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一种基于氢核磁定量分析技术测定人参皂苷Rd对照品含量的方法

阅读：987发布：2023-01-15

专利汇可以提供一种基于氢核磁定量分析技术测定人参皂苷Rd对照品含量的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种基于氢核磁定量分析技术测定人参皂苷Rd对照品含量的方法，包括如下步骤：1)测定人参皂苷Rd和内标物在不同溶剂中出峰情况，选定溶剂和定量峰；2)测定人参皂苷Rd和内标物定量目标峰在选定溶剂中的纵向弛豫时间T1；3)根据T1值设置核磁共振波谱仪的倾倒角和弛豫延迟时间，倾倒角为30-90°，弛豫延迟时间d1≥(7/3×T1max-5×T1max)；4)根据步骤2)所设定的参数测定样品和内标物中各定量目标峰的积分面积，得出人参皂苷Rd相对于内标物的摩尔比；5)根据内标物的质量，计算人参皂苷Rd的质量，然后计算人参皂苷Rd的纯度。该方法具有操作简便，内标物廉价易得，结果准确且重复性好等优点。，下面是一种基于氢核磁定量分析技术测定人参皂苷Rd对照品含量的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种基于氢核磁定量分析技术测定人参皂苷Rd对照品含量的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)测定人参皂苷Rd和内标物在不同溶剂中出峰情况，选定溶剂和定量峰；
2)测定人参皂苷Rd和内标物定量目标峰在选定溶剂中的纵向弛豫时间T1；
3)根据T1值设置核磁共振波谱仪的倾倒角和弛豫延迟时间，倾倒角为30-90°，弛豫延迟时间d1≥(7/3×T1max-5×T1max)；
4)根据步骤2)所设定的参数测定样品和内标物中各定量目标峰的积分面积，得出人参皂苷Rd相对于内标物的摩尔比；
5)根据内标物的质量，计算人参皂苷Rd的质量，然后计算人参皂苷Rd的纯度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述溶剂为氘代二甲基亚砜与重水的混合溶剂，氘代二甲基亚砜与重水的体积比为5～10:1。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：氘代二甲基亚砜与重水的体积比为8～10：
1。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：氘代二甲基亚砜与重水的体积比为9:1。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述内标物为苯甲酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述定量目标峰为人参皂苷Rd的第24位质子峰。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中，核磁共振波谱仪的参数为：测定温度25℃，观测频率400.13MHz，脉冲宽度11.8μs，采集时间4.0894s，累加次数设定为8～
128，所述倾倒角为30°、70°或90°，所述弛豫延迟时间为6～100s。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)中，所述积分面积为每一信号6次积分的平均值。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4)中，人参皂苷Rd纯度的计算公式为：
式中，ws样品的质量分数，wr内标物质量分数，As和ns分别为被测定样品的定量峰积分面积及定量峰包含质子数，Ar和nr分别为内标物质的定量峰积分面积及定量峰包含的质子数，Ms被测样品分子质量，Mr内标物质的分子质量，ms为样品的质量，mr称取的内标物质量。
10.权利要求1-9任一所述方法在测定人参皂苷Rd对照品含量中的应用。

说明书全文

一种基于氢核磁定量分析技术测定人参皂苷Rd对照品含量的

方法

技术领域

[0001] 本发明具体涉及一种基于氢核磁定量分析技术测定人参皂苷Rd对照品含量的方法。技术背景

[0002] 人参皂苷(ginsenoside)为四环三萜达玛烷型皂苷，人参的特征性化学成分，具有改善免疫功能、提高记忆、延缓衰老、改善心血管功能等作用。人参Ginseng Radix et Rhizoma，五加科人参属植物人参Panax ginseng C.A.Meyer的干燥根和根茎，传统名贵中药，《神农本草经》列为上品，载其“味甘，微寒，主补五脏，安精神，开心益智，久服轻身延年”，中国药典2015版载其“大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津养血，安神益智”，为广为认可的补益药之一。

