调控PvGRF9含量或活性的物质在调控植物茎生长发育中的应用
阅读：873发布：2023-02-21
专利汇可以提供调控PvGRF9含量或活性的物质在调控植物茎生长发育中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了调控PvGRF9含量或活性的物质在调控 植物 茎生长发育中的应用。本发明公开的应用中，PvGRF9为如下A1)、A2)或A3)：A1) 氨 基酸序列是序列1的 蛋白质 ；A2)将 序列表 中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。本发明发现PvGRF9可以正调控植物茎的生长发育以及茎的细胞壁木质素含量，对柳枝稷及其它植物提高 生物 量遗传育种具有重要意义。，下面是调控PvGRF9含量或活性的物质在调控植物茎生长发育中的应用专利的具体信息内容。
1.蛋白质或调控所述蛋白质含量或活性的物质在调控植物茎生长发育中的应用；
所述蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；
A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.与权利要求1中所述的蛋白质相关的生物材料在调控植物茎生长发育中的应用；所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B8)降低权利要求1中所述蛋白质表达量、含量或活性的核酸分子；
B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b11)-b16)中的任一种：
b11)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；
b12)序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子；
b13)序列表中序列3所示的cDNA分子或DNA分子；
b14)序列表中序列6所示的cDNA分子或DNA分子；
b15)与b11)或b12)或b13)或b14)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；
b16)在严格条件下与b11)或b12)或b13)或b14)或b15)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述植物茎生长发育体现在茎的长度和/或粗度上。
5.下述任一方法：
X1)培育株高增加植物的方法，包括使受体植物中表达权利要求1中所述蛋白质，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比株高增加的目的植物；
X2)促进植物株高增加的方法，包括使受体植物中表达权利要求1中所述蛋白质，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比株高增加的目的植物，实现植株株高的增加；
X3)培育株高降低植物的方法，包括降低受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，或降低受体植物中权利要求1中所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比株高降低的目的植物；
X4)降低植物株高的方法，包括降低受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，或降低受体植物中权利要求1中所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比株高降低的目的植物，实现株高的降低；
X5)培育茎粗增加植物的方法，包括使受体植物中表达权利要求1中所述蛋白质，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比茎粗增加的目的植物；
X6)促进植物茎粗增加的方法，包括使受体植物中表达权利要求1中所述蛋白质，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比茎粗增加的目的植物，实现植物茎粗的增加；
X7)培育干物质增加植物的方法，包括使受体植物中表达权利要求1中所述蛋白质，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比干物质增加的目的植物；
X8)促进植物干物质积累的方法，包括使受体植物中表达权利要求1中所述蛋白质，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比干物质增加的目的植物，实现促进植物干物质的积累；
X9)培育木质素增加植物的方法，包括使受体植物中表达权利要求1中所述蛋白质，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比木质素含量增加的目的植物；
X10)促进植物木质素积累的方法，包括使受体植物中表达权利要求1中所述蛋白质，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比木质素含量增加的目的植物，实现促进植物木质素的积累；
X11)培育生物量增加植物的方法，包括使受体植物中表达权利要求1中所述蛋白质，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比生物量增加的目的植物；
X12)提高植物生物量的方法，包括使受体植物中表达权利要求1中所述蛋白质，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比生物量增加的目的植物，实现生物量的提高。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：X1)、X2)和X5)-X12)所述方法均通过向所述受体植物中导入权利要求1中所述蛋白质的编码基因并使所述编码基因得到表达实现；
X3)和X4)所述方法均通过向所述受体植物中导入权利要求1中所述蛋白质与SRDX形成的融合蛋白质的编码基因并使所述编码基因得到表达实现；所述SRDX为序列表中序列5所示的蛋白质。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述编码基因为权利要求2或3中B1)所述核酸分子。
8.具有如下D1)-D7)中任一功能的产品，含有权利要求1中所述蛋白质或权利要求2或3中所述生物材料：
D1)调控植物茎的生长发育；
D2)促进植物株高的增加；
D3)降低植物株高；
D4)促进植物茎粗度的增加；
D5)促进植物干物质的积累；
D6)促进植物木质素的积累；
D7)提高植物生物量。
9.根据权利要求1-4中任一所述的应用，或权利要求5-7中任一所述的方法，或权利要求8所述的产品，其特征在于：所述植物为M1)或M2)或M3)：
M1)单子叶植物或双子叶植物；
M2)禾本科植物；
M3)柳枝稷。
调控PvGRF9含量或活性的物质在调控植物茎生长发育中的
应用
技术领域
背景技术
[0002] 柳枝稷(Panicum virgatum L.)属禾本科(Gramineae)黍亚科(Panicoideae)黍属，是一种多年生的C4草本植物，原产于北美中部和东部的大片地区，并向南延伸至中美洲。柳枝稷以品种众多，适应性强，较高的纤维含量及易降解等特性，作为生态恢复、新型能源原料和饲料作物的基础物种，受到研究者的广泛关注。目前，对柳枝稷遗传改良主要集中于提高生物量和品质两个方面。茎秆是柳枝稷生物量的主要组成部分，提高茎秆高度可显著提高植株生物量。降低柳枝稷细胞壁木质素含量是降低细胞壁抗降解性，提高品质的一个策略。
[0003] GRF(Growth regulating factor)是一类生长调控因子，植物体内特有的转录因子家族，包含多个成员。
发明内容
[0004] 本发明所要解决的技术问题是如何调控植物茎的生长发育。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种来源于柳枝稷的蛋白质(其名称为PvGRF9) 或调控PvGRF9含量或活性的物质在调控植物茎生长发育中的应用；
[0006] PvGRF9为如下A1)、A2)或A3)：
[0007] A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；
[0009] A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
[0010] 为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
