生腱蛋白C及其在类风湿关节炎的用途
阅读：87发布：2023-01-26
专利汇可以提供生腱蛋白C及其在类风湿关节炎的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种确定待测个体的类 风 湿关节炎状态、或者类风湿关节炎进展、或者用于患有类风湿关节炎的个体的合适疗法的方法，该方法包括下述步骤：(a)测定来自所述待测个体的样品中生 腱 蛋白C的 水 平；以及(b)将步骤(a)中测定的生腱蛋白C水平与一个或多个参考值相比较。优选所指的类风湿关节炎是侵蚀性类风湿关节炎。当公开时，随附有图5。，下面是生腱蛋白C及其在类风湿关节炎的用途专利的具体信息内容。
1.一种确定待测个体的类风湿关节炎状态的方法，该方法包括下述步骤：
(a)测定来自所述待测个体的样品中生腱蛋白C的水平；以及
(b)将步骤(a)中测定的生腱蛋白C水平与一个或多个参考值相比较。
2.一种确定待测个体中类风湿关节炎进展、或者类风湿关节炎对于特定治疗的反应的方法，该方法包括下述步骤：
(a)测定来自所述待测个体的样品中生腱蛋白C的水平；以及
(b)将步骤(a)中测定的生腱蛋白C水平与一个或多个参考值相比较。
3.一种确定用于患有类风湿关节炎的待测个体的合适治疗的方法，该方法包括下述步骤：
(a)测定来自所述待测个体的样品中生腱蛋白C的水平；以及
(b)将步骤(a)中测定的生腱蛋白C水平与一个或多个参考值相比较；
(c)使用步骤(b)中的结果来确定最合适的疗法。
4.如前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，所述类风湿关节炎是侵蚀性类风湿关节炎。
5.如权利要求1所述的方法，用于确定或者诊断患有类风湿关节炎的待测个体是否患有侵蚀性类风湿关节炎。
6.如前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，所述样品是血液样品，比如全血样品、血浆或者血清。
7.如前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，与参考水平相比，样品中生腱蛋白C约50％或更多的提高即是炎性紊乱，例如类风湿关节炎，尤其是侵蚀性类风湿关节炎的征候。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述参考水平是正常样品中的水平。
9.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，超过33ng生腱蛋白C每毫升血清的水平即是类风湿关节炎、尤其是侵蚀性类风湿关节炎的征候。
10.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，超过31ng生腱蛋白C每毫升血清的水平即是类风湿关节炎、尤其是侵蚀性类风湿关节炎的征候。
11.如权利要求3所述的方法，其特征在于，来自待测个体的样品中生腱蛋白C水平相比正常个体中水平的提高，表明使用抗TNF药物是不合适的。
12.如权利要求3所述的方法，其特征在于，来自待测个体的样品中生腱蛋白C水平相比正常个体中的水平的提高，表明使用抗IL17疗法或者另一种非抗TNF疗法是合适的。
13.如权利要求11或12所述的方法，其特征在于，样品中生腱蛋白C水平是至少31或
33ng/ml血清。
14.如前述权利要求中任何一项所述的方法，其在体外进行。
15.如前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，所述待测个体是哺乳动物。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。