[0003] 目前，人参皂苷含量测量主要使用反相高效(超高效)液相色谱仪，配合DAD或者ELSD检测器，或者高效液相色谱串联质谱法进行测定。这些分析测试方法均需要高纯度标准品作对照，并且杂质与目标物响应值有差异，会影响其准确性。氢核磁定量分析技术(Quantitative hydrogen nuclear magnetic resonance spectroscopy)，是基于核磁共振原理的一种定量分析方法，其原理是不同化学环境的氢原子的共振峰面积，只与其原子数目有关。方法简单、快捷，不破坏样品，可以不使用待测组分的对照品，而使用已知含量的普通化学物质为参比，相比于高效液相色谱法、气质及液质联用等定量技术具有独特的优势。但目前没有运用氢核磁定量分析技术对人参皂苷Rd含量测定的相关方法。

发明内容

[0004] 核磁定量的原理是在适当的仪器参数条件下含氢有机化合物1H NMR波谱信号直接与原子数目成正比，因此在实验参数设定时，需要被测物与内标物上的共振峰与其对应的原子数尽可能保持一致，若选择不合适位置的氢进行纯度的测定，杂质、组分、内标物和溶剂信号容易相互干扰或重叠，导致积分不准确，影响结果的可靠性。人参皂苷Rd的分子量高达946，其化学结构式如(图1)所示，含有众多羟基活泼氢，采用氢核磁定量分析技术进行测定时，信号重叠严重。含有活泼氢的氘代溶剂可以抑制化合物活泼氢信号，发明人经过研究发现，人参皂苷Rd信号在加入一定量重水之后，活泼氢信号被抑制。但重水H信号随着重水比例的变化而发生移动，且当重水比例少，活泼氢信号抑制不完全，定量峰积分准确度受影响，重水比例大，重水信号会掩盖定量峰或造成定量峰附近基线不平，选择对人参皂苷合适的重水比例对核磁共振分析具有重要意义。

[0005] 同时，不同位移峰都会对应不同的倾倒角和弛豫时间等参数，选择对定量峰合适的脉冲倾倒角和弛豫时间，是目前限制采用氢核磁共振测定人参皂苷Rd纯度的技术难题之一。而脉冲倾倒角和弛豫时间是建立氢核磁共振定量方法中的两个重要仪器参数，直接影响最终定量结果的准确性，而在之前运用氢核磁共振分析对照品的方法中，这两个参数常被忽视，导致方法的准确性和便捷性受到影响。

[0006] 为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种基于氢核磁定量分析技术测定人参皂苷Rd对照品含量的方法，该方法具有操作简便，内标物廉价易得，结果准确且重复性好等优点。

[0007] 为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：

[0008] 一种基于氢核磁定量分析技术测定人参皂苷Rd对照品含量的方法，包括如下步骤：

[0009] 1)测定人参皂苷Rd和内标物在不同溶剂中出峰情况，选定溶剂和定量峰；

[0010] 2)测定人参皂苷Rd和内标物定量目标峰在选定溶剂中的纵向弛豫时间T1；

[0011] 3)根据T1值设置核磁共振波谱仪的倾倒角和弛豫延迟时间，倾倒角为30-90°，弛豫延迟时间d1≥(7/3×T1max-5×T1max)；

[0012] 4)根据步骤2)所设定的参数测定样品和内标物中各定量目标峰的积分面积，得出人参皂苷Rd相对于内标物的摩尔比；

[0013] 5)根据内标物的质量，计算人参皂苷Rd的质量，然后计算人参皂苷Rd的纯度。

[0014] 优选的，步骤1)中，所述溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)与重水的混合溶剂，氘代二甲基亚砜与重水的体积比为5～10:1，优选为8～10：1，进一步为9:1。

