过使用重组技术引入细胞的核苷酸序列。因此，出现在指定细胞中的“异源性核酸”不在细胞中自然产生(例如，在细胞的基因组中没有对应的相同序列)，和/或在细胞中在与对应的相同序列自然存在的不同的位置产生(例如，核苷酸序列在细胞基因组的不同位置出现，或在细胞中以构建体出现而没有整合入基因组)。

[0476] 由细胞产生的任何蛋白质可在本文所述的方法中使用。例如，可产生蛋白质例如细胞因子、淋巴因子、和/或生长因子。这种蛋白质的实例包括，但不限制于，红细胞生成素、白介素1-α、白介素1-β、白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-7、白介素-8、白介素-9、白介素-10、白介素-11、白介素-12、白介素-13、白介素-14、白介素-15、淋巴细胞趋化因子、淋巴细胞毒素α、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、Megapoietin、抑瘤素M、青灰因子、血小板生成素、血管内皮细胞生长因子、骨形成蛋白、白介素-1受体拮抗剂、粒细胞集落刺激因子、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、干扰素γ、干扰素β、成纤维细胞生长因子、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、转化生长因子α、绒促性素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、巨噬细胞炎性蛋白1α、巨噬细胞炎性蛋白1-β、和Fas配体。产生上述多肽的非自然发生的、变异体的细胞也可在本文所述的方法中使用。

[0477] 除上述蛋白质，本文所述的方法也可用于产生融合蛋白，所述融合蛋白包含与指导来自细胞的融合蛋白质分泌的氨基酸序列融合的全部或部分的指定蛋白质。在一些情况下，这种融合蛋白可允许从细胞非典型分泌的多肽序列的分泌。例如，蛋白质的全部或部分(例如，膜相关蛋白，例如受体或细胞内蛋白)可与免疫球蛋白分子的部分融合(例如，与铰链区和人IgG1重链的恒定区CH2和CH3结构域融合)。

[0478] 本文所述的方法产生的蛋白质可为抗体或抗体的抗原结合片段。抗体可定向于抗原，例如蛋白质抗原，例如可溶性多肽或细胞表面受体。例如，抗体可定向于参与免疫细胞活化的细胞表面受体(一种疾病相关抗原)、或病原体产生的抗原。术语“抗体”指免疫球蛋白分子或其抗原结合部分。如本文所使用的术语“抗体”指包含至少一个，例如两个重链可变区(“VH”)，并且包含至少一个，例如两个轻链可变区(“VL”)的蛋白质。VH和VL区可进一步再分为高度变异区，又称“互补性决定区”(“CDR”)；更加保守的散开区，又称“框架区”(FR)。抗体还可包括重链和轻链恒定区，由此分别形成重和轻免疫球蛋白链。在一个实施方案中，抗体为两个重免疫球蛋白链和两个轻免疫球蛋白链的四聚体，其中重和轻的免疫球蛋白链通过例如二硫键相互连接。重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2、和CH3。轻链的恒定区包含一个结构域，CL。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。

[0479] 蛋白质可为完全人源抗体(例如，在小鼠中从人的免疫球蛋白序列遗传工程产生的抗体)、人源化抗体、或非人源抗体，例如啮齿动物(小鼠或大鼠)、山羊或灵长类(例如猴子)抗体。

[0480] G.以蛋白质运输受损为特征的疾病的治疗方法

[0481] GTP-结合的Rab蛋白，例如Rab1，酵母ypt1同系物，参与囊泡转运的整体调节。ts
如整个说明书和实施例中所详述的，在ypt 突变拯救筛选实验中确定的化合物通过例如调节Rab-ypt1通路可用于稳定运输缺陷蛋白。因此，本文公开的化合物(和包含该化合物的药物组合物)可在治疗以蛋白质运输受损为特征的各种疾病的一种或多种症状的方ts
法中使用。如实施例4中所述，使用ypt1 突变拯救筛选实验确定的化合物也可用于稳定ΔF508 CFTR。因此，本文所述的化合物在治疗或预防囊性纤维化的一种或多种症状中特别有用。

[0482] 可通过给药一种或多种本文所述的化合物(或该化合物的药物组合物)治疗的以蛋白质运输受损为特征的疾病的类型包括，例如遗传性肺气肿、遗传性血色素沉着病、眼皮肤白化病、蛋白质C缺乏症、I型遗传性血管性水肿、先天性蔗糖酶异麦芽糖酶缺乏、II型克-纳综合征综合征、拉龙综合征、遗传性髓过氧物酶症、原发性甲状腺机能减退症、先天性长QT综合征、酪氨酸结合球蛋白缺乏症、家族性高胆固醇血症、家族性乳糜微粒血症、无β-脂蛋白血症、低血浆脂蛋白a水平、伴随肝受损的遗传性肺气肿、先天性甲状腺功能减退症、成骨不全、遗传性低纤维蛋白原血症、α1抗糜蛋白酶缺乏症、肾性尿崩症、垂体神经性尿崩症、夏科-马里-图思综合征、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、IIA型冯·威利布兰德病、结合因子V和VIII缺乏症、脊椎骨骺迟缓性发育不良、无脉络膜症、I细胞疾病、巴藤病、共济失调-毛细血管扩张症、急性成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞样白血病、髓细胞性白血病、ADPKD-常染色体显性多囊性肾病、微绒毛包含病、结节性硬化症、洛氏眼-脑-肾综合征、肌萎缩侧索硬化、骨髓增生异常综合征、裸淋巴细胞综合征、丹吉尔病、家族性肝内胆汁淤积、X-连锁肾上腺脑白质营养不良、斯科特综合征、1型和2型赫曼斯基-普德拉克综合征、泽耳韦格综合征、肢近端型点状软骨发育异常(rhizomelic chondrodysplasia puncta)、常染色体隐性原发性高草酸尿症、Mohr Tranebjaerg综合征、脊髓延髓性肌萎缩症、原发性纤毛运动障碍(卡塔格纳综合征)、米-迪综合征、无脑回畸形、运动神经元病、乌斯赫尔综合征、威斯科特-奥尔德里奇二氏综合征、Optiz综合征、亨廷顿舞蹈病、遗传性胰腺炎、抗磷脂综合征、重叠结缔组织病、舍格伦综合征、僵体综合征、Brugada综合征、芬兰型型先天性肾炎综合征、杜宾-约翰逊综合征、X-连锁低磷血症、潘德雷德综合征、持续性幼儿型胰岛素过度分泌低血糖症、遗传性球形红细胞增多症、无铜蓝蛋白血症、婴儿型神经元蜡样质脂褐质沉积病、假性软骨发育不全和多重骨骺、斯塔加特样黄斑营养不良、X-连锁夏科-马里-图思病、常染色体显性色素性视网膜炎、Wolcott-Rallison综合征、库欣病、肢带型肌营养不良症、IV型粘多糖病、芬兰型遗传性家族性淀粉样变性、IV型糖原贮积症(安德森病)、肉瘤、慢性骨髓单核细胞性白血病、心肌病、面生殖发育异常、Torsion病、亨廷顿和脊髓小脑性共济失调、遗传性高同型半胱氨酸血症、多发性神经病、下位运动神经元病、色素视网膜炎、血清阴性多关节炎、间质性肺纤维化、雷诺现象、韦格纳肉芽肿病、蛋白尿、CDG-Ia、CDG-Ib、CDG-Ic、CDG-Id、CDG-Ie、CDG-If、CDG-IIa、CDG-IIb、CDG-IIc、CDG-IId、埃勒斯-当洛斯综合征、多发性外生骨疣、格里塞利综合征(1型或2型)、或X-连锁非特异性智力发育迟缓。此外、以蛋白质运输受损为特征的疾病也可包括溶酶体贮积症，例如但不限制于法布里病、法韦尔病、戈谢病、GM1-神经节苷脂贮积病、泰-萨克斯病、桑德霍夫病、GM2激活剂病、克拉伯病、异染性脑白质营养不良、尼曼-皮克二氏病(A、B和C型)、胡尔勒病、沙伊病、亨特病、桑菲列普病、莫尔丘病、马-拉病、透明质酸酶缺乏症、天冬氨酰葡糖胺尿症、岩藻糖苷贮积症、甘露糖苷贮积症、欣德勒病、1型唾液酸贮积症、蓬佩病、致密性成骨不全症、蜡样脂褐质沉积症、胆固醇酯贮积症、沃尔曼病、多种硫酸酯酶缺乏症、半乳糖涎酸贮积症、粘多糖症(II、III和IV型)、胱氨酸贮积症、唾液酸贮积症、乳糜微粒滞留病伴随马-舍综合征、赫曼斯基-普德拉克综合征、切-东二氏综合征、Danon病、或Geleophysic发育不良。

[0483] 以蛋白质运输受损为特征的疾病的症状有许多并且不同，并包括例如贫血、疲劳、容易擦伤、低血小板、肝增大、脾增大、骨骼虚弱、肺受损、感染(例如，胸感染或肺炎)、肾受损、进行性脑受损、癫痫发作、胎粪增厚、咳嗽、喘鸣、过量唾液或粘液产生、呼吸急促、腹痛、肠或消化道闭塞、生育问题、鼻息肉、手指/脚趾指甲和皮肤杵状变、手或脚痛、血管角质瘤、排汗减少、角膜和晶状体混浊、白内障、二尖瓣脱垂和/或反流、心脏肥大、温度不耐受、行走困难、吞咽困难、进行性视力丧失、进行性听力丧失、张力减退、巨舌症、反射消失、下腰痛、睡眠性呼吸暂停、端坐呼吸、嗜睡、脊柱前凸或脊柱侧凸中的一种或多种。可以理解由于运输缺陷蛋白的多种特性和所导致的疾病的表型(例如，以蛋白质运输受损为特征的疾病)，指定疾病通常仅展现特殊疾病的症状特征。例如，患有囊性纤维化的患者表现特殊亚型的上述症状，例如但不限制于，持续咳嗽、过量唾液或粘液产生、喘鸣、咳嗽、呼吸急促、肝和/或脾增大、鼻息肉、糖尿病、生育问题、感染增加(例如，呼吸道感染，例如肺炎)，或消化道或肠闭塞。

[0484] 根据疾病的特殊性质，患者可在任何年龄表现出这些症状。在许多情况下，可在儿童期或成人早期表现出症状。例如，当婴儿的消化道被增厚胎粪阻塞时，通常在出生时表现出囊性纤维化的症状。

[0485] 对受试者(例如人患者)给药一种或多种公开的化合物(或药物组合物)后，可通过比较患者治疗前和后表现出的一种或多种症状的数量和/或严重度，评价治疗在改善以蛋白质运输受损为特征的疾病的一种或多种症状中的有效性。或者，当给药化合物用于预防以蛋白质运输受损为特征的疾病的发生时，治疗效力可评价为以蛋白质运输受损为特征的疾病的一种或几种症状的出现延迟或不出现。可通过在治疗后的多个时间点评价，例如一种或多种症状的数量或严重度，确定随时间(例如，进行性改善)的治疗(例如，本文所述的化合物或组合物)在改善以蛋白质运输受损为特征的疾病的一种或多种症状中的有效性。例如，受试者(例如患者)可拥有对他或她的疾病的严重度(例如，以蛋白质运输受损为特征的疾病的一种或多种症状的数量或严重度)的初始评价，给药治疗，并随后在治疗两次或更多次后(例如，在一周和一个月；在一个月、两个月；在两周、一个月和六个月；或六周、六个月和一年)进行评价。当在限定时期内(例如，预先确定的时期)或以限定的给药次数对受试者给药一种或多种化合物或组合物时，可在最终治疗后在各个时间点评价治疗对改善以蛋白质运输受损为特征的疾病的一种或多种症状的作用。例如，在一种或多种化合物的最后给药剂量后，可在最终治疗的一个月(例如，在两个月、在六个月、在一年、在两年、在五年或更长时间)后评价患者症状的数量和严重度。

[0486] 本文所述的一种或多种化合物(或组合物)对以蛋白质运输受损为特征的疾病的一种或多种症状的治疗的有效性可评定为单一治疗或作为多重治疗方案的一部分。例如，化合物可与其它临床相关的用于以蛋白质运输受损为特征的疾病的治疗结合给药，所述用于以蛋白质运输受损为特征的疾病的治疗包括，但不限制于，物理或呼吸治疗、抗生素、抗哮喘治疗、皮质类固醇、维生素补充、阿法链道酶治疗、Cerezyme 、Ceredase 、Myozyme、胰岛素、Fabryzyme 、透析、移植物(例如肝或肾)、软便药或缓泻药、抗-血液凝固试剂(抗凝剂)、疼痛治疗、和/或血管成形术。可以理解由于运输缺陷蛋白的不同活性和相关疾病的不同临床表现(例如，法布里病、囊性纤维化、戈谢病、蓬佩病等)，“其它临床相关治疗”也可包括上述治疗之外的治疗。例如，对于囊性纤维化的其它或另外的临床相关治疗包括，例如抗生素、阿法链道酶治疗、维生素补充、软便药或缓泻药、用于囊性纤维化相关糖尿病的胰岛素、抗哮喘治疗、或皮质类固醇。

[0487] 可向受试者给药本文所述的的化合物或其药物组合物，作为与其它治疗(其它活性成分)的组合治疗，所述其它治疗例如以蛋白质运输受损为特征的疾病的治疗，例如囊性纤维化或溶酶体贮积病的治疗。例如，组合治疗可包括向受试者(例如，人患者)给药一种或多种其它试剂，所述试剂可向患有，或有风险发展为(或怀疑患有)以蛋白质运输受损为特征的疾病，例如囊性纤维化的受试者提供治疗益处。因此，化合物或药物组合物和一种或多种其它试剂同时给药。或者，可首先给药所述化合物，再给药一种或多种其它试剂。可首先给药一种或多种另外的试剂，再给药所述化合物。所述化合物可取代或提高之前或同时给药的治疗(也见下文)。例如，在用本发明的化合物治疗后，一种或多种其它试剂的给药可停止或减少，例如较低水平给药。之前的治疗给药也可保持。在一些实例中，之前的治疗可保持，直至化合物水平(例如剂量或给药时间)到达足够提供治疗作用的水平。两种治疗可组合给药。

[0488] 可以理解在一些实例中，当之前的治疗毒性特别大时(例如，以蛋白质运输受损为特征的疾病的治疗伴随显著的副作用)或受试者(例如患者)不能耐受时，给药本发明的化合物可用于抵消和/或减少之前治疗的量，至足够给予相同的或改善的治疗益处，而不伴随毒性的水平。

[0489] 在一些实例中，当向受试者给药本发明的化合物或药物组合物时，第一种治疗停止。监测受试者的第一种预选择的结果，例如以蛋白质运输受损为特征的疾病的一种或多种症状，如任何本文所述的症状(例如，见上)的改善。在一些情况下，当观察到第一种预选择的结果时，用化合物的治疗被减少或停止。之后可在用化合物的治疗被停止后监测受试者的第二种预选择的结果，例如以蛋白质运输受损为特征的疾病的症状的加重。当观察到第二种预选择的结果时，化合物对受试者的给药可恢复或增加，或者恢复第一种治疗给药，或者向受试者同时给药该化合物和第一种治疗，或该化合物和第一种治疗方案的量增加。

[0490] 评价治疗(例如本发明的化合物或组合物)效果的方法在本领域是已知的，并且包括评价以蛋白质运输受损为特征的疾病的一种或多种症状，例如本文所述的任一症状(见上)的改变(例如，改善)。此外，本发明不限制于任何特殊理论或作用机制，由于本文确定的化合物可在分子水平发挥作用以纠正以蛋白质运输受损为特征的疾病，对患有以蛋白质运输受损为特征的疾病的患者的治疗可通过评价例如(i)运输缺陷蛋白的稳定性的改善；(ii)运输缺陷蛋白的适当的、生理的运输的改善，或者(iii)运输缺陷蛋白的一种或多种功能的恢复(见上“化合物活性的评价”中)进行评价。

