阿特拉津单链抗体筛选方法及其用途
阅读：978发布：2020-05-12
专利汇可以提供阿特拉津单链抗体筛选方法及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及阿特拉津单链 抗体 的筛选方法及其应用，属于 生物 技术领域，该单链抗体是由T7 噬菌体 展示鼠源免疫抗体库中筛选出来的并进行了功能表达。本发明还涉及应用T7噬菌体展示技术筛选阿特拉津抗体的方法。本发明筛选出的阿特拉津单链抗体可以应用于污染检测与研制快速检测阿特拉津残留的免疫速测 试剂 盒 用途，为以后阿特拉津的检测与研究奠定了 基础 。，下面是阿特拉津单链抗体筛选方法及其用途专利的具体信息内容。
1.一种抗阿特拉津单链抗体，其特征在于可以特异识别小分子农药阿特拉津。
2.权利要求1抗阿特拉津单链抗体制备方法，由如下步骤组成：
(1)噬菌体展示鼠源免疫初级库的构建
取AT-BSA免疫的Balb/c小鼠(血清效价1∶100000)的脾细胞中提取总RNA，反转录合成cDNA第一链后，扩增VH、VL基因片段，大小分别为350bp，350bp左右；合成(G4S)3连接序列。利用SOE-PCR构建单链抗体文库，大小为750bp，经EcoR I和HindIII双酶切后，通过T4连接酶与T7Select 10-3载体进行连接。经体外包装后感染宿主BLT5403或BLT5615，宿主裂解增殖后后即完成噬菌体展示单链抗体文库初级库的构建。
(2)抗阿特拉津单链抗体库的筛选
用阿特拉津直接偶联经处理后氨基化的酶标板作为抗原固相筛选或者阿特拉津偶联氨基化磁珠进行筛选，淘筛过程如下：
10
①加入滴度为2×10 的噬菌体初级库500uL，37孵育2h，
②500uL PBST(含0.1％Tween 20的PBS)洗涤3次，
③加入200uL 1％SDS洗脱噬菌体。100uL噬菌体用于测定洗脱滴度，另100uL噬菌体扩增后进入下一轮筛选。
如此进行“孵育-洗脱-扩增”3个循环。以未展示有抗体的空白噬菌体作阴性对照，以洗脱的噬菌体作为一抗，兔抗T7噬菌体10A蛋白做作为二抗，噬菌体ELISA测定噬菌体的结合活性，间接竞争ELISA测定噬菌体竞争活性，具有竞争结合活性的噬菌体克隆进入下一轮筛选。
(3)抗阿特拉津单链抗体的功能表达
将四轮筛选后单链抗体文库进行序列鉴定，PCR从噬菌体基因组中扩增抗体基因，Eco R I和Xho I双酶切后连接pTIG-Trx表达载体，转化BL21(DE3)后IPTG诱导表达，经SDS-PAGE和Western Blot鉴定，在30KDa处有目的蛋白条带，与理论蛋白大小一致，确定表达产物存在于破碎菌体后的沉淀中。
(4)抗阿特拉津单链抗体的纯化与鉴定
利用6mol/L盐酸胍变性破碎后的菌体沉淀，用HisTrap HP柱进行复性并纯化。直接ELISA测定scFv的结合活性，间接竞争ELISA测定竞争结合活性与特异性
3.权利要求2中所述小鼠可以是其他品系免疫AT-BSA后的小鼠，优选Balb/c小鼠。
4.权利要求2中所述单链抗体文库两端的酶切位点可以是常见分子生物学内切酶(如BamH I、SfiI等)双酶切或单酶切，本发明优选EcoR I和HindIII双酶切.。
5.权利要求2中所述增殖方法包括固体平板法和液体增殖法，优选固体平板法。
6.权利要求2中所述筛选方法可以采用直接包被法进行固相筛选，还可以采用AT-磁珠进行液相筛选，优选在不同筛选轮次中采用不同方法交叉筛选。
7.权利要求2中所述洗脱条件可以选择pH梯度洗脱，竞争洗脱和蛋白酶酶解洗脱，本发明优选1％SDS洗脱。。
8.权利要求2中所述抗体的表达可以采用原核表达载体如pBV220，pET系列载体，并根据载体不同选择不同表达宿主，优选pTIG-TRX载体。
9.权利要求2中所述标签蛋白可以为麦芽糖结合蛋白、6×组氨酸标签等，优选6×组氨酸标签。
10.权利要求7中所述直接包被法根据改造后阿特拉津的结构不同可以采用不同的偶联方法如DCC法，戊二醛法等，本发明优选DCC法。
阿特拉津单链抗体筛选方法及其用途
技术领域
背景技术