[0015] 氘代DMSO性质稳定、不易挥发，对被测样品和内标物溶解性良好，为核磁定量的合适溶剂。单独以氘代DMSO为溶剂时，待测样品图谱中人参皂苷Rd定量峰旁边存在活泼氢信号的干扰峰。采用在DMSO加入一定量重水的混合溶剂可以屏蔽人参皂苷Rd活泼氢信号，解决了人参皂苷Rd自身信号重叠的问题(图2)。发明人经过摸索发现，当使用DMSO和重水混合溶剂时，若重水比例较少，则对活泼氢信号抑制不完全，当重水比例过大，重水信号掩盖定量峰或造成定量峰附近基线不平，重水H信号随着重水比例的变化而发生移动，最终选定合适混合溶剂比例(图3)。

[0016] 优选的，步骤2)中，所述定量目标峰为人参皂苷Rd的第24位质子峰。

[0017] 需要说明的是，核磁共振定量的原理是含氢有机化合物NMR波普信号直接与原子数目成正比，若选择不合适位置的氢进行纯度测定，会导致积分不准确，检测结果重现性差。

[0018] 本发明中人参皂苷Rd的分子量为946，结构式如背景技术中所示，实际上除了众多羟基活泼氢，人参皂苷Rd还有约69个氢信号，每一位移峰都会对应不同的倾倒角和弛豫延迟时间等参数，选择哪个位置的氢进行纯度测定是目前限制利用氢核磁共振测定人参皂苷Rd纯度的技术难题之。

[0019] 优选的，步骤2)中，核磁共振波谱仪的参数为：测定温度25℃，观测频率400.13MHz，脉冲宽度11.8μs，采集时间4.0894s，累加次数设定为8～128，所述倾倒角为
30°，70°或90°，所述弛豫延迟时间(d1)设定6～100s。

[0020] 脉冲倾倒角和弛豫延迟时间是建立氢核磁共振定量方法过程中两个重要仪器参数，直接影响最终定量结果的准确性，目前也有研究它们与检测结果关系的文献报道，在实际测定纯度时有一个公认测定步骤：将内标物与待测物质溶解于溶剂中，进行仪器参数设定的测量，在进行参数的测定时将脉冲倾倒角和弛豫延迟时间等同于共振频率等参数进行设定，导致方法准确性存在盲目性。本发明人在研究中克服了技术偏见。本发明测定了人参皂苷Rd样品及内标物的定量目标峰在氘代试剂中的纵向弛豫时间(T1)，并确定了在脉冲倾倒角30-90°时弛豫延迟时间，使检测人参皂苷Rd纯度结果更准确。

[0021] 当采用90°脉冲时，具有较好的灵敏度，但此时d1≥5×T1max是确保含量测定数据准确性的必要条件，分析时间较长，核磁定量快速性的优点得不到发挥；当采用较小的脉冲倾倒角时，如30脉冲，d1≥(7/3)×T1max就能获得准确的分析结果，且分析时间大大缩短。因此，本专利首先通过测量定量目标信号的纵向弛豫时间(T1)，按倾倒角30-90°，弛豫延迟时间d1≥(7/3)×T1max-5×T1max的原则优化脉冲倾倒角、弛豫延迟时间(d1)等参数，在确保方法准确性的前提下，尽量采用较小的弛豫延迟时间，提高分析样品的效率。

[0022] 优选的，步骤1)中，所述内标物为苯甲酸。

[0023] 苯甲酸的信号范围较人参皂苷Rd位于低场，有利于提高内标物和样品信号的分离度，且具有廉价易得、信号简单、化学性质稳定等优点。

[0024] 优选的，步骤3)中，所述积分面积为每一信号6次积分的平均值。

[0025] 优选的，步骤4)中，人参皂苷Rd纯度的计算公式为：

[0026]

[0027] 式中，ws样品的质量分数，wr内标物质量分数，As和ns分别为被测定样品的定量峰积分面积及定量峰包含质子数，Ar和nr分别为内标物质的定量峰积分面积及定量峰包含的质子数，Ms被测样品分子质量，Mr内标物质的分子质量，ms为样品的质量，mr称取的内标物质量。

