具有支链氨基酸探针的肽类似物
阅读：122发布：2020-06-26
专利汇可以提供具有支链氨基酸探针的肽类似物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及肽类似物，其包含一个或多个支链 氨 基酸探针和天然肽或其变体。，下面是具有支链氨基酸探针的肽类似物专利的具体信息内容。
1.一种包含肽和一个或多个支链氨基酸探针的肽类似物，
其中所述支链氨基酸探针包含第一氨基-烷基氨基酸残基，
所述第一氨基-烷基氨基酸残基任选地共价连接至第二氨基-烷基氨基酸残基，或共价连接至第二和第三氨基-烷基氨基酸残基，以形成具有2或3个氨基-烷基氨基酸残基的直链，
其中所述第一、第二和/或第三氨基-烷基氨基酸残基中的一个或多个的所述侧链各自通过将独立地选自由以下组成的组的分子附接至所述侧链氨基而被修饰：AAAq-AAA；
(aa3)p-AAAq；AAAq-(aa3)p；[(aa3)-AAA]p和[AAA-(aa3)]p；
其中q为选自0、1、2和3的数字；p为选自1、2和3的数字；AAA为氨基-烷基氨基酸残基；且(aa3)为独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基，
其中所述氨基-烷基氨基酸残基任选地被乙酰化，
其中所述第一氨基-烷基氨基酸残基共价连接至所述肽的N末端，共价连接至所述肽的C末端，和/或附接至所述肽内的氨基-烷基氨基酸残基的所述侧链氨基，
前提条件是所述支链氨基酸探针由2至9个氨基酸残基组成。
2.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述氨基-烷基氨基酸残基是具有包含氨基-烷基(-CnH2nNH2)的侧链的氨基酸。
3.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述氨基-烷基氨基酸残基包含选自由以下组成的组的侧链氨基-烷基：甲胺(-CH2NH2)、乙胺(-C2H4NH2)、丙胺(-C3H6NH2)、正丁胺(--C4H8NH2)、戊胺(-C5H10NH2)、正己胺(-C6H12NH2)、庚胺(-C7H14NH2)、辛胺(-C8H16NH2)、壬胺(-C9H18NH2)、癸胺(-C10H20NH2)、十一胺(-C11H22NH2)和十二胺(-C12H24NH2)。
4.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述氨基-烷基氨基酸残基的所述侧链氨基选自由以下组成的组：β-氨基(甲胺)；γ-氨基(乙胺)；δ-氨基(丙胺)；ε-氨基(正丁胺)；
ζ-氨基(戊胺)；η-氨基(正己胺)；θ-氨基(庚胺)；ι-氨基(辛胺)；κ-氨基(壬胺)；λ-氨基(癸胺)；μ-氨基(十一胺)；和ν-氨基(十二胺)。
5.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述支链氨基酸探针包含第一氨基-烷基氨基酸残基，所述第一氨基-烷基氨基酸残基任选地被乙酰化，
其中所述第一氨基-烷基氨基酸残基的所述侧链氨基通过附接独立地选自由以下组成的组的分子而被修饰：AAAq-AAA；(aa3)p-AAAq；AAAq-(aa3)p；[(aa3)-AAA]p和[AAA-(aa3)]p；其中q为选自0、1、2和3的数字；p为选自1、2和3的数字；AAA为氨基-烷基氨基酸残基(任选地被乙酰化)；且(aa3)为独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基。
6.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述支链氨基酸探针包含第一氨基-烷基氨基酸残基，其共价连接至第二氨基-烷基氨基酸残基以形成具有2个氨基-烷基氨基酸残基的直链，
所述第一和/或第二氨基-烷基氨基酸残基任选地被乙酰化，
其中所述第一和/或所述第二氨基-烷基氨基酸残基的所述侧链氨基通过附接独立地选自由以下组成的组的分子而被修饰：AAAq-AAA；(aa3)p-AAAq；AAAq-(aa3)p；[(aa3)-AAA]p和[AAA-(aa3)]p；其中q为选自0、1、2和3的数字；p为选自1、2和3的数字；AAA为氨基-烷基氨基酸残基(任选地被乙酰化)；且(aa3)为独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基。
7.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述支链氨基酸探针包含第一氨基-烷基氨基酸残基，其共价连接至第二和第三氨基-烷基氨基酸残基以形成具有3个氨基-烷基氨基酸残基的直链，
所述第一、第二和/或第三氨基-烷基氨基酸残基任选地被乙酰化，
其中所述第一、第二和/或第三氨基-烷基氨基酸残基的所述侧链氨基通过附接独立地选自由以下组成的组的分子而被修饰：AAAq-AAA；(aa3)p-AAAq；AAAq-(aa3)p；[(aa3)-AAA]p和[AAA-(aa3)]p；其中q为选自0、1、2和3的数字；p为选自1、2和3的数字；AAA为氨基-烷基氨基酸残基(任选地被乙酰化)；且(aa3)为独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基。
8.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中i)所述第一、第二和/或第三氨基-烷基氨基酸残基中的一个的所述侧链、ii)所述第一、第二和/或第三氨基-烷基氨基酸残基中的两个的所述侧链或iii)第一、第二和第三氨基-烷基氨基酸残基中的三个的所述侧链通过将分子附接至所述侧链氨基而被修饰。
9.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述氨基-烷基氨基酸残基单独地选自由L-赖氨酸、D-赖氨酸、L-鸟氨酸和D-鸟氨酸组成的组。
10.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述支链氨基酸探针的所述第一、第二和/或第三氨基-烷基氨基酸中的每一个单独地选自由L-赖氨酸、D-赖氨酸、L-鸟氨酸和D-鸟氨酸组成的组。
11.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述分子AAAq-AAA、(aa3)p-AAAq、AAAq-(aa3)p、[(aa3)-AAA]p和[AAA-(aa3)]p中的每个AAA单独地选自由L-赖氨酸、D-赖氨酸、L-鸟氨酸和D-鸟氨酸组成的组。
12.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述氨基-烷基氨基酸残基单独地选自由L-赖氨酸和L-鸟氨酸组成的组。
13.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述氨基-烷基氨基酸残基各自是相同的或不同的。
14.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述侧链氨基单独地选自所述δ-氨基(鸟氨酸)和所述ε-氨基(赖氨酸)。
15.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中待附接至所述侧链氨基的所述分子独立地选自由以下组成的组：Lysq-Lys；(aa3)p-Lysq；Lysq-(aa3)p；[(aa3)-Lys]p；[Lys-(aa3)]p；
Ornq-Orn；(aa3)p-Ornq；Ornq-(aa3)p；[(aa3)-Orn]p和[Orn-(aa3)]p；Ornp-Lysp；Lysp-Ornp；
[Orn-Lys]p和[Lys-Orn]p，其中q为选自0、1、2和3的数字；p为选自1、2和3的数字；(aa3)为独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基；且所述Lys、Orn和(aa)3氨基酸残基中的每一个任选地被乙酰化。
16.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中待附接至所述侧链氨基的所述分子独立地选自由以下组成的组：Lysq-Lys；Ornq-Orn；Ornp-Lysp；Lysp-Ornp；[Orn-Lys]p和[Lys-Orn]p，其中q为选自0、1、2和3的数字；p为选自1、2和3的数字；且所述Lys和Orn氨基酸残基中的每一个任选地被乙酰化。
17.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中待附接至所述侧链氨基的所述分子独立地选自由以下组成的组：Lysq-Lys；(aa3)p-Lysq；Lysq-(aa3)p；[(aa3)-Lys]p和[Lys-(aa3)]p；
且所述Lys残基中的每一个任选地被乙酰化。
18.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述氨基-烷基氨基酸残基单独地选自由L-赖氨酸和D-赖氨酸组成的组。
19.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中待附接至所述侧链氨基的所述分子是Lysq-Lys；其中q为选自0、1、2和3的数字且所述Lys残基中的每一个任选地被乙酰化。
20.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中待附接至所述侧链氨基的所述分子独立地选自由以下组成的组：
Ac-AAAq-AAA；Ac-(aa3)p-AAAq；Ac-AAAq-(aa3)p；Ac-[(aa3)-AAA]p；Ac-[AAA-(aa3)]p，Ac-Lysq-Lys；Ac-(aa3)p-Lysq；Ac-Lysq-(aa3)p；Ac-[(aa3)-Lys]p；Ac-[Lys-(aa3)]p；
Ac-Ornq-Orn；Ac-(aa3)p-Ornq；Ac-Ornq-(aa3)p；Ac-[(aa3)-Orn]p；Ac-[Orn-(aa3)]p；Ac-Ornp-Lysp；Ac-Lysp-Ornp；Ac-[Orn-Lys]p和Ac-[Lys-Orn]p,
其中q为选自0、1、2和3的数字；p为选自1、2和3的数字；且(aa3)为独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基。
21.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述支链氨基酸探针由2至3个氨基酸残基，如3至4个氨基酸残基，例如4至5个氨基酸残基，如5至6个氨基酸残基，例如6至7个氨基酸残基，如7至8个氨基酸残基，例如8至9个氨基酸残基组成。
22.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述支链氨基酸探针由2个氨基酸残基，如3个氨基酸残基，例如4个氨基酸残基，如5个氨基酸残基，例如6个氨基酸残基，如7个氨基酸残基，例如8个氨基酸残基，如9个氨基酸残基组成。
23.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中待附接至所述第一、第二和/或第三氨基-烷基氨基酸残基中的一个或多个的侧链氨基的所述分子选自由以下组成的组：AAA、Ac-AAA、AAA-AAA、Ac-AAA-AAA、AAA-AAA-AAA、Ac-AAA-AAA-AAA、AAA-AAA-AAA-AAA、Ac-AAA-AAA-AAA-AAA、AAA-Gly-AAA、Ac-AAA-Gly-AAA、AAA-AAA-Gly、Ac-AAA-AAA-Gly、AAA-Gly、Ac-AAA-Gly、AAA-Ala-AAA、Ac-AAA-Ala-AAA、AAA-AAA-Ala、Ac-AAA-AAA-Ala、AAA-Ala、Ac-AAA-Ala、AAA-His-AAA、Ac-AAA-His-AAA、AAA-AAA-His、Ac-AAA-AAA-His、AAA-His、Ac-AAA-His、AAA-Arg-AAA、Ac-AAA-Arg-AAA、AAA-AAA-Arg、Ac-AAA-AAA-Arg、AAA-Arg和Ac-AAA-Arg；其中AAA为任选地被乙酰化的氨基-烷基氨基酸残基。
24.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中待附接至所述第一、第二和/或第三氨基-烷基氨基酸残基中的一个或多个的所述侧链氨基的所述分子选自由以下组成的组：Lys、Ac-Lys、Lys-Lys、Ac-Lys-Lys、Lys-Lys-Lys、Ac-Lys-Lys-Lys、Lys-Lys-Lys-Lys、Ac-Lys-Lys-Lys-Lys、Lys-Gly-Lys、Ac-Lys-Gly-Lys、Lys-Lys-Gly、Ac-Lys-Lys-Gly、Lys-Gly、Ac-Lys-Gly、Lys-Ala-Lys、Ac-Lys-Ala-Lys、Lys-Lys-Ala、Ac-Lys-Lys-Ala、Lys-Ala、Ac-Lys-Ala、Lys-His-Lys、Ac-Lys-His-Lys、Lys-Lys-His、Ac-Lys-Lys-His、Lys-His、Ac-Lys-His、Lys-Arg-Lys、Ac-Lys-Arg-Lys、Lys-Lys-Arg、Ac-Lys-Lys-Arg、Lys-Arg和Ac-Lys-Arg。
25.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述支链氨基酸探针选自由以下组成的组：Ac-(Ac-Lys)Lys-Lys-、(Ac-Lys)Lys-Lys-、Ac-(Lys)Lys-Lys-、(Lys)Lys-Lys-；Ac-Lys-(Ac-Lys)Lys-、Lys-(Ac-Lys)Lys-、Ac-Lys-(Lys)Lys-、Lys-(Lys)Lys-；Ac-(Ac-Lys-Lys)-Lys-、(Ac-Lys-Lys)-Lys-、Ac-(Lys-Lys)-Lys-和(Lys-Lys)-Lys-。
26.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述支链氨基酸探针选自由Ac-(Ac-Lys)Lys-、Ac-(Lys)Lys-和(Lys)Lys-组成的组。
27.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中(aa3)是选自Gly和Ala的氨基酸残基。
28.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述第一氨基-烷基氨基酸残基附接至所述肽内的赖氨酸或鸟氨酸残基的侧链氨基。
29.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述第一氨基-烷基氨基酸残基附接至所述肽内的鸟氨酸残基的所述δ-氨基或所述肽内的赖氨酸残基的所述ε-氨基。
30.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述第一氨基-烷基氨基酸残基附接至所述肽内的赖氨酸残基的所述ε-氨基。
31.根据前述权利要求所述的肽类似物，其包含1个支链氨基酸探针，如2个支链氨基酸探针，例如3个支链氨基酸探针，如4个支链氨基酸探针，例如5个支链氨基酸探针，如6个支链氨基酸探针，例如7个支链氨基酸探针，如8个支链氨基酸探针，例如9个支链氨基酸探针，如10个支链氨基酸探针。
32.根据前述权利要求所述的肽类似物，其包含1个支链氨基酸探针。
33.根据前述权利要求所述的肽类似物，其包含共价连接至所述肽的N末端的1个支链氨基酸探针。
34.根据前述权利要求所述的肽类似物，其包含共价连接至所述肽的C末端的1个支链氨基酸探针。
35.根据前述权利要求所述的肽类似物，其包含附接至所述肽内的氨基-烷基氨基酸残基的所述侧链氨基的1个支链氨基酸探针；如附接至所述肽内的鸟氨酸残基的所述δ-氨基或所述肽内的赖氨酸残基的所述ε-氨基。
36.根据前述权利要求所述的肽类似物，其包含2个支链氨基酸探针。
37.根据前述权利要求所述的肽类似物，其包含2个支链氨基酸探针，其中
i)一个支链氨基酸探针共价结合至所述肽的N末端，且另一个支链氨基酸探针共价结合至所述肽的C末端；或
ii)一个支链氨基酸探针共价结合至所述肽的N末端，且另一个支链氨基酸探针附接至所述肽序列内的氨基-烷基氨基酸残基的所述侧链氨基；或
iii)一个支链氨基酸探针共价结合至所述肽的C末端，且另一个支链氨基酸探针附接至所述肽序列内的氨基-烷基氨基酸残基的侧链氨基；或
iv)所述两个支链氨基酸探针中的每一个附接至所述肽序列内的单独的氨基-烷基氨基酸残基的所述侧链氨基。
38.根据前述权利要求所述的肽类似物，其包含3个支链氨基酸探针。
39.根据前述权利要求所述的肽类似物，其包含3个支链氨基酸探针，其中
i)所述第一支链氨基酸探针共价结合至所述肽的N末端，所述第二支链氨基酸探针共价结合至所述肽的C末端，且所述第三支链氨基酸探针附接至所述肽序列内的氨基-烷基氨基酸残基的所述侧链氨基；或
ii)所述第一支链氨基酸探针共价结合至所述肽的N末端，且所述第二和第三支链氨基酸探针各自附接至所述肽序列内的不同氨基-烷基氨基酸残基的所述侧链氨基；或iii)所述第一支链氨基酸探针共价结合至所述肽的C末端，且所述第二和第三支链氨基酸探针各自附接至所述肽序列内的不同氨基-烷基氨基酸残基的所述侧链氨基；或iv)所述第一、所述第二和所述第三支链氨基酸探针的每一个附接至所述肽序列内的不同氨基-烷基氨基酸残基的所述侧链氨基。
40.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述肽是选自α-MSH、β-MSH和γ-MSH或其变体的黑皮质素。
41.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述类似物包含具有以下所述氨基酸序列的α-MSH肽：
(aa1)n–Y–(aa2)m–Z
其中n为选自0、1、2、3、4和5的数字，且(aa1)独立地为任何天然或非天然氨基酸残基，且其中m为0或1，且(aa2)为任何天然或非天然氨基酸残基，
其中Y选自由以下组成的组：His-Phe-Arg-Trp；His-(D-Phe)-Arg-Trp；His-Phe-(D-Arg)-Trp；His-Phe-Arg-(D-Trp)；His-(D-Phe)-Arg-(D-Trp)；His-Nal-Arg-Trp和His-(D-Nal)-Arg-Trp；且
其中Z选自由以下组成的组：Lys-Pro-Val和Lys-Pro-(D-Val)，且Val或(D-Val)任选地为缬氨酸酰胺。
42.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中(aa1)n选自由以下组成的组：Ser-Tyr-Ser-Met-Glu、Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu、Ser-Ser-Ile-Ile-Ser、Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu、Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu和Ac-Ser-Ser-Ile-Ile-Ser。
43.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中(aa2)m是Gly。
44.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述类似物包含具有以下所述氨基酸序列的γ-MSH肽：
(aa1)n–Y–(aa2)m–Z
其中n为选自0、1、2、3、4和5的数字，且(aa1)独立地为任何天然或非天然氨基酸残基，且其中m为0或1，且(aa2)为任何天然或非天然氨基酸残基，
其中Y选自由以下组成的组：His-Phe-Arg-Trp；His-(D-Phe)-Arg-Trp；His-Phe-(D-Arg)-Trp；His-Phe-Arg-(D-Trp)；His-(D-Phe)-Arg-(D-Trp)；His-Nal-Arg-Trp和His-(D-Nal)-Arg-Trp；且
其中Z选自由以下组成的组：Arg-Phe-Gly、Arg-(D-Phe)-Gly、Arg-Phe和Arg-(D-Phe)；
且Phe或(D-Phe)为苯丙氨酸酰胺，或Gly为甘氨酸酰胺。
45.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中(aa1)n选自由Tyr-Val-Met-Gly和Tyr-Val-Nle-Gly组成的组。
46.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中(aa2)m是Asp。
47.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述类似物不包含：
i)α-MSH和/或γ-MSH肽；
ii)α-MSH和γ-MSH肽，其具有共价连接至所述α-MSH和/或γ-MSH肽的最N末端氨基酸的支链氨基酸探针；
iii)α-MSH和γ-MSH肽，其具有共价连接至所述α-MSH和/或γ-MSH肽的最N末端氨基酸的包含赖氨酸残基或由其组成的支链氨基酸探针；
iv)α-MSH和γ-MSH肽，其具有共价连接至所述α-MSH和/或γ-MSH肽的最N末端氨基酸的一(1)个支链氨基酸探针；
v)α-MSH和γ-MSH肽，其具有共价连接至所述α-MSH和/或γ-MSH肽的最N末端氨基酸的包含赖氨酸残基或由其组成的一(1)个支链氨基酸探针；
vi)由8至22个氨基酸残基组成的肽，其包含以下所述氨基酸序列：X–(aa1)n–Y–(aa2)m–Z其中X包含具有选自Lys和D-Lys的第一赖氨酸残基(Lys1)的支链氨基酸探针，所述第一赖氨酸残基通过肽键连接至(aa1)n，
所述第一赖氨酸残基任选地通过肽键连接至第二赖氨酸残基(Lys2)，或连接至第二和第三赖氨酸残基(Lys3)，以形成总共具有2或3个选自Lys和D-Lys的赖氨酸残基的直链，其中所述第一、第二和/或第三赖氨酸残基中的每一个的一个或多个的所述侧链通过将独立地选自由以下组成的组的分子附接至所述赖氨酸残基中的每一个的所述一个或多个的ε-氨基而被修饰：Lysq-Lys；(aa3)p-Lysq；Lysq-(aa3)p；[(aa3)-Lys]p和[Lys-(aa3)]p，其中q为选自0、1、2和3的数字；p为选自1、2和3的数字，且(aa3)为独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基，
前提条件是X由2至9个氨基酸残基组成，
