左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立
阅读：60发布：2020-08-04
专利汇可以提供左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且左 氧 氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，主要步骤如下：1.对志贺菌进行左氧氟沙星等12种抗生素药敏试验，挑选出敏感株做诱导实验；2.测左氧氟沙星对诱导株原代MIC0；3.将单菌落至左氧氟沙星细菌液体培养基中培养；4.取步骤3中菌液至左氧氟沙星细菌液体培养基中传一代，取菌液至左氧氟沙星液体培养基中传两代，药物浓度达到敏感与中介临界值前依次将左氧氟沙星浓度倍增培养细菌，当药物浓度达到敏感与耐药临界值后依次将左氧氟沙星浓度递增培养；当诱导抗菌药物浓度达到2、4、8μg/ml时，菌株在该浓度中诱导培养两天，生长良好的单菌落诱导培养得到志贺菌诱导耐药谱型，对该诱导耐药谱型的菌株进行基因突变分析。，下面是左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立专利的具体信息内容。
1.左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，其特征在于，主要方法步骤如下：
用纸片琼脂扩散法对志贺菌进行头孢唑啉、头孢噻肟、氨苄西林、庆大霉素、氯霉素、四环素、复方新诺明、萘啶酸、吡哌酸、环丙沙星、诺氟沙星及左氧氟沙星12 种抗生素的药敏试验，以对12种抗菌药物均敏感的为敏感株，判断细菌敏感、中度敏感或耐药，将敏感株于细菌固体培养基平板上划线培养，选取生长良好的单菌落做诱导实验；
用琼脂稀释法测定左氧氟沙星对诱导株原代的最低抑菌浓度MIC0，左氧氟沙星敏感、中介、耐药标准依次为MIC（μg/ml）≤2、2~8、≥8；
从实验诱导株的细菌固体培养基平板上挑取生长良好的单菌落至至少五管左氧氟沙星浓度为1/4×MIC0的细菌液体培养基中，32℃~39℃震荡培养细菌生长至对数期OD600=0.6~1；
取步骤（3）中一定量菌液至至少五管左氧氟沙星含量为1/4× MIC0的细菌液体培养基中再传一代，然后再取一定量菌液至左氧氟沙星浓度为1/2× MIC0的液体培养基中传两代，在药物浓度达到敏感与中介临界值前，依次将左氧氟沙星浓度倍增培养细菌，当药物浓度达到敏感与耐药临界值后依次将左氧氟沙星浓度递增培养，每次递增1μg/ml；
当诱导抗菌药物浓度达到2、4、8µg/ml时，菌株在该浓度中诱导培养两天后，暂不诱导传代，先做至少两次无诱导剂传代培养后，再接种于含相同浓度诱导剂的细菌固体培养基平板上过夜培养，挑选生长良好的单菌落继续诱导培养，最终得到至少五组志贺菌诱导耐药谱型，对该诱导耐药谱型的菌株进行基因突变分析；
在诱导传代的过程中，采用琼脂稀释法测定左氧氟沙星对实验诱导株各代的MIC，左氧氟沙星敏感、中介、耐药标准依次为MIC（μg/ml）≤2、2~8、≥8；
构建左氧氟沙星诱导多组志贺菌耐药基因突变模型，以此进行诱导耐药基因突变时序分析。
2.如权利要求1所述的左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，特征在于：所述的细菌固体培养基为LB固体培养基，所述的细菌液体培养基为LB液体培养基。
3.如权利要求1所述的左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，特征在于：步骤（3）中震荡培养温度为37℃。
4.如权利要求1所述的左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，特征在于：步骤（3）中震荡培养细菌生长至OD600=0.9。
5.如权利要求1所述的左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，特征在于：步骤（4）中取步骤（3）中一定量菌液至N管左氧氟沙星含量为1/4× MIC0的LB液体培
5
养基中，使终浓度为5×10CFU/ml。
6.如权利要求1所述的左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，特征在于：最终7组志贺菌诱导传代61代。
7.如权利要求1所述的左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，其特征在于：通过多组基因突变的分析，寻找喹诺酮药物靶基因突变时序的规律，利用这个模型确定在LEV诱导作用下喹诺酮药物靶基因位点突变时序，推断在人体或自然环境中志贺菌在外界LEV压力下喹诺酮药物靶基因位点突变时序，具体为：
（1）采用gyrA基因PCR-RFLP分析和parC基因PCR-RFLP-SSCP分析的方法对通过LEV筛选出的诱导株进行检测；
1）聚合酶链式反应扩增gyrA和parC基因：
①模板DNA制备：煮沸法提取模板DNA：取增菌6小时到达对数生长期的LB增菌肉汤
1ml于1.5ml的Eppendorf管中，10000转/分离心1分，弃上清，加三蒸水100 μl，在震荡器上混匀煮沸10分钟，稍离心，则上清液即为PCR模板DNA，将提好的DNA标号后置 -20℃保存备用；
②引物及引物设计：扩增目的基因片段所需引物参考福氏2a志贺菌株301gyrA和parC基因公布序列，运用Primer5软件自行设计：
gyrA基因引物：gyrA基因全长2628bp， 喹诺酮耐药决定区（QRDR）在第166-410位点；
gyrA基因上游引物A1位于gyrA基因第24-43位，下游引物A2位于gyrA基因第652-671位，PCR扩增片段位于gyrA基因24-671位，产物648bp：
A1：5’-TAC ACC GGT CAA CAT TAA GG-3’，
A2：5’-TTA ATG ATT GCC GCC GTC GG-3’，
parC基因引物：parC基因全长2259bp， QRDR区域在第175-411位点；parC基因上游引物C1位于parC基因第88-108位碱基，下游引物C2与parC基因第538-556位碱基互补，PCR扩增片 段位于parC基因第88-556位点，产物469bp：
C1：5’-GCG TTG CCG TTT ATT GGT GAT-3’，
C2：5’-GCA GGT TAT GCG GTG GAA T-3’，
③ PCR扩增方案
表1 gyrA和parC基因PCR扩增体系（50μl）
混匀稍离心后，置温度循环仪中，94℃预变性5min后，循环；94℃变性60s后，gyrA、parC分别在56℃和61℃退火45s，再于72℃延30s，共进行35个循环， 72℃延伸600s；循环结束后进行PCR产物琼脂糖凝胶检测；
④ 扩增产物检测：制备1.5%琼脂糖凝胶，取5μl PCR产物与1μl溴酚兰载样缓冲液混合，加样于琼脂糖凝胶点样孔中，电压5V/cm进行电泳，电泳液为1× TBE，停止电泳后，取胶在读胶仪中观察结果并照相，标准为100bp DNA Ladder；
2)gyrA基因的限制性酶切片段长度多态性分析
①限制性内切酶消化：核酸片段越小，检测的敏感性越高；对于大于400bp的PCR产物应提前用限制性内切酶进行消化处理；gyrA基因扩增区域内有限制性内切酶hinfⅠ的两个识别位点（244thbp和343thbp），可将此段PCR产物消化成三条片段（221bp、99bp和
328bp）：
酶切体系为 50 µl
PCR产物 40 µl
限制性内切酶缓冲液 4 µl
限制性内切酶hinfⅠ 6 µl
混匀并稍离心，置放于37℃水浴中2h；
酶切反应后，使用琼脂糖凝胶水平电泳检测酶切效果；
②酶切图谱分析：制备2%琼脂糖凝胶，取7μl上述PCR产物与1μl载样缓冲液混合，加样点样孔中，电压5V/cm进行电泳，电泳液为1× TBE，并在读胶仪上观察酶切图谱，照相，众多研究表明，gyrA第244位碱基突变使HinfⅠ在该处识别位点丧失，从而只产生两条酶切产物片段：320bp和328bp；
3)parC基因的单链构象多态性分析
①限制性内切酶消化：对于大于400bp的PCR产物需要用限制性内切酶消化PCR产物进行处理，产生较小的DNA片段，再进行单链构象分析；parC基因扩增区域有限制性内切酶hinfⅠ的识别位点279thbp，可将此段PCR产物消化成两条片段191bp和278bp，消化方法同上；
②聚丙烯酰胺凝胶电泳：取3µl酶切样品与22µl变性上样液混合，进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，胶厚度1.0 mm，长82mm，电压8V/cm，恒压电泳4h；分子量标准100bp DNA Ladder；
③银染：电泳结束后，分开两块玻璃板，将凝胶片放入100 ml银染固定液中震荡
15min，三蒸水洗3次，每次2min，然后将凝胶片转入100ml 0.2 %的AgNO3液，用三蒸水洗
3次，每次30s，加入100ml显色液约7-10min，待DNA带显示清除时，吸去显色液，加入固定液Na2CO3，静置2-3min，取出凝胶观察；置于看片灯上观察结果并照相；
（2）采用基因测序的方法检测突变的基因位点，寻找喹诺酮药物靶基因gyrA、parC在LEV诱导下突变的时序规律；
1)核酸序列的测定：对实验室诱导株志贺菌原代的gyrA、parC基因PCR扩增产物进行测序，另挑选部分诱导菌株，对gyrA、parC基因PCR扩增产物进行测序；委托北京六合华大基因科技公司进行；
2)核酸序列的比对分析：在NCBI中通过BLST程序对所测序列结果和从GenBank检索到的gyrA、parC基因标准序列进行比对分析。
左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立
技术领域
背景技术
[0002] 细菌耐药性的出现和蔓延在很大程度上是对抗感染治疗的挑战，以志贺菌为例，众多研究已表明志贺菌目前频繁出现耐药株，且呈耐药产生速度快、耐药范围广、耐药率高、各菌型耐药谱不同等特点，喹诺酮作为目前治疗菌痢的首选药物，上世纪80年代投入使用时志贺菌属细菌对其敏感性高达95%以上，菌痢的疗效曾一度改观。但近40年来，喹诺酮类抗生素应用广泛，且该药与其他抗菌药物一起也用于动物感染的治疗，细菌尤其是肠杆科细菌对喹诺酮类药物呈现较高的耐药性。
[0003] 靶基因突变是志贺菌属细菌对喹诺酮类药物的重要分子基础，由染色体介导耐药株靶基因突变存在多态性，诱导株多重耐药性的产生可能是由于激活了它包括AcrAB在内的主动外排系统，主动外排机制和靶基因突变共同存在导致志贺菌属细菌耐哇诺酮类药物，虽然有研究用喹诺酮类药物诱导志贺菌，但只是诱导一株志贺菌，形成单个诱导体系，所呈现的耐喹诺酮药物靶基因gyrA、parC的突变先后顺序不能排除自身随机突变的影响，且不能从一致性和统计学概率上来解释突变时序的准确性，不能说明问题。
发明内容
[0004] 本发明的目的是克服以上不足，提供一种左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立。
[0005] 一种左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，主要方法步骤如下： （1）用纸片琼脂扩散法对志贺菌进行头孢唑啉、头孢噻肟、氨苄西林、庆大霉素、氯霉素、四环素、复方新诺明、萘啶酸、吡哌酸、环丙沙星、诺氟沙星及左氧氟沙星12 种抗生素的药敏试验，以对12种抗菌药物均敏感的为敏感株，判断细菌敏感、中度敏感或耐药，将敏感株于细菌固体培养基平板上划线培养，选取生长良好的单菌落做诱导实验；（2）用琼脂稀释法测定左氧氟沙星（Levofloxacin, LEV）对诱导株原代的最低抑菌浓度MIC0， LEV 敏感、中介、耐药标准依次为MIC（μg/ml）≤2、2~8、≥8；
（3）从实验诱导株的细菌固体培养基平板上挑取生长良好的单菌落至至少五管左氧氟沙星浓度为1/4×MIC0的细菌液体培养基中，32℃-39℃震荡培养细菌生长至对数期OD600=0.6-1；
（4）取步骤（3）中一定量菌液至至少五管左氧氟沙星含量为1/4× MIC0的细菌液体培养基中再传一代，然后再取一定量菌液至左氧氟沙星浓度为1/2× MIC0的液体培养基中传两代，在药物浓度达到敏感与中介临界值前，依次将左氧氟沙星浓度倍增培养细菌，当药物浓度达到敏感与耐药临界值后依次将左氧氟沙星浓度递增培养，每次递增1μg/ml；
（5）当诱导抗菌药物浓度达到2、4、8µg/ml时，菌株在该浓度中诱导培养两天后，暂不诱导传代，先做至少两次无诱导剂传代培养后，再接种于含相同浓度诱导剂的细菌固体培养基平板上过夜培养，挑选生长良好的单菌落继续诱导培养，最终得到至少五组志贺菌诱导耐药谱型；对该诱导耐药谱型的菌株进行基因突变分析；
（6）在诱导传代的过程中，采用琼脂稀释法测定左氧氟沙星对实验诱导株各代的MIC， LEV 敏感、中介、耐药标准依次为MIC（μg/ml）≤2、2~8、≥8；
（7）构建左氧氟沙星诱导多组志贺菌耐药基因突变模型，以此进行诱导耐药基因突变时序分析。
