储存细菌的方法和组合物
阅读：1075发布：2020-07-01
专利汇可以提供储存细菌的方法和组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文描述了用于培养和保存细菌的方法和组合物，其中与通过除主题方法以外的手段保存/储存的细菌相比，培养和保存的细菌展现出改进的活 力 /生长。更具体地，本文公开了用于在冷冻保存后改进细菌活力的方法和组合物。，下面是储存细菌的方法和组合物专利的具体信息内容。
1.一种改进冷冻保存后的细菌活力的方法，其包括：
a)将第一细菌物种与至少一种第二细菌物种组合以产生细菌混合物，其中所述第一细菌物种是氨基酸球菌属物种或氨基酸球菌科的成员，其中所述第一细菌物种以足以对所述至少一种第二细菌物种赋予冷冻保护的量存在于所述细菌混合物中，并且其中氨基酸球菌科物种的成员是运动琥珀酸螺菌；
b)培养所述细菌混合物以产生培养的细菌混合物，其中所述培养持续足以对所述培养的细菌混合物中的所述至少一种第二细菌物种赋予所述冷冻保护的时间段；和c)冷冻保存所述培养的细菌混合物以产生冷冻保存的细菌培养物；其中在细菌增殖测定中，所述冷冻保存的细菌培养物在重构后，相对于包含所述至少一种第二细菌物种且不含所述第一细菌物种的冷冻保存的细菌培养物在重构后的细菌增殖，展现出所述至少一种第二细菌物种的至少10×增加的细菌增殖。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述氨基酸球菌属物种是肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述第一细菌物种的足以对所述细菌混合物中的所述至少一种第二细菌物种赋予冷冻保护的量在所述细菌混合物中细菌总量的10％与50％之间。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌增殖测定是细菌平板接种测定。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌平板接种测定测量每mL的菌落形成单位(cfu/mL)。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种第二细菌物种是冷冻保护不应的。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种第二细菌物种源自哺乳动物粪便。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种第二细菌物种源自人粪便。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种第二细菌物种是以下中的至少一种：陪伴粪球菌、产甲酸多尔氏菌、扭曲真杆菌、酸奶瘤胃球菌、直肠真杆菌、普氏栖粪杆菌、挑剔真杆菌、扭链瘤胃球菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、哈氏厌氧棒状菌、鲁提布劳特氏菌、卵瘤胃球菌、粪便布劳特氏菌、长链多尔氏菌、螺状梭菌、链状真杆菌、耐氧梭菌、乳酸发酵梭菌、霍氏真杆菌、海氏梭菌、食葡糖罗斯拜瑞氏菌、人罗斯拜瑞氏菌和粪便罗斯拜瑞氏菌。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述冷冻保存包括冻结和冻干。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述重构包括使用重构介质以所述冷冻保存的细菌培养物与所述重构介质1:1的比率稀释所述冷冻保存的细菌培养物。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述冷冻保存的细菌培养物包含冻干保护剂介质。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述冻干保护剂介质包含蔗糖、Ficoll 70和聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述冷冻保存的细菌培养物包含核黄素、半胱氨酸和菊粉中的至少一种。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述冷冻保存的细菌培养物包含冷冻保护剂介质。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述冷冻保护剂介质包含甘油、聚乙二醇(PEG)和二甲基亚砜(DMSO)中的至少一种。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述足以对所述培养的细菌混合物中的所述至少一种第二细菌物种赋予所述冷冻保护的时间段是至少30分钟或至少一个小时。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述足以对所述培养的细菌混合物中的所述至少一种第二细菌物种赋予所述冷冻保护的时间段的范围是30分钟至2小时或1至2小时。
19.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一细菌物种是活的。
20.一种改进冷冻保存后的细菌活力的方法，其包括：
a)将第一细菌物种与至少一种第二细菌物种组合以产生细菌混合物，其中所述第一细菌物种是肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌，其中所述第一细菌物种以足以对所述至少一种第二细菌物种赋予冷冻保护的量存在于所述细菌混合物中；
b)培养所述细菌混合物以产生培养的细菌混合物，其中所述培养持续足以对所述培养的细菌混合物中的所述至少一种第二细菌物种赋予所述冷冻保护的时间段；和c)冷冻保存所述培养的细菌混合物以产生冷冻保存的细菌培养物；其中在细菌增殖测定中，所述冷冻保存的细菌培养物在重构后，相对于包含所述至少一种第二细菌物种且不含所述第一细菌物种的冷冻保存的细菌培养物在重构后的细菌增殖，展现出所述至少一种第二细菌物种的至少10×增加的细菌增殖。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述第一细菌物种的足以对所述细菌混合物中的所述至少一种第二细菌物种赋予冷冻保护的量在所述细菌混合物中细菌总量的10％与
50％之间。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述细菌增殖测定是细菌平板接种测定。
23.如权利要求20所述的方法，其中所述细菌平板接种测定测量每mL的菌落形成单位(cfu/mL)。
24.如权利要求20所述的方法，其中所述至少一种第二细菌物种是冷冻保护不应的。
25.如权利要求20所述的方法，其中所述至少一种第二细菌物种源自哺乳动物粪便。
26.如权利要求20所述的方法，其中所述至少一种第二细菌物种源自人粪便。
27.如权利要求20所述的方法，其中所述至少一种第二细菌物种是以下中的至少一种：
陪伴粪球菌、产甲酸多尔氏菌、扭曲真杆菌、酸奶瘤胃球菌、直肠真杆菌、普氏栖粪杆菌、挑剔真杆菌、扭链瘤胃球菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、哈氏厌氧棒状菌、鲁提布劳特氏菌、卵瘤胃球菌、粪便布劳特氏菌、长链多尔氏菌、螺状梭菌、链状真杆菌、耐氧梭菌、乳酸发酵梭菌、霍氏真杆菌、海氏梭菌、食葡糖罗斯拜瑞氏菌、人罗斯拜瑞氏菌和粪便罗斯拜瑞氏菌。
28.如权利要求20所述的方法，其中所述冷冻保存包括冻结和冻干。
29.如权利要求20所述的方法，其中所述重构包括使用重构介质以所述冷冻保存的细菌培养物与所述重构介质1:1的比率稀释所述冷冻保存的细菌培养物。
30.如权利要求20所述的方法，其中所述冷冻保存的细菌培养物包含冻干保护剂介质。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述冻干保护剂介质包含蔗糖、Ficoll 70和聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。
32.如权利要求20所述的方法，其中所述冷冻保存的细菌培养物包含核黄素、半胱氨酸和菊粉中的至少一种。
33.如权利要求20所述的方法，其中所述冷冻保存的细菌培养物包含冷冻保护剂介质。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述冷冻保护剂介质包含甘油、聚乙二醇(PEG)和二甲基亚砜(DMSO)中的至少一种。
35.如权利要求20所述的方法，其中所述足以对所述培养的细菌混合物中的所述至少一种第二细菌物种赋予所述冷冻保护的时间段是至少30分钟或至少一个小时。
36.如权利要求20所述的方法，其中所述足以对所述培养的细菌混合物中的所述至少一种第二细菌物种赋予所述冷冻保护的时间段的范围是30分钟至2小时或1至2小时。
37.如权利要求20所述的方法，其中所述第一细菌物种是活的。
38.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌混合物中所述第一细菌物种与所述至少一种第二细菌物种的比率是至少1:10。
39.如权利要求20所述的方法，其中所述细菌混合物中所述第一细菌物种与所述至少一种第二细菌物种的比率是至少1:10。
40.一种用于冷冻保存制剂的氨基酸球菌属物种，其中所述氨基酸球菌属物种改进与其一起存在于所述冷冻保存制剂中的其他细菌物种在重构后的细菌活力。
41.一种包含冷冻保存制剂的组合物，其包含：
细菌物种在人造冷冻保存介质中的混合物，所述混合物包含
a)第一细菌物种，其中所述第一细菌物种是肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌；和b)至少一种第二细菌物种，
其中所述第一细菌物种以足以在重构所述人造冷冻保存制剂时对所述至少一种第二细菌物种赋予冷冻保护的量存在于所述冷冻保存制剂中，并且
其中在细菌增殖测定中，所述人造冷冻保存制剂在重构后，相对于包含所述至少一种第二细菌物种且不含所述第一细菌物种的人造冷冻保存制剂在重构后的细菌增殖，展现出所述至少一种第二细菌物种的至少10×增加的细菌增殖。
42.如权利要求41所述的组合物，其中所述第一细菌物种的足以对所述细菌混合物中的所述至少一种第二细菌物种赋予冷冻保护的量在所述人造冷冻保存制剂中细菌总量的
10％与50％之间。
43.如权利要求41所述的组合物，其中所述细菌增殖测定是细菌平板接种测定。
44.如权利要求41所述的组合物，其中所述细菌平板接种测定测量每mL的菌落形成单位(cfu/mL)。
45.如权利要求41所述的组合物，其中所述至少一种第二细菌物种是冷冻保护不应的。
46.如权利要求41所述的组合物，其中所述至少一种第二细菌物种源自哺乳动物粪便。
47.如权利要求41所述的组合物，其中所述至少一种第二细菌物种源自人粪便。
48.如权利要求41所述的组合物，其中所述至少一种第二细菌物种是以下中的至少一种：陪伴粪球菌、产甲酸多尔氏菌、扭曲真杆菌、酸奶瘤胃球菌、直肠真杆菌、普氏栖粪杆菌、挑剔真杆菌、扭链瘤胃球菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、哈氏厌氧棒状菌、鲁提布劳特氏菌、卵瘤胃球菌、粪便布劳特氏菌、长链多尔氏菌、螺状梭菌、链状真杆菌、耐氧梭菌、乳酸发酵梭菌、霍氏真杆菌、海氏梭菌、食葡糖罗斯拜瑞氏菌、人罗斯拜瑞氏菌和粪便罗斯拜瑞氏菌。
49.如权利要求41所述的组合物，其中所述人造冷冻保存介质包含冷冻保存剂。
50.如权利要求41所述的组合物，其中所述重构包括使用重构介质以所述冷冻保存制剂与所述重构介质1:1的比率稀释所述冷冻保存制剂。
51.如权利要求41所述的组合物，其中所述人造冷冻保存介质包含冻干保护剂介质。
52.如权利要求51所述的组合物，其中所述冻干保护剂介质包含蔗糖、Ficoll 70和聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。
53.如权利要求51所述的组合物，其中所述人造冷冻保存介质包含核黄素、半胱氨酸和菊粉中的至少一种。
54.如权利要求41所述的组合物，其中所述人造冷冻保存的细菌培养物包含冷冻保护剂介质。
55.如权利要求54所述的组合物，其中所述冷冻保护剂介质包含甘油、聚乙二醇(PEG)和二甲基亚砜(DMSO)中的至少一种。
56.如权利要求41所述的组合物，其中所述第一细菌物种是活的。
57.如权利要求41所述的组合物，其中所述至少一种第二细菌物种以治疗有效量存在。
58.如权利要求41所述的组合物，其还包含药学上可接受的赋形剂。
59.一种包含冷冻保存制剂的药物组合物，其包含：
细菌物种在人造冷冻保存介质中的混合物，所述混合物包含
a)第一细菌物种，其中所述第一细菌物种是肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌；和b)至少一种第二细菌物种，其中所述至少一种第二细菌物种以治疗有效量存在，并且其中所述第一细菌物种以足以在重构所述人造冷冻保存制剂时对所述至少一种第二细菌物种赋予冷冻保护的量存在于所述冷冻保存制剂中，并且
其中在细菌增殖测定中，所述人造冷冻保存制剂在重构后，相对于包含所述至少一种第二细菌物种且不含所述第一细菌物种的人造冷冻保存制剂在重构后的细菌增殖，展现出所述至少一种第二细菌物种的至少10×增加的细菌增殖；和
药学上可接受的赋形剂。