其中Y包含由选自由以下组成的组的4个连续氨基酸残基组成的氨基酸序列：His-Phe-Arg-Trp(SEQ ID NO:16)；His-(D-Phe)-Arg-Trp；His-Phe-(D-Arg)-Trp；His-Phe-Arg-(D-Trp)；His-(D-Phe)-Arg-(D-Trp)；His-Nal-Arg-Trp和His-(D-Nal)-Arg-Trp；且Z包含由选自由以下组成的组的2或3个连续氨基酸残基组成的氨基酸序列：Lys-Pro-Val；Lys-Pro-(D-Val)；Arg-Phe-Gly；Arg-(D-Phe)-Gly；Arg-Phe和Arg-(D-Phe)；且其中n为选自0、1、2、3、4和5的数字，且(aa1)可以独立地为任何天然或非天然氨基酸残基，且
其中m为0或1，且(aa2)可以为任何天然或非天然氨基酸残基。
48.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述肽是α-MSH的环状内酰胺类似物或金属环化α-MSH类似物。
49.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述肽包含2至100个氨基酸残基，如2至3个，例如3至4个，如4至5个，例如5至6个，如6至7个，例如7至8个，如8至9个，例如9至10个，如
10至12个，例如12至14个，如14至16个，例如16至18个，如18至20个，例如20至25个，如25至
30个，例如30至40个，如40至50个，例如50至75个，如75至100个氨基酸残基。
50.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述肽包含少于50个氨基酸残基，如少于
40个，例如少于30个氨基酸残基。
51.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述肽是天然的或天然存在的。
52.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述肽是天然存在的肽的生物活性变体。
53.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述肽是较大的多肽或蛋白质的片段。
54.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述肽具有i)免疫调节效应，包括抗炎和/或促消退效应；ii)代谢效应；iii)心血管效应；和/或iv)器官保护和/或组织保护效应。
55.根据前述权利要求所述的肽类似物，其中所述肽选自由以下组成的组：VIP(血管活性肠肽；PHM27)、PACAP(垂体腺苷酸环化酶活化肽)、肽PHI 27(肽组氨酸异亮氨酸27)、GHRH
1-24(生长激素释放激素1-24)、胰高血糖素、分泌素、肠高血糖素前体、GIP(抑胃肽)、前白蛋白或转甲状腺素蛋白(TTR)、肽HI-27和生长激素释放因子(GHRF或GHRH)、肠促胰岛素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、GLP-1(7-37)、GLP-1(7-33)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、艾塞那肽、促生长素(如促生长素或生长激素(GH))、促甲状腺素(如促甲状腺激素(TSH))、促皮质素(如促肾上腺皮质激素(ACTH)和β-内啡肽)、催乳激素(如催乳素(PRL)、促性腺激素(如促黄体生成激素(LH)和促卵泡激素(FSH))、抗利尿激素(ADH或加压素)、催产素、生长激素释放激素(GHRH)、生长抑素、促甲状腺素释放激素(TRH)、促皮质素释放激素(CRH)、促性腺激素释放激素(GnRH)、CREB(cAMP反应元件结合蛋白)、乳三肽、异亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸(IPP)、缬氨酸-脯氨酸-脯氨酸(VPP)、NPY(神经肽Y)、PYY(肽YY)、APP(禽胰多肽)和PPY/PP(胰多肽)、阿黑皮素原(POMC)肽(包括阿黑皮素原的N末端肽(NPP或促γ-MSH)、γ-MSH、促皮质素(促肾上腺皮质激素或ACTH)、α-MSH、促皮质素样中叶肽(CLIP)、β-促脂解素(β-LPH)、促脂解素γ(γ-LPH)、β-MSH、β-内啡肽和[Met]脑啡肽)；脑啡肽五肽(Met-脑啡肽和Leu-脑啡肽)、强啡肽原肽、强啡肽(强啡肽A、强啡肽B、α-新内啡肽、β-新内啡肽和大强啡肽)、内啡肽(β-内啡肽、α-内啡肽、γ-内啡肽、α-新内啡肽和β-新内啡肽)、Adrenorphin、Amidorphin、Leumorphin、孤啡肽、Opiorphin、Spinorphin、激肽、速激肽神经肽(包括物质P、肛褶蛙肽、神经激肽A(NKA)、神经激肽B(NKB)、章鱼唾腺精和泡蛙肽)、缓激肽、神经介素/蛙皮素相关肽(包括神经介素B(NMB)、神经介素N、神经介素S和神经介素U(NmU))；血管紧张素、蛙皮素、降钙素基因相关肽(CGRP)、α-CGRP、β-CGRP、肌肽、可卡因和安非他明调节转录物(CART)、δ睡眠诱导肽(DSIP)、FMRF酰胺、FMRF酰胺相关肽(FaRP)、甘丙肽、甘丙肽样肽(GALP)、胃泌素释放肽(GRP)、神经肽S、神经肽Y、神经垂体素运载蛋白(神经垂体素运载蛋白I和神经垂体素运载蛋白II)、神经降压素、胰多肽、垂体腺苷酸环化酶活化肽(PACAP)、RVD-Hpα、hemopressin、VGF(VGF神经生长因子诱导蛋白)、VGF衍生肽(TLQP-21)、降钙素、胰淀素(或胰岛淀粉样多肽(IAPP))、AGG01、肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang)、自分泌运动因子、骨形态发生蛋白(BMP)(BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP10、BMP15)、脑源性神经营养因子(BDNF)、表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长分化因子-9(GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝细胞瘤衍化生长因子(HDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、IGF-1、IGF-2、迁移刺激因子、肌肉生长抑制素(GDF-8)、神经营养素、神经营养素-3(NT-3)、神经营养素-4(NT-4)、神经生长因子(NGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、血小板生成素(TPO)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)、Wnt蛋白、Wnt1、Wnt2、Wnt2B、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8A、Wnt8B、Wnt9A、Wnt9B、Wnt10A、Wnt10B、Wnt11、Wnt16、胎盘生长因子(PGF)、胎牛促生长素(FBS)、胰岛素和胰岛素样生长因子、IGF-1、IGF-2、IGF结合蛋白、IGFBP1、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP4、IGFBP5、IGFBP6、IGFBP7、松弛素家族肽激素、松弛素样(RLN)肽、胰岛素样(INSL)肽、RLN1(松弛素1)、RLN2(松弛素2)、RLN3(松弛素3)、INSL3(胰岛素样肽3、睾丸间质细胞特异性胰岛素样肽)、INSL4(胰岛素样肽4、早期胎盘胰岛素样肽、ELIP)、INSL5(胰岛素样肽
5)、INSL6(胰岛素样肽6)、胃泌素、胃泌素-34、胃泌素-17、胃泌素-14、五肽胃泌素、甲状腺激素(T4)、促甲状腺素释放激素(TRH)、加压素、蛋白激素、糖蛋白激素、生长激素(GH)、胰岛素、LH、FSH、促甲状腺激素(促甲状腺素，TSH)、血管紧张素(AGT)、血管紧张素I、血管紧张素II、血管紧张素III、血管紧张素IV、心房利钠肽(ANP)、NT-proBNP、B型利钠肽(BNP)、心房利钠肽(ANP)、膜联蛋白、膜联蛋白A-I(脂皮素I)和膜联蛋白A-II(膜联蛋白II)或其变体。
56.根据前述权利要求中任一项所述的肽类似物，其用作药物。
57.根据权利要求56所述的肽类似物，其用于治疗缺血性病症、炎性病症和/或代谢病症，所述方法包括向有需要的个体施用有效量的根据前述权利要求中任一项所述的肽类似物。
58.根据权利要求56所述的肽类似物，其用于治疗罹患疾病或病症的患者，所述治疗包括向所述患者施用足以治疗所述疾病或病症的量的根据权利要求1所述的化合物，所述疾病或病症选自包括下列的组：中风、损伤、败血性休克、全身性低血压、由于心脏病发作的心跳骤停、心律不齐、动脉粥样硬化性疾病伴血栓形成、源自心脏的栓塞或源自任何器官的血管的栓塞、血管痉挛、主动脉瘤或其它器官中的动脉瘤、冠状动脉狭窄、心肌梗塞、心绞痛、心包炎、心肌炎、粘液性水肿或心内膜炎；与手术相关的缺血性和/或炎性病症，如大手术、心胸外科手术、腹部手术、对主动脉和/或其它主要血管的手术、一个或多个心脏瓣膜的修复、心脏冠状动脉旁路移植术(CABG)、对主动脉根部或包括总颈动脉的主动脉分支的手术以及联合心脏手术如瓣膜置换术和CABG和/或主动脉根部手术，缺血性和/或炎性病症在一个实施方案中可以与器官移植相关，如实体器官移植，包括心脏移植、肺移植、心肺联合移植、肝移植和肾移植；手术后全身性炎症反应综合症(SIRS)或手术后器官功能障碍，包括术后肾功能衰竭如急性肾损伤(AKI)、肾中毒和/或慢性肾功能衰竭(CRF)；再灌注损伤、关节病(关节疾病)、类风湿性关节炎(RA)、痛风、胃肠系统的炎性疾病以及多发性硬化症；糖尿病、包括葡萄糖耐受不良的糖尿病前期病症、肥胖、超重、代谢综合症、妊娠糖尿病或与多囊卵巢综合症相关的代谢疾病，其中所述治疗可以是预防性、改善性或治愈性的。
具有支链氨基酸探针的肽类似物
发明领域
[0001] 本发明涉及支链氨基酸探针，其被添加至天然肽或所述肽的变体以产生包含肽和一个或多个支链氨基酸探针的肽类似物或缀合物。
[0002] 发明背景
[0003] 蛋白质和肽被广泛用于治疗目的，不论是以它们的天然形式、其变体形式或类似物。蛋白质治疗剂倾向于对它们的标靶具有特异性，从而导致较少副作用，但与小分子相比，通常生物利用率较低、膜渗透性较差且代谢不稳定。基于蛋白质的药物通常称为“生物制剂”，且包括如胰岛素、生长因子和工程化抗体的分子。
[0004] 蛋白质性分子通常需要注射；尽管如此，生物制剂已经成为一类极其成功的治疗剂，包括用于治疗关节炎和各种癌症的抗体、用于治疗糖尿病、骨髓抑制和肾性贫血的可溶性蛋白质；以及用于治疗多发性硬化症、癌症、子宫内膜异位和子宫肌瘤和肢端肥大症的可注射肽。
[0005] 肽代表一类对较大蛋白质生物制剂具有特异性和效力，但尺寸较小，且对于利用化学方法的制造商而言较易接近且较廉价，因此有可能综合蛋白质的一些优点和小分子的一些优点的分子。
[0006] 蛋白质和肽化合物可以多种方式修饰，以改善所述的一种或多种特征，或解决所述化合物的一个或多个潜在缺点。例如，可以将稳定化肽序列添加至药理活性肽的N末端/或C末端，从而潜在地使得它们较少受到降解的影响(WO 99/46283)。另外，与天然肽相比，添加至α-MSH的N末端的具有6个选自Lys或Glu的氨基酸的线性氨基酸探针潜在地增加功效(WO 07/22774)。已知的肽-药物缀合物另外包括添加聚阳离子肽CPP(细胞渗透肽)，以改善跨过细胞脂质双层的转运。
[0007] 发明简述
[0008] 本发明提供包含天然或天然存在的肽或蛋白质或其生物活性变体以及一个或多个支链氨基酸探针(在本文中缩写为BAP)的肽类似物。先前尚未公开通过添加一个或多个支链氨基酸探针来修饰肽。
[0009] 在一些实施方案中，本文提供的肽类似物与天然肽相比具有一种或多种改善的性质。例如，在一些实施方案中，向肽添加一个或多个支链氨基酸探针潜在地改善所述肽的一种或多种特征，如
[0010] -改善或增加所述肽的固有效应(包括例如增加药理活性肽的活性、亲和性和/或功效；改善对一种或多种相关受体的结合和/或活化)；
[0011] -改变所述肽的固有效应(包括例如改变受体结合谱)，或
[0012] -改善或改变所述肽的外部效应(包括例如增加的稳定性、减少的降解、被改变的构型和/或被改变的溶解性)。
[0013] 因此，本发明涉及一种包含肽和一个或多个支链氨基酸探针的肽类似物，[0014] 其中所述支链氨基酸探针包含第一氨基-烷基氨基酸残基，
[0015] 所述第一氨基-烷基氨基酸残基任选地共价连接至第二氨基-烷基氨基酸残基，或共价连接至第二和第三氨基-烷基氨基酸残基，以形成具有2或3个氨基-烷基氨基酸残基的直链，
[0016] 其中所述第一、第二和/或第三氨基-烷基氨基酸残基中的一个或多个的侧链各自通过将独立地选自由以下组成的组的分子附接至侧链氨基而被修饰：AAAq-AAA；(aa3)p-AAAq；AAAq-(aa3)p；[(aa3)-AAA]p和[AAA-(aa3)]p；
[0017] 其中q为选自0、1、2和3的数字；p为选自1、2和3的数字；AAA为氨基-烷基氨基酸残基；且(aa3)为独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基，
[0018] 其中所述氨基-烷基氨基酸残基任选地被乙酰化，
[0019] 其中所述第一氨基-烷基氨基酸残基共价连接至所述肽的N末端，共价连接至所述肽的C末端，和/或附接至所述肽内的氨基-烷基氨基酸残基的侧链氨基，
[0020] 前提条件是所述支链氨基酸探针由2至9个氨基酸残基组成。
[0022] 图1：支链氨基酸探针Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys-的示意图，示出第一氨基-烷基氨基酸残基为经由常规肽键附接至肽序列的N末端的赖氨酸残基(Lys1)，所述第一赖氨酸被乙酰化(COCH3)，且所述第一赖氨酸通过将另外两个赖氨酸残基(其中一个也被乙酰化(最外面的))附接至所述第一赖氨酸残基的ε-氨基而被修饰。
[0023] 发明详述
[0024] 肽类似物
[0025] 本发明的一个方面是提供通过添加一个或多个支链氨基酸探针而被修饰的肽类似物。所述肽类似物可以包含天然或天然存在的任何肽、多肽或蛋白质、或其生物活性变体或片段，它们通过添加一个或多个支链氨基酸探针(本文缩写为BAP)而被修饰。因此，在一个实施方案中，肽类似物为包含肽序列和一个或多个支链氨基酸探针的缀合物。
[0026] 术语‘肽类似物’和‘蛋白质类似物’可在本文中互换使用。术语‘肽’和‘蛋白质’可在本文中互换使用。术语‘肽’和‘肽序列’可在本文中互换使用。术语‘肽序列’和‘氨基酸序列’可在本文中互换使用。
[0027] 在一些实施方案中，本文提供的肽类似物具有某些改善的性质，例如就一种或多种受体的结合亲和力和/或活化而言。另外，在另一个实施方案中，本文提供的肽类似物较稳定，如，较不容易受到蛋白酶的影响。
[0028] 本发明的一个方面是提供包含肽和一个或多个支链氨基酸探针的肽类似物，[0029] 其中所述支链氨基酸探针包含第一氨基-烷基氨基酸残基，
[0030] 所述第一氨基-烷基氨基酸残基任选地共价连接至第二氨基-烷基氨基酸残基，或共价连接至第二和第三氨基-烷基氨基酸残基，以形成具有2或3个氨基-烷基氨基酸残基的直链，
[0031] 其中所述第一、第二和/或第三氨基-烷基氨基酸残基中的一个或多个的侧链各自通过将独立地选自由以下组成的组的分子附接至侧链氨基而被修饰：AAAq-AAA；(aa3)p-AAAq；AAAq-(aa3)p；[(aa3)-AAA]p和[AAA-(aa3)]p；
[0032] 其中q为选自0、1、2和3的数字；p为选自1、2和3的数字；AAA为氨基-烷基氨基酸残基；且(aa3)为独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基，
[0033] 其中所述氨基-烷基氨基酸残基任选地被乙酰化，
[0034] 其中所述第一氨基-烷基氨基酸残基共价连接至所述肽的N末端，共价连接至所述肽的C末端，和/或附接至所述肽内的氨基-烷基氨基酸残基的侧链氨基，
[0035] 前提条件是所述支链氨基酸探针由2至9个氨基酸残基组成。
[0036] 根据本发明，在一个实施方案中，氨基-烷基氨基酸残基共价连接至其它氨基-烷基氨基酸残基和/或肽意味着存在肽键。在一个实施方案中，共价连接意指通过肽键共价连接。在一个实施方案中，共价连接暗示存在肽键。
[0037] 肽键(酰胺键)是当一个分子的羧基与另一个分子的氨基反应，导致释放H2O分子时在两个分子之间形成的共价化学键。所述过程通常发生在氨基酸之间。
[0038] 根据本发明，氨基-烷基氨基酸残基(或AAA)各自可为相同(一致)或不同(不一致)。
[0039] 支链氨基酸探针
[0040] 氨基-烷基氨基酸残基
[0041] 根据本发明，‘氨基-烷基氨基酸残基’(或AAA)为具有常规胺(-NH2)和羧酸(-COOH)官能团以及附接至第一(α-)碳原子的侧链的氨基酸，其中所述侧链包含烷基(-CnH2n+1)和氨基(NH2)；在一个实施方案中，所述侧链包含氨基-烷基(-CnH2nNH2)。
[0042] 因此，氨基-烷基氨基酸残基(或AAA)为具有侧链的氨基酸，所述侧链包含氨基-烷基(-CnH2nNH2)或由其组成，在一个实施方案中表示为侧链氨基-烷基。
[0043] 在一个实施方案中，侧链烷基衍生自由以下组成的组：甲基(CH3-)、乙基(C2H5-)、丙基(C3H7-)、丁基(C4H9-)、戊基(C5H11-)、己基(C6H13-)、庚基(C7H15-)、辛基(C8H17-)、壬基(C9H19-)、癸基(C10H21-)、十一烷基(C11H23-)和十二烷基(C12H25-)。
[0044] 在一个实施方案中，所述氨基-烷基氨基酸残基的侧链氨基(NH2)是甲胺的胺、乙胺的胺、丙胺的胺、正丁胺的胺、戊胺的胺、正己胺的胺、庚胺的胺、辛胺的胺、壬胺的胺、癸胺的胺、十一胺的胺、或十二胺的胺。
[0045] 在一个实施方案中，根据本发明的侧链氨基-烷基选自由以下组成的组：甲胺(-CH2NH2)、乙胺(-C2H4NH2)、丙胺(-C3H6NH2)、正丁胺(--C4H8NH2)、戊胺(-C5H10NH2)、正己胺(-C6H12NH2)、庚胺(-C7H14NH2)、辛胺(-C8H16NH2)、壬胺(-C9H18NH2)、癸胺(-C10H20NH2)、十一胺(-C11H22NH2)和十二胺(-C12H24NH2)。
[0046] 在一个实施方案中，所述第一、第二和/或第三氨基-烷基氨基酸残基的侧链氨基(NH2)各自通过向其附接分子而被修饰。
[0047] 在一个实施方案中，所述氨基-烷基氨基酸残基的侧链氨基选自由以下组成的组：
[0048] β(beta)氨基(侧链中1个亚甲基；甲胺)；
[0049] γ(gamma)氨基(侧链中2个亚甲基，乙胺)；
[0050] δ(delta)氨基(侧链中3个亚甲基，丙胺)；＝鸟氨酸
[0051] ε(epsilon)氨基(侧链中4个亚甲基；正丁胺)；＝赖氨酸
[0052] ζ(zeta)氨基(侧链中5个亚甲基；戊胺)；
[0053] η(eta)氨基(侧链中6个亚甲基；正己胺)；
[0054] θ(theta)氨基(侧链中7个亚甲基；庚胺)；
[0055] ι(iota)氨基(侧链中8个亚甲基；辛胺)；
[0056] κ(kappa)氨基(侧链中9个亚甲基；壬胺)；
[0057] λ(lambda)氨基(侧链中10个亚甲基；癸胺)；
[0058] μ(mu)氨基(侧链中11个亚甲基；十一胺)；和
[0059] ν(nu)氨基(侧链中12个亚甲基；十二胺)。
[0060] 例如，ε-氨基附接至从α-碳开始(包括)的第五个碳，所述α-碳附接至羧基(C＝OOH)基团。
[0061] 其中侧链为正丁胺且侧链氨基为ε(epsilon)氨基的氨基-烷基氨基酸残基为赖氨酸(Lys，K)。
[0062] 同样地，δ-氨基附接至从α-碳开始的第四个碳。
[0063] 其中侧链为丙胺且侧链氨基为δ(delta)氨基的氨基-烷基氨基酸残基为鸟氨酸(Orn)。
[0066] 因而，本发明的氨基-烷基氨基酸残基在一个实施方案中各自呈L-或D-构型。在一个实施方案中，氨基-烷基氨基酸残基呈L-构型。
[0067] 在一个实施方案中，本发明的氨基-烷基氨基酸残基单独地选自由赖氨酸和鸟氨酸组成的组。
[0068] 在一个实施方案中，本发明的氨基-烷基氨基酸残基单独地选自由L-赖氨酸、D-赖氨酸、L-鸟氨酸和D-鸟氨酸组成的组。
[0069] 在一个实施方案中，本发明的氨基-烷基氨基酸残基选自由L-赖氨酸和L-鸟氨酸组成的组。
[0070] 在一个实施方案中，本发明的氨基-烷基氨基酸残基选自由L-赖氨酸和D-赖氨酸组成的组。
[0071] 在一个实施方案中，本发明的氨基-烷基氨基酸残基选自由L-鸟氨酸和D-鸟氨酸组成的组。
[0072] 在一个实施方案中，提供了一种包含肽和一个或多个支链氨基酸探针的肽类似物，
[0073] 其中所述支链氨基酸探针包含选自赖氨酸和鸟氨酸的第一氨基酸残基，
[0074] 所述第一氨基酸残基任选地共价连接至选自赖氨酸或鸟氨酸的第二或者第二和第三氨基酸残基，以形成具有2个或3个赖氨酸或鸟氨酸残基的直链。
[0075] 其中所述第一、第二和/或第三赖氨酸或鸟氨酸残基中的一个或多个的侧链通过将独立地选自由以下组成的组的分子附接至δ-氨基(鸟氨酸)或ε-氨基而被修饰：
[0076] Lysq-Lys；(aa3)p-Lysq；Lysq-(aa3)p；[(aa3)-Lys]p；[Lys-(aa3)]p；
[0077] Ornq-Orn；(aa3)p-Ornq；Ornq-(aa3)p；[(aa3)-Orn]p和[Orn-(aa3)]p；
[0078] Ornp-Lysp；Lysp-Ornp；[Orn-Lys]p和[Lys-Orn]p；
[0079] 其中q为选自0、1、2和3的数字；p为选自1、2和3的数字；且(aa3)为独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基，
[0080] 其中所述赖氨酸和鸟氨酸残基任选地被乙酰化，
[0081] 其中所述赖氨酸和鸟氨酸残基呈L-或D-构型，
[0082] 其中所述第一赖氨酸或鸟氨酸残基共价连接至所述肽的N末端，共价连接至所述肽的C末端，和/或附接至所述肽内的赖氨酸残基的ε-氨基或鸟氨酸残基的δ-氨基，[0083] 前提条件是所述支链氨基酸探针由2至9个氨基酸残基组成。
[0084] 在一个实施方案中，提供了一种包含肽和一个或多个支链氨基酸探针的肽类似物，
[0085] 其中所述支链氨基酸探针包含第一赖氨酸残基，
[0086] 所述第一赖氨酸残基任选地共价连接至第二或者第二和第三赖氨酸残基，以形成具有2个或3个赖氨酸残基的直链，
[0087] 其中所述第一、第二和/或第三赖氨酸残基中的一个或多个的侧链通过将独立地选自由以下组成的组的分子附接至ε-氨基而被修饰：Lysq-Lys；(aa3)p-Lysq；Lysq-(aa3)p；[(aa3)-Lys]p；[Lys-(aa3)]p；其中q为选自0、1、2和3的数字；p为选自1、2和3的数字；且(aa3)为独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基，
