技术领域
[0001] 本
发明涉及用于检测c-kit基因的多态性的探针及其用途。
背景技术
[0002] c-kit受体为细胞表面的受体型酪
氨酸激酶，与干细胞因子结合。编码c-kit受体的c-kit基因位于人的第4
染色体。已知c-kit基因例如在序列编号1所示的c-kit基因的部分序列中，
碱基编号108的碱基(w)的腺嘌呤(a)突变成胸腺嘧啶(t)、碱基编号127的碱基(d)的胸腺嘧啶(t)突变成
鸟嘌呤(g)或腺嘌呤(a)等(非
专利文献1等)。c-kit受体中，通过碱基编号108的碱基的突变，第816位的天冬氨酸(D)突变成缬氨酸(V)，通过碱基编号127的碱基的突变，第822位的天
门冬酰胺(N)突变成赖氨酸(K)。报告了这样的突变例如与急性骨髓白血病、胃肠道间质瘤(GIST)等癌症
疾病有关，与所述癌症疾病的
预后不良有关等(非专利文献1等)。因此，c-kit基因中的这些突变的有无即多态性的检测例如在疾病的诊断、选择更有效的疾病的
治疗方法等方面是极其重要的。
[0003] 另一方面，检测基因的多态性的方法报告了各种方法，例如可以举出PCR(聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction)-RFLP(限制
片段长度多态性，Restriction Fragment Length Polymorphism)法等。
[0004] 所述PCR-RFLP法是对试样的靶标DNA，用PCR扩增检测目标的区域，用限制性内切酶处理其扩增产物，通过southern杂交对由与多态性而产生的限制片段长度的变化进行分型的方法。由于当基因中存在目标突变时，限制性内切酶的识别位点消失，因此能够通过有无切断、即限制片段长度的变化来检测突变的有无。
[0005] 然而，所述PCR-RFLP法例如需要在PCR之后，用各种限制性内切酶处理所得到的扩增物并分析，花费工夫。另外，对所得的扩增物的限制性内切酶处理需要临时提取扩增物来进行。因此，有可能造成第一次的反应所得的扩增物飞散，混入第二次的其他的反应中。由于这样的问题，难以进行多态性的检测的自动化。
[0006] 由于这样的问题，近年来，作为多态性的检测方法，Tm(Melting Temperature，熔解
温度)分析受到关注。所述Tm分析也称熔解曲线分析。这种方法为如下方法。首先，使用与含有检测目标的多态性的区域互补的探针，使待测核酸与所述探针的杂交体(双链核酸)形成。然后，对所得到的杂交体实施加
热处理，通过吸光度等的
信号测定来检测伴随温度上升的杂交体向单链核酸的解离(熔解)。基于该检测结果来确定Tm值，由此判断多态性。杂交体中两条单链核酸的互补性越高，则Tm值越高，互补性越低，则Tm值越低。因此，在检测对象位点的多态性为X或Y的情况下，对于含有目标多态性(例如Y)的核酸和与其100％互补的探针的杂交体，预先求得Tm值(评价基准值)。接着，测定所述待测核酸和所述探针的Tm值(测定值)。并且，如果该测定值与所述评价基准值相同，则可以判断为所述待测核酸与所述探针完全匹配，即，所述待测核酸的检测对象位点为目标多态性(Y)。另一方面，如果所述测定值低于所述评价基准值，则可以判断为所述待测核酸和所述探针为错配，即，所述待测核酸的检测对象位点为另一种多态性(X)。通过这样的方法，例如仅通过对添加了所述探针的PCR反应液实施温度处理，进行信号测定，即可检测多态性。因此，可以实现检测装置的自动化。
[0007] 但是，利用了这样的Tm分析的检测方法，例如必须通过Tm值来判断单一碱基的差异。另外，在基因具有多种多态性的情况下，分析一个样品也需要花费大量的劳动
力。因此，在分析多个样品时也存在不实用的问题。因此，尤其需要在野生型的多态性和多个突变型的多态性混合存在时等，也能够正确地检测突变的有无。
[0009] 非专利文献
[0010] 非专利文献1：J Clin Oncol.，2006年8月20日，Vol.24，No.24，p.3904-3911发明内容
[0011] 发明要解决的问题
[0012] 由于这些理由，c-kit基因的多态性的检测例如在所述疾病的诊断和治疗方法的选择中非常重要。因此，本发明的目的在于提供一种能够简便并且可靠性优良地针对c-kit基因判别多态性的多态性检测用探针及其用途。
[0013] 用于解决问题的手段
[0014] 为了达到所述目的，本发明的多态性检测用探针为c-kit基因的多态性检测用探针，其特征在于，含有下述(P1)～(P4)和(P1’)～(P4’)中的至少一种寡核苷酸。
[0015] (P1)寡核苷酸，其由为碱基长4～50碱基长、与含有序列编号1中的碱基编号105～108的碱基序列互补的碱基序列构成，在3’末端区域具有与所述碱基编号105的碱基互补的碱基；
[0016] (P1’)寡核苷酸，其由与所述(P1)寡核苷酸互补的碱基序列构成；
[0017] (P2)寡核苷酸，其由碱基长为7～50碱基长、含有序列编号1中的碱基编号102～108的碱基序列构成，在5’末端区域具有所述碱基编号102的碱基；
[0018] (P2’)寡核苷酸，其由与所述(P2)寡核苷酸互补的碱基序列构成；
[0019] (P3)寡核苷酸，其由碱基长为8～50碱基长、与含有序列编号1中的碱基编号127～134的碱基序列互补的碱基序列构成，在5’末端区域具有与所述碱基编号134的碱基互补的碱基；
[0020] (P3’)寡核苷酸，其由与所述(P3)寡核苷酸互补的碱基序列构成；
[0021] (P4)寡核苷酸，其由碱基长为5～50碱基长、含有序列编号1中的碱基编号123～127的碱基序列构成，在5’末端区域具有所述碱基编号123的碱基；
[0022] (P4’)寡核苷酸，其由与所述(P4)寡核苷酸互补的碱基序列构成。
[0023] 本发明的多态性检测方法为c-kit基因的多态性检测方法，其特征在于，包括使用本发明的多态性检测用探针来检测c-kit基因的多态性的步骤。
[0024] 本发明的多态性检测用
试剂为用于检测c-kit基因的多态性的试剂，其特征在于，含有本发明的多态性检测用探针。
[0025] 发明的效果
[0026] 通过本发明的多态性检测用探针，例如能够通过Tm分析简便并且可靠性优良地判别c-kit基因的多态性。具体而言，例如，即使在试样中目标的多态性为野生型的c-kit基因和目标的多态性为突变型的c-kit基因共存的情况下，也能够通过进行使用了本发明的多态性检测用探针的Tm分析，来简便并且可靠性优良地检测多态性的种类和突变的有无。因此，本发明例如对于含有野生型的c-kit基因和突变型的c-kit基因两者的试样特别有用。如此，由于通过本发明，能够简便并且可靠性优良地判别c-kit基因的多态性，因此例如能够将检测结果反映到前述那样的疾病的诊断和治疗方法的选择等中。因此，可以说本发明在医疗领域等中是极其有用的。
附图说明
[0027] 图1是示出本发明的
实施例1中的、含有野生型和突变型质粒的反应液的Tm分析的结果的图；
[0028] 图2是示出本发明的实施例2中的、含有野生型和突变型质粒的反应液的Tm分析的结果的图；
[0029] 图3是示出本发明的实施例3中的、含有野生型和突变型质粒的反应液的Tm分析的结果的图。
具体实施方式
[0030] 本发明中，c-kit基因的检测目标的多态性例如为序列编号1所示的c-kit基因的部分序列中碱基编号108的碱基(w)和碱基编号127的碱基(d)的多态性。碱基编号108的碱基(w)中，野生型为腺嘌呤(a)，这种情况下，c-kit受体的第816位的氨基酸为天冬氨酸(D)(D816)。突变型为胸腺嘧啶(t)，这种情况下，c-kit受体的第816位的氨基酸为缬氨酸(V)(D816V)。碱基编号127的碱基(d)中，野生型为胸腺嘧啶(t)，这种情况下，c-kit受体的第822位的氨基酸为天门冬酰胺(N)(N822)。突变型为鸟嘌呤(g)或腺嘌呤(a)，在这些情况下，c-kit受体的第822位的氨基酸为赖氨酸(K)(N822K)。c-kit基因中，如果所述两处多态性中至少一处为所述突变型，则例如可以判断为存在急性骨髓性白血病、胃肠道间质瘤(GIST)等癌症疾病的可能性，另外，对于所述疾病，存在预后不良的可能性。
[0031] 以下，将c-kit基因中，针对所述第816位的氨基酸的密码子中的多态性称为“816多态性”。具体而言，也将作为D816的多态性称为“D816野生型或gac野生型”，也将作为D816V的多态性称为“D816V突变型或gtc突变型”。以下，将c-kit基因中针对所述第822位的氨基酸的密码子的多态性称为“822多态性”。具体而言，也将作为N822的多态性称为“N822野生型或aat野生型”，也将作为N822K的多态性称为“N822K突变型、aag突变型或aaa突变型”。
[0032] c-kit基因的碱基序列例如在GenBank登录号NG_007456中登录为碱基编号4935～87721的序列。序列编号1的碱基序列为所述登录号的碱基序列中的c-kit基因的部分序列，对应于所述登录号的碱基序列中的碱基编号80054～80293的区域。
[0033] 本发明中，以下，将作为D816野生型的c-kit基因称为“D816野生型基因”，将作为D816V突变型的c-kit基因也称为“D816V突变型基因”。以下，也将N822野生型的c-kit基因称为“N822野生型基因”、N822K突变型的c-kit基因称为“N822K突变型基因”。
[0034] 在本发明中，所述多态性发生的位点，即与序列编号1的碱基序列(正义链)中碱基编号108和碱基编号127的碱基、或其互补序列(反义链)中与所述正义链的碱基编号108和碱基编号127对应的碱基称为“检测对象位点”。将序列编号1的序列(正义链)或其互补序列(反义链)中，包括所述检测对象位点在内的能够与所述多态性检测用探针杂交的区域称为“杂交区域或检测对象序列”。也将所述检测对象位点为野生型的所述检测对象序列称为“野生型检测对象序列”、将所述检测对象位点为突变型的所述检测对象序列称为“突变型检测对象序列”。将所述检测对象序列中，与所述多态性检测用探针完全匹配的检测对象序列称为“完全匹配序列”，与所述多态性检测用探针错配的检测对象序列称为“错配序列”。本发明中，完全匹配是指所述检测对象位点的碱基与所述多态性检测用探针中的对应碱基互补，优选的是指所述检测对象序列和所述多态性检测用探针完全互补。本发明中，错配是指所述检测对象位点的碱基与所述多态性检测用探针中的对应碱基非互补，优选的是指除所述检测对象位点之外，所述检测对象序列和所述多态性检测用探针完全互补。
