与猪脂肪沉积性状相关的SNP遗传标记及应用
阅读：1050发布：2020-08-25
专利汇可以提供与猪脂肪沉积性状相关的SNP遗传标记及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 家畜 分子标记制备技术领域，具体涉及与猪脂肪沉积性状相关的SNP遗传标记及应用。从猪ACADL基因中克隆获得一种作为分子标记应用的猪脂肪沉积性状的基因 片段 ，其核苷酸序列如 附图 3所示，在序列的第498bp处有一个A/T的 碱 基替换，第508bp处有一个A/G的碱基替换，这两处突变位点的等位基因 频率 在中外猪种中存在显著的差异。本发明还公开了该分子标记的制备方法以及其在脂肪沉积性状多态性检测中的应用，为猪的标记辅助选择提供了一个新的标记。，下面是与猪脂肪沉积性状相关的SNP遗传标记及应用专利的具体信息内容。
1.一种与猪脂肪沉积性状相关的遗传标记，其核苷酸序列如下所示：
GTGGAAAATGGAATGAAAGGATTTGTTAAGGGGCGAAAGCTACATAAAATAGGACTAAAAGCTCAGGTAAGCCATAATATAAATTTGTATTTATAATATAACTTACAATATAAATTGTTTGTAAATATAATTCATATTTATTATTTATTAATAAATTGAGTCTACTCATTACGTTTCCTGTATAGAATTACATATAGCACAATCGTACCTTCCTTCCTATGCTGGATTCTTAAAATATGCTTTTCAGTAATGATAGTGGTATTTCATTGTTTATGCAACTGTGGTCAGCAATGGAAGTGAATCAGTGTTTTGAAAATCTGCTTTAGAAGTGGCAACATTAACTGCATGCTAATAGACCCTCTAGTTATGAAATGGATGAAAAAAATATGAAATAAGAACAGAAAATATTTTTTCTACTATTTGGTAATTTTTTCATTACCAAAAAGAAAAGCATGTTTTATTTGATAGGCATTAGAAATCCTTAATCCTCAATACCTWCAGAACTGGRCAGTATTAGAGCTAGAATGATAATGTATTGCAGTGGGAAAGTCACTTTTGGAATCAGTGGGAAATGGGTTTGAATCCCTGGTTTACCACTTACGAGTTGTGTTCATTAACCACTCCAACTTGGTTTTCAGTTTTGTTTTATTTTGTTTTTAATGGAAATAATATTAGTCTCATCAGGTTATTGG
上述序列中498bp处的W是A或T，508bp处的R是A或G。
2.扩增如权利要求1所述遗传标记的引物对，其特征在于，该引物对的序列如下所示：
正向引物：GTGGAAAATGGAATGAAAG，
反向引物：CCAATAACCTGATGAGACT。
3.一种猪脂肪沉积性状相关的遗传标记的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
从猪耳组织中提取基因组DNA，根据猪ACADL基因序列设计引物对，该引物对的序列如权利要求2所示，用权利要求2所示的引物对在猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR产物纯化、克隆测序，获得如权利要求1所示的核苷酸序列。
4.权利要求1所述的遗传标记在猪脂肪沉积性状检测中的应用。
5.权利要求2所述的引物对在猪脂肪沉积性状检测中的应用。
与猪脂肪沉积性状相关的SNP遗传标记及应用
技术领域
[0001] 本发明属于猪的遗传标记制备技术领域，具体涉及一种猪脂肪沉积性状相关的SNP遗传标记及应用，该遗传标记是从猪ACADL基因中克隆获得。
背景技术
[0002] 在猪育种工作中，育种者一直将提高瘦肉率和降低背膘厚作为主要育种目标。虽然这种选育方式已取得了显著的成效，但是它的遗传选择最终导致肌内脂肪含量的下降，进而导致猪肉品质的下降。随着消费者对肉质要求的不断提高，改善猪肉品质的遗传研究已成为畜牧业的研究热点。
[0003] 脂肪沉积性状是猪生产和育种中最为重要的经济性状指标之一。猪皮下脂肪的含量，如背膘厚度，主要决定胴体品质；而肌内脂肪含量(IMF)主要影响猪肉的嫩度、多汁性及加工后的风味等肉质特征。猪脂肪沉积受到品种(遗传)和环境两大因素的影响。总体而言，中国地方猪品种往往具有较强的脂肪沉积能力，表现在猪胴体脂肪含量高、肌内脂肪含量多，但生长速度缓慢、饲料转化效率低；而国外引进品种由于受到长时间的选育，已经成功降低了背膘厚度，提高了胴体瘦肉率，但猪肉品质有所下降，比如肌内脂肪含量偏低(<1.5％)，且易产生劣质的PSE肉(肉色苍白、松软、渗水)。因此，不论国外引进品种还是中国地方品种，其脂肪沉积性状仍亟需改良。背膘厚(皮下组织脂肪含量)和肌内脂肪含量是两个具有中等以上强度相关的脂肪沉积性状，单纯从表型上难以将两者分别进行选择。如果能够鉴别这些基因位点，并辨别出它们影响相关表型程度之间的差异性，则可开发出用于某一表型特异性选择的分子标记及相应检测技术，准确改良该表型。