60.一种用于改善患有胃肠疾病的受试者的胃肠疾病的症状的方法，所述方法包括给所述受试者施用如权利要求59所述的药物组合物。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述胃肠疾病包括胃肠道生态失调、艰难梭菌感染和炎症性肠病、肠易激综合征和憩室病中的至少一种。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述炎症性肠病是克罗恩病和溃疡性结肠炎中的至少一种。
储存细菌的方法和组合物
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2017年4月28日提交的美国临时申请号62/491,739的优先权，出于所有目的将其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
[0003] 本文公开了用于培养和保存/储存细菌的方法和组合物，其中培养和保存/储存的细菌与通过除所述主题方法以外的手段保存/储存的细菌相比展现出改进的活力/生长。更具体地，本文公开了在冷冻保存后改进细菌活力的方法和组合物。
背景技术
[0004] 存在许多储存细菌的方法，但是，为每种特定细菌选择的各种储存方法取决于细菌相容性(bacterial compatibility)、实验目的和细胞活力。通常，随着储存温度降低，细菌的储存期增加。一旦温度低于冻结点(freezing point)，可以使用冷冻保护剂来降低由冻结过程引起的细胞损伤。附图说明
[0005] 将参考附图进一步说明本发明，其中在几个视图中相同的结构用相同的数字表示。所示的附图不一定按比例绘制，而是通常将重点放在说明本发明的原理上。此外，一些特征可能被扩大以显示特定部件的细节。
[0006] 此外，附图中所示的任何测量、规格等都旨在是说明性的，而非限制性的。因此，本文所公开的具体结构和功能细节不应解释为限制性的，而应仅仅解释为用于教导本领域技术人员以各种方式采用本发明的代表性基础。
[0007] 图1A和图1B示出了在根据本发明的一些实施方案的方法中使用的单级恒化器容器。
[0008] 图2示出了双瓶(double flask)设备，其中黑色箭头状物标识了0.22μm过滤器的安装位置，该过滤器有效地保持两个瓶中的内容物分开，只有小于0.22μm的分子可以自由通过过滤器(例如，每种培养物的代谢副产物和细胞-细胞信号传导分子)。整个设备在使用前已灭菌。0.22μm过滤器阻止肠氨基酸球菌(A.intestini)与其共培养伴生菌株(companion strain)的直接接触(细胞-细胞)。
发明内容
[0009] 一方面，提出了一种在冷冻保存后改进细菌活力的方法，其包括：
[0010] a)将第一细菌物种与至少一种第二细菌物种组合以产生细菌混合物，其中所述第一细菌物种是氨基酸球菌属(Acidaminococcus)物种或氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae)的成员，其中所述第一细菌物种以足以对所述至少一种第二细菌物种赋予冷冻保护的量存在于所述细菌混合物中，并且其中氨基酸球菌科物种的成员是运动琥珀酸螺菌(Succinispira mobilis)；
[0011] b)培养所述细菌混合物以产生培养的细菌混合物，其中所述培养持续足以对所述培养的细菌混合物中的所述至少一种第二细菌物种赋予所述冷冻保护的时间段；和[0012] c)冷冻保存所述培养的细菌混合物以产生冷冻保存的细菌培养物；其中在细菌增殖测定中，所述冷冻保存的细菌培养物在重构(reconsitution)后，相对于包含所述至少一种第二细菌物种且不含所述第一细菌物种的冷冻保存的细菌培养物在重构后的细菌增殖，展现出所述至少一种第二细菌物种的至少10×增加的细菌增殖。
[0013] 在特定的实施方案中，在细菌增殖测定中，所述冷冻保存的细菌培养物在重构后，相对于包含所述至少一种第二细菌物种且不含所述第一细菌物种的冷冻保存的细菌培养物在重构后的细菌增殖，展现出所述至少一种第二细菌物种的至少10×、20×、100×、1,000×、10,000×或100,000×增加的细菌增殖。
[0014] 在另一个特定的实施方案中，在细菌增殖测定中，所述冷冻保存的细菌培养物在重构后，相对于大体上由所述至少一种第二细菌物种构成的冷冻保存的细菌培养物在重构后的细菌增殖，展现出所述至少一种第二细菌物种的至少10×增加的细菌增殖。
[0016] 在另一个特定的实施方案中，所述第一细菌物种的足以对所述细菌混合物中的所述至少一种第二细菌物种赋予冷冻保护的量在所述细菌混合物中细菌总量的10％与50％之间。
[0017] 在另一个特定的实施方案中，所述细菌混合物中所述第一细菌物种与所述至少一种第二细菌物种的比率是至少1:10。
[0018] 在另一个特定的实施方案中，所述细菌增殖测定是细菌平板接种(plating)测定。在更特定的实施方案中，所述细菌平板接种测定测量每mL的菌落形成单位(cfu/mL)。
[0019] 在又另一个特定的实施方案中，所述至少一种第二细菌物种是冷冻保护不应的(refractive)。
[0020] 在另外的特定实施方案中，所述至少一种第二细菌物种源自哺乳动物粪便。在更特定的实施方案中，所述至少一种第二细菌物种源自人粪便。在再更特定的实施方案中，所述至少一种第二细菌物种是以下中的至少一种：陪伴粪球菌(Coprococcus comes)、产甲酸多尔氏菌(Dorea formicigenerans)、扭曲真杆菌(Eubacterium contortum)、酸奶瘤胃球菌(Ruminococcus lactaris)、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)、普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)、挑剔真杆菌(Eubacterium eligens)、扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)、肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburia intestinalis)、哈氏厌氧棒状菌(Anaerostipes hadrus)、鲁提布劳特氏菌(Blautia luti)、卵瘤胃球菌(Ruminococcus obeum)、粪便布劳特氏菌(Blautia stercoris)、长链多尔氏菌(Dorea longicatena)、螺状梭菌(Clostridium spiroforme)、链状真杆菌(Eubacterium desmolans)、耐氧梭菌(Clostridium aerotolerans)、乳酸发酵梭菌(Clostridium lactatifermentans)、霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)、海氏梭菌(Clostridium hylemonae)、食葡糖罗斯拜瑞氏菌(Roseburia inulinivorans)、人罗斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)和粪便罗斯拜瑞氏菌(Roseburia faecis)。
[0021] 在另一个实施方案中，所述冷冻保存包括冻结和冻干。
[0022] 在又另一个实施方案中，所述重构包括使用重构介质以所述冷冻保存的细菌培养物与所述重构介质1:1的比率稀释所述冷冻保存的细菌培养物。在更特定的实施方案中，所述冷冻保存的细菌培养物包含冻干保护剂介质。在再更特定的实施方案中，所述冻干保护剂介质包含蔗糖、Ficoll 70和聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。在另一个特定的实施方案中，所述冷冻保存的细菌培养物包含核黄素、半胱氨酸和菊粉中的至少一种。在另一个特定的实施方案中，所述冷冻保存的细菌培养物包含冷冻保护剂介质。在更特定的实施方案中，所述冷冻保护剂介质包含甘油、聚乙二醇(PEG)和二甲基亚砜(DMSO)中的至少一种。
[0023] 在另一个实施方案中，所述足以对所述培养的细菌混合物中的所述至少一种第二细菌物种赋予所述冷冻保护的时间段是至少30分钟或至少一个小时。在更特定的实施方案中，所述足以对所述培养的细菌混合物中的所述至少一种第二细菌物种赋予所述冷冻保护的时间段的范围是30分钟至2小时或1至2小时。
[0024] 在另一个特定的实施方案中，所述第一细菌物种是活的。
[0025] 在又另一个特定的实施方案中，所述方法在厌氧条件下执行。
[0026] 另一方面，提出了一种在冷冻保存后改进细菌活力的方法，其包括：
[0027] a)将第一细菌物种与至少一种第二细菌物种组合以产生细菌混合物，其中所述第一细菌物种是肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌，其中所述第一细菌物种以足以对所述至少一种第二细菌物种赋予冷冻保护的量存在于所述细菌混合物中；
[0028] b)培养所述细菌混合物以产生培养的细菌混合物，其中所述培养持续足以对所述培养的细菌混合物中的所述至少一种第二细菌物种赋予所述冷冻保护的时间段；和[0029] c)冷冻保存所述培养的细菌混合物以产生冷冻保存的细菌培养物；其中在细菌增殖测定中，所述冷冻保存的细菌培养物在重构后，相对于包含所述至少一种第二细菌物种且不含所述第一细菌物种的冷冻保存的细菌培养物在重构后的细菌增殖，展现出所述至少一种第二细菌物种的至少10×增加的细菌增殖。
[0030] 在特定的实施方案中，在细菌增殖测定中，所述冷冻保存的细菌培养物在重构后，相对于包含所述至少一种第二细菌物种且不含所述第一细菌物种的冷冻保存的细菌培养物在重构后的细菌增殖，展现出所述至少一种第二细菌物种的至少10×、20×、100×、1,000×、10,000×或100,000×增加的细菌增殖。
[0031] 在另一个特定的实施方案中，在细菌增殖测定中，所述冷冻保存的细菌培养物在重构后，相对于大体上由所述至少一种第二细菌物种构成的冷冻保存的细菌培养物在重构后的细菌增殖，展现出所述至少一种第二细菌物种的至少10×增加的细菌增殖。
[0032] 在另一个特定的实施方案中，所述第一细菌物种的足以对所述细菌混合物中的所述至少一种第二细菌物种赋予冷冻保护的量在所述细菌混合物中细菌总量的10％与50％之间。
[0033] 在另一个特定的实施方案中，所述细菌混合物中所述第一细菌物种与所述至少一种第二细菌物种的比率是至少1:10。
[0034] 在另一个特定的实施方案中，所述细菌增殖测定是细菌平板接种测定。在更特定的实施方案中，所述细菌平板接种测定测量每mL的菌落形成单位(cfu/mL)。
[0035] 在又另一个特定的实施方案中，所述至少一种第二细菌物种是冷冻保护不应的。
[0036] 在另外的特定实施方案中，所述至少一种第二细菌物种源自哺乳动物粪便。在更特定的实施方案中，所述至少一种第二细菌物种源自人粪便。在再更特定的实施方案中，所述至少一种第二细菌物种是以下中的至少一种：陪伴粪球菌、产甲酸多尔氏菌、扭曲真杆菌、酸奶瘤胃球菌、直肠真杆菌、普氏栖粪杆菌、挑剔真杆菌、扭链瘤胃球菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、哈氏厌氧棒状菌、鲁提布劳特氏菌、卵瘤胃球菌、粪便布劳特氏菌、长链多尔氏菌、螺状梭菌、链状真杆菌、耐氧梭菌、乳酸发酵梭菌、霍氏真杆菌、海氏梭菌、食葡糖罗斯拜瑞氏菌、人罗斯拜瑞氏菌和粪便罗斯拜瑞氏菌。
[0037] 在另一个实施方案中，所述冷冻保存包括冻结和冻干。
[0038] 在又另一个实施方案中，所述重构包括使用重构介质以所述冷冻保存的细菌培养物与所述重构介质1:1的比率稀释所述冷冻保存的细菌培养物。在更特定的实施方案中，所述冷冻保存的细菌培养物包含冻干保护剂介质。在再更特定的实施方案中，所述冻干保护剂介质包含蔗糖、Ficoll 70和聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。在另一个特定的实施方案中，所述冷冻保存的细菌培养物包含核黄素、半胱氨酸和菊粉中的至少一种。在另一个特定的实施方案中，所述冷冻保存的细菌培养物包含冷冻保护剂介质。在更特定的实施方案中，所述冷冻保护剂介质包含甘油、聚乙二醇(PEG)和二甲基亚砜(DMSO)中的至少一种。
[0039] 在另一个实施方案中，所述足以对所述培养的细菌混合物中的所述至少一种第二细菌物种赋予所述冷冻保护的时间段是至少30分钟或至少一个小时。在更特定的实施方案中，所述足以对所述培养的细菌混合物中的所述至少一种第二细菌物种赋予所述冷冻保护的时间段的范围是30分钟至2小时或1至2小时。
[0040] 在另一个特定的实施方案中，所述第一细菌物种是活的。
[0041] 在又另一个特定的实施方案中，所述方法在厌氧条件下执行。
[0042] 另一方面，提出了一种用于冷冻保存制剂的氨基酸球菌属物种，其中所述氨基酸球菌属物种改进与其一起存在于所述冷冻保存制剂中的其他细菌物种在重构后的细菌活力。
[0043] 另一方面，提出了一种包含冷冻保存制剂的组合物，所述组合物包含：
[0044] 细菌物种在人造冷冻保存介质中的混合物，所述混合物包含
[0045] a)第一细菌物种，其中所述第一细菌物种是肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌；和[0046] b)至少一种第二细菌物种，
[0047] 其中所述第一细菌物种以足以在重构所述人造冷冻保存制剂时对所述至少一种第二细菌物种赋予冷冻保护的量存在于所述冷冻保存制剂中，并且
[0048] 其中在细菌增殖测定中，所述人造冷冻保存制剂在重构后，相对于包含所述至少一种第二细菌物种且不含所述第一细菌物种的人造冷冻保存制剂在重构后的细菌增殖，展现出所述至少一种第二细菌物种的至少10×增加的细菌增殖。