（3）从实验诱导株的细菌固体培养基平板上挑取生长良好的单菌落至至少五管左氧氟沙星浓度为1/4×MIC0的细菌液体培养基中，32℃-39℃震荡培养细菌生长至对数期OD600=0.6-1；
（4）取步骤（3）中一定量菌液至至少五管左氧氟沙星含量为1/4× MIC0的细菌液体培养基中再传一代，然后再取一定量菌液至左氧氟沙星浓度为1/2× MIC0的液体培养基中传两代，在药物浓度达到敏感与中介临界值前，依次将左氧氟沙星浓度倍增培养细菌，当药物浓度达到敏感与耐药临界值后依次将左氧氟沙星浓度递增培养，每次递增1μg/ml；
（5）当诱导抗菌药物浓度达到2、4、8µg/ml时，菌株在该浓度中诱导培养两天后，暂不诱导传代，先做至少两次无诱导剂传代培养后，再接种于含相同浓度诱导剂的细菌固体培养基平板上过夜培养，挑选生长良好的单菌落继续诱导培养，最终得到至少五组志贺菌诱导耐药谱型；对该诱导耐药谱型的菌株进行基因突变分析；
（6）在诱导传代的过程中，采用琼脂稀释法测定左氧氟沙星对实验诱导株各代的MIC， LEV 敏感、中介、耐药标准依次为MIC（μg/ml）≤2、2~8、≥8；
（7）构建左氧氟沙星诱导多组志贺菌耐药基因突变模型，以此进行诱导耐药基因突变时序分析。
[0006] 上述左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，所述的细菌固体培养基为LB固体培养基，所述的细菌液体培养基为LB液体培养基。
[0007] 上述左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，步骤（3）中震荡培养温度为37℃。
[0008] 上述左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，步骤（3）中震荡培养细菌生长至OD600=0.9。
[0009] 上述左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，步骤（4）中取步骤（3）中一定量菌液至N管左氧氟沙星含量为1/4× MIC0的LB液体培养基中，使终浓度为5
5×10CFU/ml。
5×10CFU/ml。
[0010] 上述左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，最终7组志贺菌诱导传代61代。
[0011] 上述左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，通过多组基因突变的分析，寻找喹诺酮药物靶基因突变时序的规律，利用这个模型确定在LEV诱导作用下喹诺酮药物靶基因位点突变时序，推断在人体或自然环境中志贺菌在外界LEV压力下喹诺酮药物靶基因位点突变时序，具体为：（1）采用gyrA基因PCR-RFLP分析和parC基因PCR-RFLP-SSCP分析的方法对通过LEV
筛选出的诱导株进行检测：
1）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）扩增gyrA和parC基因
①模板DNA制备：煮沸法提取模板DNA：取增菌6小时到达对数生长期的LB增菌肉汤
1ml于1.5ml的Eppendorf管中，10000转/分离心1分，弃上清，加三蒸水100 μl，在震荡器上混匀煮沸10分钟，稍离心，则上清液即为PCR模板DNA，将提好的DNA标号后置 -20℃保存备用。
筛选出的诱导株进行检测：
1）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）扩增gyrA和parC基因
①模板DNA制备：煮沸法提取模板DNA：取增菌6小时到达对数生长期的LB增菌肉汤
1ml于1.5ml的Eppendorf管中，10000转/分离心1分，弃上清，加三蒸水100 μl，在震荡器上混匀煮沸10分钟，稍离心，则上清液即为PCR模板DNA，将提好的DNA标号后置 -20℃保存备用。
[0012] ②引物及引物设计扩增目的基因片段所需引物参考福氏2a志贺菌株301 gyrA和parC基因公布序列，运
用Primer5软件自行设计：
gyrA基因引物：gyrA基因全长2628bp， QRDR区域在第166-410位点。gyrA基因上游
引物A1位于gyrA基因第24-43位碱基，下游引物A2位于gyrA基因第652-671位，PCR扩增片段位于gyrA基因24-671位，产物648bp：A1：5’-TAC ACC GGT CAA CAT TAA GG-3’，A2：5’-TTA ATG ATT GCC GCC GTC GG-3’；
parC基因引物：parC基因全长2259bp， QRDR区域在第175-411位点。parC基因上
游引物C1位于parC基因第88-108位碱基，下游引物C2与parC基因第538-556位碱基
互补，PCR扩增片 段位于parC基因第88-556位点，产物469bp：C1：5’-GCG TTG CCG TTT ATT GGT GAT-3’， C2：5’-GCA GGT TAT GCG GTG GAA T-3’；
③ PCR扩增方案
表1 gyrA和parC基因PCR扩增体系（50μl）
混匀稍离心后，置温度循环仪中，94℃预变性5min后，循环；94℃变性60s后，gyrA、parC分别在56℃和61℃退火45s，再于72℃延30s，共进行35个循环， 72℃延伸600s。循环结束后进行PCR产物琼脂糖凝胶检测。
用Primer5软件自行设计：
gyrA基因引物：gyrA基因全长2628bp， QRDR区域在第166-410位点。gyrA基因上游
引物A1位于gyrA基因第24-43位碱基，下游引物A2位于gyrA基因第652-671位，PCR扩增片段位于gyrA基因24-671位，产物648bp：A1：5’-TAC ACC GGT CAA CAT TAA GG-3’，A2：5’-TTA ATG ATT GCC GCC GTC GG-3’；
parC基因引物：parC基因全长2259bp， QRDR区域在第175-411位点。parC基因上
游引物C1位于parC基因第88-108位碱基，下游引物C2与parC基因第538-556位碱基
互补，PCR扩增片 段位于parC基因第88-556位点，产物469bp：C1：5’-GCG TTG CCG TTT ATT GGT GAT-3’， C2：5’-GCA GGT TAT GCG GTG GAA T-3’；
③ PCR扩增方案
表1 gyrA和parC基因PCR扩增体系（50μl）
混匀稍离心后，置温度循环仪中，94℃预变性5min后，循环；94℃变性60s后，gyrA、parC分别在56℃和61℃退火45s，再于72℃延30s，共进行35个循环， 72℃延伸600s。循环结束后进行PCR产物琼脂糖凝胶检测。
[0013] ④ 扩增产物检测：制备1.5%琼脂糖凝胶（PCR 扩增产物片段不同浓度不同，片段越小，浓度越高），取5μl PCR产物与1μl溴酚兰载样缓冲液混合，加样于琼脂糖凝胶点样孔中，电压5V/cm进行电泳，电泳液为1× TBE，停止电泳后，取胶在读胶仪中观察结果并照相，标准为100bp DNA Ladder。
[0014] 2)gyrA基因的限制性酶切片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）分析：①限制性内切酶消化
核酸片段越小，检测的敏感性越高。对于大于400bp的PCR产物应提前用限制性内切
酶进行消化处理。gyrA基因扩增区域内有限制性内切酶hinfⅠ的两个识别位点（244thbp和343thbp），可将此段PCR产物消化成三条片段（221bp、99bp和328bp）：酶切体系为50µl，PCR产物：40µl，限制性内切酶缓冲液：4µl，限制性内切酶hinfⅠ6µl ，混匀并稍离心，置放于37℃水浴中2h ；酶切反应后，使用琼脂糖凝胶水平电泳检测酶切效果；
②酶切图谱分析：制备2%琼脂糖凝胶，取7μl上述PCR产物与1μl载样缓冲液混合，加样点样孔中，电压5V/cm进行电泳，电泳液为1× TBE。并在读胶仪上观察酶切图谱，照相。众多研究表明，gyrA第244位碱基突变使HinfⅠ在该处识别位点丧失，从而只产生两条酶切产物片段：320bp和328bp；
3)parC基因的单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析
①限制性内切酶消化：对于大于400bp的PCR产物需要用限制性内切酶消化PCR产物
进行处理，产生较小的DNA片段，再进行单链构象分析。parC基因扩增区域有限制性内切酶hinfⅠ的识别位点（279thbp），可将此段PCR产物消化成两条片段（191bp和278bp），消化方法同上；
②聚丙烯酰胺凝胶电泳：取3µl酶切样品与22µl变性上样液混合，进行8%聚丙烯酰
胺凝胶电泳，胶厚度1.0 mm，长82mm，电压8V/cm，恒压电泳4h。分子量标准100bp DNA Ladder；
③银染：电泳结束后，分开两块玻璃板，将凝胶片放入100 ml银染固定液中震荡
15min，三蒸水洗3次，每次2min，然后将凝胶片转入100ml 0.2 %的AgNO3液，用三蒸水洗
3次，每次30s，加入100ml显色液约7-10min，待DNA带显示清除时，吸去显色液，加入固定液Na2CO3，静置2-3min，取出凝胶观察。置于看片灯上观察结果并照相；
（2）采用基因测序的方法检测突变的基因位点，寻找喹诺酮药物靶基因gyrA、parC在LEV诱导下突变的时序规律；
1)核酸序列的测定：对实验室诱导株志贺菌原代的gyrA、parC基因PCR扩增产物进行测序，另挑选部分诱导菌株，对gyrA、parC基因PCR扩增产物进行测序。委托北京六合华大基因科技公司进行；
2)核酸序列的比对分析：在NCBI中通过BLST程序对所测序列结果和从GenBank检索
到的gyrA、parC基因标准序列进行比对分析。
核酸片段越小，检测的敏感性越高。对于大于400bp的PCR产物应提前用限制性内切
酶进行消化处理。gyrA基因扩增区域内有限制性内切酶hinfⅠ的两个识别位点（244thbp和343thbp），可将此段PCR产物消化成三条片段（221bp、99bp和328bp）：酶切体系为50µl，PCR产物：40µl，限制性内切酶缓冲液：4µl，限制性内切酶hinfⅠ6µl ，混匀并稍离心，置放于37℃水浴中2h ；酶切反应后，使用琼脂糖凝胶水平电泳检测酶切效果；
②酶切图谱分析：制备2%琼脂糖凝胶，取7μl上述PCR产物与1μl载样缓冲液混合，加样点样孔中，电压5V/cm进行电泳，电泳液为1× TBE。并在读胶仪上观察酶切图谱，照相。众多研究表明，gyrA第244位碱基突变使HinfⅠ在该处识别位点丧失，从而只产生两条酶切产物片段：320bp和328bp；
3)parC基因的单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析
①限制性内切酶消化：对于大于400bp的PCR产物需要用限制性内切酶消化PCR产物
进行处理，产生较小的DNA片段，再进行单链构象分析。parC基因扩增区域有限制性内切酶hinfⅠ的识别位点（279thbp），可将此段PCR产物消化成两条片段（191bp和278bp），消化方法同上；
②聚丙烯酰胺凝胶电泳：取3µl酶切样品与22µl变性上样液混合，进行8%聚丙烯酰
胺凝胶电泳，胶厚度1.0 mm，长82mm，电压8V/cm，恒压电泳4h。分子量标准100bp DNA Ladder；
③银染：电泳结束后，分开两块玻璃板，将凝胶片放入100 ml银染固定液中震荡
15min，三蒸水洗3次，每次2min，然后将凝胶片转入100ml 0.2 %的AgNO3液，用三蒸水洗
3次，每次30s，加入100ml显色液约7-10min，待DNA带显示清除时，吸去显色液，加入固定液Na2CO3，静置2-3min，取出凝胶观察。置于看片灯上观察结果并照相；
（2）采用基因测序的方法检测突变的基因位点，寻找喹诺酮药物靶基因gyrA、parC在LEV诱导下突变的时序规律；
1)核酸序列的测定：对实验室诱导株志贺菌原代的gyrA、parC基因PCR扩增产物进行测序，另挑选部分诱导菌株，对gyrA、parC基因PCR扩增产物进行测序。委托北京六合华大基因科技公司进行；
2)核酸序列的比对分析：在NCBI中通过BLST程序对所测序列结果和从GenBank检索
到的gyrA、parC基因标准序列进行比对分析。
[0015] 采用上述技术方案，本发明有如下优点：本发明首次用同一株志贺菌敏感株平行N组(N≥5)进行药物诱导直至耐药。本发明首次用同一株志贺菌平行建立N个(N≥5)诱导体系，来观察靶基因gyrA、parC突变的规律。N株敏感株经过专一喹诺酮药物诱导后不仅形成了对各代喹诺酮的高浓度耐药，提供了耐喹诺酮药物靶基因gyrA、parC突变时序一致性的证据，可以从突变时序的一致性和概率上来说明问题，可以排除自身随机突变。此外N个诱导体系还形成对与喹诺酮类药物结构和作用机制上都无关的其他几类抗菌药的多重耐药，提示诱导过程中产生交叉耐药。其应用为寻找喹诺酮药物靶基因突变时序的规律，利用这个模型确定在LEV诱导作用下喹诺酮药物靶基因位点突变时序，推断在人体或自然环境中志贺菌在外界LEV压力下喹诺酮药物靶基因位点突变时序。