[0002] 阿特拉津(Atrazine，AT)又名莠去津，全称为2-氯-4-乙胺-6-异丙胺-1，3，5-三嗪，分子量为215.69，纯品为无色无嗅结晶，熔点为175～177℃，是选择性内吸传导型苗前、苗后除草剂，主要用于玉米、高粱、甘蔗、果树、林地等旱田，可防除一年生禾本科杂草和阔叶杂草，对某些多年生杂草也有一定的抑制作用，是一种在全球范围内广泛使用的三嗪类除草剂，因而在环境中有着广泛的分布。Hoffman等在对美国8条城市河流中农药含量作比较时，发现阿特拉津、西玛津、甲草胺等除草剂被检出率很高，许多国家及地区的地下水、地表水以及大气沉降物中都检测出有阿特拉津残留。阿特拉津在土壤中的保留期长，对粮食和食品安全造成严重威胁，影响人体的内分泌系统及生殖系统并且对全球生态环境也造成了负面影响。
[0003] 目前对阿特拉津暴露风险监测和评估的方法主要是基于大型仪器，主要检测方法为气相色谱法，气相色谱法前处理操作繁琐，质谱法仪器设备昂贵，不适于常规检测，随着科学技术的发展，又出现了超临界检测技术及固相萃取等前处理技术。目前也有在不同条件下利用高效液相色谱法测定阿特拉津的报道，但都是用来测定土壤或植物体中的阿特拉津，而基于免疫学抗原抗体反应的免疫分析(immunoanalysis，IAs)快速检测阿特拉津残留则更高效、方便且经济。与常规理化分析技术相比，免疫分析具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、成本低、安全可靠等优点。但阿特拉津分子量为215.69，属于小分子物质，不能刺激机体产生抗体，需要与载体蛋白偶联作为免疫原免疫动物，动物体内可产生相应特异性的抗阿特拉津和载体蛋白的抗体，再用另一种载体蛋白与阿特拉津的偶联物作为包被原筛选抗体，就可以得到针对阿特拉津的特异性抗体。这种结果容易出现假阳性，而且半抗原难以合成。
[0004] 噬菌体抗体库技术(phage displayantibody librarytechnology)是基因工程抗体研究中的一次重大突破，根据抗体库来源的不同，可以分为免疫抗体库(immune antibody library)、天然抗体库( antibody library)及合成抗体库(synthetic antibody library)。免疫抗体库是指采用经过免疫后的淋巴细胞所构建的抗体库，这些免疫包括疫苗注射、微生物感染、自身免疫疾病、肿瘤等。免疫库的库容一般较小，其原因是由于用于构建抗体库的淋巴细胞已在体内经过抗原选择和亲和力成熟。非免疫抗体库包括天然抗体库、半合成抗体库和全合成抗体库。
[0005] 免疫抗体库与杂交瘤技术相比，免疫抗体库的优点在于能更快速地筛选抗原特异7
性的抗体，甚至所得的抗体的亲和力比单克隆抗体还高。如Chester等从10 的库中筛选得到亲和力和特异性都优于单克隆抗体的抗CEA抗体。多样性噬菌体抗体库的构建为筛选打下了良好基础，而选择合适的筛选方法则是获得高亲和力抗体的关键环节。
性的抗体，甚至所得的抗体的亲和力比单克隆抗体还高。如Chester等从10 的库中筛选得到亲和力和特异性都优于单克隆抗体的抗CEA抗体。多样性噬菌体抗体库的构建为筛选打下了良好基础，而选择合适的筛选方法则是获得高亲和力抗体的关键环节。
发明内容
[0006] 本发明的主要目的是提供一种潜在的检测用抗阿特拉津单链抗体。
[0007] 本发明的第二个目的提供一种抗阿特拉津单链抗体的制备方法。
[0008] 本发明的第三个目的提供抗阿特拉津单链抗体在制备检测试剂盒中的用途。
[0009] 本发明的技术方案概述如下：
[0010] 本发明提供的抗阿特拉津单链抗体是从T7噬菌体展示鼠源免疫抗体库中筛选获得的并进行了可溶性功能表达。
[0011] 本发明提供的抗阿特拉津单链抗体的制备方法为：
[0012] 1.噬菌体展示鼠源免疫初级库的构建
[0013] 取AT-BSA免疫的Balb/c小鼠(血清效价1∶100000)的脾细胞中提取总RNA，反转录合成cDNA第一链后，扩增VH、VL基因片段，大小分别为350bp，350bp左右；合成(G4S)3连接序列。利用SOE-PCR构建单链抗体文库，大小为750bp，经EcoR I和HindIII双酶切后，通过T4连接酶与T7Select 10-3载体进行连接。经体外包装后感染宿主BLT5403或BLT5615，宿主裂解增殖后后即完成噬菌体展示单链抗体文库初级库的构建。
[0014] 其中小鼠可以是其他品系免疫AT-BSA后的小鼠，优选Balb/c小鼠。
[0015] 其中单链抗体文库两端的酶切位点可以是常见分子生物学内切酶(如BamH I、SfiI等)双酶切或单酶切，本发明优选EcoR I和HindIII双酶切.