[0049] 在所述组合物的实施方案中，在细菌增殖测定中，所述冷冻保存的细菌培养物在重构后，相对于大体上由所述至少一种第二细菌物种构成的冷冻保存的细菌培养物在重构后的细菌增殖，展现出所述至少一种第二细菌物种的至少10×增加的细菌增殖。
[0050] 在所述组合物的另一个实施方案中，所述第一细菌物种的足以对所述细菌混合物中的所述至少一种第二细菌物种赋予冷冻保护的量在所述人造冷冻保存制剂中细菌总量的10％与50％之间。
[0051] 在所述组合物的又另一个实施方案中，所述细菌增殖测定是细菌平板接种测定。在所述组合物的另外的实施方案中，所述细菌平板接种测定测量每mL的菌落形成单位(cfu/mL)。
[0052] 在所述组合物的另一个实施方案中，所述至少一种第二细菌物种是冷冻保护不应的。
[0053] 在所述组合物的另外的实施方案中，所述至少一种第二细菌物种源自哺乳动物粪便。在所述组合物的再另外的实施方案中，所述细菌物种源自人粪便。在所述组合物的更特定的实施方案中，所述至少一种第二细菌物种是以下中的至少一种：陪伴粪球菌、产甲酸多尔氏菌、扭曲真杆菌、酸奶瘤胃球菌、直肠真杆菌、普氏栖粪杆菌、挑剔真杆菌、扭链瘤胃球菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、哈氏厌氧棒状菌、鲁提布劳特氏菌、卵瘤胃球菌、粪便布劳特氏菌、长链多尔氏菌、螺状梭菌、链状真杆菌、耐氧梭菌、乳酸发酵梭菌、霍氏真杆菌、海氏梭菌、食葡糖罗斯拜瑞氏菌、人罗斯拜瑞氏菌和粪便罗斯拜瑞氏菌。
[0054] 在所述组合物的另一个实施方案中，所述人造冷冻保存介质包含冷冻保存剂。
[0055] 在所述组合物的又另一个实施方案中，所述重构包括使用重构介质以所述冷冻保存制剂与所述重构介质1:1的比率稀释所述冷冻保存制剂。
[0056] 在所述组合物的另外的实施方案中，所述人造冷冻保存介质包含冻干保护剂介质。在所述组合物的特定实施方案中，所述冻干保护剂介质包含蔗糖、Ficoll 70和聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。在所述组合物的另一个特定的实施方案中，所述人造冷冻保存介质包含核黄素、半胱氨酸和菊粉中的至少一种。在所述组合物的又另一个实施方案中，所述人造冷冻保存的细菌培养物包含冷冻保护剂介质。在所述组合物的更特定的实施方案中，所述冷冻保护剂介质包含甘油、聚乙二醇(PEG)和二甲基亚砜(DMSO)中的至少一种。
[0057] 在所述组合物的另一个实施方案中，所述第一细菌物种是活的。
[0058] 在所述组合物的另一个实施方案中，所述至少一种第二细菌物种以治疗有效量存在。
[0059] 在另一个实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂。
[0060] 另一方面，提出了一种包含冷冻保存制剂的药物组合物，所述药物组合物包含：
[0061] 细菌物种在人造冷冻保存介质中的混合物，所述混合物包含
[0062] a)第一细菌物种，其中所述第一细菌物种是肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌；和[0063] b)至少一种第二细菌物种，其中所述至少一种第二细菌物种以治疗有效量存在，并且
[0064] 其中所述第一细菌物种以足以在重构所述人造冷冻保存制剂时对所述至少一种第二细菌物种赋予冷冻保护的量存在于所述冷冻保存制剂中，并且
[0065] 其中在细菌增殖测定中，所述人造冷冻保存制剂在重构后，相对于包含所述至少一种第二细菌物种且不含所述第一细菌物种的人造冷冻保存制剂在重构后的细菌增殖，展现出所述至少一种第二细菌物种的至少10×增加的细菌增殖；和
[0066] 药学上可接受的赋形剂。
[0067] 另一方面，提出了一种用于改善患有胃肠疾病的受试者的胃肠疾病的症状的方法，所述方法包括给所述受试者施用包含冷冻保存制剂的药物组合物。在其实施方案中，所述胃肠疾病包括胃肠道生态失调、艰难梭菌(Clostridium difficile，Clostridioides difficile)感染和炎症性肠病、肠易激综合征和憩室病中的至少一种。在其更多实施方案中，所述炎症性肠病是克罗恩病和溃疡性结肠炎中的至少一种。
[0068] 另一方面，提出了一种方法，其包括：
[0069] 获得第一细菌物种；
[0070] 其中所述第一细菌物种是肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌
[0071] 获得第二细菌物种；
[0072] 将足够量的所述第一细菌物种和足够量的所述第二细菌物种组合以产生细菌混合物；
[0073] 其中所述细菌混合物包含所述细菌混合物中细菌总量的10％与50％之间的肠氨基酸球菌，
[0074] 培养所述细菌混合物持续一个时间段以得到培养的混合物；和储存所述培养的混合物以得到冷冻保存的细菌培养物；
[0075] 其中，当重构所述冷冻保存的细菌培养物时，与大体上由所述第二细菌物种构成的重构的细菌储存物(stock)相比，重构的冷冻保存的细菌培养物具有以所述第二细菌物种的每mL的菌落形成单位(cfu/mL)测量的至少10×增加的细菌生长。
[0076] 在一些实施方案中，所述第二细菌物种源自哺乳动物粪便。在一些实施方案中，所述第二细菌物种源自人粪便。
[0077] 在一些实施方案中，所述方法还包括将制备的培养的混合物冻干。在一些实施方案中，所述方法还包括添加冻干保护剂介质。在一些实施方案中，所述方法还包括将制备的培养的混合物冻结。在一些实施方案中，所述方法还包括添加冷冻保护剂介质。
[0078] 在一些实施方案中，所述第二细菌物种包括：陪伴粪球菌、产甲酸多尔氏菌、扭曲真杆菌、酸奶瘤胃球菌、直肠真杆菌、普氏栖粪杆菌、挑剔真杆菌、扭链瘤胃球菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、哈氏厌氧棒状菌、鲁提布劳特氏菌、卵瘤胃球菌、粪便布劳特氏菌、长链多尔氏菌、螺状梭菌、链状真杆菌、耐氧梭菌、乳酸发酵梭菌、霍氏真杆菌、海氏梭菌、食葡糖罗斯拜瑞氏菌、人罗斯拜瑞氏菌、粪便罗斯拜瑞氏菌或其任何组合。
[0079] 在一些实施方案中，所述培养进行至少30分钟。在一些实施方案中，所述培养进行30分钟至2小时。在一些实施方案中，所述培养进行1小时至2小时。在一些实施方案中，所述培养进行至少1小时。
[0080] 在一些实施方案中，肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌是活的。
[0081] 在一些实施方案中，所述储存包括添加核黄素、半胱氨酸、菊粉或其任何组合的溶液。
[0082] 在一些实施方案中，所述细菌混合物包含所述细菌混合物中细菌总量的10％至50％之间的肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌。
[0083] 在一些实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含：
[0084] 储存的细菌混合物，所述储存的细菌混合物包含：
[0085] 足够量的第一细菌物种；
[0086] 其中所述第一细菌物种是肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌；
[0087] 足够量的第二细菌物种；
[0088] 其中，当重构所述储存的细菌混合物时，与大体上由所述第二细菌物种构成的重构的细菌储存物相比，重构的储存的细菌混合物具有以每mL的菌落形成单位(cfu/mL)测量的至少10×增加的细菌生长。
[0089] 在一些实施方案中，第二细菌物种包括：陪伴粪球菌、产甲酸多尔氏菌、扭曲真杆菌、酸奶瘤胃球菌、直肠真杆菌、普氏栖粪杆菌、挑剔真杆菌、扭链瘤胃球菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、哈氏厌氧棒状菌、鲁提布劳特氏菌、卵瘤胃球菌、粪便布劳特氏菌、长链多尔氏菌、螺状梭菌、链状真杆菌、耐氧梭菌、乳酸发酵梭菌、霍氏真杆菌、海氏梭菌、食葡糖罗斯拜瑞氏菌、人罗斯拜瑞氏菌、粪便罗斯拜瑞氏菌或其任何组合。
[0090] 在一些实施方案中，肠氨基酸球菌是活的。在一些实施方案中，所述第二细菌物种是活的。
具体实施方式
[0091] 为了阐明公开内容，而不是为了限制，本发明的详细描述分为以下小节，其描述或说明了本发明的某些特征、实施方案或应用。
[0092] 在暴露于冻结和冻干条件后，若干源自人粪便的微生物不生长或显示显著减少的生长。当与肠氨基酸球菌(14 LG)(“A.intestini”)或发酵氨基酸球菌(DSM 20731)(“A.fermentans”)共培养时，这些微生物在冻结和冻干条件后显示增加的生长和生存力。不受理论的束缚，肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌的保护性质背后的机制可能主要是由于微生物之间发生的物理相互作用，而不是微生物代谢物或微生物剂(microbial agent)和其作用。
[0093] 氨基酸球菌属是厚壁菌门(细菌)(phylum of Firmicutes)中的一个属。氨基酸球菌属包含两个物种：肠氨基酸球菌和发酵氨基酸球菌。这些物种是厌氧双球菌，可以使用氨基酸作为唯一的生长能量来源。它们是革兰氏阴性的。它们与通过全物种生命树(All Species Living Tree)(基于16S rRNA的系统发生树)确定的氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)密切相关。
[0094] 值得注意的是，特别是发酵氨基酸球菌在人群体中不常见。
[0095] 定义
[0096] 除非内容另有明确规定，否则如本文所使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式。在根据马库什基团或其他分组替代方案描述多个方面或实施方案的情况下，本领域技术人员将认识到也由此根据分组中的任何单独成员或多个成员的亚组描述本发明。
[0098] 如本文所使用的，术语“大体上由……构成”指的是所陈述的特征、步骤或组分，并且还可以包括另外的要素，但是前提是那些另外的要素不实质上影响所陈述的特征、步骤或组分的基本特性。
[0099] 如本文所使用的，术语“培养”指的是通过允许微生物在受控的实验室条件下在预定的培养基中繁殖来增加微生物的方法。在一些实施方案中，使用图1A和1B中所示的设备生成培养基并且使用在美国公开申请号20140363397或美国公开申请号20140342438中描述的方法。
[0100] 如本文所使用的，术语“冻干”指的是这样的过程，其中首先冻结组合物，并且然后在仍处于冻结状态时进行升华和解吸，以减少组合物中大部分的水和溶剂，该过程旨在限制指定储存温度下的生物和化学反应以用于短期、中期或长期保存。
[0101] 如本文所使用的，术语“无稀释物(neat dilution)”指的是未稀释的培养物，其通常在培养中被平板接种或生长。
[0102] 如本文所使用的，术语“重构”指的是使冻结和/或干燥的微生物复苏的方法，所述方法包含在合适的重构介质中稀释以产生活的微生物的重构的组合物。示例性的重构介质包括但不限于1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)或保存活力的类似的生理盐溶液、适合经历重构的细菌的细菌培养基。其他重构介质包括补充有血红素和甲萘醌的胰酶大豆肉汤、脑心浸液肉汤、Wilkins-Chalgren肉汤和苛养厌氧菌肉汤。
[0103] 当数值前带有术语“约”时，术语“约”旨在指示+/-10％。
[0104] 如本文所使用的，“厌氧细菌”指的是兼性厌氧细菌和严格厌氧细菌。
[0105] 如本文所使用的，“标准培养基”指的是用于微生物的普通和/或可商购的生长培养基，例如营养肉汤和琼脂平板，其许多变型是本领域已知的。标准培养基通常至少包含用于细菌生长的碳源，例如糖比如葡萄糖；细菌生长所需的各种盐，例如镁、氮、磷和/或硫；和水。标准培养基的非限制性实例包括Luris Bertani(LB)培养基、Al肉汤和本文所述的培养基。在本文提供的方法中使用的标准培养基将由熟练技术人员根据公知常识进行选择。术语“标准培养基”和“标准实验室培养基”在本文可互换使用。
[0106] 如本文所使用的，术语“纯分离株”、“单一分离株”和“分离株”可互换使用，指的是包含单一细菌物种或菌株(在从其他细菌物种或菌株中分离出来时)的培养物，例如无异菌(axenically)生长的培养物。
[0107] 对于本文表格中列出的菌株，通过以下方式确定最接近的细菌物种：使用16S rRNA全长序列，将其与NAST服务器进行比对，并且然后使用GreenGenes分类服务器进行分类。
[0108] 收集粪便和处理来自其的细菌
[0109] 要求供体在实验室附近的私人卫生间将粪便排入提供的无菌罐中。立即将罐运送到实验室并且在排泄5分钟内将其放入厌氧容器中。应当注意，一些分离株，特别是罗斯拜瑞氏菌属某些物种(Roseburia spp.)，对氧气极度敏感，并且因此，使排泄的样品甚至在短期(5分钟)免于暴露于氧气是至关重要的。
[0110] 一旦进入厌氧培养室，将10g粪便样品称重到50mL无菌的预还原的盐水中，并且放入无菌的匀质袋(stomacher bag)中，其被放入匀质仪器(stomacher instrument)中并且拍击2分钟以使样品匀浆化。然后将匀浆放入无菌离心管中并且低速旋转以沉淀大颗粒，从而产生经处理的大体上不含大颗粒沉淀物的样品。
[0111] 然后可以如下进行两轮微生物分离：在无菌的预还原的盐水中制备匀浆上清液的一系列稀释物。将100uL的各种稀释物分别平板接种到一式四份的制备好的琼脂培养基上，所述琼脂培养基如下：