[0016] 说明书附图图1 是实施例1gyrAPCR扩增片段（648bp）电泳图；
Lanes-strain：M-100bp DNA Ladder 1- S51573 2- Y2-15 3-Y2-42 4-Y5-15
5-Y5-42 6-Y7-15 6-Y7-42；
图2是实施例1 parC PCR扩增产物电泳结果（469bp）图；
Lanes-strain：M-100bp DNA Ladder 1- S51573 2- Y2-15
3-Y2-42 4-Y5-15 5-Y5-42 6-Y7-15 7-Y7-42；
图3是实施例1的gyrAPCR扩增片段hinfⅠ酶切图谱。
Lanes-strain：M-100bp DNA Ladder 1- S51573 2- Y2-15 3-Y2-42 4-Y5-15
5-Y5-42 6-Y7-15 6-Y7-42；
图2是实施例1 parC PCR扩增产物电泳结果（469bp）图；
Lanes-strain：M-100bp DNA Ladder 1- S51573 2- Y2-15
3-Y2-42 4-Y5-15 5-Y5-42 6-Y7-15 7-Y7-42；
图3是实施例1的gyrAPCR扩增片段hinfⅠ酶切图谱。
[0017] Lanes-strain：M-100bp DNA Ladder 1- Y2-28 2- Y2-423-Y2-48 4-Y5-32 5-Y5-40 6-Y7-41 7-Y7-53 8-S51573；
8为非突变株，产生三条酶切产物（99bp、221bp、328bp）（221bp和328bp重叠）；其余为突变株，产生两条酶切产物（320bp、328bp）；
图4 是实施例1的parCPCR扩增片段hinfⅠ酶切图谱；
parC PCR 产物hinfⅠ酶切后出现191bp和278bp片段 Lanes-strain：M-100bp
DNA Ladder 1- Y2-28 2- Y2-42 3-Y2-48 4-Y5-32 5-Y5-40 6-Y7-41 7-Y7-53
8-Y1-43；
图5是实施例1的 parC PCR-RFLP-SSCP分析：parC PCR-RFLP-SSCP分析显示多条单链带；1为非突变株；2，3，4，5，6，7，8为突变株，其单链带位置与余者不同（差距大于3毫米）。
Lanes-strain：M-MarkerⅠ1-Y2-3 2-Y2-39 3-Y2-43 4-Y3-59 5-Y5-60 6-Y7-51
7-Y7-60 8-Y3-54；
图6是实施例1中 BLAST中Y2-42gyrA和标准核酸序列比对图；
图7 是实施例1中BLAST中Y2-61parC和标准核酸序列比对图；
图8 是实施例1中Y2-43 gyrA83、87位改变图，注：丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（GAC）-87→甘氨酸（GGC）；
图9是实施例1中 Y5-40 gyrA87位改变图，注：天冬氨酸（GAC）-87→酪氨酸（TAC）；
图10是实施例1中Y5-59 gyrA177位改变， 注：甘氨酸（GGT）-177→天冬氨酸（GAT）；
图11 是实施例1中Y2-43 parC 80、84位改变， 注：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA）,谷氨酸（GAA）-84→天冬氨酸（GAC）；
图12 是实施例1中Y2-61 parC 183位改变，注：组氨酸（CAT）-183→天冬氨酸（AAT）。
8为非突变株，产生三条酶切产物（99bp、221bp、328bp）（221bp和328bp重叠）；其余为突变株，产生两条酶切产物（320bp、328bp）；
图4 是实施例1的parCPCR扩增片段hinfⅠ酶切图谱；
parC PCR 产物hinfⅠ酶切后出现191bp和278bp片段 Lanes-strain：M-100bp
DNA Ladder 1- Y2-28 2- Y2-42 3-Y2-48 4-Y5-32 5-Y5-40 6-Y7-41 7-Y7-53
8-Y1-43；
图5是实施例1的 parC PCR-RFLP-SSCP分析：parC PCR-RFLP-SSCP分析显示多条单链带；1为非突变株；2，3，4，5，6，7，8为突变株，其单链带位置与余者不同（差距大于3毫米）。
Lanes-strain：M-MarkerⅠ1-Y2-3 2-Y2-39 3-Y2-43 4-Y3-59 5-Y5-60 6-Y7-51
7-Y7-60 8-Y3-54；
图6是实施例1中 BLAST中Y2-42gyrA和标准核酸序列比对图；
图7 是实施例1中BLAST中Y2-61parC和标准核酸序列比对图；
图8 是实施例1中Y2-43 gyrA83、87位改变图，注：丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（GAC）-87→甘氨酸（GGC）；
图9是实施例1中 Y5-40 gyrA87位改变图，注：天冬氨酸（GAC）-87→酪氨酸（TAC）；
图10是实施例1中Y5-59 gyrA177位改变， 注：甘氨酸（GGT）-177→天冬氨酸（GAT）；
图11 是实施例1中Y2-43 parC 80、84位改变， 注：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA）,谷氨酸（GAA）-84→天冬氨酸（GAC）；
图12 是实施例1中Y2-61 parC 183位改变，注：组氨酸（CAT）-183→天冬氨酸（AAT）。
具体实施方式
[0018] (一) 菌株来源（1）本发明的志贺菌采用宋内志贺菌，宋内志贺菌名称为Shigella sonnei，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是：CGMCCNo:7632，保藏日期为：2013年5月20日, 保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所 邮编100101。
[0019] （2）药敏试验质控菌株大肠杆菌ATCC 25922购自河南省临床检验中心，S51573来自购自中国药品检定所。
[0020] (二)本发明实验中使用的培养基、抗生素配制及主要试剂⑴ LB培养基配制：LB液体培养基：称取1.0 g胰蛋白胨，0.5 g酵母浸粉，1.0 g氯化钠,溶于100 ml蒸馏水中，用10 mol/L NaOH调pH值至7.2，121℃高压灭菌20 min，置
4℃保存备用。
4℃保存备用。
[0021] LB固体培养基：称取1.0 g胰蛋白胨，0.5 g酵母浸粉，1.0 g氯化钠,1.5 g琼脂粉，溶于100 ml蒸馏水中，用10 mol/L NaOH调pH值至7.2，121℃高压灭菌20 min，冷却至约50℃时倾注平板备用。
[0022] （2）M-H固体培养基配制：称取4.2g M-H琼脂加热溶解于100ml蒸馏水中，120℃高压灭菌20min,待冷却至50℃，倾入无菌平皿中备用。
[0023] （3）左氧氟沙星抗生素原液(2560µg／ml，100ml)，抗生素粉剂质量按下式计算： 质量(mg)=溶剂(ml)×浓度(µg／ml)／分析效能(µg／mg)=100ml×2560µg／ml／9730／mg=26.31mg。采用万分之一分析天平精确称取26.31mg粉剂药物，溶于1／2容积灭三蒸水及0.1mol／L NaOH溶液中，用0.22µm滤膜过滤除菌，分装后置-80 ℃保存，6个月内用尽。
[0024] （4）主要试剂：头孢唑啉（CFZ）、头孢噻肟（CTX）、氨苄西林（AMP）、庆大霉素（GM）、氯霉素（C）、四环素（TE）、复方新诺明（SMZ/TMP）、萘啶酸（NAL）、吡哌酸（PI）、环丙沙星（CIP）、诺氟沙星（NOR）及左氧氟沙星（LEV）等12种抗生素均产自北京天坛药物生物技术开发公司。诱导药物左氧氟沙星购自中国药品生物制品检定所。PCR相关试剂: 包括PCR Mix和 DNA Marker 100bp Ladder均购自上海莱枫生物科技有限公司。培养基相关试剂：MH琼脂购自青岛高科技园海波生物技术有限公司，胰蛋白胨和酵母浸粉购自英国Oxoid公司。其他常用试剂均为国产分析纯级试剂。未作特别说明的实验材料与方法属于公知技术，在生物技术领域常用工具书，例如，分子克隆实验指南(J.萨姆布鲁克和D.W 拉塞尔著，第三版，科学出版社，2002)，中可查到。
[0025] 实施例1：左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立：1.对鉴定、保藏过的宋内志贺菌进行头孢唑啉、头孢噻肟、氨苄西林、庆大霉素、氯霉素、四环素、复方新诺明、萘啶酸、吡哌酸、环丙沙星、诺氟沙星及左氧氟沙星12 种抗生素的药敏试验，以质控菌株作为对照，用直尺测量包括药敏纸片在内抑菌环直径，以肉眼看不到细菌明显生长为限作为抑菌环的边缘，采用美国国立临床实验室标准委员会（National Committeefor Clinical Laboratory Standards,NCCLS）制定的指南，判断细菌敏感、中度敏感或耐药。通过对鉴定、保藏过的宋内志贺菌进行上述药敏试验验证其对12种抗菌药物均敏感，以该菌株作为实验用敏感株，将敏感株于LB平板上划线培养，挑取生长状态好的单菌落做诱导实验；2.用琼脂稀释法测定左氧氟沙星对实验诱导株原代的MIC0，其中标准控制菌采用大肠埃希菌ATCC 25922，参照1999 年美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)出版的《药敏试验实验标准》标准判读：左氧氟沙星（Levofloxacin, LEV） 敏感、中介、耐药标准依次为MIC（μg/ml）≤2、2～8、≥8，测得MIC0=0.125μg/ml；3.LEV溶解于0.lmol／L NaOH 溶液，用灭菌蒸馏水稀释至需要浓度的10 倍后，-20℃短暂保存，一个月内用完，使用前用LB 肉汤稀释至需要的诱导浓度；4.从实验诱导株的LB平板上挑取生长良好的单菌落至7管左氧氟沙星浓度为0.03125μg/ml的LB液体培养基中，37℃震荡培养细菌生长至对数中期OD600=0.9；5.取步骤（4）中一定量菌液至7管左氧氟沙星含量为0.03125μg/ml的LB液体培养基中再传一代，然后再取一定量菌液至左氧氟沙星浓度为0.0625μg/ml的LB液体培养基中传两代，在药物浓度达到左氧氟沙星敏感与中介临界值前，依次将左氧氟沙星浓度倍增培养细菌，当药物浓度达到左氧氟沙星敏感与中介临界值后依次将左氧氟沙星浓度递增培养，每次递增1μg/ml；6.当诱导抗菌药物浓度达到2、4、8µg/ml时，菌株在该浓度中诱导培养两天后，暂不诱导传代，先作4次无诱导剂传代培养后，再接种于含相同浓度诱导剂的LB固体培养基过夜培养，挑选生长良好的单菌落继续诱导培养，最终7组志贺菌诱导传代61代；7.用琼脂稀释法测定左氧氟沙星对实验诱导株各代的MIC，其中标准控制菌采用大肠埃希菌ATCC 25922，参照1999 年美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)出版的《药敏试验实验标准》标准判读：LEV 敏感、中介、耐药标准依次为MIC（μg/ml）≤2、2～8、≥8；
8.采用gyrA基因PCR-RFLP分析和parC基因PCR-RFLP-SSCP分析的方法对通过MIC
筛选出的诱导株进行检测；
1）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）扩增gyrA和parC基因：①模板DNA制备：煮沸法提取模板DNA：取增菌6小时到达对数生长期的LB增菌肉汤1ml于
1.5ml的Eppendorf管中，10000转/分离心1分，弃上清，加三蒸水100 μl，在震荡器上混匀煮沸10分钟，稍离心，则上清液即为PCR模板DNA，将提好的DNA标号后置 -20℃保存备用。②引物及引物设计：扩增目的基因片段所需引物参考福氏2a志贺菌株301 gyrA和parC基因公布序列，运用Primer5软件自行设计：gyrA基因引物：gyrA基因全长2628bp， QRDR区域在第166-410位点。gyrA基因上游引物A1位于gyrA基因第24-43位碱基，下游引物A2位于gyrA基因第652-671位，PCR扩增片段位于gyrA基因24-671位，产物648bp：