[0004] SNP标记指由基因组单核苷酸变异引起的DNA序列多态性，包括碱基转换、颠换、单碱基插入或缺失等。它是基因组中分布最广泛而稳定的点突变，在动植物的基因组中，存在着大量的SNPs，对于大规模的研究而言，它比微卫星标记和其他的重复序列更可靠，随着对SNP检测和分析技术进一步发展，尤其是与DNA芯片等技术的结合，它已成继第一代限制性片段长度多态性标记和第二代微卫星多态性标记之后的第三代新型分子标记。目前，各国学者在遗传育种方面已展开对SNPs的研究，作为新一代的遗传标记技术，SNPs将在生物的遗传多样性分析、基因标记、连锁图谱的构建、基因组结构与功能研究、遗传改良和医学研究等领域发挥巨大作用。其检测方法包括PCR-SSCP、PCR-RFLP、SNP芯片及测序等。
[0005] 长链酰基辅酶A脱氢酶(acyl-CoA dehydrogenase，long chain ACADL)，是长链脂肪酸β-氧化起始步骤的催化酶，在长链脂肪酸β-氧化中起着重要作用，其调控机制主要包括调控表达以及调节其活性。辅酶A参与激活脂肪酸的代谢，脂肪酸的有效代谢可使机体避免高甘油三酯和高胆固醇造成的健康危害，它具有传递乙酰基的功能，是机体内乙酰化酶的辅酶，在糖类、蛋白和脂质的代谢中发挥着重要作用。ACADL不足或缺失造成的线粒体功能紊乱会引起肝脏脂肪变性或肝脏胰岛素抗性(Hong Ji,Mark I.Reduced Capacity for Fatty Acid Oxidation in Rats with Inherited Susceptibility to Diet-Induced Obesity[J].NIH Public Access Author Manuscript,2007,56(8):1124–1130)。蛋白质相互作用关系的网络分析表明，参与脂肪代谢的ACADL蛋白是肉鸡肝脏代谢反应的关键蛋白(岳颖.不同基因型肉仔鸡肝脏蛋白组学研究[D]:[硕士学位论文].北京:中国农业科学院，2013)。瘦蛋白(LP)能刺激脂肪组织分解，它能通过促进ACADL基因的转录和翻译，对脂肪酸在肝脏中的氧化代谢起到促进作用(张晶.猪脂肪沉积关键基因的初步筛选[D]:[硕士学位论文].郑州:河南农业大学，2012)。目前，ACADL基因的研究主要集中在人、小鼠、大鼠和牛等物种，对猪ACADL基因的研究报道较少，申请人对该基因在猪中进行了多态性研究和关联分析，为猪的遗传改良提供了重要的技术基础。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于获得与脂肪沉积性状相关的SNP分子标记及应用。从猪ACADL基因克隆得到一个特异的DNA片段，通过寻找SNP位点，并建立相应的SNP检测方法，分析该DNA片段与猪脂肪沉积性状的关系，为猪的标记辅助选择提供一种新的遗传标记。
[0007] 本发明通以下列技术方案实现：
[0008] 申请人通过对猪ACADL基因的分离克隆，发现了一种与猪脂肪沉积性状相关的SNP分子标记，该标记的核苷酸序列如下所示：
[0009] GTGGAAAATGGAATGAAAGGATTTGTTAAGGGGCGAAAGCTACATAAAATAGGACTAAAAGCTCAGGTAAGCCATAATATAAATTTGTATTTATAATATAACTTACAATATAAATTGTTTGTAAATATAATTCATATTTATTATTTATTAATAAATTGAGTCTACTCATTACGTTTCCTGTATAGAATTACATATAGCACAATCGTACCTTCCTTCCTATGCTGGATTCTTAAAATATGCTTTTCAGTAATGATAGTGGTATTTCATTGTTTATGCAACTGTGGTCAGCAATGGAAGTGAATCAGTGTTTTGAAAATCTGCTTTAGAAGTGGCAACATTAACTGCATGCTAATAGACCCTCTAGTTATGAAATGGATGAAAAAAATATGAAATAAGAACAGAAAATATTTTTTCTACTATTTGGTAATTTTTTCATTACCAAAAAGAAAAGCATGTTTTATTTGATAGGCATTAGAAATCCTTAATCCTCAATACCTWCAGAACTGGRCAGTATTAGAGCTAGAATGATAATGTATTGCAGTGGGAAAGTCACTTTTGGAATCAGTGGGAAATGGGTTTGAATCCCTGGTTTACCACTTACGAGTTGTGTTCATTAACCACTCCAACTTGGTTTTCAGTTTTGTTTTATTTTGTTTTTAATGGAAATAATATTAGTCTCATCAGGTTATTGG