[0016] 增殖方法包括固体平板法和液体增殖法，优选固体平板法。
[0017] 2.抗阿特拉津单链抗体库的筛选
[0019] (1)加入滴度为2×1010的噬菌体初级库500uL，37孵育2h，
[0020] (2)500uL PBST(含0.1％Tween 20的PBS)洗涤3次，
[0021] (3)加入200uL 1％SDS洗脱噬菌体。100uL噬菌体用于测定洗脱滴度，另100uL噬菌体扩增后进入下一轮筛选。
[0022] 如此进行“孵育-洗脱-扩增”3个循环。以未展示有抗体的空白噬菌体作阴性对照，以洗脱的噬菌体作为一抗，兔抗T7噬菌体10A蛋白做作为二抗，噬菌体ELISA测定噬菌体的结合活性，间接竞争ELISA测定噬菌体竞争活性，具有竞争结合活性的噬菌体克隆进入下一轮筛选。
[0023] 可以采用阿特拉津直接偶联酶标板进行固相筛选，或者采用阿特拉津-磁珠进行液相筛选
[0024] 直接包被法根据改造后阿特拉津的结构不同可以采用不同的偶联方法如DCC法，戊二醛法等，本发明优选DCC法。
[0025] 洗脱条件可以选择pH梯度洗脱，竞争洗脱和蛋白酶酶解洗脱，本发明优选1％SDS洗脱。
[0026] 3.抗阿特拉津单链抗体的功能表达
[0027] 将四轮筛选后单链抗体文库进行序列鉴定，PCR从噬菌体基因组中扩增抗体基因，Eco R I和Xho I双酶切后连接pTIG-Trx表达载体，转化BL21(DE3)后IPTG诱导表达，经SDS-PAGE和Western Blot鉴定，在30KDa处有目的蛋白条带，与理论蛋白大小一致，确定表达产物存在于破碎菌体后的沉淀中。
[0028] 抗体的表达可以采用原核表达载体如pBV220，pET系列载体，优选pTIG-TRX。
[0029] 标签蛋白可以为常用标签蛋白如麦芽糖结合蛋白、6×组氨酸标签等，优选6×组氨酸标签。
[0030] 4.抗阿特拉津单链抗体的纯化与鉴定
[0031] 利用6mol/L盐酸胍变性破碎后的菌体沉淀，用HisTrap HP柱进行复性并纯化。直接ELISA测定scFv的结合活性，间接竞争ELISA测定竞争结合活性与特异性
[0032] 单链抗体的纯化可以采用离子交换层析、凝胶层析、金属螯合层析等，优选金属螯合层析法。
[0033] 金属螯合层析发的金属可以选择Ni2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+等，优选Ni2+离子。
[0034] 本发明还可以提供一种测定环境和食品中阿特拉津残留的检测试剂盒中的最关键检测试剂——抗体，虽然目前阿特拉津在一些国家和地区已经禁用和限用，但由于阿特拉津在土壤中的残留期长，易于通过生态循环污染环境和水体并进一步进入食品，因此发展检测阿特拉津残留的简便、快速、灵敏的方法是非常必要的，本发明制备的阿特拉津单链抗体可以部分取代测定食品和环境样品中阿特拉津残留测定所需试剂。
[0035] 本发明所制备的抗阿特拉津单链抗体的优势在于：(1)利用免疫抗体库进行筛选，获得的阿特拉津单链抗体特异性较高；(2)所获得的单链抗体序列清楚，便于基因工程操作，易于在大肠杆菌中大量功能表达。附图说明
[0036] 图1阿特拉津直接包被流程图
[0037] 图2噬菌体ELISA 1～47：单噬菌斑，48：阴性对照。
[0038] 图3间接噬菌体竞争ELISA 13，15，17，22-25为不同的噬菌斑编号。
[0039] 图4抗AT scFv诱导表达产物的SDS-PAGE分析
[0040] 1：诱导后全细胞裂解物；2：上清；3：沉淀；4：纯化后的产物，M低分子量蛋白marker图5单链抗体竞争结合AT的竞争ELISA分析.scFv-15抗AT单链抗体，C7B1C9阿特拉津单克隆抗体。
具体实施方式
[0041] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂与材料，如无特殊说明，均可从常规试剂公司购买得到。
[0042] 实施例1噬菌体展示鼠源单链抗体初级库的构建
[0043] 一.RNA提取与cDNA的合成
[0044] 取AT-BSA免疫的Balb/c小鼠(血清效价1∶100000)的脾细胞，TRIZOL法提取脾细胞总RNA，采用反转录试剂盒合成cDNA。
[0045] 二.VH、VL基因的扩增