17.一种用于确定个体的侵蚀性类风湿关节炎状态的试剂盒，该试剂盒包含至少一种用于测定由待测个体提供的样品中的生腱蛋白C水平的试剂。
18.如权利要求17所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂是抗体。
19.如权利要求17或18中任一项所述的试剂盒，还包括以标签或插页形式记载合适操作参数的说明书。
20.如权利要求17至19中任一项所述的试剂盒，还包括一个或多个生腱蛋白C样品，用作于校准和对比的标准。
21.生腱蛋白C作为用于侵蚀性风湿性关节炎的血清生物标志物的用途。
22.血液或者血清样品中生腱蛋白C水平测定的用途，作为评价个体中侵蚀性类风湿关节炎状态的手段。
23.血液或者血清样品中生腱蛋白C水平测定的用途，作为评价个体中类风湿关节炎状态、尤其是侵蚀性类风湿关节炎状态的手段。
24.一种治疗待测个体中炎性状况例如类风湿关节炎、尤其是侵蚀性类风湿关节炎的方法，该方法包括：测定来自待测个体的样品中的生腱蛋白C水平和实施炎证治疗，尤其是基于观察到的生腱蛋白C水平实施用于类风湿关节炎或者侵蚀性类风湿关节炎的治疗。
25.一种治疗类风湿关节炎、尤其是侵蚀性类风湿关节炎的方法，该方法包括：测定来自待测个体的样品中生腱蛋白C水平；如果生腱蛋白C水平大于参考样品中的水平、但小于
33ng/ml、优选小于31g/ml，则实施抗TNF疗法。
26.一种治疗类风湿关节炎、尤其是侵蚀性类风湿关节炎的方法，该方法包括：测定来自待测个体的样品中生腱蛋白C水平；如果生腱蛋白C水平大于31ng/ml、优选大于33ng/ml，则实施除抗TNF疗法之外的疗法。
27.基本上按照本文中参考实施例和附图而描述的方法。
28.基本上按照本文中参考实施例和附图而描述的用途。
29.基本上按照本文中参考实施例和附图而描述的用途。
生腱蛋白C及其在类风湿关节炎的用途
技术领域
[0001] 本发明涉及生腱蛋白C(韧粘素C，tenascin-C)作为用于炎性紊乱的生物标志物的用途，特别是作为用于类风湿关节炎的血清生物标志物的用途。具体地讲，本发明涉及生腱蛋白C作为用于侵蚀性类风湿关节炎的生物标志物的用途。
背景技术
[0002] 生腱蛋白C是促炎胞外基质糖蛋白(proinflammatory extracellular matrix glycoprotein)(Midwood，et al.(2009)，Nat.Med.，15：774-780)，其通过模式识别受体TLR4的活化而诱导在初级人类巨噬细胞和滑液成纤维细胞中的炎性细胞因子合成。生腱蛋白C是较大的六聚蛋白质，分子量为1.5百万道尔顿。已经在炎症位点例如在类风湿关节炎病人的滑液中以及在肿瘤间质中发现高水平的生腱蛋白C。
[0003] 类风湿关节炎是慢性病，其特征是多个关节的持续的炎症、肿胀和疼痛。随着时间推移，慢性炎症导致关节内的骨组织破坏，并且导致渐进性残疾。类风湿关节炎的一个突出的标志是在其临床表现中的较大的可变性。该可变性扩及至疼痛水平、肿胀关节数量和关节变形程度。类似地，患有类风湿关节炎的病人对任何具体药物治疗的反应也差异很大，一些病人的疾病迹象和征状几乎消除，而其他病人几乎完全没有反应。
[0004] 用于类风湿关节炎的现有诊断方法由美国风湿病学会(American College of Rheumatology)确立，包括以下各项内容：
[0005] 1)晨僵持续超过1小时(主要在手指上)；
[0006] 2)在超过3个关节中肿胀；
[0007] 3)手关节(腕关节、掌指关节和近位指节间关节)肿胀；
[0008] 4)在对称的关节中肿胀(左右关节)；
[0009] 5)手的射线照相中的反常发现；
[0010] 6)皮下结节；以及
