MTHFR基因扩增用引物对、含有其的MTHFR基因扩增用试剂及其用途
阅读：620发布：2020-11-01
专利汇可以提供MTHFR基因扩增用引物对、含有其的MTHFR基因扩增用试剂及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了用于通过核酸扩增法特异性地扩增MTHFR基因的目标区域的引物对。使用包括含有F1引物和R1引物的引物对(1)、以及含有F2引物和R2引物的引物对(2)的引物对。由此，例如能够在同一反应液中同时扩增分别含有产生MTHFR基因的两种多态性的部分的两个目标区域。(F1) 碱 基长为20～28碱基长，以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号8715的 鸟 嘌呤(g)为3’末端的寡核苷酸，(R1)碱基长为18～26碱基长，与以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号8817的胞嘧啶(c)为5’末端的寡核苷酸互补的寡核苷酸，(F2)碱基长为26～36碱基长，以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号10590的鸟嘌呤(g)为3’末端的寡核苷酸，(R2)碱基长为22～34碱基长，与以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号10695的胞嘧啶(c)为5’末端的寡核苷酸互补的寡核苷酸。，下面是MTHFR基因扩增用引物对、含有其的MTHFR基因扩增用试剂及其用途专利的具体信息内容。
1.一种MTHFR基因扩增用引物对，其特征在于，包括引物对(1)以及引物对(2)中的至少一者，
所述引物对(1)包括含有下述(F1)寡核苷酸的引物和含有下述(R1)寡核苷酸的引物中的至少一者，
所述引物对(2)包括含有下述(F2)寡核苷酸的引物和含有下述(R2)寡核苷酸的引物中的至少一者，
其中，
(F1)：碱基长为20～28碱基长，以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号8715的鸟嘌呤(g)为3’末端的寡核苷酸，
(R1)：碱基长为18～26碱基长，与以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号8817的胞嘧啶(c)为5’末端的寡核苷酸互补的寡核苷酸，
(F2)：碱基长为26～36碱基长，以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号10590的鸟嘌呤(g)为3’末端的寡核苷酸，
(R2)：碱基长为22～34碱基长，与以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号10695的胞嘧啶(c)为5’末端的寡核苷酸互补的寡核苷酸。
2.根据权利要求1所述的MTHFR基因扩增用引物对，所述(F1)、(R1)、(F2)和(R2)寡核苷酸分别为下述(F1-1)、(R1-1)、(F2-1)和(R2-1)寡核苷酸，其中，(F1-1)：含有序列编号7所示的碱基序列的寡核苷酸，
(R1-1)：含有序列编号15所示的碱基序列的寡核苷酸，
(F2-1)：含有序列编号25所示的碱基序列的寡核苷酸，
(R2-1)：含有序列编号38所示的碱基序列的寡核苷酸。
3.一种基因扩增用试剂，其特征在于，含有权利要求1所述的MTHFR基因扩增用引物对和能够与MTHFR基因的扩增产物杂交的探针。
4.根据权利要求3所述的扩增用试剂，所述探针为含有下述(P1)寡核苷酸、(P1’)寡核苷酸、(P2)寡核苷酸和(P2’)寡核苷酸中的至少一者的探针，其中，(P1)：碱基长为17～50碱基长，包括与含有序列编号1中的碱基编号8744～8760的碱基序列互补的碱基序列，并且在3’末端区域具有与所述碱基编号8744的碱基互补的碱基的寡核苷酸，
(P1’)：包括与所述(P1)寡核苷酸互补的碱基序列的寡核苷酸，
(P2)：碱基长为14～50碱基长，包括与含有序列编号1中的碱基编号10643～10656的碱基序列互补的碱基序列，并且在3’末端区域具有与所述碱基编号10643的碱基互补的碱基的寡核苷酸，
(P2’)：含有与所述(P2)寡核苷酸互补的碱基序列的寡核苷酸。
5.根据权利要求4所述的扩增用试剂，所述(P1)寡核苷酸在从3’末端起数第1～4位的位置具有与所述碱基编号8744的碱基互补的碱基，
所述(P2)寡核苷酸在从3’末端起数第1～4位的位置具有与所述碱基编号10643的碱基互补的碱基。
6.根据权利要求4所述的扩增用试剂，所述(P1)寡核苷酸和(P2)寡核苷酸分别是下述(P1-1)和(P2-1)寡核苷酸，
(P1-1)：含有序列编号46所示的碱基序列的寡核苷酸，
(P2-1)：含有序列编号52所示的碱基序列的寡核苷酸。
7.根据权利要求3所述的扩增用试剂，所述探针是具有标记物质的标记探针。
8.根据权利要求7所述的扩增用试剂，所述(P1)寡核苷酸和(P2)寡核苷酸在3’末端区域具有所述标记物质，所述(P1’)寡核苷酸和(P2’)寡核苷酸在5末端区域具有所述标记物质。
9.根据权利要求8所述的扩增用试剂，所述(P1)寡核苷酸和(P2)寡核苷酸在从3’末端起数第1～4位的碱基的位置具有所述标记物质，
所述(P1’)寡核苷酸和(P2’)寡核苷酸在从5’末端起数第1～4位的碱基的位置具有所述标记物质。
10.根据权利要求8所述的扩增用试剂，所述(P1)寡核苷酸在与所述碱基编号8744的碱基互补的碱基上具有所述标记物质，
所述(P1’)寡核苷酸在序列编号1中的碱基编号8744的碱基上具有所述标记物质，所述(P2)寡核苷酸在与所述碱基编号10643的碱基互补的碱基上具有所述标记物质，所述(P2’)寡核苷酸在序列编号1中的碱基编号10643的碱基上具有所述标记物质。
11.根据权利要求4所述的扩增用试剂，包括含有所述(P1)寡核苷酸的探针和含有所述(P2)寡核苷酸的探针。
12.一种扩增产物检测方法，用于检测MTHFR基因的扩增产物，其特征在于，包括下述(A)步骤，
(A)在反应体系中，以试样中的核酸为模板，使用权利要求1所述的MTHFR基因扩增用引物对，扩增MTHFR基因的扩增步骤。
13.根据权利要求12所述的扩增产物检测方法，包括下述(A)、(B)和(C)步骤，(A)在反应体系中，以试样中的核酸为模板，使用权利要求1所述的MTHFR基因扩增用引物对，扩增MTHFR基因的扩增步骤，
(B)改变含有所述(A)步骤中的扩增产物和能够与所述MTHFR基因的扩增产物杂交的探针的反应体系的温度，测定表示所述扩增产物和所述探针的杂交体的熔解状态的信号值的测定步骤，
(C)基于伴随所述温度变化的所述信号值的变动，检测所述MTHFR基因的扩增产物的检测步骤。
14.根据权利要求13所述的增产物检测方法，在所述(A)步骤中，在含有所述探针的所述反应体系中，进行MTHFR基因的扩增，
在所述(B)步骤中，改变所述(A)步骤的所述反应体系的温度。
15.根据权利要求13所述的扩增产物检测方法，所述探针为含有下述(P1)寡核苷酸、(P1’)寡核苷酸、(P2)寡核苷酸和(P2’)寡核苷酸中的至少一者的探针，(P1)：碱基长为17～50碱基长，包括与含有序列编号1中的碱基编号8744～8760的碱基序列互补的碱基序列，并且在3’末端区域具有与所述碱基编号8744的碱基互补的碱基的寡核苷酸，
(P1’)：含有与所述(P1)寡核苷酸互补的碱基序列的寡核苷酸，
(P2)：碱基长为14～50碱基长，包括与含有序列编号1中的碱基编号10643～10656的碱基序列互补的碱基序列，并且在3’末端区域具有与所述碱基编号10643的碱基互补的碱基的寡核苷酸，
(P2’)：含有与所述(P2)寡核苷酸互补的碱基序列的寡核苷酸。
16.根据权利要求15所述的扩增产物检测方法，所述(P1)寡核苷酸和(P2)寡核苷酸分别为下述(P1-1)和(P2-1)寡核苷酸，
(P1-1)：含有序列编号46所示的碱基序列的寡核苷酸，
(P2-1)：含有序列编号52所示的碱基序列的寡核苷酸。
17.根据权利要求13所述的扩增产物检测方法，所述探针为具有标记物质的标记探针。
18.根据权利要求15所述的扩增产物检测方法，所述反应体系包括含有所述(P1)寡核苷酸的探针和含有所述(P2)寡核苷酸的探针。
19.一种多态性检测方法，其特征在于，包括下述(A)、(B)和(D)步骤，(A)在反应体系中，以试样中的核酸为模板，使用权利要求1所述的MTHFR基因扩增用引物对，扩增MTHFR基因的扩增步骤，
(B)改变含有所述(A)步骤中的扩增产物和能够与MTHR基因的检测对象位点杂交的探针的反应体系的温度，测定表示所述扩增产物和所述探针的杂交体的熔解状态的信号值的测定步骤，
(D)基于伴随所述温度变化的所述信号值的变动，检测所述检测对象位点的所述多态性的检测步骤。
20.根据权利要求19所述的多态性检测方法，在所述(A)步骤中，在含有所述探针的所述反应体系中进行MTHFR基因的扩增，
在所述(B)步骤中，改变所述(A)步骤的所述反应体系的温度。
21.根据权利要求19所述的多态性检测方法，所述探针为含有下述(P1)寡核苷酸、(P1’)寡核苷酸、(P2)寡核苷酸和(P2’)寡核苷酸中的至少一者的探针，(P1)：碱基长为17～50碱基长，包括与含有序列编号1中的碱基编号8744～8760的碱基序列互补的碱基序列，并且在3’末端区域具有与所述碱基编号8744的碱基互补的碱基的寡核苷酸，
(P1’)：含有与所述(P1)寡核苷酸互补的碱基序列的寡核苷酸，
(P2)：碱基长为14～50碱基长，包括与含有序列编号1中的碱基编号10643～10656的碱基序列互补的碱基序列，并且在3’末端区域具有与所述碱基编号10643的碱基互补的碱基的寡核苷酸，
(P2’)：含有与所述(P2)寡核苷酸互补的碱基序列的寡核苷酸。
22.根据权利要求21所述的多态性检测方法，所述(P1)寡核苷酸和(P2)寡核苷酸分别为下述(P1-1)和(P2-1)寡核苷酸，
(P1-1)：含有序列编号46所示的碱基序列的寡核苷酸，
(P2-1)：含有序列编号52所示的碱基序列的寡核苷酸。
23.根据权利要求19所述的多态性检测方法，所述探针是具有标记物质的标记探针。
(2011年4月11日国际事务局受理)
1.(修改后)一种多态性检测用探针，能够与MTHFR基因杂交，其特征在于，所述探针是包括下述(P1)寡核苷酸和(P2)寡核苷酸中的至少一者的具有标记物质的标记寡核苷酸的探针，
(P1)：碱基长为17～50碱基长，包括与含有序列编号1中的碱基编号8744～8760的碱基序列互补的碱基序列，并且与所述碱基编号8744的碱基互补的碱基用荧光染料标记的寡核苷酸，
(P2)：碱基长为14～50碱基长，包括与含有序列编号1中的碱基编号10643～10656的碱基序列互补的碱基序列，并且与所述碱基编号10643的碱基互补的碱基用荧光染料标记的寡核苷酸。
2.(修改后)根据权利要求1所述的多态性检测用探针，所述(P1)寡核苷酸在从3’末端起数第1～4位的位置具有与所述碱基编号8744的碱基互补的碱基，
所述(P2)寡核苷酸在从3’末端起数第1～4位的位置具有与所述碱基编号10643的碱基互补的碱基。
3.(修改后)根据权利要求1所述的多态性检测用探针，所述(P1)寡核苷酸在3’末端具有与所述碱基编号8744的碱基互补的碱基，
所述(P2)寡核苷酸在3’末端具有与所述碱基编号10643的碱基互补的碱基。
4.(修改后)根据权利要求3所述的多态性检测用探针，所述(P1)寡核苷酸和(P2)寡核苷酸分别是下述(P1-1)和(P2-1)寡核苷酸，
(P1-1)：含有序列编号46所示的碱基序列的寡核苷酸，
(P2-1)：含有序列编号52所示的碱基序列的寡核苷酸。
5.(修改后)一种试剂，其特征在于，含有根据权利要求1所述的能够与MTHFR基因杂交的多态性检测用探针。
6.(修改后)根据权利要求5所述的试剂，包括含有所述(P1)寡核苷酸的探针和含有所述(P2)寡核苷酸的探针，作为所述多态性检测用探针。
7.(修改后)根据权利要求5所述的试剂，还含有下述引物对(1)和下述引物对(2)中的至少一者作为MTHFR基因扩增用引物对，其中，
引物对(1)：
包括含有下述(F1)寡核苷酸的引物和含有下述(R1)寡核苷酸的引物中的至少一者的引物对，
(F1)：碱基长为20～28碱基长，以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号8715的鸟嘌呤(g)为3’末端的寡核苷酸，
