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一种密码子优化后的磷脂酶A2及其重组细胞、重组细胞的构建与应用

阅读：228发布：2023-02-17

专利汇可以提供一种密码子优化后的磷脂酶A2及其重组细胞、重组细胞的构建与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种密码子优化后的磷脂酶A2及其重组细胞、重组细胞的构建与应用。一种密码子优化后的磷脂酶A2其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述核苷酸序列SEQ ID NO.2通过对磷脂酶A2的原始基因序列如SEQ ID NO.1进行密码子优化而得到的。将SEQ ID NO.2所示的密码子优化后的基因序列在大肠杆菌中表达时会形成大量包涵体，无法得到可溶性蛋白，不能用于进一步的催化制备甘油磷脂酰胆碱。本发明利用含有该序列的重组菌株所产的磷脂酶A2、商业化磷脂酶A1 Lecitase Ultea作为催化剂来高效生产甘油磷脂酰胆碱，成本低，工业化前景好。，下面是一种密码子优化后的磷脂酶A2及其重组细胞、重组细胞的构建与应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种密码子优化后的磷脂酶A2，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述核苷酸序列SEQ ID NO.2通过对磷脂酶A2的原始基因序列如SEQ ID NO.1进行密码子优化而得到的。
2.一种表达载体，该载体包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
3.一种重组细胞，包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的表达载体。
4.基于权利要求3所述的重组细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列克隆到表达质粒上，得到重组质粒；步骤2，将重组质粒转化宿主菌，得到该重组细胞。
5.根据权利要求3所述的重组细胞的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：第一步，在SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的两端设计酶切位点NcoI和BamH亚克隆到载体pMAL-c5x上，获得重组质粒pMAL-c5x-PLA2；第二步，将重组质粒pMAL-c5x- PLA2转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到磷脂酶A2的重组菌株BL21（DE3）/pMAL-c5x- PLA2。
6.基于权利要求1所述密码子优化后的磷脂酶A2在制备甘油磷脂酰胆碱中的应用。
7.根据权利要求6所述密码子优化后的磷脂酶A2在制备甘油磷脂酰胆碱中的应用，其特征在于，在磷酸盐缓冲溶液中，加入密码子优化后的磷脂酶A2的酶液和磷脂酶A1的酶液，磷脂酰胆碱含量60g/L，37℃，200rpm震荡反应，反应时间1-24h，每2h取样，高效液相色谱法检测产物L-α-GPC的含量和底物磷脂酰胆碱的含量。

说明书全文

一种密码子优化后的磷脂酶A2及其重组细胞、重组细胞的构

建与应用

[0001]

技术领域

[0002] 本发明涉及生物催化技术和磷脂类产品的制备领域，特别涉及一种密码子优化后的磷脂酶A2及其重组细胞、重组细胞的构建与应用。

背景技术

[0003] 甘油磷脂酰胆碱（L-α-GPC,CAS号：28319-77-9）又称甘磷酸胆碱，是磷脂酰胆碱（Phosphatidyl cholines，PC）两个酰基脂肪酸链都被去掉后形成的物质，是动物体内天然存在的水溶性磷脂类代谢产物，是合成乙酰胆碱（Ach）和PC的重要前体，同时也是一种维持细胞完整性和流动性的特殊物质。临床研究表明，L-α-GPC可以穿过血脑屏障，通过直接提高海马体中Ach的水平来增强胆碱能神经传递，提高学习认知能力，维持体内荷尔蒙水平；可以改善因大脑衰退而造成的认知缺陷，对如阿尔茨海默病等老年痴呆类疾病有较好的疗效，在医药界享有“大脑防衰老营养素”的称号。在欧洲,治疗阿尔茨海默病的药物“Gliation”的主要成分就是L-α-GPC；L-α-GPC还可以用来治疗心脑血管类疾病，如缺血型中风；也可以改善肌肉反应的灵敏度。L-α-GPC可能是预防与年龄有关疾病的潜在物质，并且含L-α-GPC的食物可能发挥着抗衰老作用。由于此为自然界中天然存在的物质，主要存在于动物器官、牛的乳汁和卷心菜中，因此含量甚少，为了满足人们得到生活需要，创建一种高效生产L-α-GPC的技术将具有重要的药用、社会和研究价值。