[0012] 本发明的一个目的是提供一种可供选择的标记物、一种诊断试剂、以及一种检测方法，所述方法可以方便地用于鉴定类风湿关节炎、尤其是用于鉴定侵蚀性类风湿关节炎。
[0013] 侵蚀性类风湿关节炎是患有类风湿关节炎的病人中残疾的主要原因，并且特征是关节骨的骨损失和局部侵蚀。
[0014] 骨侵蚀的测定几乎仅仅基于影像学表现、超声和doplar研究(doplar studies)，因为对通过活体解剖得到的这些病灶的直接评估是很不实际的。术语“骨侵蚀”描述了在近关节位点的矿化组织的损失，其通常与在皮质内层中的断裂有关。骨侵蚀在疾病早期开始，并且在第一年期间发展最快，因此，快速检测和治疗侵蚀性类风湿关节炎的能力将成为极大益处。
发明内容
[0015] 根据第一方面，本发明提供一种确定待测个体的炎性紊乱状态的方法，该方法包括下述步骤：
[0016] (a)测定来自所述待测个体的样品中生腱蛋白C的水平；以及
[0017] (b)将步骤(a)中测定的生腱蛋白C水平与一个或多个参考值相比较。
[0018] 炎性紊乱可以是一种或多种类风湿关节炎，尤其是侵蚀性类风湿关节炎、关节强直性脊椎炎、牛皮癣关节炎、狼疮和肌炎。优选地，炎性紊乱是类风湿关节炎，尤其是侵蚀性类风湿关节炎。
[0019] 在一种优选的实施方式中，该方法被用于确定待测个体的类风湿关节炎状态，优选地，待测个体的侵蚀性类风湿关节炎状态。侵蚀性类风湿关节炎被定义为在关节骨中具有至少一个侵蚀性病灶的类风湿关节炎，优选地具有至少5个病灶、优选地具有至少10个病灶、优选地具有至少20个病灶。病灶数目越多，则侵蚀性类风湿关节炎越严重。
[0020] 本发明的方法可以用于确定待测个体的侵蚀性类风湿关节炎状态，所述待测个体已经被诊断为患有类风湿关节炎。优选地，本发明的方法提供了一种容易的、非侵入性的和便宜的查看患有类风湿关节炎的病人的侵蚀性类风湿关节炎状态的方法。
[0022] 优选地，该方法被用于确定待测个体是否患有侵蚀性类风湿关节炎。
[0023] 生腱蛋白C是一种新颖的用于炎性紊乱、尤其是类风湿关节炎、更具体地讲侵蚀性风湿性关节炎的血清生物标志物。
[0024] 人类生腱蛋白C的蛋白质序列能够使用登记号码P24821在GenBank上找到，并且在图8中给出了氨基酸序列。
[0025] 在本发明的方法中，所有形式的生腱蛋白C都可以被测量。优选地，至少一种320kDa的生腱蛋白C亚型被测量到。优选地，仅仅320kDa亚型的生腱蛋白C被测量。
[0026] 术语“炎性紊乱状态”包括任何可识别的炎性紊乱的表现形式。例如，炎性紊乱状态包括、但不限于：炎性紊乱的存在或者没有，炎性紊乱发展的风险，炎性紊乱的阶段，炎性紊乱的进展，以及炎性紊乱治疗的有效性或待测个体对炎性紊乱治疗的反应。
[0027] 本发明的方法可以用于下述任何一个或多个方面，例如，诊断待测个体中的炎性紊乱；评价待测个体发展炎性紊乱的可能性；为患有炎性紊乱的待测个体提供关于预后的建议；监控疾病进展；以及监控炎性紊乱治疗的有效性或待测个体对炎性紊乱治疗的反应。
[0028] 优选地，该方法容许根据对待测个体提供的样品中生腱蛋白C水平的分析来诊断待测个体的炎性紊乱。
[0029] 术语“类风湿关节炎状态”包括任何可识别的疾病的表现形式。例如，类风湿关节炎状态包括、但不限于：类风湿关节炎的存在或者没有，类风湿关节炎发展的风险，类风湿关节炎的阶段，类风湿关节炎的进展，以及类风湿关节炎治疗的有效性或者个体对于类风湿关节炎治疗的反应。在一个优选实施方式中，类风湿关节炎状态是指没有或者存在侵蚀性类风湿关节炎。