(R1)：碱基长为18～26碱基长，与以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号8817的胞嘧啶(c)为5’末端的寡核苷酸互补的寡核苷酸，
引物对(2)：
包括含有下述(F2)寡核苷酸的引物和含有下述(R2)寡核苷酸的引物中的至少一者的引物对，
(F2)：碱基长为26～36碱基长，以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号10590的鸟嘌呤(g)为3’末端的寡核苷酸，
(R2)：碱基长为22～34碱基长，与以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号10695的胞嘧啶(c)为5’末端的寡核苷酸互补的寡核苷酸。
8.(修改后)根据权利要求7所述的试剂，所述(F1)、(R1)、(F2)和(R2)寡核苷酸分别为下述(F1-1)、(R1-1)、(F2-1)和(R2-1)寡核苷酸，其中，
(F1-1)：含有序列编号7所示的碱基序列的寡核苷酸，
(R1-1)：含有序列编号15所示的碱基序列的寡核苷酸，
(F2-1)：含有序列编号25所示的碱基序列的寡核苷酸，
(R2-1)：含有序列编号38所示的碱基序列的寡核苷酸。
9.(修改后)一种MTHFR基因多态性检测方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的多态性检测用探针，检测MTHFR基因的多态性的步骤。
10.(修改后)根据权利要求9所述的多态性检测方法，包括下述(A)、(B)和(D)步骤，(A)在含有权利要求1所述的多态性检测用探针的反应体系中，以试样中的核酸为模板，扩增MTHFR基因的扩增步骤，
(B)改变含有所述(A)步骤中的扩增产物和所述多态性检测用探针的反应体系的温度，测定表示所述扩增产物和所述多态性检测用探针的杂交体的熔解状态的信号值的测定步骤，
(D)基于伴随所述温度变化的所述信号值的变动，检测所述检测对象位点的所述多态性的检测步骤。
11.(修改后)根据权利要求10所述的多态性检测方法，所述(A)步骤为使用下述引物对(1)和下述引物对(2)中的至少一者作为MTHFR基因扩增用引物对，扩增MTHFR基因的扩增步骤，其中
引物对(1)：
包括含有下述(F1)寡核苷酸的引物和含有下述(R1)寡核苷酸的引物中的至少一者的引物对，
(F1)：碱基长为20～28碱基长，以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号8715的鸟嘌呤(g)为3’末端的寡核苷酸，
(R1)：碱基长为18～26碱基长，与序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号8817的胞嘧啶(c)为5’末端的寡核苷酸互补的寡核苷酸，
引物对(2)：
包括含有下述(F2)寡核苷酸的引物和含有下述(R2)寡核苷酸的引物中的至少一者的引物对，
(F2)：碱基长为26～36碱基长，以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号10590的鸟嘌呤(g)为3’末端的寡核苷酸，
(R2)：碱基长为22～34碱基长，以与序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号10695的胞嘧啶(c)为5’末端的寡核苷酸互补的寡核苷酸。
12.(修改后)根据权利要求11所述的多态性检测方法，所述(F1)、(R1)、(F2)和(R2)寡核苷酸分别为下述(F1-1)、(R1-1)、(F2-1)和(R2-1)寡核苷酸，其中，(F1-1)：含有序列编号7所示的碱基序列的寡核苷酸，
(R1-1)：含有序列编号15所示的碱基序列的寡核苷酸，
MTHFR基因扩增用引物对、含有其的MTHFR基因扩增用试剂
及其用途
技术领域
[0001] 本发明涉及用于扩增MTHFR基因的引物对、含有其的MTHFR基因扩增用试剂及其用途。
背景技术
[0002] 同型半胱氨酸是蛋氨酸的代谢途径中的中间产物，一部分代谢成半胱氨酸，一部分再次代谢成蛋氨酸。报告了同型半胱氨酸在生物体内増加，则导致动脉硬化、冠状动脉疾病、心脏疾病等心血管疾病、高同型半胱氨酸血症。同型半胱氨酸的产生与亚甲基四氢叶酸还原酶(methylene tetrahydrofolic reductase，MTHFR)有关，也报告了MTHFR基因中的多态性与前述疾病的关联性(例如参见非专利文献1)。
[0003] 具体而言，认为起因于MTHFR基因的多态性的MTHFR活性降低使得血中同型半胱氨酸增加，引起前述疾病的发病。MTHFR基因的多态性已知例如MTHFR*677、MTHFR*1298等。前者MTHFR*677是MTHFR基因中的第8747位的碱基的野生型为胞嘧啶(c)，突变型为胸腺嘧啶(t)。后者MTHFR*1298是MTHFR基因中的第10649位的碱基的野生型为腺嘌呤(a)，突变型为胞嘧啶(c)。例如，报告了MTHFR基因中产生纯合子的变异MTHFR*677(T/T)，则MTHFR活性降低，血中同型半胱氨酸量上升。另一方面，报告了虽然机理并不清楚，但是MTHFR基因中杂合子的突变MTHFR*1298(A/C)或者纯合子的突变MTHFR*1298(C/C)产生时，MTHFR活性降低，例如，甲氨蝶呤等类风湿关节炎治疗药必要剂量减少(例如参见非专利文献2)。因此，研究MTHFR基因的多种多态性在预测血中同型半胱氨酸量的上升而引起的心血管疾病等疾病的发病、以及类风湿关节炎等的治疗药剂量方面是极其重要的。
[0004] 另一方面，作为在基因水平分析所有疾病的原因、个体间疾病易感性即易患疾病、个体间的药效差异等的方法，广泛进行了多态性检测。所述多态性例如有点突变、所谓单核苷酸多态性(SNP)等。多态性的一般的检测方法例如有直接测序法、RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性)分析、ASP-PCR法等。所述直接测序法例如是针对试样的目标DNA通过PCR(Polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)扩增相当于检测对象序列的区域，分析其全部基因序列的方法。上述RFLP法例如是，首先，利用PCR扩增试样的目标DNA的相当于检测对象序列的区域。再通过根据上述检测对象序列有无目标突变而切断作用不同的限制酶，将该扩增产物切断，进行电泳从而进行分型的方法。ASP-PCR法例如是使用目的突变位于3’末端区域的引物进行PCR，通过有无扩增判断突变的方法。
[0005] 但是，这些方法例如必须进行由试样提取出的DNA的精制、电泳、限制酶处理等，因此需要工夫和成本。另外，进行PCR后，有必要暂时开启反应容器。因此有上述扩增产物混入到之后的反应体系内、分析精度降低的顾虑。而且，由于自动化困难，因此无法分析大量的试样。另外，上述ASP-PCR法还存在特异性低的问题。
[0006] 由该问题出发，近年来作为多态性的检测方法，正在实施Tm(Melting Temperature)分析。这种方法是分析双链核酸的熔解温度(Tm)的方法，由于通过上述双链的熔解曲线的分析来进行，因此也称作熔解曲线分析。Tm分析例如为如下的方法。首先使用与含有检测目的多态性的区域互补的探针，形成被检核酸与上述探针的杂交体(双链核酸)。接着，对得到的杂交体实施加热处理，通过吸光度等信号的变动来检测随着温度上升的上述杂交体解离(熔解)成单链核酸。根据该检测结果确定Tm值，从而判断多态性。在杂交体中两个单链核酸的互补性越高则Tm值越高，互补性越低则Tm值越低。因此，在检测对象位点的多态性为X或者Y的情况下，对于含有目的多态性(例如，Y)的核酸和与其
100％互补的探针形成的杂交体，预先求得Tm值(评价基准值)。接着测定被检核酸和上述探针的Tm值(测定值)。并且，若上述测定值与所述评价基准值相同，则可以判断上述被检核酸与上述探针为完全匹配(perfect match)，即上述被检核酸的检测对象位点为目的多态性(Y)。另一方面，若上述测定值低于上述评价基准值，则可以判断上述被检核酸与上述探针为错配，即上述被检核酸的检测对象位点为另一种多态性(X)。根据这样的方法，例如，仅通过对添加了上述探针的PCR反应液实施温度处理，进行信号测定，即可检测多态性。因此，也可以实现检测装置的自动化。
100％互补的探针形成的杂交体，预先求得Tm值(评价基准值)。接着测定被检核酸和上述探针的Tm值(测定值)。并且，若上述测定值与所述评价基准值相同，则可以判断上述被检核酸与上述探针为完全匹配(perfect match)，即上述被检核酸的检测对象位点为目的多态性(Y)。另一方面，若上述测定值低于上述评价基准值，则可以判断上述被检核酸与上述探针为错配，即上述被检核酸的检测对象位点为另一种多态性(X)。根据这样的方法，例如，仅通过对添加了上述探针的PCR反应液实施温度处理，进行信号测定，即可检测多态性。因此，也可以实现检测装置的自动化。
[0007] 但是，对于利用此类Tm分析的检测方法而言，例如存在PCR中必须特异且高效地扩增含有检测目的多态性的区域的问题。特别是，在具有多种基因多态性的情况下，分析一种样品即需要大量的劳动力，因此也存在分析大量的样品并不实用的问题。
[0008] 现有技术文献
[0009] 非专利文献
[0011] 非专利文献2：Urano等“Polymorphisms in the methylenetetrahydrofolate reductase gene were associated with both the efficacy and the toxicity of methotrexate used for the treatment of rheumatoid arthritis，as evidenced by single locus and haplotype analyses.”，Pharmacogenetics，2002年4月，12(3)，183～190页。
发明内容
[0012] 因此，本发明的目的在于提供用于通过核酸扩增法特异性地扩增MTHFR基因的目的区域的引物和引物对。
[0013] 为了达到上述目的，本发明的引物为用于扩增MTHFR基因的引物，其特征在于，是[0014] 含有下述(F1)寡核苷酸的引物、
[0015] 含有下述(R1)寡核苷酸的引物、
[0016] 含有下述(F2)寡核苷酸的引物或者
[0017] 含有下述(R2)寡核苷酸的引物。
[0018] (F1)：碱基长为20～28碱基长，以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号8715的鸟嘌呤(g)为3’末端的寡核苷酸
[0019] (R1)：碱基长为18～26碱基长，与以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号8817的胞嘧啶(c)为5’末端的寡核苷酸互补的寡核苷酸
[0020] (F2)：碱基长为26～36碱基长，以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号10590的鸟嘌呤(g)为3’末端的寡核苷酸
[0021] (R2)：碱基长为22～34碱基长，与以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号10695的胞嘧啶(c)为5’末端的寡核苷酸互补的寡核苷酸
[0022] 本发明的引物对为用于扩增MTHFR基因的引物对，其特征在于，包括引物对(1)以及引物对(2)中的至少一者，
[0023] 所述引物对(1)包括含有上述(F1)寡核苷酸的引物和含有上述(R1)寡核苷酸的引物中的至少一者，
[0024] 所述引物对(2)包括含有上述(F2)寡核苷酸的引物和含有上述(R2)寡核苷酸的引物中的至少一者。
[0025] 本发明的基因扩增用试剂是MTHFR基因扩增用试剂，其特征在于，包括本发明的MTHFR基因扩增用引物或者引物对。
[0026] 本发明的扩增方法为MTHFR基因的扩增方法，其特征在于，包括在反应体系中，以试样中的核酸为模板，使用本发明的MTHFR基因扩增用引物或者引物对，进行MTHFR基因的扩增的步骤。
[0027] 本发明的扩增产物检测方法为检测MTHFR基因的扩增产物的扩增产物检测方法，其特征在于，包括下述(A)步骤，
[0028] (A)通过本发明的扩增方法，扩增MTHFR基因的扩增步骤。
[0029] 本发明的多态性检测方法为MTHFR基因的多态性检测方法，其特征在于，包括下述(A)工序。
[0030] (A)通过本发明的扩增方法，扩增MTHFR基因的扩增步骤
[0031] 发明效果