[0113] 无血液补充的苛养厌氧菌琼脂；
[0114] 苛养厌氧菌琼脂+5％去纤维蛋白的绵羊血+3％“液体黄金(liquid gold)”(如下所述)；
[0115] 苛养厌氧菌琼脂+3％液体黄金；
[0116] deMan-Rogosa-Sharpe(MRS)培养基(购自英国汉普郡的Oxoid Limited)，使乳杆菌属某些物种(Lactobacillus spp.)和双歧杆菌属某些物种(Bifidobacterium spp.)富足；
[0117] 内部配制的粘蛋白琼脂(将粘蛋白作为唯一碳源的基本培养基；使用它是因为已知人肠道微生物菌群的一些细菌物种利用粘蛋白作为碳源)；和
[0118] LS琼脂，其是补充有取自LS174 T细胞(分泌粘蛋白的人结肠细胞系；可从ATCC获得)汇合培养物的3％v/v经消耗的(spent)细胞培养物上清液的琼脂。
[0119] 微生物的选择还可以任选地包括筛选步骤以鉴定形成孢子的微生物。这种筛选通常是通过使微生物群体经受乙醇冲击来进行的。为此，将微生物的匀浆样品暴露于100％乙醇持续20分钟至1小时，然后将微生物离心沉淀并使用PBS洗涤两次，并且然后如下所述进行平板接种。这是对一些匀浆样品执行的额外步骤。它选择形成孢子的微生物，因为内生孢子对乙醇有抵抗力，而活跃生长的细胞则没有抵抗力。
[0120] 可以由以下制备细胞培养基：1个包装的极限必需培养基(Gibco#41500-034)；2.2g碳酸氢钠(Sigma)；4.766g HEPES缓冲液(Sigma)；10mL 100mM丙酮酸钠溶液；10％(v/v)热灭活的胎牛血清(Gibco)(在56℃下30min)，双蒸馏水补至1升并通过0.22μm孔径的过滤器(Millipore)进行过滤器灭菌。经消耗的细胞培养基是从在37℃下在5％CO2中培养5天的LS174T细胞的上清液中取得并通过0.22μm孔径的过滤器过滤以去除宿主细胞的培养基。
使用这种培养基是因为一些细菌分离株可能需要人细胞信号以便在体外增殖和生长。
使用这种培养基是因为一些细菌分离株可能需要人细胞信号以便在体外增殖和生长。
[0121] 通常将平板在潮湿的厌氧菌培养室(来自英国，Bridegend，Ruskinn的Bug Box)中孵育2周，并且每几天检查其生长情况。将分离的菌落挑取到新的平板，并使其生长相同的时间，以确保获得纯的培养物；去除生长的任何第二种或第三种菌落类型。在特定的实施方案中，可以将培养物小心地冷冻保存在包含乳-甘油-二甲基亚砜混合物的冻结介质中，所述混合物被设计用于保存厌氧菌，其中含有60g Carnation脱脂乳粉(Zehr's)、5mL DMSO(Sigma)和5mL甘油(Sigma)，并且使用双蒸馏的H2O使总体积达到500mL。
[0122] 一旦分离出菌株，则如上所述通过在每种不同的培养基类型上培养每种分离物并确定哪种培养基产生最佳的生长，进而凭经验确定最佳的生长条件。重要的是要注意将菌株始终保持在厌氧环境中。它们从未在厌氧环境之外使用，例如，本发明的发明人从未在开放的工作台上使用所述活的细菌，并且所述微生物始终保持尽可能健康。
[0123] 对于第二轮表征，可以在体外使用恒化器来首先稳定整个微生物群落。约1个月后达到稳态(平衡)，然后使用上述稀释和平板接种方法尝试分离另外的微生物。恒化器用于有效地进行对群落进行取样和培养，并且还富集一些可能在原始粪便样品中仅少量存在的肠道微生物。这些生物体例如可以是与粘膜紧密相关并且与结肠中的死细胞一起“脱落”的微生物。恒化器环境使这些病菌(bug)中的一些可以有效存活并增殖，从而增加了它们的数量，因此可以如上所述对它们进行平板培养。
[0124] 术语“培养的”和“生长的”在本文有时可互换使用。
[0125] 单级恒化器和接种
[0126] 下面给出了从人远端肠道(distal gut)分离细菌的示例性方案。本发明的发明人开发了单级恒化器容器以通过修改如美国公开申请号20140342438中描述的并联发酵罐(Multifors)发酵系统(Infors，瑞士)来为人远端肠道微生物群建模。通过阻塞冷凝器并使氮气鼓泡通过培养物，可以实现从发酵系统到恒化器的转化。压力的增加迫使废物以设定的高度从金属管(以前是采样管)排出，并允许维持400mL的工作体积。
[0127] 在整个实验过程中，通过向培养物中鼓入过滤的氮气(Praxair)使容器保持厌氧。温度(37℃)和pH(设定为7.0；在培养物中通常在6.9至7左右波动)由计算机操作系统自动控制和维持。系统使用5％(v/v)HCl(Sigma)和5％(w/v)NaOH(Sigma)维持培养物的pH。将生长培养基以400mL/天(16.7mL/小时)的速率连续进料至容器以得到24小时保留时间，该值被设定为模拟远端肠道的停留时间的值。还测试了65小时的另一个保留时间(-148mL/天，
6.2mL/小时)以确定保留时间对恒化器群落组成的影响。
6.2mL/小时)以确定保留时间对恒化器群落组成的影响。
[0128] 由于生长培养基含有无法承受高压灭菌法灭菌的组分，因此使用400mL ddH2O对容器进行高压灭菌。在高压灭菌过程中，调整排废管以使金属管到达容器的底部。一旦容器冷却，将其安装到计算机操作单元的其余部分，将过滤的氮气鼓泡通过水以加压和排空容器。然后将排废管升至工作体积(400mL)并且将300mL无菌培养基泵入容器。然后将容器搅拌、加热并脱气过夜。为了检查容器中的污染，对每个容器进行无菌采样，并平板接种于(有氧和厌氧)补充有5％去纤维蛋白的绵羊血的苛养厌氧菌琼脂(FAA)上。在接种前一天和在接种前重复此过程，以确保避免污染。
[0129] 粪便接种物的收集和制备
[0130] 可以从各种人供体分离新鲜的粪便样品，人供体的范围从健康女性或男性供体(例如在提供粪便前10年没有抗生素使用史)至患有已知障碍/疾病的个体。已经获得粪便收集和用于这些实验的研究伦理委员会(REB)批准。
[0131] 为了制备接种物，收集新鲜排泄的粪便样品并立即置于厌氧培养室中(在90％N2、5％CO2和5％H2的气氛中)。通过使用匀质器(Seward制造的Tekmar Stomacher Lab Blender)将5g新鲜粪便在50mL的厌氧磷酸盐缓冲盐水(PBS)中浸软1分钟来立即制备10％(w/v)的粪便浆料。将得到的粪便浆料以1500rpm离心10分钟以去除大量的食物残渣。所得的上清液可以用作接种物。
[0132] 接种过程
[0133] 为了得到400mL的最终工作体积，将100mL的例如10％接种物添加到每个容器中的300mL无菌培养基中。接种后立即开始pH控制以将容器的pH调节并保持在约6.9至7.0的pH。
在接种后的前24小时期间，使群落以分批培养的方式生长，以使群落能够从体内条件适应体外条件，并避免培养物被冲洗掉。在此时期期间，将容器加热、脱气并搅拌，同时连续调节pH。在此24小时时期之后，打开进料泵并且使容器作为恒化器运行。连续添加新鲜培养基并连续去除废物。
在接种后的前24小时期间，使群落以分批培养的方式生长，以使群落能够从体内条件适应体外条件，并避免培养物被冲洗掉。在此时期期间，将容器加热、脱气并搅拌，同时连续调节pH。在此24小时时期之后，打开进料泵并且使容器作为恒化器运行。连续添加新鲜培养基并连续去除废物。
[0134] 在恒化器中，培养条件和培养基供应保持恒定。通常将恒化器系统的保留时间设置为24小时以模拟远端肠道输送时间。
[0135] 生长培养基的制备
[0136] 可以按以下步骤制备培养基(2L)：
[0137] 混合物1：
[0138] 将以下试剂溶解在1800mL蒸馏水(ddH2O)中：蛋白胨水4g(Oxoid Limited)；酵母提取物4g(Oxoid Limited)；NaHCO3，4g(Sigma)；CaCl2，0.02g(Sigma)；果胶(来自柑橘属)，4g(Sigma)；木聚糖(来自山毛榉材)，4g(Sigma)；阿拉伯半乳聚糖，4g(Sigma)；淀粉(来自小麦，未改性)，10g(Sigma)；酪蛋白，6g(Sigma)；菊粉(来自大丽花块茎)，2g(Sigma)；NaCl，
0.2g(Sigma)。添加水(ddH2O)到1900mL，这是因为高压灭菌后体积减少到1800mL。通过在
121℃下高压灭菌60min而将混合物灭菌并使其冷却过夜。
0.2g(Sigma)。添加水(ddH2O)到1900mL，这是因为高压灭菌后体积减少到1800mL。通过在
121℃下高压灭菌60min而将混合物灭菌并使其冷却过夜。
[0139] 混合物2：
[0140] 将以下试剂(全部从Sigma购买)溶解在100mL蒸馏水中(混合物2A)：K2HPO4，0.08g；KH2PO4，0.08g；MgSO4，0.02g；血红素，0.01g；甲萘醌，0.002g。将胆汁盐(1g)溶于50mL蒸馏水中(混合物2B)。还将L-半胱氨酸HCl(1g)溶于50mL蒸馏水中(混合物2C)。在混合物2B和2C溶解后，将它们添加到混合物2A中，导致形成细的白色沉淀物。然后通过逐滴添加6M KOH使此沉淀物溶解，直到形成澄清的棕色溶液(混合物2)。将此混合物(总体积为200mL)通过0.22μm过滤器过滤灭菌。
[0141] 培养基(“培养基1”)：将混合物2(0.2L)无菌添加到混合物1(1.8L)中，以使最终体积达到2L。为了防止将来起泡，将5mL消泡剂B硅酮乳液(J.T.Baker)无菌添加到每2L培养基瓶中。将培养基储存在4℃直到使用，储存最多两周。在添加到恒化器的前一天和从恒化器中取出后立即将少量培养基平板接种于FAA上(有氧和厌氧)，以检查是否有污染。
[0142] 使用蠕动泵将培养基泵入每个容器，蠕动泵的速度由计算机操作系统控制。为了将培养基从瓶泵入容器，在标准的GL-45玻璃瓶盖(VWR)上钻孔，以适配两个不锈钢金属管。制备混合物1时，培养基瓶已经附接了所有必需的硅胶管道和0.22μm的过滤器。
[0143] 从具有2L体积培养基的一个培养基瓶进料到每个容器。由于在更换每个培养基瓶时也会更换向容器提供培养基的管道，因此这有助于防止细菌从容器生长回到无菌培养基储器中。在将每个瓶添加到恒化器中之前和从恒化器中取出每个瓶之后，将每个培养基瓶平板接种于补充的FAA上，并进行有氧和厌氧生长。
[0144] 如本文所使用的，术语“冷冻保存剂”指的是减少或防止冰晶形成和/或保护细菌细胞免于溶质浓度增加(由于冰的形成所致)的试剂。常见的冷冻保护剂包括二甲基亚砜、脱脂乳和复合糖。
[0145] 如本文所使用的，术语“冷冻保护不应的”或“对冷冻保护敏感的”指的是生物体即使在存在冷冻保护剂的情况下仍足够脆弱以致于它们在冻结过程中遭受相当大的损害，从而阻碍其在冻结条件下存活。
[0146] 如本文所使用的，术语“冷冻保护”指的是使用超冷温度(<70℃)来冻结微生物细胞并使它们保持暂停生命的状态。
[0147] 如本文所使用的，术语“细菌增殖测定”指的是用于在冷冻保存之前和之后测定微生物活力的一种或多种方法。在冷冻保存之前和之后，使用稀释系列和在琼脂上的直接平板计数，或通过对活细胞与死细胞进行特异性染色(例如使用碘化丙啶)进行的流式细胞术，对细胞生长进行定量。
[0148] 如本文所使用的，术语“冷冻保存”指的是冻结微生物培养物以在保存期间保持尽可能多的活力的行为。
[0149] 如本文所使用的，术语“冷冻保存的细菌培养物”指的是已经使用冷冻保护剂处理并在最佳温度(<70℃)下储存的细菌细胞。
[0150] 储存细菌的方法
[0151] 在一些实施方案中，本发明提供了一种方法，其包括：
[0152] 获得第一细菌物种；
[0153] 其中所述第一细菌物种是氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)，
[0154] 获得第二细菌物种；
[0155] 将足够量的所述第一细菌物种和足够量的所述第二细菌物种组合以产生细菌混合物；
[0156] 其中所述细菌混合物包含所述细菌混合物中细菌总量的10％与50％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)，培养所述细菌混合物持续一个时间段以得到培养的混合物；和[0157] 储存所述培养的混合物以得到冷冻保存的细菌培养物；
[0158] 其中，当重构所述冷冻保存的细菌培养物时，与大体上由所述第二细菌物种构成的重构的细菌储存物相比，重构的冷冻保存的细菌培养物具有以所述第二细菌物种的每mL的菌落形成单位(cfu/mL)测量的至少10×增加的细菌生长。
[0159] 在一些实施方案中，所述第二细菌物种源自哺乳动物粪便。在一些实施方案中，所述第二细菌物种源自人粪便。
[0160] 在一些实施方案中，所述方法还包括将制备的培养混合物冻干。在一些实施方案中，所述方法还包括添加冻干保护剂介质。在一些实施方案中，所述方法还包括冻结制备的培养混合物。在一些实施方案中，所述方法还包括添加冷冻保护剂介质。
[0161] 在一些实施方案中，所述第二细菌物种包括：陪伴粪球菌、产甲酸多尔氏菌、扭曲真杆菌、酸奶瘤胃球菌、直肠真杆菌、普氏栖粪杆菌、挑剔真杆菌、扭链瘤胃球菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、哈氏厌氧棒状菌、鲁提布劳特氏菌、卵瘤胃球菌、粪便布劳特氏菌、长链多尔氏菌、螺状梭菌、链状真杆菌、耐氧梭菌、乳酸发酵梭菌、霍氏真杆菌、海氏梭菌、食葡糖罗斯拜瑞氏菌、人罗斯拜瑞氏菌、粪便罗斯拜瑞氏菌或其任何组合。
[0162] 在一些实施方案中，所述培养进行至少30分钟。在一些实施方案中，所述培养进行30分钟至2小时。在一些实施方案中，所述培养进行1小时至2小时。在一些实施方案中，所述培养进行至少1小时。
[0163] 在一些实施方案中，所述氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)是活的。