[0030] 本发明的方法例如可以用于下述任何一个或多个方面：诊断待测个体中的类风湿关节炎状态、尤其是侵蚀性类风湿关节炎；评价待测个体发展类风湿关节炎状态、尤其是侵蚀性类风湿关节炎的可能性；为患有类风湿关节炎状态、尤其是侵蚀性类风湿关节炎待测的个体提供关于预后的建议；监控疾病、尤其是类风湿关节炎的进展；以及监控炎性紊乱治疗的有效性或待测个体对于类风湿关节炎、尤其是侵蚀性类风湿关节炎治疗的反应。
[0031] 优选地，该方法容许根据对由待测个体提供的样品中生腱蛋白C水平的分析来诊断待测个体的类风湿关节炎、尤其是侵蚀性类风湿关节炎。
[0032] 可以通过任何合适的测试方法来测定样品中存在的生腱蛋白C水平，所述测试方法可以包括应用下组中包含的任何一项：免疫测试、光谱测定法、Western blot、ELISA、免测沉淀法、狭缝印迹法或者点印迹测定法、等电点聚焦、SDS-PAGE、抗体微阵列免疫组织学染色、射电免疫测定(RIA)、荧光免疫分析、使用亲和素-生物素或者链霉亲和素(streptoavidin)-生物素系统的免疫测试等、或前述方法的组合。这些方法已为本领域技术人员所熟知。
[0033] 作为另一种选择，可以通过测定样品中生腱蛋白C的mRNA水平来测量生腱蛋白C水平。mRNA水平能够通过PCT或者任何其它合适技术来测量。
[0034] 优选地，用于与测定的生腱蛋白C水平相比较的参考值是在一个或多个待测个体中观察到的生腱蛋白C水平。所述待测个体未患有任何可检测到的炎性紊乱比如类风湿关节炎、或者炎性紊乱比如类风湿关节炎的任何临床症状，且具有生物标志物生腱蛋白C的所谓的“正常值”。
[0035] 优选地，与正常组织样品中的水平相比，待测样品中生腱蛋白C约50％或更多的提高即是炎性紊乱、例如类风湿关节炎、尤其是侵蚀性类风湿关节炎的症候。
[0036] 优选地，每毫升血清或血浆中生腱蛋白C超过31ng、优选超过33ng的水平，即是类风湿关节炎、尤其是侵蚀性类风湿关节炎的症候或者至少是指示。优选地，生腱蛋白C水平与其它标志物的组合容许类风湿关节炎、尤其是侵蚀性类风湿关节炎的诊断。
[0037] 作为另一种选择，参考值可以是得到的特定个体的之前的值。如果所述方法是准备用于监控疾病的进展或者监控待测个体对特定治疗的反应，可以使用此参考值。
[0038] 优选地，生腱蛋白C水平相比正常的/未患病的参考水平的提高，即是类风湿关节炎、尤其是侵蚀性类风湿关节炎的指示或征候。
[0039] 生腱蛋白C水平可以被用于将患有类风湿关节炎的病人分成患有侵蚀性类风湿关节炎的病人和非患者。
[0040] 本发明的方法也可以被用于监控类风湿关节炎进展、以及尤其是侵蚀性类风湿关节炎进展，和/或用于监控施加于个体的治疗的功效。前述方法的实现，可以通过分析在初始诊断后不同时间点取自个体的样品，监控生腱蛋白C水平的变化、并且将这些水平与正常值和/或参考值相比较。该情况下，参考水平可以包括个体中最初的生物标志物水平、或者在最后测试时个体中的生物标志物水平、或者上述两个水平。
[0041] 本发明的方法也可以被用于确定用于个体的合适治疗方案。该方法可以被用于提供个人化的医学方案。在一种实施方式中，样品中生腱蛋白C水平的提高足以导致诊断为炎性状况例如类风湿关节炎，可以被用于表明：当个体不大可能有反应时，使用抗TNF药物是不适当的。提供替代疗法或许更合适，例如，抗IL17疗法；T细胞共刺激调谐剂(比如TM TMOrencia -阿巴西普(Abatacept))：白细胞介素-6(IL-6)抑制剂(比如Actemra -托珠单TM
抗(Tocilizumab))；抗CD20抗体(比如Rituxan -美罗华(Rituxumab)；或B细胞活化因TM
子(比如抗BAFF)。其他替代疗法包括Janus激酶抑制剂(JAK)(比如Tofacitinib )和TM
脾酪氨酸激酶抑制剂(Syk)(比如Fostamatinib )。