[0033] 图1是示出本发明的实施例1中的Tm分析的结果的图；
[0034] 图2是示出本发明的实施例2中的Tm分析的结果的图。
具体实施方式
[0035] 本发明中，MTHFR基因中的检测目标多态性例如是序列编号1所示的MTHFR基因碱基序列中的碱基编号8747和碱基编号10649的至少一者的碱基的多态性。序列编号1的碱基序列中，碱基编号8747的碱基(y)的野生型为胞嘧啶(c)，突变型为胸腺嘧啶(t)。以下，将该多态性称为MTHFR*677，野生型的纯合子称为MTHFR*677(C/C)或者8747(C/C)、突变型的纯合子称为MTHFR*677(T/T)或者8747(T/T)、杂合子称为MTHFR*677(C/T)或者
8747(C/T)。另外，在序列编号1的碱基序列中，碱基编号10649的碱基(m)的野生型为腺嘌呤(a)，突变型为胞嘧啶(c)。以下，将该多态性称为MTHFR*1298，野生型的纯合子称为MTHFR*1298(A/A)或10649(A/A)，突变型的纯合子称为MTHFR*1298(C/C)或者10649(C/C)，杂合子称为MTHFR*1298(A/C)或者10649(A/C)。野生型也可称为正常型。
8747(C/T)。另外，在序列编号1的碱基序列中，碱基编号10649的碱基(m)的野生型为腺嘌呤(a)，突变型为胞嘧啶(c)。以下，将该多态性称为MTHFR*1298，野生型的纯合子称为MTHFR*1298(A/A)或10649(A/A)，突变型的纯合子称为MTHFR*1298(C/C)或者10649(C/C)，杂合子称为MTHFR*1298(A/C)或者10649(A/C)。野生型也可称为正常型。
[0036] MTHFR基因的碱基序列例如登录在NCBI登录No.AY338232。序列编号1的碱基序列是上述登录号的碱基序列中的MTHFR基因的全长序列。
[0037] 本发明中，将所述多态性发生的位点、例如序列编号1的序列(正义链)中碱基编号8747和碱基编号10649的碱基，或者其互补序列(反义链)中与所述正义链的碱基编号8747和碱基编号10649对应的碱基称为“检测对象位点”。另外，本发明中，将由本发明的引物和引物对扩增的区域称为“目标区域或扩增区域”。所述目标区域包含所述检测对象位点。所述目标区域例如可以是MTHFR基因的正义链中的区域，也可以是反义链中的区域，还可以是它们两者。本发明中，正义链和反义链也包含例如正义链的扩增产物、反义链的扩增产物的意思。
[0038] 本发明中，将MTHFR基因中的、包括上述检测对象位点、能够与后述的多态性检测用的探针杂交的区域称作“检测对象序列或者杂交区域”。上述检测对象序列中，将与上述探针完全匹配的检测对象序列称为“完全匹配序列”，将与上述探针错配的检测对象序列称为“错配序列”。本发明中，完全匹配是指上述检测对象位点的碱基与上述探针中的对应碱基互补，优选的是指上述检测对象序列和上述探针完全互补。本发明中，错配是指上述检测对象位点的碱基与上述探针中的对应碱基非互补，优选的是指上述检测对象序列和上述探针在上述检测对象位点以外完全互补。
[0039] 本发明中，碱基序列的末端是指碱基序列中5’侧和3’侧的最端部的碱基。另外，5’末端区域是指碱基序列中从5’末端起数个碱基的区域，3’末端区域是指从碱基序列的
3’末端起数个碱基的区域。上述数个碱基是指例如，包括上述末端碱基的1～10个碱基、
1～4碱基、1～3个碱基、1～2个碱基。本发明中，从碱基序列的末端起第Z位的碱基(Z为正整数)是指，按末端的碱基为第1位的顺序，例如，从末端起第1位的碱基是指末端的碱基，从末端起第2位的碱基是指末端的相邻的碱基。
3’末端起数个碱基的区域。上述数个碱基是指例如，包括上述末端碱基的1～10个碱基、
1～4碱基、1～3个碱基、1～2个碱基。本发明中，从碱基序列的末端起第Z位的碱基(Z为正整数)是指，按末端的碱基为第1位的顺序，例如，从末端起第1位的碱基是指末端的碱基，从末端起第2位的碱基是指末端的相邻的碱基。
[0040]
[0041] 如前文所述，本发明的引物是用于扩增MTHFR基因的引物，其特征在于，是[0042] 含有下述(F1)寡核苷酸的引物、
[0043] 含有下述(R1)寡核苷酸的引物、
[0044] 含有下述(F2)寡核苷酸的引物或者
[0045] 含有下述(R2)寡核苷酸的引物。
[0046] (F1)：碱基长为20～28碱基长，以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号8715的鸟嘌呤(g)为3’末端的寡核苷酸
[0047] (R1)：碱基长为18～26碱基长，与以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号8817的胞嘧啶(c)为5’末端的寡核苷酸互补的寡核苷酸
[0048] (F2)：碱基长为26～36碱基长，以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号10590的鸟嘌呤(g)为3’末端的寡核苷酸
[0049] (R2)：碱基长为22～34碱基长，与以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号10695的胞嘧啶(c)为5’末端的寡核苷酸互补的寡核苷酸
[0050] 如前文所述，本发明的MTHFR基因扩增用引物对的特征在于，含有上述引物对(1)和上述引物对(2)中的至少一者。
[0051] 通过上述本发明的引物或者含有其的引物对，例如能够特异性地扩增MTHFR基因中的目标区域。本发明的MTHFR基因扩增用引物和引物对也可以称为MTHFR基因扩增用引物试剂。
[0052] 如前文所述，通过本发明的引物和引物对，能够特异性地扩增包含例如MTHFR*677或者MTHFR*1298作为MTHFR基因的检测对象位点的目标区域，并能够高效扩增。这样，由于能够特异性地扩增MTHFR基因的上述目标区域，因此例如能够高精度检测多态性。具体而言，例如通过对得到的扩增产物，再进行使用了能够与上述检测对象位点杂交的探针的Tm分析，能够更高精度地检测上述检测对象位点的多态性，判定多态性的合子类型。另外，例如，由于能够在一个反应体系中进行上述目标区域的扩增和多态性的检测，因此能够使操作自动化。再者，若使用本发明的引物和引物对，即使是例如全血和口腔粘膜等含有杂质的试样，也可以省略除去杂质的前处理，因此能够更迅速且简便地进行扩增反应。另外，如果使用本发明的引物和引物对，由于能够以较之从前更优良的扩增效率来进行扩增反应，因此能够缩短扩增反应。因此，通过本发明的引物、引物对、含有其的试剂、以及使用其的扩增方法、扩增产物的检测方法以及多态性检测方法，能够迅速并且简便地分析MTHFR基因的多态性，因此可以说在医疗领域是极其有效的。
[0053] 本发明的MTHFR基因扩增用引物对可以仅含有例如上述引物对(1)和上述引物对(2)中的任一者，也可以含有上述引物对(1)和上述引物对(2)两者。后面将会叙述，能够利用上述引物对(1)特异性地扩增的目标区域是MTHFR基因中包含多态性MTHFR*677发生的位点的区域，能够利用上述引物对(2)特异性地扩增的目标区域是MTHFR基因中包含多态性MTHFR*1298发生的位点的区域。本发明的MTHFR基因扩增用引物对例如在含有上述引物对(1)和上述引物对(2)两者的情况下，可以在同一反应体系中，分别同时扩增MTHFR基因中的、含有多态性MTHFR*677发生的位点的目标区域和含有多态性MTHFR*1298发生的位点的目标区域。
[0054] 如前文所述，已知MTHFR基因的这两种多态性对生物体内的同型半胱氨酸量会产生影响。因此，不仅仅重视任何一种多态性，而且重视调查两种二者的多态性。但是，现有的方法存在一个反应体系中难以检测多种序列的问题。因此，调查MTHFR基因的两种多态性，即调查MTHFR*677和MTHFR*1298两者时，需要在个别的反应体系中分别扩增含有各自的多态性产生的位点的区域，个别分析得到的扩增产物。这样，在以往的方法中，仅将MTHFR基因作为模板，并且在MTHFR基因中，特异性地扩增分别含有产生上述多态性的位点的两种目标区域是极其困难的。并且，这样，存在由于分析一个样品也要花费大量劳动力，因此分析多个样品不现实的问题。与此相对，通过本发明的引物对，即使在含有上述引物对(1)和上述引物对(2)两者的情况下，也能够在同一反应体系中同时并且特异性地扩增各自的目标区域。因此，与前述的以往的方法不同，能够减轻工夫和成本。另外，这样，由于在同一反应体系中特异性地扩增两个目标区域，因此，例如使用能够与各自的目标区域中的检测对象位点杂交的探针，进行Tm分析，能够分别检测上述两种多态性，另外，能够判别合子类型。这样，由于能够在同一反应体系中分析MTHFR基因中的两种多态性，因此，对本发明的引物对来说，例如含有上述引物对(1)和上述引物对(2)中的任意一种的情况自不用说，优选含有两种。使用这样的本发明的引物对，扩增一个目标区域自不用说，就是同时扩增两个目标区域，也能够较之从前更高效地检测MTHFR基因的多态性。
[0055] 以下有时将正向引物称为F引物，将反向引物称为R引物。
[0056] 如前述，所述引物对(1)是包括含有下述(F1)寡核苷酸的引物和含有下述(R1)寡核苷酸的引物中的至少一者的引物对。
[0057] (F1)：碱基长为20～28碱基长，以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号8715的鸟嘌呤(g)为3’末端的寡核苷酸
[0058] (R1)：与碱基长为18～26碱基长，以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号8817的胞嘧啶(c)为5’末端的寡核苷酸互补的寡核苷酸
[0059] 含有上述(F1)寡核苷酸的引物是正向引物，以下也称F1引物。上述F1引物与序列编号1所示的碱基序列中的部分序列相同。即，与MTHFR基因的正义链中的部分序列相同，能够与反义链退火。
[0060] 含有上述(R1)寡核苷酸的引物是反向引物，以下也称R1引物。上述R1引物是与序列编号1所示的碱基序列中的部分序列互补的。即，与MTHFR基因的反义链中的部分序列相同，能够与正义链退火。
[0061] 上述引物对(1)例如可以仅含有上述F1引物，也可以仅含有上述R1引物，优选含有两者。
[0062] 上述引物对(1)是用于扩增含有序列编号1中的碱基编号8716～8816的区域的核酸序列以及其互补链的引物对。该区域内的碱基编号8747的碱基，即序列编号1中的碱基编号8747的碱基是前述的多态性MTHFR*677产生的位点。以下，也将该引物对(1)称作“MTHFR*677用引物对”。在仅分析MTHFR*677的多态性的情况下，可以仅使用MTHFR*677用引物对。
[0063] 在上述引物对(1)中，上述F1引物和上述R1引物，只要起决定DNA聚合酶的扩增起始点的作用的3’末端的碱基满足上述条件即可。如此通过固定各引物的3’末端的碱基，就能充分防止所述引物对(1)例如与其它类似的序列结合。
[0064] 如此，由于只需要固定F1引物和R1引物的3’末端的碱基即可，因此对上述各引物的长度本身并没有特殊的限定，可以适当调整为一般的长度。上述各引物的长度，例如为13～50碱基长的范围，优选14～45碱基长，更优选15～40碱基长。作为具体例子，上述F1引物为以序列编号1所示的碱基序列中的第8715位的鸟嘌呤(g)为3’末端的寡核苷酸，其碱基长例如为20～28碱基长，优选的是21～26碱基长，更优选的是22～24碱基长。上述R1引物为与以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号8817的胞嘧啶(c)为5’末端的寡核苷酸互补的寡核苷酸，其碱基长例如为18～26碱基长，优选的是19～25碱基长，更优选的是21～23碱基长。由于上述F1引物和上述R1引物的3’末端分别被固定，因此从引物延伸出的区域例如是前述序列编号1中的碱基编号8716～8816的区域，但所获得的扩增产物的总长度根据使用的引物的长度而变化。
[0065] 上述F1引物例如可以与序列编号1所示的碱基序列中的部分序列完全相同，也可以不完全相同。即，可以与MTHFR基因的正义链的部分序列完全相同，也可以不完全相同。作为后者的具体例，在上述F1引物例如与上述正义链的部分序列对应的情况下，在除3’末端的碱基之外的部分中，与上述部分序列可以有1个～5个碱基不同。
[0066] 上述R1引物例如可以与序列编号1所示的碱基序列中的部分序列完全互补，也可以不完全互补。即，可以与MTHFR基因的反义链的部分序列完全相同，也可以不完全相同。作为后者的具体例，在上述R1引物例如与上述反义链的部分序列对应的情况下，在除3’末端的碱基之外的部分中，与上述部分序列可以有1个～5个碱基不同。