[0164] 在一些实施方案中，所述储存包括添加核黄素、半胱氨酸、菊粉或其任何组合的溶液。
[0165] 在一些实施方案中，所述细菌混合物包含所述细菌混合物中细菌总量的10％与50％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。
[0166] 获得第一细菌物种
[0167] 在一些实施方案中，所述氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)是活的。
[0168] 在一些实施方案中，所述肠氨基酸球菌包括肠氨基酸球菌(14LG)、肠氨基酸球菌(GAM7)、肠氨基酸球菌(CC1/6 D9)或其任何组合。在一些实施方案中，所述肠氨基酸球菌包括肠氨基酸球菌(RyC-MR95)、肠氨基酸球菌(DNF00404)、肠氨基酸球菌(ADV 255.99)、肠氨基酸球菌(DSM 21505)或其任何组合。
[0169] 在一些实施方案中，所述发酵氨基酸球菌包括发酵氨基酸球菌(DSM 20731)、罗戈沙型(Rogosa)发酵氨基酸球菌(VR4；可从 25085TM购买获得)、发酵氨基酸球菌(RYC4093)、发酵氨基酸球菌(RYC4356)、发酵氨基酸球菌(RYC-MR95)或其任何组合。
[0170] 在一些实施方案中，所述氨基酸球菌科类型物种是运动琥珀酸螺菌(DSM 6222；可从 700845TM购买获得)、运动琥珀酸螺菌(DSM 6222T)或其任何组合。
[0171] 在一些实施方案中，所述氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)源自哺乳动物粪便。在一些实施方案中，所述氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)源自人粪便。在一些实施方案中，所述氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)源自健康患者。在一些实施方案中，，所述氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)源自根据美国专利申请号20140342438中披露的方法的健康患者，将所述专利申请通过引用以其整体并入本文。
[0172] 在一些实施方案中，所述氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)源自患有胃肠疾病的患者。在一些实施方案中，从根据美国专利申请号20140342438中披露的方法的患有胃肠疾病的患者中获得所述氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，从根据美国专利申请号20140363397中披露的方法的患有胃肠疾病的患者中获得所述氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)，将所述专利申请通过引用以其整体并入本文。
[0173] 在一些实施方案中，所述胃肠疾病包括生态失调、艰难梭菌感染、炎症性肠病(克罗恩病和溃疡性结肠炎)、肠易激综合征和/或憩室病。
[0174] 获得第二细菌物种
[0175] 在一些实施方案中，至少一种第二细菌物种源自哺乳动物粪便。在一些实施方案中，至少一种第二细菌物种源自人粪便。在一些实施方案中，至少一种第二细菌物种源自健康患者。在一些实施方案中，至少一种第二细菌物种源自根据美国专利申请号20140342438中披露的方法的健康患者。
[0176] 在一些实施方案中，至少一种第二细菌物种包括：陪伴粪球菌、产甲酸多尔氏菌、扭曲真杆菌、酸奶瘤胃球菌、直肠真杆菌、普氏栖粪杆菌、挑剔真杆菌、扭链瘤胃球菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、哈氏厌氧棒状菌、鲁提布劳特氏菌、卵瘤胃球菌、粪便布劳特氏菌、长链多尔氏菌、螺状梭菌、链状真杆菌、耐氧梭菌、乳酸发酵梭菌、霍氏真杆菌、海氏梭菌、食葡糖罗斯拜瑞氏菌、人罗斯拜瑞氏菌、粪便罗斯拜瑞氏菌或其任何组合。
[0177] 在一些实施方案中，至少一种第二细菌物种源自患有胃肠疾病的患者。在一些实施方案中，从根据美国专利申请号20140342438中披露的方法的患有胃肠疾病的患者获得至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，从根据美国专利申请号20140363397中披露的方法的患有胃肠疾病的患者获得至少一种第二细菌物种。
[0178] 产生细菌混合物
[0179] 在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的0.1％与99.9％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的1％与99.9％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的10％与99.9％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的20％与99.9％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的30％与99.9％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的40％与
99.9％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的50％与99.9％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的60％与99.9％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的70％与99.9％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的80％与99.9％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的90％与
99.9％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。
99.9％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的50％与99.9％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的60％与99.9％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的70％与99.9％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的80％与99.9％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的90％与
99.9％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。
[0180] 在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的0.1％与90％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的0.1％与80％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的0.1％与70％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的0.1％与60％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的0.1％与50％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的0.1％与40％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的0.1％与30％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的0.1％与20％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的0.1％与10％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。
[0181] 在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的10％与90％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的10％与80％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的10％与70％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的10％与60％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的10％与50％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的10％与40％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的10％与30％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的10％与20％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。
[0182] 在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的20％与90％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的30％与90％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的40％与90％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的50％与90％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的60％与90％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的70％与90％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的80％与90％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。
[0183] 在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的30％与80％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的40％与70％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的50％与60％之间的氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)。
[0184] 在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的0.1％与99.9％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的1％与99.9％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总数的10％与99.9％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的20％与99.9％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的30％与
99.9％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的40％与99.9％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的50％与99.9％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的60％与99.9％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的70％与99.9％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的80％与99.9％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的90％与99.9％之间的至少一种第二细菌物种。