抗(Tocilizumab))；抗CD20抗体(比如Rituxan -美罗华(Rituxumab)；或B细胞活化因TM
子(比如抗BAFF)。其他替代疗法包括Janus激酶抑制剂(JAK)(比如Tofacitinib )和TM
脾酪氨酸激酶抑制剂(Syk)(比如Fostamatinib )。
[0042] 在一个实施方式中，本发明提供一种用于确定抗TNF疗法对于患有类风湿关节炎的病人而言是否是一种合适疗法的方法。更具体地讲，如果患有类风湿关节炎的病人在其血浆或者血清中的生腱蛋白C水平为至少31ng每毫升血浆或者血清、或者至少33ng每毫升血浆或者血清的，则他们对于抗TNF疗法不太可能有反应。
[0043] 优选地，本发明的方法是体外进行。
[0045] 根据另一个方面，本发明提供一种确定患有类风湿关节炎的个体的侵蚀性类风湿关节炎状态的方法，该方法包括下述步骤：
[0046] (a)测定来自所述个体的样品中生腱蛋白C的水平；以及
[0047] (b)将步骤(a)中测定的生腱蛋白C水平与一个或多个参考值相比较。
[0048] (c)
[0049] 优选地，样品是血清样品或血浆样品。优选地，样品中生腱蛋白C水平是至少31ng每毫升样品、或者至少33ng每毫升样品。优选地，参考值是来自未患有类风湿关节炎的个体的血浆或血清样品中的生腱蛋白C数值。本领域技术人员可以理解，上述所指的所有优选的特征还可以应用于该方法和本发明的每个方面。
[0050] 根据另一个方面，本发明提供了一种用于确定个体炎性紊乱状态的试剂盒，该试剂盒包含至少一种用于测定由待测个体提供的样品中生腱蛋白C水平的试剂。
[0051] 在一种优选的实施方式中，试剂盒用于确定个体的类风湿关节炎状态、尤其是侵蚀性类风湿关节炎状态，该试剂盒包含至少一种用于测定由待测个体提供的样品中生腱蛋白C水平的试剂。
[0052] 该试剂可以是抗体。
[0054] 试剂盒可以包含一个或多个生腱蛋白C样品，用作用于校准和对比的标准。试剂盒还可以包含用于将样品中检测到的生腱蛋白C水平与校准样品或者图表比较的说明书。试剂盒还可以包括用于显示什么样的生腱蛋白C水平是类风湿关节炎、尤其是侵蚀性类风湿关节炎的征候的说明书。
[0055] 根据另一个方面，本发明提供了血液或者血清样品中生腱蛋白C水平测定的用途，其可作为评价个体中炎性紊乱状态的手段。
[0056] 在一种优选的实施方式中，本发明提供了血液或者血清样品中生腱蛋白C水平测定的用途，其可作为评价个体中类风湿关节炎状态、尤其是侵蚀性类风湿关节炎状态的手段。
[0057] 根据另一个方面，本发明提供了一种治疗个体中炎性状况比如类风湿关节炎、尤其是侵蚀性类风湿关节炎的方法，该方法包括：测定来自个体的样品中生腱蛋白C水平以及实施炎性治疗，尤其实施针对类风湿关节炎或者侵蚀性类风湿关节炎的以观察到的生腱蛋白C水平为基础的治疗。优选地，如果生腱蛋白C水平高于参考样品中的水平，就实施治疗。参考样品可以是来自不具有炎性状况的正常个体的样品。如果生腱蛋白C水平大于31ng/ml、优选地大于33ng/ml，就可以实施治疗。如果生腱蛋白C水平大于31ng/ml、优选大于33ng/ml，则可以实施抗TNF疗法的替代疗法。该替代疗法可以是上述疗法之一。
[0058] 根据另一个方面，本发明提供了一种治疗类风湿关节炎、尤其是侵蚀性类风湿关节炎的方法，该方法包括：测定来自待测个体的样品中的生腱蛋白C水平；如果生腱蛋白C水平大于参考样品中的水平但小于33ng/ml、优选小于31ng/ml，则实施抗TNF疗法。
[0059] 根据另一个方面，本发明提供了一种治疗类风湿关节炎、尤其是侵蚀性类风湿关节炎的方法，该方法包括：测定来自待测个体的样品中的生腱蛋白C水平；如果生腱蛋白C水平大于31ng/ml、优选大于33g/ml，则实施除抗TNF疗法之外的疗法。