[0067] 以下，示出所述F1引物和R1引物的具体例子，但是本发明不限定于此。
[0068] 表1
[0069]
[0070] 上述F1引物和R1引物的组合没有任何限制，作为具体例，例如特别优选包括含有序列编号7所示的寡核苷酸的F1-1引物和含有序列编号15所示的寡核苷酸的R1-1引物的引物对。上述表中的“Tm(℃)”是上表的序列和与其完全互补的序列杂交的情况下的Tm(℃)，是通过MELTCALC软件(http://www.meltcalc.com/)基于预定的参数计算出来的值(以下相同)。对于上述参数，将参数设置为寡核苷酸浓度0.2μmol/L，钠当量(Na eq.)50mmol/L。上述Tm值可以通过例如目前已知的MELTCALC软件(http://www.meltcalc.com/)等算出来，此外，还可以通过最邻近碱基对法(Nearest Neighbor Method)确定(以下相同)。
[0071] 接着，如前文所述，上述引物对(2)是包括含有下述(F2)寡核苷酸的引物和含有下述(R2)寡核苷酸引物的至少一者的引物对。
[0072] (F2)：碱基长为26～36碱基长，以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号10590的鸟嘌呤(g)为3’末端的寡核苷酸
[0073] (R2)：碱基长为22～34碱基长，与以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号10695的胞嘧啶(c)为5’末端的寡核苷酸互补的寡核苷酸
[0074] 含有上述(F2)寡核苷酸的引物是正向引物，以下也称F2引物。上述F2引物与序列编号1所示的碱基序列中的部分序列相同。即，与MTHFR基因的正义链中的部分序列相同，能够与反义链退火。
[0075] 含有上述(R2)寡核苷酸的引物是反向引物，以下也称R2引物。上述R2引物与序列编号1所示的碱基序列中的部分序列互补。即，与MTHFR基因的反义链中的部分序列相同，能够与正义链退火。
[0076] 上述引物对(2)例如可以仅含有上述F2引物，也可以仅含有上述R2引物，优选含有两者。
[0077] 上述引物对(2)是用于扩增含有序列编号1中的碱基编号10591～10694的区域的核酸序列以及其互补链的引物对。该区域内的碱基编号10649的碱基、序列编号1中的碱基编号10649的碱基是前述多态性MTHFR*1298产生的位点。以下，将也该引物对(2)称作“MTHFR*1298用引物对”。此外，在仅分析MTHFR*1298的多态性的情况下，可以仅使用MTHFR*1298用引物对。
[0078] 上述引物对(2)中的上述F2引物和R2引物，基于与上述引物对(1)相同的理由，只要3’末端的碱基满足上述条件即可。因此，上述F2引物和R2引物的长度本身没有特别限制，可以适当调节到与前述同样的长度。上述各引物的长度例如为13～50碱基长的范围，优选的是14～45碱基长，更优选的是15～40碱基长。作为具体例，上述F2引物为以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号10590的鸟嘌呤(g)为3’末端的寡核苷酸，其碱基长例如为26～36碱基长，优选的是28～34碱基长，更优选的是30～32碱基长。上述R2引物为与以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号10695的胞嘧啶(c)为5’末端的寡核苷酸互补的寡核苷酸，碱基长例如为22～34碱基长，优选的是26～32碱基长，更优选的是27～29碱基长。上述F2引物和R2引物的3’末端分别被固定，因此从引物延伸出的区域例如为前述那样的序列编号1中的碱基编号10591～10694的区域，但是得到的扩增产物的全体的长度根据使用的引物的长度而变化。
[0079] 上述F2引物可以与序列编号1所示的碱基序列中的部分序列完全相同，也可以不完全相同。即，可以与MTHFR基因的正义链的部分序列完全相同，也可以不完全相同。作为后者的具体例，上述F1引物例如对应于上述正义链的部分序列的情况下，除3’末端的碱基之外的部分中，与上述部分序列可以有1个～5个碱基不同。
[0080] 上述R2引物例如可以与序列号1所示的碱基序列中的部分序列完全互补，也可以不完全互补。即，可以与MTHFR基因的反义链的部分序列完全相同，也可以不完全相同。作为后者的具体例，在上述R2引物例如与上述反义链的部分序列对应的情况下，在除3’末端的碱基之外的部分中，与上述部分序列可以有1个～5个碱基不同。
[0081] 以下，示出所述F2引物和所述R2引物的具体例子，但是本发明不限定于此。
[0082] 表2
[0083]
[0084] 上述F2引物和上述R2引物的组合没有任何限制。作为具体例，例如特别优选包括含有序列编号25所示的寡核苷酸的F2-1引物和含有序列编号38所示的寡核苷酸的R2-1引物的引物对。
[0085] 另外，前述的引物对(1)和(2)的各引物，例如为了提高扩增反应的反应温度，可以在5’末端添加目前已知的任意序列。
[0086] 本发明的MTHFR基因扩增用引物对例如优选在扩增生物试样中的MTHFR基因时使用。上述生物试样没有特别限制，例如可以是全血试样。尤其是，如后述的，将本发明的MTHFR基因扩增用引物对与多态性检测用的探针一起使用时，优选将扩增反应的反应体系中全血试样的比例(全血含有比例)设置为例如0.1～0.5体积％。关于该点，稍后再叙。
[0087] <扩增方法>
[0088] 如前述，本发明的扩增方法是MTHFR基因的扩增方法，其特征在于，包括在反应体系中、以试样中的核酸为模板，使用本发明的MTHFR基因扩增用引物或引物对，进行上述MTHFR基因的扩增的扩增步骤。
[0089] 如前述，通过使用本发明的MTHFR基因扩增用引物或者引物对进行扩增反应，能够扩增MTHFR基因的目标区域。在本发明的MTHFR基因扩增用引物对例如含有上述引物对(1)和上述引物对(2)两者的情况下，可以在同一反应体系中同时扩增MTHFR基因中的、含有多态性MTHFR*677发生的位点的目标区域和含有多态性MTHFR*1298发生的位点的目标区域。本发明的扩增方法以使用上述本发明的引物或者引物对为特征，核酸的扩增方法的种类和条件等没有任何限制。
[0090] 上述扩增步骤中，上述MTHFR基因的扩增可以通过使用了上述本发明的引物或者引物对作为引物的扩增方法来进行。如前文所述，上述核酸的扩增方法无特别限制，例如是PCR(聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction)法、NASBA(基于核酸序列的扩增，Nucleic Acid Sequence Based Amplification)法、TMA(转录介导的扩增，Transcription Mediated Amplification)法、SDA(链置换扩增，Strand Displacement Amplification)法等，其中PCR法是优选的。
[0091] 上述扩增步骤中的扩增反应的上述反应体系例如有反应液。上述反应体系例如含有本发明的引物或引物对以及试样，还可以含有溶剂、扩增核酸中使用的各种成分等。
[0092] 适用本发明的试样没有特别限制，例如可以是含有作为模板的核酸的试样。本发明例如优选适用于含有杂质的试样。含有上述杂质的试样例如有生物试样。上述生物试样例如可以为全血、口腔内细胞(例如口腔粘膜)、指甲和毛发等体细胞、生殖细胞、吐出的痰液、羊水、石蜡包埋组织、尿、胃液(例如胃洗涤液)等、它们的悬浮液等。通过本发明的扩增方法，例如即便是含有各种杂质的试样、特别是全血和口腔细胞等生物试样，也不易受杂质影响。因此，通过本发明，能特异性地扩增MTHFR基因的上述目标区域。通过本发明，即便是通过以往方法较难扩增的含大量杂质的试样，例如也可以不进行例如从上述试样中除去杂质、对上述试样进行精制等前处理而直接使用上述试样。因此，从上述试样的前处理的观点出发，可以说本发明能较以往方法更为迅速地扩增MTHFR基因。
[0093] 上述反应体系中，上述试样的比例没有特别限制。在上述试样例如是生物试样的情况下，上述反应体系中的试样的比例下限例如为0.01体积％以上，优选0.05体积％以上，更优选的是0.1体积％以上，上限例如为2体积％以下，优选的是1体积％以下，更优选的是0.5体积％以下。作为具体例，在上述生物试样为全血试样的情况下，上述反应体系中的上述全血试样的比例例如相同。
[0094] 关于扩增反应后的上述反应体系，例如在进行后述的光学检测的情况下，上述反应体系中的上述生物试样的比例例如优选设定为0.1～0.5体积％。上述生物试样没有特别限制，例如是全血试样。上述反应体系中的全血试样的比例不仅可以用上述体积比例(例如0.1～0.5体积％)，还可以用血红蛋白(以下称作“Hb”)的重量比例表示。这种情况下，上述反应体系中的全血试样的比例换算成Hb量，例如优选0.565～113g/L的范围，更优选的是2.825～56.5g/L的范围，更为优选的是5.65～28.25g/L的范围。此外，上述反应体系中的全血试样的比例例如可以满足上述体积比例和Hb重量比例二者，也可以满足任何一者。
[0095] 上述全血，例如可以是从生物体采集的全血、采集后处理的全血中任何一种。作为具体例，可以是溶血的全血、未溶血的全血、抗凝固全血、含有凝固级分的全血等的任一种。
[0096] 上述扩增步骤中，上述试样中的核酸例如可以是单链核酸，也可以是双链核酸。上述试样中的核酸，例如是DNA。上述DNA例如可以是生物试样等试样中本来含有的DNA，也可以是通过核酸扩增法扩增的DNA扩增产物。在后者的情况下，例如，可以是由上述试样中的RNA合成的cDNA。上述试样中的上述RNA例如可以是总RNA、mRNA等，上述cDNA例如可以由上述RNA利用RT-PCR(Reverse TrAnscription PCR)合成。
[0097] 本发明的扩增方法，例如优选在上述扩增步骤中的扩增反应开始前，还向上述反应液中添加白蛋白。通过白蛋白的添加，例如能进一步降低上述沉淀物、悬浊的产生所带来的影响，且能进一步提高扩增效率。具体而言说，例如优选在上述扩增步骤之前添加白蛋白。上述扩增步骤之前例如可以是指扩增步骤中双链DNA解离为单链DNA之前。
[0098] 上述反应液中白蛋白的添加比例没有特别限制。上述比例例如为0.01～2重量％的范围、优选为0.1～1重量％的范围、更优选为0.2～0.8重量％的范围。上述白蛋白并无特别限制，例如可以是牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白、大鼠血清白蛋白、马血清白蛋白等。这些物质可以使用任一种，还可以并用两种以上。
[0099] 然后，举一个例子对本发明的扩增方法进行说明，所述例子为：以全血试样中的DNA为模板，作为本发明的MTHFR基因扩增用引物对使用含有上述引物对(1)和上述引物对(2)的引物对，通过PCR在一个反应液中同时扩增MTHFR基因的两个目标区域。上述两个目标区域是含有多态性MTHFR*677发生的位点的目标区域和含有多态性MTHFR*1298发生的位点的目标区域。本发明的特征在于使用本发明的MTHFR基因扩增用引物对，其他的构成和条件没有任何限制。
[0100] 首先，制备PCR的反应液。上述反应液含有上述引物对和上述全血试样，优选还适当含有上述扩增反应中能够使用的其他成分。
[0101] 上述反应液中，各引物的比例没有特别限制。上述反应液中，上述F1引物和上述F2引物的比例优选分别为0.1～2μmol/L，更优选的是0.25～1.5μmol/L，特别优选的是0.5～1μmol/L。另外，上述反应液中，上述R1引物和上述R2引物的比例分别优选为0.1～2μmol/L，更优选为0.25～1.5μmol/L，特别优选为0.5～1μmol/L。上述引物对(1)和上述引物对(2)各个中，F引物和R引物的比例(F∶R、摩尔比)没有特别限制，例如是1∶0.25～1∶4，优选是1∶0.5～1∶2。
[0102] 上述反应液中的上述全血试样的比例并无特别限制，例如优选前述范围。上述全血试样例如可以直接添加在反应液中，也可以预先用溶剂稀释后添加至上述反应液中。上述溶剂例如有水和缓冲液。预先稀释上述全血试样时，其稀释率并无特别限制，例如稀释率可以按照上述反应液中的最终全血比例达到上述范围的方式来进行设定，上述稀释率的具体例例如为100～2000倍、优选为200～1000倍。