[0491] 特别的，囊性纤维化治疗的有效性(例如给药本文所述的一种或多种化合物或药物组合物)可例如在治疗之前和之后通过执行“发汗检测”进行监测。发汗检测通常由医生或医务人员进行操作。将无色、无味的化学药品置于皮肤上，导致发汗，并且用仪器收集汗液。发汗检测可花费30分钟至1小时，这依赖于收集受试者排汗的所花费的TM时间。检测受试者的排汗中的氯水平(例如，使用Sweat-Chek 发汗传导分析仪(Sweat ConductivityAnalyzer)、Discovery Diagnostics，Ontario，加拿大)，并且例如＜40的相对评分说明正常，40-59的评分为中间范围，＞60的评分说明受试者仍患病较重。囊性纤维化治疗的有效性也可使用鼻内电势差(NPD)检测。该检测对于通过发汗检测确定的具有正常氯水平的受试者(例如患者)是特别有用的。NPD检测需要2个电极，与电压表例如Tholy-Medicap 仪器连接，一个电极放置于下鼻甲的鼻粘膜上，另一个电极皮下放置于前臂。通常，认为低于-40mV的读数是不正常的。因此，认为NPD检测读数超过-40mV的患者疾病改善(参见，例如，Domingo-Ribas等人(2006)Arch Bronconeumol.42：33-38)。
实施例

[0492] 提供下列实施例仅用于说明目的，并不意图限制本发明的范围。

[0493] 实施例1：恢复ypt1ts突变株生长的化合物

[0494] 酵母突变细胞系ypt1ts以温度依赖方式抑制突变YPT1等位基因的显性致死表型ts(Schmitt等人(1988)Cell 53：635-47)。酵母突变细胞系ypt1 包含具有两个点突变的YPT1等位基因：一个在121位从天门冬酰胺突变为异亮氨酸(N121I)，另一个突变是在161位从丙氨酸突变为缬氨酸(A161V)。N121I突变引发自身的显性致死性，但致死性被第二个ts
突变抑制，导致功能表型在限制性温度隐性丧失。ypt1 细胞在高达25℃的温度正常生长，ts
但在37℃生长停止(Id.)。在非许可温度37℃，ypt1 突变株累积ER膜、小囊泡，和未加工ts
的转化酶，并表现出细胞骨架缺陷和钙摄取增强(Id.)。ypt1 突变细胞可通过提供细胞外钙(Id.)而从细胞生长停滞中恢复。

[0495] 筛选化合物以评价其恢复ypt1ts细胞生长的能力。对在室温(许可温度)、ts37℃(非许可温度)和35℃(半许可温度)培养的ypt1 细胞测定化合物的作用。发现ts
拯救α-突触核蛋白毒性的某些化合物(和其类似物)也可拯救ypt1 毒性。

[0496] 为了确定是否待测化合物可拯救ypt1ts突变表型，ypt1ts细胞在补充2％葡萄糖的合成的完全(SC)培养基中在室温生长过夜。将对数期细胞稀释到SC 2％葡萄糖培养基中至OD600为0.003。然后在96-孔平底微量滴定板的每个孔中等分加入100μL的这种培养基。向每孔中加入1μL的溶解在DMSO中的检测化合物(浓度范围在5mM-0.005mM)或单独DMSO(在1％DMSO中的终浓度为50μM-0.05μM)。通过涡旋混合培养板，并在35℃和ts37℃孵育。通过测定培养物的OD600(在600nm的光密度；细胞生长)，测定化合物对ypt1温度敏感缺陷的拯救。在35℃孵育的板在孵育24和40小时检测，而在37℃生长的板在孵育40小时后检测。

[0497] 监测拯救ypt1ts突变株的测定使用溶媒、阳性对照(钙)、表II中鉴别的化合物ts进行。在表II中的相应于ypt1 的MRC(最小拯救浓度)的结果，大于或等于50毫摩尔的ts ts
标记为+；ypt1 的MRC为10～50毫摩尔的标记为++；ypt1 的MRC小于10毫摩尔的标记为+++。对于特定化合物的多个结果以逗号分开。

[0498] 上述化合物可拯救ypt1ts的蛋白质运输缺陷的发现，说明化合物可用于治疗或预防以蛋白质运输受损(例如在哺乳动物中或在哺乳动物细胞中)为特征的多种疾病。虽然这种酵母测试法对于筛选化合物以鉴别出一些在哺乳动物细胞或哺乳动物中具有活性的化合物是有用的，但是应注意的是许多化合物在哺乳动物细胞或哺乳动物中可具有活性，但是其在这种酵母测试中没有表现出活性。

[0499]

[0500]

[0501]

[0502] 实施例2A：化合物可调节ΔF508 CFTR的活性

[0503] 尤斯室(Ussing chamber)测定：如上在Am J Physiol(1994)266 L405-413所述地培养稳定地表达ΔF508 CFTR(囊性纤维化跨膜传导调节蛋白)的Fischer大鼠甲状腺(FRT)细胞。单层细胞在可分离插入皿(Snapwell inserts，Corning Inc.)在气/液界面处生长。用化合物处理单层细胞24小时。将插入皿安装在尤斯室(Harvard Apparatus)中并使用电位钳装置(WPI，Inc.)测量短路电流。使氯化物的浓度在黏膜至浆膜之间形成梯度，并使用两性霉素使基底外侧膜能渗透。通过加入最大激活CFTR的激动剂福斯高林、异丁基甲基黄嘌呤、和染料木黄酮(genistein)来测量短路电流。

[0504] 在此测定中，化合物25(见表I的结构)在加入所有的三种激动剂后，显示出约2 2
65uA/cm 的短路电流。这可与在这些试验中显示出约70uA/cm 的冷校正对照相比，并表明了这些化合物能调节ΔF508 CFTR的活性。

[0505] 实施例2B

[0506] 化合物修复了在ΔF508 CFTR运输中的缺陷

[0507] 将稳定表达ΔF508 CFTR的Fisher大鼠甲状腺(FRT)细胞和黄色荧光蛋白(YFP)的卤化物敏感的变种加入微量滴定板中，并使之在37℃和5％的CO2中生长24小时。见Pedemonte等，J.Clin.Invest.115(9)2564-2571(2005)，将其全部教导引入本文作为参考。以化合物的二甲基亚砜(DMSO)溶液预稀释细胞培养基，从细胞中除去培养基，再加入含有化合物的新鲜培养基。将细胞在37℃和5％的CO2中再次孵育24小时。

[0508] 除去培养基，以磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)洗涤单层细胞，再施加含有福斯高林和染料木黄酮的PBS，如此测定CFTR的活性。在37℃孵育30分钟后，将板置于装有试剂注射器的荧光分析仪中。在测量起始荧光值后，注射含碘的缓冲液，荧光值降低，激发波长和发射波长分别为485nm和530nm。

[0509] 修复活性计算如下。标准化的终点荧光通过如下计算：注射碘化物后的终点荧光/读取的初始荧光×100％。修复剂的EC50值从活性与浓度数据使用四参数对数拟合法(4-parameter log fit)来计算。曲线的底部被限制为零活性(DMSO对照)，同时将斜率、EC50和曲线的顶部拟合入数据。EC50被确定为拟合曲线拐点所对应的浓度。测量各个化合物的修复剂活性EC50值，并按照下列范围显示在表III中：低于2毫摩尔，以++++表示；2～5毫摩尔，以+++表示；5～10毫摩尔，以++表示；及15毫摩尔或更大，以+表示。

[0510] 对于某些化合物，分析了活性并与DMSO对照做比较，但是没有获得EC50值。与DMSO对照相比仍然显示活性的化合物以#表示，没有显示出这种活性的化合物以*表示。与DMSO对照比较在25毫摩尔下显示出活性的化合物，将其以#或*标记。与DMSO对照比较在25和2.5毫摩尔下，显示出测试活性的化合物，分别以这两种符号标记。例如，“#，#”表示在25和2.5毫摩尔浓度下均观察到了活性；“*，#”表示在25毫摩尔下没有观察到活性，但是在2.5毫摩尔下观察到了活性；“#，*”表示在25毫摩尔下观察到活性，但在2.5毫摩尔下没有；“*，*”表示在两浓度下均没有观察到活性。这些结果也显示在表III中。

[0511]

[0512]

[0513]

[0514]

[0515]

[0516]

[0517]

[0518]

[0519]

[0520]

[0521]

[0522] 实施例2C

[0523] 化合物增强了ΔF508CFTR的运输

[0524] 如上所述，将稳定表达ΔF508CFTR的Fisher大鼠甲状腺(FRT)细胞和黄色荧光蛋白(YFP)的卤化物敏感的变种加入微量滴定板中，并使之在37℃和5％的CO2中生长24小时。以新鲜的培养基替换培养基，并将细胞在27℃在5％CO2中再孵育24小时，以提高细胞表面的变异的CFTR的水平。

[0525] 以化合物的DMSO溶液预稀释含有福斯高林的磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)。除去培养基，以PBS洗涤单层细胞，再应用稀释于含有福斯高林的PBS的化合物，如此测定CFTR的活性。在37℃孵育30分钟后，将板置于装有试剂注射器的荧光分析仪中。在测量起始荧光值后，注射含碘的缓冲液，荧光值降低，激发波长和发射波长分别为485nm和530nm。

[0526] 增强剂活性按照如下计算。标准化的终点荧光通过如下计算：注射碘化物后的终点荧光/读取的初始荧光×100。增强剂的EC50值按照与修复剂EC50值相同的方法计算。根据上述用于修复活性的相同的符号方案，表IV显示了各种化合物的增强活性。

[0527]

[0528]

[0529]

[0530]

[0531]

[0532]

[0533]

[0534] 实施例2D

[0535] 某些化合物具有增强ΔF508 CFTR的活性和修复ΔF508 CFTR运输缺陷的活性[0536] 如上所述，将稳定表达ΔF508 CFTR的Fisher大鼠甲状腺(FRT)细胞和黄色荧光蛋白(YFP)的卤化物敏感的变种加入微量滴定板中，并使之在37℃和5％的CO2中生长24小时。以化合物的DMSO溶液预稀释细胞培养基，从细胞中除去培养基，应用含有化合物的新鲜培养基。将细胞在37℃和5％的CO2中再次孵育24小时。

[0537] 加入少量的福斯高林的DMSO原液，再充分混合后，测定CFTR的活性。在37℃孵育30分钟后，将板置于装有试剂注射器的荧光分析仪中。在测量起始荧光值后，注射含碘的缓冲液，荧光值降低，激发波长和发射波长分别为485nm和530nm。

[0538] 修复剂和增强剂双重活性按照如下计算。标准化的终点荧光通过如下计算：注射碘化物后的终点荧光/读取的初始荧光×100。阴性对照DMSO的活性被指定为0％。双重活性EC50值通过与修复剂EC50值相同的方法计算。

[0539] 以下是一系列通过了测试的化合物(编号与表I对应)。一些化合物在最高测试浓度下表现出较低的反应。

[0540] 2

[0541] 5

[0542] 16

[0543] 24

[0544] 25

[0545] 27

[0546] 29

[0547] 31

[0548] 33

[0549] 34

[0550] 67

[0551] 86

[0552] 95

[0553] 97

[0554] 118

[0555] 129

[0556] 165

[0557] 202

[0558] 240

[0559] 242

[0560] 246

[0561] 247

[0562] 257

[0563] 261

[0564] 265

[0565] 266

[0566] 270

[0567] 271

[0568] 276

[0569] 289

[0570] 290

[0571] 300

[0572] 311

[0573] 315

[0574] 332

[0575] 333

[0576] 336

[0577] 337

[0578] 348

[0579] 349

[0580] 350

[0581] 351

[0582] 355

[0583] 366

[0584] 401

[0585] 实施例3

[0586] 从α-突触核蛋白诱导的细胞毒性拯救细胞存活率

[0587] 以0.1μg/mL的四环素处理TS217细胞3～6天，从而诱导可以是细胞毒性的α-突触核蛋白的表达。为确定对α-突触核蛋白诱导的细胞毒性的抑制，将TS217细胞置于96孔组织培养板中，在化合物90(见表I的结构)(0.08μM，0.15μM，和0.3μM)或对照DMSO存在时，或福斯高林(0.3μM，1μM，3μM，和10μM)或对照DMSO存在时，以0.1μg/mL四环素处理5天。在5天的处理后，溶解细胞并测试作为细胞存活率函数的细胞内ATP浓度。细胞的相对存活率通过使用VIALIGHT Plus Bioassay试剂盒(Cambrex，Rockland，ME)测量细胞裂解液中的细胞ATP水平来评估。细胞相对存活率按照诱导的细胞与对照细胞(没有以四环素处理的细胞)的比值来计算，其作为α-突触核蛋白诱导的细胞毒性的一个指标。在不存在任何其他毒性诱导试剂时，细胞相对存活率在3～6天内降低超过50％，表明在这些细胞中仅表达的α-突触核蛋白就能导致细胞死亡。相对而言，以3μM浓度的化合物90处理的细胞与不含有该化合物的对照孔相比，α-突触核蛋白诱导的细胞毒性降低了45％(P＜0.02)。因此，化合物90从α-突触核蛋白诱导的细胞毒性中拯救了细胞存活率。

[0588] 实施例4

[0589] α-突触核蛋白(aS)筛选

[0590] 酵母株(Yeast Strains)

[0591] Parental W303：MAT a/α ade2-1/ade2-1 his3-11，15/his3-11，15 leu2-3，112/leu2-3，112

[0592] trp1-1/trp1-1 ura3-1/ura3-1 can1-100/can1-100

[0593] 表型：生长需要腺嘌呤、组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶。刀豆氨酸抗性。

[0594] Fx-109：MAT a/αade2-1/ade2-1 his3-11，15/his3-11，15 leu2-3，112/leu2-3，112

[0595] trp1-1/trp1-1 GALp-aS-GFP::TRP1/GALp-aS-GFP::TRP1 ura3-1/ura3-1[0596] GALp-aS-GFP::URA3/GALp-aS-GFP::URA3 can1-100/can1-100pdr1::KanMX/pdr1::KanMX erg6::KanMX/erg6::KanMX

[0597] 表型：由于表达aS，不能在半乳糖上生长。生长需要组氨酸、亮氨酸和腺嘌呤。刀豆氨酸和卡那霉素抗性。对药物高度敏感。

[0598] 培养基和试剂

[0599] 根据待检测菌株的基因型，选择合适的合成培养基补充物。包含完整构建体(construct)(例如aS)的菌株可以在保持构建体选择性的培养基中生长(见下)。CSM(Qbiogene)是市售的用于酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)生长的氨基酸混合物。可按需要获得缺少一种或多种氨基酸的CSM。对于aS和对照株，可使用缺乏色氨酸和尿嘧啶(-Trp-Ura)的培养基(Qbiogene，Inc.，Carlsbad，CA有售)。

[0600] 为配制液体合成培养基，混合在表B、C和D中列出的成分。在这些成分溶解后，过滤灭菌(Millipore Stericup Cat#SCGPU11RE)，放入灭菌瓶中。

[0601] 表B.合成完全培养基

[0602]成分公司货号# 大小量/升终浓度
无氨基酸的酵母氮源 Difco 291920 2kg 6.7g 0.67％(w/v)
(Yeast Nitrogen Base)
碳源：葡萄糖、半乳糖、见下见下见下 20g 2％(w/v)
棉子糖中的一种
CSM：菌株决定类型 Qbiogene 见下见下～0.8g
(根据生产厂)
MilliQ水 - - 1L -

[0603] 表C.碳源

[0604]葡萄糖(也称为右旋糖) Fisher D16-10 10kg 20g 2％(w/v)
半乳糖 SIGMA G-0750 1kg 20g 2％(w/v)
棉子糖 Difco 217410 100g 20g 2％(w/v)

[0605] 表D.CSM

[0606]CSM-Trp-Ura，用于 Qbiogene 4520-522 100g 0.72g 见Qbiogene
aS和对照株网页
CSM，用于亲代株 Qbiogene 4500-022 100g 0.79g 见Qbiogene
网页

[0607] 使用光密度384-孔筛选方法

[0608] 第1天

[0609] 用Fx-109菌株接种合适体积的SRaffinose-Trp-Ura培养基。

[0610] 在30℃振荡孵育过夜，直至细胞达到对数或对数中期(OD6000.5-1.0；0.1 OD600对应于～1.75×10E6个细胞)。

[0611] 第2天

[0612] 在室温将细胞离心沉降(spin down)，去除培养基，并在等体积SGalactose-Trp-Ura培养基中再分散。测定OD600并稀释细胞至0.001。自动转移30μl的细胞悬液(MicroFill，Biotek)至384-孔板(NUNC 242757)的每孔中。