[0088] 其中所述赖氨酸残基任选地被乙酰化，
[0089] 其中所述赖氨酸残基呈L-或D-构型，
[0090] 其中所述第一赖氨酸残基共价连接至所述肽的N末端，共价连接至所述肽的C末端，和/或附接至所述肽内的赖氨酸残基的ε-氨基，
[0091] 前提条件是所述支链氨基酸探针由2至9个氨基酸残基组成。
[0092] 使探针分支
[0093] 根据本发明的支链氨基酸探针在一个实施方案中由2至9个氨基酸残基组成。
[0094] 在一个实施方案中，支链氨基酸探针由2至3个氨基酸残基，如3至4个氨基酸残基，例如4至5个氨基酸残基，如5至6个氨基酸残基，例如6至7个氨基酸残基，如7至8个氨基酸残基，例如8至9个氨基酸残基组成。
[0095] 在一个实施方案中，支链氨基酸探针由2个氨基酸残基，如3个氨基酸残基，例如4个氨基酸残基，如5个氨基酸残基，例如6个氨基酸残基，如7个氨基酸残基，例如8个氨基酸残基，如9个氨基酸残基组成。
[0096] 在一个实施方案中，支链氨基酸探针包含第一氨基-烷基氨基酸残基(也表示AAA1)，所述第一氨基-烷基氨基酸残基连接至肽，以提供根据本发明的肽类似物。
[0097] 在一个实施方案中，一个或多个支链氨基酸探针(其中的每一个)的第一氨基-烷基氨基酸共价连接至所述肽的N末端，共价连接至所述肽的C末端，和/或附接至所述肽内的氨基-烷基氨基酸残基的侧链氨基。
[0098] 在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第一氨基-烷基氨基酸被乙酰化。
[0099] 在一个实施方案中，所述第一氨基-烷基氨基酸残基共价连接至第二氨基-烷基氨基酸残基，以形成具有2个氨基-烷基氨基酸残基的直链。
[0100] 在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第二氨基-烷基氨基酸被乙酰化。
[0101] 在一个实施方案中所述第一氨基-烷基氨基酸残基共价连接至第二和(共价连接至)第三氨基-烷基氨基酸残基，以形成具有3个氨基-烷基氨基酸残基的直链。在这种情况下，应该理解，第一氨基-烷基氨基酸残基可以具有都附接在它的胺基或都附接至它的羧酸基团的第二和第三氨基-烷基氨基酸残基；或者它可具有附接在它的胺基的第二氨基-烷基氨基酸残基和附接至它的羧酸基团的第三氨基-烷基氨基酸残基。
[0102] 在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第三氨基-烷基氨基酸被乙酰化。
[0103] 第二和第三氨基-烷基氨基酸残基可分别表示为AAA2和AAA3。
[0104] 在一个实施方案中，所述第一、第二和/或第三氨基-烷基氨基酸残基中的每一个为具有选自由以下组成的组的侧链氨基-烷基的氨基酸：甲胺(-CH2NH2)、乙胺(-C2H4NH2)、丙胺(-C3H6NH2)、正丁胺(--C4H8NH2)、戊胺(-C5H10NH2)、正己胺(-C6H12NH2)、庚胺(-C7H14NH2)、辛胺(-C8H16NH2)、壬胺(-C9H18NH2)、癸胺(-C10H20NH2)、十一胺(-C11H22NH2)和十二胺(-C12H24NH2)。
[0105] 在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第一、第二和/或第三氨基-烷基氨基酸中的每一个单独地选自由L-赖氨酸、D-赖氨酸、L-鸟氨酸和D-鸟氨酸组成的组。
[0106] 在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第一、第二和第三氨基-烷基氨基酸中的每一个为赖氨酸残基(包括L-赖氨酸和D-赖氨酸)。
[0107] 在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第一、第二和第三氨基-烷基氨基酸中的每一个都被乙酰化(Ac-AAA)(COCH3)。
[0108] 在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第一、第一和第二和/或第一、第二和第三氨基-烷基氨基酸残基被称为支链氨基酸探针的氨基-烷基氨基酸主链(AAA1、AAA1-2、AAA1-3)。
[0109] 在一个实施方案中，第一、第二和第三氨基-烷基氨基酸残基为赖氨酸残基。在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第一、第一和第二和/或第一、第二和第三赖氨酸残基被称为支链氨基酸探针的赖氨酸主链(Lys1、Lys1-2、Lys1-3)。
[0110] 在一个实施方案中，支链氨基酸探针的赖氨酸主链的第一赖氨酸残基、或第二赖氨酸残基、或第三赖氨酸残基、或第一和第二赖氨酸残基、或第一和第三赖氨酸残基、或第二和第三赖氨酸残基、或第一、第二和第三赖氨酸残基被乙酰化(Ac-Lys)。
[0111] 在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第一、第二和第三赖氨酸残基中的每一个都被乙酰化(Ac-Lys)。
[0112] 在一个实施方案中，所述第一、第二和/或第三氨基-烷基氨基酸残基中的每一个中的一个或多个的侧链通过将独立地选自由以下组成的组的分子附接至侧链氨基而被修饰：AAAq-AAA；(aa3)p-AAAq；AAAq-(aa3)p；[(aa3)-AAA]p和[AAA-(aa3)]p；其中q为选自0、1、2和3的数字；p为选自1、2和3的数字；AAA为氨基-烷基氨基酸残基；且(aa3)为独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基。
[0113] 在一个实施方案中，所述第一、第二和/或第三氨基-烷基氨基酸残基中的每一个中的一个或多个的侧链通过将独立地选自由以下组成的组附接至侧链氨基而被修饰：
[0114] Lysq-Lys；(aa3)p-Lysq；Lysq-(aa3)p；[(aa3)-Lys]p；[Lys-(aa3)]p；
[0115] Ornq-Orn；(aa3)p-Ornq；Ornq-(aa3)p；[(aa3)-Orn]p和[Orn-(aa3)]p；
[0116] Ornp-Lysp；Lysp-Ornp；[Orn-Lys]p和[Lys-Orn]p；
[0117] 其中q为选自0、1、2和3的数字；p为选自1、2和3的数字；且(aa3)为独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基。
[0118] 在一个实施方案中所述第一、第二和/或第三氨基-烷基氨基酸残基中的每一个中的一个或多个的侧链通过将独立地选自由以下组成的组的分子附接至侧链氨基而被修饰：Lysq-Lys；(aa3)p-Lysq；Lysq-(aa3)p；[(aa3)-Lys]p和[Lys-(aa3)]p；其中q为选自0、1、2和3的数字；p为选自1、2和3的数字；Lys为选自L-Lys和D-Lys的赖氨酸残基；且(aa3)为独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基。
[0119] 在一个实施方案中，赖氨酸主链的所述第一、第二和/或第三赖氨酸残基中的每一个中的一个或多个的侧链通过将独立地选自由以下组成的组的分子附接至侧链的ε-氨基而被修饰：Lysq-Lys；(aa3)p-Lysq；Lysq-(aa3)p；[(aa3)-Lys]p和[Lys-(aa3)]p；其中q为选自0、1、2和3的数字；p为选自1、2和3的数字；Lys为选自L-Lys和D-Lys的赖氨酸残基；且(aa3)为独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基。
[0120] 在一个实施方案中，赖氨酸主链的所述第一、第二和/或第三赖氨酸残基中的每一个中的一个或多个的侧链通过将为Lysq-Lys的分子附接至侧链的ε-氨基而被修饰；其中q为选自0、1、2和3的数字，且Lys为选自L-Lys和D-Lys的赖氨酸残基。
[0121] 在一个实施方案中，i)所述第一、第二和/或第三氨基-烷基氨基酸残基中的一个、ii)所述第一、第二和/或第三氨基-烷基氨基酸残基中的两个、或iii)第一、第二和第三氨基-烷基氨基酸残基中的所有三个的侧链通过将如本文所定义的分子附接至侧链氨基而被修饰。
[0122] 在一个实施方案中，i)第一氨基-烷基氨基酸残基、ii)第二氨基-烷基氨基酸残基、iii)第三氨基-烷基氨基酸残基、iv)第一和第二氨基-烷基氨基酸残基、v)第一和第三氨基-烷基氨基酸残基、vi)第二和第三氨基-烷基氨基酸残基、或vii)第一、第二和第三氨基-烷基氨基酸残基的侧链各自通过将如本文所定义的分子附接至侧链氨基而被修饰。
[0123] 在一个实施方案中，本发明的支链氨基酸探针的赖氨酸主链的第一赖氨酸残基、或第二赖氨酸残基、或第三赖氨酸残基、或第一和第二赖氨酸残基、或第一和第三赖氨酸残基、或第二和第三赖氨酸残基、或第一、第二和第三赖氨酸残基各自通过向ε-氨基附接一个分子而被修饰。
[0124] 在一个实施方案中，待附接至支链氨基酸探针的赖氨酸主链的一个或多个赖氨酸残基的ε-氨基的分子独立地选自由以下组成的组：Lysq-Lys；(aa3)p-Lysq；Lysq-(aa3)p；[(aa3)-Lys]p和[Lys-(aa3)]p，其中q为选自0、1、2和3的数字；p为选自1、2和3的数字，且(aa3)为独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基。
[0125] 因而，在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第一赖氨酸残基、或第二赖氨酸残基、或第三赖氨酸残基、或第一和第二赖氨酸残基、或第一和第三赖氨酸残基、或第二和第三赖氨酸残基、或第一、第二和第三赖氨酸残基通过将独立地选自由以下组成的组的分子附接至ε-氨基而被修饰：Lysq-Lys；(aa3)p-Lysq；Lysq-(aa3)p；[(aa3)-Lys]p和[Lys-(aa3)]p，其中q为选自0、1、2和3的数字；p为选自1、2和3的数字，且(aa3)为独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基。
[0126] 在一个具体实施方案中，(aa3)为独立地选自Gly和Ala的氨基酸残基。在另一个实施方案中，(aa3)为Gly。
[0127] 在一个实施方案中，待附接至侧链氨基的分子另外被乙酰化。在一个实施方案中，所述分子独立地选自由以下组成的组：Ac-AAAq-AAA；Ac-(aa3)p-AAAq；Ac-AAAq-(aa3)p；Ac-[(aa3)-AAA]p和Ac-[AAA-(aa3)]p、和/或AAAq-AAAs；(aa3)p-AAAq；AAAq-(aa3)p；[(aa3)-AAA]p和[AAA-(aa3)]p。
[0128] 在一个实施方案中，所述分子独立地选自由以下组成的组：Ac-Ornq-Orn；Ac-(aa3)p-Ornq；Ac-Ornq-(aa3)p；Ac-[(aa3)-Orn]p；Ac-[Orn-(aa3)]p；Ac-Ornp-Lysp；Ac-Lysp-Ornp；Ac-[Orn-Lys]p和Ac-[Lys-Orn]p、和/或Ornq-Orn；(aa3)p-Ornq；Ornq-(aa3)p；[(aa3)-Orn]p和[Orn-(aa3)]p；Ornp-Lysp；Lysp-Ornp；[Orn-Lys]p和[Lys-Orn]p。
[0129] 因而，所述分子在一个实施方案中独立地选自由以下组成的组：Ac-Lysq-Lys；Ac-(aa3)p-Lysq；Ac-Lysq-(aa3)p；Ac-[(aa3)-Lys]p和Ac-[Lys-(aa3)]p、和/或Lysq-Lys；(aa3)p-Lysq；Lysq-(aa3)p；[(aa3)-Lys]p和[Lys-(aa3)]p。
[0130] 在一个具体实施方案中，待附接至侧链氨基的分子为AAAq-AAA，其中q为选自0、1、2和3的数字。
[0131] 因而，在一个实施方案中，支链氨基酸探针由2至9个氨基-烷基氨基酸残基组成。在一个实施方案中，所述2至9个氨基-烷基氨基酸残基单独地选自由L-赖氨酸、D-赖氨酸、L-鸟氨酸和D-鸟氨酸组成的组。
[0132] 在一个具体实施方案中，待附接至侧链氨基的分子为Lysq-Lys，其中q为选自0、1、2和3的数字。
[0133] 因而，在一个实施方案中，本发明的支链氨基酸探针由2至9个选自Lys和D-Lys的赖氨酸残基组成。
[0134] 在一个实施方案中，支链氨基酸探针包含最多1、2、3或4个选自Arg、His、Gly和Ala(aa3)的氨基酸，其中其余的氨基酸为氨基-烷基氨基酸残基。在另一个实施方案中，支链氨基酸探针包含最多1个Arg残基，和/或包含最多1个His残基，和/或包含最多1个Gly残基，和/或包含最多1个Ala残基。
[0135] 在一个实施方案中，待附接至第一、第二和/或第三氨基-烷基氨基酸残基中的一个或多个的侧链氨基的分子选自由以下组成的组：AAA、Ac-AAA、AAA-AAA、Ac-AAA-AAA、AAA-AAA-AAA、Ac-AAA-AAA-AAA、AAA-AAA-AAA-AAA、Ac-AAA-AAA-AAA-AAA、AAA-Gly-AAA、Ac-AAA-Gly-AAA、AAA-AAA-Gly、Ac-AAA-AAA-Gly、AAA-Gly、Ac-AAA-Gly、AAA-Ala-AAA、Ac-AAA-Ala-AAA、AAA-AAA-Ala、Ac-AAA-AAA-Ala、AAA-Ala、Ac-AAA-Ala、AAA-His-AAA、Ac-AAA-His-AAA、AAA-AAA-His、Ac-AAA-AAA-His、AAA-His、Ac-AAA-His、AAA-Arg-AAA、Ac-AAA-Arg-AAA、AAA-AAA-Arg、Ac-AAA-AAA-Arg、AAA-Arg和Ac-AAA-Arg；其中AAA为如本文所指定的氨基-烷基氨基酸残基(任选地各自被乙酰化)。上述AAA、Gly、Ala、His和Arg氨基酸残基可各自呈L-或D-构型。
[0136] 在一个实施方案中，待附接至第一、第二和/或第三氨基-烷基氨基酸残基中的一个或多个的侧链氨基的分子选自由以下组成的组：Lys、Ac-Lys、Lys-Lys、Ac-Lys-Lys、Lys-Lys-Lys、Ac-Lys-Lys-Lys、Lys-Lys-Lys-Lys、Ac-Lys-Lys-Lys-Lys、Lys-Gly-Lys、Ac-Lys-Gly-Lys、Lys-Lys-Gly、Ac-Lys-Lys-Gly、Lys-Gly、Ac-Lys-Gly、Lys-Ala-Lys、Ac-Lys-Ala-Lys、Lys-Lys-Ala、Ac-Lys-Lys-Ala、Lys-Ala、Ac-Lys-Ala、Lys-His-Lys、Ac-Lys-His-Lys、Lys-Lys-His、Ac-Lys-Lys-His、Lys-His、Ac-Lys-His、Lys-Arg-Lys、Ac-Lys-Arg-Lys、Lys-Lys-Arg、Ac-Lys-Lys-Arg、Lys-Arg和Ac-Lys-Arg。
[0137] 在一个具体实施方案中，待附接至第一、第二和/或第三赖氨酸残基中的一个或多个的ε-氨基的分子选自由以下组成的组：Lys、Ac-Lys、Lys-Lys、Ac-Lys-Lys、Lys-Lys-Lys、Ac-Lys-Lys-Lys、Lys-Lys-Lys-Lys、Ac-Lys-Lys-Lys-Lys、Lys-Gly-Lys、Ac-Lys-Gly-Lys、Lys-Lys-Gly、Ac-Lys-Lys-Gly、Lys-Gly、Ac-Lys-Gly、Lys-Ala-Lys、Ac-Lys-Ala-Lys、Lys-Lys-Ala、Ac-Lys-Lys-Ala、Lys-Ala、Ac-Lys-Ala、Lys-His-Lys、Ac-Lys-His-Lys、Lys-Lys-His、Ac-Lys-Lys-His、Lys-His、Ac-Lys-His、Lys-Arg-Lys、Ac-Lys-Arg-Lys、Lys-Lys-Arg、Ac-Lys-Lys-Arg、Lys-Arg和Ac-Lys-Arg。
[0138] 在一个具体实施方案中，本发明的支链氨基酸探针包含选自Lys和D-Lys的第一赖氨酸残基或由其组成，所述第一赖氨酸残基任选地被乙酰化，其中所述第一赖氨酸残基通过将选自由以下组成的组的分子附接至所述第一赖氨酸残基的ε-氨基而被修饰：Lys、Ac-Lys、Lys-Lys、Ac-Lys-Lys、Lys-Lys-Lys、Ac-Lys-Lys-Lys、Lys-Lys-Lys-Lys、Ac-Lys-Lys-Lys-Lys、Lys-Gly-Lys、Ac-Lys-Gly-Lys、Lys-Lys-Gly、Ac-Lys-Lys-Gly、Lys-Gly、Ac-Lys-Gly、Lys-Ala-Lys、Ac-Lys-Ala-Lys、Lys-Lys-Ala、Ac-Lys-Lys-Ala、Lys-Ala、Ac-Lys-Ala、Lys-His-Lys、Ac-Lys-His-Lys、Lys-Lys-His、Ac-Lys-Lys-His、Lys-His、Ac-Lys-His、Lys-Arg-Lys、Ac-Lys-Arg-Lys、Lys-Lys-Arg、Ac-Lys-Lys-Arg、Lys-Arg和Ac-Lys-Arg。
[0139] 在一个具体实施方案中，本发明的支链氨基酸探针包含各自选自Lys和D-Lys的第一和第二赖氨酸残基或由其组成，所述第一和第二赖氨酸残基各自任选地被乙酰化，其中i)所述第一赖氨酸残基、ii)所述第二赖氨酸残基、或iii)所述第一和第二残基各自通过将选自由以下组成的组的分子附接至所述赖氨酸残基的ε-氨基而被修饰：Lys、Ac-Lys、Lys-Lys、Ac-Lys-Lys、Lys-Lys-Lys、Ac-Lys-Lys-Lys、Lys-Lys-Lys-Lys、Ac-Lys-Lys-Lys-Lys、Lys-Gly-Lys、Ac-Lys-Gly-Lys、Lys-Lys-Gly、Ac-Lys-Lys-Gly、Lys-Gly、Ac-Lys-Gly、Lys-Ala-Lys、Ac-Lys-Ala-Lys、Lys-Lys-Ala、Ac-Lys-Lys-Ala、Lys-Ala、Ac-Lys-Ala、Lys-His-Lys、Ac-Lys-His-Lys、Lys-Lys-His、Ac-Lys-Lys-His、Lys-His、Ac-Lys-His、Lys-Arg-Lys、Ac-Lys-Arg-Lys、Lys-Lys-Arg、Ac-Lys-Lys-Arg、Lys-Arg和Ac-Lys-Arg。
[0140] 在一个具体实施方案中，本发明的支链氨基酸探针包含各自选自Lys和D-Lys的第一、第二和第三赖氨酸残基或由其组成，所述第一、第二和第三赖氨酸残基各自任选地被乙酰化，其中i)所述第一赖氨酸残基、ii)所述第二赖氨酸残基、iii)所述第三赖氨酸残基、iv)所述第一和第二赖氨酸残基、v)所述第一和第三赖氨酸残基、vi)所述第二和第三赖氨酸残基、或vii)所述第一、第二和第三赖氨酸残基各自通过将选自由以下组成的组的分子附接至所述赖氨酸残基的ε-氨基而被修饰：Lys、Ac-Lys、Lys-Lys、Ac-Lys-Lys、Lys-Lys-Lys、Ac-Lys-Lys-Lys、Lys-Lys-Lys-Lys、Ac-Lys-Lys-Lys-Lys、Lys-Gly-Lys、Ac-Lys-Gly-Lys、Lys-Lys-Gly、Ac-Lys-Lys-Gly、Lys-Gly、Ac-Lys-Gly、Lys-Ala-Lys、Ac-Lys-Ala-Lys、Lys-Lys-Ala、Ac-Lys-Lys-Ala、Lys-Ala、Ac-Lys-Ala、Lys-His-Lys、Ac-Lys-His-Lys、Lys-Lys-His、Ac-Lys-Lys-His、Lys-His、Ac-Lys-His、Lys-Arg-Lys、Ac-Lys-Arg-Lys、Lys-Lys-Arg、Ac-Lys-Lys-Arg、Lys-Arg和Ac-Lys-Arg。
[0141] 在一个实施方案中，支链氨基酸探针包含下式或由其组成：Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys1-(与Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys-一致)，其中Lys1为被乙酰化的第一赖氨酸残基，且(Ac-Lys-Lys)为附接至所述第一赖氨酸残基Ly1的ε-氨基的分子。图1示出这个化学式/结构。
[0142] 在一个实施方案中，支链氨基酸探针包含选自由以下组成的组的化学式或由其组成：Ac-(Ac-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Lys-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Gly-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Gly)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Gly)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Ala-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Ala)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Ala)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-His-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-His)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-His)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Arg-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Arg)Lys1-、和Ac-(Ac-Lys-Arg)Lys1-。
[0143] 更具体地说，在一个实施方案中，支链氨基酸探针包含选自由以下组成的组的化学式或由其组成：Ac-(Ac-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Lys-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Gly-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Gly)Lys1-和Ac-(Ac-Lys-Gly)Lys1-。
[0144] 在一个实施方案中，支链氨基酸探针包含下式或由其组成：Ac-(Ac-Lys)Lys2-Lys1-，其中Lys1为被乙酰化的第一赖氨酸残基，Lys2为经由肽键附接至Lys1的第二赖氨酸残基，且(Ac-Lys)为附接至所述第一赖氨酸残基Lys1的ε-氨基的分子。