A1：5’-TAC ACC GGT CAA CAT TAA GG-3’，A2：5’-TTA ATG ATT GCC GCC GTC GG-3’， parC基因引物：parC基因全长2259bp， QRDR区域在第175-411位点。parC基因上游引物C1位于parC基因第88-108位碱基，下游引物C2与parC基因第538-556位碱基互补，PCR扩增片 段位于parC基因第88-556位点，产物469bp： C1：5’-GCG TTG CCG TTT ATT GGT GAT-3’，C2：5’-GCA GGT TAT GCG GTG GAA T-3’。③ PCR扩增方案 ：表1 gyrA和parC基因PCR扩增体系（50μl）
混匀稍离心后，置温度循环仪中，94℃预变性5min后，循环；94℃变性60s后，gyrA、parC分别在56℃和61℃退火45s，再于72℃延30s，共进行35个循环， 72℃延伸600s。
循环结束后进行PCR产物琼脂糖凝胶检测。④ 扩增产物检测：制备1.5%琼脂糖凝胶（PCR 扩增产物片段不同浓度不同，片段越小，浓度越高），取5μl PCR产物与1μl溴酚兰载样缓冲液混合，加样于琼脂糖凝胶点样孔中，电压5V/cm进行电泳，电泳液为1× TBE，停止电泳后，取胶在读胶仪中观察结果并照相，标准为100bp DNA Ladder。
8.采用gyrA基因PCR-RFLP分析和parC基因PCR-RFLP-SSCP分析的方法对通过MIC
筛选出的诱导株进行检测；
1）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）扩增gyrA和parC基因：①模板DNA制备：煮沸法提取模板DNA：取增菌6小时到达对数生长期的LB增菌肉汤1ml于
1.5ml的Eppendorf管中，10000转/分离心1分，弃上清，加三蒸水100 μl，在震荡器上混匀煮沸10分钟，稍离心，则上清液即为PCR模板DNA，将提好的DNA标号后置 -20℃保存备用。②引物及引物设计：扩增目的基因片段所需引物参考福氏2a志贺菌株301 gyrA和parC基因公布序列，运用Primer5软件自行设计：gyrA基因引物：gyrA基因全长2628bp， QRDR区域在第166-410位点。gyrA基因上游引物A1位于gyrA基因第24-43位碱基，下游引物A2位于gyrA基因第652-671位，PCR扩增片段位于gyrA基因24-671位，产物648bp：
A1：5’-TAC ACC GGT CAA CAT TAA GG-3’，A2：5’-TTA ATG ATT GCC GCC GTC GG-3’， parC基因引物：parC基因全长2259bp， QRDR区域在第175-411位点。parC基因上游引物C1位于parC基因第88-108位碱基，下游引物C2与parC基因第538-556位碱基互补，PCR扩增片 段位于parC基因第88-556位点，产物469bp： C1：5’-GCG TTG CCG TTT ATT GGT GAT-3’，C2：5’-GCA GGT TAT GCG GTG GAA T-3’。③ PCR扩增方案 ：表1 gyrA和parC基因PCR扩增体系（50μl）
混匀稍离心后，置温度循环仪中，94℃预变性5min后，循环；94℃变性60s后，gyrA、parC分别在56℃和61℃退火45s，再于72℃延30s，共进行35个循环， 72℃延伸600s。
循环结束后进行PCR产物琼脂糖凝胶检测。④ 扩增产物检测：制备1.5%琼脂糖凝胶（PCR 扩增产物片段不同浓度不同，片段越小，浓度越高），取5μl PCR产物与1μl溴酚兰载样缓冲液混合，加样于琼脂糖凝胶点样孔中，电压5V/cm进行电泳，电泳液为1× TBE，停止电泳后，取胶在读胶仪中观察结果并照相，标准为100bp DNA Ladder。
[0026] 2)gyrA基因的限制性酶切片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）分析：①限制性内切酶消化：核酸片段越小，检测的敏感性越高。对于大于400bp的PCR产物应提前用限制性内切酶进行消化处理。gyrA基因扩增区域内有限制性内切酶hinfⅠ的两个识别位点（244thbp和343thbp），可将此段PCR产物消化成三条片段（221bp、99bp和328bp）：酶切体系为50 µl，PCR产物40 µl，限制性内切酶缓冲液4 µl，限制性内切酶hinfⅠ6 µl，混匀并稍离心，置放于37℃水浴中2h 。酶切反应后，使用琼脂糖凝胶水平电泳检测酶切效果。②酶切图谱分析：制备2%琼脂糖凝胶，取7μl上述PCR产物与1μl载样缓冲液混合，加样点样孔中，电压5V/cm进行电泳，电泳液为1× TBE。并在读胶仪上观察酶切图谱，照相。众多研究表明，gyrA第244位碱基突变使HinfⅠ在该处识别位点丧失，从而只产生两条酶切产物片段：320bp和328bp。
[0027] 3)parC基因的单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析：①限制性内切酶消化：对于大于400bp的PCR产物需要用限制性内切酶消化PCR产物进行处理，产生较小的DNA片段，再进行单链构象分析。parC基因扩增区域有限制性内切酶hinfⅠ的识别位点（279thbp），可将此段PCR产物消化成两条片段（191bp和278bp），消化方法同上。②聚丙烯酰胺凝胶电泳：取3µl酶切样品与22µl变性上样液混合，进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，胶厚度1.0 mm，长82mm，电压8V/cm，恒压电泳4h。分子量标准100bp DNA Ladder。③银染：电泳结束后，分开两块玻璃板，将凝胶片放入100 ml银染固定液中震荡15min，三蒸水洗3次，每次2min，然后将凝胶片转入100ml 0.2 %的AgNO3液，用三蒸水洗3次，每次30s，加入100ml显色液约7-10min，待DNA带显示清除时，吸去显色液，加入固定液Na2CO3，静置2-3min，取出凝胶观察。置于看片灯上观察结果并照相。 [0028] （8）采用基因测序的方法检测突变的基因位点，寻找喹诺酮药物靶基因gyrA、parC突变的规律。
[0029] 1)核酸序列的测定：对实验室诱导株原代的gyrA、parC基因PCR扩增产物进行测序，另挑选部分诱导菌株，对gyrA、parC基因PCR扩增产物进行测序。委托北京六合华大基因科技公司进行。2)核酸序列的比对分析：在NCBI中通过BLAST程序对所测序列结果和从GenBank检索到的gyrA、parC基因标准序列进行比对分析。
[0030] 实验结果：实验诱导株平行诱导7次，分别标记为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7 。各诱导传代61 代，左氧氟沙星终浓度18μg/ml，左氧氟沙星对各组诱导株其中数代及最终的MIC 值见表2，随着诱导剂左氧氟沙星浓度的增大，左氧氟沙星对诱导菌株的MIC 可由0.125 μg/ml 最高上升至128 μg/ml～256 μg/ml，是原来的1024～2048 倍。
[0031] 表2 左氧氟沙星对各代菌株的MIC值运用左氧氟沙星次抑菌浓度作为起始浓度成功诱导并构建喹诺酮耐药志贺菌模型。7 株敏感株经过专一喹诺酮药物诱导后不仅形成了对各代喹诺酮的高浓度耐药，而且形成对与喹诺酮类药物结构和作用机制上都无关的其他几类抗菌药的多重耐药，结果见表3。
[0032] 表3 诱导耐药菌株对10种抗生素的MIC注：CFZ头孢唑啉、CTX头孢噻肟、AMP阿莫西林、GM庆大霉素、C氯霉素、TE四环素、SMZ复方新诺明、NOR诺氟沙星、CIP环丙沙星、LEV左氧氟沙星；各类药物右上方标记为各自对细菌的耐药MIC界值,其中1≥32µg/ml, 2≥64µg/ml, 3≥32µg/ml, 4≥8µg/ml,
5≥32µg/ml, 6≥16µg/ml, 7≥32µg/ml, 8≥8µg/ml, 9≥4µg/ml, 10≥8µg/m
Y1-Y7 经左氧氟沙星诱导得到的各代菌株全部分别扩增出648bp 和469bp 长度的片
段，分别是gyrA 基因、parC 基因PCR 扩增产物，结果见图1、2。gyrA PCR-RFLP 分析显示，对喹诺酮类药物未出现耐药的传代株均在酶切后出现221bp、99bp 和328bp 三条酶切产物片段；对喹诺酮类药物出现耐药的传代株的酶切图谱发生改变，产生两条300bp 左右的酶切片段见图3。8为非突变株，产生三条酶切产物（99bp、221bp、328bp）（221bp和328bp重叠）；其余为突变株，产生两条酶切产物（320bp、328bp）。parC PCR-RFLP 分析，见图4，喹诺酮敏感株出现一致单链构象。PCR-SSCP分析，见图5，耐药株中出现不同单链构象。
5≥32µg/ml, 6≥16µg/ml, 7≥32µg/ml, 8≥8µg/ml, 9≥4µg/ml, 10≥8µg/m
Y1-Y7 经左氧氟沙星诱导得到的各代菌株全部分别扩增出648bp 和469bp 长度的片
段，分别是gyrA 基因、parC 基因PCR 扩增产物，结果见图1、2。gyrA PCR-RFLP 分析显示，对喹诺酮类药物未出现耐药的传代株均在酶切后出现221bp、99bp 和328bp 三条酶切产物片段；对喹诺酮类药物出现耐药的传代株的酶切图谱发生改变，产生两条300bp 左右的酶切片段见图3。8为非突变株，产生三条酶切产物（99bp、221bp、328bp）（221bp和328bp重叠）；其余为突变株，产生两条酶切产物（320bp、328bp）。parC PCR-RFLP 分析，见图4，喹诺酮敏感株出现一致单链构象。PCR-SSCP分析，见图5，耐药株中出现不同单链构象。
[0033] 实验诱导株实验诱导株平行7 株（编号依次为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7）的gyrA、parC PCR 扩增产物测序，碱基序列与S51573 比对均相同。根据各代菌株PCR-RFLP-SSCP 分析的结果，挑选菌株进行测序，将gyrA、parC PCR扩增产物进行分析，在NCBI 中通过BLAST 程序对所测序列结果和从GenBank检索到的gyrA、parC 基因标准序列进行比对，比对结果如图6，7。图6为Y2-42gyrA 和标准核酸序列比对，第83、87 位碱基出现替换，丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（GAC）-87→甘氨酸（GGC）；图7为Y2-61parC和标准核酸序列比对，第80、84、183 位碱基出现替换，丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（ GAA）-84→天冬氨酸（GAC），天冬酰胺（CAT）-183→天冬氨酸（AAT）。比对情况在图中空缺部分可示。
[0034] 每一诱导体系均诱导传代61 代，各代诱导株均扩增出gyrA 和parC 基因。7个诱导体系的诱导过程随着诱导剂浓度的增加，各自体系在靶位突变位点上突变数量和涉及靶位酶数目上均表现出一致性，故以Y2 诱导体系为例详细叙述改变过程：在第28 代当左氧氟沙星终浓度为5 μg/ml，gyrA 第83 位氨基酸首先发生改变，左氧氟沙星对诱导株的MIC=8μg/ml。第28 代诱导株测序结果与原代序列进行比对，gyrA 基因发生丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG）改变；parC 进行PCR-RFLP-SSCP 分析，构象未发生改变，且parC 序列测序并未出现改变。在第33 代当左氧氟沙星终浓度为8 μg/ml，出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（ GAC）-87→甘氨酸（GGC）改变；parC 基因PCR-RFLP-SSCP 分析，构象发生改变，parC 基因碱基点突变为丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA）， 左氧氟沙星对诱导株的MIC=16μg/ml。在第43 代当左氧氟沙星终浓度为11 μg/ml，出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（ GAC）-87→甘氨酸（GGC）改变；parC PCR-RFLP-SSCP构象未发生改变，但parC 基因测序发现如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（GAA）-84→天冬氨酸（GAC）。左氧氟沙星对诱导株的MIC=32μg/ml。在第53 代当左氧氟沙星终浓度为16 μg/ml ，左氧氟沙星对诱导株的MIC=128μg/ml。出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（GAC）-87→甘氨酸（GGC），甘氨酸（GGT）-177→天冬氨酸（GAT）； parC基因如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（ GAA）-84→天冬氨酸（GAC）。在第61 代当左氧氟沙星终浓度为18 μg/ml ，左氧氟沙星对诱导株的MIC=256μg/ml。出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（GAC）-87→甘氨酸（GGC），甘氨酸（GGT）-177→天冬氨酸（GAT） 改变；parC 基因如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（ GAA）-84→天冬氨酸（GAC），天冬酰胺（ CAT）-183→天冬氨酸（AAT）。以上突变位点均在gyrA 和parC QRDR 区域内，见图8-12。诱导靶基因gyrA、parC 中氨基酸位点改变检测情况汇总见表4。