[0028] 本发明的有益效果：

[0029] 本发明相比于高效液相色谱法、液质联用等方法，不需要绘制标准曲线，单次测定能准确得出人参皂苷Rd的绝对含量。避免了溶剂残留对纯度的干扰，操作简便，结果准确且重复性好。不依赖色谱分离，基于质子的响应而实现定量，信号无选择性响应。不依赖于被测物的高纯标准品进行定量分析。此外，定量同时可体现提取物结构信息，可在定量同时具有一定定性特征。

[0030] 本发明样品前处理简单，分析时间短，特别适合无共轭紫外吸收的样品的纯度分析和质量控制，为人参皂苷类纯度提供了新方法。

[0031] 本发明采用DMSO和重水混合溶剂可以屏蔽人参皂苷Rd活泼氢信号，解决了人参皂苷Rd自身信号重叠的问题。选择苯甲酸为内标物，其信号范围较人参皂苷Rd位于低场，解决了内标物和样品信号分离度的问题。

[0032] 本发明系统测定了可用于氢核磁定量的目标信号的T1值，在此基础上深入探讨了仪器脉冲倾倒角和弛豫延迟时间等参数对含量测定结果的影响，确保所建立的人参皂苷Rd纯度检测方法的准确性。

[0033] 本发明首先通过测量定量目标信号的纵向弛豫时间(T1)，按倾倒角30-90°，弛豫延迟时间d1≥(7/3)×T1max-5×T1max的原则优化脉冲倾倒角、弛豫延迟时间(d1)等参数，在确保方法准确性的前提下，尽量采用较小的弛豫延迟时间，提高分析样品的效率。附图说明

[0034] 图1为人参皂苷Rd(左)和苯甲酸(右)结构式图；

[0035] 图2不同氘代溶剂中核磁共振氢谱法测定图谱，A为人参皂苷Rd部分H谱(dDMSO)；B为人参皂苷Rd和苯甲酸混合物(dDMSO)；C为人参皂苷Rd和苯甲酸混合物(dDMSO+D2O)；

[0036] 图3为不同比例dDMSO-重水混合溶剂核磁共振氢谱法测定人参皂苷Rd和苯甲酸混合物的图谱，A为dDMSO-重水(5:1)；B为dDMSO-重水(7:1)；C为dDMSO-重水(9:1)；

[0037] 图4为实施例1中核磁共振氢谱图全谱；

[0038] 图5为实施例1中核磁共振氢谱图；

[0039] 图6为实施例2中核磁共振氢谱图；

[0040] 图7为实施例3中核磁共振氢谱图；

[0041] 图8为实施例4中核磁共振氢谱图；

[0042] 图9为实施例5中核磁共振氢谱图；

[0043] 图10为实施例6中核磁共振氢谱图；

[0044] 图11为实施例7中核磁共振氢谱图；

[0045] 图12为实施例8中核磁共振氢谱图；

[0046] 图13为实施例9中核磁共振氢谱图；

[0047] 图14为实施例10中核磁共振氢谱图；

[0048] 图15为实施例11中核磁共振氢谱图；

[0049] 图16为实施例12中核磁共振氢谱图；

[0050] 图17为实施例13中核磁共振氢谱图；

[0051] 图18为实施例14中核磁共振氢谱图。

具体实施方式

[0052] 应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

[0053] 需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

[0054] 1)溶剂选择

[0055] 选择对人参皂苷合适的重水比例对核磁共振分析具有重要意义。如图3所示分别为dDMSO-重水(5:1，7:1，9:1，V/V)时H NMR谱图，水峰信号分别位于δΗ 3.74，3.80，4.00，可以看到，随着重水比例增加，水峰信号向低场移动。而dDMSO-重水(9:1，V/V)时，已经可以完全抑制活泼氢信号。