[0613] 向每孔中加入100nl药物的DMSO(Cybio)溶液(最终浓度17μg/ml的药物和0.333％的DMSO)。

[0614] 对于阳性对照，加入葡萄糖至终浓度的0.1％和1％。

[0615] 在30℃，将板在潮湿室不振荡孵育24和/或48小时。

[0616] 第3天(24小时后)和/或第4天(48小时后)

[0617] 读数OD650(Envision，Perkin Elmer)并肉眼检查用于酵母培养物生长的孔。

[0618] 实施例5

[0619] ypt1ts突变活性化合物可稳定ΔF508 CTFR

[0620] 对这些化合物可测试其稳定ΔF508 CTFR的能力。CFBE细胞，通过用SV40转化囊性纤维化气管支气管细胞(ΔF508 CTFR纯合子)产生的细胞系(Bruscia等人(2002)Gene Ther.9(11)：683-685)，可以用10μM的选定化合物、或10μM的VRT-325在37℃培养16小时(VRT-325在例如Van Goor等人(2006)Am.J.Physiol.Lung Cell Mol.Physiol.290：L1117-L1130中描述)。还可用二甲基亚砜(DMSO)溶剂培养细胞群落，作为对照。

[0621] 在孵育后，裂解细胞，在Laemmli缓冲液中溶解，并加至SDS-PAGE。通过使用对CFTR特异性抗体进行蛋白质印迹，可视化CFTR蛋白。与化合物25(见表I结构)一起培养的CFBE细胞增加了细胞ΔF508 CFTR蛋白的量。该化合物也增加了糖基化形式的ΔF508 CFTR的量，说明这种蛋白质通过高尔基体的运输的增加。化合物25在稳定ΔF508 CFTR的作用相当于或更好于已知的CFTR稳定剂VRT-325。

[0622] 不同浓度的化合物25对ΔF508 CFTR的作用在剂量响应实验中进行测试。在存在0、1.25、2.5、5或10μM的化合物25时，使CFBE细胞在37℃生长16小时。孵育后，从处理的细胞制备细胞裂解物，将细胞裂解物溶于Laemmli缓冲液中，再加至SDS-PAGE。通过蛋白质印迹可视化糖基化和未糖基化的ΔF508 CFTR蛋白的相对量(图10A)，并通过扫描和光密度测定定量带强度(图10B)。与不存在化合物25时蛋白质的量相比，对于所测试的浓度(1.25～10μM)，其表现出糖基化的(带B)和未糖基化的(带C)ΔF508CFTR蛋白质的增多。也测试了化合物5(表I)。在0、1、2.5、5或10μM的化合物5存在下，CFBE细胞在37℃生长16小时。孵育后，由处理的细胞制备细胞裂解物，将细胞裂解物溶于Laemmli缓冲液中，并加至SDS-PAGE。通过蛋白质印迹可视化糖基化的和未糖基化的ΔF508 CFTR蛋白的相对量(图11A)，并通过扫描和光密度测定定量带强度(图11B)。与不存在化合物5时蛋白质的量相比，对于所测试的浓度(1～10μM)，其表现出糖基化的(带B)和未糖基化的(带C)ΔF508 CFTR蛋白质的增多。

[0623] 这些数据表明在ypt1ts突变拯救筛选实验中鉴定的例如化合物25可稳定ΔF508 CFTR蛋白，并因此可用于治疗囊性纤维化。

[0624] 实施例6

[0625] 化合物可恢复sar1ts突变株的生长

[0626] sar1ts突变酵母菌株(ATCC，Manassas，VA)携带SAR1基因的温度敏感突变等位基ts因，可允许菌株在25℃生长，但在35℃或更高温度下生长停止。在35℃的突变Sar1 蛋白的失活可阻止在ER的转运小泡的形成，导致ER至高尔基体运输的阻断(Saito等人(1998)J.Biochem.(Tokyo)124(4)：816-823)。

[0627] 为了鉴别拯救sar1ts突变表型的化合物，突变菌株可首先在25℃在富集的培养基中生长过夜。菌株可稀释至含有2％葡萄糖的SC培养基中至OD600为0.004，并与在含有2％葡萄糖的SC培养基中多种稀释浓度的待测化合物(0.05至50μM)混合。细胞可在25℃或35℃孵育72小时。在检测化合物存在下与无检测化合物相比，培养的细胞的OD600(酵母细ts
胞浓度)的增加时，可认为sar1 突变表型得到拯救。

[0628] 可以使用可拯救sar1ts突变表型的对照化合物，例如放线菌酮(cycloheximide)和均霉素。增加OD600浓度的化合物是活性化合物。

[0629] 实施例7

[0630] 化合物可恢复sec23ts突变株的生长

[0631] sec23-2ts突变酵母菌株携带SEC23基因的温度敏感突变等位基因，可允许菌株在25℃正常生长，但在30℃或更高生长停止。在限定温度，Sec23温度敏感的突变蛋白的失活可阻止在ER的转运小泡的形成，导致ER至高尔基的运输阻断(见，例如Hicke等人(1989)EMBO J.8(6)：1677-1684和Castillo-Flores等人(2005)J.Biol.Chem.280(40)：34033-34041)。

[0632] 为了鉴别拯救sec23ts突变表型的化合物，突变菌株可首先在25℃在富集的培养基中生长过夜。菌株可稀释至含有2％葡萄糖的SC培养基中至OD600为0.004，并与在含有2％葡萄糖的SC培养基中多种稀释浓度的待测化合物(0.05至50μM)混合。细胞可在25℃或30℃孵育24小时。在检测化合物存在下与无检测化合物相比，培养的细胞的OD600的增ts
加时，可认为sar23 突变表型得到拯救。OD600浓度增加的化合物是活性化合物。

[0633] 合成实施例

[0634] 本文说明的化合物使用上述方案和方法制备，并通过以下进一步说明。

[0635] 实施例8

[0636] 3-(4-氯-苯基)-1-环丙基甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(化合物29)[0637]

[0638] 步骤A：

[0639]

[0640] 将市售的5-氨基-1H-吡唑-4-腈(16.22g，0.15mol)和甲酰胺(84.6ml)的混合物在180℃在氮气氛围中加热4小时。将该溶液冷却至室温并分离结晶，以水洗涤并干燥而提供1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺产物(18.6g，0.13mol)。

[0641] 步骤B：

[0642]

[0643] 将1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(11.75g，0.09mol)(步骤A)和N-碘代琥珀酰亚胺(25.45g，0.11mol)在二甲基甲酰胺(300ml)中的混合物在50℃加热24小时。加入第二批N-碘代琥珀酰亚胺(3.92g，0.02mol)并另外搅拌24小时。在室温下静置，有沉淀物形成，通过过滤分离该沉淀物并以二甲基甲酰胺和乙醇洗涤，从而提供10.05克3-碘-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺。将滤液真空浓缩至约一半的初始体积，再加入500ml水。过滤分离沉淀产物并以乙醇洗涤从而得到第二批产物(10.53g，共得到20.58g，0.08mol)；LC/+MS，API-ES，Pos，(M+H)，262.1。

[0644] 步骤C：

[0645]

[0646] 将3-碘-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(1.0g，3.83mmol)(步骤B)、环丙基-甲醇(0.83g，11.51mmol)和三苯基膦(2.01g，7.66mmol)溶于无水四氢呋喃(50ml)中并在0℃进行搅拌。缓慢加入偶氮二甲酸二乙酯(1.33g，7.63mmol)并在0℃搅拌15分钟。将该溶液缓慢温热至室温并搅拌1小时。在真空中蒸除溶剂并将产物吸附在硅胶上。在硅胶上进行快速柱色谱分离(洗脱液，己烷∶乙酸乙酯，50∶50～20∶80)，在通过与乙腈研磨提供1-环丙基甲基-3-碘-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(0.77g，2.44mmol)；LC/MS，+
API-ES，Pos，(M+H)，316.1。

[0647] 步骤D：

[0648] 在1，2-二甲氧基乙烷(10ml)和水(5ml)中混合1-环丙基甲基-3-碘-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(0.12g，0.38mmol)(步骤C)、4-氯苯基硼酸(0.65g，0.42mmol)、四(三苯基膦)钯(0.03g，0.02mmol)和碳酸钠(0.09g，0.85mmol)，并将该将溶液在氩气下回流6小时。加入水并以乙酸乙酯(2×25ml)萃取产物。蒸除溶剂后，在通过在硅胶上进行快速柱色谱分离(洗脱液，己烷∶乙酸乙酯，50∶50～10∶90)，从而提供标题化合物+(0.04g，0.13mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，300.1。

[0649] 实施例9

[0650] 1-叔丁基-3-(4-氟-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(化合物9)

[0651]

[0652] 步骤A

[0653]

[0654] 在0℃，向搅拌的丙二腈(2.08g，31.5mmol)在50ml无水四氢呋喃中的溶液中缓慢地分批加入氢化钠(60％，2.52g，63mmol)，并将溶液搅拌10分钟。经加料漏斗缓慢加入4-氟-苯甲酰氯(5.0g，31.5mmol)的四氢呋喃溶液(25ml)，并将该溶液在室温下搅拌1小时。加入稀盐酸(1mol/L，100ml)，并以乙酸乙酯萃取产物。有机层以水、盐水洗涤，并蒸发而提供残余物，该残余物以己烷研磨而提供2-(4-氟-苯甲酰基)-丙二腈(4.98g，-
26.5mmol)；LC/MS，API-ES，Neg，(M-H)，187.0。

[0655] 步骤B：

[0656]

[0657] 将2-(4-氟-苯甲酰基)-丙二腈(4.98g，26.47mmol)(步骤A)溶于无水乙腈(100ml)和甲醇(10ml)的混合液中，并加入三甲基硅烷基重氮甲烷(2M的乙醚溶液，
19.9ml，39.8mmol)。在0℃在氮气氛围中搅拌该溶液，并缓慢加入N，N-二异丙基乙胺(6.84g，52.9mmol)。将该溶液在室温下搅拌18小时，并在真空中蒸除溶剂。将残余物吸附在硅胶上并以色谱法纯化(洗脱液，己烷∶乙酸乙酯，80∶20～70∶30)从而提供油状的2-[(4-氟-苯基)-甲氧基-亚甲基]-丙二腈(2.83g，13.9mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，+
(M+H)，203.0。

[0658] 步骤C：

[0659]

[0660] 将2-[(4-氟-苯基)-甲氧基-亚甲基]-丙二腈(2.80g，13.85mmol)(步骤B)溶于无水乙醇(75ml)中，加入叔丁基肼盐酸盐(1.73g，13.88mmol)，再加入三乙胺(1.54g，15.27mmol)。将溶液回流2小时后蒸除溶剂。将产物在硅胶上进行快速柱色谱纯化(洗脱液，己烷∶乙酸乙酯，80∶20～30∶70)从而提供5-氨基-1-叔丁基-3-(4-氟-苯+
基)-1H-吡唑-4-腈(3.02g，11.7mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，259.1。

[0661] 步骤D：

[0662] 混合5-氨基-1-叔丁基-3-(4-氟-苯基)-1H-吡唑-4-腈(0.82g，3.16mmol)与甲酰胺(5ml)，并将该混合物在氮气氛围中在180℃加热3小时。经过冷却后，通过过滤分离结晶状的产物，以水洗涤该产物并干燥从而提供标题化合物(0.73g，2.56mmol)；LC/MS，+API-ES，Pos，(M+H)，286.1。

[0663] 实施例10

[0664] 3-苯并[b]噻吩-2-基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(化合物16)

[0665]

[0666] 步骤A：

[0667]

[0668] 搅拌叔丁基肼盐酸盐(4.67g，53mmol)和三乙胺(5.35g，53mmol)在无水乙醇(250ml)中的混合物，缓慢地分批加入乙氧基亚甲基丙二腈(6.47g，53mmol)。将该混合物在回流下加热3小时。在真空中除去溶剂，从乙酸乙酯-己烷结晶产物，再从乙醚结晶产物，从而提供浅褐色结晶的5-氨基-1-叔丁基-1H-吡唑-4-腈(5.6g，34.1mmol)；LC/MS，-API-ES，Neg，(M-H)，163.0。

[0669] 步骤B：

[0670]

[0671] 将5-氨基-1-叔丁基-1H-吡唑-4-腈(5.5g，33.5mmol)(步骤A)和甲酰胺(68ml)的混合物在氮气氛围中在185℃加热3小时。将该混合物剂加入水中，并以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和碳酸氢钠溶液洗涤，再以水和盐水洗涤。干燥有机层(无水硫酸钠)，在真空中除去溶剂而提供残余物，该残余物以小量的乙醚结晶而提供1-叔丁基-1H-吡唑并[3，+
4-d]嘧啶-4-基胺(化合物12；3.91g，20.4mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，192.1。

[0672] 步骤C：

[0673]

[0674] 将1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(1.6g，8.37mmol)(步骤B)分散在水中(30ml)，加入溴(2.68g，16.7mmol)。将该混合物在室温下搅拌1小时，再在100℃搅拌1小时。在冷却后，通过过滤分离沉淀的产物。残余物在50ml的5％的亚硫酸氢钠水溶液中搅拌0.5小时，并以10ml饱和碳酸氢钠溶液处理。通过过滤分离沉淀，以水洗涤沉淀并干燥从而得到3-溴-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(化合物107；1.46g，5.40mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)+，270.0和272.0。

[0675] 步骤D：

[0676] 在1，2-二甲氧基乙烷(20ml)和(10ml)水中混合3-溴-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(351mg，1.3mmol)(步骤C)、苯并[b]噻吩-2-基硼酸(255mg，
1.43mmol)、四(三苯基膦)钯(90mg，0.07mmol)和碳酸钠(330mg，3.11mmol)，并将该溶液在氩气中回流6小时。加入水并以乙酸乙酯萃取产物(2×25ml)。蒸除溶剂，再通过在硅胶上进行快速色谱分离(洗脱液，己烷∶乙酸乙酯，80∶20～65∶35)而得到灰白色粉末状标题化合物(136mg，0.42mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)+，324.1。

[0677] 实施例11

[0678] 1-乙基-3-对甲苯基-1H-吲哚-4-基胺(化合物43)

[0679]

[0680] 步骤A：

[0681]

[0682] 在0℃，向搅拌的4-硝基吲哚(2.5g，15.4mmol)的50ml丙酮溶液中加入4.32克(76.9mmol)粉末状的氢氧化钾，并将溶液搅拌5分钟。加入碘乙烷(4.8g，30.8mmol)，并将溶液在室温下剧烈搅拌15分钟。加入甲苯(300ml)，并通过过滤除去不溶物。将溶液以5％的柠檬酸水溶液洗涤，再以水洗涤，干燥(无水硫酸钠)，在真空中除去溶剂。以己烷-乙酸乙酯(7∶3)研磨残余物，从而得到1-乙基-4-硝基-1H-吲哚(2.6g，13.6mmol)；LC/MS，API-ES，Pos(M+H)+，191.1。

[0683] 步骤B：

[0684]

[0685] 将1-乙基-4-硝基-1H-吲哚(2.93g，15.4mmol)(步骤A)的无水四氢呋喃溶液(100ml)在-78℃进行搅拌。缓慢加入N-溴代琥珀酰亚胺(3.56g，20.0mmol)，并将溶液在此温度下搅拌2小时。加入硅胶(8.0g)，且将溶液在真空中蒸发得到浆液，通过在硅胶上进行快速色谱分离(洗脱液，己烷∶乙酸乙酯，90∶10至80∶20)。分离得到淡黄色固体状+3-溴-1-乙基-4-硝基-1H-吲哚(2.48g，9.22mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，269.0和271.0。

[0686] 步骤C：

[0687]

[0688] 在1，2-二甲氧基乙烷(20ml)和水(10ml)中混合3-溴-1-乙基-4-硝基-1H-吲哚(349.8mg，1.3mmol)(步骤B)、4-甲基苯基硼酸(194.4mg，1.43mmol)、四(三苯基膦)钯(90.1mg，0.08mmol)和碳酸钠(330.7mg，3.12mmol)，并将溶液在氩气下回流6小时。加入水，并以乙酸乙酯(3×25ml)萃取产物。蒸除溶剂，然后在硅胶上进行快速色谱分离(洗脱液，己烷∶乙酸乙酯，90∶10～80∶20)得到1-乙基-4-硝基-3-对甲苯基-1H-吲哚+(220mg，0.79mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，281.1。