[0035] 表4 各代诱导菌株LEV的MIC值及靶位检测结果注：*为诱导剂浓度(µg/ml)；空白为未检测；“—”为检测但未改变
表4 各代诱导菌株LEV的MIC值及靶位检测结果（续上表）
注：*为诱导剂浓度(µg/ml)；空白为未检测；“—”为检测但未改变。
表4 各代诱导菌株LEV的MIC值及靶位检测结果（续上表）
注：*为诱导剂浓度(µg/ml)；空白为未检测；“—”为检测但未改变。
[0036] 综上，7 个实验室诱导体系均显示左氧氟沙星诱导过程先出现为gyrA 点突变，随着诱导液浓度增加，后出现parC 点突变，且突变位点的时序为：gyrA-83，gyrA-87，parC-80，parC-84，gyrA-177，parC-183位，随着点突变或多靶位酶突变，耐药程度不断提高。
[0037] 实施例2：左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立：方法步骤同实施例1，其中细菌固体培养基采用LB平板，细菌液体培养基采用LB液体培养，步骤（4）中32℃震荡培养细菌生长至对数期OD600=1。取步骤（4）中一定量菌液至5管左氧氟沙星含量为0.03125μg/ml的LB液体培养基中再传一代，然后再取一定量菌液至左氧氟沙星浓度为0.0625的LB液体培养基中传两代，在药物浓度达到左氧氟沙星敏感与中介临界值前，依次将左氧氟沙星浓度倍增培养细菌，当药物浓度达到左氧氟沙星敏感与中介临界值后依次将左氧氟沙星浓度递增培养，每次递增1μg/ml。当诱导抗菌药物浓度达到2、4、8µg/ml时，菌株在该浓度中诱导培养两天后，暂不诱导传代，先作2次无诱导剂传代培养后，再接种于含相同浓度诱导剂的LB固体平皿过夜培养。挑选生长良好的单菌落继续诱导培养，最终5组志贺菌诱导传代60代。采用gyrA基因PCR-RFLP分析和parC基因PCR-RFLP-SSCP分析的方法对通过MIC筛选出的诱导株进行检测。采用基因测序的方法检测突变的基因位点，寻找喹诺酮药物靶基因gyrA、parC突变的规律。
[0038] 实验结果：实验诱导株平行诱导5组，分别标记为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5。各诱导传代60代，左氧氟沙星终浓度17μg/ml，随着诱导剂左氧氟沙星浓度的增大，左氧氟沙星对诱导菌株的MIC 可由0.125 μg/ml 最高上升至128 μg/ml～256 μg/ml，是原来的1024～
2048 倍。运用左氧氟沙星次抑菌浓度作为起始浓度成功诱导并构建喹诺酮耐药志贺菌模型。5株敏感株经过专一喹诺酮药物诱导后不仅形成了对各代喹诺酮的高浓度耐药，而且形成对与喹诺酮类药物结构和作用机制上都无关的其他几类抗菌药的多重耐药。Y1-Y5 经左氧氟沙星诱导得到的各代菌株全部分别扩增出648bp 和469bp 长度的片段，分别是gyrA 基因、parC 基因PCR 扩增产物。gyrA PCR-RFLP 分析显示，对喹诺酮类药物未出现耐药的传代株均在酶切后出现221bp、99bp 和328bp 三条酶切产物片段；对喹诺酮类药物出现耐药的传代株的酶切图谱发生改变，产生两条300bp 左右的酶切片段。parC PCR-RFLP 分析,喹诺酮敏感株出现一致单链构象。PCR-SSCP分析耐药株中出现不同单链构象。
2048 倍。运用左氧氟沙星次抑菌浓度作为起始浓度成功诱导并构建喹诺酮耐药志贺菌模型。5株敏感株经过专一喹诺酮药物诱导后不仅形成了对各代喹诺酮的高浓度耐药，而且形成对与喹诺酮类药物结构和作用机制上都无关的其他几类抗菌药的多重耐药。Y1-Y5 经左氧氟沙星诱导得到的各代菌株全部分别扩增出648bp 和469bp 长度的片段，分别是gyrA 基因、parC 基因PCR 扩增产物。gyrA PCR-RFLP 分析显示，对喹诺酮类药物未出现耐药的传代株均在酶切后出现221bp、99bp 和328bp 三条酶切产物片段；对喹诺酮类药物出现耐药的传代株的酶切图谱发生改变，产生两条300bp 左右的酶切片段。parC PCR-RFLP 分析,喹诺酮敏感株出现一致单链构象。PCR-SSCP分析耐药株中出现不同单链构象。
[0039] 实验诱导株平行5 组（编号依次为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5）的gyrA、parC PCR 扩增产物测序，碱基序列与S51573 比对均相同。根据各代菌株PCR-RFLP-SSCP 分析的结果，挑选菌株进行测序，将gyrA、parC PCR扩增产物进行分析，在NCBI 中通过BLAST 程序对所测序列结果和从GenBank检索到的gyrA、parC 基因标准序列进行比对。每一诱导体系均诱导传代60 代，各代诱导株均扩增出gyrA 和parC 基因。5个诱导体系的诱导过程随着诱导剂浓度的增加，各自体系在靶位突变位点上突变数量和涉及靶位酶数目上均表现出一致性，故以Y3 诱导体系为例详细叙述改变过程：在第30代当左氧氟沙星终浓度为6 μg/ml，gyrA 第83 位氨基酸首先发生改变，左氧氟沙星对诱导株的MIC=8μg/ml。第30 代诱导株测序结果与原代序列进行比对，gyrA 基因发生丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG）改变；parC 进行PCR-RFLP-SSCP 分析，构象未发生改变，且parC 序列测序并未出现改变。在第34 代当左氧氟沙星终浓度为8 μg/ml，出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（ GAC）-87→甘氨酸（GGC）改变；parC 基因PCR-RFLP-SSCP 分析，构象发生改变，parC 基因碱基点突变为丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA）， 左氧氟沙星对诱导株的MIC=16μg/ml。在第44 代当左氧氟沙星终浓度为11 μg/ml，出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（ GAC）-87→甘氨酸（GGC）改变；parC PCR-RFLP-SSCP构象未发生改变，但parC 基因测序发现如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（GAA）-84→天冬氨酸（GAC）。左氧氟沙星对诱导株的MIC=32μg/ml。在第54 代当左氧氟沙星终浓度为16 μg/ml ，左氧氟沙星对诱导株的MIC=128μg/ml。出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（GAC）-87→甘氨酸（GGC），甘氨酸（GGT）-177→天冬氨酸（GAT）； parC基因如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（ GAA）-84→天冬氨酸（GAC）。在第60 代当左氧氟沙星终浓度为17 μg/ml ，左氧氟沙星对诱导株的MIC=256μg/ml。出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（GAC）-87→甘氨酸（GGC），甘氨酸（GGT）-177→天冬氨酸（GAT） 改变；parC 基因如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（ GAA）-84→天冬氨酸（GAC），天冬酰胺（ CAT）-183→天冬氨酸（AAT）。以上突变位点均在gyrA 和parC QRDR 区域内。 [0040] 综上，5 个实验室诱导体系均显示左氧氟沙星诱导过程先出现为gyrA 点突变，随着诱导液浓度增加，后出现parC 点突变，且突变位点的时序为：gyrA-83，gyrA-87，parC-80，parC-84，gyrA-177，parC-183位，随着点突变或多靶位酶突变，耐药程度不断提高。
[0041] 实施例3左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立：方法步骤同实施例1，其中细菌固体培养基采用LB平板，细菌液体培养基采用LB液体培养，步骤（4）中39℃震荡培养细菌生长至对数期OD600=0.6。取步骤（4）中一定量菌液至10管左氧氟沙星含量为0.03125μg/ml的LB液体培养基中再传一代，然后再取一定量菌液至左氧氟沙星浓度为0.0625的LB液体培养基中传两代，在药物浓度达到左氧氟沙星敏感与中介临界值前，依次将左氧氟沙星浓度倍增培养细菌，当药物浓度达到左氧氟沙星敏感与中介临界值后依次将左氧氟沙星浓度递增培养，每次递增1μg/ml。当诱导抗菌药物浓度达到2、4、8µg/ml时，菌株在该浓度中诱导培养两天后，暂不诱导传代，先作3次无诱导剂传代培养后，再接种于含相同浓度诱导剂的LB固体平皿过夜培养。挑选生长良好的单菌落继续诱导培养，最终10组志贺菌诱导传代59代。采用gyrA基因PCR-RFLP分析和parC基因PCR-RFLP-SSCP分析的方法对通过MIC筛选出的诱导株进行检测。采用基因测序的方法检测突变的基因位点，寻找喹诺酮药物靶基因gyrA、parC突变的规律。
[0042] 实验结果：实验诱导株平行诱导10组，分别标记为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10。各诱导传代59代，左氧氟沙星终浓度17μg/ml，随着诱导剂左氧氟沙星浓度的增大，左氧氟沙星对诱导菌株的MIC 可由0.125 μg/ml 最高上升至128 μg/ml～256 μg/ml，是原来的1024～2048 倍。
[0043] 运用左氧氟沙星次抑菌浓度作为起始浓度成功诱导并构建喹诺酮耐药志贺菌模型。10株敏感株经过专一喹诺酮药物诱导后不仅形成了对各代喹诺酮的高浓度耐药，而且形成对与喹诺酮类药物结构和作用机制上都无关的其他几类抗菌药的多重耐药。
[0044] Y1-Y10 经左氧氟沙星诱导得到的各代菌株全部分别扩增出648bp 和469bp 长度的片段，分别是gyrA 基因、parC 基因PCR 扩增产物。gyrA PCR-RFLP 分析显示，对喹诺酮类药物未出现耐药的传代株均在酶切后出现221bp、99bp 和328bp 三条酶切产物片段；对喹诺酮类药物出现耐药的传代株的酶切图谱发生改变，产生两条300bp 左右的酶切片段。parC PCR-RFLP 分析,喹诺酮敏感株出现一致单链构象。PCR-SSCP分析耐药株中出现不同单链构象。