[0103] 上述其他成分没有特别限制，可以是目前已知的成分，其比例也无特别限定。上述成分例如可以是溶剂等。上述成分例如有PCR中使用的各种成分，具体例为DNA聚合酶等聚合酶、核苷三磷酸。如上所述，上述成分可以是白蛋白。上述反应液中，各组成成分的添加顺序并无任何限定。
[0104] 上述DNA聚合酶并无特别限定，例如可以使用目前已知的耐热性细菌来源的聚合酶。具体例子有可以商业地获得的Thermus AquAticus来源的DNA聚合酶(美国专利第4,889,818号和第5,079,352号)(商品名TAq聚合酶)、Thermus thermophilus来源的DNA聚合酶(WO 91/09950)(rTth DNA polymerAse)、Pyrococcus furiosus来源的DNA聚合酶(WO 92/9689)(Pfu DNA polymerAse：StrAtAgenes公司制造)、Thermococcus litorAlis来源的聚合酶(EP-A 455 430)(商标Vent：New EnglAnd BiolAbs公司制造)，其中，优选Thermus AquAticus来源的耐热性DNA聚合酶。
[0105] 上述反应液中DNA聚合酶的添加比例并无特别限定，例如为1～100U/mL、优选为5～50U/mL、更优选为20～30U/mL。另外，对于DNA聚合酶的活性单位(U)，一般以活化鲑鱼精DNA为模板引物，在活性测定用反应液中、74℃下、30分钟内，将10nmol的总核苷酸吸收到酸不溶性沉淀物中的活性作为1U。上述活性测定用反应液的组成例如为25mmol/L TAPS缓冲液(pH9.3、25℃)、50mmol/L KCl、2mmol/L MgCl2、1mmol/L巯基乙醇、200μmol/L
32
dATP、200μmol/L dGTP、200μmol/L dTTP、100μmol/L“α- P”dCTP、0.25mg/mL活化鲑鱼精DNA。
32
dATP、200μmol/L dGTP、200μmol/L dTTP、100μmol/L“α- P”dCTP、0.25mg/mL活化鲑鱼精DNA。
[0106] 上述核苷三磷酸通常可以是dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP或dUTP)。上述反应液中的dNTP的比例并无特别限定，例如为0.01～1mmol/L、优选为0.05～0.5mmol/L、更优选为0.1～0.3mmol/L。
[0107] 上述溶剂例如可以为缓冲液、水等。上述缓冲液例如可以是Tris-HCl、三羟甲基甘氨酸(Tricine)、MES、MOPS、HEPES、CAPS等，可以使用市售的PCR用缓冲液和市售的PCR试剂盒的缓冲液等。
[0108] 作为上述其他成分，上述反应液还可以含有肝素、甜菜碱、KCl、MgCl2、MgSO4、甘油等，它们的比例例如只要设定为不干扰PCR反应的范围即可。
[0109] 上述反应液的总体积并无特别限定，例如可以根据热循环仪等的使用的机器等适当地设定，上述体积通常例如为1～500μL、优选为10～100μL。
[0110] 接着，进行PCR。上述PCR循环条件并无特别限定。具体例有例如(1)双链DNA解离成单链DNA、(2)引物的退火为上述单链DNA、(3)引物的延伸分别可以例示为下表3的条件。PCR循环次数也无特别限定，以下述(1)～(3)的3步骤为1个循环，例如优选为30个循环以上。所述循环次数的上限并无特别限定，例如为100个循环以下、优选70个循环以下、更优选50个循环以下。各步骤的温度变化例如可以使用热循环仪等自动地控制。如上所述，当使用本发明的MTHFR基因扩增用引物对时，扩增效率优异。因此与利用以往方法时50个循环需要3小时左右相比，利用本发明可以在约1小时左右(优选1小时以内)完成50个循环。
[0111] 表3
[0112]
[0113] 这样，能够在同一反应体系中，同时扩增MTHFR基因中的上述两个目标区域。在扩增上述两个目标区域中任意一者的情况下，例如，将上述引物对(1)和上述引物对(2)中与上述目标区域对应的一者的引物对作为本发明的MTHFR基因扩增用引物对使用即可。
[0114] 本发明的扩增方法还可以包含对通过上述扩增步骤获得的目标区域的扩增产物进行检测的检测步骤。由此，例如能够如后述的，检测上述目标区域的扩增的有无、MTHFR基因的上述目标区域的多态性，例如，MTHFR*677或MTHFR*1298。上述扩增的有无和上述多态性的检测可以通过以往公知的方法来确认。具体而言，例如，在上述扩增步骤，还向上述反应体系中，添加能够与MTHFR基因的检测对象位点杂交的探针。上述探针例如可以是具有荧光物质的标记探针。然后，在上述扩增步骤之后，在上述检测步骤中，对上述反应体系测定上述标记探针的上述荧光物质的荧光强度。由此，能够确认上述目标区域的扩增的有无以及上述检测对象位点的多态性。另外，在扩增的目标区域有两个的情况下，例如，在上述扩增步骤中，还向上述反应体系中添加两种能够与MTHFR基因的各检测对象位点杂交的探针。然后，在上述检测步骤中，针对上述反应体系，测定上述各标记探针的上述荧光物质的荧光强度。由此，能够分别确认上述各目标区域的扩增的有无和各检测对象位点的多态性。
[0115] 下面作为本发明的扩增方法的其他方式，以下分别说明MTHFR基因的上述目标区域的扩增产物的检测、以及MTHFR基因的多态性例如MTHFR*677和MTHFR*1298的检测。
[0116] <扩增产物检测方法>
[0117] 本发明的扩增产物的检测方法为检测MTHFR基因的扩增产物的扩增产物检测方法，其特征在于，使用本发明的引物或者本发明的引物对，包括下述(A)步骤。
[0118] (A)通过本发明的MTHFR基因的扩增方法，扩增MTHFR基因的扩增步骤[0119] 上述(A)步骤例如可以称作在反应体系中，以试样中的核酸为模板、使用本发明的MTHFR基因扩增用引物对，扩增MTHFR基因的扩增步骤(以下相同)。
[0120] 本发明的检测方法例如优选还包括使用探针，检测上述MTHFR基因的扩增产物的步骤。具体来说，例如优选包括下述(A)、(B)和(C)步骤。
[0121] (A)通过本发明的MTHFR基因的扩增方法，扩增MTHFR基因的扩增步骤[0122] (B)改变包含上述(A)步骤中的扩增产物和能够与上述MTHFR基因的扩增产物杂交的探针的反应体系的温度，测定显示上述扩增产物和上述探针的杂交体的融解状态的信号值的测定步骤
[0123] (C)基于伴随温度变化的上述信号值的变动，检测上述MTHFR基因的扩增产物的检测步骤
[0124] 在本发明的扩增产物检测方法中，上述(A)步骤可以引用前述的本发明的MTHFR基因的扩增方法中的记载。
[0125] 本发明的扩增产物的检测方法例如可以在上述探针的存在下，进行MTHFR基因的扩增。即本发明的扩增产物的检测方法例如可以在上述(A)步骤中，在含有上述探针的上述反应体系中进行MTHFR基因的扩增，并且，在上述(B)步骤中，例如可以改变上述(A)步骤的上述反应体系的温度，进行上述信号值的测定。
[0126] 本发明的扩增产物检测方法可以引用后述的本发明的多态性的检测方法中的记载。具体而言，例如本发明的扩增产物检测方法中的上述(A)步骤和上述(B)步骤可以引用后述的本发明的多态性检测方法中的(A)步骤和(B)步骤。另外，例如，本发明的扩增产物检测方法中的上述(C)步骤可以引用后述的本发明的多态性的检测方法中的(D)步骤，具体而言，在后述的(D)步骤中，对上述(C)步骤一并进行说明。
[0127] <多态性检测方法>
[0128] 本发明的多态性检测方法如前文所述，是以包含下述(A)步骤为特征的MTHFR基因的多态性检测方法。
[0129] (A)通过本发明的扩增方法，扩增MTHFR基因的扩增步骤
[0130] 本发明的多态性检测方法例如优选还包括使用探针，检测MTHFR基因的检测对象位点的多态性的步骤。具体而言，例如优选含有下述(A)、(B)和(D)步骤。
[0131] (A)通过本发明的扩增方法，扩增MTHFR基因的扩增步骤
[0132] (B)改变含有上述(A)步骤中的扩增产物和能够与上述检测对象位点杂交的探针的反应体系的温度，测定表示上述扩增产物和上述探针的杂交体的熔解状态的信号值的测定步骤
[0133] (D)基于伴随上述温度变化的上述信号值的变动，检测上述检测对象位点的上述多态性的检测步骤
[0134] 通过使用本发明的引物或者引物对扩增MTHFR基因，如前文所述，能够扩增含有MTHFR基因中的上述检测对象位点的目标区域。因此，例如，能够精确度良好地分析上述目标区域中的上述检测对象位点的多态性。
[0135] 上述扩增步骤(A)能够与前述的本发明的扩增方法类似地进行。本发明的扩增产物检测方法中，上述(A)步骤可以引用前述的本发明的MTHFR基因的扩增方法中的记载。
[0136] 上述测定步骤(B)中上述探针没有特别的限制。上述探针例如可以为与MTHFR*677的检测对象位点杂交的探针和与MTHFR*1298的检测对象位点杂交的探针。以下，前者也称为“MTHFR*677用探针”，后者也称为“MTHFR*1298用探针”。这些探针优选为与MTHFR基因中、含有上述检测对象位点的检测对象序列互补的探针。本发明例如可以使用MTHFR*677用探针和MTHFR*1298用探针中任意一种，也可以并用两种。本发明中使用的探针例如可以根据由本发明的MTHFR基因扩增用引物或者引物对扩增的目标区域的种类，适当决定。通过并用两种探针，例如使用同一反应体系，分析两个检测对象位点的多态性，即MTHFR*677和MTHFR*1298。
[0137] 上述探针例如可以是能够与MTHFR基因的正义链杂交的探针，也可以是能够与反义链杂交的探针。上述探针的设计方法没有特别限制，可以采用以往公知的方法。例如，将含有上述检测对象位点的检测对象序列设定为MTHFR基因的正义链的序列，基于上述序列设计，也可以将上述检测对象序列设定为反义链的序列，基于上述序列设计。上述检测对象序列中的上述检测对象位点的碱基可以根据上述检测对象位点的各多态性的种类适当决定。
[0138] 在MTHFR*677的情况下，作为序列编号1中的碱基编号8747的碱基，已知“c”和“t”。因此，例如可以是与正义链中碱基编号8747为胞嘧啶(c)的检测对象序列互补的探针，以及与正义链中碱基编号8747为胸腺嘧啶(t)的检测对象序列互补的探针。这些可以说是与正义链杂交的正义链的检测用探针。另外，可以是与其反义链的序列互补的探针，这些可以说是与反义链杂交的反义链的检测用探针。
[0139] 在MTHFR*1298的情况下，作为序列编号1中的碱基编号10649的碱基，已知“a”和“c”。因此，例如可以是与正义链中碱基编号10649为腺嘌呤(a)的检测对象序列互补的探针，以及与正义链中碱基编号10649为胞嘧啶(c)的检测对象序列互补的探针。这些可以说是与正义链杂交的正义链的检测用探针。另外，可以是与其反义链的序列互补的探针，这些可以说是与反义链杂交的反义链的检测用探针。
[0140] 这样，即使将多态性产生的检测对象位点的碱基决定为前述的任意一种碱基，设计探针，通过后述的方法，也能够判断MTHFR基因的各检测对象位点显示何种多态性。
[0141] 上述探针的长度并无特别限定，例如为5～50碱基长，优选为10～30碱基长。
[0142] 上述探针的具体例例如可以为含有下述(P1)寡核苷酸、(P1’)寡核苷酸、(P2)寡核苷酸和(P2’)寡核苷酸中的至少一者的探针。
[0143] (P1)：包括碱基长为17～50碱基长、与含有序列编号1中的碱基编号8744～8760的碱基序列互补的碱基序列，3’末端区域中具有与上述碱基编号8744的碱基互补的碱基的寡核苷酸
[0144] (P1’)：包含与上述(P1)寡核苷酸互补的碱基序列的寡核苷酸
[0145] (P2)：包括碱基长为14～50碱基长、与含有序列编号1中的碱基编号10643～10656的碱基序列互补的碱基序列，3’末端区域具有与上述碱基编号10643的碱基互补的碱基的寡核苷酸
[0146] (P2’)：包含与上述(P2)寡核苷酸互补的碱基序列的寡核苷酸
[0147] 上述探针例如可以是含有上述寡核苷酸的探针，也可以是含有上述寡核苷酸的探针。
[0148] 这些探针仅是一个例子，本发明不限于此。以下，将含有上述(P1)寡核苷酸的探针称为P1探针，将含有上述(P1’)寡核苷酸的探针称为P1’探针，将含有上述(P2)寡核苷酸的探针称为P2探针，将含有上述(P2’)寡核苷酸的探针称为P2’探针。也将这些探针称为本发明的MTHFR基因的检测用探针。