[0011] 表：标签的序列
[0012]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
[0013] 上述A2)中的PvGRF9蛋白质，为与序列1所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。
[0014] 上述A2)中的PvGRF9蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0015] 上述A2)中的PvGRF9蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或 3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列2所示的DNA分子编码序列1所示的 PvGRF9蛋白质。
[0016] 本发明还提供了与PvGRF9相关的生物材料在调控植物茎生长发育中的应用；所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：
[0017] B1)编码PvGRF9的核酸分子；
[0018] B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
[0019] B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
[0020] B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
[0021] B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
[0022] B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
[0023] B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
[0024] B8)降低PvGRF9表达量、含量或活性的核酸分子；
[0025] B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。
[0026] B1)所述核酸分子可为如下b11)-b16)中的任一种：
[0027] b11)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；
[0028] b12)序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子；
[0029] b13)序列表中序列3所示的cDNA分子或DNA分子；
[0030] b14)序列表中序列6所示的cDNA分子或DNA分子；
[0031] b15)与b11)或b12)或b13)或b14)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码PvGRF9的cDNA分子或DNA分子；
[0032] b16)在严格条件下与b11)或b12)或b13)或b14)或b15)限定的核苷酸序列杂交，且编码PvGRF9的cDNA分子或DNA分子。
[0033] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0034] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码PvGRF9蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的PvGRF9蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码PvGRF9蛋白质且具有PvGRF9蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0035] 这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或 90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0036] 上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS 中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃， 0.5×SSC，
0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、 0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％ SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，
0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE (或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、 0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％ SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，
0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE (或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
[0037] 上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
[0038] 上述应用中，B2)所述的含有编码PvGRF9蛋白质的核酸分子的表达盒(PvGRF9基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达PvGRF9蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动PvGRF9基因转录的启动子，还可包括终止PvGRF9基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH (苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP 启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128 (CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-
3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人 (1987)Gene,56:
125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot (1991)Cell,64:671；
Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人 (1987)Gene,56:
125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot (1991)Cell,64:671；
Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
[0039] 可用现有的表达载体构建含有所述PvGRF9基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、 pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、PSN1301或pCAMBIA1391-Xb (CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0040] 上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pZh01 载体或pZh01-SRDX载体。
[0041] B3)所述重组载体具体可为pZh01-PvGRF9或pZh01-rPvGRF9。所述pZh01-PvGRF9为将 pZh01载体的XbaI和KpnI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列2所示的DNA片段得到的重组载体。所述pZh01-rPvGRF9为将pZh01载体的XbaI和KpnI识别序列间的DNA 片段替换为序列表中序列6所示的DNA片段得到的重组载体。