[0689] 步骤D：

[0690] 将1-乙基-4-硝基-3-对甲苯基-1H-吲哚(220mg，0.78mmol)(步骤C)溶于甲醇和乙酸乙酯(3∶1，50ml)的混合物中，并加入10％Pd/C(22mg)。缓慢鼓入氢气通过溶液2小时。通过过滤除去催化剂，并蒸发溶剂。产物通过硅胶快速色谱法(洗脱液，己烷∶乙酸乙酯，90∶10～80∶20)纯化得到标题化合物(65mg，0.26mmol)，为无色油状物；LC/+MS，API-ES，Pos，(M+H)，251.2。

[0691] 实施例12

[0692] 1-乙基-3-对甲苯基-1H-吲唑-4-基胺(化合物44)

[0693]

[0694] 步骤A：

[0695]

[0696] 在0℃搅拌2-甲基-3-硝基-苯基胺(5.5g，36.15mmol)在冰醋酸(250ml)中的溶液。将亚硝酸钠(2.5g，36.15mmol)溶于水(6ml)中，并一次性加入该搅拌的溶液中，再继续搅拌15分钟。通过过滤滤除并丢弃黄色的沉淀物，并将溶液在室温下搅拌4小时。真空中除去溶剂，并加入水(20ml)。通过过滤分离沉淀并干燥得到粗产物。硅胶色谱法纯化(洗脱液，己烷∶乙酸乙酯，70∶30～50∶50)得到4-硝基-1H-吲唑(4.0g，24.52mmol)。

[0697] 步骤B：

[0698]

[0699] 将氢化钠(60％，0.40g，10mmol)分散在无水二甲基甲酰胺(8ml)中，并在-10℃搅拌。缓慢加入溶于二甲基甲酰胺(8ml)的4-硝基-1H-吲唑(1.0g，6.13mmol)(步骤A)，并溶液在此温度下搅拌20分钟。滴加碘乙烷(1.05g，6.73mmol)，并将溶液在环境温度下搅拌2小时。然后将溶液倾倒至冰-水上，且用二氯甲烷萃取产物。TLC和LC-MS分析表明存在两种异构体产物，通过硅胶柱色谱法(洗脱液，己烷∶乙酸乙酯，80∶20～60∶40)分离+
得到1-乙基-4-硝基-1H-吲唑(0.43g，2.24mmol)，LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，192.1，和+
异构体2-乙基-4-硝基-2H-吲唑(0.48g，2.51mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，192.1。

[0700] 步骤C：

[0701]

[0702] 将1-乙基-4-硝基-1H-吲唑(0.43g，2.26mmol)(步骤B)溶于冰醋酸(15ml)中，并加入溴(0.47g，2.94mmol)。溶液于80℃搅拌30分钟，并加入第二批溴(0.11g，0.68mmol)，且将溶液再搅拌30分钟。将溶液加入到饱和碳酸氢钠水溶液中，且用二氯甲烷萃取产物。有机层用水洗涤，并干燥(无水硫酸镁)，并在真空中蒸发溶剂得到粗产物。3-溴-1-乙基-4-硝基-1H-吲唑通过硅胶快速色谱法(洗脱液，己烷∶乙酸乙酯，+
80∶20～70∶30)纯化(0.59g，2.18mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，270.0和272.0。

[0703] 步骤D：

[0704]

[0705] 在1，2-二甲氧基乙烷(20ml)和水(10ml)中混合3-溴-1-乙基-4-硝基-1H-吲唑(0.59g，2.18mmol)(步骤C)、4-甲基苯基硼酸(0.36g，2.65mmol)、四(三苯基膦)钯(0.15g，0.13mmol)和碳酸钠(0.55g，5.19mmol)，并将溶液在氩气下回流8小时。加入水，并以乙酸乙酯(3×25ml)萃取产物。蒸除溶剂，然后在硅胶上进行快速色谱分离(洗脱液，己烷∶乙酸乙酯，90∶10～80∶20)得到1-乙基-4-硝基-3-对甲苯基-1H-吲唑(0.50g，+1.77mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，282.1。

[0706] 步骤E：

[0707] 将1-乙基-4-硝基-3-对甲苯基-1H-吲唑(0.50g，1.77mmol)(步骤D)溶于甲醇(80ml)和乙酸乙酯(20ml)的混合物中，并加入10％Pd/C(50mg)。缓慢鼓入氢气通过溶液，同时在环境温度下搅拌2小时。通过经硅藻土的过滤除去催化剂，并在真空中蒸发滤液。通过硅胶快速色谱法(洗脱液，己烷∶乙酸乙酯，90∶10～85∶15)纯化得到标题化+合物(0.33g，1.31mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，252.1。

[0708] 实施例13

[0709] 1-叔丁基-3-(4-氟-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4，6-二胺(化合物116)[0710]

[0711] 将5-氨基-1-叔丁基-3-(4-氟-苯基)-1H-吡唑-4-腈(1.0g，3.87mmol)，碳酸胍(1.22g，6.77mmol)和三乙胺(5ml)的混合物在密封管中于205℃加热2.5小时。加入水，并以乙酸乙酯(4×30ml)萃取产物。有机层用水和盐水洗涤，干燥(无水硫酸钠)并蒸发。将粗产物级分(1/4)以反相制备型HPLC分离，并合并所需的峰(水-乙腈梯度，0.05％三氟乙酸，70∶30～10∶90，20分钟，线性梯度；流速，15ml/分钟；色谱柱，Phenomenex Luna 5μC18，100x 21.2mm；UV 254和218nm)。蒸发溶剂然后从乙醚中结晶得到标题化合物(55mg，0.18mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)+，301.1。

[0712] 实施例14

[0713] [1-叔丁基-3-(4-氟-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基]-甲基-胺(化合物38)和[1-叔丁基-3-(4-氟-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基]-二甲基-胺
(化合物39)

[0714]

[0715] 将氢化钠(60％，22mg，0.55mmol)分散在无水二甲基甲酰胺(5ml)中，并在0℃进行搅拌。加入1-叔丁基-3-(4-氟-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(142.6mg，0.5mmol)溶于1ml二甲基甲酰胺的溶液，并搅拌溶液10分钟。加入碘甲烷(354.9mg，
2.5mmol)，并将溶液在环境温度下搅拌过夜。加入水，且用乙酸乙酯萃取产物。有机层用水和盐水洗涤，干燥(无水硫酸钠)并蒸发得到产物混合物。进行硅胶快速色谱法(洗脱液，己烷∶乙酸乙酯，90∶10～70∶30)得到标题化合物

[0716] [1-叔丁基-3-(4-氟-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基]-二甲基-胺+
(66.5mg，0.21mmol)，LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，314.1及

[0717] [1-叔丁基-3-(4-氟-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基]-甲基-胺+
(41.5mg，0.14mmol)，LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，300.1。

[0718] 实施例15

[0719] N-[1-叔丁基-3-(4-氟-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基]-乙酰胺(化合物118)和N-乙酰基-N-[1-叔丁基-3-(4-氟-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基]-乙酰胺(化合物117)

[0720]

[0721] 将1-叔丁基-3-(4-氟-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(142.6mg，0.5mmol)溶于2ml无水吡啶中，并在0℃搅拌该溶液。滴加乙酰氯(196.3mg，2.5mmol)，且溶液在环境温度下搅拌过夜。加入水，且用乙酸乙酯萃取产物。有机层用水和盐水洗涤，干燥(无水硫酸钠)并蒸发得到产物混合物。进行硅胶快速色谱法(洗脱液，己烷∶乙酸乙酯，90∶10～70∶30)得到标题化合物

[0722] N-乙酰基-N-[1-叔丁基-3-(4-氟-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基]-乙+酰胺(45.0mg，0.12mmol)，LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，370.1

[0723] 及N-[1-叔丁基-3-(4-氟-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基]-乙酰胺+
(12.7mg，0.04mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)328.1。

[0724] 实施例16

[0725] N-[1-叔丁基-3-(4-氟-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基]-苯甲酰胺(化合物40)

[0726]

[0727] 将1-叔丁基-3-(4-氟-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(142.6mg，0.5mmol)溶于2ml无水吡啶中，并在0℃搅拌该溶液。滴加苯甲酰氯(351.4mg，2.5mmol)，且溶液在环境温度下搅拌过夜。加入水，且用乙酸乙酯萃取产物。有机层用水和盐水洗涤，干燥(无水硫酸钠)并蒸发得到产物混合物。残余物在乙腈中搅拌，并通过过滤分离沉淀。
通过硅胶快速色谱法(洗脱液，己烷∶乙酸乙酯，90∶10～70∶30)纯化得到标题化合物+
(75.0mg，0.19mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，390.1。

[0728] 实施例17

[0729] 1-叔丁基-3-(4-氯-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺盐酸盐(化合物407)

[0730]

[0731] 将1-叔丁基-3-(4-氯-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(100mg，0.33mmol)溶于3ml的无水氯仿中，并加入HCl乙醚溶液(1M溶液，0.4ml，0.4mmol)。在环境温度下静置溶液1小时。蒸发部分溶剂后，生成沉淀，通过倾析分离，且残余物用少量乙+
醚和二氧杂环己烷洗涤得到标题化合物(80mg，0.24mmol)，LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，游离碱的母离子峰，302.1。

[0732] 实施例18

[0733] 4-(4-氨基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-苯甲酸乙酯(化合物123)

[0734]

[0735] 在1，2-二甲氧基乙烷(20ml)和水(10ml)中混合3-溴-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(351mg，1.3mmol)、4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊-2-基)苯甲酸乙酯(395mg，1.43mmol)、四(三苯基膦)钯(90mg，0.07mmol)和碳酸钠(330mg，3.11mmol)，并将溶液在氩气下回流6小时。加入水，并以乙酸乙酯(3×25ml)萃取产物。蒸发溶剂，然后进行硅胶快速色谱法(洗脱液，己烷∶乙酸乙酯，80∶20～60∶40)+
得到标题化合物，其从甲醇(80mg，0.24mmol)中结晶；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，340.1。

[0736] 实施例19

[0737] 4-氨基-1-叔丁基-3-对甲苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-甲酸(化合物45)[0738]

[0739] 步骤A：

[0740]

[0741] 将亚硫酰氯(22.3ml，0.3mol)加入到4-甲基-苯甲酸(27.1g，0.2mol)的乙醇(200ml)溶液中，并搅拌溶液过夜。蒸除溶剂得到4-甲基-苯甲酸乙酯(30g，0.18mol)，为粘稠状液体。

[0742] 步骤B：

[0743]

[0744] 向搅拌的乙腈(48ml，0.92mol)和甲苯(100ml)的溶液中，分份加入氢化钠(22g，0.92mol)。在50℃搅拌2小时后，加入4-甲基-苯甲酸乙酯(30g，0.18mol)(步骤A)的甲苯(100ml)溶液，并回流4小时。然后在真空下蒸发溶剂。残余物用冰(200ml)淬灭，并用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，在无水硫酸钠上干燥，浓缩，并通过柱色谱纯化得到
3-氧代-3-对甲苯基-丙腈(22g，0.14mol)。

[0745] 步骤C：

[0746]

[0747] 将3-氧代-3-对甲苯基-丙腈(22g，0.14mol)(步骤B)溶于异丙醇(500ml)中，加入三乙胺(40ml，0.28mol)，且搅拌混合物5分钟，然后加入叔丁基肼盐酸盐，混合物在氮气下回流5小时。将反应冷却至室温，并真空除去溶剂。将残余物溶于乙酸乙酯中，用水、盐水洗涤，并在无水硫酸钠上干燥。过滤有机层，真空下浓缩，负载到硅胶柱上，并纯化得到2-叔丁基-5-对甲苯基-2H-吡唑-3-基胺(24g，0.11mol)。

[0748] 步骤D：

[0749]

[0750] 将2-叔丁基-5-对甲苯基-2H-吡唑-3-基胺(10g，0.044mol)(步骤C)与(乙氧基亚甲基)丙二酸二乙酯(9.5g，0.044mol)一起在120℃搅拌4小时。将混合物溶于二氯甲烷中，吸附在硅胶上，并通过柱色谱纯化得到2-[(2-叔丁基-5-对甲苯基-2H-吡唑-3-基氨基)-亚甲基]-丙二酸二乙酯(10g，0.03mol)。

[0751] 步骤E：

[0752]

[0753] 在190℃，将2-[(2-叔丁基-5-对甲苯基-2H-吡唑-3-基氨基)-亚甲基]-丙二酸二乙酯(5g，12.5mmol)(步骤D)在二苯基醚(75ml)中搅拌48小时。将所得溶液冷却至室温，缓慢倾倒至硅胶柱上，并用石油醚洗脱得到1-叔丁基-4-羟基-3-对甲苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-甲酸乙酯(1.1g，3.11mmol)。

[0754] 步骤F：

[0755]

[0756] 将1-叔丁基-4-羟基-3-对甲苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-甲酸乙酯(1.1g，3.1mmol)(步骤E)在POCl3中回流4小时。真空下浓缩混合物以除去POCl3。残余物用水稀释，并用乙酸乙酯萃取。干燥萃取液(无水硫酸钠)，过滤并浓缩滤液，然后通过柱色谱纯化得到1-叔丁基-4-氯-3-对甲苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-甲酸乙酯(0.8g，
2.15mmol)。

[0757] 步骤G：

[0758]

[0759] 在密封的钢容器中，在110℃，将1-叔丁基-4-氯-3-对甲苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-甲酸乙酯(0.8g，2.2mmol)在25ml用氨饱和的乙醇中搅拌12小时。浓缩冷却的反应混合物，并用乙醚研磨残余物，并过滤。干燥滤液(无水硫酸钠)，过滤并浓缩滤液，然后通过柱色谱纯化得到4-氨基-1-叔丁基-3-对甲苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-甲酸乙酯(化合物45；0.5g，1.42mmol)。

[0760] 步骤H：

[0761] 将4-氨基-1-叔丁基-3-对甲苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-甲酸乙酯(0.5g，1.4mmol)在乙醇(95％)和氢氧化钠中于50℃搅拌过夜。浓缩混合物，将残余物溶于水(600ml)，过滤并以乙酸酸化。收集形成的沉淀，用水洗涤并在空气中干燥得到4-氨基-1-叔丁基-3-对甲苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-甲酸(0.3g，0.92mmol)，为白色-
固体；LC/MS，APCI，Neg，(M-H)，323.3。

[0762] 实施例20

[0763] 1-叔丁基-3-对甲苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基胺(化合物69).