[0035] 本发明中，也将用于检测所述816多态性(a/t)的探针称为“816用探针”，将用于检测所述822多态性(t/g，t/a)的探针称为“822用探针”。也将所述检测对象序列中，与野生型的检测对象位点完全匹配的探针称为“野生型探针”，将与所述突变型的检测对象位点完全匹配的探针称为“突变型探针”。
[0036] 本发明中，以下将在扩增c-kit基因使得到的扩增物和本发明的多态性检测用探针杂交的情况下，c-kit基因中的扩增区域称为“扩增对象区域”。所述扩增对象区域例如可以是c-kit基因的正义链中的区域，也可以是与其相对应的反义链中的区域，也可以是两者。本发明中，正义链和反义链例如含有正义链的扩增物，反义链的扩增物的意思。
[0037] 本发明中，碱基序列的末端是指碱基序列的5’侧和3’侧的最端部的碱基。5’末端区域是从碱基序列的5’末端起数个碱基的区域，3’末端区域是从碱基序列的3’末端起数个碱基的区域。所述数个碱基例如从末端起1个碱基～10个碱基，1～4个碱基，1～3个碱基，1～2个碱基。本发明中，从碱基序列的末端起第Z位的碱基(Z为正整数)是指，以末端的碱基为第1位的顺序，例如，从末端起第1位的碱基是末端的碱基，从末端起第2位的碱基是末端的相邻碱基。
[0038] <多态性检测用探针>
[0039] 本发明的多态性检测用探针如前所述是c-kit基因的多态性检测用探针，其特征在于，含有下述(P1)～(P4)和(P1’)～(P4’)中至少一种寡核苷酸。
[0040] (P1)寡核苷酸，其由碱基长为4～50碱基长、与含有序列编号1中的碱基编号105～108的碱基序列互补的碱基序列构成，在3’末端区域具有与所述碱基编号105的碱基互补的碱基；
[0041] (P1’)寡核苷酸，其由与所述(P1)寡核苷酸互补的碱基序列构成；
[0042] (P2)寡核苷酸，其由碱基长为7～50碱基长、含有序列编号1中的碱基编号102～108的碱基序列构成，在5’末端区域具有所述碱基编号102的碱基；
[0043] (P2’)寡核苷酸，其由与所述(P2)寡核苷酸互补的碱基序列构成；
[0044] (P3)寡核苷酸，其由碱基长为8～50碱基长、与含有序列编号1中的碱基编号127～134的碱基序列互补的碱基序列构成，在5’末端区域具有与所述碱基编号134的碱基互补的碱基；
[0045] (P3’)寡核苷酸，其由与所述(P3)寡核苷酸互补的碱基序列构成；
[0046] (P4)寡核苷酸，其由碱基长为5～50碱基长、含有序列编号1中的碱基编号123～127的碱基序列构成，在5’末端区域具有所述碱基编号123的碱基；
[0047] (P4’)寡核苷酸，其由与所述(P4)寡核苷酸互补的碱基序列构成。
[0048] 所述(P1)和(P1’)寡核苷酸的碱基长为4～50碱基长，优选的是10～50碱基长，更优选的是13～30碱基长，进一步优选的是15～20碱基长。所述(P2)和(P2’)寡核苷酸的碱基长为7～50碱基长，优选的是10～50碱基长，更优选的是13～30碱基长，进一步优选的是15～20碱基长。所述(P3)和(P3’)寡核苷酸的碱基长为8～50碱基长，优选的是10～50碱基长，更优选的是13～30碱基长，进一步优选的是15～20碱基长。所述(P4)和(P4’)寡核苷酸的碱基长为5～50碱基长，优选的是10～50碱基长，更优选的是13～30碱基长，进一步优选的是15～20碱基长。
[0049] 含有所述(P1)、(P1’)、(P2)和(P2’)寡核苷酸的探针是用于检测所述816多态性(a/t)的探针，即，所述816用探针。在序列编号1的碱基序列中，碱基编号108的碱基(w)为腺嘌呤(a)或胸腺嘧啶(t)，碱基编号127的碱基(d)为胸腺嘧啶(t)、鸟嘌呤(g)或腺嘌呤(a)(以下相同)。
[0050] 所述(P1)寡核苷酸例如与c-kit基因的正义链互补，通过与所述正义链的杂交能够确认所述多态性。
[0051] 所述(P1)寡核苷酸中，与序列编号1的碱基编号108的碱基(w＝a，t)对应的互补的碱基用w表示，所述w为胸腺嘧啶(t)或腺嘌呤(a)。所述w为胸腺嘧啶(t)的所述寡核苷酸与含有D816野生型的检测对象位点的检测对象序列完全匹配。因此，可以说是D816野生型探针。所述w为腺嘌呤(a)的所述寡核苷酸与含有D816V突变型的检测对象位点的检测对象序列完全匹配。因此，可以说是D816V突变型探针。通过这些寡核苷酸是否与所述c-kit基因的检测对象序列完全匹配，能够检测c-kit基因的816多态性。
[0052] 所述(P1)寡核苷酸在3’末端区域具有与所述碱基编号105的碱基互补的碱基，优选的是在从3’末端起数第1～4位的
位置，更优选的是第1～3位，尤其优选的是在第1位(3’末端)或第2位。
[0053] 所述(P1)寡核苷酸例如可举出序列编号2的寡核苷酸，w为胸腺嘧啶或腺嘌呤。所述寡核苷酸作为具体例，例如可举出序列编号6的寡核苷酸。含有序列编号6的所述寡核苷酸的探针例如可以作为D816V突变型探针使用。
[0054] 5′-aatcattcttgatgwctc-3′(序列编号2)
[0055] 5′-aatcattcttgatgactc-3′(序列编号6)
[0056] 所述(P1’)寡核苷酸如前文所述，与所述(P1)寡核苷酸互补。所述(P1’)寡核苷酸例如也可以为如下所述。
[0057] (P1’)寡核苷酸，其由碱基长为4～50碱基长、含有序列编号1中的碱基编号105～108的碱基序列构成，在5’末端区域具有所述碱基编号105的碱基
[0058] 所述(P1’)寡核苷酸与c-kit基因的正义链同源，通过与反义链的杂交，能够确认多态性。
[0059] 所述(P2)寡核苷酸例如与c-kit基因的正义链同源，通过与反义链的杂交，能够确认所述多态性。
[0060] 所述(P2)寡核苷酸中，序列编号1的碱基编号108的碱基(w)如前文所述，是腺嘌呤(a)和胸腺嘧啶(t)。所述w为腺嘌呤(a)的所述寡核苷酸与含有D816野生型的检测对象位点的检测对象序列完全匹配。因此可以说是D816野生型探针。所述w为胸腺嘧啶(t)的所述寡核苷酸与含有D816V突变型的检测对象位点的检测对象序列完全匹配。因此，可以说是D816V突变型探针。通过这些寡核苷酸是否与所述c-kit基因的检测对象序列完全匹配，能够检测c-kit基因的816多态性。
[0061] 所述(P2)寡核苷酸在5’末端区域具有所述碱基编号102的碱基，优选的是在从5’末端起数第1～4位的位置，更优选的是第1～3位，特别优选的是第1位(5’末端)或第2位具有所述碱基编号102的碱基。
[0062] 所述(P2)寡核苷酸例如可以举出序列编号3的寡核苷酸，w为胸腺嘧啶或腺嘌呤。所述寡核苷酸作为具体例，例如可以举出序列编号7的寡核苷酸。含有序列编号7的寡核苷酸的探针例如可以作为D816V突变型探针使用。
[0063] 5′-ccagagwcatcaagaatg-3′(序列编号3)
[0064] 5′-ccagagtcatcaagaatg-3′(序列编号7)
[0065] 所述(P2’)寡核苷酸如前所述，与所述(P2)寡核苷酸互补。所述(P2’)寡核苷酸例如也可以为如下所述。
[0066] (P2’)寡核苷酸，其由碱基长为7～50碱基长、与含有序列编号1中的碱基编号102～108的碱基序列互补的碱基序列构成，在3’末端区域具有与所述碱基编号102补的碱基
[0067] 所述(P2’)寡核苷酸与c-kit基因的正义链互补，通过与所述正义链的杂交能够确认多态性。
[0068] 含有所述(P3)、(P3’)、(P4)和(P4’)寡核苷酸的探针为用于检测所述822多态性(t/g，t/a)的探针，即所述822用探针。在序列编号1的碱基序列中，碱基编号127的碱基(d)为胸腺嘧啶(t)、鸟嘌呤(g)和腺嘌呤(a)(以下相同)。
[0069] 所述(P3)寡核苷酸例如与c-kit基因的正义链互补，通过与所述正义链的杂交能够确认所述多态性。
[0070] 在所述(P3)寡核苷酸中，与序列编号1的碱基编号127的碱基(d＝t，g，a)对应的互补的碱基用h表示，所述h为腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)和胸腺嘧啶(t)。所述h为腺嘌呤(a)的所述寡核苷酸与含有N822野生型的检测对象位点的检测对象序列完全匹配。因此，可以说是N822野生型探针。所述h为胞嘧啶(c)的所述寡核苷酸与含有N822K突变型的检测对象位点的检测对象序列完全匹配。因此可以说是N822K突变型探针。所述h为胸腺嘧啶(t)的所述寡核苷酸与含有N822K突变型的检测对象位点的检测对象序列完全匹配。因此可以说是N822K突变型探针。通过这些寡核苷酸是否与所述c-kit基因的检测对象序列完全匹配能够检测c-kit基因的822多态性。
[0071] 所述(P3)寡核苷酸在5’末端区域具有与所述碱基编号134的碱基互补的碱基，优选在从5’末端起数第1～4位的位置，更优选的是在第1～3位，尤其优选的是在第1位(5’末端)或第2位具有与所述碱基编号134的碱基互补的碱基。
[0072] 所述(P3)寡核苷酸例如可以举出序列编号4所示的寡核苷酸，h为腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)或胸腺嘧啶(t)。所述寡核苷酸作为具体例，例如可以举出序列编号8的寡核苷酸。含有序列编号8的寡核苷酸的探针例如可以作为N822K突变型探针使用。
[0073] 5′-ccacatahttagaatcattctt-3′(序列编号4)
[0074] 5′-ccacatacttagaatcattctt-3′(序列编号8)
[0075] 所述(P3’)寡核苷酸如前所述，与所述(P3)寡核苷酸互补。所述(P3’)寡核苷酸例如也可以为如下所述。
[0076] (P3’)寡核苷酸，其由碱基长为8～50碱基长、含有序列编号1中的碱基编号127～134的碱基序列构成，在3’末端区域具有所述碱基编号134的碱基。