[0042] B9)所述重组载体可为pZh01-PvGRF9-SRDX。所述pZh01-PvGRF9-SRDX为将pZh01-SRDX 载体的XbaI和BamHI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列4所示的DNA片段得到的重组载体。所述pZh01-SRDX载体将pZh01载体的BamH1和Sal1识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列4所示的SRDX序列得到的重组载体。
[0044] 上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
[0045] 所述植物茎生长发育可体现在茎的长度和/或粗度上。
[0046] 所述粗度可体现在茎的直径上。
[0047] 本发明还提供了下述任一方法：
[0048] X1)培育株高增加植物的方法，包括使受体植物中表达PvGRF9，或提高受体植物中PvGRF9 的含量，或提高受体植物中PvGRF9的活性，得到与所述受体植物相比株高增加的目的植物；
[0049] X2)促进植物株高增加的方法，包括使受体植物中表达PvGRF9，或提高受体植物中PvGRF9 的含量，或提高受体植物中PvGRF9的活性，得到与所述受体植物相比株高增加的目的植物，实现植株株高的增加；
[0050] X3)培育株高降低植物的方法，包括降低受体植物中PvGRF9的含量，或降低受体植物中 PvGRF9的活性，得到与所述受体植物相比株高降低的目的植物；
[0051] X4)降低植物株高的方法，包括降低受体植物中PvGRF9的含量，或降低受体植物中PvGRF9 的活性，得到与所述受体植物相比株高降低的目的植物，实现株高的降低；
[0052] X5)培育茎粗增加植物的方法，包括使受体植物中表达PvGRF9，或提高受体植物中PvGRF9 的含量，或提高受体植物中PvGRF9的活性，得到与所述受体植物相比茎粗增加的目的植物；
[0053] X6)促进植物茎粗增加的方法，包括使受体植物中表达PvGRF9，或提高受体植物中PvGRF9 的含量，或提高受体植物中PvGRF9的活性，得到与所述受体植物相比茎粗增加的目的植物，实现植物茎粗的增加；
[0054] X7)培育干物质增加植物的方法，包括使受体植物中表达PvGRF9，或提高受体植物中 PvGRF9的含量，或提高受体植物中PvGRF9的活性，得到与所述受体植物相比干物质增加的目的植物；
[0055] X8)促进植物干物质积累的方法，包括使受体植物中表达PvGRF9，或提高受体植物中 PvGRF9的含量，或提高受体植物中PvGRF9的活性，得到与所述受体植物相比干物质增加的目的植物，实现促进植物干物质的积累；
[0056] X9)培育木质素增加植物的方法，包括使受体植物中表达PvGRF9，或提高受体植物中 PvGRF9的含量，或提高受体植物中PvGRF9的活性，得到与所述受体植物相比木质素含量增加的目的植物；
[0057] X10)促进植物木质素积累的方法，包括使受体植物中表达PvGRF9，或提高受体植物中 PvGRF9的含量，或提高受体植物中PvGRF9的活性，得到与所述受体植物相比木质素含量增加的目的植物，实现促进植物木质素的积累；
[0058] X11)培育生物量增加植物的方法，包括使受体植物中表达PvGRF9，或提高受体植物中 PvGRF9的含量，或提高受体植物中PvGRF9的活性，得到与所述受体植物相比生物量增加的目的植物；
[0059] X12)提高植物生物量的方法，包括使受体植物中表达PvGRF9，或提高受体植物中PvGRF9 的含量，或提高受体植物中PvGRF9的活性，得到与所述受体植物相比生物量增加的目的植物，实现生物量的提高。
[0060] 所述干物质可为茎的干物质。
[0061] 所述粗度可体现在茎的直径上。
[0062] 所述木质素增加可为茎中木质素的增加。
[0063] 所述木质素积累可为茎中木质素的积累。
[0064] 所述生物量可为茎的生物量。
[0065] X1)、X2)和X5)-X12)所述方法均可通过向所述受体植物中导入PvGRF9的编码基因并使所述编码基因得到表达实现。X1)、X2)和X5)-X12)所述方法具体可通过向所述受体植物中转化所述pZh01-PvGRF9或所述pZh01-rPvGRF9实现。
[0066] X3)和X4)所述方法均通过向所述受体植物中导入PvGRF9与SRDX形成的融合蛋白质的编码基因并使所述编码基因得到表达实现；所述SRDX为序列表中序列5所示的蛋白质。X3) 和X4)所述方法具体可通过向所述受体植物中转化所述pZh01-PvGRF9-SRDX实现。
[0067] 所述PvGRF9的编码基因可为上文B1)所述核酸分子。
[0068] 上述方法中，其中所述PvGRF9的编码基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：
[0069] 1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述PvGRF9的编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；
[0070] 2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
[0071] 3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
[0072] 4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV 的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
[0073] 5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。
[0074] 所述PvGRF9的编码基因可利用含有所述PvGRF9的编码基因的重组表达载体导入受体植物。所述重组表达载体具体可为所述pZh01-PvGRF9或所述pZh01-rPvGRF9。。
[0075] 所述重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for Plant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition).)。
[0076] 所述目的植物理解为不仅包含PvGRF9蛋白或其编码基因被改变的第一代植物，也包括其子代。对于所述目的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述目的植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
[0077] 本发明还提供了具有如下D1)-D7)中任一功能的产品，所述产品含有PvGRF9或所述生物材料：
[0078] D1)调控植物茎的生长发育；
[0079] D2)促进植物株高的增加；
[0080] D3)降低植物株高；
[0081] D4)促进植物茎粗度的增加；
[0082] D5)促进植物干物质的积累；
[0083] D6)促进植物木质素的积累；
[0084] D7)提高植物生物量。
[0085] 所述产品可以PvGRF9或所述生物材料作为其活性成分，还可将PvGRF9或所述生物材料与其他具有相同功能的物质一起作为其活性成分。
[0086] 本发明中，所述植物可为M1)或M2)或M3)：
[0087] M1)单子叶植物或双子叶植物；
[0088] M2)禾本科植物；
[0089] M3)柳枝稷。
[0090] 所述干物质可为茎的干物质。
[0091] 所述粗度可体现在茎的直径上。
[0092] 所述木质素增加可为茎中木质素的增加。
[0093] 所述木质素积累可为茎中木质素的积累。
[0094] 所述生物量可为茎的生物量。
[0096] 图1为PvGRF9相关植物表达载体结构图。
[0097] (a)pZh01-PvGRF9-SRDX载体结构图；(b)pZh01-PvGRF9植物表达载体图， pZh01-PvGRF9-OX表示pZh01-PvGRF9；(c)rPvGRF9突变位点；(d)pZh01-rPvGRF9植物表达载体图，pZh01-rPvGRF9-OX表示pZh01-rPvGRF9。
[0098] 注：35S：烟草花叶病毒35S启动子；NOS：终止子；HTP：潮霉素抗性基因；LB和RB： T-DNA的左端和右端。
[0099] 图2为转基因植株PCR扩增产物电泳图。