[0045] 实验诱导株平行10 组（编号依次为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10）的gyrA、parC PCR 扩增产物测序，碱基序列与S51573 比对均相同。根据各代菌株PCR-RFLP-SSCP 分析的结果，挑选菌株进行测序，将gyrA、parC PCR扩增产物进行分析，在NCBI 中通过BLAST 程序对所测序列结果和从GenBank检索到的gyrA、parC 基因标准序列进行比对。每一诱导体系均诱导传代59 代，各代诱导株均扩增出gyrA 和parC 基因。10个诱导体系的诱导过程随着诱导剂浓度的增加，各自体系在靶位突变位点上突变数量和涉及靶位酶数目上均表现出一致性，故以Y5 诱导体系为例详细叙述改变过程：在第29代当左氧氟沙星终浓度为6 μg/ml，gyrA 第83 位氨基酸首先发生改变，左氧氟沙星对诱导株的MIC=8μg/ml。第29 代诱导株测序结果与原代序列进行比对，gyrA 基因发生丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG）改变；parC 进行PCR-RFLP-SSCP 分析，构象未发生改变，且parC 序列测序并未出现改变。在第32 代当左氧氟沙星终浓度为7 μg/ml，出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（ GAC）-87→甘氨酸（GGC）改变；parC 基因PCR-RFLP-SSCP 分析，构象发生改变，parC 基因碱基点突变为丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA）， 左氧氟沙星对诱导株的MIC=8μg/ml。在第41 代当左氧氟沙星终浓度为10 μg/ml，出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（ GAC）-87→甘氨酸（GGC）改变；parC PCR-RFLP-SSCP构象未发生改变，但parC 基因测序发现如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（GAA）-84→天冬氨酸（GAC）。左氧氟沙星对诱导株的MIC=16μg/ml。在第52 代当左氧氟沙星终浓度为15 μg/ml ，左氧氟沙星对诱导株的MIC=128μg/ml。出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（GAC）-87→甘氨酸（GGC），甘氨酸（GGT）-177→天冬氨酸（GAT）； parC基因如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（ GAA）-84→天冬氨酸（GAC）。在第59 代当左氧氟沙星终浓度为17 μg/ml ，左氧氟沙星对诱导株的MIC=256μg/ml。出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（GAC）-87→甘氨酸（GGC），甘氨酸（GGT）-177→天冬氨酸（GAT） 改变；parC 基因如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（ GAA）-84→天冬氨酸（GAC），天冬酰胺（ CAT）-183→天冬氨酸（AAT）。以上突变位点均在gyrA 和parC QRDR 区域内。 [0046] 综上，10 个实验室诱导体系均显示左氧氟沙星诱导过程先出现为gyrA 点突变，随着诱导液浓度增加，后出现parC 点突变，且突变位点的时序为：gyrA-83，gyrA-87，parC-80，parC-84，gyrA-177，parC-183位，随着点突变或多靶位酶突变，耐药程度不断提高。
[0047] 实施例4：左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立：方法步骤同实施例1，其中细菌固体培养基采用LB平板，细菌液体培养基采用LB液体培养，步骤（4）中33℃震荡培养细菌生长至对数期OD600=0.7。取步骤（4）中一定量菌液至15管左氧氟沙星含量为0.03125μg/ml的LB液体培养基中再传一代，然后再取一定量菌液至左氧氟沙星浓度为0.0625的LB液体培养基中传两代，在药物浓度达到左氧氟沙星敏感与中介临界值前，依次将左氧氟沙星浓度倍增培养细菌，当药物浓度达到左氧氟沙星敏感与中介临界值后依次将左氧氟沙星浓度递增培养，每次递增1μg/ml。当诱导抗菌药物浓度达到2、4、8µg/ml时，菌株在该浓度中诱导培养两天后，暂不诱导传代，先作5次无诱导剂传代培养后，再接种于含相同浓度诱导剂的LB固体平皿过夜培养。挑选生长良好的单菌落继续诱导培养，最终15组志贺菌诱导传代62代。采用gyrA基因PCR-RFLP分析和parC基因PCR-RFLP-SSCP分析的方法对通过MIC筛选出的诱导株进行检测。采用基因测序的方法检测突变的基因位点，寻找喹诺酮药物靶基因gyrA、parC突变的规律。
[0048] 实验结果：实验诱导株平行诱导15组，分别标记为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11、Y12、Y13、Y14、Y15。各诱导传代62代，左氧氟沙星终浓度18μg/ml，随着诱导剂左氧氟沙星浓度的增大，左氧氟沙星对诱导菌株的MIC 可由0.125 μg/ml 最高上升至128 μg/ml～256 μg/ml，是原来的1024～2048 倍。
[0049] 运用左氧氟沙星次抑菌浓度作为起始浓度成功诱导并构建喹诺酮耐药志贺菌模型。15株敏感株经过专一喹诺酮药物诱导后不仅形成了对各代喹诺酮的高浓度耐药，而且形成对与喹诺酮类药物结构和作用机制上都无关的其他几类抗菌药的多重耐药。
[0050] Y1-Y15 经左氧氟沙星诱导得到的各代菌株全部分别扩增出648bp 和469bp 长度的片段，分别是gyrA 基因、parC 基因PCR 扩增产物。gyrA PCR-RFLP 分析显示，对喹诺酮类药物未出现耐药的传代株均在酶切后出现221bp、99bp 和328bp 三条酶切产物片段；对喹诺酮类药物出现耐药的传代株的酶切图谱发生改变，产生两条300bp 左右的酶切片段。parC PCR-RFLP 分析,喹诺酮敏感株出现一致单链构象。PCR-SSCP分析耐药株中出现不同单链构象。
[0051] 实验诱导平行15组（编号依次为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11、Y12、Y13、Y14、Y15）的gyrA、parC PCR 扩增产物测序，碱基序列与S51573 比对均相同。根据各代菌株PCR-RFLP-SSCP 分析的结果，挑选菌株进行测序，将gyrA、parC PCR扩增产物进行分析，在NCBI 中通过BLAST 程序对所测序列结果和从GenBank检索到的gyrA、parC 基因标准序列进行比对。每一诱导体系均诱导传代62 代，各代诱导株均扩增出gyrA 和parC 基因。15个诱导体系的诱导过程随着诱导剂浓度的增加，各自体系在靶位突变位点上突变数量和涉及靶位酶数目上均表现出一致性，故以Y10 诱导体系为例详细叙述改变过程：在第29代当左氧氟沙星终浓度为6 μg/ml，gyrA 第83 位氨基酸首先发生改变，左氧氟沙星对诱导株的MIC=8μg/ml。第29 代诱导株测序结果与原代序列进行比对，gyrA 基因发生丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG）改变；parC 进行PCR-RFLP-SSCP 分析，构象未发生改变，且parC 序列测序并未出现改变。在第34 代当左氧氟沙星终浓度为8 μg/ml，出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（ GAC）-87→甘氨酸（GGC）改变；parC 基因PCR-RFLP-SSCP 分析，构象发生改变，parC 基因碱基点突变为丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA）， 左氧氟沙星对诱导株的MIC=8μg/ml。在第39 代当左氧氟沙星终浓度为9 μg/ml，出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（ GAC）-87→甘氨酸（GGC）改变；parC PCR-RFLP-SSCP构象未发生改变，但parC 基因测序发现如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（GAA）-84→天冬氨酸（GAC）。左氧氟沙星对诱导株的MIC=16μg/ml。在第53 代当左氧氟沙星终浓度为16 μg/ml ，左氧氟沙星对诱导株的MIC=128μg/ml。出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（GAC）-87→甘氨酸（GGC），甘氨酸（GGT）-177→天冬氨酸（GAT）； parC基因如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（ GAA）-84→天冬氨酸（GAC）。在第62 代当左氧氟沙星终浓度为18 μg/ml ，左氧氟沙星对诱导株的MIC=256μg/ml。出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（GAC）-87→甘氨酸（GGC），甘氨酸（GGT）-177→天冬氨酸（GAT） 改变；parC 基因如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（ GAA）-84→天冬氨酸（GAC），天冬酰胺（ CAT）-183→天冬氨酸（AAT）。以上突变位点均在gyrA 和parC QRDR 区域内。
[0052] 综上，15 个实验室诱导体系均显示左氧氟沙星诱导过程先出现为gyrA 点突变，随着诱导液浓度增加，后出现parC 点突变，且突变位点的时序为：gyrA-83，gyrA-87，parC-80，parC-84，gyrA-177，parC-183位，随着点突变或多靶位酶突变，耐药程度不断提高。
[0053] 实施例5：左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立：方法步骤同实施例1，其中细菌固体培养基采用LB平板，细菌液体培养基采用LB液体培养，步骤（4）中34℃震荡培养细菌生长至对数期OD600=0.7。取步骤（4）中一定量菌液至20管左氧氟沙星含量为0.03125μg/ml的LB液体培养基中再传一代，然后再取一定量菌液至左氧氟沙星浓度为0.0625的LB液体培养基中传两代，在药物浓度达到左氧氟沙星敏感与中介临界值前，依次将左氧氟沙星浓度倍增培养细菌，当药物浓度达到左氧氟沙星敏感与中介临界值后依次将左氧氟沙星浓度递增培养，每次递增1μg/ml。当诱导抗菌药物浓度达到2、4、8µg/ml时，菌株在该浓度中诱导培养两天后，暂不诱导传代，先作6次无诱导剂传代培养后，再接种于含相同浓度诱导剂的LB固体平皿过夜培养。挑选生长良好的单菌落继续诱导培养，最终20组志贺菌诱导传代63代。采用gyrA基因PCR-RFLP分析和parC基因PCR-RFLP-SSCP分析的方法对通过MIC筛选出的诱导株进行检测。采用基因测序的方法检测突变的基因位点，寻找喹诺酮药物靶基因gyrA、parC突变的规律。
[0054] 实验结果：实验诱导株平行诱导20组，分别标记为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11、Y12、Y13、Y14、Y15、Y16、Y17、Y18、Y19、Y20。各诱导传代63代，左氧氟沙星终浓度19μg/ml，随着诱导剂左氧氟沙星浓度的增大，左氧氟沙星对诱导菌株的MIC 可由0.125 μg/ml 最高上升至128 μg/ml～256 μg/ml，是原来的1024～2048 倍。
[0055] 运用左氧氟沙星次抑菌浓度作为起始浓度成功诱导并构建喹诺酮耐药志贺菌模型。20株敏感株经过专一喹诺酮药物诱导后不仅形成了对各代喹诺酮的高浓度耐药，而且形成对与喹诺酮类药物结构和作用机制上都无关的其他几类抗菌药的多重耐药。
[0056] Y1-Y20 经左氧氟沙星诱导得到的各代菌株全部分别扩增出648bp 和469bp 长度的片段，分别是gyrA 基因、parC 基因PCR 扩增产物。gyrA PCR-RFLP 分析显示，对喹诺酮类药物未出现耐药的传代株均在酶切后出现221bp、99bp 和328bp 三条酶切产物片段；对喹诺酮类药物出现耐药的传代株的酶切图谱发生改变，产生两条300bp 左右的酶切片段。parC PCR-RFLP 分析,喹诺酮敏感株出现一致单链构象。PCR-SSCP分析耐药株中出现不同单链构象。
[0057] 实验诱导株平行20组（编号依次为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11、Y12、Y13、Y14、Y15、Y16、Y17、Y18、Y19、Y20）的gyrA、parC PCR 扩增产物测序，碱基序列与S51573 比对均相同。根据各代菌株PCR-RFLP-SSCP 分析的结果，挑选菌株进行测序，将gyrA、parC PCR扩增产物进行分析，在NCBI 中通过BLAST 程序对所测序列结果和从GenBank检索到的gyrA、parC 基因标准序列进行比对。每一诱导体系均诱导传代63 代，各代诱导株均扩增出gyrA 和parC 基因。20个诱导体系的诱导过程随着诱导剂浓度的增加，各自体系在靶位突变位点上突变数量和涉及靶位酶数目上均表现出一致性，故以Y15 诱导体系为例详细叙述改变过程：在第33代当左氧氟沙星终浓度为8 μg/ml，gyrA 第83 位氨基酸首先发生改变，左氧氟沙星对诱导株的MIC=8μg/ml。第33代诱导株测序结果与原代序列进行比对，gyrA 基因发生丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG）改变；parC 进行PCR-RFLP-SSCP 分析，构象未发生改变，且parC 序列测序并未出现改变。在第43 代当左氧氟沙星终浓度为11 μg/ml，出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（ GAC）-87→甘氨酸（GGC）改变；parC 基因PCR-RFLP-SSCP 分析，构象发生改变，parC 基因碱基点突变为丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA）， 左氧氟沙星对诱导株的MIC=32μg/ml。在第54 代当左氧氟沙星终浓度为16 μg/ml，出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（ GAC）-87→甘氨酸（GGC）改变；parC PCR-RFLP-SSCP构象未发生改变，但parC 基因测序发现如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（GAA）-84→天冬氨酸（GAC）。