[0060] 该替代疗法可以是抗IL-17疗法、或者上述替代疗法中的任何一种。
[0061] 本领域技术人员将会理解，本发明的任何一个实施方式和/或方面的优选特征可以应用于本发明的所有其它实施方式和/或方面。
[0063] 图1显示了在患有类风湿关节炎的病人中生腱蛋白C水平显著升高。在该研究中考虑52个病人，类风湿关节炎患者中的86.6％显示出具有异常高的(显著升高的)生腱蛋白C水平。结果显示，类风湿关节炎病人的平均生腱蛋白C值是87.87ng/ml血清，而正常人群的平均生腱蛋白C值是20.34ng/ml血清。患有类风湿关节炎的病人的95％置信界限是31ng/ml，因此得出如下结论：高于31ng/ml血清的生腱蛋白C水平是类风湿关节炎的征候。
[0064] 图2是Western blot，显示了在患有类风湿关节炎(RA)的病人中生腱蛋白C的循环水平(circulating level)。图2A显示了在来自RA病人的基准样品(baseline samples)中，观察到一个主要的320kDa的TNC条带(n＝18)。通过ELISA检测到的相同样品中的相应TNC水平以pg/mL为单位显示在印迹下方。在健康对照血浆(N)中检测到低水平的TNC。rhTNC＝0.05μg人重组TNC。图2B显示，在使用抗生腱蛋白C抗体(TNC)进行Western blotting时，除在320kDa下检测到的主要条带，还有MW219、201、190和156kDa的条带存在于一些RA病人的血浆中。对于每个RA样品，同一个膜的丽春红(Ponceau S)染色显示出相当的蛋白质加载。
[0065] 图3显示，生腱蛋白C水平与当前使用的关节炎的CRP标志物及抗CCP标志物之间没有相关性。因此显示出生腱蛋白C是可供选择的和改进的生物标志物，尤其是用于类风湿关节炎、具体地讲用于侵蚀性类风湿关节炎的生物标志物。在该研究中考虑52个病人，并且将生腱蛋白C的血清水平与CRP和抗CCP的血清水平相比较。TNC水平与CRP及抗CCP之间没有关联，表明生腱蛋白C是一种独特的类风湿关节炎生物标志物。
[0066] 图4显示，患有类风湿关节炎的病人血清中的生腱蛋白C表达水平与在病人关节中观察到的侵蚀程度之间有相关性，x轴代表观察到的骨侵蚀数目。呈现的数据显示，血清中生腱蛋白C水平表明在关节中存在骨侵蚀，并且生腱蛋白C血清水平越高，则观察到的侵蚀就越多。
[0067] 图5显示，当患有类风湿关节炎的病人被分成具有异常的血清中生腱蛋白C水平(也就是说，大于31ng/ml)的患者和具有正常的生腱蛋白C水平(血清中生腱蛋白C水平为0-31ng/ml)患者时，具有异常的生腱蛋白C水平的病人具有统计学上提高的侵蚀评分。因而表明，血清中的生腱蛋白C水平是一种好的用于侵蚀性类风湿关节炎的生物标志物。
[0068] 图6A-6C显示，生腱蛋白C水平与触痛及肿胀关节数(通过GP计数)之间没有相关性(图6A)，或者与整体评估分数(医生整体评估，医生按标度1-10来评定病人疾病活性)之间(图6B)或生物化学标志物CRP或者与红细胞沉降率(ESR)之间没有相关性(图6C)。CRP是在炎症中升高的急性期蛋白质，并且是炎症的非专一性标志物，其水平通过ELISA测量。ESR是在1小时的周期内红细胞沉积的速率，并且是炎症的非专一性测量值。为了进行测试，抗凝的血液被置于被称为Westergren试管的直立试管中，测量红细胞下落的速率并且以mm/h为单位报告。ESR取决于在促沉积因子(主要为纤维蛋白原)与阻止淀积的因子(即红血球的负电荷(动电位))之间的平衡。当炎性过程出现时，血液中高比例的纤维蛋白原会引起红细胞彼此粘附。