[0145] 在一个实施方案中，支链氨基酸探针包含下式或由其组成：Ac-Lys2-(Ac-Lys)Lys1-，其中分子(Ac-Lys)附接至所述第二赖氨酸残基Lys2的ε-氨基。
[0146] 在一个实施方案中，支链氨基酸探针选自由以下组成的组：Ac-(Ac-Lys)Lys-Lys-、(Ac-Lys)Lys-Lys-、Ac-(Lys)Lys-Lys-、(Lys)Lys-Lys-；Ac-Lys-(Ac-Lys)Lys-、Lys-(Ac-Lys)Lys-、Ac-Lys-(Lys)Lys-、Lys-(Lys)Lys-；Ac-(Ac-Lys-Lys)-Lys-、(Ac-Lys-Lys)-Lys-、Ac-(Lys-Lys)-Lys-和(Lys-Lys)-Lys-。
[0147] 在一个实施方案中，支链氨基酸探针选自由以下组成的组：Ac-(Ac-Lys)Lys-、Ac-(Lys)Lys-和(Lys)Lys-。
[0148] 在一个实施方案中，支链氨基酸探针选自由以下组成的组：Ac-(Ac-Lys)Lys2-Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys2-Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Gly)Lys2-Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Lys)Lys2-Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Lys-Lys)Lys2-Lys1-、Ac-Lys2-(Ac-Lys)-Lys1-、Ac-Lys2-(Ac-Lys-Lys)-Lys1-、Ac-Lys2-(Ac-Lys-Gly)-Lys1-、Ac-Lys2-(Ac-Lys-Lys-Lys)-Lys1-、Ac-Lys2-(Ac-Lys-Lys-Lys-Lys)-Lys1-、Ac-(Ac-Lys)Lys2-(Ac-Lys-)-Lys1-、Ac-(Ac-Lys)Lys2-(Ac-Lys-Lys-)-Lys1-、和Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys2-(Ac-Lys-Lys-)-Lys1-。
[0149] 更具体地说，在一个实施方案中，支链氨基酸探针选自由以下组成的组：Ac-(Ac-Lys)Lys2-Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys2-Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Gly)Lys2-Lys1-、Ac-Lys2-(Ac-Lys)-Lys1-、Ac-Lys2-(Ac-Lys-Lys)-Lys1-、Ac-Lys2-(Ac-Lys-Gly)-Lys1-、Ac-(Ac-Lys)Lys2-(Ac-Lys-)-Lys1-、Ac-(Ac-Lys)Lys2-(Ac-Lys-Lys-)-Lys1-、和Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys2-(Ac-Lys-Lys-)-Lys1-。
[0150] 在一个实施方案中，支链氨基酸探针选自由以下组成的组：Ac-Lys3-Lys2-(Ac-Lys)Lys1-、Ac-Lys3-(Ac-Lys)Lys2-Lys1-、Ac-(Ac-Lys)Lys3-Lys2-Lys1-、Ac-Lys3-(Ac-Lys)Lys2-(Ac-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys)Lys3-(Ac-Lys)Lys2-Lys1-、和Ac-(Ac-Lys)Lys3-Lys2-(Ac-Lys)Lys1-。
[0151] 在一个具体实施方案中，支链氨基酸探针选自由以下组成的组：Ac-(Ac-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Lys-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Gly-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Gly)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Gly)Lys1-、Ac-(Ac-Lys)Lys2-Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys2-Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Gly)Lys2-Lys1-、Ac-Lys2-(Ac-Lys)-Lys1-、Ac-Lys2-(Ac-Lys-Lys)-Lys1-、Ac-Lys2-(Ac-Lys-Gly)-Lys1-、Ac-(Ac-Lys)Lys2-(Ac-Lys-)-Lys1-、Ac-(Ac-Lys)Lys2-(Ac-Lys-Lys-)-Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys2-(Ac-Lys-Lys-)-Lys1-、Ac-Lys3-Lys2-(Ac-Lys)Lys1-、Ac-Lys3-(Ac-Lys)Lys2-Lys1-、Ac-(Ac-Lys)Lys3-Lys2-Lys1-、Ac-Lys3-(Ac-Lys)Lys2-(Ac-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys)Lys3-(Ac-Lys)Lys2-Lys1-、和Ac-(Ac-Lys)Lys3-Lys2-(Ac-Lys)Lys1-。
[0152] 在一个具体实施方案中，支链氨基酸探针由3个赖氨酸残基(选自L-Lys和D-Lys)组成。
[0153] 在另一个实施方案中，支链氨基酸探针由2个赖氨酸残基(选自L-Lys和D-Lys)组成。
[0154] 在一个具体实施方案中，支链氨基酸探针由选自Lys和D-Lys的第一和第二赖氨酸残基组成，其中所述第一和第二赖氨酸残基中的一个或两个通过将一个选自Lys和D-Lys的赖氨酸残基附接至所述第一和/或第二赖氨酸残基的ε-氨基而被修饰；其中所述赖氨酸残基中的每一个任选地被乙酰化。
[0155] 在一个具体实施方案中，支链氨基酸探针由选自Lys和D-Lys的第一赖氨酸残基组成，其中所述第一赖氨酸残基通过将两个选自Lys和D-Lys的赖氨酸残基附接至所述第一赖氨酸残基的ε-氨基而被修饰；其中所述赖氨酸残基中的每一个任选地被乙酰化。
[0156] 连接支链氨基酸探针和肽
[0157] 根据本发明，一个或多个支链氨基酸探针中的每一个的第一氨基-烷基氨基酸残基共价连接至肽的N末端，共价连接至所述肽的C末端，和/或附接至待根据本发明修饰的肽内的氨基-烷基氨基酸残基的侧链氨基。
[0158] 将一个或多个支链氨基酸探针附接至肽得到肽/探针缀合物。
[0159] 应当理解，共价结合或连接至肽的N末端意指本发明的支链氨基酸探针通过所述肽的最N末端氨基酸与支链氨基酸探针的第一氨基-烷基氨基酸残基间的肽键连接。
[0160] 同样，应当理解，共价结合或连接至肽的C末端意指本发明的支链氨基酸探针通过所述肽的最C末端氨基酸与支链氨基酸探针的第一氨基-烷基氨基酸残基间的肽键连接。
[0161] 此外，应当理解，支链氨基酸探针在一个实施方案中附接至所述肽序列内的氨基-烷基氨基酸残基的侧链氨基。
[0162] 在一个具体实施方案中，所述肽序列内的所述氨基-烷基氨基酸残基选自由鸟氨酸残基和赖氨酸残基组成的组。在一个具体实施方案中，所述肽序列内的所述氨基-烷基氨基酸残基为赖氨酸残基。
[0163] 在一个实施方案中，本发明的支链氨基酸探针的第一氨基-烷基氨基酸残基附接至所述肽内的鸟氨酸残基的δ-氨基或所述肽内的赖氨酸残基的ε-氨基。
[0164] 在一个实施方案中，本发明的支链氨基酸探针的第一氨基-烷基氨基酸残基附接至所述肽内的赖氨酸残基的ε-氨基。
[0165] 应当理解，所述肽序列内的氨基-烷基氨基酸残基意指所述氨基-烷基氨基酸残基不形成支链氨基酸探针本身的一部分，而是出现在所述肽的现有氨基酸序列内的残基。所述氨基-烷基氨基酸残基可位于所述肽的任何位置，即它可为所述肽的第一氨基酸、所述肽的第二氨基酸、所述肽的第三氨基酸、所述肽的第四氨基酸等，直到所述肽的最后一个氨基酸残基。
[0166] 根据本发明，包含一个或多个支链氨基酸探针的肽类似物意指所述肽类似物在一个实施方案中包含1个支链氨基酸探针，如2个支链氨基酸探针，例如3个支链氨基酸探针，如4个支链氨基酸探针，例如5个支链氨基酸探针，如6个支链氨基酸探针，例如7个支链氨基酸探针，如8个支链氨基酸探针，例如9个支链氨基酸探针，如10个支链氨基酸探针。
[0167] 原则上，肽类似物可以包含任何数量的支链氨基酸探针，只要它们可附接至所述肽(N末端、C末端和/或所述肽序列内的一种或多种氨基-烷基氨基酸残基。
[0168] 在本发明的一个实施方案中，本发明的肽类似物包含1个支链氨基酸探针。
[0169] 在一个实施方案中，所述肽类似物包含1个支链氨基酸探针，所述支链氨基酸探针共价结合至所述肽的N末端。
[0170] 在一个实施方案中，所述肽类似物包含1个支链氨基酸探针，所述支链氨基酸探针共价结合至所述肽的C末端。
[0171] 在一个实施方案中，肽类似物包含1个支链氨基酸探针，所述支链氨基酸探针附接至所述肽序列内的氨基-烷基氨基酸残基的侧链氨基。
[0172] 在一个实施方案中，肽类似物包含超过一种(两种或更多种)支链氨基酸探针。在其中肽类似物包含超过一个支链氨基酸探针的实施方案中，应当理解，所述超过一个支链氨基酸探针可各自为相同(一致)或不同(不一致)。
[0173] 在本发明的一个实施方案中，本发明的肽类似物包含2个支链氨基酸探针。
[0174] 在一个实施方案中，肽类似物包含2个支链氨基酸探针，其中一个支链氨基酸探针共价结合至所述肽的N末端，且另一个支链氨基酸探针共价结合至所述肽的C末端。
[0175] 在一个实施方案中，肽类似物包含2个支链氨基酸探针，其中一个支链氨基酸探针共价结合至所述肽的N末端，且另一个支链氨基酸探针附接至所述肽序列内的氨基-烷基氨基酸残基的侧链氨基。
[0176] 在一个实施方案中，肽类似物包含2个支链氨基酸探针，其中一个支链氨基酸探针共价结合至所述肽的C末端，且另一个支链氨基酸探针附接至所述肽序列内的氨基-烷基氨基酸残基的侧链氨基。
[0177] 在一个实施方案中，肽类似物包含2个支链氨基酸探针，其中两个支链氨基酸探针中的每一个附接至所述肽序列内的不同(或单独)的氨基-烷基氨基酸残基的侧链氨基。
[0178] 在本发明的一个实施方案中，本发明的肽类似物包含3个支链氨基酸探针。
[0179] 在一个实施方案中，本发明的肽类似物包含3个支链氨基酸探针，其中第一支链氨基酸探针共价结合至所述肽的N末端，第二支链氨基酸探针共价结合至所述肽的C末端，且第三支链氨基酸探针附接至所述肽序列内的氨基-烷基氨基酸残基的侧链氨基。
[0180] 在一个实施方案中，本发明的肽类似物包含3个支链氨基酸探针，其中第一支链氨基酸探针共价结合至所述肽的N末端，且第二和第三支链氨基酸探针各自附接至所述肽序列内的不同氨基-烷基氨基酸残基的侧链氨基。
[0181] 在一个实施方案中，本发明的肽类似物包含3个支链氨基酸探针，其中第一支链氨基酸探针共价结合至所述肽的C末端，且第二和第三支链氨基酸探针各自附接至所述肽序列内的不同氨基-烷基氨基酸残基的侧链氨基。
[0182] 在一个实施方案中，本发明的肽类似物包含3个支链氨基酸探针，其中第一、第二和第三支链氨基酸探针的每一个附接至所述肽序列内的不同氨基-烷基氨基酸残基的侧链氨基。
[0183] 类似物的肽部分
[0184] 根据本发明的肽类似物包含肽和一个或多个支链氨基酸探针。
[0185] 在一个实施方案中，肽类似物的肽为任何肽、多肽或蛋白质，所述肽类似物的肽在一个实施方案中为天然或天然存在的，所述肽类似物的肽在一个实施方案中为天然存在的肽的生物活性变体。
[0186] 在一个实施方案中，所述肽为较大多肽或蛋白质的片段。
[0187] 在一个实施方案中，所述肽为包含所述蛋白质的1-50个最N末端氨基酸，如所述蛋白质的1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-12、12-14、14-16、16-18、18-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50个最N末端氨基酸的N末端片段。
[0188] 在一个实施方案中，所述肽为包含所述蛋白质的1-50个最C末端氨基酸，如所述蛋白质的1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-12、12-14、14-16、16-18、18-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50个最C末端氨基酸的C末端片段。
[0189] 在一个实施方案中，所述肽为包含所述蛋白质的1-50个连续氨基酸残基，如所述蛋白质的1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-12、12-14、14-16、16-18、18-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50个连续氨基酸残基的片段。
[0190] 在一些实施方案中，本文提供的肽类似物与天然肽相比具有一种或多种改善的性质。
[0191] 肽为源自氨基酸缩合的单一线性聚合物链。肽可基于大小与蛋白质区分开来，且作为任意基准可理解为包含约75(如50)个或更少氨基酸残基。
[0192] 在一个实施方案中，本发明肽类似物的肽部分为具有(包含或由其组成)2至100个氨基酸残基，如2至3个，例如3至4个，如4至5个，例如5至6个，如6至7个，例如7至8个，如8至9个，例如9至10个，如10至12个，例如12至14个，如14至16个，例如16至18个，如18至20个，例如20至25个，如25至30个，例如30至40个，如40至50个，例如50至75个，如75至100个氨基酸残基的肽。
[0193] 在一个实施方案中，本发明的肽为具有少于50个氨基酸残基，如少于40个，例如少于30个氨基酸残基的肽。
[0194] 天然肽中的氨基酸残基的序列是由基因序列决定，所述序列以遗传密码编码。一般而言，遗传密码指定20种天然掺入多肽的标准氨基酸(蛋白原)：Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Tyr、Thr、Trp、Val，且其中的2种通过独特的合成机制掺入蛋白质中：Sec(硒代半胱氨酸或U)和Pyl(吡咯赖氨酸，O)。这些全部为L-立体异构体。
[0195] 除22种标准或天然氨基酸以外，还有许多其它非天然存在的氨基酸(非蛋白原或非标准)。它们无法在蛋白质中找到，也不是通过标准细胞机器直接且孤立地产生。非标准氨基酸通常通过修饰标准氨基酸而形成，如翻译后修饰。非天然氨基酸残基的实例为Nle(正亮氨酸)、Orn(鸟氨酸，去胍基化的精氨酸)、Nal(β-2-萘基-丙氨酸)、D-Nal(β-2-萘基-D-丙氨酸)、D-Arg、D-Trp、D-Phe和D-Val。
[0196] 根据本发明的任何氨基酸都可以呈L-或D-构型。如果没有指定，优选地意指提及L-异构形式。
[0197] 术语肽还包括通过化学或酶催化反应引入的翻译后修饰，这是本领域内所已知的。如果需要，此类翻译后修饰可以在分配之前引入。还有，功能等效物可以包含以下化学修饰，如泛素化、加标记(例如，用放射性核素、各种酶等)、聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生化)或通过插入(或通过化学合成取代)氨基酸如鸟氨酸，这些情况通常不出现在人蛋白质中。
[0198] 本发明还涵盖具有N末端烷基化和C末端酯化的肽。功能等效物还包括与相同分子(包括二聚体或无关化学部分)形成的糖基化和共价或聚集缀合物。此类功能等效物通过本领域内已知的方式将官能连接至见于片段的基团(包括连接N末端和C末端中的任何一个或两个)而制备。
[0199] 在一些实施方案中，通过乙酰化，如N末端乙酰化修饰根据本发明的方法的肽。在一些实施方案中，通过C末端酰胺化修饰根据本发明的肽。
[0200] 本发明的肽可为技术人员已知具有生物效应的任何肽。在一个实施方案中，将支链氨基酸探针添加至所考虑的肽将影响所述生物效应，如增强或改善生物效应。
[0201] 在一个实施方案中，本发明的肽的变体为通过一个或多个氨基酸残基的断裂(如N末端片段、C末端片段或肽内的片段)、删除、插入、突变或取代(如保守氨基酸取代或引入非蛋白原氨基酸残基)和/或如通过乙酰化、通过插入D-构型的氨基酸或技术人员已知的其它修饰调节肽，从天然肽衍生的肽。
[0202] 在一个实施方案中，本发明的肽类似物包含一个或多个支链氨基酸探针和具有免疫调节效应(免疫调节肽)的肽，在一个实施方案中具有抗炎和/或促消退效应的肽。
[0203] 在一个实施方案中，本发明的肽类似物包含一个或多个支链氨基酸探针和具有代谢效应的肽。
[0204] 在一个实施方案中，本发明的肽类似物包含一个或多个支链氨基酸探针和具有心血管效应的肽。
[0205] 在一个实施方案中，本发明的肽类似物包含一个或多个支链氨基酸探针和具有器官保护和/或组织保护效应的肽。
[0206] 在一个实施方案中，肽类似物包含肽激素、神经递质、神经肽、脂肽、酶、生长因子、代谢原(metabologen)、转录因子、受体激动剂、受体拮抗剂、配体或载体蛋白。
[0207] 在一个实施方案中，肽类似物包含选自由以下组成的组的肽：VIP(血管活性肠肽；PHM27)、PACAP(垂体腺苷酸环化酶活化肽)、肽PHI 27(肽组氨酸异亮氨酸27)、GHRH 1-24(生长激素释放激素1-24)、胰高血糖素、分泌素、肠高血糖素前体、GIP(胃抑肽)、前白蛋白或甲状腺素运转蛋白(TTR)、肽HI-27和生长激素释放因子(GHRF或GHRH)、肠促胰岛素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、GLP-1(7-37)、GLP-1(7-33)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)和艾塞那肽(exendin-4)或其变体。
[0208] 在一个实施方案中，肽类似物包含选自由以下组成的组的肽：促生长素(如促生长素或生长激素(GH))、促甲状腺素(如促甲状腺激素(TSH))、促皮质素(如促肾上腺皮质激素(ACTH)和β-内啡肽)、催乳激素(如催乳素(PRL)、促性腺激素(如促黄体生成激素(LH)和促卵泡激素(FSH))、抗利尿激素(ADH或加压素)、催产素、生长激素释放激素(GHRH)、生长抑素、促甲状腺素释放激素(TRH)、促皮质素释放激素(CRH)、促性腺激素释放激素(GnRH)、CREB(cAMP反应元件结合蛋白)、乳三肽、异亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸(IPP)和缬氨酸-脯氨酸-脯氨酸(VPP)及其变体。
[0209] 在一个实施方案中，肽类似物包含胰多肽相关肽，包括NPY(神经肽Y)、PYY(肽YY)、APP(禽胰多肽)和PPY/PP(胰多肽)或其变体。
[0210] 在一个实施方案中，肽类似物包含阿片样肽(或阿片样多肽激素/阿片样神经肽)，包括阿黑皮素原(POMC)肽(包括阿黑皮素原的N末端肽(NPP或促γ-MSH)、γ-MSH、促皮质素(促肾上腺皮质激素或ACTH)、α-MSH、促皮质素样中叶肽(CLIP)、β-促脂解素(β-LPH)、促脂解素γ(γ-LPH)、β-MSH、β-内啡肽和[Met]脑啡肽)；脑啡肽五肽(Met-脑啡肽和Leu-脑啡肽)、强啡肽原肽、强啡肽(强啡肽A、强啡肽B、α-新内啡肽、β-新内啡肽和大强啡肽)、内啡肽类(β-内啡肽、α-内啡肽、γ-内啡肽、α-新内啡肽和β-新内啡肽)、Adrenorphin、Amidorphin、Leumorphin、孤啡肽、Opiorphin和Spinorphin或其变体。
[0211] 在一个实施方案中，肽类似物包含神经肽或神经递质，包括激肽、速激肽神经肽(包括物质P、肛褶蛙肽、神经激肽A(NKA)、神经激肽B(NKB)、章鱼唾腺精(eledoisin)和泡蛙肽)、缓激肽、神经介素/蛙皮素相关肽(包括神经介素B(NMB)、神经介素N、神经介素S和神经介素U(NmU))；血管紧张素、蛙皮素、降钙素基因相关肽(CGRP)、α-CGRP、β-CGRP、肌肽、可卡因和安非他明调节转录物(CART)、δ睡眠诱导肽(DSIP)、FMRF酰胺、FMRF酰胺相关肽(FaRP)、甘丙肽、甘丙肽样肽(GALP)、胃泌素释放肽(GRP)、神经肽S、神经肽Y、神经垂体素运载蛋白(神经垂体素运载蛋白I和神经垂体素运载蛋白II)、神经降压素、胰多肽、垂体腺苷酸环化酶活化肽(PACAP)、RVD-Hpα、hemopressin、VGF(VGF神经生长因子诱导蛋白)和VGF衍生肽(TLQP-21)或其变体。
[0212] 在一个实施方案中，肽类似物包含降钙素肽，包括降钙素、胰淀素(或胰岛淀粉样多肽(IAPP))和AGG01或其变体。
[0213] 在一个实施方案中，肽类似物包含生长因子，其在一个实施方案中包括肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang)、自分泌运动因子、骨形态发生蛋白(BMP)(BMP1、B；MP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP10、BMP15)、脑源性神经营养因子(BDNF)、表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长分化因子-9(GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝细胞瘤衍化生长因子(HDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、IGF-1、IGF-2、迁移刺激因子、肌肉生长抑制素(GDF-8)、神经营养素、神经营养素-3(NT-3)、神经营养素-4(NT-4)、神经生长因子(NGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、血小板生成素(TPO)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)、Wnt蛋白、Wnt1、Wnt2、Wnt2B、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8A、Wnt8B、Wnt9A、Wnt9B、Wnt10A、Wnt10B、Wnt11、Wnt16、胎盘生长因子(PGF)和胎牛促生长素(FBS)或其变体。