左氧氟沙星对诱导株的MIC=128μg/ml。在第59 代当左氧氟沙星终浓度为17 μg/ml ，左氧氟沙星对诱导株的MIC=256μg/ml。出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（GAC）-87→甘氨酸（GGC），甘氨酸（GGT）-177→天冬氨酸（GAT）； parC基因如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（ GAA）-84→天冬氨酸（GAC）。在第61 代当左氧氟沙星终浓度为18 μg/ml ，左氧氟沙星对诱导株的MIC=256μg/ml。出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（GAC）-87→甘氨酸（GGC），甘氨酸（GGT）-177→天冬氨酸（GAT） 改变；parC 基因如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（GAA）-84→天冬氨酸（GAC），天冬酰胺（CAT）-183→天冬氨酸（AAT）。以上突变位点均在gyrA 和parC QRDR 区域内。
左氧氟沙星对诱导株的MIC=128μg/ml。在第59 代当左氧氟沙星终浓度为17 μg/ml ，左氧氟沙星对诱导株的MIC=256μg/ml。出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（GAC）-87→甘氨酸（GGC），甘氨酸（GGT）-177→天冬氨酸（GAT）； parC基因如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（ GAA）-84→天冬氨酸（GAC）。在第61 代当左氧氟沙星终浓度为18 μg/ml ，左氧氟沙星对诱导株的MIC=256μg/ml。出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（GAC）-87→甘氨酸（GGC），甘氨酸（GGT）-177→天冬氨酸（GAT） 改变；parC 基因如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（GAA）-84→天冬氨酸（GAC），天冬酰胺（CAT）-183→天冬氨酸（AAT）。以上突变位点均在gyrA 和parC QRDR 区域内。
[0058] 综上，20 个实验室诱导体系均显示左氧氟沙星诱导过程先出现为gyrA 点突变，随着诱导液浓度增加，后出现parC 点突变，且突变位点的时序为：gyrA-83，gyrA-87，parC-80，parC-84，gyrA-177，parC-183位，随着点突变或多靶位酶突变，耐药程度不断提高。
[0059] 实施例6：左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立：方法步骤同实施例1，其中细菌固体培养基采用LB平板，细菌液体培养基采用LB液体培养，步骤（4）中35℃震荡培养细菌生长至对数期OD600=0.8。取步骤（4）中一定量菌液至25管左氧氟沙星含量为0.03125μg/ml的LB液体培养基中再传一代，然后再取一定量菌液至左氧氟沙星浓度为0.0625的LB液体培养基中传两代，在药物浓度达到左氧氟沙星敏感与中介临界值前，依次将左氧氟沙星浓度倍增培养细菌，当药物浓度达到左氧氟沙星敏感与中介临界值后依次将左氧氟沙星浓度递增培养，每次递增1μg/ml。当诱导抗菌药物浓度达到2、4、8µg/ml时，菌株在该浓度中诱导培养两天后，暂不诱导传代，先作7次无诱导剂传代培养后，再接种于含相同浓度诱导剂的LB固体平皿过夜培养。挑选生长良好的单菌落继续诱导培养，最终25组志贺菌诱导传代64代。采用gyrA基因PCR-RFLP分析和parC基因PCR-RFLP-SSCP分析的方法对通过MIC筛选出的诱导株进行检测。采用基因测序的方法检测突变的基因位点，寻找喹诺酮药物靶基因gyrA、parC突变的规律。
[0060] 实验结果：实验诱导株平行诱导25组，分别标记为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11、Y12、Y13、Y14、Y15、Y16、Y17、Y18、Y19、Y20、Y21、Y22、Y23、Y24、Y25。各诱导传代64代，左氧氟沙星终浓度19μg/ml，随着诱导剂左氧氟沙星浓度的增大，左氧氟沙星对诱导菌株的MIC 可由0.125 μg/ml 最高上升至128 μg/ml～256 μg/ml，是原来的1024～2048 倍。
[0061] 运用左氧氟沙星次抑菌浓度作为起始浓度成功诱导并构建喹诺酮耐药志贺菌模型。25株敏感株经过专一喹诺酮药物诱导后不仅形成了对各代喹诺酮的高浓度耐药，而且形成对与喹诺酮类药物结构和作用机制上都无关的其他几类抗菌药的多重耐药。
[0062] Y1-Y25 经左氧氟沙星诱导得到的各代菌株全部分别扩增出648bp 和469bp 长度的片段，分别是gyrA 基因、parC 基因PCR 扩增产物。gyrA PCR-RFLP 分析显示，对喹诺酮类药物未出现耐药的传代株均在酶切后出现221bp、99bp 和328bp 三条酶切产物片段；对喹诺酮类药物出现耐药的传代株的酶切图谱发生改变，产生两条300bp 左右的酶切片段。parC PCR-RFLP 分析,喹诺酮敏感株出现一致单链构象。PCR-SSCP分析耐药株中出现不同单链构象。
[0063] 实验诱导株平行25组（编号依次为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11、Y12、Y13、Y14、Y15、Y16、Y17、Y18、Y19、Y20、Y21、Y22、Y23、Y24、Y25）的gyrA、parC PCR 扩增产物测序，碱基序列与S51573 比对均相同。根据各代菌株PCR-RFLP-SSCP 分析的结果，挑选菌株进行测序，将gyrA、parC PCR扩增产物进行分析，在NCBI 中通过BLAST 程序对所测序列结果和从GenBank检索到的gyrA、parC 基因标准序列进行比对。每一诱导体系均诱导传代64 代，各代诱导株均扩增出gyrA 和parC 基因。25个诱导体系的诱导过程随着诱导剂浓度的增加，各自体系在靶位突变位点上突变数量和涉及靶位酶数目上均表现出一致性，故以Y20 诱导体系为例详细叙述改变过程：在第28代当左氧氟沙星终浓度为5μg/ml，gyrA 第83 位氨基酸首先发生改变，左氧氟沙星对诱导株的MIC=4μg/ml。第28代诱导株测序结果与原代序列进行比对，gyrA 基因发生丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG）改变；parC 进行PCR-RFLP-SSCP 分析，构象未发生改变，且parC 序列测序并未出现改变。在第40 代当左氧氟沙星终浓度为9 μg/ml，出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（ GAC）-87→甘氨酸（GGC）改变；parC 基因PCR-RFLP-SSCP 分析，构象发生改变，parC 基因碱基点突变为丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA）， 左氧氟沙星对诱导株的MIC=16μg/ml。在第48 代当左氧氟沙星终浓度为13 μg/ml，出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（ GAC）-87→甘氨酸（GGC）改变；parC PCR-RFLP-SSCP构象未发生改变，但parC 基因测序发现如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（GAA）-84→天冬氨酸（GAC）。左氧氟沙星对诱导株的MIC=64μg/ml。在第54代当左氧氟沙星终浓度为16 μg/ml ，左氧氟沙星对诱导株的MIC=128μg/ml。出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（GAC）-87→甘氨酸（GGC），甘氨酸（GGT）-177→天冬氨酸（GAT）； parC基因如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（ GAA）-84→天冬氨酸（GAC）。在第64 代当左氧氟沙星终浓度为19 μg/ml ，左氧氟沙星对诱导株的MIC=256μg/ml。出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（GAC）-87→甘氨酸（GGC），甘氨酸（GGT）-177→天冬氨酸（GAT） 改变；parC 基因如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（GAA）-84→天冬氨酸（GAC），天冬酰胺（CAT）-183→天冬氨酸（AAT）。以上突变位点均在gyrA 和parC QRDR 区域内。
[0064] 综上，25 个实验室诱导体系均显示左氧氟沙星诱导过程先出现为gyrA 点突变，随着诱导液浓度增加，后出现parC 点突变，且突变位点的时序为：gyrA-83，gyrA-87，parC-80，parC-84，gyrA-177，parC-183位，随着点突变或多靶位酶突变，耐药程度不断提高。
[0065] 实施例7：左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立：方法步骤同实施例1，其中细菌固体培养基采用LB平板，细菌液体培养基采用LB液体培养，步骤（4）中36℃震荡培养细菌生长至对数期OD600=0.8。取步骤（4）中一定量菌液至30管左氧氟沙星含量为0.03125μg/ml的LB液体培养基中再传一代，然后再取一定量菌液至左氧氟沙星浓度为0.0625的LB液体培养基中传两代，在药物浓度达到左氧氟沙星敏感与中介临界值前，依次将左氧氟沙星浓度倍增培养细菌，当药物浓度达到左氧氟沙星敏感与中介临界值后依次将左氧氟沙星浓度递增培养，每次递增1μg/ml。当诱导抗菌药物浓度达到2、4、8µg/ml时，菌株在该浓度中诱导培养两天后，暂不诱导传代，先作8次无诱导剂传代培养后，再接种于含相同浓度诱导剂的LB固体平皿过夜培养。挑选生长良好的单菌落继续诱导培养，最终30组志贺菌诱导传代64代。采用gyrA基因PCR-RFLP分析和parC基因PCR-RFLP-SSCP分析的方法对通过MIC筛选出的诱导株进行检测。采用基因测序的方法检测突变的基因位点，寻找喹诺酮药物靶基因gyrA、parC突变的规律。
[0066] 实验结果：实验诱导株平行诱导30组，分别标记为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11、Y12、Y13、Y14、Y15、Y16、Y17、Y18、Y19、Y20、Y21、Y22、Y23、Y24、Y25、Y26、Y27、Y28、Y29、Y30。各诱导传代65代，左氧氟沙星终浓度20μg/ml，随着诱导剂左氧氟沙星浓度的增大，左氧氟沙星对诱导菌株的MIC 可由0.125 μg/ml 最高上升至128 μg/ml～256 μg/ml，是原来的1024～2048 倍。
[0067] 运用左氧氟沙星次抑菌浓度作为起始浓度成功诱导并构建喹诺酮耐药志贺菌模型。30株敏感株经过专一喹诺酮药物诱导后不仅形成了对各代喹诺酮的高浓度耐药，而且形成对与喹诺酮类药物结构和作用机制上都无关的其他几类抗菌药的多重耐药。
[0068] Y1-Y30 经左氧氟沙星诱导得到的各代菌株全部分别扩增出648bp 和469bp 长度的片段，分别是gyrA 基因、parC 基因PCR 扩增产物。gyrA PCR-RFLP 分析显示，对喹诺酮类药物未出现耐药的传代株均在酶切后出现221bp、99bp 和328bp 三条酶切产物片段；对喹诺酮类药物出现耐药的传代株的酶切图谱发生改变，产生两条300bp 左右的酶切片段。parC PCR-RFLP 分析,喹诺酮敏感株出现一致单链构象。PCR-SSCP分析耐药株中出现不同单链构象。