[0100] 注：M：DNA marker；+：阳性对照， r9ox图中“+”表示植物表达载体pZh01-rPvGRF9，9sr图中“+”表示植物表达载体pZh01-Pv GRF9-SRDX；WT：野生型；9sr：转PvGRF9-SRDX基因的潮霉素抗性植株；r9ox：转rPvGRF9基因的潮霉素抗性植株。9sr图中泳道36、2、4、25、52、
42、14和3为转PvGRF9-SRDX基因阳性植株，r9ox图中1、2、12、21、19、20、9、11、21、10均为转rPvGRF9基因阳性植株。
42、14和3为转PvGRF9-SRDX基因阳性植株，r9ox图中1、2、12、21、19、20、9、11、21、10均为转rPvGRF9基因阳性植株。
[0101] 图3为转基因植株中目的基因表达水平分析。
[0102] 注：9sr：转PvGRF9-SRDX基因植株中PvGRF9-SRDX基因的表达水平；r9ox：转 rPvGRF9基因植株中rPvGRF9基因的表达水平；9ox：转PvGRF9基因植株中 PvGRF9基因的表达水平；WT：野生型柳枝稷；L：低度表达；M：中度表达；H高度表达。每个株系的表达量均为平均值±标准差(n＝3)。
[0103] 图4为野生型柳枝稷和PvGRF9相关转基因植株形态。
[0104] (a)野生型和转PvGRF9-SRDX基因植株形态；(b)WT和转rPvGRF9基因、转PvGRF9基因植株形态；(c)WT和转基因植株茎秆形态。
[0105] 注：9sr：转PvGRF9-SRDX基因植株；r9ox和rGRF9-OX：转rPvGRF9基因植株；9ox和 GRF9-OX：转PvGRF9基因植株；WT：野生型；L：低度表达；M：中度表达；H高度表达。
[0106] 图5为野生型和PvGRF9相关转基因植株高度(a)茎秆干物质量(b)比较。
[0107] 注：9sr：转PvGRF9-SRDX基因植株；r9ox：转rPvGRF9基因植株；9ox：转PvGRF9基因植株；WT1和WT2：两株野生型柳枝稷；L：低度表达；M：中度表达；H高度表达。误差线代表4个生物学重复的SD值。标有不同字母的数据间差异显著(P<0.05)。
[0108] 图6为野生型柳枝稷和PvGRF9相关转基因植株克莱森木质素含量测定结果。
[0109] 注：9sr：转PvGRF9-SRDX基因植株；r9ox：转rPvGRF9基因植株；9ox：转PvGRF9基因植株；WT：野生型柳枝稷；L：低度表达；M：中度表达；H高度表达。数值代表平均值±标准差(n＝3)，每个生物学重复包括5个技术重复。标有不同字母的数据间差异显著(P< 0.05)。
[0110] 图7为野生型柳枝稷和PvGRF9相关转基因植株酶解效率。
[0111] 注：数值代表平均值±标准差(n＝3)。每个生物学重复含有5次技术重复。不同的字母表示P<0.05水平差显著。9sr：过表达PvGRF9-SRDX转基因植株；r9ox：过表达rPvGRF9 转基因植株；WT：野生型；L：低度表达；M：中度表达。标有不同大写字母的数据间差异显著(P<0.05)，标有不同小写字母的数据间差异显著(P<0.05)。
[0112] 图8为转基因植株PCR检测结果。
[0113] 注：M：DNA marker；OE17：过表达miR396转基因植株；WT：野生型柳枝稷；+：阳性对照；9ox/OE17：OE17背景下转PvGRF9基因株系；r9ox/OE17：OE17背景下转rPvGRF9基因株系。9ox/OE17结果中，L4、H6、H8、M19、M27、L41和L43均为转PvGRF9基因阳性植株；r9ox/OE17 结果中，L1、L4、M19、H6、M27、L41、H10和H49均为转rPvGRF9基因阳性植株。
[0114] 图9为转基因植株PvGRF9表达量qRT-PCR检测
[0115] 注：OE17：过表达miR396转基因植株；WT：野生型柳枝稷；9ox/OE17：OE17背景下转 PvGRF9基因株系；r9ox/OE17：OE17背景下转rPvGRF9基因植株。L：低度表达；M：中度表达；H高度表达。数值代表平均值±标准差(n＝3)。
[0116] 图10为野生型柳枝稷和转基因植株形态。
[0117] WT、OE17、9ox/OE17和r9ox/OE17植株(a)、茎(b)、节长(c)形态。
[0118] 注：OE17：过表达miR396转基因植株；WT：野生型柳枝稷；9ox/OE17：在OE17背景下转PvGRF9基因株系；r9ox/OE17：在OE17背景下转rPvGRF9基因株系；L：低度表达；M：中度表达；H：高度表达。
[0119] 图11为转基因植株形态特征统计结果。
[0120] WT、OE17、9ox/OE17和r9ox/OE17植株高度(a)、每株茎秆干物质量(b)统计分析。
[0121] 注：OE17：过表达miR396转基因植株；WT：野生型柳枝稷；9ox/OE17：在OE17背景下 转PvGRF9基因；r9ox/OE17：在OE17背景下转rPvGRF9基因；L：低度表达；M：中度表达； H高度表达。数值代表平均值±标准差(n＝4)，图中每个生物学重复含有20个技术重复。标 有不同字母数据间差异显著(P<0.05)。
[0122] 图12为野生型柳枝稷和转基因植株克莱森木质素含量测定结果。
[0123] 注：OE17：过表达miR396转基因植株；WT：野生型柳枝稷；9ox/OE17：在OE17背景下转PvGRF9基因；r9ox/OE17：在OE17背景下转rPvGRF9基因；L：低度表达；M：中度表达； H高度表达。数值代表平均值±标准差(n＝3)，每个生物学重复含有5个技术重复。标有不同字母数据间差异显著(P<0.05)。
[0124] 图13为野生型柳枝稷和转基因植株酶解效率检测结果。
[0125] (a)直接酶解效率；(b)样品预处理后酶解效率。
[0126] 注：OE17：过表达miR396转基因植株；WT：野生型柳枝稷；9ox/OE17：在OE17背景下转PvGRF9基因；r9ox/OE17：在OE17背景下转rPvGRF9基因；L：低度表达；M：中度表达； H高度表达。数值代表平均值±标准差(n＝3)，每个生物学重复含有5个技术重复。同一图中标有不同字母数据间差异显著(P<0.05)。
[0127] 图14为PvGRFs在柳枝稷不同部位的表达量检测结果。a为小花结构图，b-l为不同PvGRFs 基因的检测结果。
[0128] 注：各值为平均值±标准差(n＝3)。
[0129] 图15为PvGRF9原位杂交表示PvGRF9在茎维管束筛管细胞中表达。
[0130] (a)红色荧光标记PvGRF9在柳枝稷横切面未成熟茎(S1)维管束中的表达部位。箭头所 指处为维管束筛管细胞，具有红色荧光标记；(b)S1横切面维管束中细胞核DAPI显色(蓝色 荧光)；(c)图a与b重叠后的图示。
[0131] 注：标尺代表100μm。
具体实施方式
[0132] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应 DNA/RNA的3′末端核苷酸。
[0133] 下述实施例中的pZh01载体(Xiao H.,Wang Y.,Liu D.,Wang W.,Li X.,Zhao X., Xu J.,Zhai W.,Zhu L.(2003)Functional analysis of the rice AP3homologue OsMADS16 by RNA interference.Plant Molecular Biology,52,957-966)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0134] 本发明发现一个来源于柳枝稷(Panicum virgatum L.)Alamo(Hardin C F,Fu C,Hisano H,Xiao X,Shen H,Jr.Stewart C N,Parrott W,Dixon R A,Wang Z.Standardization of switchgrass sample collection for cell wall and biomass trait analysis[J]. BioEnergy Research,2013,6(2):755-762)的蛋白质可以调控柳枝稷茎的生长发育，并且还可以正调控柳枝稷细胞壁木质素含量，该蛋白质的名称为PvGRF9，在柳枝稷Alamo中，该蛋白质的氨基酸序列为序列表中序列1，由序列表中序列2所示的PvGRF9基因的CDS 序列编码，PvGRF9基因的序列为序列表中序列3。
[0135] 下文所用野生型柳枝稷均为柳枝稷Alamo。