[0010] 上述序列中的第498bp处的W是A或T，508bp处的R是A或G，由于没有引起酶切位点的改变，所以我们采用直接测序的方法进行检测。
[0011] 申请人设计了扩增上述猪ACADL基因片段的引物对(该引物对也是检测本发明的分子标记的引物对)，其DNA序列如下所示：
[0012] 正向引物：5’GTGGAAAATGGAATGAAAG 3’，与SEQ ID NO:2所示的序列对应。
[0013] 反向引物：5’CCAATAACCTGATGAGACT 3’。与SEQ ID NO:3所述的序列对应。
[0014] 本发明建立了一种筛选与猪脂肪沉积性状相关的分子标记的方法，具体步骤如下：
[0015] 提取猪基因组DNA，根据NCBI中公布的猪ACADL基因序列信息，设计PCR扩增引物对(该引物的序列如序列表SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示)，以大白猪、长白猪和梅山猪基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物纯化、克隆测序，获得如图3所示的核苷酸序列(在图3的序列中的W和R显示碱基突变位置，498bp处的W是A或T，508bp处的R是A或G)，并在大白×梅山F2代群体中进行基因型与猪脂肪沉积性状之间的关联分析检测。
[0016] 本发明为猪脂肪沉积性状的分子标记辅助育种提供了一个新的遗传标记。
[0018] 序列表SEQ ID NO:1是克隆的中国地方猪品种“大白猪”的核苷酸序列。序列长度为692bp，其中在该序列的第498bp处存在一个A/T替换，第508bp出存在一个G/A替换。(在图5和图6中显示的序列中是已经替换的碱基，突变位点分别是498bp和第508bp)。
[0019] 序列表SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3是本发明设计的引物对的DNA序列。
[0020] 序列表SEQ ID NO:4是克隆的中国地方猪猪种“梅山猪”的核苷酸序列。序列长度为692bp，其中在该序列的第498bp处存在一个T/A替换，第508bp出存在一个A/G替换。。
[0021] 图1：是本发明的总体技术路线图。
[0022] 图2：是猪ACADL基因第6内含子的扩增结果。
[0023] 琼脂糖浓度为1.5％；图中标记说明：泳道M：DL2000Marker；泳道1-3分别为大白猪、长白猪和梅山猪中的扩增片段，片段大小为692bp。
[0024] 图3：是猪ACADL基因片段核苷酸序列。图中加粗带框字母W和R代表碱基突变位置，带下划线序列代表引物位置。
[0025] 图4：本发明中检测ACADL基因第6内含子序列突变位点的测序图谱。
[0026] 图5：是本发明制备的遗传标记的核苷酸序列(大白猪)，序列长度为692bp,其中在第498bp处存在一个A碱基突变，508bp出存在一个G碱基突变。
[0027] 图6：是本发明制备的遗传标记的核苷酸序列(梅山猪)，序列长度为692bp,其中在第498bp处存在一个T碱基突变，508bp出存在一个A碱基突变。
具体实施方式
[0028] 实施例1猪ACADL基因片段的获得及多态性检测方法的建立
[0029] 1、猪基因组DNA的提取
[0030] 本发明的试验猪品种为大白猪、长白猪(为国外血缘猪品种)、梅山猪(为中国地方猪血缘品种)，样品均由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所动物胚胎与分子育种湖北省重点实验室提供，为常用品种。猪基因组DNA采用北京百泰克生物技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒(按该试剂盒说明书进行操作)提取，具体步骤如下所述：
[0031] (1)采集20-50mg猪的耳组织，用眼科手术剪剪成糊状后放入2ml的离心管中，加入200μl裂解液TL，用枪头吹打均匀。
[0032] (2)加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)，剧烈颠倒充分混匀，55℃水浴锅中消化过夜。
[0033] (3)加入200μl结合液CB(该试剂盒自带)，充分颠倒混匀，70℃放置10min。
[0034] (4)冷却后加入100μl异丙醇，剧烈颠倒充分混匀。
[0035] (5)用1mL的枪头吸取上述混合物，加入吸附柱AC中，10000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。