[0077] 所述(P3’)寡核苷酸与c-kit基因的正义链同源，通过与反义链杂交能够确认多态性。
[0078] 所述(P4)寡核苷酸例如与c-kit基因的正义链同源，通过与反义链杂交能够确认所述多态性。
[0079] 在所述(P4)寡核苷酸中，序列编号1的碱基编号127的碱基(d)如前所述，为胸腺嘧啶(t)，鸟嘌呤(g)和腺嘌呤(a)。所述d为胸腺嘧啶(t)的所述寡核苷酸与含有N822野生型的检测对象位点的检测对象序列完全匹配。因此，可以说是N822野生型探针。所述d为鸟嘌呤(g)的所述寡核苷酸与含有N822K突变型的检测对象位点的检测对象序列完全匹配。因此，可以说是N822K突变型探针。所述d为腺嘌呤(a)的所述寡核苷酸与含有N822K突变型的检测对象位点的检测对象序列完全匹配。因此，可以说是N822K突变型探针。通过这些寡核苷酸是否与所述c-kit基因的检测对象序列完全匹配，能够检测c-kit基因的822多态性。
[0080] 所述(P4)寡核苷酸在5’末端区域具有所述碱基编号123的碱基，优选的是在从5’末端起数第1～4位的位置，更优选的是第1～3位，特别优选的是在第1位(5’末端)或第2位具有所述碱基编号123的碱基。
[0081] 所述(P4)寡核苷酸例如可以举出序列编号5所示的寡核苷酸，在该碱基序列中，d为胸腺嘧啶(t)、鸟嘌呤(g)和腺嘌呤(a)。所述寡核苷酸作为具体例，例如可以举出序列编号9所示的寡核苷酸。含有序列编号9的寡核苷酸的探针例如可以作为N822K突变型探针使用。
[0082] 5′-ctaadtatgtggttaaaggaaa-3′(序列编号5)
[0083] 5′-ctaagtatgtggttaaaggaaa-3′(序列编号9)
[0084] 所述(P4’)寡核苷酸前述所述，与所述(P4)寡核苷酸互补。所述(P4’)寡核苷酸例如也可以为如下所述。
[0085] (P4’)寡核苷酸，其由碱基长为5～50碱基长、与含有序列编号1中的碱基编号123～127的碱基序列互补的碱基序列构成，在3’末端区域具有与所述碱基编号123的碱基互补的碱基
[0086] 所述(P4’)寡核苷酸与c-kit基因的正义链互补，通过与所述正义链杂交，能够确认多态性。
[0087] 本发明的多态性检测用探针例如可以是含有所述寡核苷酸的探针，也可以是由所述寡核苷酸构成的探针。
[0088] 本发明的多态性检测用探针例如也可以是由所述(P1)或(P3)寡核苷酸在与所述检测对象位点对应的碱基位点以及与碱基编号105或134的碱基互补的碱基之外，缺失、取代或添加了一个或多个碱基的碱基序列构成，且能够与所述检测对象序列杂交的寡核苷酸。另外，例如，也可以是由所述(P1’)或(P3’)寡核苷酸在与所述检测对象位点对应的碱基位点以及碱基编号105或134的碱基之外，缺失、取代或添加了一个或多个碱基的碱基序列构成，且能够与所述检测对象序列杂交的寡核苷酸。例如，也可以是由所述(P2)或(P4)寡核苷酸在与所述检测对象位点对应的碱基位点以及碱基编号102或123的碱基之外，缺失、取代或添加了一个或多个碱基的碱基序列构成，并且能够与所述检测对象序列杂交的寡核苷酸。另外，例如，也可以是由所述(P2’)或(P4’)寡核苷酸在与所述检测对象位点对应的碱基位点以及与碱基编号102或123的碱基互补的碱基之外，缺失、取代或添加了一个或多个碱基的碱基序列构成，并且能够与所述检测对象序列杂交的寡核苷酸。
[0089] 这些探针例如可以使用任一种，也可以同时使用两种以上。在同时使用两种以上的情况下，例如优选同时使用野生型探针和突变型探针。由此，可以不仅仅检测是野生型还是突变型，而且能够确定突变型。
[0090] 本发明的多态性检测用探针优选为具有标记物质的标记探针，例如优选前述的寡核苷酸被用所述标记物质标记(修饰)。在所述寡核苷酸中，被所述标记物质标记的位点无特别限制，例如优选为5’末端区域或3’末端区域，更优选的是5’末端或3’末端。如后文所述，在所述寡核苷酸中，被所述标记物质标记的碱基例如优选胞嘧啶(c)或鸟嘌呤(g)。所述标记物质例如可以直接标记碱基，也可以间接标记所述碱基。在后者的情况下，例如，可以通过标记含有所述碱基的核苷酸残基中任何位点，来间接标记所述碱基。所述(P1)寡核苷酸例如优选3’末端的胞嘧啶(c)被所述标记物质标记，所述(P2)～(P4)寡核苷酸例如优选5’末端的胞嘧啶(c)被所述标记物质标记。所述(P1’)寡核苷酸例如优选5’末端的鸟嘌呤(g)被所述标记物质标记，所述(P2’)～(P4’)寡核苷酸例如优选3’末端的鸟嘌呤(g)被所述标记物质标记。
[0091] 所述(P1)，(P2’)，(P3’)和(P4’)寡核苷酸优选在3’末端区域具有所述标记物质，具体而言，例如优选在从3’末端起数第1～4位的碱基的位置具有所述标记物质，更优选的是从3’末端起数第1～3位的碱基、特别优选的是从3’末端起数第2位或3’末端的碱基具有所述标记物质。所述(P1)寡核苷酸例如优选与所述碱基编号102～108的任一碱基互补的碱基具有所述标记物质，更优选的是与所述碱基编号105的碱基互补的碱基具有所述标记物质。所述(P2’)寡核苷酸例如优选与所述碱基编号99～105的任一碱基互补的碱基具有所述标记物质，更优选的是与所述碱基编号102的碱基互补的碱基具有所述标记物质。所述(P3’)寡核苷酸例如优选所述碱基编号131～137的任一碱基具有所述标记物质，更优选的是所述碱基编号134的碱基具有所述标记物质。所述(P4’)寡核苷酸例如优选与所述碱基编号120～126的任一碱基互补的碱基具有所述标记物质，更优选的是与所述碱基编号123的碱基互补的碱基具有所述标记物质。
[0092] 所述(P1’)、(P2)、(P3)和(P4)寡核苷酸优选在5’末端区域具有所述标记物质，具体而言，例如在从5’末端起数第1～4位的碱基的位置具有所述标记物质，更优选的是从5’末端起数第1～3位的碱基，尤其优选的是从5’末端起数第2位或5’末端的碱基具有所述标记物质。所述(P1’)寡核苷酸例如优选所述碱基编号102～108的任一碱基具有所述标记物质，更优选的是所述碱基编号105的碱基具有所述标记物质。所述(P2)寡核苷酸例如优选所述碱基编号99～105的任一碱基具有所述标记物质，更优选的是所述碱基编号102的碱基具有所述标记物质。所述(P3)寡核苷酸例如优选与所述碱基编号131～137的任一碱基互补的碱基具有所述标记物质，更优选的是与所述碱基编号134的碱基互补的碱基具有所述标记物质。所述(P4)寡核苷酸例如优选所述碱基编号120～126的任一碱基具有所述标记物质，更优选的是所述碱基编号123的碱基具有所述标记物质。
[0093] 所述标记物质无特别限制，例如，优选所述标记探针单独发出信号，或通过形成杂交体而发出信号。所述信号的种类无特别限制，例如可以举出
荧光、呈色、发色等。在所述信号为荧光的情况下，信号值例如可以举出荧光强度。在所述信号为呈色或发色的情况下，所述信号值例如可以举出反射率、吸光度、透过率等。所述信号例如可以从所述标记物质直接发出，也可以间接发出。
[0094] 所述标记物质无特别限制，例如可举出荧光团等荧光物质等。所述荧光物质例如是荧光素、
磷光体、罗丹明、聚甲炔染料衍
生物等。市售的荧光物质例如可举出Pacific Blue(注册商标，Molecular Probes公司制造)、BODIPY FL(注册商标，Molecular Probes公司制造)、FluorePrime(商品名，Amersham Pharmacia公司制造)、Fluoredite(商品名，Millipore公司制造)、FAM(注册商标，ABI公司制造)、Cy3以及Cy5(商品名，Amersham Pharmacia公司制造)、TAMRA(注册商标，Molecular Probes公司制造)等等。所述荧光物质的检测条件无特别限制，例如可根据使用的荧光物质的种类来适当决定，例如，对Pacific Blue而言检测
波长450～480nm、对TAMRA而言检测波长585～700nm、对BODIPY FL而言检测波长515～555nm时，能够进行检测。使用这样的探针，例如，通过荧光检测作为信号、测定荧光强度作为信号值，就能根据荧光强度的变动容易地确认杂交和解离。
[0095] 所述标记探针例如优选为单独显示信号且通过杂交体形成而不显示信号的标记探针，或者单独不显示信号且通过杂交体形成而显示信号的标记探针。在所述标记物质为荧光物质的情况下，所述标记探针例如优选用所述荧光物质标记，单独显示荧光，且通过杂交体形成而荧光减少(例如淬灭)的探针。这种现象一般称作荧光淬灭现象(Quenching phenomenon)。利用了该现象的探针一般称为荧光淬灭探针。其中，所述荧光淬灭探针例如优选寡核苷酸的3’末端或5’末端用所述荧光物质标记，经标记的所述末端的碱基优选是胞嘧啶(c)或鸟嘌呤(g)。在所述末端的碱基为胞嘧啶(c)的情况下，所述荧光淬灭探针例如优选在与待测核酸形成杂交体时，设计所述荧光淬灭探针的碱基序列，以使所述待测核酸中的经标记的末端的胞嘧啶(c)成对的碱基或距所述成对的碱基1～3碱基的碱基为鸟嘌呤(g)。距所述成对的碱基一个碱基的碱基是指所述成对的碱基的相邻的碱基。这样的探针一般称为鸟嘌呤淬灭探针，已知所谓QProbe(注册商标)。当这样的鸟嘌呤淬灭探针与所述待测核酸杂交时，例如，显示被所述荧光物质标记的末端的胞嘧啶(c)通过靠近所述待测核酸中的鸟嘌呤(g)，所述荧光物质的荧光变弱(荧光强度减少)的现象。如果使用这样的探针，则通过荧光强度的变动，能够容易地确认杂交和解离。同样地，在所述末端的碱基为鸟嘌呤(g)的情况下，所述荧光淬灭探针例如优选在与所述待测核酸形成杂交体时，设计所述荧光淬灭探针的碱基序列，以使所述待测核酸中的与经标记的末端的鸟嘌呤(g)成对的碱基或距所述成对的碱基1～3个碱基的碱基为胞嘧啶(c)。
[0096] 本发明的多态性检测用探针例如可以在3’末端添加
磷酸基。如后文所述，待测核酸例如可以通过PCR等核酸扩增法来制备，此时可以使本发明的多态性检测用探针共存于核酸扩增反应的反应体系中。这种情况下，如果在所述多态性检测用探针的3’末端添加磷酸基，则能够充分防止所述多态性检测用探针自体通过所述核酸扩增反应而延长。通过在3’末端添加前述的标记物质，也能够获得同样的效果。