[0214] 在一个实施方案中，肽类似物包含胰岛素/IGF/松弛素家族的肽，其在一个实施方案中包括胰岛素和胰岛素样生长因子、IGF-1、IGF-2、IGF结合蛋白、IGFBP1、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP4、IGFBP5、IGFBP6、IGFBP7、松弛素家族肽激素、松弛素样(RLN)肽、胰岛素样(INSL)肽、RLN1(松弛素1)、RLN2(松弛素2)、RLN3(松弛素3)、INSL3(胰岛素样肽3、睾丸间质细胞特异性胰岛素样肽)、INSL4(胰岛素样肽4、早期胎盘胰岛素样肽、ELIP)、INSL5(胰岛素样肽5)和INSL6(胰岛素样肽6)或其变体。
[0215] 在一个实施方案中，肽类似物包含肽激素，其在一个实施方案中包括胃泌素、胃泌素-34、胃泌素-17、胃泌素-14、五肽胃泌素、甲状腺激素(T4)、促甲状腺素释放激素(TRH)、加压素、蛋白激素、糖蛋白激素、生长激素(GH)、胰岛素、LH、FSH、促甲状腺激素(促甲状腺素，TSH)、血管紧张素(AGT)、血管紧张素I、血管紧张素II、血管紧张素III、血管紧张素IV、心房利钠肽(ANP)、NT-proBNP、B型利钠肽(BNP)和心房利钠肽(ANP)或其变体。
[0216] 在一个实施方案中，肽类似物包含膜联蛋白，其在一个实施方案中包括膜联蛋白A-I(脂皮素I)和膜联蛋白A-II(膜联蛋白II)或其变体，其中一些是本领域中已知的。
[0217] 激动剂
[0218] 在一个实施方案中，本发明的肽类似物包含激动剂。术语“激动剂”在当前语境下是指如本文所定义的能够结合受体，或在一些实施方案中至少在一定程度上能够结合受体和/或活化受体，或在一些实施方案中至少在一定程度上活化受体的物质或肽。
[0219] 激动剂可为若干种不同类型受体的激动剂，且因此能够结合和/或活化若干种不同类型的受体。所述激动剂也可以是只结合并活化一种类型的受体的选择性激动剂。术语“拮抗剂”在当前语境下是指能够抑制受体激动剂的效应的物质。
[0220] 完全激动剂结合(具有亲和性)并活化受体，随所述受体表现出完全功效。“部分激动剂”在当前语境中为能够结合并活化给定受体，但相对于完全激动剂对所述受体只具有部分功效的肽。部分激动剂在与完全激动剂竞争受体占有时可以充当拮抗剂，且与只用完全激动剂观察到的效应和活化相比使受体活化出现净减少。
[0221] “选择性激动剂”在当前语境中为具有选择性，且因此主要结合并活化一种类型的受体的化合物。
[0222] 根据本发明的肽在一个实施方案中为能够在一定程度上结合并活化一种或若干种受体，且可对不同受体具有不同结合亲和力和/或不同受体活化功效的激动剂，其中亲和力是指肽配体与其受体间的分子间力的数量和大小，及所述配体在其受体结合位点上的停留时间；且受体活化功效是指肽配体在结合目标受体时产生生物反应的能力和这个反应的量级。
[0223] 在一些实施方案中，通过本领域内常规的受体结合/活化研究测定亲和力和受体活化功效的此类差异，例如通过生成模拟配体在表达一种或若干种类型的受体的细胞中或在表达不同类型的受体的组织上的结合的EC50和Emax值。高亲和力意味着与具有较低亲和力的肽相比获得结合50％受体所需的化合物的浓度较低，高受体活化功效意味着与具有较低亲和力和/或受体活性功效的肽(EC50值较高)相比获得50％受体活化反应所需的肽浓度较低(低EC50值)。
[0224] 黑皮质素
[0225] 在一个实施方案中，本发明的肽类似物的肽为黑皮质素。
[0226] 在一个实施方案中，黑皮质素选自α-MSH、γ-MSH(包括γ1-MSH和γ-MSH)和β-MSH、或其变体。
[0227] 在一个实施方案中，黑皮质素选自α-MSH和γ-MSH、或其变体。
[0228] 在一个实施方案中，肽变体为肽的生物活性变体，即保留天然(非变体)肽的至少一种功能的变体。
[0229] α-MS Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val
[0230] H SYSMEHFRWGKPV
[0231] P01189[138-150]，阿黑皮素原，智人
[0232] aa修饰：缬氨酸酰胺(pos 150)
[0233] γ1-MS Tyr-Val-Met-Gly-His-Phe-Arg-Trp-Asp-Arg-Phe-Gly
[0234] H YVMGHFRWDRFG
[0235] P01189[77-88]，阿黑皮素原，智人
[0236] aa修饰：苯丙氨酸酰胺(pos 88)
[0237] γ2-MS Tyr-Val-Met-Gly-His-Phe-Arg-Trp-Asp-Arg-Phe
[0238] H YVMGHFRWDRF
[0239] P01189[77-87]，阿黑皮素原，智人
[0240] aa修饰：苯丙氨酸酰胺(pos 87)
[0241] 因此，本发明的一个方面是提供包含黑皮质素肽和一个或多个支链氨基酸探针的黑皮质素类似物，
[0242] 其中所述支链氨基酸探针包含第一氨基-烷基氨基酸残基，
[0243] 所述第一氨基-烷基氨基酸残基任选地共价连接至第二氨基-烷基氨基酸残基，或共价连接至第二和第三氨基-烷基氨基酸残基，以形成具有2或3个氨基-烷基氨基酸残基的直链，
[0244] 其中所述第一、第二和/或第三氨基-烷基氨基酸残基中的一个或多个的侧链各自通过将独立地选自由以下组成的组的分子附接至侧链氨基而被修饰：AAAq-AAA；(aa3)p-AAAq；AAAq-(aa3)p；[(aa3)-AAA]p和[AAA-(aa3)]p；
[0245] 其中q为选自0、1、2和3的数字；p为选自1、2和3的数字；AAA为氨基-烷基氨基酸残基；且(aa3)为独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基，
[0246] 其中所述氨基-烷基氨基酸残基任选地被乙酰化，
[0247] 其中所述第一氨基-烷基氨基酸残基共价连接至所述黑皮质素肽的N末端，共价连接至所述黑皮质素肽的C末端，和/或附接至所述黑皮质素肽内的氨基-烷基氨基酸残基的侧链氨基，
[0248] 前提条件是所述支链氨基酸探针由2至9个氨基酸残基组成。
[0249] 在一个实施方案中，前提条件是当黑皮质素类似物包含含有一个或多个赖氨酸残基的一个支链氨基酸探针时，所述支链氨基酸探针不附接至所述黑皮质素的N末端。
[0250] 在一个实施方案中，前提条件是当所述类似物的黑皮质素肽为α-MSH或γ-MSH、或其变体时，所述支链氨基酸探针不附接至所述黑皮质素的N末端。
[0251] 在一个实施方案中，前提条件是当黑皮质素类似物包含含有一个或多个赖氨酸残基的一个支链氨基酸探针，且所述类似物的黑皮质素肽为α-MSH或γ-MSH、或其变体时，所述支链氨基酸探针不附接至所述黑皮质素的N末端。
[0252] 在一个实施方案中，一个或多个支链氨基酸探针的第一氨基-烷基氨基酸残基不共价连接至所述黑皮质素肽的N末端。
[0253] 在一个实施方案中，一个或多个支链氨基酸探针的第一氨基-烷基氨基酸残基不共价连接至所述黑皮质素肽的N末端，前提条件为i)所述黑皮质素类似物包含一(1)个支链氨基酸探针，ii)所述支链氨基酸探针包含一个或多个赖氨酸残基，和/或iii)所述黑皮质素类似物包含选自以下组成的组的黑皮质素肽：α-MSH和γ-MSH(包括γ1-MSH和γ-MSH)、或其变体。
[0254] 在一个实施方案中，所述黑皮质素类似物包含一个支链氨基酸探针，所述探针共价连接至所述肽的C末端，或附接至所述黑皮质素肽内的氨基-烷基氨基酸残基的侧链氨基。
[0255] 在一个实施方案中，所述黑皮质素肽内的氨基-烷基氨基酸残基为赖氨酸残基。
[0256] 在一个实施方案中，所述黑皮质素肽内的氨基-烷基氨基酸残基为鸟氨酸残基。
[0257] 在一个实施方案中，所述黑皮质素类似物为α-MSH类似物，且包含附接至包含在天然α-MSH肽中的赖氨酸残基(Lys)(加下划线：Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val)的ε-氨基的支链氨基酸探针。
[0258] 在本发明的一个实施方案中，黑皮质素肽类似物包含2个支链氨基酸探针，其中i)一个支链氨基酸探针共价结合至N末端，且另一个支链氨基酸探针共价结合至黑皮质素肽的C末端；ii)一个支链氨基酸探针共价结合至N末端，且另一个支链氨基酸探针附接至所述黑皮质素肽内的氨基-烷基氨基酸残基的侧链氨基；iii)一个支链氨基酸探针共价结合至C末端，且另一个支链氨基酸探针附接至所述黑皮质素肽内的氨基-烷基氨基酸残基的侧链氨基；或iv)两个支链氨基酸探针中的每一个附接至所述黑皮质素肽内不同(或单独)的氨基-烷基氨基酸残基的侧链氨基。
[0259] 在本发明的一个实施方案中，本发明的肽类似物包含3个支链氨基酸探针，其中第一、第二和第三支链氨基酸探针中的每一个共价结合至所述肽的N末端，共价结合至所述肽的C末端或附接至所述黑皮质素肽内的氨基-烷基氨基酸残基的侧链氨基。
[0260] 在一个实施方案中，本发明的黑皮质素类似物包含α-MSH肽、或其变体。
[0261] 在一个实施方案中，本发明的黑皮质素类似物包含γ-MSH肽、或其变体。
[0262] 在一个实施方案中，本发明的黑皮质素类似物包含一个或多个支链氨基酸探针和具有以下氨基酸序列的黑皮质素肽：
[0263] (aa1)n–Y–(aa2)m–Z
[0264] 其中Y为由选自由以下组成的组的4个连续氨基酸残基组成的氨基酸序列：His-Phe-Arg-Trp；His-(D-Phe)-Arg-Trp；His-Phe-(D-Arg)-Trp；His-Phe-Arg-(D-Trp)；His-(D-Phe)-Arg-(D-Trp)；His-Nal-Arg-Trp和His-(D-Nal)-Arg-Trp；且
[0265] 其中Z为由选自由以下组成的组的2或3个连续氨基酸残基组成的氨基酸序列：Lys-Pro-Val；Lys-Pro-(D-Val)；Arg-Phe-Gly；Arg-(D-Phe)-Gly；Arg-Phe和Arg-(D-Phe)；
且
且
[0266] 其中n为选自0、1、2、3、4和5的数字，且(aa1)可以独立地为任何天然或非天然氨基酸残基，且
[0267] 其中m为0或1，且(aa2)可以为任何天然或非天然氨基酸残基。
[0268] 在一个实施方案中，所述黑皮质素肽为α-MSH或γ-MSH或衍生自α-MSH或γ-MSH。
[0269] 在一个实施方案中，(aa1)n为由0至5个氨基酸组成的序列(n＝0、1、2、3、4或5)。在一个具体实施方案中，(aa1)n为由4或5个连续氨基酸组成的序列(n＝4或5)。
[0270] 在一个实施方案中，(aa1)n选自由以下组成的组：Ser-Tyr-Ser-Met-Glu、Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu和Ser-Ser-Ile-Ile-Ser，其中所述N末端Ser任选地被乙酰化。
[0271] 在一个实施方案中，(aa1)n选自由以下组成的组：Ser-Tyr-Ser-Met-Glu、Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu、Ser-Ser-Ile-Ile-Ser、Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu、Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu和Ac-Ser-Ser-Ile-Ile-Ser。
[0272] 在一个实施方案中，(aa1)n选自由以下组成的组：Tyr-Val-Met-Gly和Tyr-Val-Nle-Gly。
[0273] 在一个实施方案中，(aa2)m选自由以下组成的组：Gly和Asp。在一个实施方案中(aa2)m为Gly。在另一个实施方案中，(aa2)m为Asp。
[0274] 在一个实施方案中，Z为Lys-Pro-Val或Lys-Pro-(D-Val)。在另一个实施方案中，Z为Arg-Phe-Gly或Arg-(D-Phe)-Gly。在又另一个实施方案中，Z为Arg-Phe或Arg-(D-Phe)。
[0275] 在一个实施方案中，黑皮质素肽的最羧基末端氨基酸被酰胺化(-NH2；–CONH2)。因此，在一个实施方案中，Val或(D-Val)为缬氨酸酰胺。在另一个实施方案中，Phe或(D-Phe)为苯丙氨酸酰胺。在又另一个实施方案中，Gly为甘氨酸酰胺。
[0276] 在一个实施方案中，本发明的黑皮质素类似物包含一个或多个支链氨基酸探针和具有以下氨基酸序列的α-MSH肽：
[0277] (aa1)n–Y–(aa2)m–Z
[0278] 其中n为选自0、1、2、3、4和5的数字，且(aa1)独立地为任何天然或非天然氨基酸残基，且
[0279] 其中m为0或1，且(aa2)为任何天然或非天然氨基酸残基，
[0280] 其中Y选自由以下组成的组：His-Phe-Arg-Trp；His-(D-Phe)-Arg-Trp；His-Phe-(D-Arg)-Trp；His-Phe-Arg-(D-Trp)；His-(D-Phe)-Arg-(D-Trp)；His-Nal-Arg-Trp和His-(D-Nal)-Arg-Trp；且
[0281] 其中Z选自由以下组成的组：Lys-Pro-Val和Lys-Pro-(D-Val)，且Val或(D-Val)任选地为缬氨酸酰胺。
[0282] 在一个实施方案中，(aa1)n选自由以下组成的组：Ser-Tyr-Ser-Met-Glu、Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu、Ser-Ser-Ile-Ile-Ser、Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu、Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu和Ac-Ser-Ser-Ile-Ile-Ser。在一个实施方案中，(aa2)m为Gly。
[0283] 在一个实施方案中，黑皮质素肽衍生自α-MSH，且(aa1)n为Ser-Tyr-Ser-Met-Glu、Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu或Ser-Ser-Ile-Ile-Ser；Y为His-Phe-Arg-Trp、His-(D-Phe)-Arg-Trp或His-Phe-Arg-(D-Trp)；(aa2)m为Gly，且Z为Lys-Pro-Val。
[0284] 在一个实施方案中，本发明的黑皮质素类似物包含一个或多个支链氨基酸探针和选自由以下组成的组的α-MSH肽：
[0285] Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val(SEQ ID NO：1)，[0286] Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val，
[0287] Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-(D-Arg)-Trp-Gly-Lys-Pro-Val
[0288] Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-(D-Trp)-Gly-Lys-Pro-Val，
[0289] Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-(D-Phe)-Arg-(D-Trp)-Gly-Lys-Pro-Val，
[0290] Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val，
[0291] Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-(D-Nal)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val，
[0292] Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)，
[0293] Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)，
[0294] Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-(D-Arg)-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)，
[0295] Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-(D-Trp)-Gly-Lys-Pro-(D-Val)，
[0296] Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-(D-Phe)-Arg-(D-Trp)-Gly-Lys-Pro-(D-Val)，[0297] Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)，
[0298] Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-(D-Nal)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)，
[0299] Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val(SEQ lD NO：3)，[0300] Ser-Tyr-Ser-Nle Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val，
[0301] Ser-Tyr-Ser-Nle Glu-His-Phe-(D-Arg)-Trp-Gly-Lys-Pro-Val
[0302] Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Phe-Arg-(D-Trp)-Gly-Lys-Pro-Val，
[0303] Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-(D-Trp)-Gly-Lys-Pro-Val，
[0304] Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val，
[0305] Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Nal)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val，
[0306] Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)，
[0307] Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)，
[0308] Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Phe-(D-Arg)-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)，
[0309] Ser-Tyr-Ser-Nle Glu-His-Phe-Arg-(D-Trp)-Gly-Lys-Pro-(D-Val)，
[0310] Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-(D-Trp)-Gly-Lys-Pro-(D-Val)，[0311] Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)，
[0312] Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Nal)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)，
[0313] Ser-Ser-lle-lle-Ser-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val(SEQ ID NO：5)，[0314] Ser-Ser-lle-lle-Ser-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val，
[0315] Ser-Ser-lle-lle-Ser-His-Phe-(D-Arg)-Trp-Gly-Lys-Pro-Val
[0316] Ser-Ser-lle-lle-Ser-His-Phe-Arg-(D-Trp)-Gly-Lys-Pro-Val，
[0317] Ser-Ser-lle-lle-Ser-His-(D-Phe)-Arg-(D-Trp)-Gly-Lys-Pro-Val，
[0318] Ser-Ser-lle-lle-Ser-His-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val，
[0319] Ser-Ser-lle-lle-Ser-His-(D-Nal)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val，
[0320] Ser-Ser-lle-lle-Ser-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)，
[0321] Ser-Ser-lle-lle-Ser-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)，
[0322] Ser-Ser-lle-lle-Ser-His-Phe-(D-Arg)-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)，
[0323] Ser-Ser-lle-lle-Ser-His-Phe-Arg-(D-Trp)-Gly-Lys-Pro-(D-Val)，
[0324] Ser-Ser-lle-lle-Ser-His-(D-Phe)-Arg-(D-Trp)-Gly-Lys-Pro-(D-Val)，[0325] Ser-Ser-lle-lle-Ser-His-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)，和
[0326] Ser-Ser-lle-lle-Ser-His-(D-Nal)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)，
[0327] 其中最羧基末端的Val或(D-Val)任选地为缬氨酸酰胺。
[0328] 在一个实施方案中，本发明的黑皮质素类似物包含一个或多个支链氨基酸探针和具有以下氨基酸序列的γ-MSH肽：
[0329] (aa1)n-Y-(aa2)m-Z