[0136] E3期是指分蘖具有3个可见的节点时期(Hardin C F,Fu C,Hisano H,Xiao X,Shen H,Jr.Stewart C N,Parrott W,Dixon R A,Wang Z.Standardization of switchgrass sample collection for cell wall and biomass trait analysis[J].BioEnergy Research,2013, 6(2):755-762)。
[0137] 实施例1、PvGRF9及其编码基因可以调控柳枝稷植株高度、茎秆干物质量和木质素含量
[0138] 本实施例通过在野生型柳枝稷进行转基因实验检测了PvGRF9及其编码基因的功能，检测步骤如下：
[0139] 一、重组载体的构建
[0140] PvGRF9基因植物表达载体pZh01-PvGRF9：以野生型柳枝稷的cDNA为模板，采用引物 GRF9(OX)_XbaF和GRF9(OX)_KpnR进行PCR扩增，得到PCR产物；利用限制性内切酶XbaI 和KpnI酶切PCR产物，将得到的酶切产物与pZh01载体经XbaI和KpnI双酶切得到的载体骨架相连，将得到的序列正确的重组载体记为pZh01-PvGRF9。pZh01-PvGRF9为将pZh01 载体的XbaI和KpnI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列2所示的DNA片段得到的重组载体(图1中b)，该重组载体能表达序列表中序列1所示的PvGRF9蛋白质，该蛋白质的表达由35S驱动。
[0141] PvGRF9显性抑制植物表达载体pZh01-PvGRF9-SRDX：利用嵌合子沉默技术抑制PvGRF9 活性，以上文GRF9(OX)_XbaF和GRF9(OX)_KpnR的PCR产物为模板，用引物PvGRF9 (SDRX)_XbaF和PvGRF9(SRDX)_BamR进行PCR扩增，得到PCR产物，将该PCR产物利用XbaI 和BamHI进行双酶切，将得到的酶切产物与pZh01-SRDX载体经XbaI和BamHI双酶切得到的载体骨架相连，得到重组载体，将序列正确的重组载体命名为pZh01-PvGRF9-SRDX。pZh01-PvGRF9-SRDX为将pZh01-SRDX载体的XbaI和BamHI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列2的第1-1272位所示的DNA片段得到的重组载体(图1中a)，该重组载体中序列2的第1-1272位所示的DNA片段与3’端的SRDX序列形成融合基因PvGRF9-SRDX(图1中 a)，能表达PvGRF9与SRDX形成的融合蛋白质，该融合蛋白质可以竞争性的与PvGRF9互作的元件相结合，用于间接抑制PvGRF9活性(Hiratsu K,Matsui K,Koyama T,Ohme-Takagi M (2003)Dominant repression of target genes by chimeric repressors that include the EAR motif,a repression domain,in Arabidopsis.Plant J 34:733–739)。
[0142] pZh01-SRDX载体的制备方法如下：将pZh01载体的BamH1和Sal1识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列4所示的SRDX序列，得到重组载体，将该重组载体记为pZH01-SRDX 载体，pZH01-SRDX载体能表达序列表中序列5所示的蛋白质SRDX。
[0143] SRDX序列：GGATCC CTGGATCTGGATCTGGAACTGCGCCTGGGCTTTGCGTAAGTCGAC(序列表中序列 4，下划线分别为BamH1和Sal1的识别序列)。
[0144] 突变型rPvGRF9基因植物表达载体pZh01-rPvGRF9：根据密码子简并性原则同义突变 PvGRF9基因miR396靶位点处核苷酸序列，得到突变基因，记为rPvGRF9基因，rPvGRF9基因的序列为序列表中序列6，rPvGRF9基因与PvGRF9基因编码的蛋白质序列相同，rPvGRF9基因与PvGRF9基因的不同核苷酸见图1中c。以上文GRF9(OX)_XbaF和GRF9(OX)_KpnR的PCR 产物为模板，分别利用引物GRF9(OX)_XbaF和rGRF9_R扩增基因的上半段序列，利用引物 GRF9(OX)_KpnR和rGRF9_F扩增基因的下半段序列；然后以上半段和下半段序列的混合物为模板，利用引物GRF9(OX)_XbaF和GRF9(OX)_KpnR进行PCR扩增，得到PCR产物；将该PCR 产物利用XbaI和KpnI进行双酶切，将得到的酶切产物与pZh01载体经XbaI和KpnI双酶切得到的载体骨架相连，将得到的序列正确的重组载体记为pZh01-rPvGRF9。pZh01-rPvGRF9 为将pZh01载体的XbaI和KpnI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列6所示的DNA 片段得到的重组载体(图1中d)，该重组载体能表达序列表中序列1所示的PvGRF9蛋白质，该蛋白质的表达由35S驱动。
[0145] 表1、引物序列
[0146]
[0147] 注：表1中下划线标记序列为限制性内切酶识别序列。
[0148] 二、转基因植物的制备
[0149] 农杆菌介导的遗传转化：采用热激转化方法将构建好的PvGRF9相关植物表达载体(即步骤一的pZh01-PvGRF9、pZh01-PvGRF9-SRDX和pZh01-rPvGRF9)分别转化至根癌农杆菌EHA105 中，通过在含有100mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的YEP培养基筛选及菌液PCR验证，确定植物表达载体成功转入EHA105农杆菌中。然后利用文献“Liu Y,Cen H,Yan J,Zhang Y, Zhang W.Inside out:high-efficiency plant regeneration and agrobacterium-mediated transformation of upland and lowland switchgrass cultivars[J].Plant Cell Reports, 2015,34:1099-1108”中的农杆菌介导的遗传转化方法进行遗传转化，所用受体植物为柳枝稷Alamo。
[0150] 通过潮霉素筛选，利用pZh01-PvGRF9获得转PvGRF9基因的潮霉素抗性植株20株；利用 pZh01-rPvGRF9获得转rPvGRF9基因的潮霉素抗性植株19株，利用pZh01-PvGRF9-SRDX获得转PvGRF9-SRDX基因的潮霉素抗性植株25株。
[0151] PvGRF9相关转基因植株PCR检测：为了检测含有目的基因的载体片段是否整合到植物基因组中，采用CTAB法提取野生型及抗性转基因植株幼嫩叶片的基因组DNA。以转基因抗性植株DNA为模板，野生型柳枝稷植株(WT，即受体植物)为阴性对照，分别以各自所用植物表达载体为阳性对照(+)，利用35S_F和表1的GRF9(OX)_KpnR为引物扩增rPvGRF9基因特异片段，利用35S_F和表1的PvGRF9(SRDX)_BamR为引物扩增融合基因PvGRF9-SRDX特异片段，利用35S_F和表1的GRF9(OX)_KpnR为引物扩增PvGRF9基因特异片段。
[0152] 35S_F：5′-CGCACAATCCCACTATCCTTC-3′。
[0153] 部分鉴定结果如图2所示，转基因阳性植株扩增得到与阳性对照(+)大小一致的条带，阴性对照(WT)未扩增出目的条带，说明载体片段已整合进入植物基因组中。通过PCR检测确定获得转rPvGRF9基因阳性植株(记为r9ox)17个；转PvGRF9-SRDX基因阳性植株(记为 9sr)20个，转PvGRF9基因阳性植株(记为9ox)15个。
[0154] PvGRF9相关转基因植株qRT-PCR检测：
[0155] 为了检测转基因植株中目的基因表达量，通过qRT-PCR对目的基因在转基因植株中的表达量进行检测和分析。以转基因PCR阳性植株cDNA为模板，持家基因ubiquitin为内参基因，检测转基因植株中目的基因相对表达量。根据转基因植株相对表达量差异，将各载体转基因植株分为低表达(L)、中度表达(M)、高度表达(H)三组。利用野生型柳枝稷植株作为对照。
[0156] 检测9sr中PvGRF9-SRDX基因表达量、检测r9ox中rPvGRF9基因表达量以及检测9ox中 PvGRF9基因表达量所用引物均为：PvGRF9_F:5′-CAGAACCTGGAAGATGCCGT-3′；PvGRF9_R: 5′-GCTTTCTTGAACGATGACGATT-3′。内参基因ubiquitin(AP13CTG25905)引物为Ubq_F:5′ -CAGCGAGGGCTCAATAATTCCA-3′；Ubq_R:5′-TCTGGCGGACTACAATATCCA-3′。