[0764]

[0765] 将4-氨基-1-叔丁基-3-对甲苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-甲酸(0.1g，0.3mmol)在氮气氛围中于180℃加热48小时。所得产物通过柱色谱法纯化得到1-叔丁基-3-对甲苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基胺(20mg，0.07mmol)，为淡棕色固体；LC/+
MS，APCI，Pos，(M+H)，281.5。

[0766] 实施例21

[0767] 1-叔丁基-3-苯氧基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(化合物90)

[0768]

[0769] 将3-溴-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(540mg，2mmol)(实施例10，步骤C)和苯酚(753mg，8mmol)与几滴1-戊醇混合，并在120℃加热5分钟。加入碳酸钾(1.1g，8mmol)和铜粉(51mg，0.8mmol)，并将混合物在195℃加热1小时。加入水，且用二氯甲烷萃取产物。有机层以水洗涤，干燥(无水硫酸钠)并蒸发得到残余物，该残余物以反相制备性HPLC分离(水-乙腈梯度，0.05％三氟乙酸，70∶30～10∶90，20分钟，线性梯度；流速，15ml/分钟；色谱柱，Phenomenex Luna 5μC18，100x 21.2mm；UV 254和218nm)。
合并期望的峰，并在真空中蒸除溶剂。将残余物溶于二氯甲烷中，溶液以饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，再以水洗涤，蒸除溶剂得到标题化合物(50mg，0.18mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，+
(M+H)，284.2。

[0770] 实施例22

[0771]

[0772] 3-苄基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(化合物11)

[0773] 步骤A：

[0774]

[0775] 将丙二腈(8.95g，135.4mmol)溶于无水的四氢呋喃(400ml)中，所得溶液在冰水浴中搅拌。分批加入氢化钠(60％在矿物油中，10.8g，270mmol)，然后滴加苄氧基乙酰氯(25g，135.4mmol，在四氢呋喃中，50ml)。将溶液在环境温度下搅拌2小时。加入1M的盐酸(500ml)，且溶液以乙酸乙酯(3×250ml)萃取。有机层以水洗涤，干燥(无水硫酸钠)并在真空中蒸发得到残余物，该残余物以己烷研磨得到2-(2-苄氧基乙酰基)-丙二腈，为无定形粉末，其以这种形式直接用于下一步；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)+，215.2。

[0776] 步骤B：

[0777]

[0778] 将在二氧杂环己烷(500ml)中的在上一步中得到的2-(2-苄氧基乙酰基)-丙二腈(135.4mmol)、碳酸钾(31.7g，230.2mmol)和硫酸二甲酯(23.9g，189.5mmol)在85℃搅拌3小时。将溶液过滤并蒸除溶剂得到残余物，该残余物经硅胶色谱法分离(洗脱液；己烷-乙酸乙酯梯度)得到2-(2-苄氧基-1-甲氧基-亚乙基)-丙二腈(12.9g，56.5mmol)；+
LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，229.2。

[0779] 步骤C：

[0780]

[0781] 将在无水乙醇(300ml)中的2-(2-苄氧基-1-甲氧基-亚乙基)-丙二腈(12.9g，56.5mmol)、叔丁基肼盐酸盐(6.95g，55.7mmol)和三乙胺(7.3g，72.1mmol)加热回流2小时。经过滤除去不可溶物质，在真空中除去溶剂得到残余物，该残余物以快速硅胶色谱法分离。以己烷-乙酸乙酯的梯度洗脱得到5-氨基-3-苄氧基甲基-1-叔丁基-1H-吡唑-4-腈+
(12.1g，42.5mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，285.3。

[0782] 步骤D：

[0783]

[0784] 将在甲酰胺(170ml)中的5-氨基-3-苄氧基甲基-1-叔丁基-1H-吡唑-4-腈(12.1g，42.5mmol)在185℃加热2.5小时。将所得溶液在室温下静置过夜，通过过滤分离沉积的晶体物质。晶体以甲酰胺洗涤，再以水洗涤，在空气中干燥而得到3-苄氧基甲基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(化合物81；9.2g，29.5mmol)；LC-MS，API-ES，Pos，+
(M+H)，312.3。

[0785] 步骤E：

[0786]

[0787] 将3-苄氧基甲基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(4.0g，12.9mmol)溶于无水二氯甲烷中(130ml)并在-78℃搅拌。在搅拌时滴加三氯化硼(1M的庚烷溶液，51.8ml，51.8mmol)，并将溶液温热至0℃，并在此温度下搅拌15分钟。将该溶液冷却至-78℃并加入甲醇(71ml)。将溶液温热至0℃，并以氢氧化铵中和至pH为7。将溶液过滤，滤液在真空中蒸发得到残余物，该残余物从少量乙醚和己烷结晶得到(4-氨基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-甲醇(化合物148；2.4g，10.8mmol)；LC-MS，API-ES，Pos，(M+H)+，222.2。

[0788] 步骤F：

[0789]

[0790] 将(4-氨基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-甲醇(2.93g，13.2mmol)溶于氯仿(150ml)中，并加入二氧化锰(11.5g，132.3mmol)。将溶液在室温下搅拌20小时，并通过一层硅藻土过滤。在真空中蒸发滤液，残余物从乙腈中结晶得到4-氨基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-甲醛(化合物149；2.3g，10.4mmol)；LC-MS，API-ES，Pos，+(M+H)，220.2。

[0791] 步骤G：

[0792]

[0793] 在0℃，向搅拌的4-氨基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-甲醛(0.49g，2.2mmol)的无水四氢呋喃溶液中滴加苯基溴化镁(1M的四氢呋喃溶液，2.45ml，
2.45mmol)。将该溶液在0℃搅拌0.5小时，然后在环境温度下搅拌1.5小时。加入饱和的氯化铵溶液(50ml)，并以二氯甲烷萃取产物。有机层以水洗涤，干燥(无水硫酸钠)并蒸发溶剂得到残余物，该残余物经快速硅胶色谱法纯化(洗脱液，己烷-乙酸乙酯梯度)得到(4-氨基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-苯基-甲醇(化合物82；0.19g，+
0.64mmol)；LC-MS，API-ES，Pos，(M+H)，298.3。

[0794] 步骤H：

[0795] 将(4-氨基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-苯基-甲醇(20mg，0.06mmol)溶于三氟乙酸中(1ml)，并在冰浴中冷却此溶液。加入三乙基硅烷(23mg，
0.20mmol)，并将混合物搅拌过夜。蒸除溶剂，残余物在真空中干燥并以己烷研磨，得到标题+
化合物，为灰白色固体(15mg，0.05mmol)；LC-MS，API-ES，Pos，(M+H)，282.3。

[0796] 实施例23

[0797]

[0798] (4-氨基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-苯基-甲酮(化合物83)[0799] 将(4-氨基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-苯基-甲醇(90mg，0.27mmol)(实施例19，步骤G)溶于无水二氯甲烷中(5ml)并在0℃搅拌。加入Dess-Martin试剂(Dess-Martin periodinane)溶液(0.3M的二氯甲烷溶液，1.85ml，0.55mmol)，并将溶液在此温度下搅拌1.5小时。先后以亚硫酸钠水溶液(1.3M的溶液，4ml)、饱和碳酸氢钠溶液(4ml)淬灭反应，并在0℃搅拌0.5小时。溶液以二氯甲烷萃取，以水洗涤，干燥(无水硫酸钠)，并在真空中除去溶剂得到残余物，该残余物以快速硅胶色谱法纯化(洗脱液，己烷-乙酸乙酯梯度)得到标题化合物(42mg，0.14mmol)；LC-MS，API-ES，Pos，(M+H)+，296.3。

[0800] 实施例24

[0801]

[0802] 4-氨基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-甲酸(化合物85)

[0803] 将4-氨基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-甲醛(150mg，0.68mmol)溶于丙酮(5ml)中，加入高锰酸钾(216mg，1.36mmol)的丙酮-水(1∶1，2ml)的溶液。溶液在环境温度下搅拌过夜。加入乙酸(3ml)，并以二氯甲烷萃取产物。有机层以水洗涤，干燥(无水硫酸钠)并在真空中蒸发得到残余物，该残余物从乙腈-甲醇中结晶得到标题化合物+ -(80mg，0.34mmol)；LC-MS，API-ES，Pos，(M+H)，236.2，API-ES，Neg，(M-H)，233.9。

[0804] 实施例25

[0805]

[0806] 4-氨基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-羧酸苄基酰胺(carboxylic acidbenzylamide)(化合物160)

[0807] 将4-氨基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-甲酸(47mg，0.2mmol)和苄胺(24mg，0.22mmol)溶于无水二甲基甲酰胺(2ml)中。加入二异丙基乙基胺(77mg，0.6mmol)和2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基六氟磷酸盐(HBTU，83mg，0.22mmol)，并将溶液在环境温度下搅拌过夜。将溶液过滤并以反相制备型HPLC分离(水-乙腈梯度，0.05％甲酸，80∶20～10∶90，20分钟，线性梯度；流速，15ml/分钟；色谱柱，Phenomenex Luna 5μC18，100x21.2mm；UV 254和218nm)，得到标题化合物(31mg，0.1mmol，从乙腈结+
晶)，LC-MS，API-ES，Pos，(M+H)，325.3。

[0808] 实施例26

[0809]

[0810] 4-氨基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-腈(化合物159).

[0811] 步骤A：

[0812]

[0813] 在冰冷却下，向搅拌的精细研磨的叔丁基肼盐酸盐(12.5g，0.1mol)的乙醇(95％，100ml)混悬液中，加入NaOH(4.0g，0.1mol)的乙醇(150ml)溶液。加入精细研磨的四氰基乙烯(12.8g，0.1mol)，以约10ml乙醇完成转移。将混合物在环境温度下搅拌0.5小时，从深红色溶液中过滤出白色沉淀(由产物和NaCl组成)，并以最少量的乙醇(5-10ml)洗涤。沉淀以乙腈(5×50ml)彻底洗涤并过滤。滤液在真空下浓缩并以乙醚重结晶得到5-氨基-1-叔丁基-1H-吡唑-3，4-二腈(8.63g，45.6mmol)，为淡粉红色固体；LC-MS，API-ES，-Neg，(M-H)，187.9。

[0814] 步骤B：

[0815]

[0816] 将5-氨基-1-叔丁基-1H-吡唑-3，4-二腈(6.56g，35mmol)在原甲酸三乙酯(60ml，350mmol)中回流3天，直至反应完成(LCMS)。浓缩混合物并在真空下干燥。所得黄色固体[N-(2-叔丁基-4，5-二氰基-2H-吡唑-3-基)-甲酰胺]无需另外的纯化，而用于下一步骤；LC-MS API-ES，Neg，(M-H)-，215.9。

[0817] 步骤C：

[0818] 将N-(2-叔丁基-4，5-二氰基-2H-吡唑-3-基)-甲酰胺(35mmol，步骤B)溶于甲醇(150ml)中。向溶液中加入氨溶液(7N的甲醇溶液，6.0ml，42mmol)，并将混合物搅拌2小时。在真空中浓缩混合物并通过硅胶色谱法分离(洗脱液，二氯甲烷-甲醇，100∶0～80∶20)，得到标题化合物，为黄色固体。从乙酸乙酯重结晶得到分析样品，为灰白色固体(3.67g，16.9mmol)；LC-MS，API-ES，Pos.，(M+H)+，217.2。

[0819] 实施例27

[0820]

[0821] 4-氨基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-甲酰胺(化合物89).

[0822] 将4-氨基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-腈(216mg，1mmol)与浓缩的氢氧化铵水溶液(28％，4ml)和过氧化氢(30-35％，1ml)混合。混合物搅拌过夜，过滤，以+水洗涤得到标题化合物(207mg，0.88mmol)，为灰白色固体；LC-MS，API-ES，Pos.，(M+H)，
235.2。

[0823] 实施例28

[0824]

[0825] 1-叔丁基-3-(3-三氟甲基-苯硫基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(化合物244)

[0826] 将3-溴-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4基胺(0.50g，1.85mmol)、CuI(0.0176g，0.093mmol)、碳酸钾粉末(0.511g，3.70mmol)、乙二醇(0.21ml，3.70mmol)、
2-丙醇(1.86ml)和3-三氟甲基苯硫酚(0.33g，1.85mmol)置于盛有磁力搅拌子的微波反应管中，脱气，并在微波反应器中在130℃加热30分钟。将反应混合物加入饱和的硫代硫酸钠水溶液中，并以二氯甲烷(3×15ml)萃取。有机层用水、盐水洗涤，并在无水硫酸钠上干燥，过滤，浓缩，通过快速硅胶柱色谱法纯化(洗脱液，己烷-乙酸乙酯)，然后通过制备型RPHPLC纯化(水-乙腈梯度，0.05％甲酸)，而获得1-叔丁基-3-(3-三氟甲基-苯硫+
基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(0.30g，0.82mmol)；LC-MS，API-ES，Pos.，(M+H)，
340.1。

[0827] 实施例29

[0828]

[0829] 3-苯磺酰基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(化合物191)

[0830] 步骤A：

[0831]

[0832] 向搅拌的1-叔丁基-3-苯硫基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(380mg，1.27mmol)的氯仿(30ml)溶液中，加入3-氯过氧苯甲酸(70-75％，1.56g，6.35mmol)，将混合物回流1天，直至起始原料已经消耗(LCMS)。将所得的氧化物的混合物以饱和碳酸氢钠水溶液(100ml)洗涤，水层以二氯甲烷(3×20ml)萃取，萃取液以盐水(20ml)洗涤，在硫酸镁上干燥，在真空下浓缩，并在硅胶上纯化(50g，洗脱液，二氯甲烷-乙腈，100∶0～
0∶100)而得到两种氧化物：3-苯磺酰基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(152mg，0.46mmol)和3-苯亚磺酰基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(化合+
物173，217mg，0.69mmol)，为白色固体，LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，316.1。

[0833] 步骤B：

[0834] 将3-苯亚磺酰基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(370mg，1.17mmol)溶于乙腈(20ml)中，加入4-甲基吗啉N-氧化物(0.56g，4.8mmol)和四氧化锇溶液(2.5％的丁醇溶液，0.13ml，0.01mmol)，并将混合物在微波反应器中在70℃加热
90分钟，直至反应完成(LCMS)。在真空下浓缩混合物，以二氯甲烷稀释(20ml)，以水进行分配(100ml)，水层以二氯甲烷(2×15ml)萃取。合并的有机萃取液以盐水(15ml)洗涤，在硫酸镁上干燥，并在真空下浓缩。残余物通过硅胶色谱法纯化(洗脱液，二氯甲烷-乙腈，100∶0～0∶100)得到3-苯磺酰基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺+
(223mg，0.67mmol)，为灰白色晶体；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，332.1。

[0835] 实施例30

[0836]

[0837] 1-叔丁基-3-(异喹啉-1-基氧基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(化合物370)

[0838] 步骤A：

[0839]

[0840] 将四氰基乙烯(12.8g，100mmol)与在(50ml)甲醇中的脲(2.0g，33.3mmol)在50℃搅拌0.5小时。加入乙醚(250ml)并将溶液冷冻至-78℃。在冰冷状态下通过过滤分离沉淀，而得到2-二甲氧基亚甲基-丙二腈(5.6g，40.5mmol)，为灰白色固体，LC/MS，API-ES，+
Pos，(M+H)，139.1。处理母液，另外得到2.1g产物(15mmol)。

[0841] 步骤B：

[0842]

[0843] 将2-二甲氧基亚甲基-丙二腈(4.26g，30.9mmol)(步骤A)、三乙胺(4.07g，40.2mmol)和叔丁基肼盐酸盐(3.86g，30.9mmol)在甲醇(100ml)中的混合物在回流下加热2小时。过滤溶液，并在真空中蒸除溶剂得到残余物，该残余物经快速硅胶柱色谱法纯化(洗脱液，己烷∶乙酸乙酯，90∶10～10∶90)得到5-氨基-1-叔丁基-3-甲氧基-1H-吡+
唑-4-腈(3.83g，19.7mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，195.3。

[0844] 步骤C：

[0845]

[0846] 将5-氨基-1-叔丁基-3-甲氧基-1H-吡唑-4-腈(3.8g，19.6mmol)(步骤B)和甲酰胺(50ml)的混合物在185℃加热2小时。将混合物冷却至环境温度，并通过过滤分离沉淀的固体。该固体以甲酰胺洗涤，再以水洗涤，在空气中干燥而得到1-叔丁基-3-甲氧基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(化合物312；2.83g，12.8mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，+(M+H)，222.3。

[0847] 步骤D：

[0848]

[0849] 向1-叔丁基-3-甲氧基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(2.83g，12.8mmol)(步骤C)和碘化钠(3.83g，25.6mmol)在乙腈(100ml)中的混合物中加入三甲基氯硅烷(2.78g，25.6mmol)，并将溶液在氩气下回流过夜。LC-MS分析显示约有20％的未反应的起始原料存在。加入第二批碘化钠(0.58g，3.8mmol)和三甲基氯硅烷(0.42g，3.8mmol)，并将溶液另外回流12小时。过滤溶液，在真空中除去溶剂得到残余物。从乙腈和水结晶得到4-氨基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-醇(化合物325；2.2g，10.6mmol)；LC/+
MS，API-ES，Pos，(M+H)，208.3。

[0850] 步骤E：

[0851] 将4-氨基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-醇(步骤D)(104mg，0.5mmol)、1-氯异喹啉(98mg，0.6mmol)与碳酸钾(83mg，0.6mmo)在无水二甲基亚砜(2ml)中的混合物在130℃搅拌4小时。加入水(15ml)，并以乙酸乙酯(3×10ml)萃取产物。合并的有机层用水洗涤，干燥(无水硫酸钠)并在真空中蒸发。残余物以反相制备型HPLC分离(水-乙腈梯度，0.05％甲酸，80∶20～10∶90，20分钟，线性梯度；流速，15ml/分钟；色谱柱，PhenomenexLuna 5μC18，100×21.2mm；UV 254和218nm)，得到1-叔丁基-3-(异喹啉-1-基氧基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(23mg，0.07mmol)；LC-MS，API-ES，Pos，+
(M+H)，335.3。

[0852] 实施例31

[0853]

[0854] 1-[4-氨基-3-(4-氯-苯基)-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基]-乙酮(化合物181).[0855] 向3-(4-氯苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺(100mg，0.41mmol)的二甲基甲酰胺(5ml)的混悬液中，加入吡啶(39mg，0.49mmol)。滴加在1ml DMF中的乙酰氯(35mg，0.45mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。另外加入1.2当量的吡啶和1.1当量的乙酰氯，并将溶液搅拌1小时。重复此过程一次，并将混合物倾入水中，以乙酸乙酯萃取。
有机层用水洗涤，干燥(无水硫酸钠)并蒸发。从丙酮结晶残余物得到标题化合物(40mg，+
0.14mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，288.0，290.0。

[0856] 实施例32

[0857]

[0858] 4-氨基-3-(4-氯-苯基)-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-甲酸甲酯(化合物186).