[0097] 在使用了本发明的多态性检测用探针的多态性的检测中，检测方法没有任何限制，只要是利用所述检测对象序列和探针的杂交的方法即可。作为所述多态性的检测方法，以下说明本发明的多态性检测方法。
[0098] <多态性检测方法>
[0099] 本发明的多态性检测方法如前文所述，是c-kit基因的多态性检测方法，其特征在于，包括使用本发明的c-kit基因的多态性检测用探针，检测c-kit基因的多态性的步骤。
[0100] 本发明的多态性检测方法，例如优选含有下述(A)步骤和(B)步骤。
[0101] (A)改变含有检测所述多态性的待测核酸和本发明的多态性检测用探针的反应体系的温度，测定显示所述待测核酸和所述多态性检测用探针的杂交体的熔解状态的信号值的步骤
[0102] (B)基于伴随所述温度变化的所述信号值的变动，来检测所述待测核酸的所述多态性的步骤
[0103] 本发明的多态性检测方法的特征在于使用本发明的多态性检测用探针，其他的构成或条件等，不限于下述记载。本发明的多态性检测用探针如前所述，优选标记探针。在本发明中，所述反应体系例如为反应液。
[0104] 在本发明中，所述本发明的多态性检测用探针例如可以使用任一种，也可以同时使用两种以上。使用的所述多态性检测用探针的种类例如可以根据检测目标的多态性而适当决定。
[0105] 在使用所述多态性检测用探针的情况下，只要至少一种为本发明的多态性检测用探针即可。所述探针的种类例如可以根据c-kit基因的检测目标的多态性而适当决定。在本发明中，例如，可以仅检测816多态性，也可以仅检测822多态性，也可以在一个反应体系中检测两者的多态性。也可以在一个反应体系中检测所述816多态性和822多态性的至少一者和其他的多态性。
[0106] 在仅检测所述816多态性的情况下，所述本发明的多态性检测用探针中，优选使用所述816用探针。所述816用探针例如可以是D816野生型探针，也可以是D816V突变型探针，也可以同时使用两者。在仅检测所述822多态性的情况下，所述本发明的多态性检测用探针中，优选使用所述822用探针。所述822用探针例如可以是N822野生型探针，也可以是N822K突变型探针，也可以同时使用两者。
[0107] 在同时使用两种所述多态性检测用探针的情况下，例如，各探针优选为具有不同的标记物质的标记探针。所述不同的标记物质例如可以举出检测条件不同的标记物质。
[0108] 在本发明中，所述待测核酸可以是单链核酸，也可以是双链核酸。在所述待测核酸为所述双链核酸的情况下，例如如后文所述，在所述(A)步骤中，优选包括对所述反应体系进行加热，使双链的所述待测核酸解离的步骤。通过将所述双链核酸解离成单链核酸，例如，本发明的多态性检测用探针和所述单链核酸杂交。
[0109] 在本发明中，所述待测核酸例如为试样中原本含有的核酸，也可以是所述核酸的扩增物。后者例如从能够提高检测
精度的
角度优选。所述扩增物例如将所述试样中的所述核酸作为模板核酸，通过核酸扩增法来使之扩增而制备。所述扩增物例如，可以是以所述试样中的DNA为模板的扩增物，也可以是以由所述试样中的RNA合成的cDNA为模板的扩增物。所述试样中的RNA例如可以举出总RNA、mRNA等RNA，所述cDNA例如可以由所述RNA通过RT-PCR(Reverse Transcription PCR)而合成。所述扩增物例如优选为含有所述检测对象序列的区域的扩增物。所述检测对象序列作为所述检测对象位点例如可以只含有所述816多态性的检测对象位点，也可以只含有所述822多态性的检测对象位点，也可以含有所述816多态性和所述822多态性两者。
[0110] 本发明的多态性检测方法例如在所述待测核酸为所述扩增物的情况下，例如还可以含有下述(X)步骤。所述(X)步骤例如优选在所述(A)步骤之前进行。另外，所述(X)步骤例如可以是在所述多态性检测用探针的存在下，在所述反应体系中由所述模板核酸生成所述扩增物的步骤。
[0111] (X)由模板核酸生成所述扩增物的步骤
[0112] 在所述(A)步骤中，所述多态性检测用探针例如只要包含在所述反应体系中即可，其添加时机无特别限制。在所述待测核酸为所述扩增物的情况下，所述(A)步骤中的所述反应体系例如可以使用所述(X)步骤中得到的所述扩增物和所述多态性检测用探针重新制备，也可以是所述(X)步骤中的所述扩增反应的反应体系。在后者的情况下，所述多态性检测用探针例如可以在所述(X)步骤之前或中途添加到所述扩增反应的反应体系中，也可以在所述(X)步骤之后，添加到所述扩增反应的反应体系中。
[0113] 所述核酸扩增法无特别限制，例如可以举出PCR(聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction)法、NASBA(基于核酸序列的扩增，Nucleic Acid Sequence Based Amplification)法、TMA(转录介导扩增，Transcription-Mediated Amplification)法、SDA(链置换扩增，Strand Displacement Amplification)法等，其中优选PCR法。所述核酸扩增法的条件无特别限制，可以通过现有公知的方法来进行。
[0114] 由所述模板核酸生成所述扩增物时，例如优选使用用于扩增含有c-kit基因中的检测目标多态性的区域的引物。所述引物的序列无特别限制，例如，只要能够扩增含有所述检测对象位点的检测对象序列即可，可以根据所述检测对象序列和其周边序列等，利用现有公知的方法来适当设定。所述引物的长度无特别限制，可以设定成一般的长度，例如可以举出10～50碱基长，优选的是10～40碱基长。
[0115] 通过所述引物进行扩增的扩增对象区域无特别限制，可以根据检测目标多态性而适当设定。在检测目标多态性为所述816多态性的情况下，所述扩增对象区域例如优选含有所述816多态性的检测对象位点的区域，即，序列编号1的碱基序列中含有碱基编号108的碱基的区域。在检测目标的多态性为所述822多态性的情况下，所述扩增对象区域例如优选含有所述822多态性的检测对象位点的区域，即，序列编号1的碱基序列中含有碱基编号127的碱基的区域。在检测目标的多态性为所述816多态性和所述822多态性两者的情况下，所述扩增对象区域例如可以是含有所述816多态性的检测对象位点的区域和含有所述822多态性的检测对象位点的区域这两个区域，也可以是含有所述816多态性和所述822多态性两者的检测对象位点的区域，即，序列编号1的碱基序列中由碱基编号108～127的序列构成的区域或含有所述序列的区域。在检测所述816多态性和所述822多态性两者的情况下，例如，由于能够减少使用的引物数，因此如前文所述，优选将序列编号1的碱基序列中，含有碱基编号108～127的序列的区域作为扩增对象区域。
[0116] 所述引物例如可以使用扩增基因的正义链的正向引物(以下也称“F引物”)和扩增反义链的反向引物(以下也称“R引物”)中的任一者，优选将两者作为一对的引物对。以下例示F引物和R引物，但是其为一个例子而已，并不限制本发明。
[0117] 通过由下述F1寡核苷酸构成的F引物和下述R1或R2寡核苷酸构成的R引物，例如，能够扩增含有816多态性和822多态性两者的区域，即，序列编号1所示的碱基序列中含有碱基编号108～127的序列的区域。
[0118] (F引物)
[0119] F1(序列编号10)
[0120] 5′-tgtattcacagagacttggca-3′
[0121] (R引物)
[0122] R1(序列编号11)
[0123] 5′-gagaatgggtactcacgtttc-3′
[0124] R2(序列编号12)
[0125] 5′-aaatcctttgcaggactgtc-3′
[0126] 所述F引物和所述R引物例如可以为设计成能够与含有所述检测对象位点的区域
退火的引物。这种情况下，所述检测对象位点例如可以设定为野生型和突变型中的任一种。能够与含有野生型的检测对象位点的区域退火的引物例如能够扩增野生型的检测对象序列，以下也称野生型引物。能够与含有突变型的检测对象位点的区域退火的引物例如能够扩增突变型的检测对象序列，以下也称突变型引物。在所述引物中，与所述检测对象位点对应的碱基的位置无特别限制，例如优选3’末端。
[0127] 以下例示能够与含有816多态性的检测对象位点的区域退火的F引物。以下将这样的引物称作816用引物。所述引物为用于扩增c-kit基因的引物，其特征在于由下述(F2)寡核苷酸构成。下述寡核苷酸中，w为腺嘌呤(a)或胸腺嘧啶(t)。通过该引物，例如也能够扩增含有816多态性的检测对象位点和822多态性的检测对象位点的区域。
[0128] (F2)寡核苷酸，其碱基长为10～50碱基长，在序列编号1所示的碱基序列中以碱基编号108的碱基(w)为3’末端
[0129] 所述(F2)寡核苷酸例如可以举出下述(F2-wt)和(F2-mt)寡核苷酸。所述(F2-wt)寡核苷酸的3’末端能够与D816野生型的检测对象位点退火。所述(F2-mt)寡核苷酸的3’末端能够与D816V突变型的检测对象位点退火。
[0130] (F2-wt)寡核苷酸，其碱基长为10～50碱基长，在序列编号1的碱基序列中，以碱基编号108的碱基(w)为3’末端，所述w为腺嘌呤(a)
[0131] (F2-mt)寡核苷酸，其碱基长为10～50碱基长，在序列编号1的碱基序列中，以碱基编号108的碱基(w)为3’末端，所述w为胸腺嘧啶(t)
[0132] 作为所述(F2-wt)的具体例，以下示出下述(F2-wt1)，作为所述(F2-mt)的具体例以下示出下述(F2-mt1)。在下述序列中，大写字母的碱基为与检测对象位点退火的碱基。
[0133] F2-wt1(序列编号13)
[0134] 5′-attttggtctagccagagA-3′
[0135] F2-mt1(序列编号14)
[0136] 5′-tgattttggtctagccagagT-3′
[0137] 以下，例示出能够与含有822多态性的检测对象位点的区域退火的F引物。以下将这样的引物称为822用引物。所述引物为用于扩增c-kit基因的引物，其特征在于由下述(F3)寡核苷酸构成。下述寡核苷酸中，d为胸腺嘧啶(t)，鸟嘌呤(g)或腺嘌呤(a)。