[0036] (6)加入500uL抑制物去除液IR(该试剂盒自带)，12000rpm离心30s，弃废液。
[0037] (7)加入700μl漂洗液WB，12000rpm离心30s，倒掉废液。
[0038] (8)重复操作步骤(7)。
[0039] (9)将吸附柱AC放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量去除漂洗液，以免残留的乙醇抑制下游反应。
[0040] (10)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置3-5min，12000rpm离心1min，将溶液收集到离心管中。
[0041] (11)对提取出的DNA的浓度及质量进行检测后置于-20℃下保存备用。
[0042] 2、猪ACADL基因片段的获得
[0043] (1)PCR扩增
[0044] 根据ACADL基因的基因组序列(GenBank登陆号：NC_D89478.1)设计以下引物对：
[0045] 正向引物：5’GTGGAAAATGGAATGAAAG 3’，
[0046] 反向引物：5’CCAATAACCTGATGAGACT 3’。
[0047] 利用上述引物在大白猪、长白猪和梅山猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR反应体系25μL，体系中各组分的浓度为100ng模板DNA、1×Taq buffer 2.5mmol/L、MgCl21.5mmol/L、dNTPs 2.5mmol/L、上述正反向引物各0.5mmol/L、1U TaqDNA聚合酶，PCR的运行程序如下：预变性94℃4min；然后94℃30s，56℃40s，72℃45s，34个循环；最后72℃继续延伸10min，PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检。
[0048] (2)PCR产物纯化
[0049] 上述PCR产物用上海生工生物工程有限公司的Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化，具体步骤如下：首先从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管，加入400μL溶胶液，50-60℃水浴至胶彻底融化，加热融胶时，每2min混匀一次，冷却至室温；将离心柱放入收集管中，把混合液移至离心柱，室温放置2min；12000r/min离心1min，此时DNA被吸附到柱上；倒掉收集管中废液，将离心柱放入同一个收集管中，加入700μL洗脱液，12000r/min离心1min；倒掉收集管中的废液，12000r/min离心1min；将离心柱放入一预先准备好的灭菌1.5mL离心管中，加入40μL洗脱液或双蒸水(pH＞7.0)，室温或37℃放置2-3min(提高洗脱温度至55-80℃有利于提高DNA的洗脱效率，可洗脱两次。)；12000r/min离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段。
[0050] 3、利用PCR产物直接测序法检测分子标记
[0051] 将上述获得的PCR产物直接送到北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序，直接从测序色谱图(见图4)上进行基因型分析。
[0052] 实施例2本发明的分子标记在不同猪群中的多态性分布检测验证[0053] 申请人在大白猪、长白猪和梅山猪三个群体中检测了猪ACADL基因两处多态性分布频率分布频率，检测结果如表1所示：在第498bp处的A/T多态性分布，在中国地方猪品种中A等位基因占主要优势，而在国外猪种中T等位基因占主要优势，中、外猪品种中存在显著差异。同时我们也检测到：在第508bp处的A/G多态性分布，在中国地方猪品种中A等位基因占主要优势，而在国外猪种中G等位基因占主要优势。中、外猪品种中也存在显著差异。
[0054] 表1 ACADL基因第6内含子两SNPs的等位基因在不同品种中的分布结果[0055]
[0056] 实施例3本发明克隆的分子标记与猪脂肪沉积性状的关联分析及应用[0057] 1、单体型的构建
[0058] 将上述利用PCR-直接测序法得到的所有的个体的两个多态位点的基因型数据输入Haploview软件(一种自由下载软件)，可以计算得到各个体的单倍型，同时计算位点之间的成对连锁不平衡程度，用标准化的连锁不平衡系数D’表示。结果发现两个位点间连锁不平衡系数D’等于1，即为完全连锁不平衡。两种单体型AA和TG占所有等位基因的频率分别为38.6％和61.4％，构成3种单体型组合AA/AA，AA/TG，TG/TG。