[0330] 其中n为选自0、1、2、3、4和5的数字，且(aa1)独立地为任何天然或非天然氨基酸残基，且
[0331] 其中m为0或1，且(aa2)为任何天然或非天然氨基酸残基，
[0332] 其中Y选自由以下组成的组：His-Phe-Arg-Trp；His-(D-Phe)-Arg-Trp；His-Phe-(D-Arg)-Trp；His-Phe-Arg-(D-Trp)；His-(D-Phe)-Arg-(D-Trp)；His-Nal-Arg-Trp和His-(D-Nal)-Arg-Trp；且
[0333] 其中Z选自由以下组成的组：Arg-Phe-Gly、Arg-(D-Phe)-Gly、Arg-Phe和Arg-(D-Phe)；且Phe或(D-Phe)为苯丙氨酸酰胺，或Gly为甘氨酸酰胺。
[0334] 在一个实施方案中，(aa1)n选自由以下组成的组：Tyr-Val-Met-Gly和Tyr-Val-Nle-Gly。在一个实施方案中，(aa2)m为Asp。
[0335] 在一个实施方案中，本发明的黑皮质素类似物包含一个或多个支链氨基酸探针和选自由以下组成的组的γ1-MSH肽：
[0336] Tyr-Val-Met-Gly-His-Phe-Arg-Trp-Asp-Arg-Phe-Gly，
[0337] Tyr-Val-Met-Gly-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Asp-Arg-Phe-Gly，
[0338] Tyr-Val-Met-Gly-His-Phe-(D-Arg)-Trp-Asp-Arg-Phe-Gly，
[0339] Tyr-Val-Met-Gly-His-Phe-Arg-(D-Trp)-Asp-Arg-Phe-Gly，
[0340] Tyr-Val-Met-Gly-His-(D-Phe)-Arg-(D-Trp)-Asp-Arg-Phe-Gly，
[0341] Tyr-Val-Met-Gly-His-Nal-Arg-Trp-Asp-Arg-Phe-Gly，
[0342] Tyr-Val-Met-Gly-His-(D-Nal)-Arg-Trp-Asp-Arg-Phe-Gly，
[0343] Tyr-Val-Met-Gly-His-Phe-Arg-Trp-Asp-Arg-(D-Phe)-Gly，
[0344] Tyr-Val-Met-Gly-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Asp-Arg-(D-Phe)-Gly，
[0345] Tyr-Val-Met-Gly-His-Phe-(D-Arg)-Trp-Asp-Arg-(D-Phe)-Gly，
[0346] Tyr-Val-Met-Gly-His-Phe-Arg-(D-Trp)-Asp-Arg-(D-Phe)-Gly，
[0347] Tyr-Val-Met-Gly-His-(D-Phe)-Arg-(D-Trp)-Asp-Arg-(D-Phe)-Gly，
[0348] Tyr-Val-Met-Gly-His-Nal-Arg-Trp-Asp-Arg-(D-Phe)-Gly，
[0349] Tyr-Val-Met-Gly-His-(D-Nal)-Arg-Trp-Asp-Arg-(D-Phe)-Gly，
[0350] Tyr-Val-Nle-Gly-His-Phe-Arg-Trp-Asp-Arg-Phe-Gly，
[0351] Tyr-Val-Nle-Gly-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Asp-Arg-Phe-Gly，
[0352] Tyr-Val-Nle-Gly-His-Phe-(D-Arg)-Trp-Asp-Arg-Phe-Gly，
[0353] Tyr-Val-Nle-Gly-His-Phe-Arg-(D-Trp)-Asp-Arg-Phe-Gly，
[0354] Tyr-Val-Nle-Gly-His-(D-Phe)-Arg-(D-Trp)-Asp-Arg-Phe-Gly，
[0355] Tyr-Val-Nle-Gly-His-Nal-Arg-Trp-Asp-Arg-Phe-Gly，
[0356] Tyr-Val-Nle-Gly-His-(D-Nal)-Arg-Trp-Asp-Arg-Phe-Gly，
[0357] Tyr-Val-Nle-Gly-His-Phe-Arg-Trp-Asp-Arg-(D-Phe)-Gly，
[0358] Tyr-Val-Nle-Gly-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Asp-Arg-(D-Phe)-Gly，
[0359] Tyr-Val-Nle-Gly-His-Phe-(D-Arg)-Trp-Asp-Arg-(D-Phe)-Gly，
[0360] Tyr-Val-Nle-Gly-His-Phe-Arg-(D-Trp)-Asp-Arg-(D-Phe)-Gly，
[0361] Tyr-Val-Nle-Gly-His-(D-Phe)-Arg-(D-Trp)-Asp-Arg-(D-Phe)-Gly，
[0362] Tyr-Val-Nle-Gly-His-Nal-Arg-Trp-Asp-Arg-(D-Phe)-Gly，和
[0363] Tyr-Val-Nle-Gly-His-(D-Nal)-Arg-Trp-Asp-Arg-(D-Phe)-Gly，
[0364] 其中最羧基末端的Gly任选地为甘氨酸酰胺。
[0365] 在一个实施方案中，本发明的黑皮质素类似物包含一个或多个支链氨基酸探针和选自由以下组成的组的γ2-MSH肽：
[0366] Tyr-Val-Met-Gly-His-Phe-Arg-Trp-Asp-Arg-Phe(SEQ ID NO：11)，
[0367] Tyr-Val-Met-Gly-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Asp-Arg-Phe，
[0368] Tyr-Val-Met-Gly-His-Phe-(D-Arg)-Trp-Asp-Arg-Phe，
[0369] Tyr-Val-Met-Gly-His-Phe-Arg-(D-Trp)-Asp-Arg-Phe，
[0370] Tyr-Val-Met-Gly-His-(D-Phe)-Arg-(D-Trp)-Asp-Arg-Phe，
[0371] Tyr-Val-Met-Gly-His-Nal-Arg-Trp-Asp-Arg-Phe，
[0372] Tyr-Val-Met-Gly-His-(D-Nal)-Arg-Trp-Asp-Arg-Phe，
[0373] Tyr-Val-Met-Gly-His-Phe-Arg-Trp-Asp-Arg-(D-Phe)，
[0374] Tyr-Val-Met-Gly-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Asp-Arg-(D-Phe)，
[0375] Tyr-Val-Met-Gly-His-Phe-(D-Arg)-Trp-Asp-Arg-(D-Phe)，
[0376] Tyr-Val-Met-Gly-His-Phe-Arg-(D-Trp)-Asp-Arg-(D-Phe)，
[0377] Tyr-Val-Met-Gly-His-(D-Phe)-Arg-(D-Trp)-Asp-Arg-(D-Phe)，
[0378] Tyr-Val-Met-Gly-His-Nal-Arg-Trp-Asp-Arg-(D-Phe)，
[0379] Tyr-Val-Met-Gly-His-(D-Nal)-Arg-Trp-Asp-Arg-(D-Phe)，
[0380] Tyr-Val-Nle-Gly-His-Phe-Arg-Trp-Asp-Arg-Phe(SEQ ID NO：13)，
[0381] Tyr-Val-Nle-Gly-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Asp-Arg-Phe，
[0382] Tyr-Val-Nle-Gly-His-Phe-(D-Arg)-Trp-Asp-Arg-Phe，
[0383] Tyr-Val-Nle-Gly-His-Phe-Arg-(D-Trp)-Asp-Arg-Phe，
[0384] Tyr-Val-Nle-Gly-His-(D-Phe)-Arg-(D-Trp)-Asp-Arg-Phe，
[0385] Tyr-Val-Nle-Gly-His-Nal-Arg-Trp-Asp-Arg-Phe，
[0386] Tyr-Val-Nle-Gly-His-(D-Nal)-Arg-Trp-Asp-Arg-Phe，
[0387] Tyr-Val-Nle-Gly-His-Phe-Arg-Trp-Asp-Arg-(D-Phe)，
[0388] Tyr-Val-Nle-Gly-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Asp-Arg-(D-Phe)，
[0389] Tyr-Val-Nle-Gly-His-Phe-(D-Arg)-Trp-Asp-Arg-(D-Phe)，
[0390] Tyr-Val-Nle-Gly-His-Phe-Arg-(D-Trp)-Asp-Arg-(D-Phe)，
[0391] Tyr-Val-Nle-Gly-His-(D-Phe)-Arg-(D-Trp)-Asp-Arg-(D-Phe)，
[0392] Tyr-Val-Nle-Gly-His-Nal-Arg-Trp-Asp-Arg-(D-Phe)，和
[0393] Tyr-Val-Nle-Gly-His-(D-Nal)-Arg-Trp-Asp-Arg-(D-Phe)，
[0394] 其中最羧基末端的Phe或(D-Phe)任选地为苯丙氨酸酰胺。
[0395] 在一个实施方案中，本发明的黑皮质素类似物包含一个或多个支链氨基酸探针和α-MSH的环状内酰胺类似物，在一个实施方案中为α-MSH的侧链环状内酰胺类似物。
[0396] 在一个实施方案中，α-MSH的环状内酰胺类似物选自由以下组成的组：Ac-Nle-环[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]-NH2(MT-II,Melano tan II)；SHU9005、SHU9119、[DNal(1’)]-MTII、[Nal(2’)]-MTII、环状α-MSH(1-13)内酰胺类似物；α-MSH的片段的侧链环状内酰胺类似物；环状α-MSH(4-10)内酰胺类似物；MBX36；MBX37；Ac-Nle4-环[Asp5,D-Phe7,Lys10]α-MSH-(4-10)-NH2；环二硫化α-MSH(4–10)类似物；环状α-MSH(4-11)内酰胺类似物；Ac-[Nle4,D-Orn5,Gl u8]α-MSH4-11-NH；Ac-[Nle4,D-Orn5,D-Phe7、Glu8]α-MSH4-11-N H2；[N-乙酰基-Cys4,D-Phe7,Cys10]-α-MSH(4-13)，环状；或其变体。
[0397] 在一个实施方案中，本发明的黑皮质素类似物包含一个或多个支链氨基酸探针和金属环化α-MSH类似物，在一个实施方案中为与1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)偶联的ReO-环化[Cys3,4,10,-D-Phe7]-MSH3-13(DOTA-ReCCMSH)。
[0398] 在一个实施方案中，本发明的黑皮质素类似物包含一个或多个支链氨基酸探针和提供α-MSH的环化衍生物的二硫键，如在一个实施方案中为MBJ-06(WO1998027113)。
[0400] 在一个具体实施方案中，本发明的肽类似物不包含如PCT/EP2013/071935中公开的α-MSH和γ-MSH类似物。
[0401] 在一个实施方案中，本发明肽类似物不包含α-MSH和/或γ-MSH肽、或其变体。
[0402] 在一个实施方案中，本发明肽类似物包含不同于α-MSH和/或γ-MSH肽、或其变体的肽。
[0403] 在一个实施方案中，肽类似物不包含具有共价连接(或通过肽键连接)至所述α-MSH和/或γ-MSH肽的最N末端氨基酸的支链氨基酸探针的α-MSH和γ-MSH肽。
[0404] 在一个实施方案中，肽类似物不包含具有支链氨基酸探针的α-MSH和/或γ-MSH肽，所述探针包含至少一个赖氨酸残基，其中所述支链氨基酸探针共价连接至所述α-MSH和/或γ-MSH肽的最N末端氨基酸。
[0405] α-MSH的最N末端氨基酸为Ser(加下划线：Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val。
[0406] γ-MSH的最N末端氨基酸为Tyr(加下划线：Tyr-Val-Met-Gly-His-Phe-Arg-Trp-Asp-Arg-Phe(-Gly)
[0407] 在一个实施方案中，其中本发明的肽类似物包含一(1)个支链氨基酸探针，其中支链氨基酸探针的氨基-烷基氨基酸残基中的至少一个或多个(或至少一个)为赖氨酸，且其中所述肽为α-MSH和/或γ-MSH、或其变体，所述支链氨基酸探针不附接至所述肽的N末端。
[0408] 在一个实施方案中，一个或多个支链氨基酸探针的第一氨基-烷基氨基酸残基不共价连接至所述肽的N末端，前提条件为i)所述肽类似物包含一(1)个支链氨基酸探针，ii)所述支链氨基酸探针包含一个或多个赖氨酸残基，和/或iii)所述肽类似物包含选自由以下组成的组的黑皮质素肽：α-MSH和γ-MSH(包括γ1-MSH和γ-MSH)。
[0409] 在一个实施方案中，本发明的肽类似物不包含或包括：
[0410] 由8至22个氨基酸残基组成的肽，其包含以下氨基酸序列：X–(aa1)n–Y–(aa2)m–Z[0411] 其中X包含具有选自Lys和D-Lys的第一赖氨酸残基(Lys1)的支链氨基酸探针，所述第一赖氨酸残基通过肽键连接至(aa1)n，
[0412] 所述第一赖氨酸残基任选地通过肽键连接至第二赖氨酸残基(Lys2)，或连接至第二和第三赖氨酸残基(Lys3)，以形成总共具有2或3个选自Lys和D-Lys的赖氨酸残基的直链，
[0413] 其中所述第一、第二和/或第三赖氨酸残基中的每一个的一个或多个的侧链通过将独立地选自由以下组成的组的分子附接至所述赖氨酸残基中的每一个的所述一个或多个的ε-氨基而被修饰：Lysq-Lys；(aa3)p-Lysq；Lysq-(aa3)p；[(aa3)-Lys]p和[Lys-(aa3)]p，其中q为选自0、1、2和3的数字；p为选自1、2和3的数字，且(aa3)为独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基，
[0414] 前提条件是X由2至9个氨基酸残基组成，
[0415] 其中Y包括由选自由以下组成的组的4个连续氨基酸残基组成的氨基酸序列：His-Phe-Arg-Trp(SEQ ID NO:16)；His-(D-Phe)-Arg-Trp；His-Phe-(D-Arg)-Trp；His-Phe-Arg-(D-Trp)；His-(D-Phe)-Arg-(D-Trp)；His-Nal-Arg-Trp和His-(D-Nal)-Arg-Trp；且[0416] Z包含由选自由以下组成的组的2或3个连续氨基酸残基组成的氨基酸序列：Lys-Pro-Val；Lys-Pro-(D-Val)；Arg-Phe-Gly；Arg-(D-Phe)-Gly；Arg-Phe和Arg-(D-Phe)；且[0417] 其中n为选自0、1、2、3、4和5的数字，且(aa1)可以独立地为任何天然或非天然氨基酸残基，且
[0418] 其中m为0或1，且(aa2)可以为任何天然或非天然氨基酸残基。
[0419] 在一个实施方案中，本发明的肽类似物不包含或包括：
[0420] 由8至22个氨基酸残基组成的肽，其包含以下氨基酸序列：X–(aa1)n–Y–(aa2)m–Z[0421] 其中X包含具有选自Lys和D-Lys的第一赖氨酸残基(Lys1)的支链氨基酸探针，所述第一赖氨酸残基通过肽键连接至(aa1)n，
[0422] 所述第一赖氨酸残基任选地通过肽键连接至第二赖氨酸残基(Lys2)，或连接至第二和第三赖氨酸残基(Lys3)，以形成总共具有2或3个选自Lys和D-Lys的赖氨酸残基的直链，
[0423] 其中所述第一、第二和/或第三赖氨酸残基中的每一个的一个或多个的侧链通过将独立地选自由以下组成的组的分子附接至所述赖氨酸残基中的每一个的所述一个或多个的ε-氨基而被修饰：Lysq-Lys；(aa3)p-Lysq；Lysq-(aa3)p；[(aa3)-Lys]p和[Lys-(aa3)]p，其中q为选自0、1、2和3的数字；p为选自1、2和3的数字，且(aa3)为独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基，
[0424] 前提条件是X由2至9个氨基酸残基组成，
[0425] 其中Y包含由选自由以下组成的组的4个连续氨基酸残基组成的氨基酸序列：His-Phe-Arg-Trp(SEQ ID NO:16)；His-(D-Phe)-Arg-Trp；His-Phe-(D-Arg)-Trp；His-Phe-Arg-(D-Trp)；His-(D-Phe)-Arg-(D-Trp)；His-Nal-Arg-Trp和His-(D-Nal)-Arg-Trp；且[0426] Z包含由选自由以下组成的组的2或3个连续氨基酸残基组成的氨基酸序列：Lys-Pro-Val；Lys-Pro-(D-Val)；Arg-Phe-Gly；Arg-(D-Phe)-Gly；Arg-Phe和Arg-(D-Phe)；且[0427] 其中(aa1)n选自由以下组成的组：Ser-Tyr-Ser-Met-Glu、Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu、Ser-Ser-Ile-Ile-Ser、Tyr-Val-Met-Gly和Tyr-Val-Nle-Gly；且
[0428] 其中(aa2)m选自由以下组成的组：Gly和Asp。
[0429] 制备方法
[0430] 根据本发明的肽类似物可通过本领域内已知的任何合适方法制备。因此，在一些实施方案中，肽和支链氨基酸探针各自通过标准肽制备技术制备，如溶液合成或固相肽合成(SPPS)，如Merrifield型固相合成。
[0431] 在一个实施方案中，本发明的肽类似物是通过固相合成制备，通过首先利用熟知的标准保护、偶联和去保护程序构建药理活性肽序列，然后以类似于构建活性肽的方式依次将支链氨基酸探针偶联至活性肽，最后从载体裂解掉整个肽类似物。这种策略得到肽，其中支链氨基酸探针在所述肽的N末端氮原子处共价结合至药理活性肽。
[0432] 在一个实施方案中，在将支链氨基酸序列偶联在活性肽上之前或之后，利用标准酰化技术，以乙酰基给支链氨基酸序列中的最后氨基酸上的α氮加帽。
[0433] N和C末端处促进合成期间的氨基酸偶联的反应性部分以及反应性侧链官能团可在合成和肽延长期间与游离末端或其它侧链基团相互作用，且不利地影响收率和纯度。因此形成结合至特异性氨基酸官能团，并阻止或防止官能团进行非特异性反应的化学基团。纯化的单个氨基酸在合成前与这些保护基团反应，然后在肽合成的特定步骤期间被选择性移除。N末端保护基团的实例为通常用于固相肽合成中的t-Boc和Fmoc。C末端保护基团主要用于液相合成中。因为N末端去保护在肽合成期间连续发生，所以已经建立保护方案，其中将不同类型的侧链保护基团(苄基；Bzl或叔丁基；tBu)分别与Boc或Fmoc配对，以优化去保护。
[0434] 在本发明的一个具体实施方案中，当制备以Ac(Ac-Lys-Lys)Lys-例示的支链氨基酸探针时，Lys的保护基团为Mtt，所述被保护的氨基酸可在市面上购得(Fmoc-Lys(Mtt)-OH；N-α-Fmoc-N-ε-4-甲基三苯甲基-L-赖氨酸，CAS#167393-62-6)。Lys(Mtt)允许以乙酰基给Lys加帽，因为它不会在裂解Fmoc的条件下被裂解，且可在不裂解其它侧链保护基团的情况下被移除。
[0435] 在一些实施方案中，所述制备方法经过本领域中的常规方法优化，这可增加由此制备的合成肽的收率和/或质量。例如，在含丝氨酸和苏氨酸的肽的Fmoc SPPS中使用假脯氨酸(噁唑烷)二肽可以改善粗产物的质量和收率，且可以帮助避免不必要地重复合成无效序列。这些二肽容易使用：简单地用合适的假脯氨酸二肽取代肽序列中的丝氨酸或苏氨酸残基以及前面的氨基酸残基。天然序列在裂解和去保护时再生。
[0436] 在一个实施方案中，通过以下方式分别制备各自药理活性肽和支链氨基酸探针(或其一部分)的序列，例如溶液合成、固相合成、重组技术或酶法合成，随后通过熟知的片段缩合程序，在溶液中或利用固相技术、或其组合偶联(至少)两个序列。
[0437] 在一个实施方案中，通过重组DNA方法制备肽，并且通过固相或液相合成制备支链氨基酸探针。在一个实施方案中，肽和支链氨基酸探针是通过使用化学连接进行缀合。这种技术允许以高度特异性方式组装完全未受保护的肽片段。在另一个实施方案中，通过蛋白酶催化肽键形成进行缀合，这提供高度特异性技术来经由肽键组合完全未受保护的肽片段。
[0438] 在一个实施方案中，通过常见接头将支链氨基酸探针的C末端氨基酸或肽的C末端氨基酸附接至固体载体材料，如2,4-二甲氧基-4'-羟基-二苯甲酮、4-(4-羟基-甲基-3-甲氧基苯氧基)-丁酸、4-羟基-甲基苯甲酸、4-羟甲基-苯氧基乙酸、3-(4-羟甲基苯氧基)丙酸或p-{(R,S)-α-[1-(9H-芴-9-基)-甲氧基甲酰胺基]-2,4-二甲氧基苄基}-苯氧基乙酸(Rink酰胺接头)。
[0440] 在一些实施方案中，所产生的本发明肽类似物借助于酸从固体载体材料裂解，所述酸如三氟乙酸、三氟甲磺酸、氢溴酸、氢氯酸、氢氟酸等，任选地与一种酚、茴香硫醚等组合，或者在其它实施方案中，本发明的肽缀合物借助于碱从固体载体裂解，所述碱如氨、肼、醇盐(如乙醇钠)、氢氧化物(如氢氧化钠)等。
[0441] 在其它实施方案中，本发明的肽类似物可通过重组技术制备或生产。因此，在本发明的一个方面，肽是通过包含编码所述肽或肽类似物的第一核酸序列的宿主细胞产生，所述第一核酸序列可操作地结合能够指导所述宿主细胞中的表达的第二核酸。在一些实施方案中，第二核酸序列包含将指导感兴趣的蛋白质在所述细胞中的表达的启动子或甚至由其组成。技术人员将容易地能够识别用于给定宿主细胞中的有用第二核酸序列(例如载体和质粒)。
[0442] 一般而言生产重组肽的方法包括以下步骤：提供宿主细胞，制备包含编码所述肽的第一核酸的基因表达构建体，所述第一核酸可操作地连接至能够指导所述感兴趣的蛋白质在宿主细胞中的表达的第二核酸，用所述构建体使所述宿主细胞转化并培养所述宿主细胞，从而获得所述肽的表达。在本发明的一个实施方案中，重组产生的肽通过宿主细胞分泌。宿主细胞包括本领域中已知的任何合适的宿主细胞，包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
[0443] 在一个实施方案中，由此产生的重组肽通过任何常规方法来分离，且可以通过常规肽键形成化学连接至任何被适当保护的支链氨基肽部分。技术人员将能够鉴别用于纯化肽的合适蛋白质分离步骤。
[0444] 治疗方法