[0138] (F3)寡核苷酸，其碱基长为10～50碱基长，在序列编号1的碱基序列中，以碱基编号127的碱基(d)为3’末端
[0139] 所述(F3)寡核苷酸例如可以举出下述(F3-wt)和(F3-mt)寡核苷酸。所述(F3-wt)寡核苷酸的3’末端能够与N822野生型的检测对象位点退火。在所述(F3-mt)寡核苷酸中，d为r(鸟嘌呤或腺嘌呤)，3’末端能够与N822K突变型的检测对象位点退火。
[0140] (F3-wt)寡核苷酸，其碱基长为10～50碱基长，在序列编号1的碱基序列中，以碱基编号127的碱基(d)为3’末端，所述d为胸腺嘧啶(t)
[0141] (F3-mt)寡核苷酸，其碱基长为10～50碱基长，在序列编号1的碱基序列，以碱基编号127的碱基(d)为3’末端，所述d为r
[0142] 下面作为所述(F3-wt)的具体例示出下述(F3-wt1)，作为所述(F3-mt)的具体例，示出下述(F3-mt1g)和(F3-mt1a)。下述序列中，大写字母的碱基为与检测对象位点退火的碱基。
[0143] F3-wt1(序列编号15)
[0144] 5′-cagagacatcaagaatgattctaaT-3′
[0145] F3-mt1g(序列编号16)
[0146] 5′-cagagacatcaagaatgattctaaG-3′
[0147] F3-mt1a(序列编号17)
[0148] 5′-cagagacatcaagaatgattctaaA-3′
[0149] 所述F引物和所述R引物例如也可以在其5’末端具有添加序列。所述添加序列的长度无特别限制，例如为1～10碱基长，优选的是2～7碱基长。所述添加序列无特别限制，例如，可以举出gatcg，tggca等的序列。以下，例示出具有所述添加序列、能够与含有822多态性的检测对象位点的区域退火的F引物。F3-wt2能够与野生型的检测对象位点退火，F3-mt2g和F3-mt2a能够与突变型的检测对象位点退火。下述序列中，带下划线的部分为所述添加序列，大写字母的碱基为与检测对象位点退火的碱基。
[0150] F3-wt2(序列编号18)
[0151] 5′-gatcgcagagacatcaagaatgattctaaT-3′
[0152] F3-mt2g(序列编号19)
[0153] 5′-tggcacagagacatcaagaatgattctaaG-3′
[0154] F3-mt2a(序列编号20)
[0155] 5′-tggcacagagacatcaagaatgattctaaA-3′
[0156] 在本发明中，所述引物的组合无特别限制，例如，优选将F引物和R引物作为一对引物对使用。而且，对于F引物和R引物的至少一者，优选同时使用所述野生型引物和所述突变型引物。组合的具体例例如可以举出扩增野生型的检测对象区域的F引物(野生型F引物)和扩增突变型的检测对象区域的F引物(突变型F引物)和R引物的组合。通过同时使用所述野生型引物和所述突变型引物，例如，即使在突变型c-kit基因为微量的情况下，也能够相比于野生型c-kit基因高效率地扩增突变型c-kit基因。并且，结果，例如能够高精度、高灵敏度地检测突变型的检测对象序列。
[0157] 所述引物的组合无特别限制，例如，可以举出以下的组合。
[0158] (1)F2-wt1和F2-mt1的组合
[0159] (2)F3-wt1和F3-mt1g或F3-mt1a的组合
[0160] (3)F3-wt2和F3-mt2g或F3-mt2a的组合
[0161] (4)(1)～(3)的至少一者和R1和R2的至少一者的组合
[0162] (5)F1、R1和R2的至少一者的组合
[0163] 所述引物和所述多态性检测用探针的组合无特别限制。具体而言，例如对于例示的所述(1)～(5)的引物的组合，优选使用下述探针。
[0164] 所述引物的组合(1)和(4)中使用的探针例如是816用探针和822用探针的至少一者，优选的是816用探针，更优选的是突变型的816用探针。所述引物的组合(2)、(3)和(4)中使用的探针例如为822用探针，优选为突变型的822用探针。所述引物的组合(5)中使用的探针例如为816用探针和822用探针的至少一者，优选的是816用探针和822用探针，更优选的是，突变型的816用探针和突变型的822用探针。
[0165] 在所述反应体系中，所述引物的添加比例无特别限制，例如，对于一种引物，例如为0.1～2μmol/L，优选的是0.25～1.5μmol/L，特别优选的是0.5～1μmol/L。在使用F引物和R引物的情况下，所述F引物(F)和R引物(R)的添加比例(摩尔比F∶R)无特别限制，例如优选1∶0.25～1∶4，更优选的是1∶0.5～1∶2。
[0166] 在所述(A)步骤中，相对于所述待测核酸的本发明的多态性检测用探针的添加比例(摩尔比)无特别限制，从能够充分确保检测信号的角度，优选1倍以下。此时，所述待测核酸例如可以为具有完全匹配序列的完全匹配核酸和具有错配序列的错配核酸的合计，也可以是含有完全匹配序列的扩增物和含有错配序列的扩增物的合计。此外，待测核酸中的完全匹配核酸的比例通常是不清楚的，但是结果上，所述多态性检测用探针的添加比例(摩尔比)优选相对于完全匹配核酸(含有完全匹配序列的扩增物)为10倍以下，更优选的是5倍以下，进一步优选的是3倍以下。其下限无特别限制，例如为0.001倍以上，优选为0.01倍以上，更优选的是0.1倍以上。本发明的多态性检测用探针相对于所述待测核酸的添加比例例如可以是相对于双链核酸的摩尔比，也可以是相对于单链核酸的摩尔比。
[0167] 所述反应体系中的本发明的多态性检测用探针的添加比例无特别限制，例如，对于一种所述多态性检测用探针，优选添加处于10～1000nmol/L的范围，更优选的是20～500nmol/L。例如，从确保充分的信号值的角度，所述反应体系中，所述多态性检测用探针相对于所述待测核酸的摩尔比例如优选1倍以下。所述多态性检测用探针相对于所述待测核酸的添加比例例如可以为相对于双链核酸的摩尔比，也可以为相对于单链核酸的摩尔比。
[0168] 应用本发明的多态性检测方法的试样无特别限制，可以举出生物试样。所述生物试样的具体例例如可以举出
全血、白血球细胞等血细胞、骨髓、
口腔粘膜等口腔内细胞、指甲或毛发等
体细胞、生殖细胞、吐出的痰液、
羊水、
石蜡包埋组织、尿、胃液、
洗胃液等。在本发明中，所述试样的采集方法、从所述试样制备待测核酸的制备方法等无特别限制，可以采用现有公知的方法。
[0169] 本发明的多态性检测方法如前文所述，能够在所谓的Tm分析(也称熔解曲线分析)中利用。这里对Tm分析中的Tm值进行说明。例如，对含有双链DNA的溶液进行加热时，260nm处的吸光度上升。这是因为双链DNA中的两链之间的氢键由于加热处理而断裂，解离成单链DNA(DNA的熔解)。并且，当全部双链DNA解离成单链DNA时，其吸光度显示为加热开始时的吸光度(仅双链DNA的吸光度)的约1.5倍左右，由此能够判断熔解完成。基于该现象，熔解温度Tm一般定义为吸光度达到吸光度总上升量的50％时的温度。
[0170] 在所述(A)步骤中，显示所述待测核酸和所述多态性检测用探针的杂交体的熔解状态的信号的测定可以是上述的260nm处的吸光度测定，也可以是标记物质的信号测定。具体而言，作为所述多态性检测用探针，如前文所述，优选使用经所述标记物质标记的标记探针，进行所述标记物质的信号测定。所述标记探针例如可以举出单独显示信号并且通过杂交体形成而不显示信号的标记探针，或者为单独不显示信号且通过杂交体形成而显示信号的标记探针。如果是前者那样的探针，则在与所述扩增物形成杂交体(双链DNA)时不显示信号，通过加热所述探针从所述扩增物解离时显示信号。如果是后者的探针，则通过与所述扩增物形成杂交体(双链DNA)而显示信号，通过加热所述探针从所述扩增物游离时信号减少(消失)。因此，通过检测所述标记物质的信号，能够与所述260nm处的吸光度测定同样地，进行杂交体的熔解的过程的检测以及Tm值的决定等。所述标记物质的信号检测例如只要是对所述标记物质的信号在特有的条件下进行检测即可，所述条件例如可以举出激发波长、检测波长等。所述标记探针以及所述标记物质如前文所述。
[0171] 在所述(B)步骤中，基于信号值的变动对所述多态性的检测可以通过现有的方法来进行。作为具体例，例如可以将所述信号值的变动，与所述多态性检测用探针和突变型的检测对象序列的杂交体的变动和/或所述多态性检测用探针和野生型的检测对象序列的杂交体的变动进行比较，判断多态性是突变型还是野生型。即，如果与突变型相同则判断为突变型，如果与野生型相同则判断为野生型。另外，例如基于所述信号的变动求Tm值，通过Tm值的比较能够判断多态性。首先，基于所述信号值的变动求Tm值。接着，将所测定的所述Tm值与预先求出的评价基准，即关于野生型的检测对象序列的Tmwt值和/或关于突变型的检测对象序列的Tmmt值相比较。并且，如果测定的Tm值与所述评价基准的Tm值wt相同或者同等程度，则可以判断为野生型，如果比Tmwt值低则可以判断为突变型，如果与所述评价基准的Tmmt值相同或同等程度则可以判断为突变型，如果比Tmmt值低则可以判断为野生型。同等程度例如为±3℃左右。
[0172] 接着，举例说明本发明的多态性检测方法。本例是以下的示例：作为本发明的多态性检测用探针，使用以荧光物质标记的标记探针，在所述多态性检测用探针的存在下，进行由模板核酸的扩增，将所得到的扩增物作为所述待测核酸。本发明的多态性检测方法的特征在于使用本发明的多态性检测用探针本身，其他的步骤或条件无任何限制。
[0173] 首先，从所述生物试样分离基因组DNA。从所述生物试样分离基因组DNA可以通过现有公知的方法来进行。具体而言，例如可以使用市售的基因组DNA分离盒(商品名GFX Genomic Blood DNA Purification kit；GE Healthcare Bioscience公司制造)等。
[0174] 接着，向含有分离出的基因组DNA的试样中添加标记探针，制备反应液。所述标记探针例如如前文所述，优选QProbe(注册商标)。
[0175] 所述标记探针例如可以添加到含有分离的基因组DNA的试样中，也可以在