[0059] 2、单体型组合与猪生产性状的关联分析
[0060] 用于关联分析的试验猪群为308头大白×梅山F2代资源群体，该生物材料已经发表，参见文献Liu et al.Association of MYF5and MYOD1 gene polymorphisms and meat quality traits in Large White×Meishan F2 pig populations.Biochem Genet.2008,46:720-732(血样委托华中农业大学猪遗传育种农业部重点实验室采集)，采用实施例1所建立的PCR-直接测序法进行多态性检测，用SAS统计软件(SAS Institute Inc,Version 8.0)GLM程序进行方差分析，分析猪RTL1基因3种不同单体型组合与猪胴体和肉质性状的相关关系，所采用模型为：
[0061] Yijk＝μ+Gi+Sj+Yk(+bijkXijk)+eijk
[0062] Yijk为性状表型值，μ为平均值，Gi为基因型效应，Sj、Yk为固定效应，分别为性别、年度效应，bijk为屠宰体重或屠宰日龄的回归系数，胴体性状以屠宰体重为协变量，肉质性状以屠宰日龄为协变量，eijk为残差效应。结果列于表2。
[0063] 由表2可以看出：基因型不同时，肩部膘厚、6-7腰椎间膘厚、臀部膘厚和背最长肌肌内脂肪含量等性状存在显著差异(P<0.05)平均背膘厚性状存在极显著差异(P<0.01)，单倍型TG/TG有利于降低脂肪含量，单倍型AA/AA是提高肌内脂肪含量的优势基因型。
[0064] 表2 猪ACADL基因第6内含子单体型组合与脂肪性状的统计分析表[0065]
[0066] 注：(1)、以上数值为最小二乘均值±标准误；同行含有相同字母表示差异不显著，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)；基因型效应*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。
[0067] 主要参考文献
[0068] 1.栾贻宏,路宁,王基伟,等.辅酶A的生化功能和应用[J].中国生化药物杂志,2003,24(3):159-161.
[0069] 2.臧莎莎等，胰岛素抵抗大鼠骨骼肌脂质沉积及线粒体功能的影响[J].中成药,2014,36(7):1371-1376.
[0071] 4.Hong Ji,Mark I.Reduced Capacity for Fatty Acid Oxidation in Rats with Inherited Susceptibility to Diet-Induced Obesity[J].NIH Public Access Author Manuscript,2007,56(8):1124–1130.
[0072] 5.岳颖.不同基因型肉仔鸡肝脏蛋白组学研究[D]:[硕士学位论文].北京:中国农业科学院,2013.
[0073] 6.谢棒详.用Affymetrix芯片筛选前列腺癌进展相关基因及功能初探[D]:[博士学位论文].北京:中国人民解放军军事医学科学院,2008.
[0074] 7.Maher AC,Mohsen AW,Vockley J,et al.Low expression of long-chain acyl-CoA dehydrogenase in human skeletal muscle[J].Molecular Genetics and Metabolism.2010；100(2)；163-167.
[0075] 8.张晶.猪脂肪沉积关键基因的初步筛选[D]:[硕士学位论文].郑州:河南农业大学,2012。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 专利撰写图文匹配系统及其匹配方法 | 2020-05-11 | 244 |
| 专利摘要附图下载方法及系统 | 2020-05-11 | 281 |
| 六定位平装式车箱开关 | 2020-05-11 | 434 |
| 空调器及其面板和用于制作、使用、加固面板的方法及装置 | 2020-05-13 | 34 |
| 高温超导体 | 2020-05-12 | 693 |
| 专利首页摘要附图切割方法及系统 | 2020-05-11 | 401 |
| 一种重力增能的方法及产品设计方案 | 2020-05-12 | 423 |
| 内陆城市水资源良性循环与水污染全面治理法 | 2020-05-12 | 216 |
| 打窝器 | 2020-05-12 | 46 |
| 经天纬地市区高速公路网 | 2020-05-13 | 664 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