[0056] 2)人参皂苷Rd及苯甲酸定量峰选择

[0057] 而由1D及2D核磁共振谱对人参皂苷Rd进行信号归属，在其1H NMR谱上可观察到δΗ5.07，δΗ 4.46，δΗ4.29信号达到基线分离，不受其他信号干扰，可以作为定量峰。选择苯甲
1
酸为内标物，苯甲酸 H NMR谱中，δΗ 7.62为其的4位质子信号，δΗ7.94为其的2位和6位质子信号，δΗ7.50为其的3位和5位质子信号，与其他信号完全分开，可作为内标物定量峰。

[0058] 3)T1值测定

[0059] 采用质子反转-恢复T1实验方法测定各定量目标峰的纵向弛豫时间T1，并用Bruker的T1计算程序计算。设定脉冲弛豫延迟时间范围为1-30s。经过测定以氘代DMSO-重水(9：1，V/V)为溶剂时，人参皂苷RdδΗ5.07(t,J＝6.6Hz，H-24)处信号T1为1.410s。δΗ 4.29 (2’-rha-1”)处信号T1为1.055s。考虑到H-24两侧基线更为平坦，可使积分面积值误差更小，更符合定量原则，实施例中选择24位质子信号的积分面积值作为测定人参皂苷Rd含量的计算依据。

[0060] 苯甲酸δΗ7.94质子峰T1为2.518s，δΗ7.62质子峰T1为4.082s，δΗ7.50质子峰T1为2.320s。考虑到T1越大，测试所需时间更长，实施例中选择T1值较小，同时分离度较好的δΗ
7.94质子峰积分面积值作为定量峰。

[0061] 4)实施例

[0062] 实施例1

[0063] 分别精密称取14.772mg人参皂苷Rd对照品和1.023mg苯甲酸对照品，置于核磁共振样品管中(直径5mm)，氘代DMSO-重水(9：1，V/V)为溶剂溶解，制成待测试样溶液。在上述实验条件下调整仪器参数，匀场、采样，得到图谱后进行相位和基线调整，对人参皂苷Rd和苯甲酸的定量峰分别进行积分，各积分6次，当相对标准偏差<1％时取平均值。按照1H-NMR内标法根据积分结果用以下公式计算样品的质量分数。

[0064] 核磁共振(NMR)采集条件：测定温度25℃，观测频率400.13MHz，脉冲宽度11.8μs，采集时间4.0894s，脉冲倾倒角90°(zg)，Number of Scans 16，Receiver Gain 18，RelaxationDelay 100s，测定样品的NMR谱图。

[0065] 如图4和图5所示，在1H NMR谱中，内标物苯甲酸δH7.94信号峰积分为2，人参皂苷RdδH5.07处信号峰积分为1.84，根据公式1可得到人参皂苷Rd的纯度为98.3％，重复6次，标准误差为0.25％，相对标准偏差0.3％。

[0066] 人参皂苷Rd纯度的计算公式为：

[0067]

[0068] 式中，ws样品的质量分数；wr为内标物质量分数；As为被测定样品的定量峰积分面积，1.84；ns为被测定样品的定量峰包含质子数，1；Ar为内标物质的定量峰积分面积，1；nr为内标物质的定量峰包含的质子数，1；Ms被测样品摩尔质量，947.17g/mol；Mr内标物质的摩尔质量，122.12g/mol；ms为样品的质量，14.772mg；mr称取的内标物质量，1.023mg。

[0069] 实施例2

[0070] 1H NMR测试样品同实例1。核磁共振(NMR)采集条件：测定温度25℃，观测频率400.13MHz，脉冲宽度11.8μs，采集时间4.0894s，脉冲序列zg(90°)，Number of Scans 16，Receiver Gain 18，Relaxation Delay 80s，测定样品的NMR谱图。

[0071] 如图6示，在1H NMR谱中，内标物苯甲酸δH7.94信号峰积分为2，人参皂苷RdδH5.07处信号峰积分为1.85，根据公式1可得到人参皂苷Rd的纯度为98.9％，重复6次，标准误差0.11％，相对标准偏差0.3％。