溶剂中与基因组DNA混合。所述溶剂无特别限制，例如，可以举出含Tris-HCl等缓冲液、KCl、MgCl2、MgSO4、甘油等的溶剂、PCR用反应液等扩增用反应液等现有公知的溶剂。
[0176] 所述标记探针的添加时机无特别限制，例如在进行扩增反应之前、中途或扩增反应之后添加。其中，例如为了不必为添加所述标记探针而将所述反应液暴露到外部环境中，并且，为了能够连续进行所述扩增反应和信号值的测定，因此优选在所述扩增反应之前向所述反应液中添加所述标记探针。这种情况下，所述标记探针如前文所述，优选3’末端用标记物质或磷酸基修饰。
[0177] 接着，以分离出的基因组DNA为模板，在所述标记探针的存在下，通过PCR等核酸扩增法，来扩增含有检测目标的多态性发生的检测对象位点的序列。以下，作为核酸扩增法以PCR为例，说明本发明，但是不限于此。PCR的条件无特别限制，可以通过现有公知的方法来进行。
[0178] 具体而言，使用含有所述基因组DNA、所述标记探针和所述引物的所述反应液进行PCR。该反应液的组成无特别限制，本领域技术人员能够适当设定，例如除了所述基因组DNA、所述标记探针和所述引物之外，也可以含有DNA聚合酶等聚合酶、核苷三磷酸、缓冲液、各种催化剂等。所述反应液中的所述标记探针和所述引物的添加比例无特别限制，例如可以分别举出前述的范围。
[0179] 所述DNA聚合酶无特别限制，例如可以使用现有公知的来源于耐热细菌的聚合酶。具体例子中，来源于水生栖热菌(Thermus aquaticus)的DNA聚合酶(美国专利4,889,818和5,079,352)(商品名Taq聚合酶)、来源于嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的DNA聚合酶(WO 91/09950)(rTth DNA聚合酶)、来源于极端嗜热菌(Pyrococcus furiosus)的DNA聚合酶(WO 92/9689)(Pfu DNA聚合酶，Stratagenes公司制造)、来源于附岸热球菌(Thermococcus litoralis)的DNA聚合酶(EP-A455430(商标Vent)：New England Biolabs公司制造)等可商业获得，其中来源于水生栖热菌(Thermus aquaticus)的耐热性聚合酶是优选的。
[0180] 所述反应液中的DNA聚合酶的添加比例无特别限制，例如为1～100U/mL，优选的是5～50U/mL，更优选的是20～40U/mL。DNA聚合酶的活性单位(U)一般来说，以活化的鲑鱼精DNA作为模板引物，在活性测定用反应液中，在74℃，30分钟内将10nmol的所有核酸转换为酸不溶性沉淀物的活性为1U。所述活性测定用反应液的组成例如是25mmol/L TAPS缓冲液(pH 9.3，25℃)、50mmol/L KCl、2mmol/L MgCl2、1mmol/L巯基
乙醇、200μmol/32
L dATP、200μmol/L dGTP、200μmol/LdTTP、100μmol/L“α- P”dCTP、0.25mg/mL活化的鲑鱼精DNA。
[0181] 所述三磷酸核苷通常可举出dNTP(dATP、dCTP、dGTP以及dTTP或dUTP)。所述反应液中的dNTP的添加比例无特别限制，例如是0.01～1mmol/L，优选为0.05～0.5mmol/L，更优选为0.1～0.3mmol/L。
[0182] 所述缓冲液例如举出Tris-HCl、Tricine、MES、MOPS、HEPES、CAPS等，可以使用市售的PCR用缓冲液和市售的PCR
试剂盒的缓冲液等。
[0183] 所述反应液还可以含有肝素、甜菜碱、KCl、MgCl2、MgSO4、甘油等，这些物质的添加比例，例如被设定在不妨碍PCR反应的范围内即可。
[0184] 所述反应液的总体积无特别限制，例如可以根据热循环仪等使用的仪器进行适当设定，其通常为1～500μL，优选为10～100μL。
[0185] 下面进行PCR反应。所述PCR的循环条件无特别限制，例如，关于(1)作为待测核酸的双链DNA解离为单链DNA，(2)引物退火为所述单链DNA，(3)所述引物通过聚合酶反应的延伸，可分别例示下表1的条件。此外，循环数也无特别限制，下述(1)～(3)的三步作为1个循环，例如30个循环以上是优选的。所述循环数总和的上限无特别限制，例如是100个循环以下，优选为70个循环以下，进一步优选为50个循环以下。各步的温度变化例如可以通
过热循环仪等进行自动控制。
[0186] [表1]
[0187]
[0188] 所述反应液中的标记探针的添加比例无特别限制，例如，添加所述标记探针为10～1000nmol/L的范围是优选的，更优选为20～500nmol/L的范围。例如，为了确保充分的信号值，所述反应液中，所述标记探针相对于所述待测核酸的摩尔比例如优选为1倍以下。所述标记探针相对于所述待测核酸的添加比例，例如可以是相对于双链核酸的摩尔比，也可以是相对于单链核酸的摩尔比。
[0189] 下面进行得到的扩增产物(双链DNA)的解离以及经解离得到的单链DNA与所述标记探针的杂交。这例如可在所述标记探针存在的情况下，改变所述反应液的温度来进行。此时，如前文所述，对于预先添加了所述标记探针的所述反应液来说，优选在扩增反应结束后改变所述反应液的温度。
[0190] 所述解离步骤中的加热温度只要是双链的所述扩增产物能解离为单链的温度则无特别限制，例如是85～95℃。加热时间无特别限制，通常为1秒～10分钟，优选为1秒～5分钟。
[0191] 解离的单链DNA与所述标记探针的杂交例如可在所述解离步骤之后，通过降低所述解离步骤中的加热温度来实现。温度条件例如是40～50℃。所述温度下的处理时间无特别限制，例如是1～600秒。
[0192] 然后，改变所述反应液的温度，测定显示所述扩增产物与所述标记探针的杂交体的熔解状态的信号值。具体而言，例如，对所述反应液(所述单链DNA与所述标记探针的杂交体)进行加热，测定伴随温度上升的信号值的变化。如前文所述，使用鸟嘌呤淬灭探针，即末端的胞嘧啶(c)被标记的探针时，其与单链DNA杂交的状态下荧光强度减少(或淬灭)，解离的状态下则发出荧光。因此，可以对荧光强度减少(或淬灭)的杂交体慢慢加热，测定伴随温度上升的荧光强度的增加。
[0193] 测定所述荧光强度的变动时的温度范围无特别限制。起始温度例如是室温～85℃，优选为25～70℃；终止温度例如是40～105℃。此外，温度的上升速度无特别限制，例如是0.1～20℃/秒，优选为0.3～5℃/秒。
[0194] 下面，分析所述信号值的变化，来确定Tm值。具体地，根据测得的荧光强度计算出各温度下每单位时间的荧光强度的变化量(-d荧光强度增加量/dt)，将显示最低值的温度确定为Tm值。还可以将每单位时间内荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/dt)的最高点确定为Tm值。作为所述标记探针，使用单独不显示信号并且通过杂交体形成而显示信号的探针，而不使用荧光淬灭探针时，与之前相反，测定荧光强度的减少量即可。另外，例如作为所述标记探针，使用标记了检测波长不同的标记物质的多个探针，可以对于每个所述检测波长分析所述信号值的变动。
[0195] 所述Tm值，例如可根据已有公知的MELTCALC
软件(http://www.meltcalc.com)计算得出，或者，也可以根据最邻近碱基对法(Nearest Neighbor Method)来确定。
[0196] 接下来，根据所述Tm值来确定所述检测对象序列中、c-kit基因的多态性是所述野生型还是所述突变型。所述Tm分析中，完全互补的杂交体(匹配)比起一个碱基或者多个碱基不同的杂交体(错配)，能够获得显示解离的Tm值变高的结果。因此，预先针对所述标记探针，确定与检测对象位点匹配的杂交体(例如，完全互补的杂交体)的Tm值和与检测对象位点错配的杂交体(例如，一个碱基或多个碱基不同的杂交体)的Tm值作为评价基准值，由此能够确定所述检测对象序列的多态性是所述野生型还是所述突变型。如前文所述，如果同时使用所述野生型探针和突变型探针，例如通过显示完全互补的杂交体的Tm值的是哪个探针，也能够确定所述多态性的种类。
[0197] 例如，在使用突变型探针作为所述探针的情况下，如果显示完全互补的匹配的杂交体的Tm值，则能够判断多态性为突变型，如果显示错配的杂交体的Tm值，则能够判断多态性为野生型。另一方面，例如，作为所述探针使用野生型探针的情况下，如果显示完全互补的匹配的杂交体的Tm值，则能够判断多态性为野生型，如果显示错配的杂交体的Tm值，则能够判断多态性为突变型。
[0198] 在本发明中，也可以替代如前文所述升高含有所述多态性检测用探针的反应体系的温度(对杂交体加热)，测定伴随温度上升的信号变动的方法，例如进行杂交体形成时的信号变动的测定。即，也可以在降低含有所述多态性检测用探针的反应体系的温度形成杂交体时，测定伴随所述温度下降的信号变动。
[0199] 作为具体例，在使用单独显示信号且通过形成杂交体而不显示信号的标记探针(例如，鸟嘌呤淬灭探针)的情况下，所述标记探针在单链DNA和所述标记探针解离的状态下发出荧光，而由于温度下降形成杂交体时，所述荧光减少(或淬灭)。因此，例如可以慢慢降低所述反应液的温度，测定伴随温度下降的荧光强度的减少。另一方面，使用单独不显示信号、且通过杂交体形成而显示信号的标记探针的情况下，所述标记探针在所述单链DNA与所述标记探针解离的状态下不发出荧光，而由于温度降低形成杂交体时发出荧光。因此，例如可以慢慢降低所述反应液的温度，测定伴随温度降低的荧光强度的增加。
[0200] 本发明如前文所述，例如可以在一个反应体系中，使用两种以上的多态性检测用探针。在使用多种多态性检测用探针的情况下，各探针的添加时机，例如与前述相同，优选在所述(A)步骤之前同時添加，在进行扩增反应的情况下，优选在扩增反应之前同时添加。
[0201] 多个探针例如可以是D816野生型探针和D816V突变型探针的组合，也可以是N822野生型探针和N822K突变型探针的组合。所述多个探针例如可以是816多态性用探针和822多态性用探针的组合，例如，可以是D816野生型探针和D816V突变型探针中的至少一种与N822野生型探针和N822K突变型探针中的至少一种的组合。