[0157] 结果显示，9sr的株系中，与野生型柳枝稷(WT)相比，株系9sr-62的PvGRF9-SRDX基因表达量无显著变化；株系9sr-L36、9sr-L2和9sr-L22的PvGRF9-SRDX基因表达量显著提高2-3倍，记为低度表达株系；株系9sr-M4、9sr-M25、9sr-M52、9sr-M42和9sr-M14的 PvGRF9-SRDX基因表达量约为WT的50-100倍，记为中度表达株系；株系9sr-H32和9sr-H3的 PvGRF9-SRDX基因表达量超过WT的100倍，记为高度表达株系，图3中a。
[0158] r9ox的株系中，株系r9ox-L1、r9ox-L12、r9ox-L9和r9ox-L20的rPvGRF9基因的表达量是WT的1-2倍；其余植株系(r9ox-L11、r9ox-L21、r9ox-L2和r9ox-L19)的rPvGRF9基因的表达量是WT的3-6倍，均记为低度表达株系，图3中b。
[0159] 9ox的株系中，株系9ox-M13的PvGRF9基因的表达量是WT的20倍，记为中度表达株系；株系9ox-H8、9ox-H15和9ox-H11的PvGRF9基因的表达量是WT的30-40倍，记为高度表达株系。
[0160] 三、转基因植物的表型分析
[0161] 在柳枝稷的R3生长期(花序完全长出)，观察并统计植株表型数据，结果显示，通过嵌合子沉默技术抑制柳枝稷植株内PvGRF9的活性后，9sr的株系呈现出不同程度的矮化(图4、图5、表1)。PvGRF9-SRDX基因低度表达的转基因株系植株高度与野生型相比无显著差异，但是节间长度降低。PvGRF9-SRDX基因中度表达的转基因株系植株高度显著低于野生型，其中花序轴长(即分蘖顶端节点到花序顶部长度)缩短约15cm，植株茎秆缩短15cm左右。 PvGRF9-SRDX基因高度表达的转基因株系H3呈现出重度矮化的现象，高度约为WT的55％，植株茎节长度(即节间长度)、粗度(即茎直径)仅为WT的50％，且高度表达的株系在温室生长6个月的植株无开花现象。9sr株系的茎秆干物质量与WT相比呈现不同程度的降低，L22 与WT相比无显著差异，M25和M14植株地上茎秆干物质量与WT相比降低约15％，但无显著差异，高度表达植株H3茎秆干物质量仅为WT的38％左右(图5)。
[0162] r9ox的株系中植株高度显著高于野生型植株(图4，图5和表1)。R3期分蘖中，花序轴长增加约10cm，平均节间长度增加1-2cm，株系L2茎粗(即茎直径)显著大于WT。每株植株茎秆干物质量显著高于WT，约为WT的1.3倍(图5)。
[0163] 9ox的株系中，高度和中度过表达野生型PvGRF9转基因株系(9ox-H8、H15、H11、M13) 植株表型与野生型相比均无显著差异，因此茎秆干物质量与WT无显著差异。
[0164] 其中，茎秆干物质量的测定方法为：R3期分蘖65℃烘干48h，剥去叶片及叶鞘，去掉花序轴，测定茎秆重，每个植株选取20个分蘖，平均值作为一个生物学重复。
[0165] 表1、野生型柳枝稷和PvGRF9相关转基因植株形态特征统计分析
[0166]株系 茎直径(mm)§ 花序轴长(cm)& 节间长度(cm)& 植株高度(cm) 茎秆干物质量(g) WT1 3.56±0.07bc 71.72±0.87dce 21.20±1.15abc 181.17±4.44de 89.20±12.85bc WT2 4.06±0.55b 77.86±1.27abc 21.17±0.70abc 189.73±6.86de 87.57±9.81bcd
9sr-L22 3.72±0.03bc 65.08±1.53de 19.51±0.55abc 188.98±6.35de 88.79±6.61bc
9sr-M25 3.72±0.07bc 63.21±4.26de 18.83±0.54bc 153.52±3.66f 75.92±6.61bc
9sr-M14 3.41±0.14bc 61.63±0.53e 17.58±0.11c 146.13±2.65f 80.83±7.60cd
9sr-H3 2.77±0.07c - 13.34±0.73d 101.34±4.16g 34.06±4.76e
r9ox-L19 4.02±0.03b 83.58±3.77ab 23.07±0.81ab 229.99±13.28a 124.64±9.69a r9ox-L2 5.26±1.13a 78.81±6.92abc 22.13±1.91ab 210.52±4.09bc 127.18±7.22a r9ox-L21 4.22±0.68ab 82.88±5.17ab 23.63±3.47a 217.97±6.95ab 142.06±18.35a
9ox-H8 4.52±0.66ab 84.22±6.13a 23.90±4.17a 197.68±11.47dc 93.83±10.92bc
9ox-H15 4.24±0.46ab 79.41±8.83abc 21.39±3.01abc 188.42±15.34dc 101.25±8.29b
9ox-H11 4.10±0.59b 73.20±7.33bcd 20.17±2.12abc 183.50±11.23de 68.05±13.89d
9ox-M13 3.64±1.35bc 69.13±6.84cde 18.44±1.14bc 176.78±7.41e 74.90±10.39cd [0167] 注：§游标卡尺测定R3分蘖中茎基部茎秆直径；&测定R3期分蘖节间长度和节数；每个株系测定4个植株，每个植株测定20个值为一个生物学重复。WT1和WT2为两个不同的野生型柳枝稷植株。结果展示为平均值±SD，同一列中标有不同字母的数据间差异显著(P<
0.05)，“-”表示未测量该数据。
9sr-L22 3.72±0.03bc 65.08±1.53de 19.51±0.55abc 188.98±6.35de 88.79±6.61bc
9sr-M25 3.72±0.07bc 63.21±4.26de 18.83±0.54bc 153.52±3.66f 75.92±6.61bc
9sr-M14 3.41±0.14bc 61.63±0.53e 17.58±0.11c 146.13±2.65f 80.83±7.60cd
9sr-H3 2.77±0.07c - 13.34±0.73d 101.34±4.16g 34.06±4.76e
r9ox-L19 4.02±0.03b 83.58±3.77ab 23.07±0.81ab 229.99±13.28a 124.64±9.69a r9ox-L2 5.26±1.13a 78.81±6.92abc 22.13±1.91ab 210.52±4.09bc 127.18±7.22a r9ox-L21 4.22±0.68ab 82.88±5.17ab 23.63±3.47a 217.97±6.95ab 142.06±18.35a
9ox-H8 4.52±0.66ab 84.22±6.13a 23.90±4.17a 197.68±11.47dc 93.83±10.92bc
9ox-H15 4.24±0.46ab 79.41±8.83abc 21.39±3.01abc 188.42±15.34dc 101.25±8.29b
9ox-H11 4.10±0.59b 73.20±7.33bcd 20.17±2.12abc 183.50±11.23de 68.05±13.89d
9ox-M13 3.64±1.35bc 69.13±6.84cde 18.44±1.14bc 176.78±7.41e 74.90±10.39cd [0167] 注：§游标卡尺测定R3分蘖中茎基部茎秆直径；&测定R3期分蘖节间长度和节数；每个株系测定4个植株，每个植株测定20个值为一个生物学重复。WT1和WT2为两个不同的野生型柳枝稷植株。结果展示为平均值±SD，同一列中标有不同字母的数据间差异显著(P<
0.05)，“-”表示未测量该数据。
[0168] 步骤三中的茎秆干物质量为每株的茎秆干物质量。
[0169] 四、PvGRF9相关转基因植株细胞壁组分分析
[0170] 1、PvGRF9转基因植株木质素含量测定
[0171] 为了确定PvGRF9对木质素含量的影响，本发明测定了野生型柳枝稷和PvGRF9相关转基因植株茎秆干物质中克莱森木质素的含量。测定步骤如下：
[0172] 茎秆干物质样品(DMS)：
[0173] 植株在温室生长6个月后，在每个株系的4株植株中，挑选生长良好的3株进行细胞壁组分分析。取每个植株中20个R3期分蘖，剥去叶片、叶鞘，去掉花序轴，将茎秆部分65℃烘干48h，粉碎过筛(0.8mm)，得到一份样品(DMS)。每个株系获得3份样品。
[0174] 细胞壁残渣(Cell Wall Residue，CWR)制备