[0072] 实施例3

[0073] 1H NMR测试样品同实例1。核磁共振(NMR)采集条件：测定温度25℃，观测频率400.13MHz，脉冲宽度11.8μs，采集时间4.0894s，脉冲倾倒角90°(zg)，Number ofScans32，Receiver Gain 18，Relaxation Delay50s，测定样品的NMR谱图。

[0074] 如图7所示，在1H NMR谱中，内标物苯甲酸δH7.94信号峰积分为2，人参皂苷RdδH5.07处信号峰积分为1.83，根据公式1可得到人参皂苷Rd的纯度为97.8％，重复6次，标准误差0.22％，相对标准偏差0.2％。

[0075] 实施例4

[0076] 1H NMR测试样品同实例1。核磁共振(NMR)采集条件：测定温度25℃，观测频率400.13MHz，脉冲宽度11.8μs，采集时间4.0894s，脉冲倾倒角90°(zg)，Number ofScans32，Receiver Gain 21，Relaxation Delay 30s，测定样品的NMR谱图。

[0077] 如图8所示，在1H NMR谱中，内标物苯甲酸δH7.94信号峰积分为2，人参皂苷RdδH5.07处信号峰积分为1.86，根据公式1可得到人参皂苷Rd的纯度为99.4％，重复6次，标准误差0.30％，相对标准偏差0.31％。

[0078] 实施例5

[0079] 1H NMR测试样品同实例1。核磁共振(NMR)采集条件：测定温度25℃，观测频率400.13MHz，脉冲宽度11.8μs，采集时间4.0894s，脉冲倾倒角90°(zg)，Number ofScans16，Receiver Gain 18，Relaxation Delay 25s，测定样品的NMR谱图。

[0080] 如图9所示，在1H NMR谱中，内标物苯甲酸δH 7.94信号峰积分为2，人参皂苷RdδH 5.07处信号峰积分为1.85，根据公式1可得到人参皂苷Rd的纯度为98.9％，重复6次，标准误差0.28％，相对标准偏差0.2％。

[0081] 实施例6

[0082] 1H NMR测试样品同实例1。核磁共振(NMR)采集条件：测定温度25℃，观测频率400.13MHz，脉冲宽度11.8μs，采集时间4.0894s，脉冲倾倒角90°(zg)，Number of Scans32，Receiver Gain 18，Relaxation Delay 20s，测定样品的NMR谱图。

[0083] 如图10所示，在1H NMR谱中，内标物苯甲酸δH 7.94信号峰积分为2，人参皂苷RdδH 5.07处信号峰积分为1.82，根据公式1可得到人参皂苷Rd的纯度为，重复6次，标准误差
0.23％，相对标准偏差0.19％。

[0084] 实施例7

[0085] 1H NMR测试样品同实例1。核磁共振(NMR)采集条件：测定温度25℃，观测频率400.13MHz，脉冲宽度11.8μs，采集时间4.0894s，脉冲倾倒角90°(zg)，Number ofScans32，Receiver Gain 21，Relaxation Delay 15s，测定样品的NMR谱图。

[0086] 如图11所示，在1H NMR谱中，内标物苯甲酸δH 7.94信号峰积分为2，人参皂苷RdδH5.07处信号峰积分为1.81，根据公式1可得到人参皂苷Rd的纯度为96.7％，重复6次，标准误差0.36％，相对标准偏差0.26％。

[0087] 实施例8

[0088] 1H NMR测试样品同实例1。核磁共振(NMR)采集条件：测定温度25℃，观测频率400.13MHz，脉冲宽度11.8μs，采集时间4.0894s，脉冲倾倒角90°(zg)，Number of Scans32，Receiver Gain 21，Relaxation Delay 13s，测定样品的NMR谱图。

[0089] 如图12所示，在1H NMR谱中，内标物苯甲酸δH 7.94信号峰积分为2，人参皂苷RdδH5.07处信号峰积分为1.84，根据公式1可得到人参皂苷Rd的纯度为98.3％，重复6次，标准误差0.42％，相对标准偏差0.31％。