[0202] 在一个反应体系中检测816多态性和822多态性两者时，例如能够同时使用816用探针和822用探针。此时，所述816用探针和822用探针如前文所述，优选具有分别不同的标记物质。并且能够通过改变所述反应液的温度，根据各标记物质的测定条件来检测信号，来确定各自的Tm值。
[0203] 如前文所述，对于目标多态性，也能够同时使用所述野生型探针和突变型探针。在这种情况下，例如通过显示完全互补(匹配)的杂交体的Tm值的是哪个探针，也能够确定所述多态性的种类。例如，在使用具有不同的标记物质的突变型探针和野生型探针的情况下，对于突变型探针，如果显示完全互补(匹配)的杂交体的Tm值，则能够判断多态性为突变型，对于野生型探针，如果显示完全互补(匹配)的杂交体的Tm值，则能够判断多态性为野生型。
[0204] 本发明的多态性检测方法，例如可以同时使用用于检测c-kit基因的多态性的本发明的多态性检测用探针和用于检测其他的基因的多态性的探针。通过同时使用本发明的多态性检测用探针和用于检测其他的基因的探针，能够在同一反应体系中检测含有c-kit基因的二种以上的基因的多态性。
[0205] <探针试剂>
[0206] 本发明的探针试剂的特征在于含有本发明的多态性检测用探针。本发明的多态性检测用探针如前文所述，可以是任一种探针，也可以含有两种以上的探针。所述探针的组合能够如前所述地例示，但是不限于此。
[0207] <引物和引物试剂>
[0208] 本发明的引物是c-kit基因的扩增用引物，其特征在于由下述(F2)和(F3)中的至少一种寡核苷酸构成。
[0209] (F2)寡核苷酸，其碱基长为10～50碱基长，在序列编号1的碱基序列中，以碱基编号108的碱基w为3’末端
[0210] (F3)寡核苷酸，其碱基长为10～50碱基长，在序列编号1的碱基序列中，以碱基编号127的碱基d为3’末端
[0211] 由所述(F2)寡核苷酸构成的引物为所述816用引物，w为腺嘌呤(a)或胸腺嘧啶(t)。由所述(F3)寡核苷酸构成的引物为所述822用引物，d为胸腺嘧啶(t)、鸟嘌呤(g)或腺嘌呤(a)。所述(F2)和(F3)寡核苷酸如前所述。
[0212] 本发明的引物试剂为含有用于扩增c-kit基因的引物的试剂，其特征在于含有所述本发明的引物。本发明的引物试剂只要含有所述本发明的引物即可，其他的构成没有任何限制。本发明的引物试剂还可以具有用于扩增正义链的反向引物。
[0213] 在本发明的引物试剂中，所述本发明的引物可以是任一种，也可以含有两种以上。所述引物的种类例如能够根据目标的扩增对象区域而适当确定。在扩增含有所述816多态性的检测对象序列的情况下，优选含有所述(F2)寡核苷酸，尤其是优选含有所述(F2-wt)寡核苷酸和(F2-mt)寡核苷酸。在扩增含有所述822多态性的检测对象序列的情况下，优选含有所述(F3)寡核苷酸，尤其是优选含有所述(F3-wt)寡核苷酸和(F3-mt)寡核苷酸。
如此，通过含有野生型引物和突变型引物两者作为能够与检测对象位点退火的引物，例如，能够特异性地扩增微量的突变型检测对象序列。另外，所述引物的组合可以如前文所述地例示，但是不限于此。
[0214] <多态性检测用试剂>
[0215] 本发明的多态性检测用试剂是用于检测c-kit基因的多态性的试剂，其特征在于含有本发明的多态性检测用探针。在本发明中，含有前述的本发明的多态性检测用探针为特征，其他的构成和条件没有任何限制。本发明的多态性检测用试剂例如也可以说是在c-kit基因的多态性的检测中使用的探针试剂盒。
[0216] 所述多态性检测用试剂例如可以含有一种所述多态性检测用探针，也可以含有两种以上，能够根据检测目标的多态性而适当确定。在仅检测所述816多态性的情况下，例如优选含有所述816用探针。所述816用探针例如可以是D816野生型探针，也可以是D816V突变型探针，也可以含有两者。在仅检测所述822多态性的情况下，例如优选含有所述822用探针。所述822用探针例如可以是N822野生型探针，也可以是N822K突变型探针，也可以含有两者。所述探针的组合可以如前所述地例示，但是不限于此。
[0217] 本发明的多态性检测用试剂还可以含有用于扩增含有c-kit基因中的检测对象位点的区域的引物或引物对。引物例如可以举出前述的引物，优选含有本发明的引物。所述引物的组合可以如前所述地例示，但是不限于此。
[0218] 本发明的多态性检测用试剂除此之外，例如也可以含有核酸扩增反应所需的成分。具体例例如可以举出DNA聚合酶等聚合酶、核苷三磷酸、缓冲液、各种催化剂等。本发明的多态性检测用试剂也可以是检测试剂试剂盒，而且还可以含有使用
说明书。
[0219] 接着说明本发明的实施例。但是，本发明不限于下述实施例。对于BSA和NaN3而言，％表示w/v％，对于甘油而言，％表示v/v％，其他表示w/w％。实施例[0220] [实施例1]
[0221] 本例中，在野生型质粒和突变型质粒共存的情况下，进行Tm分析，检测c-kit基因的多态性。
[0222] 作为c-kit基因的部分序列，准备了插入有具有D816野生型和N822野生型的寡核苷酸(序列编号23)的野生型质粒(WT)、插入有具有D816V突变型和N822野生型的寡核苷酸(序列编号24)的D816V突变型质粒(D816V)、插入有具有D816野生型和N822K突变型的寡核苷酸(序列编号25)的N822K突变型质粒(N822K)。在所述野生型质粒(WT)中，序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号108的碱基(w)为腺嘌呤(a)，碱基编号127的碱基(d)为胸腺嘧啶(t)。在所述D816V突变型质粒(D816V)中，序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号108的碱基(w)为胸腺嘧啶(t)，碱基编号127的碱基(d)为胸腺嘧啶(t)。在所述N822K突变型质粒(N822K)中，序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号108的碱基(w)为腺嘌呤(a)，碱基编号127的碱基(d)为鸟嘌呤(g)。在下述序列编号23～序列编号25中，带下划线部分的大写字母的碱基对应于序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号108和127的碱基。
[0223] WT(序列编号23)
[0224] 5’-cactatagtattaaaaagttagttttcactctttacaagttaaaatgaatttaaatggttttcttttctcctccaacctaatagtgtattcacagagacttggcagccagaaatatcctccttactcatggtcggatcacaaagatttgtgattttggtctagccagagAcatcaagaatgattctaaTtatgtggttaaaggaaacgtgagtacccattctctgcttgacagtcctgcaaaggatttttagtttcaactttcgataaaaattgtttcctgtgactttcataatgtaaat-3’D816V(序列编号24)
[0225] 5’-cactatagtattaaaaagttagttttcactctttacaagttaaaatgaatttaaatggttttcttttctcctccaacctaatagtgtattcacagagacttggcagccagaaatatcctccttactcatggtcggatcacaaagatttgtgattttggtctagccagagTcatcaagaatgattctaaTtatgtggttaaaggaaacgtgagtacccattctctgcttgacagtcctgcaaaggatttttagtttcaactttcgataaaaattgtttcctgtgactttcataatgtaaat-3’
[0226] N822K(序列编号25)
[0227] 5’-cactatagtattaaaaagttagttttcactctttacaagttaaaatgaatttaaatggttttcttttctcctccaacctaatagtgtattcacagagacttggcagccagaaatatcctccttactcatggtcggatcacaaagatttgtgattttggtctagccagagAcatcaagaatgattctaaGtatgtggttaaaggaaacgtgagtacccattctctgcttgacagtcctgcaaaggatttttagtttcaactttcgataaaaattgtttcctgtgactttcataatgtaaat-3’
[0228] 以以下所示的预定比例混合这些质粒，制备三种质粒试样。质粒试样每1μL为4
2×10 拷贝/μL。
[0229] [表2]
[0230]
[0231] 对下述表3的PCR反应液50μL，使用全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(注册商标)，爱科来公司制)，进行PCR和Tm分析。所述PCR中，在95℃下60秒之后，以95℃1秒和58℃15秒为一个循环反复进行50个循环。并且，所述Tm分析如下进行：将所述反应液在95℃下处理1秒以及40℃下处理60秒之后，将温度上升速度设为1℃/3秒，从40℃加热到95℃，测定检测波长445～480nm(Pacific Blue)和520～555nm(BODIPY FL)下的荧光强度随时间的变化。
[0232] [表3]
[0233]
[0234]
[0235] 所述F引物和R引物的序列如下所示。
[0236] (F引物)
[0237] F1(序列编号10)
[0238] 5′-tgtattcacagagacttggca-3′
[0239] (R引物)
[0240] R1(序列编号11)
[0241] 5′-gagaatgggtactcacgtttc-3′