[0046] 1.引物设计：
[0047] VH引物：
[0048] PHF 5’-GCCGAATTCATGGCCCAGGTSMARCTGCAG-3’
[0049] PHR 5’-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTGCCTTGGCCC-3’
[0050] VL引物：
[0051] PLF 5’-GACATCGAGCTCACTCAGTCCCA-3’
[0052] PLR 5’-CGAAGCTTCCGTTTBAKYTCCARCTTKGTSCC-3’
[0053] 简并引物中各种核苷的单字母表示法：M＝A or C R＝A or G；S＝G or C；W＝A or T；B＝T or C，G；K＝T or G；Y＝C or T。
[0054] Liner：
[0055] 5’ACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGTGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCTGACATCGAGCTCACTCAG-3’
[0056] 扩增连接肽的上下游引物：
[0057] GS/for 5’ACGGTCACCGTCTCCTCA 3’
[0058] GS/back 5’CTGAGTGAGCTCGATGTC 3’
[0059] 2.VH、VL基因片段的PCR扩增体系：
[0060] 用Pfu酶分别扩增VH和VL。扩增体系如下
[0061]
[0063] 轻链扩增分两阶段进行，第一阶段退火温度从53℃开始逐渐升高，每个循环升高0.5℃扩增10个循环；第二阶段的退火温度为58℃不变，扩增25个循环。具体过程如下：
94℃预变性5min，94℃变性30s，53-58℃退火30s，72℃延伸45s，10个循环，每个循环退火温度升0.5℃；94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸45s；25个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
94℃预变性5min，94℃变性30s，53-58℃退火30s，72℃延伸45s，10个循环，每个循环退火温度升0.5℃；94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸45s；25个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
[0064] 1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。Promega胶回收试剂盒收目的片段并保存于-20℃。
[0065] 3.(G4S)4linker的制备
[0066] 选择最常用的GS linker。即(G4S)3，：N-Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly GlySer-C，其DNA序列为3’-GGT GGA GGC GGT TCA GGT GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGATCT-5’。分别在其上游加上与重链下游和轻链上游序列后其大小为80bp，这一序列交由invitrogen公司全合成。合成序列加A后，经TA克隆连接到pMD18-T克隆载体，转化DH5α感受态细胞。OMEGA质粒提取试剂盒提取质粒，并以此质粒为模板大量扩增(G4S)4linker。
[0067] 三.scFv文库的构建
[0068] 用TAKARA HS DNA聚合酶来扩增。PCR扩增体系如下
[0069]
[0070] PCR连接VH、VL、GS分为两个阶段，第一阶段反应为两步法，不加上下游引物，条件为：98℃预变性3min，98℃变性10s，68℃退火延伸50s，20个循环，第二阶段为三步法，加入上下游引物，另外补加聚合酶0.5uL，条件为：98℃变性30s；60℃退火5s；72℃延伸40s；25个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