[0069] 图7显示了在7个患有类风湿关节炎的病人中抗TNF疗法InfliximabTM(英夫利昔单抗)和氨甲蝶呤(MTX)对于生腱蛋白C水平的影响。结果显示，这些疗法对于生腱蛋白C几乎没有长期影响。
[0070] 图8详细列出了人类生腱蛋白C的氨基酸序列。
[0071] 图9表明，处于基准线的生腱蛋白C水平预示在开始Infliximab(抗TNF)治疗后16-18周和54周RA病人的将来的触痛关节数。通过ELISA分析在分组A中处于基准线的(进入试验的)来自RA病人的血清的生腱蛋白C水平。在接受Infliximab疗法后16-18周(A)和54周(B)，用专业人员测定到的这些病人的触痛关节数显示生腱蛋白C水平。通过Spearman等级相关分析确定显著性。分组A包括根据ACR1987标准具有侵蚀性RA诊断的病人，具有持续0.5至3年的症状。分组B包括具有RA诊断的病人，疾病活性得分处于中等水平或更高水平。
具体实施方式
[0072] 患有类风湿关节炎的病人与正常/对照个体比较的生腱蛋白C水平的评估[0073] 自患有类风湿关节炎的病人的血液以及正常个体获得血清，并且在-80℃下储存直到使用。在分析当天，血清在冰上解冻，以1∶50的比例通常地稀释在EIA缓冲液(1％BSA，PBS中0.05％吐温20)，为了用于ELISA。ELISA试剂盒购自IBL(目录编号27751)，用于检测人类生腱蛋白C的高分子量变体。100μL的稀释血清在预先涂有未标记的捕获抗生腱蛋白C抗体的ELISA板上孵育，一式两份在37℃下孵育60分钟。ELISA板(在0.001％吐温20/PBS中)洗涤7次，每个孔中加入用HRP标记的抗人类生腱蛋白C抗体(100μL)。这些孔然后于4℃下孵育30分钟，并且然后用0.001％吐温20/PBS洗涤9次。然后将100μL色原(提供的TMB溶液)添加至每个孔，并且避光孵育30分钟或者直至判断变色充分。通过加入100μL1N H2SO4终止反应。使用MultiScan板分析器在450nm读取变色，并且使用Ascent version2.6计算出生腱蛋白C的浓度。使用由ELISA板(24-0.38ng/ml)提供的、由生腱蛋白C产生的标准曲线作为标准。
[0074] 上述ELISA是在自52个患有类风湿关节炎的病人获得的血清样品上、以及自20个没有类风湿关节炎迹象的正常对照个体获得的血清样品上进行。结果如图1所示，显示出在类风湿关节炎病人中具有显著更高的生腱蛋白C水平，得出如下结论：大于31ng/ml血清生腱蛋白C水平或大于33ng/ml血清的生腱蛋白C水平是类风湿关节炎、尤其是侵蚀性类风湿关节炎的征候。
[0075] Western blotting显示，存在于类风湿关节炎病人样品中的生腱蛋白C的主要形式具有320kDa的质量(图2A)，但在一些病人中也观察到生腱蛋白C的次要的、较小的形式(图2B)。
[0076] 使用下述方法得到了图2中Western blot数据。1μL的血清或者血浆在4-12％Bis-Tris预先浇注的聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen公司，Life Technologies，帕斯力，英国)上进行电泳。蛋白质被转印到硝酸纤维素膜(Amersham公司，GE保健公司，查尔芬特，英国)上，并且使用丽春红染色(Sigma Aldrich公司，格林汉姆，英国)显像。在用TBS/0.01％吐温洗涤以除去染色剂后，膜在5％BSA/TBS-吐温中于室温下被封闭1小时，并且与初级抗体以1∶1000稀释度在37℃下孵育1小时，该初级抗体可识别人类TNC的N端区域(MAB1908，Merck Millipore公司，沃特福德，英国)。被辣根过氧化物酶共轭的抗小鼠IgG(DAKO公司，伊利，英国)被用作第二抗体，稀释度为1∶3000。使用增强化学发光试剂盒(Amersham公司，GE保健公司)检测被结合的抗体，并且在Super RX医用X线胶片(富士公司，日本)上显像。