[0175] 称取2g左右DMS(记为m1)置于50mL离心管中，依次用氯仿：甲醇(体积比2:1)、甲醇、50％(v/v)甲醇水溶液、超纯水洗涤，每次使用量为25mL，洗涤30min，每种试剂洗涤3次。将残渣真空干燥后称重记为m2。干燥后残渣即获得CWR。植株CWR产率＝ m2/m1×100％。每个样品重复3次。测定CWR产率后将每个样品的3个重复混匀，即为该样品的CWR。
[0177] 1)称取300mg CWR或DMS，加3mL 72％(v/v)硫酸水溶液，搅拌混匀后置于30℃，保持1h。
[0178] 2)步骤1)完成后，加入84mL去离子水，然后置于121℃保持1h，最后冷却到室温，得到反应产物。
[0180] 4)步骤3)完成后，使用HPLC分析滤液中葡萄糖和木糖含量。
[0181] 5)105℃烘干纤维袋，称重(M1)。
[0182] 6)将滤渣装入称重后的纤维袋中，105℃干燥3h，干燥后称重(M2)。
[0184] 8)计算克莱森木质素含量和细胞壁碳水化合物量，滤液中葡萄糖和木糖总量为细胞壁碳水化合物量，克莱森木质素含量＝((M2-M1)-(M4-M3))/0.3×100％。
[0185] 每个株系含有3个样品，每个样品重复5次。
[0186] 结果如图6所示，抑制PvGRF9活性的转基因株系9sr-L22、9sr-M25、9sr-M14木质素含量显著低于WT，约为WT的82％-86％；转rPvGRF9基因株系r9ox-L19和r9ox-L21中木质素含量显著高于WT，转PvGRF9基因株系9ox-H8、9ox-11和9ox-M13中木质素含量与WT无显著差异。表明rPvGRF9基因正调控柳枝稷的木质素的含量。WT、9sr-L22、9sr-M25、9sr-M14、 r9ox-L19和r9ox-L21中木质素含量分别为18.41±0.62％、16.56±0.43％、16.09±0.83％、 16.19±0.12％、19.64±0.62％、18.98±0.52％、20.44±0.01％。9ox-H8、9ox-H11、9ox-M13 中木质素含量分别为18.56±0.17％、18.04±0.31％、18.38±0.52％。
[0187] 2、PvGRF9相关转基因植株酶解效率分析
[0189] 转PvGRF9基因植株不影响植株木质素含量，发明人对转PvGRF9-SRDX基因植株和转 rPvGRF9基因植株进行酶解效率分析。检测步骤如下：
[0190] 所需试剂配制：
[0191] 1)醋酸钠缓冲液(pH 4.8，1.5L)：A液：称取27.22g三水合醋酸钠药品溶解于800mL 去离子水中，定容至1L；B液：量取11.8mL冰醋酸加去离子水稀释至1L；量取885mL A 液与615mL B液充分混匀，得到醋酸钠缓冲液。
[0192] 2)纤维素复合酶溶液(4g/L，1L)：称取4g纤维素复合酶粉末(宁夏和氏璧生物技术有限公司)溶解于1L醋酸钠缓冲液中。
[0194] 直接酶解(Unpretreated)：
[0195] 1)称取50mg按照步骤1中的方法得到的CWR样品于2mL离心管中，向离心管中加入 4g/L纤维素复合酶溶液500μL，然后用醋酸钠缓冲液(pH 4.8)定容至1mL。
[0196] 2)步骤1)完成后，50℃摇床150rmp震荡培养72h。
[0197] 3)步骤2)完成后，沸水浴5min，冷却至室温。
[0198] 4)步骤3)完成后，室温12000rmp离心2min，取上清。应用HPLC测定葡萄糖和木糖含量，即单糖总量。
[0199] 直接酶解效率为酶解后释放单糖总量占细胞壁碳水化合物量的百分比，细胞壁碳水化合物量按照步骤1中的方法测定。每个植株包括3个样品，每个样品重复5次。
[0200] 预处理酶解(Pretreated)
[0201] 1)碱预处理：称取CWR 50mg于2mL离心管中，向离心管中加入10g/L的NaOH溶液 1mL，充分摇匀，50℃摇床150rmp震荡培养2h。
[0202] 2)步骤1)完成后，4000rpm离心5min，取上清测定单糖含量(即葡萄糖和木糖总含量)，获得上清糖含量。
[0203] 3)步骤2)完成后，残渣(即步骤2)离心所得沉淀)用超纯水洗涤4次，醋酸钠缓冲液(pH 4.8)清洗两次。
[0204] 4)步骤3)完成后，向残渣中加入4g/L纤维素复合酶溶液500μL，然后用0.2M醋酸钠缓冲液定容至1mL。
[0205] 5)步骤4)完成后，50℃摇床150rmp震荡培养72h。
[0206] 6)步骤5)完成后，沸水浴5min灭酶活，冷却，12000rmp离心2min，取上清。使用HPLC测定单糖含量(即葡萄糖和木糖总含量)，获得残渣糖含量，计算预处理酶解效率。
[0207] 预处理酶解效率为酶解释放单糖总量占细胞壁碳水化合物量的百分比，酶解释放单糖总量为上清糖含量与残渣糖含量之和，细胞壁碳水化合物量按照步骤1中的方法测定。每个植株包括3个样品，每个样品重复5次。
[0208] 结果如图7所示，野生型柳枝稷和转基因植株直接酶解效率(经过预处理)约为5％-10％，转PvGRF9-SRDX基因株系9sr-M14直接酶解效率最高，转rPvGRF9基因株系r9ox-L19和 r9ox-L2植株直接酶解效率显著低于野生型。植株茎CWR样品经过NaOH预处理2h后再进行酶解实验，各植株酶解效率均显著提高，其中9sr-M25和9sr-M14的酶解效率显著高于WT，约为WT的1.2倍；植株9sr-L22酶解效率略高于WT，但无显著差异；转rPvGRF9基因植株的酶解效率与WT相比无显著差异。
[0209] 实施例2、PvGRF9及其编码基因可以调控柳枝稷植株高度、茎秆干物质量和木质素含量
[0210] 本实施例通过在过表达miR396转基因植株OE17(OE17为发明人向柳枝稷Alamo中转入水稻miR396a基因获得的植物材料)中进行转基因实验检测了PvGRF9及其编码基因的功能。水稻miR396a基因序列为序列表中序列7。检测步骤如下：
[0211] 一、PvGRF9、rPvGRF9回补OE17转基因植株((r)9ox/OE17)的获得
[0212] 农杆菌介导的遗传转化：
[0213] 按照实施例中步骤二的方法利用实施例步骤一得到的pZh01-PvGRF9和pZh01-rPvGRF9分别进行遗传转化，所用受体植物为OE17，所用组织为OE17植株幼穗。
[0214] 通过潮霉素筛选，利用pZh01-PvGRF9获得转PvGRF9基因的潮霉素抗性植株36株 (9ox/OE17)；利用pZh01-rPvGRF9获得转rPvGRF9基因的潮霉素抗性植株24株。(r9ox/OE17)[0215] 转基因植株PCR检测：为了检测含有目的基因的载体片段是否整合到植物基因组中，采用CTAB法提取野生型及抗性植株幼嫩叶片基因组DNA。以转基因抗性植株DNA为模板，过表达miR396柳枝稷植株(OE17)为阴性对照，分别以各自所用植物表达载体为阳性对照(+)，利用实施例1的35S_F和GRF9(OX)_KpnR为引物扩增rPvGRF9基因特异片段，利用35S_F和 GRF9(OX)_KpnR为引物扩增PvGRF9基因特异片段。
[0216] 结果如图8所示，转基因阳性植株扩增出与阳性对照一致大小的片段，OE17阴性对照未扩增出目的条带，说明载体目的片段已成功插入基因组中。通过PCR检测，获得PvGRF9/OE17 阳性植株21个，rPvGRF9/OE17阳性植株19个。
[0217] 转基因植株qRT-PCR检测：
[0218] 为了确定转基因植株中目的基因的表达量，通过qRT-PCR对目的基因的表达量进行检测和分析。以转基因PCR阳性植株cDNA为模板，持家基因ubiquitins为内参基因，检测转基因植株中目的基因相对表达量。分别利用野生型柳枝稷植株(WT)和OE17作为对照。
[0219] 结果如图9所示，所得到的转PvGRF9基因植株PvGRF9基因的表达水平为WT的1-4倍，将转基因阳性植株根据表达量的差异分为三组：L组(低度表达组)：PvGRF9基因表达量为 WT的1-2倍；M组(中度表达组)：PvGRF9基因表达量为WT的2-3倍；H组(高度表达组)： PvGRF9基因表达量为WT的为WT的3-4倍。L组入选株系有9ox/OE17-L4和9ox/OE17-L41， M组入选株系有9ox/OE17-M19、9ox/OE17-M24、9ox/OE17-M27和9ox/OE17-M28，H组入选株系有9ox/OE17-H6。
[0220] 所得到的转rPvGRF9基因植株rPvGRF9基因的表达水平均显著提高，将转基因阳性植株根据表达量的差异分为三组：L组(低度表达组)：rPvGRF9基因表达量为WT的1-2倍；M组 (中度表达组)：rPvGRF9基因表达量为WT的2-3倍；H组(高度表达组)：rPvGRF9基因表达量为WT的为WT的3-4倍。L组入选株系有r9ox/OE17-L1和r9ox/OE17-L4，M组入选株系有r9ox/OE17-M19、r9ox/OE17-M24、r9ox/OE17-M36、r9ox/OE17-M38和r9ox/OE17-M42，H 组入选株系有r9ox/OE17-H8、r9ox/OE17-H9、r9ox/OE17-H10、r9ox/OE17-H48和 r9ox/OE17-H49。