[0071] 大量扩增后，Promega胶回收试剂盒回收GS片段，并于-20℃保存。
[0072] 4.噬菌体展示scFv初级库的构建
[0073] 抗阿特拉津scFv片段经EcoR I和HindIII双酶切后，通过T4连接酶与T7Select10-3载体进行连接。经体外包装后感染宿主BLT5403或BLT5615，宿主裂解后即完成初级库的构建。
[0074] ①重组T7噬菌体载体的体外包装
[0075] 其体外包装步骤如下：将T7Select包装提取物放在冰上融化，将5uL连接产物全部加入25uL包装提取物中，用枪头轻轻搅拌混匀，室温(22℃)反应2h，加入270uL LB培养基以终止包装反应。完成包装反应后，即可进行初级库的库容测定和增殖。
[0076] ②重组噬菌体滴度测定
[0077] 重组噬菌体滴度测定采用噬菌斑计数来测定，具体步骤如下：取出-70℃保存的甘油菌(BLT 5403或BLT 5615)于含Amp的LB平板上划线，37℃培养过夜。挑单菌落于5mL M9TB培养基中，37℃培养至OD600＝1.0。1％接种量转接到50mL M9TB培养基中，37℃培养至OD600＝1.0。将培养好的宿主菌放在冰箱4℃备用，但保存时间不要超过48h。融化顶板琼脂，并于45-50℃水浴保存；用LB或TB培养基对重组噬菌体进行10梯度稀释，稀释梯度在102-105之间；取5mL离心管加入如下组分：250uLBLT5403宿主菌，100uL各浓度梯度噬菌体稀释液，3.5mL顶板琼脂。盖紧离心管盖，颠倒混匀后倒入含有Amp的LB平板中，待凝固后，37培养箱中培养2-3h至出现肉眼可见的噬菌斑。
[0078] 计数噬菌斑，对噬菌斑数在30-300的稀释梯度平板进行计数，并按照如下公式计算出重组噬菌体的滴度：滴度＝10×稀释倍数×噬菌斑个数
[0079] ③重组噬菌体的扩增
[0080] 以106噬菌体每10mL宿主菌的比例，加入宿主菌到50mL离心管，加入重组噬菌体后混匀。噬菌体与宿主菌混合后放置时间不要超过20min。吸取1mL混合物，加入到15mL离心管中，倒入10mL融化好的顶板琼脂，颠倒混匀后倒入直径为150mm含Amp的LB平板中。37℃培养2-3h至出现肉眼可见的噬菌斑。往每块平板上加入10mL噬菌体提取缓冲液(20mM Tris-HCl，100mM NaCl，6mM MgSO4，pH 8.0)，将平板入在冰箱4℃2h或过夜。用枪头吸取所有噬菌体提取液到一个新离心管，加入0.5mL氯仿，缓慢混匀后，3000g，4℃离心5分钟。转移上清到另一离心管，此溶液中的噬菌体在4℃可存放数月，长期保存可加1/10体积80％甘油后-80℃保存。
[0081] 重组噬菌体经一轮扩增后即完成初级库的构建。
[0082] 实施例2阿特拉津单链抗体的筛选
[0083] 一.直接包被阿特拉津亲和筛选
[0084] 本实验采用直接包被法将阿特拉津偶联在96孔酶标板的表面，用于阿特拉津特异抗体的富集。
[0085] 阿特拉津直接包被方法如图1所示。
[0086] 1.羧基化阿特拉津的活化
[0087] 采用DCC法活化羧基化阿特拉津。分别称取羧基化的阿特拉津10mg，DCC 12mg，NHS 6mg溶于1mL DMF中，避光振荡过夜。通过薄层层析进行鉴定羟基的活化。
[0088] 2.96孔酶标板的氨基化处理
[0089] 具体过程如下：
[0090] (1)配制47％(v/v)HNO3的浓H2SO4溶液(HNO31.9mL∶H2SO42.1mL)。混匀后以每孔200μL加入聚苯乙烯酶标孔中，并常温孵育30min。使聚苯乙烯酶标孔表面产生-NO2。
[0091] (2)配制5％的APTES水溶液，用浓盐酸调节pH值至6-7之间。ddH2O洗两遍后，每孔加入APTES水溶液200μL并常温孵育2h。
[0092] (3)酶联板62℃恒温箱放置2h。
[0093] (4)将活化后的阿特拉津用10％DMF水溶液稀释到合适的摩尔浓度，每孔加入100μL上述溶液，酶4℃过夜，PBS洗孔三次，每次2min，拍干。
[0094] (5)双蒸水洗孔两次，每次2min，拍干。
[0095] (6)每孔加入200μL 0.2mol/L甲醛PBS溶液37℃封闭2h，PBS洗孔四次，每次2min，拍干，4℃保存备用。
[0096] 3.噬菌体展示免疫抗体库的筛选：淘选过程如下：