[0077] 在患有类风湿关节炎的病人中的生腱蛋白C水平与骨侵蚀水平之间的相关性[0078] 为了显示在病人血清中生腱蛋白C水平与侵蚀性类风湿关节炎之间的相关性，将类风湿关节炎病人中的侵蚀水平与血清中循环生腱蛋白C水平相比较。
[0079] 使用超声和功率多普勒成像测量侵蚀，按照TaylorPC在Rheumatology(牛津大学)，2005年6月；44(6)：721-8和Epub2005年1月11日综述中描述的方法。
[0080] 根据图4可以看出，当比照着生腱蛋白C水平绘制侵蚀评分时，观察到显著相关性。
[0081] 通过将具有血清中异常生腱蛋白C水平(也就是说，大于31ng/ml)的患有类风湿关节炎的病人的侵蚀评分与具有正常生腱蛋白C水平(血清中生腱蛋白C水平为0-31ng/ml)的患有类风湿关节炎的病人的侵蚀评分相比较，图5进一步表明与侵蚀性类风湿关节炎有更强的相关性。具有异常生腱蛋白C水平的病人显示出具有统计学上提高的侵蚀评分。因而表明，血清中的生腱蛋白C水平是一种好的侵蚀性类风湿关节炎的生物标志物。
[0082] 此外，没有观察到类风湿关节炎的其它测量值与生腱蛋白C水平之间的显著相关性(图6A-6C)，这进一步表明血清中生腱蛋白C水平是一种好的用于类风湿关节炎、尤其是侵蚀性类风湿关节炎的生物标志物。
[0083] 类风湿关节炎治疗对于生腱蛋白C水平的影响
[0084] 如图7所示，当前使用的用于类风湿关节炎的治疗未表现出对生腱蛋白C水平有任何影响。
[0085] 高的血清生腱蛋白C是在Infliximab治疗的病人中未解决的关节触痛的预示[0086] 不管采用抗TNF试剂疗法例如Infliximab的重大进步，但使用抗TNF试剂治疗的类风湿关节炎病人的大部分没有响应并且继续获得关节侵蚀和提高的DAS28评分。鉴于生腱蛋白C水平与侵蚀评分的相关性、以及Infliximab对于循环生腱蛋白C水平的影响，进行研究以便确定生腱蛋白C水平是否用作Infliximab治疗的病人的将来疾病进展的预示。在基准生腱蛋白C水平或者在疗法开始后第18或52周的生腱蛋白C水平变化与对Infliximab的反应之间没有关系。然而，在处于基准线的生腱蛋白C水平与Infliximab治疗的病人在开始治疗后第16-18周和54周的后续的TJC评分之间可见显著的相关性(图9)。因此，这些数据提示，在开始Infliximab疗法之前具有较高生腱蛋白C水平的病人很可能与未解决的关节触痛有关，尽管进行了Infliximab疗法。
[0087] 结果表明，在开始抗TNF治疗之前的血清中生腱蛋白C水平可早在提前一年时作为病人中触痛关节数的预示，并且可以将可能受益于抗TNF治疗的病人与那些不大可能有响应的病人区别开来。
[0088] 此外，图2中显示的结果表明，在患有类风湿关节炎、尤其是侵蚀性类风湿关节炎的病人的血清中生腱蛋白C的主要变体是质量为320kDa的亚型，其构成占支配地位的“大亚型”。生腱蛋白C是大的多模型分子。它包含许多不同的结构域，包括装配结构域、一系列14个半表皮生长因子样重复片段、一系列多达17个III型粘连蛋白样重复片段(TNIII)、以及纤维蛋白原样结构域。生腱蛋白C被单个基因编码，该基因被可选地拼接以便产生大小范围为190-320kDa的单体。这特别地发生在TNIII结构域中；TNIII结构域中的8个被组成性地表达(TNIII1-8)，并且TNIII结构域中的9个能够被可选地拼接(A1-4、B、AD2、AD1、C和D)。
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