99.9％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的40％与99.9％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的50％与99.9％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的60％与99.9％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的70％与99.9％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的80％与99.9％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的90％与99.9％之间的至少一种第二细菌物种。
[0185] 在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的0.1％与90％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的0.1％与80％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的0.1％与70％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的0.1％与60％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的0.1％与50％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的0.1％与40％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的0.1％与30％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的0.1％与20％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的0.1％与10％之间的至少一种第二细菌物种。
[0186] 在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的10％与90％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的10％与80％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的10％与70％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的10％与60％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的10％与50％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的10％与40％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的10％与30％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的10％与20％之间的至少一种第二细菌物种。
[0187] 在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的20％与90％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的30％与90％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的40％与90％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的50％与90％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的60％与90％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的70％与90％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的80％与90％之间的至少一种第二细菌物种。
[0188] 在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的30％与80％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的40％与70％之间的至少一种第二细菌物种。在一些实施方案中，所述细菌混合物包含细菌混合物中细菌总量的50％与60％之间的至少一种第二细菌物种。
[0189] 在一些实施方案中，所述细菌混合物至少包含氨基酸球菌属物种(例如肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌)或氨基酸球菌科类型物种(例如运动琥珀酸螺菌)和第二细菌物种。在一些实施方案中，第二细菌物种包括：陪伴粪球菌、产甲酸多尔氏菌、扭曲真杆菌、酸奶瘤胃球菌、直肠真杆菌、普氏栖粪杆菌、挑剔真杆菌、扭链瘤胃球菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、哈氏厌氧棒状菌、鲁提布劳特氏菌、卵瘤胃球菌、粪便布劳特氏菌、长链多尔氏菌、螺状梭菌、链状真杆菌、耐氧梭菌、乳酸发酵梭菌、霍氏真杆菌、海氏梭菌、食葡糖罗斯拜瑞氏菌、人罗斯拜瑞氏菌、粪便罗斯拜瑞氏菌或其任何组合。
[0190] 培养细菌混合物
[0191] 在一些实施方案中，所述培养进行至少30分钟。在一些实施方案中，所述培养进行30分钟至2小时。在一些实施方案中，所述培养进行1小时至2小时。在一些实施方案中，所述培养进行至少1小时。
[0192] 在一些实施方案中，所述培养可以进行最多至48小时。在一些实施方案中，所述培养进行1小时至48小时。在一些实施方案中，所述培养可以进行最多至48小时。在一些实施方案中，所述培养进行2小时至48小时。在一些实施方案中，所述培养进行4小时至48小时。在一些实施方案中，所述培养进行8小时至48小时。在一些实施方案中，所述培养进行12小时至48小时。在一些实施方案中，所述培养进行24小时至48小时。在一些实施方案中，所述培养进行1小时至24小时。在一些实施方案中，所述培养进行1小时至12小时。在一些实施方案中，所述培养进行1小时至8小时。在一些实施方案中，所述培养进行1小时至4小时。
[0193] 在一些实施方案中，所述方法包括将所述细菌混合物培养一个时间段以得到培养的混合物。在一些实施方案中，使用美国专利申请号20140342438中披露的方法进行培养，将所述专利申请通过引用以其整体并入本文。
[0194] 冷冻保存的细菌培养物
[0195] 在一些实施方案中，所述冷冻保存的细菌培养物包含核黄素、半胱氨酸、菊粉或其任何组合。
[0196] 在一些实施方案中，所述冷冻保存的细菌培养物包含冻干保护剂介质。在一些实施方案中，所述冻干保护剂介质包括蔗糖、Ficoll 70、聚乙烯吡咯烷酮或其任何组合。
[0197] 在一些实施方案中，所述冷冻保存的细菌培养物包含冷冻保护剂介质。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂介质包括甘油、聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜(DMSO)或其任何组合。
[0198] 在一些实施方案中，冷冻保存培养的细菌混合物包括：向培养的细菌混合物中添加合适的冷冻保存组合物，并冻结包含培养的细菌混合物和合适的冷冻保存组合物的组合物以产生冻结的细菌冷冻保存组合物。在一些实施方案中，冻结是在或低于0摄氏度(℃)。在一些实施方案中，冻结是在或低于-20℃。在一些实施方案中，冻结是在或低于-60℃。在一些实施方案中，冻结是在或低于-80℃。
[0199] 在一些实施方案中，冻结是在或低于0摄氏度(℃)。在一些实施方案中，冻结是在或低于-20℃。在一些实施方案中，冻结是在或低于-60℃。在一些实施方案中，冻结是在或低于-80℃。在一些实施方案中，冻结是在-100℃至0℃。在一些实施方案中，冻结是在-80℃至0℃。在一些实施方案中，冻结是在-60℃至0℃。在一些实施方案中，冻结是在-40℃至0℃。在一些实施方案中，冻结是在-20℃至0℃。在一些实施方案中，冻结是在-100℃至-20℃。在一些实施方案中，冻结是在-100℃至-40℃。在一些实施方案中，冻结是在-100℃至-60℃。在一些实施方案中，冻结是在-100℃至-80℃。在一些实施方案中，冻结是在-80℃至-
20℃。在一些实施方案中，冻结是在-60℃至-40℃。
20℃。在一些实施方案中，冻结是在-60℃至-40℃。
[0200] 在一些实施方案中，冷冻保存培养的细菌混合物包括：向培养的细菌混合物中添加合适的冷冻保存组合物，冻结包含培养的细菌混合物和合适的冷冻保存组合物的组合物以产生冻结的细菌冷冻保存组合物，并将冻结的细菌冷冻保存组合物冻干以产生冷冻保存的细菌培养物。在一些实施方案中，冻干是使用本领域普通技术人员已知的通常使用的方法进行的。
[0201] 在一些实施方案中，保存培养的细菌混合物以产生保存的细菌培养物包括：向培养的细菌混合物中添加合适的保存组合物，并且冻干包含培养的细菌混合物和合适的保存组合物的组合物以产生脱水的保存的细菌培养物。在一些实施方案中，冻干是使用本领域普通技术人员已知的通常使用的方法进行的。
[0202] 重构冷冻保存的细菌培养物
[0203] 在一些实施方案中，可以使用本领域已知的用于冻结的或冻结并且冻干的(冷冻干燥的)培养物的方法来进行冷冻保存的细菌培养物的重构。作为非限制性的例子，为了重构冷冻干燥的培养物，可以使用合适体积的介质来使细菌物种再水化以用于划线(streaking)、在培养管中生长等。作为另外的非限制性例子，为了重构冻结的培养物，可以将冻结的培养物的一部分解冻并且用于接种平板、培养物等。在一些实施方案中，可以使用美国专利申请号20140342438中披露的方法生成所述介质。
[0204] 在一些实施方案中，当重构所述冷冻保存的细菌培养物时，与大体上由至少一种第二细菌物种构成的重构的细菌储存物相比，重构的冷冻保存的细菌培养物具有以至少一种第二细菌物种的菌落形成单位/毫升(cfu/mL)测量的至少10×增加的细菌生长。在一些实施方案中，当重构所述冷冻保存的细菌培养物时，与大体上由至少一种第二细菌物种构成的重构的细菌储存物相比，冷冻保存的细菌培养物具有以至少一种第二细菌物种的菌落形成单位/毫升(cfu/mL)测量的至少100×增加的细菌生长。在一些实施方案中，当重构所述冷冻保存的细菌培养物时，与大体上由至少一种第二细菌物种构成的重构的细菌储存物相比，重构的冷冻保存的细菌培养物具有以至少一种第二细菌物种的菌落形成单位/毫升(cfu/mL)测量的至少1,000×增加的细菌生长。在一些实施方案中，当重构所述冷冻保存的细菌培养物时，与大体上由至少一种第二细菌物种构成的重构的细菌储存物相比，重构的冷冻保存的细菌培养物具有以至少一种第二细菌物种的菌落形成单位/毫升(cfu/mL)测量的至少10,000×增加的细菌生长。在一些实施方案中，当重构所述冷冻保存的细菌培养物时，与大体上由至少一种第二细菌物种构成的重构的细菌储存物相比，重构的冷冻保存的细菌培养物具有以至少一种第二细菌物种的菌落形成单位/毫升(cfu/mL)测量的至少100,000×增加的细菌生长。在一些实施方案中，当重构所述冷冻保存的细菌培养物时，与大体上由至少一种第二细菌物种构成的重构的细菌储存物相比，重构的冷冻保存的细菌培养物具有以至少一种第二细菌物种的菌落形成单位/毫升(cfu/mL)测量的至少1,000,000×增加的细菌生长。在一些实施方案中，当重构所述冷冻保存的细菌培养物时，与大体上由至少一种第二细菌物种构成的重构的细菌储存物相比，重构的冷冻保存的细菌培养物具有以至少一种第二细菌物种的菌落形成单位/毫升(cfu/mL)测量的至少10,000,000×增加的细菌生长。
[0205] 细菌组合物
[0206] 一方面，提出了一种包含冷冻保存制剂的组合物，其包含：
[0207] 细菌物种在人造冷冻保存介质中的混合物，所述混合物包含
[0208] a)第一细菌物种，其中所述第一细菌物种是肠氨基酸球菌或发酵氨基酸球菌；和[0209] b)至少一种第二细菌物种，
[0210] 其中所述第一细菌物种以足以在重构所述人造冷冻保存制剂时对所述至少一种第二细菌物种赋予冷冻保护的量存在于所述冷冻保存制剂中，并且
[0211] 其中在细菌增殖测定中，所述人造冷冻保存制剂在重构后，相对于包含所述至少一种第二细菌物种且不含所述第一细菌物种的人造冷冻保存制剂在重构后的细菌增殖，展现出所述至少一种第二细菌物种的至少10×增加的细菌增殖。
[0212] 如本文所使用的，人造冷冻保存介质指的是适合冷冻保存细胞(例如细菌细胞)并由“人手工(hand of man)”制成的合成介质。
[0213] 细菌增殖测定
[0214] 用于测定细菌细胞活力和增殖能力的各种测定是本领域已知的。在示例性的实施方案中，细菌增殖测定涉及在合适的基质(substrate)(例如，包含合适的细菌生长培养基的琼脂平板)上划线/平板接种，并且在适合所讨论的细菌的生长条件下孵育平板。在特定的实施方案中，将平板在厌氧条件下孵育。参见例如本文提供的实施例。
[0215] 在另一个示例性的实施方案中，细菌增殖测定涉及细胞分选。流式细胞术用于分析细菌的活力、代谢状态和抗原标记物。流式细胞术通常用于测定样品中活细菌的数量。活细胞具有完整的膜并且对于例如碘化丙啶(PI)的染料是不可渗透的，碘化丙啶仅渗入膜受损的细胞中。例如，噻唑橙(TO)是一种渗透染料并且可以不同程度地进入所有活的和死的细胞。对于革兰氏阴性生物体，使用EDTA耗尽脂多糖层促进TO摄取。因此，这两种染料的组合提供了一种快速且可靠的方法来区分活细菌和死细菌。如果细菌计数很重要，则可以使用流式细胞术珠粒标准物(bead standard)BD Biosciences液体计数珠粒(BD Biosciences，圣何塞，加利福尼亚州)来精确定量样品中活细菌、死细菌和总细菌的数量。