[0097] (1)加入滴度为2×1010的噬菌体初级库500uL，37孵育2h，
[0098] (2)500uL PBST(含0.1％Tween 20的PBS)洗涤3次，
[0099] (3)加入200uL 1％SDS洗脱噬菌体。100uL噬菌体用于测定洗脱滴度，另100uL噬菌体扩增后进入下一轮筛选。
[0100] 如此“孵育-洗脱-扩增”三个循环。以未展示有抗体的空白噬菌体作阴性对照。
[0101] 二.磁珠法筛选阿特拉津特异性抗体
[0102] 1.阿特拉津与磁珠偶联
[0103] 采用活性酯法完成偶联。分别称取羧基化阿特拉津、EDC：HCl、NHS，1.4mg、1.4mg、0.8mg，溶于100uL DMF，充分溶解后加入900μL MES缓冲液(0.1mol/L，pH5.5)，室温避光振荡8h。取1mL氨基化磁珠(0.5％)，MES缓冲液洗涤3后用MES缓冲液重悬。将活化好的活性酯加入磁珠悬液中，4℃振荡过夜完成偶联。偶联完成后用PBS洗3将后，用PBS定量磁珠到0.5％，4℃保存。
[0104] 2.噬菌体展示免疫抗体库的磁珠筛选
[0105] 取阿物拉津偶联磁珠(0.5％)50uL，加入到1.5mL离心管中；加入滴度为2×1010的噬菌体初级库500μL，37孵育2h，其间不停颠倒混匀；500uLPBST洗涤3次，每次5分钟。加入200uL 1％SDS洗脱噬菌体。100uL噬菌体用于测定洗脱滴度，另100uL噬菌体扩增后进入下一轮筛选。
[0106] 如此“孵育-洗脱-扩增”3个循环，以抗体库孵育时间作为筛选的严谨条件，每轮的孵育时间减少半小时。以未展示有抗体的空白噬菌体作阴性对照。噬菌体ELISA测定噬菌体的结合活性，得到了8株具有较高结合活性的噬菌体(图2)，间接竞争ELISA测定噬菌体竞争活性，其中15号噬菌体的最大竞争抑制率达到了80％。
[0107] 实施例3抗阿特拉津单链抗体的功能表达、纯化与鉴定
[0108] 一.抗阿特拉津单链抗体的功能表达
[0109] 1.筛选后单链抗体基因的扩增
[0110] 将经测序翻译完全正确的单链抗体基因用重新设计的含有酶切位点的引物PCR扩增抗体DNA片段。引物为：上游：CGCGAATTCTAAATGGCCCAGGT，含Eco R I酶切位点。下游：CGCCTCGAGAAGCTTCCGTTTTATTTCC，含Xho I酶切位点。
[0111] PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火90s，72℃延伸30s；35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，胶回收目的片段。
[0112] 2.重组scfv原核表达质粒构建：
[0113] 用EcoRI、XhoI双酶切质粒pTIG-TRX。酶切体系50μL：：EcoRI 2.5μL，XhoI2.5μL，10×buffer 5μL，ddH2O 10μL；质粒pTIG-TRX 30μL。37℃过夜酶切。1.5％琼脂糖凝胶电泳，将EcoRI、XhoI双酶切后产物切胶回收。将双酶切后纯化得到的scfv片段和同样酶的质粒pTIG-TRX用takara公司T4DNA连接酶连接，连接体系：切开的pTIG-TRX
1μL，scfv 3μL，dd H2O 4μL，混匀后45℃温浴5min，立即放入0℃。再加入T4连接酶(Takara)1μL，10×buffer 1μL，16℃连接3h。转化宿主菌BL21(DE3)，并鉴定阳性转化菌落。
1μL，scfv 3μL，dd H2O 4μL，混匀后45℃温浴5min，立即放入0℃。再加入T4连接酶(Takara)1μL，10×buffer 1μL，16℃连接3h。转化宿主菌BL21(DE3)，并鉴定阳性转化菌落。
[0114] 3.单链抗体蛋白的诱导表达与纯化