[0004] 目前已经有专利公开了利用商业化的磷脂酶A1（Lecitase Ultra）在水相体系中制备GPC的研究，但是磷脂酶A1只能专一性的水解Sn-1位的脂肪酸，磷脂酶A2只能专一性的水解Sn-2位的脂肪酸；若单用磷脂酶A1催化PC水解生成GPC，则要先进行一步酰基转移反应，将Sn-2位的脂肪酸转移到Sn-1位上，才能将剩余的脂肪酸全部水解下来。这就使得仅用磷脂酶A1催化生成GPC反应的速率和PC的利用程度非常依赖于中间产物Sn-2-LPC的酰基转移的速率。

[0005] 目前也已经有研究者采用了联合磷脂酶A1和磷脂酶A2的方法催化生产GPC的反应体系，但是由于磷脂酶A2的来源有限且价格昂贵，目前商业化的主要来源是从动物的胰腺和蛇毒中提取，价格较为昂贵，不符合实际生产的需求，极大地限制了这种技术的发展。

发明内容

[0006] 针对现有技术中酶法制备甘油磷脂酰胆碱的生产效率低，价格昂贵的问题，本发明提供了一种密码子优化后的磷脂酶A2及其重组细胞、重组细胞的构建与应用，该磷脂酶A2表达时不易形成包涵体，可用于生产甘油磷脂酰胆碱，降低了生产成本，提高了效率。

[0007] 一种密码子优化后的磷脂酶A2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述核苷酸序列SEQ ID NO.2通过对磷脂酶A2的原始基因序列如SEQ ID NO.1进行密码子优化而得到的。将SEQ ID NO.2所示的密码子优化后的基因序列在大肠杆菌中表达时会形成大量包涵体，无法得到可溶性蛋白，不能用于进一步的催化制备甘油磷脂酰胆碱。

[0008] 一种表达载体，该载体包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

[0009] 一种重组细胞，包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的表达载体。

[0010] 上述重组细胞的构建方法，包括如下步骤步骤1，将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列克隆到表达质粒上，得到重组质粒；
步骤2，将步骤1得到的重组质粒转化宿主菌，即得重组细胞。

[0011] 上述重组细胞的构建方法，具体如下所示：第一步，在SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的两端设计酶切位点NcoI和BamH亚克隆到载体pMAL-c5x上，获得重组质粒pMAL-c5x-PLA2；
第二步，将重组质粒pMAL-c5x- PLA2转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到磷脂酶A2的重组菌株BL21（DE3）/pMAL-c5x- PLA2。

[0012] 上述重组菌株BL21（DE3）/pMAL-c5x- PLA2培养方法如下：挑取BL21（DE3）/pMAL-c5x- PLA2单菌落，接种于LB培养基，置于37℃过夜培养；再将该菌转接于LB培养基，接种量为LB培养基体积的1-5%，37℃培养2 3小时，加入IPTG至终浓度~
0.5mmol/L，30℃过夜培养。

[0013] 上述密码子优化后的磷脂酶A2在制备甘油磷脂酰胆碱中的应用。

[0014] 上述应用的具体步骤如下：在磷酸盐缓冲溶液中，加入密码子优化后的磷脂酶A2的酶液和磷脂酶A1的酶液，PC含量60g/L，37℃，200rpm震荡反应，反应时间1-24h，每2h取样，高效液相色谱法检测产物L-α-GPC的含量和底物PC的含量。

[0015] 有益效果：本发明通过对来源于Streptomyces violaceoruber的磷脂酶A2进行密码子优化得到了可以在大肠杆菌中正常表达的基因序列，并构建了产磷脂酶A2的重组大肠杆菌，并通过MBP融合蛋白表达的方法，提高了磷脂酶A2的异源高效表达，解决了磷脂酶A2的来源问题。

[0016] 本发明弥补了现有技术中，单用磷脂酶A1催化中遇到的酰基转移的不足，提供了一种可以高效生产甘油磷脂酰胆碱的方法。该方法可以显著的提高酶的催化效率、产品的得率和底物的利用率。