[0859] 向3-(4-氯苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺(200mg，0.81mmol)的二甲基甲酰胺(5ml)的混悬液中，加入吡啶(77mg，0.98mmol)。滴加氯甲酸甲酯(84mg，0.90mmol)。另外加入1.2当量的吡啶和1.1当量的氯甲酸甲酯，随后搅拌1小时。重复此过程两次。将混合物倾入水中，并用乙酸乙酯萃取。有机层用水洗涤，干燥(无水硫酸钠)并蒸发。以乙+
酸乙酯研磨得到标题化合物(57mg，0.19mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，304.0，306.0。

[0860] 实施例33

[0861]

[0862] 1-叔丁基-3-(萘-1-基氧基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(化合物198).[0863] 将3-溴-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(500mg，1.85mmol)(实施例10，步骤C)、2，2，6，6-四甲基-庚烷-3，5-二酮(34.1mg，0.18mmol)、氯化亚铜(91.6mg，0.92mmol)和碳酸铯(1.21g，3.71mmol)在N-甲基吡咯烷酮(4ml)中的混合物在120℃在氩气氛围中加热18小时。加入水，且用二氯甲烷萃取产物。有机层以水洗涤，干燥(无水硫酸钠)并在真空中蒸发得到残余物，该残余物经硅胶快速柱色谱法纯化(洗脱液，己烷-乙酸乙酯梯度)。合并含有期望物质的级分，并蒸发溶剂。残余物经反相制备型HPLC分离，并收集基于在254nm下的紫外吸收的峰(水-乙腈梯度，0.05％甲酸，80∶20～10∶90，20分钟，线性梯度；流速，15ml/分钟；色谱柱，PhenomenexLuna 5μC18，100×21.2mm；UV 254和218nm)。合并含有期望物质的级分，并在真空中蒸发溶剂。以乙腈研磨得到标题化合物+
(9mg，0.19mmol)(9mg，0.03mmol)，LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，334.2。

[0864] 实施例34

[0865]

[0866] 3-(4-氯-苯基)-1-甲磺酰基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(化合物203).[0867] 向3-(4-氯苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺(200mg，0.81mmol)的二氯甲烷(5ml)的混悬液中，加入吡啶(77mg，0.98mmol)，然后加入甲磺酰氯(102mg，0.90mmol)。1.5小时后，加入另外的1.2当量吡啶，并将反应搅拌过夜。加入1.1当量的甲磺酰氯和1.2当量的吡啶，并将反应在环境温度下搅拌4小时。反应以5ml水淬灭，并以二氯甲烷萃取。
有机层以水洗涤，干燥(无水硫酸钠)并蒸发得到残余物，该残余物经硅胶柱色谱法分离(洗脱液；二氯甲烷-甲醇梯度)得到标题化合物(33mg，0.10mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)+，324.0，326.0。

[0868] 实施例35

[0869]

[0870] N-乙酰基-N-[5-(4-氯-苯基)-7-乙基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基]-乙酰胺(化合物211).

[0871] 向搅拌的5-(4-氯-苯基)-7-乙基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基胺(42mg，0.15mmol)的吡啶(2ml)溶液中，加入乙酰氯(0.15ml，1.5mmol)，并将反应混合物在60℃搅拌1天直至反应完成(LCMS)。混合物在真空中浓缩并通过硅胶色谱法纯化(10g，洗脱液，己烷-乙酸乙酯100∶0～0∶100)得到标题化合物(36mg，0.10mmol)，为白色固体；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)+，357.1，359.1。

[0872] 实施例36

[0873]

[0874] 4-氨基-3-(4-氯-苯基)-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-甲酸乙基酰胺(carboxylic acidethylamide)(化合物213)

[0875] 步骤A：

[0876]

[0877] 向3-(4-氯苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺(500mg，2.04mmol)的二甲基甲酰胺(7ml)混悬液中，加入吡啶(193mg，2.44mmol)和甲磺酰氯(257mg，2.24mmol)。在环境温度下搅拌1小时后，另外加入吡啶(193mg，2.44mmol)和甲磺酰氯(257mg，2.24mmol)，并将溶液搅拌2小时。将反应混合物倾入水中，并以20ml饱和碳酸氢钠水溶液碱化。沉淀产物通过过滤分离并以丙酮洗涤，得到N′-[3-(4-氯-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基]-N，N-二甲基-甲脒，为棕色固体(397mg，1.32mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，+(M+H)，301.0，303.1。

[0878] 步骤B：

[0879]

[0880] 向N′-(3-(4-氯苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基)-N，N-二甲基甲脒(200mg，0.67mmol)的二氧杂环己烷(8ml)的混悬液中，加入异氰酸乙酯(0.05ml，
0.67mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1小时，再在60℃加热2小时。将混合物在20℃搅拌过夜，另外加入1.2当量的异氰酸乙酯，再在40℃搅拌8小时。在真空中蒸发混合物，残余物以丙酮研磨得到3-(4-氯苯基)-4-(二甲基氨基-亚甲基氨基)-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-甲酸乙基酰胺(180mg，0.48mmol)。

[0881] 步骤C：

[0882] 将3-(4-氯-苯基)-4-(二甲基氨基-亚甲基氨基)-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-甲酸乙基酰胺(150mg，0.40mmol)溶于1摩尔的盐酸乙腈溶液(10ml)中。将混合物在25℃搅拌过夜。然后将混合物在减压下浓缩，以饱和碳酸钠水溶液(pH 8)中和并过滤。固体从丙+酮研磨得到标题化合物(60mg，0.18mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，316.7，318.9。

[0883] 实施例37

[0884]

[0885] 3-(3-氯-苯氧基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(化合物220)

[0886] 在0℃，向搅拌的浓硫酸中分批加入1-叔丁基-3-(3-氯-苯氧基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(1g，3.3mmol)(根据与实施例21相似的方法从3-氯苯酚和3-溴-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺制备)。将溶液在此温度下搅拌15分钟，再在环境温度下搅拌30分钟。将溶液缓慢倾入在冰上，并通过过滤分离沉淀物。过滤的水溶液以碳酸钠水溶液中和，并通过过滤分离沉淀。合并的沉淀以水洗涤并空气干燥。
以少量的甲醇研磨得到标题化合物(化合物220；0.61g，2.48mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，+
(M+H)，262.0，264.0。

[0887] 实施例38

[0888]

[0889] 3-(3-氯-苯氧基)-1-环戊基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(化合物221).[0890] 将3-(3-氯-苯氧基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(150mg，0.57mmol)，溴代环戊烷(169.9mg，1.14mmol)和碳酸钾(173.1mg，1.25mmol)在无水二甲基甲酰胺(2ml)中的混合物在70℃搅拌4小时。加入水，且用二氯甲烷萃取产物。有机层用水洗涤，干燥(无水硫酸钠)并在真空中蒸发。残余物经反相制备型HPLC分离(水-乙腈梯度，0.05％甲酸，80∶20～10∶90，20分钟，线性梯度；流速，15ml/分钟；色谱柱，Phenomenex Luna5μC18，100×21.2mm；UV 254和218nm)。合并含有期望物质的级分，并在真空中蒸发溶剂得到标题化合物(19mg，0.06mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)+，330.1，332.1。

[0891] 实施例39

[0892]

[0893] 1-乙基-N3-苯基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3，4-二胺(化合物223).

[0894] 步骤A：

[0895]

[0896] 将2-(双-甲基硫基-亚甲基)-丙二腈(3.40g，20mmol)和苯胺(1.82ml，20mmol)在乙醇(50ml)中回流1.5小时，直至反应完成(LCMS)。冷却混合物，过滤形成的沉淀，以乙醇(3×7ml)洗涤，在空气中干燥得到2-(甲基硫基-苯基氨基-亚甲基)-丙二腈(2.97g，13.8mmol)，为灰白色固体。

[0897] 步骤B：

[0898]

[0899] 向搅拌的2-(甲基硫基-苯基氨基-亚甲基)-丙二腈(215mg，1.0mmol)和乙基肼草酸盐(150mg，1.0mmol)的乙醇混悬液(20ml)中，加入三乙胺(0.14ml，1.0mmol)，并将混合物回流15小时，冷却，并在真空中浓缩。LCMS分析显示有两种异构体产物存在，通过硅胶柱色谱法分离两种异构体(50g，洗脱液，己烷-乙酸乙酯100∶0至0∶100)得到5-氨基-1-乙基-3-苯基氨基-1H-吡唑-4-腈(93mg，0.41mmol)，为白色低熔点固体，LCMS，3.42分钟，API-ES，Pos，(M+H)+，228.1；以及异构体3-氨基-1-乙基-5-苯基氨基-1H-吡唑-4-腈(39mg，0.17mmol)，为灰白色固体，LC/MS，3.18分钟。

[0900] 步骤C：

[0901] 将5-氨基-1-乙基-3-苯基氨基-1H-吡唑-4-腈(92mg，0.40mmol)在190℃在甲酰胺(6ml)中搅拌6小时。以水(10ml)稀释混合物，过滤，以水洗涤(3×5ml)，干燥，再溶解于THF中(20ml)，以活性炭处理，通过硅藻土过滤，在真空中浓缩，并在通过硅胶色谱法纯化(10g，洗脱液，二氯甲烷-甲醇，100∶0～80∶30)得到1-乙基-N3-苯基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3，4-二胺(41mg，0.16mmol)，为灰白色固体，LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)+，255.1。

[0902] 实施例40

[0903]

[0904] 1-嘧啶-2-基-3-对甲苯基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(化合物229).[0905] 将3-对甲苯基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(245.6mg，1mmol)，2-氯嘧啶(137.4mg，1.2mmol)和碳酸钾(165.6mg，1.2mmol)在无水二甲基亚砜(2ml)中的混合物在110℃在氩气氛围中搅拌2小时。加入水，且用二氯甲烷萃取产物。有机层用水洗涤，干燥(无水硫酸钠)并在真空中蒸发。残余物以乙腈研磨，并经反相制备型HPLC分离(水-乙腈梯度，0.05％甲酸，80∶20～10∶90，20分钟，线性梯度；流速，15ml/分钟；色谱柱，PhenomenexLuna 5μC18，100×21.2mm；UV 254和218nm)。合并含有期望物质的级分，并+
在真空中蒸发溶剂得到标题化合物(33mg，0.10mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，324.0，
326.0。

[0906] 实施例41

[0907]

[0908] 1-[1-叔丁基-3-(4-氯-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基]-3-苯基-脲(化合物230).

[0909] 将1-叔丁基-3-(4-氯苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺(100mg，0.33mmol)和苯异氰酸酯(39.5mg，0.33mmol)在二氧杂环己烷中(2ml)的混合物在室温下搅拌过夜。在真空中除去溶剂，并以丙酮研磨残余物得到标题化合物(60mg，0.14mmol)；LC/MS，-API-ES，Neg，(M-H)，419.3，421.2。

[0910] 实施例42

[0911]

[0912] N′-[1-叔丁基-3-(4-氯-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基]-N，N-二甲基-甲脒(化合物232).

[0913] 将1-叔丁基-3-(4-氯苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺(150mg，0.50mmol)溶于2ml二甲基甲酰胺二甲缩醛中。混合物在室温下搅拌过夜。在真空中蒸发溶剂，产物经硅胶柱色谱法纯化(洗脱液；二氯甲烷∶甲醇，10∶1)得到产物，为粘性固体。该物质以己烷在超声波浴中处理。分离得到产物，为沉淀，该沉淀通过过滤收集得到标题化合物+(84mg，0.24mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，357.3，359.3。

[0914] 实施例43

[0915]

[0916] (1-叔丁基-3-对甲苯基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基)-嘧啶-2-基-胺(化合物234).

[0917] 步骤A：

[0918]

[0919] 将3-溴-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(1.35g，5.0mmol)(实施例10，步骤C)，2-氯嘧啶(1.15g，10.0mmol)和碳酸钾(1.38g，10.0mmol)在无水二甲基亚砜(10ml)中的混合物在120℃在氩气氛围中搅拌12小时。加入水，且用二氯甲烷萃取产物。有机层用水洗涤，干燥(无水硫酸钠)并蒸发。残余物在环境温度下在乙腈中搅拌，沉淀物质通过过滤分离，在空气中干燥得到(3-溴-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基)-嘧啶-2-基-胺(0.69g，1.98mmol)。该化合物如此直接用于下一步骤。

[0920] 步骤B：

[0921] 将(3-溴-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基)-嘧啶-2-基-胺(348.2mg，1mmol)、4-甲基苯硼酸(149.6mg，1.1mmol)、碳酸钠(254.4mg，2.4mmol)和四(三苯基膦)钯(69.3mg，0.06mmol)在乙二醇二甲基醚(25ml)和水(12.5ml)中的混合物在氩气氛围中回流加热6小时。加入水，且用二氯甲烷萃取产物。有机层用水洗涤，干燥(无水硫酸钠)并在真空中蒸发。残余物经反相制备型HPLC分离(水-乙腈梯度，0.05％甲酸，80∶20～10∶90，20分钟，线性梯度；流速，15ml/分钟；色谱柱，Phenomenex Luna
5μC18，100×21.2mm；UV 254和218nm)。合并含有期望物质的级分，并在真空中蒸发。以甲醇研磨，再以乙腈研磨，得到标题化合物(113mg，0.31mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)+，
360.1。

[0922] 实施例44

[0923]

[0924] 5-(4-氯-苯基)-7-环丙基甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基胺(化合物242).

[0925] 步骤A：

[0926]

[0927] 向六亚甲基四胺(17.6g，125.5mmol)的乙醇(500ml)溶液中滴加2-溴-4’-氯苯乙酮(26.6g，114.1mmol)的氯仿(60ml)溶液。在1小时后加入碘化钠(17.1g，114.1mmol)。将混合物在室温下搅拌24小时。过滤沉淀并以冰乙醇洗涤。该物质以乙醇(100ml)和浓盐酸(36.5ml，433mmol)稀释，并在55℃加热30分钟。冷却混合物并使其蒸发24小时。
固体以己烷稀释，搅拌15分钟，过滤得到2-氨基-1-(4-氯-苯基)-乙酮盐酸盐(15.9g，
77.2mmol)。该化合物如此直接用于下一步骤。

[0928] 步骤B：

[0929]

[0930] 向冷却至0℃的乙酸酐(30.5ml，323.2mmol)中加入2-氨基-1-(4-氯-苯基)-乙酮盐酸盐(15.9g，77.2mmol)，再加入醋酸钠(12.6g，154.3mmol)在水(30ml)中的溶液。将溶液在0℃保持30分钟。温热至室温，搅拌4小时，并以1N的盐酸稀释。水层以二氯甲烷萃取。有机层以盐水洗涤、干燥(MgSO4)，并在真空中浓缩得到N-[2-(4-氯-苯基)-2-氧代-乙基]-乙酰胺(13.0g，61.4mmol)。该化合物如此直接用于下一步骤。

[0931] 步骤C：

[0932]

[0933] 向N-[2-(4-氯-苯基)-2-氧代-乙基]-乙酰胺(13.0g，61.4mmol)的甲醇(100ml)溶液中加入丙二腈(5.5g，83.1mmol)。将溶液冷却至0℃，并加入50％的氢氧化钾水溶液直至pH达到10～12。将此深色溶液在0℃搅拌20分钟，然后在65℃加热6小时。将混合物冷却至室温并倾倒在冰上。过滤沉淀，以水洗涤，在真空中干燥得到2-氨基-4-(4-氯-苯基)-1H-吡咯-3-腈(10.4g，47.8mmol)。该化合物如此直接用于下一步骤。

[0934] 步骤D：

[0935]

[0936] 2-氨基-4-(4-氯-苯基)-1H-吡咯-3-腈(3.6g，16.5mmol)以甲酰胺(25ml，628.3mmol)稀释，并在185℃加热4小时。将该溶液冷却至室温，以水稀释，并以乙酸乙酯萃取。浓缩有机层。所得固体以水-丙酮(4∶1)研磨，过滤，再次以乙醚研磨。固体在真空中干燥得到5-(4-氯-苯基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基胺(2.9g，11.9mmol)。该化合物如此直接用于下一步骤。

[0937] 步骤E：

[0938] 向在DMF(3ml)中的5-(4-氯-苯基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基胺(190mg，0.78mmol)中加入乙醇钠(64mg，0.94mmol)。将混合物在室温下搅拌15分钟，再加入溴代甲基环丙烷(115mg，0.86mmol)。将溶液搅拌16小时。粗产物经反相制备型LC/MS纯化(水-乙腈梯度，0.05％甲酸，95∶5～5∶95，14分钟，线性梯度；流速，42ml/分钟；色谱柱，Phenomenex Luna 5μC18(2)，100×30mm；UV 254和218nm)。合并含有期望物质的级+
分，并在真空中蒸发得到标题化合物(16mg，53.5mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，299.1。

[0939] 实施例45

[0940]

[0941] N-[5-(4-氯-苯基)-7-乙基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基]-乙酰胺(化合物246).