[0115] 将步骤2鉴定的阳性菌落接种于5ml含Amp的LB液体培养基，37℃，200r/min振荡培养过夜，次日将菌液按1∶100的比例重新转接于5mL含Amp的LB液体培养基，并设阴性对照，30℃振荡培养至A600约为0.4-0.6，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，然后继续振荡培养，诱导4h。用细胞破碎机进行破碎，破碎至菌液清亮，取出在冷冻离心机10000r/min离心20min，离心后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE蛋白电泳。如图4所示，目的表达产物抗AT单链抗体以包涵体形式存在。通过6mol/L盐酸胍变性后用HisTrapHP柱进行复性并纯化。纯化步骤如下：变性：用含6mol/L盐酸胍的适量结合缓冲液(20mmol/LTris-HCl，0.5mol/LNaCl，5mmol/L咪唑，6mol/L盐酸胍，1mmol/Lβ-巯基乙醇，pH 8.0；)将包涵体溶解，并4℃放置8-16h，以充分变性。12000rpm，4℃离心去除不溶物。用结合缓冲液平衡纯化柱10个柱床体积(cv)。上清用结合缓冲液稀释10-20倍，并用0.45um滤器过滤后上样：
以(1/10-1/5)cv/min流速上样，并收集穿透液，用结合缓冲液平衡3-10cv或洗至基线，流速为(1/5-1)cv/min。用洗涤缓冲液(20mmol/LTris-HCl，0.5mol/LNaCl，20mmol/L咪唑，
6mol/L尿素，1mmol/Lβ-巯基乙醇，pH 8.0)洗至基线，流速为(1/5-1)cv/min，以10-30cv再折叠缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，5mmol/L咪唑，1mmol/Lβ-巯基乙醇，pH 8.0)进行线性洗涤，流速为(1/10-1/5)cv/min，以5-10cv洗脱缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，500mmol/L咪唑，1mmol/Lβ-巯基乙醇，pH 8.0)进行线性洗脱，流速为(1/5-1)cv/min。收集所有洗脱液。SDS-PAGE检测穿透液和洗脱液。
以(1/10-1/5)cv/min流速上样，并收集穿透液，用结合缓冲液平衡3-10cv或洗至基线，流速为(1/5-1)cv/min。用洗涤缓冲液(20mmol/LTris-HCl，0.5mol/LNaCl，20mmol/L咪唑，
6mol/L尿素，1mmol/Lβ-巯基乙醇，pH 8.0)洗至基线，流速为(1/5-1)cv/min，以10-30cv再折叠缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，5mmol/L咪唑，1mmol/Lβ-巯基乙醇，pH 8.0)进行线性洗涤，流速为(1/10-1/5)cv/min，以5-10cv洗脱缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，500mmol/L咪唑，1mmol/Lβ-巯基乙醇，pH 8.0)进行线性洗脱，流速为(1/5-1)cv/min。收集所有洗脱液。SDS-PAGE检测穿透液和洗脱液。
[0116] 二.抗阿特拉津单链抗体的鉴定
[0117] 用阿特拉津直接偶联法进行包被酶标板，小鼠抗组氨酸标签单克隆抗体为二抗，酶标山羊抗小鼠IgG为三抗，ELISA测定scFv的结合活性，以阿特拉津单抗作为对照，间接竞争ELISA测定其竞争活性(图5)。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种柔性抗冲击仿生拉压体膝关节 | 2020-05-12 | 84 |
| 一种柔性抗冲击仿生拉压体膝关节 | 2020-05-13 | 409 |
| 一种新型镍导体抗拉电力电缆 | 2020-05-13 | 690 |
| 一种互锁抗拉砌体砖 | 2020-05-11 | 109 |
| 具有抗拉构件的流体填充室 | 2020-05-13 | 260 |
| 防扭转的一体式隔震支座抗拉装置 | 2020-05-13 | 976 |
| 抗埃博拉病毒的中和性单克隆抗体 | 2020-05-11 | 564 |
| 具有抗拉构件的流体填充室 | 2020-05-11 | 280 |
| 一种多股镀锡导体抗拉电缆 | 2020-05-11 | 686 |
| 一种建筑节能保温隔热抗拉压墙体 | 2020-05-12 | 627 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