[0216] 流式细胞术的示例性方案如下：
[0217] 细菌：
[0218] 对于培养的细菌，在染色缓冲液中稀释至约5×105至9×106个细菌/mL的浓度范围。为了制备死细菌，在稀释前，将0.5mL培养物与0.5ml SPOR-KLENZTM(Steris Corporation，圣路易斯，密苏里州，目录号6525-01)消毒剂混合5分钟。
[0219] 染色：
[0220] 1.标记12×75-mm聚苯乙烯管。
[0221] 2.涡旋细菌悬浮液或样品并且在染色缓冲液中以至少1:10稀释。
[0222] 3.添加200μL细菌悬浮液，在染色缓冲液中如上进行稀释。
[0223] 4.将5.0μL每种染料溶液添加到管中。TO的最终染色浓度是420nM并且PI的最终染色浓度是48μM。
[0224] 5.涡旋并且在室温下孵育5分钟。
[0225] 6.将50μL BD液体计数珠粒反向吸移(reverse pipet)至染色管中以测定活细菌、死细菌和总细菌的浓度。
[0226] 7.在例如BD FACS品牌的流式细胞仪(BD FACSCalibur流式细胞仪或等同产品)上进行分析。
[0227] 流式细胞仪设置：
[0228] 1.使用BD CaliBRITETM 3珠粒(BD Biosciences目录号349502)和适当的软件(例如BD FACSCompTM或BD AutoCOMPTM软件)来设置光电倍增管(PMT)电压和荧光补偿，并且在使用前检查仪器灵敏度。
[0229] 2.初始仪器设置应当如下：
[0230] ·阈值—SSC
[0231] ·FSC—E01，对数放大
[0232] ·SSC—375V，对数放大
[0233] ·FL1—600V，对数放大
[0234] ·FL3—800V，对数放大
[0235] ·补偿-未使用
[0236] 3.实际设置可以因应用而异，并且应当如下进行优化：设置侧向散射(SSC)阈值，并且使用未染色的稀释细菌样品调整PMT电压和阈值水平。应当定位细菌群体使得其完全在FSC与SSC图上在标度(scale)上(图1A)。应当检查各个FSC和SSC直方图以确保钟形(bell-shaped)群体可见。如果不存在全部群体，则调整PMT值以将峰定位在直方图上，并减小阈值直到全部群体可见。随着电压进一步增加，背景噪声应当在直方图的下端变得明显。PMT电压与阈值的平衡应当允许观察到整个峰，以及在细菌和噪声之间的至少一部分谷。实际的峰形和相对于噪声的分辨度将随着细菌形态和样品基质变化。
[0237] 4.设置FL1和FL3 PMT电压以将未染色的群体置于FL1与FL3图的左下象限。
[0238] 数据采集与分析：
[0239] 1.使用SSC阈值在BD FACS品牌流式细胞仪上采集制备好的样品。在采集到分析模式下，使用BD CellQuestTM Pro或BD LYSYSTM II软件采集数据。使用细菌群体周围(R1)的活门(live gate)建立FSC与SSC图。如果使用BD液体计数珠粒，在FSC与SSC图上在珠粒周围设置区域R2。在FL2与SSC点图和FL1与FL3图中，在染色细菌群体周围设置另一个区域R3，在组合参数FSC、SSC和FL2(在[R1 OR R2]AND R3上门控FL1与FL3)上设置门以显示染色结果(图1C)。
[0240] 2.总共获取10,000个事件。
[0241] 3.在分析模式下，绘制活群体、死群体和受损群体周围的用直线围着的(rectilinear)区域。
[0242] 4.如果使用BD液体计数珠粒，则测定绝对计数。
[0243] 对照：
[0244] 使用未染色的细菌样品确认适当设置了PMT电压。稀释、染色并获取培养基或样品基质的等分试样(与细菌样品一样进行稀释)以确认测定背景是低的。使用活细菌和死细菌的混合物来确认充分解析了已经染色的活细菌群体、受损细菌群体和死细菌群体。
[0245] 除PI外，还可以使用其他活体染料，例如但不限于溴化乙锭、荧光素二乙酸和吖啶，它们可以用于流式细胞术中以测定活/死细菌细胞的数量。
[0246] 实施例
[0247] 实施例1：菌株生存力
[0248] 源自人粪便的许多微生物展现出对冻结和冻干的敏感性，这通过降低的活力得以证明，并且在极端情况下，这些微生物在这些过程中不能存活。这就带来了一个问题，因为它改变了可从粪便样品中产生的微生物的群体多样性，从而使此类微生物群体无法代表原始材料。在其中具有有益特性的物种对冻结和冻干展现出敏感性的情况下，它会限制和/或禁止保持敏感物种储存物的能力，从而需要定期从主要来源获取新鲜分离的敏感物种供应。
[0249] 为了冷冻，将含有本文描述的共培养物的1mL等分试样的小瓶置于-80℃冰箱中并冷冻至少24小时。为了冻干，用于冷冻干燥过程的冻干机是Labconco Freeze Dry System/Freezone 4.5，7750000。为了重构微生物，使用了以下方案：
[0250] (1)将重构介质(1×PBS)置于厌氧培养室中过夜以对所述介质脱气。整个重构方案均在厌氧培养室内进行。使用共培养物体积与重构介质1:1的比率重构共培养物。例如，如果冻结并且冻干1mL共培养的体积，则使用1mL重构培养物。
[0251] (2)将1mL重构介质等分到包含冻结的共培养物的小瓶中，并且在厌氧培养室中放置15分钟。每几分钟倒转小瓶以确保彻底混合培养物。
[0252] (3)然后将此培养物平板接种以测定cfu/mL。
[0253] 即使使用冷冻保护剂和冻干保护剂介质，敏感菌株(例如表1所示的那些)的重构值等于或低于102cfu/mL。所有八种菌株(来自如US 20140363397中所述的源自人粪便的MET-1定义的群落)也经历了批次间的不一致，有时即使在无稀释下，也不会从冻干中生长回来。
[0254] 表1：源自人粪便的八种菌株(MET-1)冻干后的重构cfu/mL结果：
[0255]
[0256] *NG-在苛养厌氧菌琼脂(FAA)平板上未稀释的细菌培养物的等分试样无生长[0257] 实施例2：与肠氨基酸球菌(14 LG)共培养
[0258] 将6 FM、43 FAA、F1 FAA、1 FAA、29 FAA、18 FAA、39 FAA和30 FAA(来自MET-1)的过夜培养物的稀释系列平板接种到FAA上以测定起始cfu/mL(参见例如表2)。然后将所有八种菌株各自与肠氨基酸球菌14 LG(OD600＝0.782)的过夜培养物按等份(10mL:10mL)共培养2小时。然后将培养物离心并以10％固体的浓度重悬于5％核黄素/半胱氨酸/菊粉中。将样品等分至1mL体积并于-80℃冷冻过夜。然后将样品冻干、重构并平板接种以测定恢复cfu/mL。观察所有八种菌株的混合培养物(这是预期的并且表明同时存在14 LG和目标菌株二者)。在14 LG与每个目标菌株之间观察到菌落形态的差异并通过Sanger测序确认了它们的个体身份。列举了来自目标菌株的菌落，并且可以用作近似的恢复cfu/mL(参见例如表2)。
[0259] 表2：与14 LG共培养后，八种菌株的重构cfu/mL结果。结果是一式三份试验的平均值：
[0260]
[0261] 重构后，所有八种菌株不仅在冻结和冻干条件下都存活，而且还具有可预测的稳健性(例如但不限于至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的细菌物种存活并在FAA平板上生长)。
[0262] 还与14 LG一起共培养了从不同粪便供体(“NB2”-健康的具有平均体重指数(BMI)的28岁男性个体，之前已接受过健康筛查，该健康筛查为允许他成为加拿大FMT供体的程序的一部分)分离的菌株群组。在39种菌株中，21种在使用传统的冷冻和冻干保护剂方法冷冻和冻干后，至少10-4的10,000×或(4倍系列)稀释下未生长回来。将这些菌株分别与14 LG的过夜培养物按等份(10mL:10mL)共培养2小时。然后将培养物离心并以10％固体的浓度重悬于5％核黄素/半胱氨酸/菊粉中。将样品等分至1mL体积并于-80摄氏度冷冻过夜。然后将样品冻干、重构并将等分试样不稀释地平板接种在FAA平板上以测定恢复cfu/mL。观察到所有21种菌株的混合培养物(这是预期的并且表明同时存在14 LG和目标菌株二者)。在14 LG与每个目标菌株之间观察到菌落形态的差异并通过Sanger测序确认了它们的个体身份。对目标菌落的菌株进行计数，并且可以用作近似的恢复cfu/mL(参见例如表3)。
[0263] 表3：与14 LG共培养后，来自供体NB2的21种菌株的重构cfu/mL结果。结果是一式三份试验的平均值：
[0264]
[0265] 重构后，来自供体NB2的所有21种菌株不仅在冻结和冻干条件下都存活，而且还具有可预测的稳健性(例如但不限于至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的细菌物种存活并在FAA平板上生长)。
[0266] 实施例3：与过滤器灭菌的肠氨基酸球菌14 LG的上清液共培养
[0267] 使用未稀释的等分试样将43 FAA、F1 FAA和6 FM的过夜培养物在FAA平板上平板接种以测定起始cfu/mL(参见例如表4)。然后将43 FAA、F1 FAA和6 FM分别与14 LG的过夜培养物(OD600＝0.763)的过滤器灭菌(0.22μm过滤器)的上清液按等份(10mL:10mL)共培养2小时。然后将培养物以4000rpm离心并以10％固体的浓度重悬于5％核黄素/半胱氨酸/菊粉中。将样品等分至1mL体积并于-80摄氏度冷冻过夜。然后将样品冻干、重构并平板接种以测定恢复cfu/mL。在所有重构平板(包括未掺水的平板(neat plate))上，对于所有菌株均未观察到生长(参见例如表4)。这表明14 LG的保护性质可能是活微生物之间相互作用的结果，而不是其分泌产物造成的。
[0268] 表4：与过滤器灭菌的14 LG上清液共培养后，三种菌株的重构cfu/mL结果。结果是一式三份试验的平均值：
[0269]菌株 起始OD600 起始cfu/mL 重构cfu/mL
43 FAA(人罗斯拜瑞氏菌) 0.322 2.2×1011 无生长*
F1 FAA(挑剔真杆菌) 1.035 2.4×1012 无生长
6 FM(直肠真杆菌) 0.153 1.9×1011 无生长
43 FAA(人罗斯拜瑞氏菌) 0.322 2.2×1011 无生长*
F1 FAA(挑剔真杆菌) 1.035 2.4×1012 无生长
6 FM(直肠真杆菌) 0.153 1.9×1011 无生长
[0270] *在苛养厌氧菌琼脂(FAA)平板上未稀释的细菌培养物等分试样无生长[0271] 实施例4：与其他肠氨基酸球菌菌株(GAM 7、CC1/6 D9)共培养：
[0272] 还测试了从不同供体粪便样本中分离出的其他肠氨基酸球菌菌株。GAM 7是从肥胖个体的粪便样品分离出的肠氨基酸球菌菌株，而CC1/6 D9是从患有结直肠癌的个体的肠活检中分离出的肠氨基酸球菌菌株。将1 FAA和39 FAA的过夜培养物分别与GAM 7(OD600＝0.776)或CC1/6 D9(OD600＝1.216)的过夜培养物按等份(10mL:10mL)共培养2小时。然后将培养物离心并以10％固体的浓度重悬于5％核黄素/半胱氨酸/菊粉中。将样品等分至1mL体积并于-80摄氏度冷冻过夜。然后将样品冻干、重构并使用未稀释的等分试样平板接种在FAA平板上以测定恢复cfu/mL。对菌落进行计数，挑取并递送用于Sanger测序，以确定最接近的物种身份。与GAM 7或CC1/6 D9的共培养导致1 FAA和39 FAA的重构值相对稳健且一致，所述重构值等于或超过与14 LG共培养时观察到的那些值(例如参见表5和表6)。这些结果表明，在冷冻和冻干之前与肠氨基酸球菌共培养的保护性质是与物种相关的能力，而不是与特定菌株相关的能力。
[0273] 表5：与GAM 7共培养后，两种菌株的重构cfu/mL结果。结果是一式三份试验的平均值：
[0274] 菌株 起始OD600 重构cfu/mL1 FAA(直肠真杆菌) 0.411 6.25×106
39 FAA(粪便罗斯拜瑞氏菌) 1.37 7.1×105
39 FAA(粪便罗斯拜瑞氏菌) 1.37 7.1×105
[0275] 表6：与CC1/6 D9共培养后，两种菌株的重构cfu/mL结果。结果是一式三份试验的平均值：
[0276] 菌株 起始OD600 重构cfu/mL1 FAA(直肠真杆菌) 0.411 5.3×107
39 FAA(粪便罗斯拜瑞氏菌) 1.37 4.1×107
39 FAA(粪便罗斯拜瑞氏菌) 1.37 4.1×107
[0277] 实施例5：与除肠氨基酸球菌以外的菌株(25 MRS、5 MM和12 FMU)共培养：
[0278] 选择肠氨基酸球菌的替代微生物进行共培养，以测定冷冻和冻干期间的保护是肠氨基酸球菌特有的特性，还是仅仅是与其他微生物共培养的副产物。从我们的MET-1微生物列表中选择干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)(25 MRS)和椭圆形拟杆菌(Bacteroides ovatus)(5 MM)，并且从我们的NB2微生物列表中选择琥珀酸考拉杆菌(Phascolarctobacterium succinatutens)(12 FMU)作为肠氨基酸球菌的替代品进行共培养。将1 FAA和39 FAA(来自MET-1)的过夜培养物分别与25 MRS(OD600＝1.3)或5 MM(OD600＝
1.3)的过夜培养物按等份(10mL:10mL)共培养2小时。另外，将14FMU、9NA、17 FMU和5 TSAB(来自NB2)分别与12 FMU的过夜培养物(OD600＝0.166)按等份(10mL:10mL)共培养2小时。然后将培养物离心并以10％固体的浓度重悬于5％核黄素/半胱氨酸/菊粉中。将样品等分至