[0069] 实验诱导株平行30组（编号依次为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11、Y12、Y13、Y14、Y15、Y16、Y17、Y18、Y19、Y20、Y21、Y22、Y23、Y24、Y25、Y26、Y27、Y28、Y29、Y30）的gyrA、parC PCR 扩增产物测序，碱基序列与S51573 比对均相同。根据各代菌株PCR-RFLP-SSCP 分析的结果，挑选菌株进行测序，将gyrA、parC PCR扩增产物进行分析，在NCBI 中通过BLAST 程序对所测序列结果和从GenBank检索到的gyrA、parC 基因标准序列进行比对。每一诱导体系均诱导传代65 代，各代诱导株均扩增出gyrA 和parC 基因。30个诱导体系的诱导过程随着诱导剂浓度的增加，各自体系在靶位突变位点上突变数量和涉及靶位酶数目上均表现出一致性，故以Y25 诱导体系为例详细叙述改变过程：在第30代当左氧氟沙星终浓度为6μg/ml，gyrA 第83 位氨基酸首先发生改变，左氧氟沙星对诱导株的MIC=4μg/ml。第30代诱导株测序结果与原代序列进行比对，gyrA 基因发生丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG）改变；parC 进行PCR-RFLP-SSCP 分析，构象未发生改变，且parC 序列测序并未出现改变。在第41 代当左氧氟沙星终浓度为10 μg/ml，出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（ GAC）-87→甘氨酸（GGC）改变；parC 基因PCR-RFLP-SSCP 分析，构象发生改变，parC 基因碱基点突变为丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA）， 左氧氟沙星对诱导株的MIC=16μg/ml。在第52 代当左氧氟沙星终浓度为15 μg/ml，出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（ GAC）-87→甘氨酸（GGC）改变；parC PCR-RFLP-SSCP构象未发生改变，但parC 基因测序发现如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（GAA）-84→天冬氨酸（GAC）。左氧氟沙星对诱导株的MIC=64μg/ml。在第54代当左氧氟沙星终浓度为16 μg/ml ，左氧氟沙星对诱导株的MIC=128μg/ml。出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（GAC）-87→甘氨酸（GGC），甘氨酸（GGT）-177→天冬氨酸（GAT）； parC基因如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（ GAA）-84→天冬氨酸（GAC）。在第62 代当左氧氟沙星终浓度为18 μg/ml ，左氧氟沙星对诱导株的MIC=256μg/ml。出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（GAC）-87→甘氨酸（GGC），甘氨酸（GGT）-177→天冬氨酸（GAT） 改变；parC 基因如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（GAA）-84→天冬氨酸（GAC），天冬酰胺（CAT）-183→天冬氨酸（AAT）。以上突变位点均在gyrA 和parC QRDR 区域内。
[0070] 综上，30 个实验室诱导体系均显示左氧氟沙星诱导过程先出现为gyrA 点突变，随着诱导液浓度增加，后出现parC 点突变，且突变位点的时序为：gyrA-83，gyrA-87，parC-80，parC-84，gyrA-177，parC-183位，随着点突变或多靶位酶突变，耐药程度不断提高。
[0071] 实施例8：左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立：方法步骤同实施例1，其中细菌固体培养基采用LB平板，细菌液体培养基采用LB液体培养，步骤（4）中38℃震荡培养细菌生长至对数期OD600=0.9。取步骤（4）中一定量菌液至35管左氧氟沙星含量为0.03125μg/ml的LB液体培养基中再传一代，然后再取一定量菌液至左氧氟沙星浓度为0.0625的LB液体培养基中传两代，在药物浓度达到左氧氟沙星敏感与中介临界值前，依次将左氧氟沙星浓度倍增培养细菌，当药物浓度达到左氧氟沙星敏感与中介临界值后依次将左氧氟沙星浓度递增培养，每次递增1μg/ml。当诱导抗菌药物浓度达到2、4、8µg/ml时，菌株在该浓度中诱导培养两天后，暂不诱导传代，先作9次无诱导剂传代培养后，再接种于含相同浓度诱导剂的LB固体平皿过夜培养。挑选生长良好的单菌落继续诱导培养，最终35组志贺菌诱导传代66代。采用gyrA基因PCR-RFLP分析和parC基因PCR-RFLP-SSCP分析的方法对通过MIC筛选出的诱导株进行检测。采用基因测序的方法检测突变的基因位点，寻找喹诺酮药物靶基因gyrA、parC突变的规律。
[0072] 实验结果：实验诱导株平行诱导35组，分别标记为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11、Y12、Y13、Y14、Y15、Y16、Y17、Y18、Y19、Y20、Y21、Y22、Y23、Y24、Y25、Y26、Y27、Y28、Y29、Y30、Y31、Y32、Y33、Y34、Y35。各诱导传代66代，左氧氟沙星终浓度20μg/ml，随着诱导剂左氧氟沙星浓度的增大，左氧氟沙星对诱导菌株的MIC 可由0.125 μg/ml 最高上升至128 μg/ml～256 μg/ml，是原来的1024～2048 倍。
[0073] 运用左氧氟沙星次抑菌浓度作为起始浓度成功诱导并构建喹诺酮耐药志贺菌模型。35株敏感株经过专一喹诺酮药物诱导后不仅形成了对各代喹诺酮的高浓度耐药，而且形成对与喹诺酮类药物结构和作用机制上都无关的其他几类抗菌药的多重耐药。
[0074] Y1-Y35 经左氧氟沙星诱导得到的各代菌株全部分别扩增出648bp 和469bp 长度的片段，分别是gyrA 基因、parC 基因PCR 扩增产物。gyrA PCR-RFLP 分析显示，对喹诺酮类药物未出现耐药的传代株均在酶切后出现221bp、99bp 和328bp 三条酶切产物片段；对喹诺酮类药物出现耐药的传代株的酶切图谱发生改变，产生两条300bp 左右的酶切片段。parC PCR-RFLP 分析,喹诺酮敏感株出现一致单链构象。PCR-SSCP分析耐药株中出现不同单链构象。
[0075] 实验诱导株平行35组（编号依次为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11、Y12、Y13、Y14、Y15、Y16、Y17、Y18、Y19、Y20、Y21、Y22、Y23、Y24、Y25、Y26、Y27、Y28、Y29、Y30、Y30、Y31、Y32、Y33、Y34、Y35）的gyrA、parC PCR 扩增产物测序，碱基序列与S51573 比对均相同。根据各代菌株PCR-RFLP-SSCP 分析的结果，挑选菌株进行测序，将gyrA、parC PCR扩增产物进行分析，在NCBI 中通过BLAST 程序对所测序列结果和从GenBank检索到的gyrA、parC 基因标准序列进行比对。每一诱导体系均诱导传代66 代，各代诱导株均扩增出gyrA 和parC 基因。35个诱导体系的诱导过程随着诱导剂浓度的增加，各自体系在靶位突变位点上突变数量和涉及靶位酶数目上均表现出一致性，故以Y30 诱导体系为例详细叙述改变过程：在第31代当左氧氟沙星终浓度为7μg/ml，gyrA 第83 位氨基酸首先发生改变，左氧氟沙星对诱导株的MIC=8μg/ml。第30代诱导株测序结果与原代序列进行比对，gyrA 基因发生丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG）改变；parC 进行PCR-RFLP-SSCP 分析，构象未发生改变，且parC 序列测序并未出现改变。在第40 代当左氧氟沙星终浓度为9 μg/ml，出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（ GAC）-87→甘氨酸（GGC）改变；parC 基因PCR-RFLP-SSCP 分析，构象发生改变，parC 基因碱基点突变为丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA）， 左氧氟沙星对诱导株的MIC=16μg/ml。在第49 代当左氧氟沙星终浓度为13 μg/ml，出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（ GAC）-87→甘氨酸（GGC）改变；parC PCR-RFLP-SSCP构象未发生改变，但parC 基因测序发现如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（GAA）-84→天冬氨酸（GAC）。
左氧氟沙星对诱导株的MIC=64μg/ml。在第54代当左氧氟沙星终浓度为16 μg/ml ，左氧氟沙星对诱导株的MIC=128μg/ml。出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（GAC）-87→甘氨酸（GGC），甘氨酸（GGT）-177→天冬氨酸（GAT）； parC基因如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（ GAA）-84→天冬氨酸（GAC）。在第63 代当左氧氟沙星终浓度为19 μg/ml ，左氧氟沙星对诱导株的MIC=256μg/ml。出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（GAC）-87→甘氨酸（GGC），甘氨酸（GGT）-177→天冬氨酸（GAT） 改变；parC 基因如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（GAA）-84→天冬氨酸（GAC），天冬酰胺（CAT）-183→天冬氨酸（AAT）。以上突变位点均在gyrA 和parC QRDR 区域内。
左氧氟沙星对诱导株的MIC=64μg/ml。在第54代当左氧氟沙星终浓度为16 μg/ml ，左氧氟沙星对诱导株的MIC=128μg/ml。出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（GAC）-87→甘氨酸（GGC），甘氨酸（GGT）-177→天冬氨酸（GAT）； parC基因如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（ GAA）-84→天冬氨酸（GAC）。在第63 代当左氧氟沙星终浓度为19 μg/ml ，左氧氟沙星对诱导株的MIC=256μg/ml。出现gyrA 基因丝氨酸（TCG）-83→亮氨酸（TTG），天冬氨酸（GAC）-87→甘氨酸（GGC），甘氨酸（GGT）-177→天冬氨酸（GAT） 改变；parC 基因如下碱基点突变：丝氨酸（AGC）-80→精氨酸（AGA），谷氨酸（GAA）-84→天冬氨酸（GAC），天冬酰胺（CAT）-183→天冬氨酸（AAT）。以上突变位点均在gyrA 和parC QRDR 区域内。
[0076] 综上，35 个实验室诱导体系均显示左氧氟沙星诱导过程先出现为gyrA 点突变，随着诱导液浓度增加，后出现parC 点突变，且突变位点的时序为：gyrA-83，gyrA-87，parC-80，parC-84，gyrA-177，parC-183位，随着点突变或多靶位酶突变，耐药程度不断提高。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种支持目录级别的容器磁盘配额限制方法和装置 | 2020-05-21 | 97 |
| 一种赖氨酸修饰的二氧化硅粒子制备及提取DNA方法 | 2020-05-16 | 76 |
| 一种天然气田燃气喷嘴 | 2020-05-23 | 658 |
| 一种保护汽车乘员颈部安全的主动头枕的使用方法 | 2020-05-24 | 72 |
| 一种动态Huffman编码硬件实现系统及其实现方法 | 2020-05-13 | 687 |
| 一种提高气动阀门开关速度的方法 | 2020-05-25 | 152 |
| 一种会员到店提醒的系统和方法 | 2020-05-13 | 356 |
| 一种基于脉冲反馈的故障快速检测电路 | 2020-05-17 | 678 |
| 解决交通运输车辆拥堵的方法 | 2020-05-18 | 285 |
| 一种木本植物扦插繁殖方法及用于其扦插的装置 | 2020-05-17 | 898 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
提前公布热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