[0445] 一个方面是提供用作药物的根据本发明所定义的肽类似物。
[0446] 在另一个方面，本发明提供用于治疗、预防或减轻医学病状的方法。在一个实施方案中，根据本发明的此类方法包括向有需要的个体施用或释放有效量的根据本发明的肽类似物或包含一种或多种此类肽的药物组合物的一个或多个步骤。在一个实施方案中，根据本发明的这些施用或释放步骤是同时、依序或单独进行的。
[0447] 如本文所提到的有需要的个体在一个实施方案中是受益于施用根据本发明的肽或药物组合物的个体。这样的个体在一个实施方案中罹患疾病或病症或有罹患所述疾病或病症的风险。所述个体在一个实施方案中是任何人，不论男性或女性、婴儿、中年或老年。在一个实施方案中，个体中的待治疗或预防的病症涉及个体的年龄、个体的一般健康状况、用于治疗个体的药物以及个体是否具有罹患可能已经或已经诱导个体中的病状的疾病或病症的既往史。
[0448] 如本文所用的术语“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”是指为了对抗病状、疾病或病症而对患者进行的管理和护理。该术语意欲包括针对患者正在遭受的给定病状的全面治疗，如施用肽类似物以用于：减轻或缓解症状或并发症；延迟病状的进展、部分阻止临床表现、疾病或病症；治愈或消除病状、疾病或病症；和/或预防或降低获得病状、疾病或病症的风险，其中“预防(preventing)”或“预防(prevention)”应该被理解为是指为了阻碍病状、疾病或病症的发展而对患者进行的管理和护理，并且包括施用活性化合物以预防或降低症状或并发症发作的风险。待治疗的患者优选是哺乳动物，特别是人。然而，如小鼠、大鼠、狗、猫、牛、马、羊和猪的动物的治疗也在本发明的范围之内。根据本发明的待治疗的患者可以具有各种年龄，例如，成人、儿童、16岁以下的儿童、6-16岁的儿童、2-16岁的儿童、2个月至6岁的儿童或2个月至5岁的儿童。
[0449] 在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗缺血性病症、炎性病症和/或代谢病症的根据本发明的肽类似物。
[0450] 在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗缺血性病症、炎性病症和/或代谢病症的方法，所述方法包括向有需要的个体施用有效量的根据本发明的肽类似物。
[0451] 其它活性成分
[0452] 在一些实施方案中，本发明的肽类似物与一种或多种其它活性成分组合或包含它们，所述其它活性成分被理解为其它治疗化合物或其药学上可接受的衍生物。
[0453] 因此，根据本发明的治疗方法在一个实施方案中进一步包括同时或依序并以任何合适的比率施用一种或多种其它活性成分的一个或多个步骤。
[0454] 根据本发明的治疗方法在一个实施方案中包括其中如本文所定义的药物组合物或肽类似物与一种或多种其它活性成分同时、依序或单独施用的步骤。
[0455] 施用与剂量
[0456] 根据本发明，包含如本文所定义的肽类似物的组合物在一个实施方案中是以药学有效剂量或治疗有效量被施用给有需要的个体。
[0457] 根据本发明的肽的治疗有效量在一个实施方案中是足以治愈、预防给定的疾病或病症及其并发症的临床表现，减轻给定的疾病或病症及其并发症的风险，减缓或部分阻止给定的疾病或病症及其并发症的临床表现的量。对特定治疗目的有效的量将取决于病症的严重性和种类以及受试者的体重和一般状态。足以实现该目的的量被定义为“治疗有效量”。
[0458] 在本发明的一个实施方案中，所述组合物的施用剂量为1μg/天至100mg/天；如1μg/天至10μg/天、如10μg/天至100μg/天、如100μg/天至250μg/天、如250μg/天至500μg/天、如500μg/天至750μg/天、如750μg/天至1mg/天、如1mg/天至2mg/天、如2mg/天至5mg/天或如5mg/天至10mg/天、如10mg/天至20mg/天、如20mg/天至30mg/天、如30mg/天至40mg/天、如
40mg/天至50mg/天、如50mg/天至75mg/天或如75mg/天至100mg/天。
40mg/天至50mg/天、如50mg/天至75mg/天或如75mg/天至100mg/天。
[0459] 在本发明的一个实施方案中，施用单一剂量的组合物且所述单一剂量可以包括1μg/kg体重至100mg/kg体重；如1至10μg/kg体重、如10至100μg/天、如100至250μg/kg体重、如250至500μg/kg体重、如500至750μg/kg体重、如750μg/kg体重至1mg/kg体重、如1mg/kg体重至2mg/kg体重、如2至5mg/kg体重、如5至10mg/kg体重、如10至20mg/kg体重、如20至30mg/kg体重、如30至40mg/kg体重、如40至50mg/kg体重、如50至75mg/kg体重或如75至100mg/kg体重。
[0460] 在一个实施方案中，根据本发明的剂量每天被施用一次或若干次，如每天1至6次、如每天1至5次、如每天1至4次、如每天1至3次、如每天1至2次、如每天2至4次、如每天2至3次。
[0461] 施用途径
[0462] 应该理解的是，优选的施用途径将取决于待治疗的受试者的一般状况和年龄、待治疗的病症的性质、待治疗的组织在身体内的位置以及所选的活性成分。
[0463] 全身治疗
[0464] 在一个实施方案中，施用途径允许将肽类似物引入血流中以最终靶向期望的作用部位。
[0465] 在一个实施方案中，施用途径是任何合适的途径，如肠内途径(包括口服、直肠、鼻部、肺部、颊部、舌下、经皮、脑池内和腹膜内施用)和/或肠胃外途径(包括皮下、肌内、鞘内、静脉内和皮内施用)。
[0466] 用于此类施用的合适剂型可以通过常规技术来制备。
[0467] 肠胃外施用
[0468] 肠胃外施用是任何不是口服/肠内途径的施用途径，借此药物避免了在肝脏中的首过降解。因此，肠胃外施用包括任何注射和输注，例如推注或连续输注，如静脉内施用、肌内施用或皮下施用。另外，肠胃外施用包括吸入和局部施用。
[0469] 因此，所述肽类似物或组合物在一个实施方案中被局部施用以穿过待被给予所述物质或肽的动物的任何粘膜(例如在鼻部、阴道、眼部、口部、生殖道、肺部、胃肠道或直肠中，例如鼻部或口部的粘膜)，并且相应地，肠胃外施用还可以包括颊部、舌下、鼻部、直肠、阴道和腹膜内施用以及通过吸入或装置进行的肺部和支气管施用。在一些实施方案中，肽类似物被局部施用以穿过皮肤。
[0470] 在一个实施方案中，采用肠胃外施用的静脉内、皮下和肌内形式。
[0471] 局部治疗
[0472] 在一个实施方案中，根据本发明的肽类似物或组合物被用作局部治疗，即被直接引入到作用部位。因此，所述肽可以直接应用于皮肤或粘膜，或所述肽可以被注射至作用部位中，例如进入患病组织或直接通向患病组织的终动脉。
[0473] 药物制剂
[0474] 在一个实施方案中，将所述肽类似物或其药学上可接受的衍生物单独或与药学上可接受的载体或赋形剂组合地以单剂量或多剂量形式施用。根据本发明的药物组合物或化合物可以用药学上可接受的载体或稀释剂以及其它任何已知的佐剂和赋形剂按照常规技术(如在Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第20版，Gennaro,编著,Mack Publishing Co.,Easton,PA,2000中公开的那些)来配制。
[0475] 在本上下文中的术语“药学上可接受的衍生物”包括药学上可接受的盐，其指示对患者无害的盐。此类盐包括药学上可接受的碱加成盐或酸加成盐以及药学上可接受的金属盐、铵盐和烷基化铵盐。药学上可接受的衍生物进一步包括化合物的药学上可接受的酯、前药或其它前体(它们可以被生物代谢成活性化合物)或化合物的晶体形式。
[0476] 所述药物组合物或药学上可接受的组合物可以被特定地配制来用于通过任何合适的途径(如肠内途径、口服、直肠、鼻部、肺部、颊部、舌下、经皮、脑池内、腹膜内和肠胃外(包括皮下、肌内、鞘内、静脉内和皮内)途径)进行施用。
[0477] 在本发明的一个实施方案中，本发明的药物组合物或肽被配制来用于穿越血脑屏障。
[0478] 用于口服施用的药物组合物包括固体剂型，如硬胶囊或软胶囊、片剂、糖锭、糖衣丸、丸剂、锭剂、散剂和颗粒剂。在适当的情况下，根据本领域中公知的方法，它们可以被制备成具有包衣如肠溶衣，或者它们可以进行配制，以便提供活性成分的控制释放如持续或延长释放。在相同的固体剂型中，可以组合两种活性成分，以便提供一种活性成分的控制释放和另一种活性成分的立即释放。
[0479] 用于口服施用的液体剂型包括溶液剂、乳剂、水性或油性混悬剂、糖浆和酏剂。
[0480] 用于肠胃外施用的药物组合物包括无菌水性或非水性可注射溶液、分散液、混悬液或乳剂，以及待在使用前复水为无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。储库型可注射制剂也被视为是在本发明的范围之内。
[0482] 在一个实施方案中，根据本发明使用的化合物或肽通常被用作游离物质或用作药物衍生物如药学上可接受的酯或如其盐。后者的实例是：具有游离碱官能团的化合物的酸加成盐，以及具有游离酸官能团的化合物的碱加成盐。术语“药学上可接受的盐”是指根据本发明使用的化合物的非毒性盐，所述盐一般是通过使游离碱与合适的有机或无机酸反应或通过使酸与合适的有机或无机碱反应来制备。当根据本发明使用的化合物含有游离碱官能团时，此类盐是以常规方式通过用化学当量的药学上可接受的酸处理所述化合物的溶液或悬浮液来制备。当根据本发明使用的化合物含有游离酸官能团时，此类盐是以常规方式通过用化学当量的药学上可接受的碱处理所述化合物的溶液或悬浮液来制备。具有羟基的化合物的生理上可接受的盐包括与合适的阳离子如钠离子或铵离子组合的该化合物的阴离子形式。非药学上可接受的其它盐可能可用于制备本发明的化合物，并且这些形成本发明的另一个方面。药学上可接受的酸加成盐包括但不限于：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、三氯乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、蔗糖盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即，1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。
[0483] 在本发明的一个实施方案中，本发明的肽是结晶形式，例如共结晶形式或结晶形式的水合物。
[0484] 术语“前药”是指例如通过在血液中水解或通过在细胞(例如，基底神经节的细胞)中的新陈代谢在体内迅速转化以得到上式的母体化合物的肽。全面的讨论提供于T.Higuchi和V Stella，"Pro-drugs as Novel Delivery Systems"，A.C.SSymposium Series，第14卷以及Bioreversible Carriers in Drug Design，Edward B.Roche编著，American Pharmaceutical Association and Pergamon Press,1987中，这两者在此均通过引用并入。前药的实例包括本发明化合物的药学上可接受的无毒性酯。本发明化合物的酯可以根据常规方法来制备("March's Advanced Organic Chemistry，第5版，M.B.Smith&J.March,John Wiley&Sons,2001)。
[0485] 在一个实施方案中，对于肠胃外施用，采用根据本发明的肽在无菌水溶液中、在水性丙二醇中或在芝麻油或花生油中的溶液。水溶液应该视情况被适当缓冲，并且用例如足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。水溶液特别适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。待使用的无菌水性介质都容易通过本领域技术人员已知的标准技术获得。
[0486] 合适的药物载体包括惰性固体稀释剂或填充剂、无菌水溶液和各种有机溶剂。固体载体的实例为乳糖、石膏粉、蔗糖、环糊精、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸以及纤维素的低级烷基醚。液体载体的实例为糖浆、花生油、橄榄油、磷脂、脂肪酸、脂肪酸胺、聚氧乙烯和水。此外，所述载体或稀释剂可以包括本领域中已知的任何持续释放材料，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯(单独或与蜡混合)。通过将根据本发明的化合物与药学上可接受的载体组合而形成的药物组合物然后被容易地以适用于所公开的施用途径的各种剂型施用。所述制剂可以通过药学领域中已知的方法方便地以单位剂型提供。
[0487] 适合于口服施用的本发明的制剂可以作为离散单位如胶囊或片剂提供，所述胶囊或片剂各自含有预定量的活性成分并且可以包括合适的赋形剂。
[0488] 此外，口服可用的制剂可以是散剂或颗粒剂形式、在水性或非水性液体中的溶液剂或混悬剂形式或油包水或水包油液体乳剂的形式。
[0489] 可以根据任何已知的方法来制备旨在用于口服使用的组合物，且此类组合物可以包含一种或多种选自由甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂组成的组的试剂，以便提供药学上美观和适口的制剂。片剂可以包含活性成分和适于制造片剂的药学上可接受的非毒性赋形剂的混合物。这些赋形剂可以是例如：惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；粒化剂和崩解剂，例如玉米淀粉或藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以无包衣或它们可以通过已知技术进行包衣，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收并由此在较长时间内提供持续作用。例如，可以采用时间延迟材料如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。它们还可以通过在美国专利号4,356,108、4,166,452和4,265,874(所述专利的内容都通过引用并入本文中)中描述的技术进行包衣，以形成用于控制释放的渗透性治疗片剂。
[0490] 用于口服使用的制剂还可以呈硬明胶胶囊形式，其中活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合；或呈软明胶胶囊形式，其中活性成分与水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。水性混悬剂可以包含根据本发明使用的化合物与适于制备水性混悬剂的赋形剂的混合物。此类赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮、西黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂如卵磷脂、或环氧烷与脂肪酸的缩合产物例如聚氧乙烯硬脂酸酯、或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物例如十七亚乙基氧基十六醇、或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯、或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物例如聚乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。水性混悬剂还可以包含一种或多种着色剂、一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂如蔗糖或糖精。
[0491] 油性混悬剂可以通过将活性成分悬浮于植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(如液体石蜡)中来配制。油性混悬剂可以包含增稠剂，例如蜂蜡、硬质石蜡或十六醇。可以添加甜味剂(如上文所列出的那些甜味剂)和调味剂，以提供适口的口服制剂。这些组合物可以通过加入抗氧化剂如抗坏血酸来防腐。
[0492] 适于通过加水来制备水性混悬剂的分散性散剂和颗粒剂提供活性化合物与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂的混合物。合适的分散剂或润湿剂以及悬浮剂是例如上文已经提到的那些。还可以存在另外的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。
[0493] 根据本发明使用的包含肽的药物组合物还可以是水包油乳剂的形式。油相可以是植物油例如橄榄油或花生油；或矿物油例如液体石蜡；或其混合物。合适的乳化剂可以是天然生成的树胶，例如阿拉伯胶或黄芪胶；天然生成的磷脂，例如大豆卵磷脂；和衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如山梨糖醇酐单油酸酯；以及所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。乳剂还可以包含甜味剂和调味剂。
[0494] 糖浆和酏剂可以用甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖来配制。此类制剂还可以包含镇痛剂、防腐剂以及调味剂和着色剂。药物组合物可以呈无菌可注射的水性或油性混悬剂形式。该混悬剂可以根据已知方法使用上述合适的分散剂或润湿剂以及悬浮剂来配制。无菌可注射制剂还可以是在肠胃外可接受的非毒性稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的媒介物和溶剂是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌固定油方便地用作溶剂或悬浮介质。为此，可以采用任何温和的固定油，其使用合成的单甘油酯或二甘油酯。另外，脂肪酸如油酸被用于制备可注射剂。
[0495] 所述组合物还可以呈栓剂形式，从而用于本发明化合物的直肠施用。这些组合物可以通过将化合物与合适的非刺激性赋形剂混合来制备，该赋形剂在常温下是固体，但在直肠温度下是液体且因此将在直肠中融化以释放药物。此类材料包括例如可可脂和聚乙二醇。
[0496] 本发明的肽还可以以脂质体递送系统如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡的形式来施用。脂质体可以由各种磷脂(如但不限于胆固醇、硬脂酰胺或磷脂酰胆碱)形成。
[0498] 因此，另一个实施方案提供了一种药物组合物，其包含根据本发明使用的肽或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药以及一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
[0499] 本发明还包括包含本发明的α-MSH、γ-MSH类似物、GLP-1类似物、GLP-2类似物和膜联蛋白A1的N末端类似物的药物组合物，以及用作药物的本发明的α-MSH和γ-MSH类似物、GLP-1类似物、GLP-2类似物或膜联蛋白A1的N末端类似物。
[0500] 具体地说，根据本发明的α-MSH和γ-MSH类似物α-MSH、γ-MSH类似物、GLP-1类似物、GLP-2类似物和膜联蛋白A1的N末端的类似物可能适用于治疗在哺乳动物的一个或多个器官的组织中的缺血性和/或炎性病症，其中所述治疗可以是预防性、改善性或治愈性的。
[0501] 有关的所述缺血性病症在一个实施方案中可以归因于以下基础病症或由其引起：如中风、损伤、败血性休克、全身性低血压、由于心脏病发作的心跳骤停、心律不齐、动脉粥样硬化性疾病伴血栓形成、源自心脏的栓塞或源自任何器官的血管的栓塞、血管痉挛、主动脉瘤或其它器官中的动脉瘤、冠状动脉狭窄、心肌梗塞、心绞痛、心包炎、心肌炎、粘液性水肿(myxodemia)或心内膜炎。
[0502] 另外，所述缺血性和/或炎性病症在一个实施方案中可以与手术如大手术相关，其中所述手术可以包括心胸外科手术、腹部手术、对主动脉和/或其它主要血管的手术、一个或多个心脏瓣膜的修复、心脏冠状动脉旁路移植术(CABG)、对主动脉根部或包括总颈动脉的主动脉分支的手术以及联合心脏手术如瓣膜置换术和CABG和/或主动脉根部手术。
[0503] 此外，所述缺血性和/或炎性病症在一个实施方案中可以与器官移植相关，如实体器官移植，包括心脏移植、肺移植、心肺联合移植、肝移植和肾移植。
[0504] 在一个实施方案中，所述缺血性和/或炎性病症是手术后全身性炎症反应综合症(SIRS)或手术后器官功能障碍，包括术后肾功能衰竭如急性肾损伤(AKI)、肾中毒和/或慢性肾功能衰竭(CRF)。
[0505] 在一个实施方案中，所述缺血性和/或炎性病症是再灌注损伤。
[0506] 另外，所述缺血性和/或炎性病症可以是炎性疾病，包括但不限于关节病(关节疾病)、类风湿性关节炎(RA)、痛风、胃肠系统的炎性疾病以及多发性硬化症。
[0507] 除了缺血性和/或炎性病症以外，根据本发明的α-MSH和γ-MSH类似物α-MSH、γ-MSH类似物、GLP-1类似物、GLP-2类似物和膜联蛋白A1的N末端类似物可能适用于治疗代谢病症，包括1型或2型糖尿病、包括葡萄糖耐受不良的糖尿病前期病症、肥胖、超重、代谢综合症、妊娠糖尿病或与多囊卵巢综合症相关的代谢疾病，其中所述治疗可以是预防性、改善性或治愈性的。
[0508] 根据本发明的修饰肽可以用于治疗已指定使用母体肽进行治疗的相同的疾病和病症。实施例
[0509] 实施例1-经BAP修饰的α-MSH肽类似物的合成。
[0510] α-MSH类似物1：
[0511] Ac-(Ac-Lys-Lys-)Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2
[0512] γ-MSH类似物1：
[0513] Ac-(Ac-Lys-Lys-)Lys-Tyr-Val-Met-Gly-His-Phe-Arg-(D-Trp)-Asp-Arg-Phe-Gly-NH2。
[0514] 使用Fmoc(9-芴甲氧羰基)化学来制造肽。使用被适当的接头官能化的聚苯乙烯树脂来制备肽，且然后使用Intavis肽合成仪制造肽。添加相对于树脂为4倍过量的氨基酸并且使用3.95倍过量的HATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)或HCTU(2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸铵)来产生活性酯。连同8倍过量的DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)作为碱一起，这些试剂催化下一个氨基酸的添加。一旦氨基酸偶联(每个循环包括双重偶联循环以确保有效偶联)，就使树脂暴露于20％乙酸酐以终止(“脱帽”)还没有添加下一个氨基酸的任何肽链。