[0090] 实施例9

[0091] 1H NMR测试样品同实例1。核磁共振(NMR)采集条件：测定温度25℃，观测频率400.13MHz，脉冲宽度11.8μs，采集时间1.9999s，脉冲倾倒角90°(zg)，Number of Scans
32，Receiver Gain 18，Relaxation Delay 15s，测定样品的NMR谱图。

[0092] 如图13所示，在1H NMR谱中，内标物苯甲酸δH7.94信号峰积分为2，人参皂苷RdδH5.07处信号峰积分为1.84，根据公式1可得到人参皂苷Rd的纯度为98.3％，重复6次，标准误差0.38％，相对标准偏差0.25％。

[0093] 实施例10

[0094] 1H NMR测试样品同实例1。核磁共振(NMR)采集条件：测定温度25℃，观测频率400.13MHz，脉冲宽度11.8μs，采集时间4.0894s，脉冲倾倒角30°(zg30)，Number of Scans16，Receiver Gain 32，Relaxation Delay 30s，测定样品的NMR谱图。

[0095] 如图14所示，在1H NMR谱中，内标物苯甲酸δH7.94信号峰积分为2，人参皂苷RdδH5.07处信号峰积分为1.82，根据公式1可得到人参皂苷Rd的纯度为97.3％，重复6次，标准误差0.36％，相对标准偏差0.4％。

[0096] 实施例11

[0097] 1H NMR测试样品同实例1。核磁共振(NMR)采集条件：测定温度25℃，观测频率400.13MHz，脉冲宽度11.8μs，采集时间4.0894s，脉冲倾倒角30°(zg30)，Number of Scans32，Receiver Gain 32，Relaxation Delay 20s，测定样品的NMR谱图。

[0098] 如图15所示，在1H NMR谱中，内标物苯甲酸δH7.94信号峰积分为2，人参皂苷RdδH5.07处信号峰积分为1.86，根据公式1可得到人参皂苷Rd的纯度为99.4％，重复6次，标准误差0.30％，相对标准偏差0.2％。

[0099] 实施例12

[0100] 1H NMR测试样品同实例1。核磁共振(NMR)采集条件：测定温度25℃，观测频率400.13MHz，脉冲宽度11.8μs，采集时间4.0894s，脉冲倾倒角30°(zg30)，Number of Scans32，Receiver Gain 32，Relaxation Delay 15s，测定样品的NMR谱图。

[0101] 如图16所示，在1H NMR谱中，内标物苯甲酸δH7.94信号峰积分为2，人参皂苷RdδH5.07处信号峰积分为1.84，根据公式1可得到人参皂苷Rd的纯度为98.3％，重复6次，标准误差0.39％，相对标准偏差0.3％。

[0102] 实施例13

[0103] 1H NMR测试样品同实例1。核磁共振(NMR)采集条件：测定温度25℃，观测频率400.13MHz，脉冲宽度11.8μs，采集时间4.0894s，脉冲倾倒角30°(zg30)，Number of Scans32，Receiver Gain 32，Relaxation Delay 13s，测定样品的NMR谱图。

[0104] 如图17所示，在1H NMR谱中，内标物苯甲酸δH 7.94信号峰积分为2，人参皂苷RdδH5.07处信号峰积分为1.83，根据公式1可得到人参皂苷Rd的纯度为97.8％，重复6次，标准误差0.42％，相对标准偏差0.4％。

[0105] 实施例14

[0106] 1H NMR测试样品同实例1。核磁共振(NMR)采集条件：测定温度25℃，观测频率400.13MHz，脉冲宽度11.8μs，采集时间1.9999s，脉冲倾倒角30°(zg30)，Number of Scans32，Receiver Gain 32，Relaxation Delay 15s，测定样品的NMR谱图。

[0107] 如图18所示，在1H NMR谱中，内标物苯甲酸δH7.94信号峰积分为2，人参皂苷RdδH5.07处信号峰积分为1.83，根据公式1可得到人参皂苷Rd的纯度为97.8％，重复6次，标准误差0.51％，相对标准偏差0.4％。

[0108] 以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

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