[0942] 在0℃，向5-(4-氯-苯基)-7-乙基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基胺(50mg，184mmol)的乙酸酐(1ml)溶液中加入醋酸钠(30mg，368mmol)。将溶液温热至室温并搅拌4小时。粗产物经反相制备型LC/MS纯化(水-乙腈梯度，0.05％甲酸，95∶5～5∶95，14分钟，线性梯度；流速，42ml/分钟；色谱柱，PhenomenexLuna 5μC18(2)，100×30mm；UV 254和218nm)。合并含有期望物质的级分，并在真空中蒸发得到标题化合物(18mg，57mmol)；
+
LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，315.1。

[0943] 实施例46

[0944]3 3

[0945] 1-乙基-N-甲基-N-苯基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3，4-二胺(化合物248).3

[0946] 向1-乙基-N-苯基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3，4-二胺(100mg，0.4mmol)和碳酸钾(70mg，0.5mmol)在无水DMF(3ml)中的搅拌混合物中，加入碘甲烷(25μl，0.4mmol)，并将混合物在封闭的容器中在40℃搅拌1天。加入另外量的碘甲烷(25μl，0.4mmol)，并将混合物在40℃另外搅拌4天。过滤所得产物的混合物，并在C18反相硅胶柱上通过制备型-HPLC纯化(洗脱液，H2O-CH3CN-HCOOH，95∶5∶0.05～5∶95∶0.05)，在从乙腈重+结晶得到标题化合物(18mg，0.067mmol)，为白色粉末；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，269.1。

[0947] 实施例47

[0948]

[0949] 1-环丁基-N3-苯基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3，4-二胺(化合物253).

[0950] 步骤A：

[0951]

[0952] 将2-(甲硫基-苯基氨基-亚甲基)-丙二腈(2.07g，9.6mmol)(实施例39，步骤A)和水合肼(0.45ml，10mmol)的无水乙醇(50ml)溶液在惰性气体氛围中回流2小时(由LCMS确证完全转化)。所得混合物在真空中浓缩得到纯的5-氨基-3-苯基氨基-1H-吡唑-4-腈(1.88g，9.4mmol)，为灰白色固体。

[0953] 步骤B：

[0954]

[0955] 借助回流冷凝器，将5-氨基-3-苯基氨基-1H-吡唑-4-腈(1.88g，9.4mmol)和甲酰胺(30ml)的混合物在190℃搅拌3小时(由LCMS控制)。将反应混合物冷却，过滤沉3
淀，以水(3×7ml)和乙醚(2×5ml)洗涤，并在真空中干燥得到纯的N-苯基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3，4-二胺(1.88g，8.3mmol)，为浅褐色固体。

[0956] 步骤C：

[0957] 在氩气下，向搅拌的N3-苯基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3，4-二胺(226mg，1.0mmol)和碳酸钾(276mg，2.0mmol)的无水DMF(3ml)混悬液中加入环丁基溴(200μl，
2.0mmol)，将所得混合物在密封的容器中在70℃搅拌12小时，过滤，并在反相C18柱上通过制备型HPLC纯化(洗脱液，H2O-CH3CN-HCOOH，95∶5∶0.05～5∶95∶0.05)，再从乙腈
3
重结晶得到标题化合物1-环丁基-N-苯基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3，4-二胺(133mg，+
0.48mmol)，为灰白色固体；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，281.1。

[0958] 实施例48

[0959]

[0960] N-[1-叔丁基-3-(4-氯-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基]-N-甲基-乙酰胺(化合物259).

[0961] 步骤A：

[0962]

[0963] 向搅拌的1-叔丁基-3-(4-氯-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(302mg，1.0mmol)的吡啶混悬液中加入乙酸酐(0.30ml，3.2mmol)，将混合物在密封瓶中在70℃加热1小时(由LCMS控制)，在真空中浓缩，经硅胶色谱法纯化(20g，洗脱液，己烷-乙酸乙酯，100∶0～50∶50)，再以乙腈研磨得到N-[1-叔丁基-3-(4-氯-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基]-乙酰胺(化合物2；180mg，0.52mmol)，为灰白的固体，还伴随有二乙酰化的副产物(化合物97；91mg，0.24mmol)。

[0964] 步骤B：

[0965] 向搅拌的N-[1-叔丁基-3-(4-氯-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基]-乙酰胺(68mg，0.2mmol)和碳酸钾(41mg，0.3mmol)的无水DMF(3ml)混悬液中，加入碘甲烷(19μl，0.3mmol)，并将混合物在环境温度下搅拌过夜，并在反相C18柱上通过制备型-HPLC纯化(洗脱液H2O-CH3CN-HCOOH，95∶5∶0.05～5∶95∶0.05)，得到N-[1-叔丁基-3-(4-氯-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基]-N-甲基-乙酰胺(47mg，0.13mmol)，+为白色固体；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，358.1，360.1。

[0966] 实施例49

[0967]

[0968] 7-叔丁基-5-(4-氯-苯基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基胺(化合物261).[0969] 步骤A：

[0970]

[0971] 在0 ℃，向搅拌的叔丁胺(6.8g，30mmol)的甲苯溶液(20mL)中滴加4’-氯-2-溴-苯乙酮(2.3g，20mmol)的甲苯溶液(15mL)，历时5分钟。将溶液在0℃搅拌1.5小时。加入浓盐酸至pH为1～2，并将混合物在0℃搅拌15分钟。过滤所得沉淀，并以乙醚洗涤。该物质[2-叔丁基氨基-1-(4-氯-苯基)-乙酮]如此直接用于下一步。

[0972] 步骤B：

[0973]

[0974] 在0℃，向2-叔丁基氨基-1-(4-氯-苯基)-乙酮(0.98g，3.72mmol)、丙二腈(0.32g，4.84mmol)在甲醇(10ml)中的混合物中，加入50％的氢氧化钾水溶液至pH为10～12。将深色溶液在65℃加热4小时，同时保持pH不变。将该物质倾倒至碎冰上。收集沉淀，以水洗涤，得到2-氨基-1-叔丁基-4-(4-氯-苯基)-1H-吡咯-3-腈(0.35g，1.28mmol)。

[0975] 步骤C：

[0976] 将搅拌的2-氨基-1-叔丁基-4-(4-氯-苯基)-1H-吡咯-3-腈(0.23g，0.86mmol)和甲酰胺(5ml)的混合物加热至180℃，保持4小时。冷却溶液，以水稀释，并以二氯甲烷萃取。浓缩有机层并经反相制备型HPLC纯化(水-乙腈梯度，0.05％甲酸，80∶20～10∶90，20分钟，线性梯度；流速，15ml/分钟；色谱柱，Phenomenex Luna 5μC18，100×21.2mm；
UV 254和218nm)。合并含有期望物质的级分，并在真空中蒸发得到标题化合物(16mg，+
53mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，301.1。

[0977] 实施例50

[0978]

[0979] 3-[4-氨基-3-(4-氯-苯基)-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基]-氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(化合物267).

[0980] 步骤A：

[0981]

[0982] 在0℃，向氮杂环丁烷-3-醇盐酸盐(1.00g，9.13mmol)的乙醇溶液(18ml)中加入三乙胺(3.80ml，27.4mmol)，再加入二碳酸二叔丁酯(2.18g，10.0mmol)。将该混合物在室温下搅拌30分钟。在减压下浓缩该溶液，并将残余物溶于乙酸乙酯，以10％的柠檬酸洗涤，再以盐水洗涤。干燥有机层(无水硫酸钠)，并在真空中除去溶剂。粗产物经快速硅胶色谱法纯化(洗脱液；己烷-乙酸乙酯级分)得到3-羟基-氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(0.8g，4.62mmol)，为无色油状物。

[0983] 步骤B：

[0984]

[0985] 向3-羟基-1-氮杂环丁烷甲酸叔丁酯(770mg，4.45mmol)的乙酸乙酯(7ml)溶液中，加入三乙胺(0.80ml，5.78mmol)，再加入甲磺酰氯(0.41ml，5.34mmol)。将混合物在0℃搅拌1小时。过滤溶液，残余物以乙酸乙酯洗涤。在真空中蒸发有机滤液得到3-甲磺酰氧基-氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(1g，3.98mmol)，为黄色油状物。

[0986] 步骤C：

[0987] 将3-(4-氯苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺(684mg，2.79mmol)、3-甲磺酰氧基-氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(700mg，2.79mmol)和碳酸铯(1.18g，3.62mmol)的混合物于90℃在二甲基酰胺(14ml)中在氩气下加热24小时。将混合物冷却至室温，倾入冰水中，并以5％的甲醇-二氯甲烷萃取。干燥有机层(无水硫酸钠)，并在减压下蒸发。产物经快速硅胶色谱法纯化(洗脱液，二氯甲烷-甲醇梯度)，得到标题化合物(600mg，+
1.49mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，400.9，402.9。

[0988] 实施例51

[0989]

[0990] N-[1-叔丁基-3-(4-氯-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基]-甲磺酰胺(化合物274).

[0991] 在0℃，向搅拌的1-叔丁基-3-(4-氯苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺(100mg，0.33mmol)的二甲基甲酰胺(1.5ml)溶液中，加入氢化钠(60％，在矿物油中，40.0mg，0.85mmol)。搅拌20分钟后，缓慢加入甲磺酰氯(80.0mg，0.66mmol)，并将混合物在环境温度下搅拌1小时。加入冰水淬灭反应，并以乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用水洗涤，再以盐水洗涤，干燥(无水硫酸钠)并在真空中浓缩。残余物经硅胶色谱法纯化(二氯+
甲烷-甲醇梯度)，得到标题化合物(65mg，0.17mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，380.0，
382.0。

[0992] 实施例52

[0993]

[0994] 3-[4-氨基-3-(4-氯-苯基)-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基]-氮杂环丁烷-1-甲酸乙基酰胺(化合物275)

[0995] 向1-(氮杂环丁烷-3-基)-3-(4-氯苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺二盐酸盐(200mg，0.54mmol)的二氧杂环己烷(5ml)溶液中，加入吡啶(0.14ml，1.71mmol)和异氰酸乙酯(0.11m，1.34mmol)。将混悬液在室温下搅拌24小时。加入二甲基甲酰胺(3ml)，并将混合物在室温下另外搅拌24小时。加入水，以乙酸乙酯萃取产物，干燥(无水硫酸钠)并在真空中除去溶剂。粗产物经硅胶柱色谱法纯化(洗脱液，二氯甲烷∶甲醇，25∶1)得+到标题化合物(100mg，0.27mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，372.1，374.1。

[0996] 实施例53

[0997]

[0998] [1-叔丁基-3-(4-氯-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基]-氨基甲酸甲酯(化合物294)

[0999] 向1-叔丁基-3-(4-氯苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺(200mg，0.66mmol)的二甲基甲酰胺(2ml)溶液中，加入氢化钠(60％，在石蜡中，40.0mg，0.10mmol)，再加入氯甲酸甲酯(0.06ml，0.80mmol)。将混合物在环境温度下搅拌3小时。另外再加入氢化钠(20.0mg，0.50mmol)和氯甲酸甲酯(0.03ml，0.40mmol)，并将混合物搅拌3小时。混合物用水稀释，并用乙酸乙酯萃取产物。有机层在无水硫酸钠上干燥，并在真空中除去溶剂。残余物经柱色谱法分离(二氯甲烷-甲醇梯度)，再经制备型环形薄层色谱(Chromatotron)分+离，得到标题化合物(60mg，0.17mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，360.1，362.1。

[1000] 实施例54

[1001]

[1002] 1-{3-[4-氨基-3-(4-氯-苯基)-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基]-氮杂环丁烷-1-基}-乙酮(化合物295).

[1003] 向1-(氮杂环丁烷-3-基)-3-(4-氯苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺二盐酸盐(200mg，0.54mmol)的二甲基甲酰胺(5ml)溶液中，加入吡啶(0.14ml，1.71mmol)和乙酰氯(0.11ml，1.60mmol)。将混合物在环境温度下搅拌2.5小时。混合物用水稀释，并用乙酸乙酯萃取。有机层以盐水洗涤，干燥(无水硫酸钠)，并在真空中除去溶剂。以丙酮研磨-得到标题化合物(64mg，0.19mmol)；LC/MS，API-ES，Neg，(M-H)，341.3，343.4。

[1004] 实施例55

[1005]

[1006] 3-(4-氯-苯基)-1-(1-甲基-氮杂环丁烷-3-基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(化合物296).

[1007] 以碳酸钠水溶液中和1-(氮杂环丁烷-3-基)-3-(4-氯苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺二盐酸盐(150mg，0.40mmol)的水溶液。沉淀通过过滤分离，并分散在5ml乙腈中。向此混悬液中加入甲醛(0.16ml，1.61mmol，37％的水溶液)和NaBH3CN(40.0mg，
0.64mmol)。通过加入乙酸将溶液的pH值维持在7，并搅拌2小时。在真空中浓缩混合物并将残余物溶于乙酸乙酯中，再以碳酸钠水溶液洗涤。干燥有机层(无水硫酸钠)，并在真空中除去溶剂。残余物经硅胶柱色谱法纯化(洗脱液，二氯甲烷∶甲醇∶氨水，100∶1∶0.5)得到标题化合物(37mg，0.12mmol)。

[1008] 实施例56

[1009]

[1010] 3-(4-氨基-3-萘-1-基甲基-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯(化合物297).

[1011] 将3-((萘-1-基)甲基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺(5.00g，18.2mmol)，碳酸铯(7.69g，23.6mmol)和1-(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷-3-基-甲磺酸酯(5.02g，20.0mmol)在二甲基甲酰胺(200ml)中的混合物在85℃搅拌过夜。将混合物加入到水中，并用乙酸乙酯萃取。有机层以水、盐水洗涤，干燥(无水硫酸钠)，并在真空中除去溶剂。
残余物经硅胶柱色谱法纯化(洗脱液，二氯甲烷∶甲醇，50∶1)得到标题化合物(5.8g，
13.5mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)+，431.1。

[1012] 实施例57

[1013]

[1014] [1-叔丁基-3-(4-氯-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基]-氨基甲酸四氢呋喃-3-基酯(化合物301).

[1015] 步骤A：

[1016]

[1017] 向(S)-四氢呋喃-3-醇(88.0mg，1.0mmol)的二氯甲烷(2ml)溶液中，加入三光气(133mg，0.45mmol)。将溶液冷却至-40℃，并缓慢加入吡啶(105mg，1.33mmol)的二氯甲烷(2ml)溶液，用时5分钟。将混合物在室温下搅拌3.5小时，并在真空中除去溶剂得到粗制(S)-四氢呋喃-3-基氯甲酸酯。

[1018] 步骤B：

[1019] 向1-叔丁基-3-(4-氯苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺(150mg，0.50mmol)在5ml的二甲基甲酰胺(5ml)的混悬液中，加入氢化钠(60％，在矿物油中，40mg，1.00mmol)。将混合物在环境温度搅拌5分钟，并加入(S)-四氢呋喃-3-基氯甲酸酯。搅拌过夜后，加入3当量的(S)-四氢呋喃-3-基氯甲酸酯和4当量的氢化钠，并将混合物搅拌24小时。加入水，以乙酸乙酯萃取产物，干燥(无水硫酸钠)并在真空中除去溶剂。残余物经硅胶柱色谱法纯化(洗脱液，二氯甲烷∶甲醇，100∶1)，再经制备型环形TLC(Chromatotron)-
纯化得到标题化合物(20mg，0.05mmol)；LC/MS，API-ES，Neg，(M-H)，414.3，416.1。

[1020] 实施例58

[1021]

[1022] 3-(4-氯-苯基)-1-(1-异丙基-氮杂环丁烷-3-基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(化合物304).