[0149] 上述P1探针和P1’探针是上述MTHFR*677用探针的一个例子。这些探针是用于检测序列编号1的碱基序列中的碱基编号8747的碱基(y)的多态性(c/t)的探针。上述(P1)寡核苷酸例如与MTHFR基因的正义链互补，通过与正义链的杂交，能够确认上述多态性。上述(P1’)寡核苷酸例如与MTHFR基因的正义链同源，通过与反义链的杂交，能够确认上述多态性。
[0150] 上述(P1)和(P1’)寡核苷酸如前文所述，其碱基长为17～50碱基长，例如优选17～40碱基长，更优选的是17～30碱基长，进一步优选的是17～21碱基长。
[0151] 上述(P1)寡核苷酸含有与序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号8747的碱基(y)对应的碱基(r)。上述r为鸟嘌呤(g)或者腺嘌呤(a)。在上述P1探针中，在“r为g”的情况下，上述(P1)寡核苷酸与正义链中的上述检测对象位点(y)为野生型(c)的检测对象序列完全匹配，在“r为a”的情况下，上述(P1)寡核苷酸与正义链中的上述检测对象位点(y)为突变型(t)的检测对象序列完全匹配。因此，由上述扩增方法得到的上述扩增产物和上述(P1)寡核苷酸是否完全匹配，可以确认上述检测对象位点的多态性是野生型还是突变型。
[0152] 上述(P1)寡核苷酸在上述3’末端区域，优选的是从3’末端起数第1～4位的位置，更优选的是第1～3位的位置，特别优选的是第1位(3’末端)或者第2位，具有与上述碱基编号8744的碱基互补的碱基。上述(P1)寡核苷酸例如可以例示为包括下述表4的序列编号44～48中任意一者所示的碱基序列的寡核苷酸。在上述(P1)寡核苷酸的碱基序列中，碱基(r)可以是鸟嘌呤(g)和腺嘌呤(a)中的任意一者，优选的是腺嘌呤(a)。
[0153] 表4
[0154]
[0155] 上述(P1’)寡核苷酸如前文所述，与上述(P1)寡核苷酸互补。上述(P1’)寡核苷酸可以称为包括碱基长为17～50碱基长，与含有序列编号1中的碱基编号8744～8760的碱基序列同源的碱基序列，在5’末端区域具有上述碱基编号8744的碱基的寡核苷酸。
[0156] 上述(P1’)寡核苷酸在为包括与上述(P1)寡核苷酸互补的碱基序列的寡核苷酸的情况下，含有序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号8747的碱基(y)。上述y为胞嘧啶(c)或者胸腺嘧啶(t)。在上述P1’探针中，“y为c”的情况下，上述(P1’)寡核苷酸与反义链中的上述检测对象位点(r)为野生型(g)的检测对象序列完全匹配，在“y为t”的情况下，上述(P1’)寡核苷酸与反义链中的上述检测对象位点(r)为突变型(a)的检测对象序列完全匹配。因此，通过上述扩增方法得到的上述扩增产物和上述(P1’)寡核苷酸是否完全匹配，可以确认上述检测对象位点的多态性是野生型还是突变型。
[0157] 上述P2探针和P2’探针是上述MTHFR*1298用探针的一个例子。这些探针是用于检测在序列编号1所示的碱基序列中碱基编号10649的碱基(m)的多态性(a/c)的多态性的探针。上述(P2)寡核苷酸例如与MTHFR基因的正义链互补，通过与正义链的杂交，能够确认上述多态性。上述(P2’)寡核苷酸例如与MTHFR基因的正义链同源，通过与反义链的杂交，能够确认上述多态性。
[0158] 上述(P1)和(P1’)寡核苷酸，如前文所述，其碱基长为14～50碱基长，例如优选14～40碱基长，更优选的是14～30碱基长，进一步优选的是14～19碱基长。
[0159] 上述(P2)寡核苷酸含有与序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号10649的碱基(m)对应的碱基(k)。上述k为胸腺嘧啶(t)、尿嘧啶(u)或者鸟嘌呤(g)。上述(P2)寡核苷酸中，在“r为t或者u”的情况下，上述(P2)寡核苷酸与正义链中的上述检测对象位点(m)为野生型(a)的检测对象序列完全匹配，在“r为g”的情况下，上述(P2)寡核苷酸与正义链中的上述检测对象位点(m)为突变型(c)的检测对象序列完全匹配。因此，通过上述扩增方法得到的上述扩增产物和上述(P2)寡核苷酸是否完全匹配，能够确认上述检测对象位点的多态性是野生型还是突变型。
[0160] 上述(P2)寡核苷酸在上述3’末端区域，优选的是在从3’末端起数第1～4位的位置，更优选的是第1～3位，特别优选的是在第1位(3’末端)或者第2位，具有与上述碱基编号10643的碱基互补的碱基。上述(P1)寡核苷酸例如可以例示为包括上述表4的序列编号49～54中任意一者所示的碱基序列的寡核苷酸。上述(P2)寡核苷酸的碱基序列中，碱基(k)可以是胸腺嘧啶(t)、尿嘧啶(u)和鸟嘌呤(g)中任意一者，优选的是鸟嘌呤(g)。
[0161] 上述(P2’)寡核苷酸，如前文所述，与上述(P2)寡核苷酸互补。上述(P2)寡核苷酸可以称为包括碱基长为14～50碱基长，与含有序列编号1中的碱基编号10643～10656的碱基序列同源的碱基序列，在5’末端区域具有上述碱基编号10643的碱基的寡核苷酸。
[0162] 上述(P2’)寡核苷酸在为包括与上述(P2)寡核苷酸互补的碱基序列的寡核苷酸的情况下，包含序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号10649的碱基(m)。上述m为腺嘌呤(a)或者胞嘧啶(c)。上述(P2’)寡核苷酸中，“m为a”的情况下，上述(P2’)寡核苷酸与反义链中的上述检测对象位点(k)为野生型(t)的检测对象序列完全匹配，“m为c”的情况下，上述(P2’)寡核苷酸与反义链中的上述检测对象位点(k)为突变型(g)的检测对象序列完全匹配。因此，通过由上述扩增方法得到的上述扩增产物与上述(P2’)寡核苷酸是否完全匹配，能够确认上述检测对象位点的多态性是野生型还是突变型。
[0163] 在上述P1探针中，上述MTHFR*677用探针优选为包括含有序列编号46所示的碱基序列的寡核苷酸的探针(P1-1)，在上述P2探针中，MTHFR*1298用探针优选包括含有序列编号52所示的碱基序列的寡核苷酸的探针(P2-1)。上述表4中，上述P1探针的“Tm(℃)”是上述碱基(r)为腺嘌呤(a)的序列和与其完全互补的序列杂交的情况下的Tm(℃)，通过上述MELTCALC软件，基于上述参数计算出的值。上述表4中，上述P2探针的“Tm(℃)”是上述碱基(k)为鸟嘌呤(g)的序列和与其完全互补的序列杂交的情况下的Tm(℃)，与上述类似地计算出的值。
[0164] 上述P1探针和上述P2探针例如可以是包含上述表4所示的各序列编号所示的寡核苷酸的探针，也可以是含有上述寡核苷酸的探针。
[0165] 上述探针例如优选为具有标记物质的标记探针，例如，上述寡核苷酸优选用上述标记物质标记(修饰)。上述寡核苷酸中，由上述标记物质标记的位点没有特别限制，例如优选5’末端区域或3’末端区域，更优选的是5’末端或3’末端。如后所述，在上述寡核苷酸中，由上述标记物质标记的碱基例如优选胞嘧啶(c)或者鸟嘌呤(g)，更优选的是胞嘧啶(c)。上述标记物质可以是例如直接标记碱基，或者间接标记上述碱基。在后者的情况下，例如可以通过标记含有上述碱基的核苷酸残基中任何一位点，来间接标记上述碱基。
[0166] 上述(P1)寡核苷酸和(P2)寡核苷酸优选在3’末端区域具有上述标记物质，具体而言，例如优选在从3’末端起数第1～4位的碱基的位置具有上述标记物质，更优选的是从3’末端起数第1～4位的碱基，进一步优选的是从3’末端起数第1～3位的碱基，特别优选的是从3’末端起数第2位或者3’末端的碱基。上述(P1)寡核苷酸例如优选与上述碱基编号8744～8747的碱基互补的任意碱基具有上述标记物质，更优选的是，与上述碱基编号8744的碱基互补的碱基(c)具有上述标记物质。上述(P2)寡核苷酸例如优选与上述碱基编号10643～10646的碱基互补的任意碱基具有上述标记物质，更优选的是，与上述碱基编号10643的碱基互补的碱基(c)具有上述标记物质。
[0167] 上述(P1’)寡核苷酸和(P2’)寡核苷酸优选在5’末端区域具有上述标记物质，具体而言，例如，在从5’末端起数第1～4位的碱基的位置具有上述标记物质，更优选的是从5’末端起数第1～4位的碱基，进一步优选的是从5’末端起数第1～3位的碱基，特别优选的是从5’末端起数第2位或者5’末端的碱基。上述(P1’)寡核苷酸例如优选在上述碱基编号8744～8747的任意碱基上具有上述标记物质，更优选的是上述碱基编号8744的碱基(g)上具有上述标记物质。上述(P2)寡核苷酸例如优选在上述碱基编号10643～10646的碱基的任意碱基上具有上述标记物质，更优选的是在上述碱基编号10643的碱基(g)上具有上述标记物质。
[0168] 上述标记物质无特别限制，例如优选上述标记探针单独发出信号、或者通过形成杂交体而发出信号。上述信号的种类无特别限制，例如有荧光、呈色等。上述呈色例如可以是发色，也可以是变色。上述信号是荧光的情况下，信号值例如可以是荧光强度。上述信号是呈色的情况下，上述信号值例如可以是反射率、吸光度、透过率等。上述信号可以从上述标记物质直接发出，也可以间接发出。
[0169] 上述标记物质无特别限制，例如是荧光团等荧光物质。上述荧光物质例如是荧光素、磷光体、罗丹明、聚甲炔染料衍生物等。市售的荧光物质例如为Pacific Blue(商标名，Molecular Probes公司制造)、BODIPY FL(商标名，Molecular Probes公司制造)、FluorePrime(商品名，Amersham Pharmacia公司制造)、Fluoredite(商品名，Millipore公司制造)、FAM(注册商标，ABI公司制造)、Cy3以及Cy5(商品名，Amersham Pharmacia公司制造)、TAMRA(商标名，Molecular Probes公司制造)等等。上述荧光物质的检测条件无特别限制，例如可根据使用的荧光物质的种类适当决定。作为具体示例，例如，对Pacific Blue而言检测波长450～480nm、对TAMRA而言检测波长585～700nm、对BODIPYFL而言检测波长515～555nm下，能够进行检测。如果使用这类标记探针，例如检测荧光作为上述信号，测定荧光强度作为上述信号值，由此能够基于荧光强度的变动容易地确认杂交和解离。
[0170] 如前文所述，本发明例如可以在同一反应体系中扩增MTHFR基因的两个目标区域。因此，通过在同一反应体系中并用上述MTHFR*677用探针和上述MTHFR*1298用探针，可以在同一反应体系中判别MTHFR基因中的MTHFR*677和MTHFR*1298的多态性。这种情况下，上述各探针优选分别具有在不同条件下检测的不同的标记物质。这样，通过使用不同标记物质，即使在同一反应体系中，例如，通过改变检测条件，也能够个别分析各检测对象位点的多态性。
[0171] 在并用两种以上的探针的情况下，各探针例如优选具有不同的荧光染料作为上述标记物质，具体而言优选具有在不同波长下检测的荧光染料。在上述探针为鸟嘌呤消光探针的情况下，例如，上述表4所示的MTHFR*677用探针(P1探针)和MTHFR*1298用探针(P2探针)，例如用所述荧光染料标记3’末端区域、优选3’末端的胞嘧啶(c)。具体而言，例如，作为上述荧光染料，优选分别用TAMRA、BODIPY FL等不同荧光染料标记。在将上述探针的5’末端用荧光染料标记的情况下，上述探针例如还可以在3’末端添加磷酸基。由此例如可以防止上述探针自身延长。
[0172] 上述标记探针例如优选单独显示信号并且通过形成杂交体而不显示信号的标记探针，或者是单独不显示信号并且通过形成杂交体而显示信号的标记探针。在上述标记物质是荧光物质的情况下，上述标记探针例如优选为经上述荧光物质标记、单独显示荧光并且通过形成杂交体而荧光减少(例如淬灭)的探针。这种现象一般称为荧光淬灭现象(Quenching phenomenon)。这种利用荧光淬灭现象(Quenching phenomenon)的探针，一般称为荧光淬灭探针。其中，上述荧光淬灭探针例如优选寡核苷酸的3’末端或5’末端经上述荧光物质标记，经标记的上述末端的碱基优选为胞嘧啶(c)或者鸟嘌呤(g)。在所述末端的碱基为胞嘧啶(c)的情况下，优选将上述荧光淬灭探针的碱基序列设计为使得：上述荧光淬灭探针例如在与被检核酸形成杂交体时，上述被检核酸中的与经标记的末端的胞嘧啶(c)配对的碱基或与上述配对的碱基距离1～3个碱基的碱基为鸟嘌呤(g)。与上述配对的碱基距离1个碱基的碱基例如是指上述配对的碱基的相邻的碱基。这种探针一般称为鸟嘌呤淬灭探针，已知为所谓QProbe(注册商标)。这种鸟嘌呤淬灭探针与所述被检核酸杂交时，例如，经上述荧光物质标记的末端的胞嘧啶(c)靠近上述被检核酸中的鸟嘌呤(g)，由此出现上述荧光物质的发光变弱，即荧光强度减少的现象。如果使用这种探针，例如通过荧光强度的变动，能够容易地确定杂交和解离。同样地，在上述末端的碱基为鸟嘌呤(g)的情况下，优选将上述荧光标记探针的碱基序列设计为使得：在上述荧光淬灭探针例如在与上述被检核酸形成杂交体时，上述被检核酸中的与经标记的末端的鸟嘌呤(g)配对的碱基或与上述配对的碱基距离1～3个碱基的碱基为胞嘧啶(c)。