[0242] 使用下述序列的探针作为所述816用探针和822用探针。下述D816V突变型探针1为与D816V突变型的c-kit基因的正义链中的检测对象序列完全匹配的探针，在所述序列中，带下划线部分的碱基为与D816V突变型互补的碱基。所述D816V突变型探针1的3’末端用
荧光染料BODIPY FL标记。下述N822K突变型探针1为与N822K突变型的c-kit基因的正义链中的检测对象序列完全匹配的探针，所述序列中，带下划线部分的碱基为与N822K突变型互补的碱基。所述N822K突变型探针1的5’末端用荧光染料Pacific Blue标记，
3’末端磷
酸化。
[0243] (816用探针)
[0244] D816V突变型探针1(序列编号6)
[0245] 5′-aatcattcttgatgactc-(BODIPY FL)-3
[0246] (822用探针)
[0247] N822K突变型探针1(序列编号8)
[0248] 5′-(Pacific Blue)-ccacatacttagaatcattctt-P-3
[0249] 其结果示于图1。图1是表示伴随温度上升的荧光强度的变化的Tm分析的图。在图1中，(A)为WT 100％的结果，(B)为D816V 20％的结果，(C)为N822K 20％的结果。在图1中，白圈(○)所示的图为关于822用探针的熔解曲线，黑圈(●)所示的图为关于816用探针的熔解曲线。横轴表示测定时的温度(℃)，纵轴表示荧光强度的变化(以下也称“荧光变化量”)，单位为荧光强度变化量的微分值即“d荧光强度增加量/dt”(dF/dt)。与所述D816V突变型探针1的Tm值，D816(WT)在48℃附近，D816V在54℃附近，与所述N822K突变型探针1的Tm值，N822(WT)在46℃附近，N822K在55℃附近。
[0250] 在图1中，如(A)所示，WT 100％仅在D816的Tm值和N822的Tm值处确认到峰。另一方面，在含有野生型质粒和突变型质粒的试样中，对于混合有突变型质粒的多态性，在两个Tm值处确认到峰。即，如图1(B)所示，D816V 20％中，D816的Tm值和D816V的Tm值两者、以及N822的Tm值处确认到峰。如图1(C)所示，N822K 20％中，在N822的Tm值和N822K的Tm值两者以及D816的Tm值处确认到峰。如此可知，如果使用本实施例的野生型F引物、野生型R引物和各多态性的突变型探针，即使在野生型和突变型的多态性混合存在的情况下，也能够区别野生型和突变型，检测多态性，而且，对于两种多态性，也能够在同一反应体系中进行检测。
[0251] [实施例2]
[0252] 在本例中，在野生型质粒和突变型质粒的共存下进行Tm分析，检测c-kit基因的816多态性。
[0253] 以如下所示的预定比例混合所述实施例1的插入有具有野生型质粒(WT)和D816V突变型的寡核苷酸的D816V突变型质粒(D816V)，制备三种质粒试样。质粒试样每1μL，为4
2×10 拷贝/μL。
[0254] [表4]
[0255]
[0256] 除了使用下述表4的PCR反应液50μL、下述PCR和Tm分析条件之外，与所述实施例1同样地进行PCR和Tm分析。所述PCR和Tm分析条件为在95℃处理60秒之后，以95℃1秒和61℃15秒为一个循环，反复进行50个循环，另外，在95℃处理1秒以及40℃处理60秒，接着将温度的上升速度设为1℃/3秒，从40℃加热到75℃，检测波长为585～
700nm(TAMRA)。
[0257] [表5]
[0258]
[0259] 所述野生型F引物、突变型F引物和R引物的序列如下所示。
[0260] (野生型F引物)
[0261] F2-wt1(序列编号13)
[0262] 5′-attttggtctagccagaga-3′
[0263] (突变型F引物)
[0264] F2-mt1(序列编号14)
[0265] 5′-tgattttggtctagccagagt-3′
[0266] (R引物)
[0267] R2(序列编号12)
[0268] 5′-aaatcctttgcaggactgtc-3′
[0269] 作为所述探针，使用以下的D816V突变型探针2。下述探针为与D816V突变型的c-kit基因的反义链中的检测对象序列完全匹配的探针，在所述序列中，带下划线部分的碱基为与D816V突变型互补的序列。所述D816V突变型探针2中，5’末端用荧光染料TAMRA标记，3’末端磷酸化。
[0270] 5′-(TAMRA)-ccagagtcatcaagaatg-P-3′(序列编号7)
[0271] 其结果示于图2。图2是示出伴随温度上升的荧光强度的变化的Tm分析的图。图2中，(A)为WT 100％的结果，(B)为D816V 0.3％的结果，(C)为D816V 1％的结果。横轴表示测定时的温度(℃)，纵轴表示荧光强度的变化(以下，也称“荧光变化量”)，单位为荧光强度变化量的微分值即“d荧光强度增加量/dt”(dF/dt)。与所述D816V突变型探针2的Tm值中，WT在48℃附近，D816V在56℃附近。
[0272] 在图2中，如(A)所示，WT 100％中，仅在WT的Tm值处确认到峰。另一方面，如图2(B)和(C)所示，含有野生型质粒和突变型质粒的D816V 0.3％和D816V 1％中，在WT的Tm值和D816V的Tm值两者处确认到峰。如此可知，如果使用本实施例的突变型探针、野生型F引物、突变型F引物和野生型R引物，即使在野生型和微量的突变型的多态性混合存在的情况下，也能够区别野生型和突变型，检测多态性。
[0273] [实施例3]
[0274] 在本例中，在野生型质粒和突变型质粒共同存在的情况下，进行Tm分析，检测c-kit基因的822多态性。
[0275] 以以下所示的预定比例混合所述实施例1的插入有具有野生型质粒(WT)和N822K突变型的寡核苷酸的N822K突变型质粒(N822K)，制备三种质粒试样。每种质粒试样每1μL4
为1×10 拷贝/μL。
[0276] [表6]
[0277]
[0278]
[0279] 除了使用所述质粒试样、以及下述所示的引物和探针、下述PCR条件之外，与所述实施例2同样地进行PCR和Tm分析。所述PCR条件为在95℃下处理60秒之后，以95℃、1秒和63℃、15秒为一个循环，反复进行50个循环，再在95℃下处理1秒，以及40℃下处理60秒。
[0280] 以下示出所述野生型F引物和突变型F引物的序列。所述R引物使用与所述实施例2相同的引物。
[0281] (野生型F引物)
[0282] F3-wt2(序列编号18)
[0283] 5′-gatcgcagagacatcaagaatgattctaat-3′
[0284] (突变型F引物)
[0285] F3-mt2g(序列编号19)
[0286] 5′-tggcacagagacatcaagaatgattctaag-3′
[0287] 作为所述探针，使用以下的N822K突变型探针2。下述探针为与N822K突变型的c-kit基因的反义链中的检测对象序列完全匹配的探针，在所述序列中，带下划线部分的碱基为与N822K突变型互补的序列。所述N822K突变型探针2中，5’末端用荧光染料TAMRA标记，3’末端磷酸化。
[0288] 5′-(TAMRA)-ctaagtatgtggttaaaggaaa-P-3′(序列编号9)
[0289] 图3中示出它们的结果。图3是表示伴随温度上升的荧光强度的变化的Tm分析的图。在图3中，(A)为WT 100％的结果，(B)为N822K 0.3％的结果，(C)为N822K 10％的结果。横轴表示测定时的温度(℃)，纵轴表示荧光强度的变化(以下，也称“荧光变化量”)，单位为荧光强度变化量的微分值即“d荧光强度增加量/dt”(dF/dt)。与所述N822K突变型探针2的Tm值中，WT在50℃附近，N822K在55℃附近。
[0290] 在图3中，如(A)所示，WT 100％中，仅在WT的Tm值处确认到峰。另一方面，如图3(B)和(C)所示，含有野生型质粒和突变型质粒的N822K 0.3％和N822K 10％中，WT的Tm值附近和N822K的Tm值两者处确认到峰。如此可知，如果使用本实施例的突变型探针、野生型F引物、突变型F引物和野生型R引物，即使在野生型和微量的突变型的多态性混合存在的情况下，也能够区别野生型和突变型，检测多态性。
[0291] [比较例]
[0292] 在本例中，除了作为所述探针使用下述D816V突变型探针3和4之外，与所述实施例2同样地检测c-kit基因的816多态性。
[0293] 下述探针3为与D816V突变型的c-kit基因的正义链中的检测对象序列完全匹配的探针，所述序列中，带下划线部分的碱基为与D816V突变型互补的序列。下述探针4为与D816V突变型的c-kit基因的反义链中的检测对象序列完全匹配的探针，所述序列中，带下划线部分的碱基为与D816V突变型互补的序列。所述探针3和4的每一个中，5’末端用荧光染料TAMRA标记，3’末端磷酸化。
[0294] 探针3(序列编号21)
[0295] 5′-(TAMRA)-cttgatgactctggct-P-3′
[0296] 探针4(序列编号22)
[0297] 5′-(TAMRA)-ctagccagagtcatcaa-P-3′
[0298] 在本例中，WT 100％中，仅在WT的Tm值处确认到峰。但是含有野生型质粒和突变型质粒的D816V 0.3％和D816V 1％中，在D816V的Tm值和D816的Tm值两者处，未确认到峰。如此，在使用本比较例的突变型探针的情况下，不能检测816多态性。
[0299] 产业上的可利用性
[0300] 综上所述，通过本发明的多态性检测用探针，例如能够通过Tm分析，简便并且以优良的可靠性判别c-kit基因的多态性。具体而言，例如即使在试样中目标的多态性为野生型的c-kit基因和目标的多态性为突变型的c-kit基因共存的情况下，也能够通过进行使用了本发明的多态性检测用探针的Tm分析，来简便并且以优良的可靠性检测多态性的种类或突变的有无。因此，本发明中，对于含有野生型的c-kit基因和突变型的c-kit基因两者的试样，特别有用。如此，通过本发明，能够简便并且可靠性优良地判别c-kit基因的多态性，因此例如，能够将检测结果反映到前述那样的疾病的诊断和治疗方法的选择等中。因此，本发明可以说在医疗领域等中是极其有用的。