[0221] 二、转基因植株表型分析
[0222] 在柳枝稷的R3时期(Hardin C F,Fu C,Hisano H,Xiao X,Shen H,Jr.Stewart C N, Parrott W,Dixon R A,Wang Z.Standardization of switchgrass sample collection for cell wall and biomass trait analysis[J].BioEnergy Research,
2013,6(2):755-762)，观察并统计植株表型数据。利用野生型柳枝稷和OE17作为对照。
2013,6(2):755-762)，观察并统计植株表型数据。利用野生型柳枝稷和OE17作为对照。
[0223] 结果显示，OE17背景下转PvGRF9或rPvGRF9基因，随着转基因植株表达量的不同植株株高及花序形态等呈现不同程度的回补。OE17与野生型相比植株高度显著降低，仅为WT的 41.6％。在OE17的背景下转PvGRF9基因(9ox/OE17)，转PvGRF9基因株系9ox/OE17-L41、 9ox/OE17-M27和M19的植株高度均显著增加，高度可以恢复到WT的86％；高度表达PvGRF9 基因的株系9ox/OE17-H6植株高度恢复到野生型程度(图10和11)。柳枝稷植株高度由茎秆长度和花序轴长共同决定，对茎秆长度进行统计分析，结果表明9ox/OE17-M27茎秆长度与OE17相比显著增加，增加约20cm，为WT的81％；转基因株系9ox/OE17-L41、9ox/OE17-M19 和
9ox/OE17-H6的茎秆长度比OE17增加约30％，与WT相比有降低，但无显著差异；各株系平均节长显著低于野生型植株。转基因株系9ox/OE17-L41、9ox/OE17-M27和9ox/OE17-M19 的花序轴长度与OE17相比具有显著增加，约为OE17的8.3倍，但与WT相比仍有10cm左右的缩短。
每株干物质量(即每株的茎秆干物质量)在不同株系间的变化趋势与植株高度基本一致。
9ox/OE17-H6的茎秆长度比OE17增加约30％，与WT相比有降低，但无显著差异；各株系平均节长显著低于野生型植株。转基因株系9ox/OE17-L41、9ox/OE17-M27和9ox/OE17-M19 的花序轴长度与OE17相比具有显著增加，约为OE17的8.3倍，但与WT相比仍有10cm左右的缩短。
每株干物质量(即每株的茎秆干物质量)在不同株系间的变化趋势与植株高度基本一致。
[0224] 每株干物质量的即为生物量。
[0225] 在OE17的背景下转rPvGRF9基因(r9ox/OE17)，转rPvGRF9基因株系r9ox/OE17-L4、 r9ox/OE17-M19、r9ox/OE17-M36和r9ox/OE17-H48的植株高度均显著增加，r9ox/OE17-H48 的植株高度与WT无显著差异。每株干物质量和每个分蘖茎秆干物质量在不同株系间的变化趋势与植株高度基本一致。
[0226] 三、转基因植株细胞壁组分分析
[0227] 细胞壁木质素含量测定：
[0228] 为了定量分析9ox/OE17和r9ox/OE17植株中木质素含量，本实验检测了茎秆CWR样品中克莱森木质素的含量，测定方法同实施例1。利用野生型柳枝稷和OE17作为对照。
[0229] 结果如图12所示，OE17植株中木质素含量显著低于WT，约为WT的80％。OE17中转PvGRF9 或rPvGRF9基因后，转基因植株中木质素含量与OE17相比显著增加，并且随着表达量的增加木质素含量有增加的趋势，其中r9ox/OE17-L4和r9ox/OE17-M19株系木质素含量较OE17增加2％左右，其余株系增加约3％左右。所检测的9ox/OE17和r9ox/OE17植株内木质素含量与 WT相比均无显著差异。
[0230] 酶解效率测定：
[0231] 按照实施例1中的方法，测定9ox/OE17和r9ox/OE17植株的酶解效率。利用野生型柳枝稷和OE17作为对照。该步骤对茎CWR进行酶解实验，一方面应用纤维素复合酶对植株CWR直接进行酶解，72h后借助液相色谱仪测定酶解液中单糖含量，获得直接酶解效率；另一方面对CWR进行碱预处理，对预处理后样品再进行酶解实验，获得样品预处理后酶解效率。
[0232] 直接酶解效率结果如图13中a所示，WT植株直接酶解效率约为5.6％；OE17酶解效率显著高于WT，增加约8％；在OE17中转PvGRF9或rPvGRF9基因后，转基因植株的酶解效率与 OE17相比具有显著下降，但植株r9ox/OE17-H48酶解效率仍然显著高于WT，其它植株与WT 相比略高但无显著差异。所测样品预处理后的酶解效率较直接酶解相比均显著增高，OE17酶解率最高，与WT相比增加达18％；其余植株预处理酶解率均显著低于OE17，其中9ox/OE17-M27 的酶解效率最低，约为OE17的66.7％，为WT的86％；其他转基因株系酶解效率均为OE17的 78％左右，与WT相比无显著差异。该实验表明，PvGRF9基因和rPvGRF9基因对柳枝稷细胞壁组分的改变显著负调控植株木质纤维素的糖化。
[0233] 实施例3、PvGRFs表达模式分析
[0234] 一、qRT-PCR分析
[0235] 取柳枝稷Alamo材料E3期植株分蘖从上向下第二节节间区(S1)、节中间部位5mm(S2)、第一叶(L1)和第二叶(L2)距叶基部1cm处样品；R3期成熟花序小轴(R)、外稃(M)、雄蕊(T)、雌蕊(P)。液氮速冻。用于RNA提取及qRT-PCR分析。实验重复3次。
[0236] 所检测基因、内参基因(ubiquitin(AP13CTG25905))及所用引物见表2。
[0237] 结果如图14所示，PvGRF1在茎S2部位表达量显著高于其他部位，在叶片(L1和L2)、花序轴(R)中的表达量较低；PvGRF2在雌蕊中的表达量显著低于其他部位，在外稃(M)和叶 (L2)中表达量较高，其他部位表达无显著差异；PvGRF3在M，R，T，L1和S1中的表达量无差异，但在S2中显著增加，在雄蕊(P)和L2中的表达量显著低于其他部位；PvGRF4在P中表达量显著低于其他部位；PvGRF5的表达量除在P和M中的略低外，在其他部位差异不显著；PvGRF6 在雄蕊和L1中具有特异性的高表达，其次为S1和S2，在M、R和T中的表达量差异不显著，在L2 中表达量最低；PvGRF8在不同部位均有表达，各部位之间表达量差异不显著；PvGRF9在茎S2 部位显著高表达于其他部位；PvGRF10和PvGRF11在不同部位的表达量相似，在雌蕊中表达量最高，在S2中表达量最低。综上所述，PvGRF1和PvGRF9在茎S2中具有特异性表达。
[0238] 表2、PvGRFs qRT-PCR检测引物
[0239]
[0240] 二、原位杂交
[0241] 根据PvGRF9基因序列设计特异性探针通过原位杂交对PvGRF9在茎S1中的表达部位进行分析。所用探针为：5’- GAGCAGGGACAAGGTGGGTTGTCGATTTGTAGAATTTAGCAATGGAGCACTGTTGTCTTC-3’。5’端以CY3荧光染料标记，CY3受激发后发出肉眼可见红色荧光。。
[0242] 结果显示，PvGRF9在茎维管束筛管细胞中具有特异性表达(图15)。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
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| 序列特异性检测和表型确定 | 2020-05-12 | 506 |
| 用于提高表达的细菌前导序列 | 2020-05-13 | 773 |
| 一种抑制caspase-3基因表达的siRNA序列 | 2020-05-13 | 298 |
| 一种抑制bak基因表达的siRNA序列 | 2020-05-13 | 52 |
| 人类肝脏中表达的表达序列标签I组 | 2020-05-11 | 225 |
| 人类肝脏中表达的表达序列标签E组 | 2020-05-11 | 628 |
| 表位序列 | 2020-05-11 | 100 |
| 表达序列 | 2020-05-11 | 388 |
| 增强表达的内含子序列 | 2020-05-11 | 103 |
| 时间序列数据的多表示存储 | 2020-05-12 | 327 |
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