[0173] 上述探针例如可以在3’末端添加磷酸基。如前文所述，上述扩增步骤可以在探针的共存下进行。这种情况下，如果在上述探针的3’末端添加磷酸基，则能够充分防止上述扩增步骤中上述探针自身延长。另外，上述3’末端添加如前述的标记物质，也能获得同样的效果。
[0174] 上述测定步骤(B)的上述反应体系中，上述探针的比例没有特别限制，例如，对于一种探针优选10～1000nmol/L的范围，更优选的是20～500nmol/L。
[0175] 在上述探针是具有荧光物质作为上述标记物质的标记探针的情况下，例如，为了调节检测的荧光强度，可以并用与上述标记探针相同序列的非标记探针。上述非标记探针例如可以在其3’末端添加磷酸。上述标记探针和上述非标记探针的摩尔比例如优选1∶10～10∶1。上述反应体系中，上述扩增产物和上述探针的摩尔比例如优选1∶10～
10∶1。上述扩增产物和上述探针的摩尔比例如可以是相对双链核酸的摩尔比，也可以是单链核酸的摩尔比。
10∶1。上述扩增产物和上述探针的摩尔比例如可以是相对双链核酸的摩尔比，也可以是单链核酸的摩尔比。
[0176] 上述测定步骤(B)中，上述探针例如可以包含在含有上述扩增步骤(a)中得到的扩增产物的反应体系中，其添加的时机没有特别限制。上述测定步骤(B)中的上述反应体系例如使用上述扩增步骤(A)得到的扩增产物和上述探针而新制备，也可以是上述扩增步骤(A)中的上述扩增反应的反应体系。在后者的情况下，上述探针例如可以在上述扩增步骤(A)之前或者中途添加到上述扩增反应的反应体系中，也可以在上述扩增步骤(A)之后，添加到上述扩增反应的反应体系中。其中例如优选，在上述扩增步骤(A)中的上述扩增反应之前预先将上述探针添加到上述扩增反应的反应体系中。这种情况下，上述扩增步骤(A)优选在上述探针的存在下扩增MTHFR基因。由此，例如不需要为了添加上述探针，在扩增反应中途或者之后，将上述反应体系暴露在外部环境中，另外，可以连续进行上述扩增反应和信号值的测定。
[0177] 如前述，上述测定步骤(B)的上述反应体系例如可以使用上述扩增步骤(A)的上述反应体系。上述扩增步骤(A)的上述反应体系中，上述试样的比例没有特别限制，可以按照上述本发明的扩增方法中所述的那样。这里，上述试样为生物试样，在上述测定步骤(B)中，作为上述反应体系使用上述扩增步骤(A)的上述反应体系，在上述探针的存在下进行光学信号检测的情况下，上述扩增步骤(A)的上述反应体系中的试样的比例，例如优选设定为0.1～0.5体积％。在上述生物试样例如为全血试样的情况下，上述反应体系中试样的比例例如优选0.1～0.5体积％。PCR等扩增反应中，通常，为了使DNA变性，即解离为单链DNA，因此对试样实施热处理。但由于该加热处理，试样所含的糖、蛋白质等变性，有产生不溶沉淀物、浑浊等的顾虑。因此，在如前述地检测信号的情况下，上述沉淀物和浑浊等的发生可能对测定精度造成影响。对此，如果将上述扩增步骤(A)的上述反应体系中上述试样的比例例如设定在上述范围内，虽然机理不明，但能充分防止变性所产生的沉淀物等造成的影响，因此能防止光学方法的测定精度的下降。另外，如果设定为上述范围，能充分地抑制上述试样中的杂质对扩增反应的妨碍，因此能进一步防止扩增效率降低。因而，在使用本发明的引物对的基础上，通过将上述反应体系的上述试样的比例设定在上述范围内，可以进一步排除试样前处理的必要性。
[0178] 在上述试样为全血试样的情况下，上述反应体系中的全血试样的比例可以不用前述的体积比例、例如0.1～0.5体积％，例如用血红蛋白(以下称为“Hb”)的重量比例表示。上述反应体系中的全血试样的比例换算成Hb量，例如优选0.565～113g/L的范围，更优选的是2.825～56.5g/L的范围，进一步优选的是5.65～28.25g/L的范围。上述反应体系中的全血试样的比例，例如可以满足上述体积比例和上述Hb重量比例两者，也可以满足任意一者。
[0179] 如前所述，本发明的多态性检测方法能利用于上述的所谓的Tm分析。下面，对Tm分析中的Tm值进行说明。例如，对含有双链DNA的溶液进行加热时，260nm处的吸光度会升高。原因是，双链DNA的两链之间的氢键由于加热而断裂，解离为单链DNA(DNA的熔解)。并且，当所有双链DNA全部解离成为单链DNA时，该吸光度显示加热开始时的吸光度(仅双链DNA时的吸光度)的约1.5倍左右。由此可以判断为熔解完全。根据该现象，一般而言，熔解温度(Tm)被定义为吸光度达到吸光度最大上升值的50％时的温度。
[0180] 在上述测定步骤(B)中，对表示上述扩增产物和上述探针的杂交体的熔解状态的信号的测定，例如是前述的260nm处的吸光度测定，也可以是上述标记物质的信号测定。具体而言，作为上述探针，如前文所述，优选使用经上述标记物质标记的标记探针，进行上述标记物质的信号测定。上述标记探针例如是单独显示信号并且通过形成杂交体而不显示信号的标记探针；或者是单独不显示信号并且通过形成杂交体而显示信号的标记探针。前一种探针的情况下，与上述扩增产物形成杂交体(双链DNA)时不显示信号，通过加热上述探针从上述扩增产物上解离时显示信号。另外，后一种探针的情况下，通过与上述扩增产物形成杂交体(双链DNA)而显示信号，通过加热上述探针从上述扩增产物上游离时信号减少(消失)。因此，通过检测上述标记物质的信号，与上述260nm处的吸光度测定类似，能够进行杂交体的熔解过程的检测以及Tm值的确定。上述标记物质的信号检测，例如可在对上述标记物质的信号来说特有的条件下进行检测，上述检测条件例如是激发波长、检测波长等。上述标记探针和上述标记物质，参见前文所述。
[0181] 上述(D)步骤或者上述(C)步骤中，基于信号值的变动检测上述多态性可以利用现有的方法进行。作为具体示例，例如将上述信号值的变动，与上述多态性检测用探针与突变型检测对象序列的杂交体的变动和/或所述多态性检测用探针和野生型的检测对象序列的杂交体的变动进行比较，可以判断多态性是突变型还是野生型。也就是说，如果与突变型相同则是突变型，如果与野生型相同则是野生型。另外，例如基于上述信号的变动求Tm值，通过与评价基准的Tm值进行比较，可以判断多态性。首先，基于上述信号值的变动，求Tm值。接着，将测定的上述Tm值，与预先求出的、关于野生型的检测对象序列的Tmwt值和/或关于突变型的检测对象序列的Tmmt值进行比较。然后，如果测定的Tm值与评价基准的Tmwt值相同或者同等程度则可以判断为野生型，如果低于Tmwt值则可以判断为突变型，如果与评价基准的Tmmt值相同或者同等程度则可以判断为突变型，低于Tmmt值则可以判断为野生型。
[0182] 接着，举例说明本发明的多态性检测方法。本例是，使用包含上述引物对(1)和上述引物对(2)的引物对作为本发明的MTHFR基因扩增用引物对，使用荧光物质标记的下述两种探针作为上述探针的示例。本例中，通过使用了上述引物对的PCR，在一个反应液中同时扩增MTHFR基因的两个目标区域，并且使用上述探针，检测MTHFR基因中的两个多态性MTHFR*677和MTHFR*1298。下述MTHFR*677用探针是包含序列编号46所示的碱基序列，碱基(r)为腺嘌呤(a)，3’末端用荧光染料TAMRA标记的探针。下述MTHFR*1298用探针是包含序列编号52所示的碱基序列，碱基(k)为鸟嘌呤(g)，3’末端用荧光染料BODIPY FL标记的探针。本发明不限于此。
[0183] (探针)
[0184] MTHFR*677用探针
[0185] 5′-gtgatgatgaaatcgActc-(TAMRA)-3′(序列编号55)
[0186] MTHFR*1298用探针
[0187] 5′-aagacacttGcttcac-(BODIPYFL)-3′(序列编号56)
[0188] 首先，制备PCR的反应液，如上所述地进行PCR，在同一反应液中同时扩增MTHFR基因的两个目标区域。上述反应液含有例如上述引物对(1)、引物对(2)和试样，优选还适当含有上述扩增反应中能够使用的其他成分。如前文所述，通过本发明，例如即使是全血之类的含有杂质的试样，也可以不进行前处理而直接使用上述试样。
[0189] 如上所述，上述反应液例如还可以含有上述探针。这种情况下，例如可以在上述探针存在的情况下进行上述MTHFR基因的扩增。
[0190] 接着，进行将得到的扩增产物(双链DNA)解离为单链DNA以及进行经解离得到的上述单链DNA与上述标记探针的杂交。上述反应，例如可在上述标记探针存在的情况下，改变上述反应液的温度来进行。此时，如前文所述，对于预先添加了上述标记探针的上述反应液来说，扩增反应结束后改变上述反应液的温度是优选的。
[0191] 上述解离步骤中的加热温度，例如是双链的上述扩增产物能解离为单链的温度。上述加热温度无特别限制例如是85～95℃。加热时间无特别限制，通常为1秒～10分钟，优选为1秒～5分钟。
[0192] 解离的单链DNA与上述标记探针的杂交例如可在上述解离步骤之后，通过降低上述解离步骤的加热温度来进行。温度条件例如是40～50℃。上述温度下的处理时间无特别限制，其例如是1～600秒。
[0193] 然后，改变上述反应液的温度，测定显示上述扩增产物与上述标记探针的杂交体熔解状态的信号值。具体而言，例如，对上述反应液加热，即对上述单链DNA与上述标记探针的杂交体加热，测定伴随温度上升的信号值的变动。如前文所述，使用鸟嘌呤淬灭探针、即末端胞嘧啶(c)被标记的探针时，与单链DNA杂交的状态下荧光减少(或淬灭)，解离的状态下则发出荧光。因此，例如可以对荧光减少(或淬灭)的杂交体慢慢加热，测定伴随温度上升的荧光强度的增加。
[0194] 当测定上述荧光强度的变化时，其温度范围无特别限制。上述起始温度例如是室温～85℃，优选为25～70℃，终止温度例如是40～105℃。温度的上升速度无特别限制，例如是0.1～20℃/秒，优选为0.3～5℃/秒。
[0195] 接着，分析上述信号值的变动，来确定Tm值。具体而言，可以根据测得的荧光强度计算出各温度下每单位时间的荧光强度的变化量(-d荧光强度变化量/dt，或者d荧光强度变化量/dt)，将显示最大变化的值的温度确定为Tm值。在上述标记探针是上述荧光淬灭探针的情况下，例如可以测定荧光强度的增加量，将每单位时间的荧光强度的增加量(-d荧光强度增加量/dt)显示为最低值的温度，或者将每单位时间的荧光强度的增加量(d荧光强度增加量/dt)显示为最高值的温度确定为Tm值。另一方面，在作为上述标记探针，不使用上述荧光淬灭探针而使用单独不显示信号并且通过形成杂交体而显示信号的探针时，与之前相反，可以测定荧光强度的减少量。
[0196] 作为上述标记探针，例如使用标记了检测波长不同的标记物质的多个探针的情况下，可以针对上述各检测波长，分析上述信号值的变动。
[0197] 上述Tm值，例如可根据已有的公知的MELTCALC软件(http://www.meltcalc.com/)计算得出，或者，也可以根据最邻近碱基对法(Nearest Neighbor Method)来确定。
[0198] 本例中，为了检测两个多态性MTHFR*677和MTHFR*1298，在与上述2种探针的各标记物质对应的条件下，进行信号值的测定。然后，针对上述各探针的信号，决定各自的Tm值。MTHFR*677用探针的TAMRA可以在检测波长585～700nm下检测，MTHFR*1298用探针的BODIPY FL可以在检测波长为515～555nm下检测。
[0199] 接下来，根据这些Tm值来确定各检测对象位点的基因型。也就是说，决定序列编号1的碱基序列中的碱基编号8747和碱基编号10649的碱基是上述野生型还是上述突变型。Tm分析中，例如可以得到较之一个碱基以上不同的杂交体(错配)，完全互补的杂交体(匹配)的显示解离的Tm值变高的结果。因此，通过事先针对上述探针决定完全互补的杂交体的Tm值与一个碱基不同的杂交体的Tm，可决定上述检测对象位点的多态性。具体而言，能够如下述地决定。假定上述检测对象位点的碱基为突变型，例如序列编号1中的碱基编号8747的碱基为胸腺嘧啶(t)，在使用与包含该碱基的检测对象序列互补的探针的情况下，如果形成的杂交体的Tm值与完全互补的杂交体的Tm值相同，则上述扩增产物的多态性可以判断为突变型的纯合子。另外，如果形成的杂交体的Tm值与一个碱基不同的杂交体的Tm值相同(低于完全互补的杂交体的Tm值的值)，则上述扩增产物的多态性可以判断为野生型的纯合子，例如，序列编号1中的碱基编号8747的碱基可以判断为胞嘧啶(c)的纯合子。此外，在检测出两者Tm值的情况下，可以决定为杂合子。这样，基于针对上述各探针的两个Tm值，可以判断多态性MTHFR*677和MTHFR*1298的基因型。