[1023] 通过加入碳酸钠水溶液碱化(pH 8)1-(氮杂环丁烷-3-基)-3-(4-氯苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺二盐酸盐(150mg，0.40mmol)在1，2-二氯乙烷中的混悬液。白色固体通过过滤分离，并分散在5ml的1，2-二氯乙烷中。加入丙酮(0.03ml，
0.41mmol)、NaBH(OAc)3(119mg，0.56mmol)和乙酸(0.02ml，0.40mmol)，并在环境温度下搅拌24小时。混合物以碳酸钠水溶液稀释，以二氯甲烷萃取，干燥(无水硫酸钠)和蒸发。残余物经硅胶柱色谱法纯化(洗脱液，二氯甲烷∶甲醇∶氨水，100∶1∶0.5)得到标题化合+
物(20mg，0.06mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，343.3，345.2。

[1024] 实施例59

[1025]

[1026] N-[5-(4-氯-苯基)-7-乙基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基]-甲磺酰胺(化合物305).

[1027] 向5-(4-氯苯基)-7-乙基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-胺(0.10g，0.37mmol)的无水二甲基酰胺(10ml)溶液中缓慢加入氢化钠(60％，在矿物油中，0.02g，0.73mmol)。搅拌0.5小时后，加入甲磺酰氯(0.08g，0.73mmol)。在溶液搅拌2小时后，加入两摩尔当量的氢化钠，再加入两摩尔当量的乙磺酰氯，并将溶液搅拌过夜。加入水，且产物用乙酸乙酯萃取。在真空中除去溶剂，残余物经硅胶柱色谱法纯化(己烷-丙酮梯度)，再以己烷研磨得+到标题化合物(28mg，0.08mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，351.0，353.1。

[1028] 实施例60

[1029]

[1030] 3-(4-氨基-3-苯硫基-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(化合物320).

[1031] 将3-(4-氨基-3-碘-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(2.0g，4.8mmol)、苯硫酚(1.06g，9.60mmol)、K2CO3(2.66g，19.2mmol)和铜(0.12g，1.90mmol)在25ml甲苯中的混合物加热回流并搅拌3小时。浓缩混合物，用水稀释，并用乙酸乙酯萃取。合并的有机相以盐水洗涤，干燥(无水硫酸钠)，并在真空中除去溶剂。残余物经硅胶柱色谱法纯化(二氯甲烷-甲醇梯度)，得到标题化合物(1.2g，3.01mmol)；LC/+
MS，API-ES，Pos，(M+H)，399.0。

[1032] 实施例61

[1033]

[1034] N-[1-叔丁基-3-(3-氯-苯氧基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基]-苯甲酰胺(化合物332).

[1035] 将1-叔丁基-3-(3-氯-苯氧基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(200mg，0.63mmol)溶于无水二甲基甲酰胺(5ml)和二异丙基乙基胺(244.2mg，1.89mmol)中，并加入苯甲酸(184.6mg，1.51mmol)。搅拌溶液，加入O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基六氟磷酸盐(HATU)(622.8mg，1.63mmol)，并将溶液在环境温度下搅拌24小时。加入水，且用二氯甲烷萃取产物。有机层以水洗涤，干燥(无水硫酸钠)并在真空中蒸发得到残余物，该残余物以反相制备型HPLC分离(水-乙腈梯度，0.05％甲酸，80∶20～10∶90，20分钟，线性梯度；流速，15ml/分钟；色谱柱，Phenomenex Luna
5μC18，100x21.2mm；UV 254和218nm)。合并含有期望物质的级分，并在真空中蒸发，再+
从乙腈中重结晶得到标题化合物(18mg，0.04mmol)；LC-MS，API-ES，Pos，(M+H)，422.1，
424.1。

[1036] 实施例62

[1037]

[1038] 3-(4-氨基-3-苯氧基-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(化合物341).

[1039] 将3-(4-氨基-3-碘-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(300mg，0.72mmol)、苯酚(140mg，1.4mmol)、碳酸铯(700mg，2.2mmol)、催化量的CuI(14mg，0.072mmol)和N，N-二甲基甘氨酸盐酸盐(30mg，0.22mmol)依次加入二氧杂环己烷(5ml)中。将混合物在真空中脱气，以氩气冲洗，并在90℃加热搅拌过夜。将冷却的混合物通过一层硅藻土过滤，在以乙酸乙酯洗涤。合并的滤液以盐水洗涤，干燥(无水硫酸钠)，并在真空中除去溶剂。残余物经硅胶柱色谱法纯化(己烷-乙酸乙酯梯度)，再经反+
相制备型HPLC纯化得到标题化合物(18mg，0.05mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，383.2。

[1040] 实施例63

[1041]

[1042] 3-[4-氨基-3-(3-氯-苯硫基)-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基]-氮杂环丁烷-1-甲酸乙酯(化合物345).

[1043] 向3-(3-氯苯硫基)-1-(氮杂环丁烷-3-基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺(0.10g，0.30mmol)的二甲基甲酰胺(15ml)溶液中，加入吡啶(0.07g，0.90mmol)和氯甲酸乙酯(0.04g，0.36mmol)。将混合物在环境温度下搅拌3小时。混合物用水稀释，并用二氯甲烷萃取。合并的有机层以盐水洗涤，干燥(无水硫酸钠)，并在真空中除去溶剂。残余物经硅胶柱色谱法纯化(二氯甲烷-甲醇梯度)，得到标题化合物(69mg，0.17mmol)；LC/MS，-API-ES，Neg，(M-H)，403.3，405.1。

[1044] 实施例64

[1045]

[1046] 3-[4-氨基-3-(3-氯-苯硫基)-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基]-氮杂环丁烷-1-甲酸乙基酰胺(化合物346).

[1047] 向3-(3-氯苯硫基)-1-(氮杂环丁烷-3-基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺(0.10g，0.30mmol)的二甲基甲酰胺(15ml)溶液中，加入吡啶(0.07g，0.90mmol)和异氰酸乙酯(0.03g，0.39mmol)。将混合物在环境温度下搅拌4小时。混合物用水稀释，并用二氯甲烷萃取。合并的有机层以盐水洗涤，干燥(无水硫酸钠)，并在真空中除去溶剂。残余物经硅胶柱色谱法纯化(二氯甲烷-甲醇梯度)，得到标题化合物(68mg，0.16mmol)；LC/MS，+API-ES，Pos，(M+H)，404.1，406.1。

[1048] 实施例65

[1049]

[1050] 3-苯并噁唑-2-基-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(化合物355).[1051] 步骤A

[1052]

[1053] 向搅拌的二甲基甲酰胺二甲缩醛(291.2mg，2.22mmol)的甲苯(20ml)溶液中，加入3-溴-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(500.0mg，1.85mmol)。将此溶液在110℃搅拌5小时。在真空中除去溶剂，产物通过硅胶色谱法纯化(己烷-乙酸乙酯梯度)得到N′-(3-溴-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基)-N，N-二甲基甲脒(420.0mg，+
1.29mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，325.1，327.1。

[1054] 步骤B

[1055] 将三苯基膦(160mg，0.61mmol)、苯并噁唑(185mg，1.54mmol)、碳酸铯(1.0g，3.1mmol)和N′-(3-溴-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基)-N，N-二甲基甲脒(600mg，1.8mmol)依次加入10ml无水无氧的二甲基乙酰胺中。混合物以氩气冲洗，并加入催化量的Pd(OAc)2(35mg，0.15mmol)。将混合物在真空中脱气，以氩气冲洗，并在120℃加热搅拌过夜。冷却所得混合物，并以二氯甲烷稀释，经一层硅藻土过滤。滤液以盐水和水洗涤，用无水硫酸钠干燥，再在真空中蒸发。残余物经硅胶柱色谱法纯化(己烷-乙酸乙酯梯度)，再经制备型环形TLC(Chromatotron)纯化(己烷-乙酸乙酯梯度)。从乙醚和己烷中+
结晶得到标题化合物(0.2g，0.64mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，309.1。

[1056] 实施例66

[1057]

[1058] 3-(4-氯-苯基)-1-(1-甲基-吡咯烷-3-基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(化合物356).

[1059] 步骤A：

[1060]

[1061] 在氩气氛围下，将3-碘-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(200mg，0.766mmol)、PPh3(400mg，1.5mmol)、(S)-1-甲基-3-吡咯烷醇(160mg，1.5mmol)在无水THF(10mL)中的混悬液冷却至0℃，并向混合物中加入DEAD(270mg，1.5mmol)。加入后，将反应混合物在环境温度下搅拌3小时。对混合物进行TLC分析显示起始原料消失。将所得混合物在真空中浓缩以除去溶剂，产物经硅胶柱色谱法纯化(二氯甲烷-甲醇梯度)得到3-碘-1-(1-甲基-吡咯烷-3-基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺，为浅黄色固体(135mg，0.39mmol)。

[1062] 步骤B：

[1063] 向搅拌的3-碘-1-(1-甲基-吡咯烷-3-基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(130mg，0.37mmol)(步骤A)的DME(4ml)和水(2ml)的溶液中，依次加入4-氯苯基硼酸(71mg，0.45mmol)和Na2CO3(80mg，0.76mmol)。混合物以氩气冲洗，再加入催化量的Pd(PPh3)4(44mg，0.038mmol)。将混合物脱气、氩气充气三次。将混合物加热回流3小时。
加入水，且产物用乙酸乙酯萃取。合并的萃取液以盐水洗涤，在无水硫酸钠上干燥，过滤，浓缩得到残余物，该残余物经硅胶柱色谱法纯化(二氯甲烷-甲醇梯度)，在通过制备型环形TLC(Chromatotron)(二氯甲烷∶甲醇，15∶1)纯化得到标题化合物(30mg，0.09mmol)；
+
LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，329.2，331.2。

[1064] 实施例67

[1065]

[1066] N-(1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基)-苯甲酰胺(化合物388)

[1067] 向1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺(100mg，0.52mmol)的吡啶(2ml)溶液中加入苯甲酰氯(110mg，0.78mmol)。将反应混合物在环境温度下搅拌3小时。加入水，且产物用乙酸乙酯萃取。分离有机层，干燥(无水硫酸钠)并在真空中蒸发。产物经硅胶柱色谱法纯化(己烷-乙酸乙酯梯度)，并重结晶(己烷和丙酮)，得到标题化合物(100mg，+0.34mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，296.1。

[1068] 实施例68

[1069]

[1070] N-[1-叔丁基-3-(4-氯-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基]-2-氧代-2-苯基-乙酰胺(化合物395).

[1071] 向干燥的圆底烧瓶中加入苯甲酰甲酸(99mg，0.66mmol)、HATU(252mg，0.66mmol)和二甲基甲酰胺(3ml)。将此溶液在25℃搅拌15分钟，再加入1-叔丁基-3-(4-氯-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(100mg，0.33mmol)和DIEA(220μL，1.33mmol)。将所得混合物在25℃搅拌16小时。粗产物经反相制备型HPLC-MS纯化，浓缩，并以乙腈研磨+得到标题化合物(17mg，0.04mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)，434.9，436.9。

[1072] 实施例69

[1073]

[1074] 1-[1-叔丁基-3-(4-氯-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基]-3-甲基-硫脲(化合物397).

[1075] 将1-叔丁基-3-(4-氯-苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺(100mg，0.33mmol)溶于无水二氧杂环己烷中(5ml)并将溶液在0℃搅拌。加入氢化钠(60％，在石蜡油中，15.8mg，0.4mmol)，并将溶液搅拌5分钟。加入异硫氰酸甲酯(28.9mg，0.39mmol)，并将溶液在环境温度下搅拌30分钟。加入水，并以二氯甲烷萃取产物。有机层用水洗涤，干燥(无水硫酸钠)并在真空中蒸发。残余物经反相制备型HPLC纯化(水-乙腈梯度，
0.05％甲酸，80∶20～10∶90，20分钟，线性梯度；流速，15ml/分钟；色谱柱，Phenomenex Luna 5μC18，100×21.2mm；UV 254和218nm)。合并含有期望物质的峰，并在真空中蒸发溶剂得到残余物，该残余物从乙腈中结晶得到标题化合物(16mg，0.04mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)+，375.0，377.0。

[1076] 实施例70

[1077]

[1078] 7-乙基-5-苯硫基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基胺(化合物333).

[1079] 将7-乙基-5-碘-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-胺(0.10g，0.35mmol)、苯硫酚(0.08g，0.69mmol)、铜(0.01g，0.14mmol)和碳酸钾(0.19g，1.39mmol)在10ml甲苯中的混合物在110℃搅拌过夜。在过滤和浓缩后，残余物经硅胶柱色谱法纯化(己烷∶丙酮梯度，10∶1，8∶1，6∶1)得到标题化合物，为灰色固体(35mg，0.13mmol)；LC/MS，API-ES，Pos，+
(M+H)，271.5。

[1080] 实施例71

[1081]

[1082] 4-氨基-N-苄基-3-(4-氯苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-甲酰胺(化合物213)

[1083]

[1084] 步骤A：

[1085]

[1086] 向3-(4-氯苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺(500mg，2.04mmol)的二甲基甲酰胺(7ml)混悬液中，加入吡啶(193mg，2.44mmol)和甲磺酰氯(257mg，2.24mmol)。1小时后，TLC(CH2Cl2∶MeOH＝15∶1)显示有新点(Rf＝0.6)，并且起始原料还未完全消失。然后，每1小时加入1.2当量的吡啶和1.1当量的甲磺酰氯。在加入两次后，起始原料完全消失。将反应混合物倾入水中，但是没有沉淀。然后加入20ml饱和NaHCO3水溶液。产物通过过滤分离，以丙酮洗涤而得到标题化合物，为棕色固体(397mg，64％)。MS(ESI，pos.)，+ +
m/z，301.0(MH，100％)，303.1(MH，27％)。

[1087] 步骤B：

[1088]

[1089] 向N′-(3-(4-氯苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基)-N，N-二甲基甲脒(200mg，0.67mmol)的二氧杂环己烷(15ml)的混悬液中，加入异氰酸苄酯(88.0mg，
0.67mmol)。将反应混合物在50℃加热1小时。TLC(CH2Cl2∶MeOH＝15∶1)显示有两个新点(Rf＝0.4，弱；Rf＝0.5，强)，并且起始原料还未完全消失。2小时后，将反应混合物在80℃加热3小时。将反应在室温下搅拌过夜。TLC显示仍然有少量的起始原料。然后加入1当量异氰酸苄酯，并将反应在80℃加热2小时，直至反应完成。冷却反应混合物。滤除沉淀，以丙酮洗涤而得到标题化合物，为黄色固体(248mg，85％)。MS(ESI，pos.)，m/z，+ + + +
433.9(MH，100％)，435.8(MH，37％)，866.4(2MH，41％)，868.4(2MH，30％)。

[1090] 步骤C：

[1091]

[1092] 将N-苄基-3-(4-氯苯基)-4-((E)-甲酰氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-甲酰胺(60.0mg，0.14mmol)溶于10ml的HCl/CH3CN溶液中(1M)。将反应混合物在25℃搅拌过夜。TLC(CH2Cl2∶MeOH＝15∶1)显示反应完成。然后浓缩反应混合物，以饱和NaHCO3水溶液中和从而调节pH至7～8。滤除沉淀，以丙酮洗涤而得到标题化合物，为白色固体(40mg，+ + +76％)。MS(ESI，pos.)，m/z，378.9(MH，14％)，441.4(MNa+CH3CN，83％)，778.8(2MNa，
1
100 ％)；H NMR(C5D5N，400MHz，080128 BL-13-007-2_1H)δ＝9.98(t，J＝ 6.0Hz，1H)，
8.65(s，1H)，7.87(d，J＝8.8Hz，2H)，7.62(d，J＝7.2Hz，2H)，7.36-7.41(m，4H)，7.29(dd，J＝7.2，7.6Hz，1H)，4.92(d，J＝6.0Hz，2H)。

[1093] 因为改变将对本领域技术人员是明显的，因此本发明意图仅通过所附权利要求书的范围限定。

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