[0515] 将氨基酸溶解于NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)或DMF(二甲基甲酰胺)中用于洗涤。在每个偶联循环的最后使用哌啶去除Fmoc基团，这允许添加下一个氨基酸。
[0516] 所制得的α-MSH类似物1在末端具有Lys(Mtt)；使所述肽乙酰化，去除Mtt，添加Lys，添加Lys且然后再乙酰化。
[0517] 对于γ-MSH类似物1，在含丝氨酸和/或苏氨酸的肽的合成过程中添加一种或多种假脯氨酸(噁唑烷)二肽改善肽质量并且增加全长粗肽的产量。在这种情况下，将肽补充至MEHF，添加假脯氨酸二肽(Fmoc-YS)，使下一个氨基酸“Ser”偶联3次以确保其完成，并通过添加Lys(Mtt)、进行乙酰化以及然后如上述进行最终处理来人工完成所述肽。
[0518] 在每种情况下，使用MeOH(3X)、DCM(3X)干燥所述肽，使用92％TFA、2％水、2％三异丙基硅烷、2％苯甲硫醚和2％乙二硫醇在室温下裂解3-4小时。使肽在冷乙醚中沉淀，离心(2，000RPM)并用冷乙醚洗涤球团2X。干燥后，将肽溶解于含0.1％TFA的水(缓冲液A)中并使用C18柱(缓冲液B＝95％乙腈/0.1％TFA)进行RP-HPLC。
[0519] 通过分析型HPLC测定纯度并通过MS确认理论单同位素分子量。通过CID串联MS/MS测序来验证序列完整性。
[0520] 实施例2：经BAP修饰的α-MSH类似物的药理学表征。
[0521] 方法：
[0522] 表达MCr1的小鼠B16-F1细胞被用来测定对MC1r的结合亲和力和激动剂活性。表达MC3r、MC4r或MC5r的人重组CHO细胞分别被用来测定对MC3r、MC4r和MC5r的亲和力或激动剂活性。在如关于放射性配体结合研究目录no 0644(MC1r)、no 0447(MC3r)、no 0420(MC3r)和no 0448(Mc5r)Cerep,France的程序中所述而进行的实验中测定结合亲和力。在所有实125 -13 -5
验中，Ki值是基于测试化合物置换 I-NDP-αMSH的能力来计算。测试物品是在10 至10 M的浓度范围内进行测试。
验中，Ki值是基于测试化合物置换 I-NDP-αMSH的能力来计算。测试物品是在10 至10 M的浓度范围内进行测试。
[0523] 对于针对MCR的激动剂活性，进行以下程序：将细胞与10-13至10-5M浓度的测试物品一起孵育。在所有分析中，在孵育后测定cAMP积累，并且当NDP-αMSH被用作阳性对照时，在给定浓度下的反应表示为最大对照特异性激动剂反应的百分比((特异性反应测量值/对照特异性激动剂反应)×100)。EC50值(产生半最大特异性反应的浓度)是通过使用希尔方程曲线拟合(Y＝D+[(A–D)/(1+(C/C50)nH)]，其中Y＝特异性反应，D＝最小特异性反应，A＝最大特异性反应，C＝化合物浓度，且C50＝EC50，且nH＝斜率因子)对利用平均复制值产生的浓度-反应曲线进行非线性回归分析来确定。有关更多详情，参见Cerep研究方案no 2147(MC1r)、no 0959(MC3r)、no 0699(MC4r)和no 1869(MC5r)的具体方案。
[0524] 测试肽类似物：
[0525] 类似物1：Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2
[0526] 类似物2：Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)-NH2
[0527] 类似物3：Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-DPhe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2
[0528] 类似物4：Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys-Ser-Ser-Ile-Ile-Ser-His-DPhe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2
[0529] 对照肽：
[0530] 对照肽1(αMSH)：Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2
[0531] 对照肽2(NDP-αMSH)：Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-DPhe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2
[0532] 结果
[0533] Ki值(nM)：
[0534] MC1r MC3r MC4r MC5r
对照肽1 4.6 114 128 404
对照肽2 1.5 8.8 7.1 14
类似物1 1.2 24 26 193
对照肽1 4.6 114 128 404
对照肽2 1.5 8.8 7.1 14
类似物1 1.2 24 26 193
[0535] 相对于对照肽1的MCr结合：
[0536] MC1r MC3r MC4r MC5r
类似物1 4x 5x 5x 2x
类似物2 3.3x 8.5x
类似物3 41x 47x
类似物4 9.4x 42x 53x
类似物1 4x 5x 5x 2x
类似物2 3.3x 8.5x
类似物3 41x 47x
类似物4 9.4x 42x 53x
[0537] EC50值(nM)：
[0538] MC1r MC3r MC4r MC5r
对照肽1 13 62 28 1104
对照肽2 15 24 10 40
类似物1 8.9 53 18 625
对照肽1 13 62 28 1104
对照肽2 15 24 10 40
类似物1 8.9 53 18 625
[0539] 实施例3：经BAP修饰的γ-MSH类似物的药理学表征。
[0540] 测试肽类似物：
[0541] 类似物1：Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys-Tyr-Val-Met-Gly-His-Phe-Arg-DTrp-Asp-Arg-Phe-Gly-NH2
[0542] 类似物2：Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys-Tyr-Val-Met-Gly-His-Phe-Arg-Trp-Asp-Arg-Phe-Gly-NH2
[0543] 类似物3：Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys-Tyr-Val-Met-Gly-His-DPhe-Arg-DTrp-Asp-Arg-Phe-Gly-NH2
[0544] 类似物4：Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys-Tyr-Val-Met-Gly-His-Phe-Arg-DTrp-Asp-Arg-DPhe-Gly-NH2
[0545] 类似物5：Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys-Tyr-Val-Nle-Gly-His-Phe-Arg-DTrp-Asp-Arg-Phe-Gly-NH2
[0546] 类似物6：Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys-Tyr-Val-Nle-Gly-His-Phe-Arg-Trp-Asp-Arg-Phe-Gly-NH2
[0547] 类似物7：Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys-Tyr-Val-Nle-Gly-His-DPhe-Arg-Trp-Asp-Arg-Phe-Gly-NH2
[0548] 类似物8：Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys-Tyr-Val-Nle-Gly-His-DPhe-Arg-DTrp-Asp-Arg-Phe-Gly-NH2
[0549] 对照肽：
[0550] 对照肽1 Ac-Tyr-Val-Met-Gly-His-Phe-Arg-Trp-Asp-Arg-Phe-Gly-NH2
[0551] 对照肽2 Ac-Tyr-Val-Met-Gly-His-Phe-Arg-DTrp-Asp-Arg-Phe-Gly-NH2
[0552] 结果
[0553] Ki值(nM)：
[0554]
[0555] 相对于对照肽1的MCr结合亲和力：
[0556] MC1r MC3r MC4r MC5r
类似物1 27x 5x 2x 5x
类似物1 27x 5x 2x 5x
[0557] 相对于对照肽2的MCr结合亲和力：
[0558] MC1r MC3r MC4r MC5r
类似物1 4x 2x 2x 3x
类似物1 4x 2x 2x 3x
[0559] 相对于αMSH(Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2)的MCr结合亲和力：
[0560] MC1r MC3r MC4r MC5r
对照肽1 0.04x 1.5x 0.1x 0.4x
对照肽2 0.16x 0.36x 0.74x 1.1x
类似物1 1.2x 7.6x 0.9x 2x
类似物2 0.5x 11.6x 1.2x
类似物3 20x 8.5x
类似物4 7.7x 4.8x 1.3x
类似物5 1.9x 38x 2.8x
类似物6 4.6x 2.9x
类似物7 46x 37x
类似物8 7.3x 37x 10.7x
对照肽1 0.04x 1.5x 0.1x 0.4x
对照肽2 0.16x 0.36x 0.74x 1.1x
类似物1 1.2x 7.6x 0.9x 2x
类似物2 0.5x 11.6x 1.2x
类似物3 20x 8.5x
类似物4 7.7x 4.8x 1.3x
类似物5 1.9x 38x 2.8x
类似物6 4.6x 2.9x
类似物7 46x 37x
类似物8 7.3x 37x 10.7x
[0561] EC50值(nM)：
[0562] MC1r MC3r MC4r MC5r
对照肽1 141 46 279 1787
对照肽2 167 170 56 505
类似物1 68 2.0 252 555
对照肽1 141 46 279 1787
对照肽2 167 170 56 505
类似物1 68 2.0 252 555
[0563] 实施例4：BAP修饰肽的合成
[0564] 类似地，利用标准Fmoc化学，使用作为偶联试剂的1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HATU)或2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸铵(HCTU)以及休尼格碱(N,N-二异丙基乙胺，DIPEA)合成经BAP修饰的α-MSH肽类似物(实施例1)肽。对于如下文更详细描述的赖氨酸分支，使用正交保护的赖氨酸的组合，包括Fmoc-Lys(MTT)-OH、Fmoc-Lys(ivDde)-OH和Fmoc-Lys(Boc)-OH。
[0565] 使用包括三氟乙酸、三异丙基硅烷和水的标准裂解混合剂来裂解肽并在冰冷的乙醚中沉淀。所有粗肽通过反相色谱法在具有C-18官能性的柱上且使用乙腈、去离子水和三氟乙酸的梯度作为运行缓冲液进行纯化。通过高压液相色谱法测定纯度并且使用纳喷雾质谱仪获得质谱(MS)和序列(串联MS)信息。
[0566] BAP附接在序列的C末端
[0567] 在C末端赖氨酸上分支(方法1)：在哌啶去保护后将N-α-Fmoc-N-ε-4-甲基三苯甲基-L-赖氨酸添加到Rink酰胺树脂中。添加目标肽的剩余序列并用乙酸酐使全长序列乙酰化。然后利用1％三氟乙酸的二氯甲烷溶液去除甲基三苯甲基。然后将额外的Nα-Fmoc-Nε-Boc-L-赖氨酸添加到侧链上并在需要时进行乙酰化。
[0568] 在非C末端赖氨酸上分支：类似于将BAP附接至N末端和C末端之间的序列中的赖氨酸(方法2)。
[0569] BAP附接至N末端和C末端之间的序列中的赖氨酸
[0570] 方法2：将N-α-Fmoc-N-ε-4-甲基三苯甲基-L-赖氨酸添加到肽序列上，在最终确定序列和任选地进行N末端乙酰化后去除甲基三苯甲基。依次添加适当的赖氨酸类似物如Fmoc-Lys(MTT)-OH、Fmoc-Lys(ivDde)-OH和Fmoc-Lys(Boc)-OH并选择性地去保护，然后进行乙酰化以确保适当的侧链和乙酰基添加。
[0571] BAP附接在序列的N末端
[0572] 在N末端赖氨酸上分支(方法3)：将N-α-Fmoc-N-ε-4-甲基三苯甲基-L-赖氨酸添加到序列的N末端，去除Fmoc，使序列在N末端处乙酰化，并去除甲基三苯甲基。然后将额外的Nα-Fmoc-Nε-Boc-L-赖氨酸添加到侧链上并在需要时进行乙酰化。
[0573] 在非N末端赖氨酸上分支：类似于将BAP附接至N末端和C末端之间的序列中的赖氨酸(方法2)。
[0574] 肽
[0575] 类似物1(通过方法1)：
[0576] Ac-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-(Lys-Lys-Ac)Lys-NH2
[0577] 纯度：99.1％
[0578] MS:546.9,637.8,765.2
[0579] 类似物2(通过方法1)：
[0580] Ac-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-(Lys-Lys-Ac)Lys-NH2
[0581] 纯度：99.3％
[0582] MS:635.5,762.4,952.7
[0583] 类似物3(通过方法1)：
[0584] Ac-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-(Lys-Lys-Ac)Lys-NH2
[0585] 纯度：96.2％
[0586] MS:605.5,706.2,847.2,1058.8
[0587] 类似物4(通过方法1)：
[0588] Ac-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-(Lys-Lys-Ac)Lys-NH2
[0589] 纯度：95.1％
[0590] MS:603.5,703.9,844.4,1055.3
[0591] 类似物5(通过方法1)：
[0592] Ac-His-(D-Ala)-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-(Lys-Lys-Ac)Lys-NH2
[0593] 纯度：96.9％
[0594] MS:706.2,847.2,1058.8
[0595] 类似物6(通过方法1)：
[0596] Ac-Ala-Met-Val-Ser-Glu-Phe-Leu-Lys-Gln-(D-Ala)-Trp-Phe-Ile-Glu-Asn-Glu-Glu-Gln-Glu-Tyr-Val-Gln-Thr-Val-Lys-Lys-(Lys-Ac)Lys-NH2
[0597] 纯度：96.0
[0598] MS:879.2
[0599] 类似物7(通过方法2)：
[0600] Ac-Ala-Met-Val-Ser-Glu-Phe-Leu-(Ac-(Lys-Ac)Lys-Lys)Lys-Gln-Ala-Trp-NH2
[0601] 纯度：97.3
[0602] MS:442.2,662.9
[0603] 实施例5：经BAP修饰的GLP-1类似物的药理学表征
[0604] 方法：
[0605] 通过用PBS-EDTA(5mM EDTA)温和冲洗分离在无抗生素培养基中生长的表达人GLP-1受体的CHO-K1细胞，通过离心回收并再悬浮于分析缓冲液(KRH：5mM KCl、1.25mM MgSO4、124mM NaCl、25mM HEPES、13.3mM葡萄糖、1.25mM KH2PO4、1.45mM CaCl2、0.5g/l BSA)中。
[0606] 将12μl细胞与浓度渐增的12μl测试化合物(溶解于PBS/0.5％BSA中并且最后从1mM的原液稀释)混合在96孔板中，然后在室温下孵育30分钟。在加入裂解缓冲液和孵育1小时后，通过使用穴状化合物标记的抗cAMP和d2标记的cAMP(来自CisBio的HTRF试剂盒)使用竞争性免疫分析来测定cAMP产生，并根据制造商说明书计算ΔF百分比值。利用测试化合物和参照化合物平行地完成剂量反应曲线。
[0607] HTRF技术是基于标记型cAMP(外源的)和由细胞在MCr活化后产生cAMP之间的竞争的滴定分析。该分析的动态范围为3至4倍，这意味着线性范围(其能够从原始数据转换为cAMP的nM)在该范围内。曲线的顶部和底部之间的窗口较高(约100)，这意味着当转换成cAMP的nM时，cAMP的分析窗口是从1nM(基线)到约30nM(Emax)。所有实验是在非选择性磷酸二酯酶抑制剂IBMX(最终浓度为1mM)的存在下进行。
[0608] 测试化合物是在10-14至10-7M的浓度范围内进行测试。
[0610] 对照肽：
[0611] GLP-1(7-36):
[0612] H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-OH
[0613] 结果：
[0614]
[0615] 当与具有相当于对照肽GLP-1(7-37)的亚纳摩尔EC50值的对照肽GLP-1(7-36)相比较时，类似物1和类似物2都显示出完全的激动剂活性。较低的希尔斜率表明激动剂活性可以在较低浓度(相较于在使用对照肽时将见到的浓度)下获得。
[0616] 实施例6：经BAP修饰的GLP-2类似物的药理学表征
[0617] 方法：
[0618] 通过用PBS-EDTA(5mM EDTA)温和冲洗分离在无抗生素培养基中生长的表达人GLP-2受体的CHO-K1细胞，通过离心回收并再悬浮于分析缓冲液(KRH：5mM KCl、1.25mM MgSO4、124mM NaCl、25mM HEPES、13.3mM葡萄糖、1.25mM KH2PO4、1.45mM CaCl2、0.5g/l BSA)中。
[0619] 将12μl细胞与浓度渐增的12μl测试化合物(溶解于PBS/0.5％BSA中并且最后从1mM的原液稀释)混合在96孔板中，然后在室温下孵育30分钟。在加入裂解缓冲液和孵育1小时后，通过使用穴状化合物标记的抗cAMP和d2标记的cAMP(来自CisBio的HTRF试剂盒)使用竞争性免疫分析来测定cAMP产生，并根据制造商说明书计算ΔF百分比值。利用测试化合物和参照化合物平行地完成剂量反应曲线。
[0620] HTRF技术是基于标记型cAMP(外源的)和由细胞在MCr活化后产生cAMP之间的竞争的滴定分析。该分析的动态范围为3至4倍，这意味着线性范围(其能够从原始数据转换为cAMP的nM)在该范围内。曲线的顶部和底部之间的窗口较高(约100)，这意味着当转换成cAMP的nM时，cAMP的分析窗口是从1nM(基线)到约30nM(Emax)。所有实验是在非选择性磷酸二酯酶抑制剂IBMX(最终浓度为1mM)的存在下进行。
[0621] 测试化合物是在10-14至10-7M的浓度范围内进行测试。
[0622] 数据以平均值呈现。EC50(即诱导50％最大反应的浓度)和希尔斜率(hill slope)是在使用graph pad软件(版本6.0)进行对数转换后通过最佳拟合分析确定。
[0623] 对照肽：
[0624] GLP-2(1-34):
[0625] H-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Arg-OH[0626] 结果：
[0627]
[0628]
[0629] 当与具有在nM范围内的EC50值的对照肽GLP-2(1-34)相比时，所有三种类似物都显示出完全的激动剂活性。因此，经BAP修饰的GLP-2类似物的当前实例是针对人GLP-2受体的完全和有效的激动剂。
[0630] 实施例7：经BAP修饰的AnxA1N末端片段的药理学表征
[0631] 方法：
[0632] 使共表达线粒体水母蛋白和重组人2型甲酰肽受体(FPR2)的重组细胞在测试前于不包含抗生素的培养基中生长18小时，通过用PBS-EDTA(5mM EDTA)温和冲洗使其分离，通过离心回收并再悬浮于分析缓冲液(具有HEPES和0.1％无蛋白酶BSA的DHEM/HAM′s F12)中。然后在进行DR研究之前将细胞在室温腔肠素h(来自Molecular Probes)下孵育至少4小时。
[0633] 将50μl细胞悬浮液注射在96孔板中的浓度渐增的50μl测试或对照化合物(溶解于PBS/0.5％BSA中并且最后从1mM的原液稀释)上，然后在室温下孵育30分钟。使用Hamamatsu功能性药物筛选系统6000(FDSS6000)记录所产生的光发射。对于遍及所有板和在实验之间的记录的光发射的标准化，将100μM毛地黄皂苷或20μM ATP添加到一些孔中。
[0634] 激动剂活性表示为使用内部对照化合物Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Met所获得的最大活性的％。
[0635] 测试化合物是在10-11至10-5M的浓度范围内进行测试。
[0636] 数据以平均值呈现。在可能时，EC50(即诱导50％最大反应的浓度)是在使用graph pad软件(版本6.0)进行对数转换后通过最佳拟合分析确定。
[0637] 对照肽1：
[0638] AnxA1(2-26):
[0639] Ac-Ala-Met-Val-Ser-Glu-Phe-Leu-Lys-Gln-Ala-Trp-Phe-Ile-Glu-Asn-Glu-Glu-Gln-Glu-Tyr-Val-Gln-Thr-Val-Lys-OH
[0640] 对照肽2：
[0641] AnxA1(2-12):
[0642] Ac-Ala-Met-Val-Ser-Glu-Phe-Leu-Lys-Gln-Ala-Trp-NH2
[0643] 结果：
[0644] 在文献中，AnxA1蛋白的AnxA1(2-12)和AnxA1(2-26)N末端片段被描述为FPR2受体的激动剂，它们都不是显著有效的，但在设定中，对照肽1或对照肽2都不能够在施加的浓度范围内诱导激动剂活性。与此相反，类似物6和类似物7都显示激动剂活性。对于类似物6，激动剂活性达到使用内部对照化合物Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Met所观察到的最大反应的33％。对照化合物1的相应最大活性为小于1％。对于类似物7，EC50被测定为1.56μM。在最高测试剂量下获得的最大激动剂反应是使用Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Met六肽所得到的最大反应的85％，而对照肽的最大活性小于1％。
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