1mL体积并于-80摄氏度冷冻过夜。然后将样品冻干、重构并使用未稀释的等分试样平板接种在FAA平板上以测定复原cfu/mL。对菌落进行计数，挑取并递送用于Sanger测序，以测定最接近的物种匹配/身份。在39 FAA和1 FAA与5 MM或25 MRS的共培养中，重构后没有观察到39 FAA或1 FAA的生长(参见例如表7和表8)。同样地，将12 FMU与14 FMU、9 NA、17 FMU或
5 TSAB共培养导致重构后没有观察到14 FMU、9 NA、17 FMU或5 TSAB的生长(参见例如表
9)。这些结果表明，在冷冻和冻干之前与肠氨基酸球菌共培养的保护性质是与肠氨基酸球菌相关的能力，而不仅仅是任何两种微生物共培养的结果。
1.3)的过夜培养物按等份(10mL:10mL)共培养2小时。另外，将14FMU、9NA、17 FMU和5 TSAB(来自NB2)分别与12 FMU的过夜培养物(OD600＝0.166)按等份(10mL:10mL)共培养2小时。然后将培养物离心并以10％固体的浓度重悬于5％核黄素/半胱氨酸/菊粉中。将样品等分至
1mL体积并于-80摄氏度冷冻过夜。然后将样品冻干、重构并使用未稀释的等分试样平板接种在FAA平板上以测定复原cfu/mL。对菌落进行计数，挑取并递送用于Sanger测序，以测定最接近的物种匹配/身份。在39 FAA和1 FAA与5 MM或25 MRS的共培养中，重构后没有观察到39 FAA或1 FAA的生长(参见例如表7和表8)。同样地，将12 FMU与14 FMU、9 NA、17 FMU或
5 TSAB共培养导致重构后没有观察到14 FMU、9 NA、17 FMU或5 TSAB的生长(参见例如表
9)。这些结果表明，在冷冻和冻干之前与肠氨基酸球菌共培养的保护性质是与肠氨基酸球菌相关的能力，而不仅仅是任何两种微生物共培养的结果。
[0279] 表7：与25 MRS共培养后，两种菌株的重构cfu/mL结果。结果是一式三份试验的平均值。
[0280] 菌株 起始OD600 重构cfu/mL1 FAA(直肠真杆菌) 0.411 无生长*
39 FAA(粪便罗斯拜瑞氏菌) 1.37 无生长
39 FAA(粪便罗斯拜瑞氏菌) 1.37 无生长
[0281] *在苛养厌氧菌琼脂(FAA)平板上未稀释的细菌培养物等分试样无生长[0282] 表8：与5 MM共培养后，两种菌株的重构cfu/mL结果。结果是一式三份试验的平均值。
[0283] 菌株 起始OD600 重构cfu/mL1 FAA(直肠真杆菌) 0.170 无生长*
39 FAA(粪便罗斯拜瑞氏菌) 1.33 无生长
39 FAA(粪便罗斯拜瑞氏菌) 1.33 无生长
[0284] *在苛养厌氧菌琼脂(FAA)平板上未稀释的细菌培养物等分试样无生长[0285] 表9：与12 FMU共培养后，两种菌株的重构cfu/mL结果。结果是一式三份试验的平均值。
[0286]菌株 起始OD600 重构cfu/mL
14 FMU(扭链瘤胃球菌) 0.207 无生长*
9 NA(卵瘤胃球菌) 1.058 无生长
17 FMU(直肠真杆菌) 0.089 无生长
5 TSAB(粪便布劳特氏菌) 0.361 无生长
14 FMU(扭链瘤胃球菌) 0.207 无生长*
9 NA(卵瘤胃球菌) 1.058 无生长
17 FMU(直肠真杆菌) 0.089 无生长
5 TSAB(粪便布劳特氏菌) 0.361 无生长
[0287] *在苛养厌氧菌琼脂(FAA)平板上未稀释的细菌培养物等分试样无生长[0288] 实施例6：在不使用冷冻/冻干保护剂的情况下与14 LG共培养：
[0289] 在不使用冷冻保护剂或冻干保护剂介质的情况下进行共培养以确定与14 LG的共培养是否足以促进对冷冻/冻干敏感的菌株的存活。将1 FAA和39 FAA的过夜培养物分别与14 LG的过夜培养物(OD600＝0.633)按等份(10mL:10mL)共培养2小时。然后将培养物离心并以10％固体的浓度重悬于ddH2O中。将样品等分至1mL体积并于-80摄氏度冷冻过夜。然后将样品冻干、重构并使用未稀释的等分试样平板接种在FAA平板上以测定复原cfu/mL。使用本文所述的方法对菌落进行计数，挑取并递送用于Sanger测序以测定身份。在不使用任何冷冻/冻干保护剂介质的情况下，14 LG的共培养导致1 FAA和39 FAA二者的持续存活(参见例如表10)。然而，当组合使用与14 LG和冷冻/冻干保护剂介质的共培养时，1 FAA和39 FAA二者均具有比单独共培养更高的重构值(参见例如表2和表10)。这些结果证实，与14 LG的共培养足以提高敏感微生物在冷冻和冻干过程中的生存力，但在另外补充冷冻/冻干保护剂介质后观察到生长增加(例如但不限于，当使用冷冻/冻干保护剂介质时，敏感微生物100×、1,000×、10,000×、100,000×提高的生存力)。
[0290] 表10：在不使用任何冷冻保护剂或冻干保护剂的情况下，与14 LG共培养后，两种菌株的重构cfu/mL结果。结果是一式三份试验的平均值：
[0291] 菌株 起始OD600 重构cfu/mL1 FAA(直肠真杆菌) 0.411 7.7×105
39 FAA(粪便罗斯拜瑞氏菌) 1.37 1.2×102
39 FAA(粪便罗斯拜瑞氏菌) 1.37 1.2×102
[0292] 实施例7：与杀灭的14 LG共培养：
[0293] 与杀灭的14 LG进行共培养以确定其保护特性是否是活微生物之间发生相互作用的结果。将14 LG的过夜培养物(OD600＝0.676)煮沸20分钟以破坏所有活细胞。然后将此培养物用未稀释的等分试样平板接种在FAA平板上以确保没有观察到生长。将1 FAA和39 FAA的过夜培养物分别与煮沸的14 LG按等份(10mL:10mL)共培养2小时。然后将培养物离心并以10％固体的浓度重悬于5％核黄素/半胱氨酸/菊粉中。将样品等分至1mL体积并于-80摄氏度冷冻过夜。然后将样品冻干、重构并平板接种以测定恢复cfu/mL。在任何稀释度下(包括在未掺水的平板上(例如，在苛养厌氧菌琼脂(FAA)平板上未稀释的细菌培养物等分试样))都没有观察到生长(参见例如表11)。这种观察结果表明14 LG共培养的保护性质是活微生物之间发生相互作用的结果。可替代地，煮沸过程改变或破坏了14LG细胞的某些物理特征，这些物理特征在保护特性中起作用。
[0294] 表11：与杀灭的14 LG共培养后，两种菌株的重构cfu/mL结果。结果是一式三份试验的平均值。
[0295]菌株 起始OD600 重构cfu/mL
1 FAA(直肠真杆菌) 0.170 无生长*
100X39 FAA(粪便罗斯拜瑞氏菌) 1.33 无生长
1 FAA(直肠真杆菌) 0.170 无生长*
100X39 FAA(粪便罗斯拜瑞氏菌) 1.33 无生长
[0296] *在苛养厌氧菌琼脂(FAA)平板上未稀释的细菌培养物等分试样无生长[0297] 实施例8：14 LG共培养的替代时间安排和浓度：
[0298] 在进行的所有实验中，细菌分离株与14 LG的等份共培养进行2小时。然而，还以不同的稀释度和不同的持续时间测试了共培养。对于八种敏感微生物中的每一种，分别在0分钟、30分钟和1小时的时间点测试了1:20(14 LG:菌株X)和1:10(14 LG:菌株X)的稀释度。使6 FM、43 FAA、F1 FAA、1 FAA、29 FAA、18 FAA、39 FAA和30 FAA的过夜培养物生长，并以适当的稀释度和适当的持续时间与14 LG共培养，并且然后按照前述的方法进行处理。将样品重构并平板接种以测定恢复cfu/mL。尽管每种菌株的结果不同，但是有趋势表明，随着共培养的持续时间和14 LG浓度的增加，重构值提高(参见例如表12)。这表明14 LG在冷冻和冻干过程中用来保护敏感微生物的机制需要时间才能最佳地发挥功能。
[0299] 表12：以不同的持续时间与不同浓度的14 LG共培养后，所有8种菌株的重构cfu/mL结果：
[0300]
[0301] *NG-在苛养厌氧菌琼脂(FAA)平板上未稀释的细菌培养物等分试样无生长[0302] 实施例9：与密切相关的发酵氨基酸球菌(DSM 20731)共培养：
[0303] 选择发酵氨基酸球菌进行共培养测试以确定在冷冻和冻干过程中赋予的保护作用是否是肠氨基酸球菌在全物种生命树(基于16S rRNA的系统发生树)上的近亲也共有的特征。本实验中使用了B-6CNA(源自NB2的挑剔真杆菌)、B-10 FAA(源自NB2的肠道罗斯拜瑞氏菌)、DSM 20731(来自DSMZ菌株库的发酵氨基酸球菌)、14 LG(从MET-1分离得到的肠氨基酸球菌)和DSM 21505(来自DSMZ菌株库的肠氨基酸球菌)。将B-6 CNA(OD600＝0.8)和B-10 FAA(OD600＝0.232)的过夜培养物分别与DSM 20731(OD600＝0.685)、14 LG(OD600＝0.777)或DSM 21505(OD600＝0.762)的过夜培养物按等份(10mL:10mL)共培养2小时。然后将培养物离心并以10％固体的浓度重悬于5％核黄素/半胱氨酸/菊粉中。将样品等分至1mL体积并于-80℃冷冻过夜。然后将样品冻干、重构并平板接种以测定恢复cfu/mL。对菌落进行计数，挑取并递送用于Sanger测序以测定身份。与发酵氨基酸球菌共培养，尽管不如肠氨基酸球菌对B-6 CNA稳健，但与没有任何共培养的冷冻和冻干相比，仍能使B-6 CNA和B-10 FAA均持续恢复(表13和表14)。这些结果表明，尽管发酵氨基酸球菌对某些微生物可能不像肠氨基酸球菌那样提供稳健的保护，但它仍然允许微生物的持续恢复，否则这些微生物将无法在冷冻和冻干中存活。
[0304] 表13：与DSM 20731、14 LG或DSM 21505共培养后B-6 CNA的重构cfu/mL结果。结果是一式三份试验的平均值。
[0305]菌株 重构cfu/mL
DSM 20731(发酵氨基酸球菌) 4.5×103
14 LG(肠氨基酸球菌) 2.9×105
DSM 21505(肠氨基酸球菌) 9.8×106
无共培养伴侣 无生长*
DSM 20731(发酵氨基酸球菌) 4.5×103
14 LG(肠氨基酸球菌) 2.9×105
DSM 21505(肠氨基酸球菌) 9.8×106
无共培养伴侣 无生长*
[0306] *未掺水的平板上无生长。
[0307] 表14：与DSM 20731、14 LG或DSM 21505共培养后B-10 FAA的重构cfu/mL结果。结果是一式三份试验的平均值。
[0308]菌株 重构cfu/mL
5
DSM 20731(发酵氨基酸球菌) 5.8×10
14 LG(肠氨基酸球菌) 5.0×105
DSM 21505(肠氨基酸球菌) 1.8×106
无共培养伴侣 无生长*
5
DSM 20731(发酵氨基酸球菌) 5.8×10
14 LG(肠氨基酸球菌) 5.0×105
DSM 21505(肠氨基酸球菌) 1.8×106
无共培养伴侣 无生长*
[0309] *未掺水的平板上无生长。
[0310] 实施例10：肠氨基酸球菌的冷冻/冻干保护需要细胞-细胞接触吗？
[0311] 尚不清楚在与肠氨基酸球菌共培养过程中是否需要细胞-细胞接触以赋予冷冻/冻干保护。为了研究这个问题，使用了共培养双瓶设备(参见图2)。
[0312] 对B-6 CNA(来自NB2的挑剔真杆菌)以三种不同的方式进行了测试。第一种，将B-6 CNA的过夜培养物离心并以10％固体的浓度重悬于5％核黄素/半胱氨酸/菊粉中。第二种，将B-6 CNA的过夜培养物与14 LG(来自MET-1的肠氨基酸球菌)的过夜培养物按等份(10mL:10mL)共培养2小时。然后将培养物离心并以10％固体的浓度重悬于ddH2O中。第三种，在共培养双瓶设备中将100mL B-6 CNA过夜培养物与100mL 14 LG过夜培养物共培养(即B-6 CNA在一侧/瓶中，而14 LG在另一侧/瓶中)2个小时。然后将来自所有三种不同处理组的样品等分至1mL体积并于-80℃冷冻过夜。然后将样品冻干、重构并平板接种以测定恢复cfu/mL。B-6 CNA仅在与14 LG直接接触共培养时才能恢复(表15)。这些发现表明，肠氨基酸球菌共培养物的保护性质可能是肠氨基酸球菌与其共培养陪伴菌株之间直接细胞-细胞接触的结果。这些结果也为上述实施例7中的发现的描述了与过滤器无菌肠氨基酸球菌上清液共培养的无效性的结果提供了证据。
[0313] 表15：无共培养和以直接接触或通过双瓶设备与14 LG共培养后，B-6 CNA的重构cfu/mL结果。结果是一式三份试验的平均值。
[0314]菌株 重构cfu/mL
14 LG(肠氨基酸球菌)，通过双瓶设备 无生长*
14 LG(肠氨基酸球菌)，直接接触 3.5×106
无共培养伴侣 无生长
14 LG(肠氨基酸球菌)，通过双瓶设备 无生长*
14 LG(肠氨基酸球菌)，直接接触 3.5×106
无共培养伴侣 无生长
[0315] *未掺水的平板上无生长无生长。
[0316] 本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用以其整体并入本说明书中，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被特别地且单独地指出通过引用并入本文。另外，本申请中任何参考文献的引用或标识不应被解释为承认这样的参考文献可用作本发明的现有技术。就使用章节标题来说，它们不应被解释为必然限制。
[0317] 尽管已经描述了本发明的许多实施方案，但是应当理解，这些实施方案仅是说明性的，而不是限制性的。
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