[0200] 这样基于信号值的变动，能够检测MTHFR基因的多态性，因此同样也能够检测是否扩增了含有上述多态性的上述目标区域。因此，与上述(D)步骤同样，通过进行前述的本发明的扩增产物检测方法的上述(C)步骤，能够进行上述扩增产物的检测。
[0201] 如前文所述，本发明，替代升高含有上述探针的反应体系的温度，即对杂交体进行加热，测定伴随温度升高的信号变动的方法，例如可以进行杂交体形成时的信号变动的测定。即，也可以在降低含有上述探针的反应体系的温度以形成杂交体时，例如测定伴随上述温度降低的信号变动。
[0202] 以如下情况作为具体示例：使用单独显示信号并且通过形成杂交体而不显示信号的标记探针(例如鸟嘌呤淬灭探针)的情况。这种情况下，上述标记探针在单链DNA与上述标记探针解离的状态下发出荧光，但是由于降低温度而形成杂交体时，上述荧光减少(或淬灭)。因此，例如，可以慢慢降低上述反应体系的温度，测定伴随温度降低的荧光强度减少。另一方面，使用单独不显示信号并且通过形成杂交体而显示信号的标记探针的情况下，在上述单链DNA与上述标记探针解离的状态下不发出荧光，但是由于降低温度而形成杂交体时发出荧光。因此，例如，可以慢慢降低上述反应体系的温度，测定伴随温度降低的荧光强度的增加。
[0203] 本发明中，在分析MTHFR基因的两种多态性MTHFR*677和MTHFR*1298中的一种多态性的情况下，例如，可以使用本发明的MTHFR基因扩增用引物对(包括上述引物对(1)和上述引物对(2)中的与目标区域对应的一种引物对)，而且，使用与目标检测对象位点杂交的一种探针。
[0204]
[0205] 如前文所述，本发明的MTHFR基因扩增用试剂为MTHFR基因的扩增用试剂，其特征在于，含有本发明的MTHFR基因扩增用引物或者引物对。本发明的MTHFR基因扩增用试剂的特征为含有上述本发明的引物对，除此之外的组成等没有任何限制。
[0206] 本发明的MTHFR基因扩增用试剂例如优选含有上述引物对(1)和上述引物对(2)中的任意一者，更优选的是含有两者。
[0207] 例如为了检测使用了本发明的引物对的扩增方法而得到的扩增产物，本发明的MTHFR基因扩增用试剂优选还含有能够与MTHFR基因的扩增产物杂交的探针。如前文所述，通过本发明的引物对，例如根据其中包含的上述引物对(1)和上述引物对(2)的种类，可以获得MTHFR基因中的一个或者两个目标区域的扩增产物。因此，通过上述探针，例如可以通过上述的方法，检测有无扩增以及检测对象位点的多态性等。上述探针如前文所述。上述探针例如优选含有上述P1探针和上述P2探针中的至少一者，更优选的是含有两者。
[0208] 本发明的MTHFR基因扩增用试剂优选例如在扩增全血等生物试样中的MTHFR基因时使用。尤其是，在将本发明的MTHFR基因扩增用试剂例如与上述探针一起使用时，优选使扩增反应的反应体系中的全血试样的比例为0.1～0.5体积％。
[0209] 除此之外，本发明的MTHFR基因扩增用试剂可以含有例如核酸的扩增反应所需的成分。具体示例有例如前文所述的DNA聚合酶等聚合酶、三磷酸核苷、缓冲液、各种催化剂等。本发明的多态性检测用试剂中，各成分可以收容在相同的容器中，也可以收容在另外的容器中。
[0210] 本发明的MTHFR基因扩增用试剂的方式不特别限制，例如可以是含有本发明的MTHFR基因扩增用引物对的液体试剂，也可以是使用前用溶剂悬浮的干燥试剂。另外，MTHFR基因扩增用引物对的含量也不特别限制。
[0211] 本发明的扩增用试剂例如也可以说是MTHFR基因的扩增中使用的试剂盒。本发明的扩增用试剂盒中，各成分例如可以收容在相同的容器中，也可以收容在另外的容器中。本发明的扩增用试剂盒还可以含有使用说明书。
[0212] <扩增产物检测用试剂和多态性检测用试剂>
[0213] 本发明的扩增产物检测用试剂为MTHFR基因的扩增产物的检测用试剂，其特征在于含有本发明的MTHFR基因扩增用引物对。另外，本发明的多态性检测用试剂为MTHFR基因的多态性的检测用试剂，其特征在于，含有本发明的MTHFR基因扩增用引物对。本发明以含有上述本发明的MTHFR基因扩增用引物对为特征，除此之外的结构和条件没有任何限制。只要不特别示出，本发明的扩增产物检测用试剂和多态性检测用试剂与上述MTHFR基因扩增用试剂相同。
[0214] 本发明的多态性检测用探针的特征在于，如前文所述，含有上述(P1)和(P2)中的至少一种寡核苷酸。本发明的多态性检测方法为MTHFR基因的多态性检测方法，其特征在于包括使用本发明的多态性检测用探针检测MTHFR基因的多态性的步骤。本发明的探针和使用了该探针的各种方法可以参照前文所述的记载。
[0215] 下面对本发明的实施例进行说明。本发明不限于下述实施例。在下述实施例中，只要没有特别表示，％表示w/v％。
[0216] [实施例1]
[0217] 本实施例中，使用未经前处理的全血试样作为试样，进行MTHFR基因的扩增，分析多态性。
[0218] 从待测者3人使用肝素锂采血管采集全血，分别作为样品1、2、3。在下述组成的稀释液170μL中添加上述全血10μL并混合，将该混合液10μL添加到下述组成的稀释液270μL中，制备稀释试样。将上述稀释试样17μL加入到带盖的试管中，在盖开启的状态下，在95℃下加热10分钟，将上述稀释试样浓缩到约4μL。向上述浓缩试样添加下述表5所示的反应试剂46μL，作为PCR反应液。对上述PCR反应液，使用热循环仪进行PCR。PCR的条件为，在95℃下处理60秒之后，以95℃1秒和66℃15秒为一个循环反复进行50个循环，再在95℃下处理1秒、40℃下处理60秒。然后，将温度的上升速度设为1℃/3秒，将上述PCR反应液从40℃加热到75℃，测定荧光强度随时间的变化，进行Tm分析。测定波长是
515～555nm(荧光染料BODIPY FL的检测)和585～700nm(荧光染料TAMRA的检测)。
515～555nm(荧光染料BODIPY FL的检测)和585～700nm(荧光染料TAMRA的检测)。
[0219] (稀释液1)
[0220]
[0221] (稀释液2)
[0222]
[0223] 表5
[0224]
[0225]
[0226] ※商品名Gene Taq FP：Nippon Gene公司制造
[0227] (探针)
[0228] MTHFR*677用探针
[0229] 5′-gtgatgatgaaatcgActc-(TAMRA)-3′(序列编号55)
[0230] MTHFR*1298用探针
[0231] 5′-aagacacttGcttcac-(BODIPY FL)-3′(序列编号56)
[0232] (引物对)
[0233] MTHFR*677F1引物
[0234] 5′-cagggagctttgaggctgacctg-3′(序列编号7)
[0235] MTHFR*677R1引物
[0236] 5′-gatggggcaagtgatgcccatg-3′(序列编号15)
[0237] MTHFR*1298F2引物
[0238] 5′-gctgaaggactactacctcttctacctgaag-3′(序列编号25)
[0239] MTHFR*1298R2引物
[0240] 5′-gcatcactcactttgtgaccattccgg-3′(序列编号38)
[0241] 在Tm分析中，在形成的杂交体为完全匹配的情况下，作为评价基准的Tm如下。与MTHFR*677用探针完全匹配的杂交体的Tm值为62.5℃、与MTHFR*677用探针错配的杂交体的Tm值为56℃、与MTHFR*1298用探针完全匹配的杂交体的Tm值为57℃、与MTHFR*1298用探针错配的杂交体的Tm值为47℃。
[0242] 其结果示于图1。图1是表示随着温度上升的荧光强度的变化的Tm分析的图。在图1中，纵轴表示在各温度下荧光强度的变化(以下也称为“荧光强度变化量”)。纵轴的单位是微分值“d荧光强度增加量/dt”，表示为“dF/dt”。在图1中，横轴表示测定时的温度(℃)。
[0243] 基于图1所示的信号的峰，决定各样品中MTHFR*677和THFR*1298的基因型。其结果，样品1的MTHFR*677的基因型为突变型的纯合子677(T/T)，MTHFR*1298的基因型为野生型的纯合子1298(A/A)。样品2的MTHFR*677的基因型为野生型和突变型的杂合子677(C/T)，MTHFR*1298的基因型为野生型和突变型的杂合子1298(A/C)。样品3的MTHFR*677的基因型为野生型的纯合子677(C/C)，MTHFR*1298的基因型为野生型的纯合子1298(A/A)。
[0244] 为了验证上述实施例1的结果，对上述样品1、2和3，通过现有方法的RFLP法，确认MTHFR*677和MTHFR*1298的基因型。通过以往的RFLP法得出的上述各样品的基因类型与实施例1为相同结果。
[0245] 这样，通过使用本发明的引物对，使用未经前处理的全血试样，在同一反应液中同时扩增MTHFR基因的两个区域，并且，使用上述同一反应液分析两种多态性，可以判定合子类型。
[0246] [实施例2]
[0247] 本例中，使用精制核酸作为试样，进行MTHFR基因的扩增，分析多态性。
[0248] 替代上述实施例1中的上述浓缩试剂4μL，使用精制的人基因组4μL。并且，不对上述人基因组进行上述加热处理，添加上述表5所示的反应试剂46μL，除此之外与上述实施例1类似地进行PCR和Tm分析。上述精制人基因组由上述实施例1的样品1、2和3的全血制备。具体而言，使用GFX Genomic Blood DNA Purification Kit(GE Healthcare Bioscience公司制造)，按照上述试剂盒所附的基因组DNA提取协议，精制上述全血，制备上述精制人基因组。
[0249] 在Tm分析中，在形成的杂交体为完全匹配的情况下，作为评价基准的Tm与前述相同。即，与MTHFR*677用探针完全匹配的杂交体的Tm值为62.5℃，与MTHFR*677用探针错配的杂交体的Tm值为56℃，与MTHFR*1298用探针完全匹配的杂交体的Tm值为57℃，与MTHFR*1298用探针错配的杂交体的Tm值为47℃。
[0250] 其结果示于图2。该图是表示随着温度上升的荧光强度的变化的Tm分析的图。在图2中，纵轴表示各温度下荧光强度的变化(以下，也称为“荧光强度变化量”)。纵轴的单位为微分值“d荧光强度増加量/dt”，表示为“dF/dt”。在图2中，横轴表示测定时的温度(℃)。
[0251] 基于图2所示的信号的峰，决定各样品中MTHFR*677和MTHFR*1298的基因型。其结果，样品1的MTHFR*677的基因型为野生型的纯合子677(C/C)，MTHFR*1298的基因型为突变型的纯合子1298(C/C)。样品2的MTHFR*677的基因型为突变型的纯合子677(T/T)，MTHFR*1298的基因型为野生型的纯合子1298(A/A)。样品3的MTHFR*677的基因型为野生型和突变型的杂合子677(C/T)，MTHFR*1298的基因型为野生型和突变型的杂合子1298(A/C)。
[0252] 为了验证上述实施例2的结果，针对上述样品1、2和3，通过已知方法的RFLP法，确认MTHFR*677和MTHFR*1298的基因型。已知方法的RFLP法得出的各样品的基因类型，与实施例为相同的结果。
[0253] 这样，通过使用本发明的引物对，能够在同一反应液中同时扩增MTHFR基因的两个区域，并且，使用上述同一反应液分析两种多态性，能够判定合子类型。
[0254] 产业上的利用可能性
[0255] 如上，使用本发明的引物和引物对，能够特异性地扩增含MTHFR基因中的检测对象位点(例如，MTHFR*677或MTHFR*1298)的目标区域。因此，通过本发明的引物、引物对、含有它的试剂、以及使用它们的扩增方法以及多态性检测方法，能迅速且简便地分析MTHFR基因的多态性，因此可以说在医疗领域极其有效。
[0256] 以上参照实施方式和实施例，对本发明进行了说明，但是，在上述发明的范围内，可以进行本领域技术人员能够理解的各种变更。
[0257] 本申请主张以2009年11月19日申请的日本申请特愿2009-264052为基础的优先权，将其全部公开内容并入本文。
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