[0017]附图说明

[0018] 图1为重组质粒的构建图；图2为磷脂酶A1作用于PC的位点的图；
图3为磷脂酶A2作用于PC的位点的图；
图4为磷脂酶A催化合成甘油磷脂酰胆碱的路径图；
图5为重组菌株BL21（DE3）/pET-28a-PLA2的磷脂酶A2的蛋白表达情况；
图6为重组大肠杆菌BL21(DE3)/pMal-c5x-PLA2的的蛋白表达情况。

[0019]

具体实施方式

[0020] 实施例1 重组菌株BL21(DE3)-pET28a-PLA2的构建构建表达磷脂酶A2的基因工程菌：根据已报导的Streptomyces violaceoruber来源磷脂酶A2的氨基酸序列，进行密码子优化后合成该序列，密码子优化后的序列如SEQ ID NO.1所示，两端设计酶切位点NcoI和XhoI，亚克隆到载体pET-28a上，获得重组质粒pET-28a-PLA2。将构建好的重组质粒pET-28a-PLA2转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到磷脂酶A2的重组菌株BL21（DE3）/pET-28a-PLA2。

[0021] 实施例2 培养表达磷脂酶A2的基因工程菌挑取重组菌株BL21（DE3）/pET-28a-PLA2的单菌落，接种于LB培养基，置于37℃过夜培养；再将该菌转接于LB培养基，接种量为LB培养基体积的1-5%，37℃培养2-3小时，加入IPTG诱导表达，30℃过夜培养，离心收集表达磷脂酶A2的基因工程菌，进行细胞破碎，8000rpm条件下，离心20min收集上清酶液。

[0022] 实施例3 磷脂酶A2表达菌株蛋白表达的研究。

[0023] 重组菌株BL21（DE3）/PET-28a-PLA2的磷脂酶A2的蛋白表达情况如图5所示，但是经过蛋白电泳的研究发现蛋白几乎全部以沉淀的形式出现，上清液中几乎没有可溶性的蛋白，即出现了较严重的包涵体现象，使得构建的菌株完全没有活性。经过了降温诱导，以及改变其他的诱导条件，均未得到有活性的菌株。后期，我们更换了载体pMal-c5x，该载体含有一个麦芽糖结合蛋白，可以较好的增强可溶性蛋白的表达。因此后续使用该载体来继续进行下一步的研究。

[0024] 实施例4 重组菌株BL21(DE3)-pMal-c5x- PLA2的构建重新在两端设计酶切位点NcoI和BamHI，亚克隆到载体pMAL-c5x上，获得重组质粒pMAL-c5x-pla2。将构建好的重组质粒pMAL-c5x- pla2转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到磷脂酶A2的重组菌株BL21（DE3）/pMaL-c5x-PLA2。

[0025] 实施例5 重组大肠杆菌BL21(DE3)-pMal-c5x- pla2的培养及诱导表达挑取表达磷脂酶A2的基因工程菌单菌落，接种于LB培养基，置于37℃过夜培养；再将该菌转接于LB培养基，接种量为LB培养基体积的1-5%，37℃培养2-3小时，加入IPTG诱导表达，30℃过夜培养，离心收集表达磷脂酶B的基因工程菌，进行细胞破碎，即8000rpm条件下，离心20min收集上清酶液。

[0026] 实施例6 新构建的磷脂酶A2表达菌株蛋白表达的研究新构建的磷脂酶A2的表达菌株的蛋白表达情况如图6所示，虽未完全解决包涵体的问题，但是已经有了可溶性的蛋白表达。

[0027] 实施例7 磷脂酶A催化PC水解生成GPC的反应在磷酸盐缓冲溶液中，加入磷脂酶A2的酶液和磷脂酶A1的酶液，PC含量60g/L，37℃，
200rpm震荡反应，反应时间1-24h，每2h取样，并利用高效液相色谱法检测产物L-α-GPC的含量和底物PC的含量。

[0028] 结论：反应最终得到的L-α-GPC的转化率为90%，PC的消耗率为95%以上。

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