黄腐醇相关蛋白及其在稳定黄腐醇合成途径中产物中的应用
阅读：222发布：2023-02-20
专利汇可以提供黄腐醇相关蛋白及其在稳定黄腐醇合成途径中产物中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了黄腐醇相关蛋白及其在稳定黄腐醇合成途径中产物中的应用。本发明公开的黄腐醇相关蛋白为如下A1)、A2)或A3)：A1) 氨 基酸序列是序列1的 蛋白质 ；A2)将 序列表 中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，本发明的黄腐醇相关蛋白具有稳定黄腐醇合成途径中产物的作用，在黄 酮 类化合物和脱甲基黄腐醇合成 生物 学应用以及人类健康保健等领域有广泛的应用前景。，下面是黄腐醇相关蛋白及其在稳定黄腐醇合成途径中产物中的应用专利的具体信息内容。
1.蛋白质，为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；
A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B7)中的任一种：
B1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b1)或b2)或b3)：
b1)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；
b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
b3)在严格条件下与b1)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
4.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料在提高黄腐醇合成途径中产物稳定性中的应用。
5.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料在制备提高黄腐醇合成途径中产物稳定性产品中的应用。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述产物为查尔酮和/或脱甲基黄腐醇。
7.稳定黄腐醇合成途径中产物的产品，包括权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于：所述产物为查尔酮和/或脱甲基黄腐醇。
9.稳定黄腐醇合成途径中产物的方法，包括：利用权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料实现稳定黄腐醇合成途径中产物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述产物为查尔酮和/或脱甲基黄腐醇。
黄腐醇相关蛋白及其在稳定黄腐醇合成途径中产物中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 啤酒花(也称作忽布、蛇麻花等，Humulus lupulus L.，是二倍体，2n＝2x＝20)属于蔷薇目大麻科葎草属，是多年生攀缘草本植物,雌雄异株，雌花是由苞片呈复瓦状排列形成的球果状花序，长3～4厘米，内层苞片下面生有大量黄色腺体腺毛。雌花主要用于酿造啤酒,是啤酒特有香味和苦味的主要来源，被认为是啤酒酿造的“绿色黄金”。2011年全球的啤酒销售收入是1500多亿美元。目前中国已经成为世界第一大啤酒生产和消费国，2011年中国的啤酒市场销收入大约1589.4亿人民币，无论国内国外，啤酒销售市场仍在不断的扩大。啤酒爽口不爽口，很大程度上取决于啤酒花风味品质(其它因素还包括大麦芽和酵母菌株等)。啤酒花作为重要的经济作物在我国中西部地区(新疆，甘肃，内蒙等地)有大面积种植，是当地农民的主要经济来源。我国酒花生产的主要问题是品种单一，风味品质较差，所以我国高档啤酒制造所需酒花仍需要进口，仅在2008年中国就进口总价值5千万美元的啤酒花。
啤酒花风味品质主要是由一些酒花特有的次生代谢物(萜类，苦味酸，黄腐醇)的含量及比例决定的，这些化合物生物合成和积累主要是在啤酒花腺体腺毛中完成。酒花香味来源于其精油成分，主要包括单萜(月桂烯Myrcene)、倍半萜(石竹烯Caryophyllene和啤酒花烯Humulene)和苦味酸等。除此之外，啤酒花腺体腺毛还合成积累大量的异戊烯基化的查尔酮类化合物(Prenylchalcone)，包括黄腐醇(Xanthohumol，Xan)、脱甲基黄腐醇
(Desmethylxanthohumol，DMX)，等，啤酒花中黄腐醇合成途径如图1所示。在自然条件下，脱甲基黄腐醇不稳定，会自发环化生成黄烷酮类化合物
啤酒花风味品质主要是由一些酒花特有的次生代谢物(萜类，苦味酸，黄腐醇)的含量及比例决定的，这些化合物生物合成和积累主要是在啤酒花腺体腺毛中完成。酒花香味来源于其精油成分，主要包括单萜(月桂烯Myrcene)、倍半萜(石竹烯Caryophyllene和啤酒花烯Humulene)和苦味酸等。除此之外，啤酒花腺体腺毛还合成积累大量的异戊烯基化的查尔酮类化合物(Prenylchalcone)，包括黄腐醇(Xanthohumol，Xan)、脱甲基黄腐醇
(Desmethylxanthohumol，DMX)，等，啤酒花中黄腐醇合成途径如图1所示。在自然条件下，脱甲基黄腐醇不稳定，会自发环化生成黄烷酮类化合物
[0003] 6-Prenylnaringenin(6PN)和8-Prenylnaringenin(8PN)，但在啤酒花体内检测到的绝大多数是处于开环状态的脱甲基黄腐醇，而且有研究表明开环的脱甲基黄腐醇要比环化的黄烷酮类化合物具有更强的药理活性。最近的药理研究表明，(脱甲基)黄腐醇具有抗癌(尤其是前列腺癌)和抗氧化的功效(有效浓度低于10μM)，而且没有明显的毒副作用。黄腐醇和苦味酸的这一系列功效也是当下比较认同“适量饮用啤酒有益健康”的理论基础，从某种意义上啤酒中黄腐醇和苦味酸有些像红葡萄酒中白藜芦醇(Resveratrol)的功效。问题是啤酒中的苦味酸和黄腐醇含量很低(每500毫升啤酒含0.31毫克黄腐醇)，而为达到保健功效成人需每天至少摄入150毫克左右，所以如何在不增加生产成本(加大啤酒花的使用量理论上可行，但很不经济)的情况下增加啤酒中苦味酸和黄腐醇含量是一个比较棘手的实际生产问题。提高啤酒花中苦味酸和黄腐醇含量也是啤酒花育种行业不断追求的目标之一。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种黄腐醇相关蛋白及其在稳定黄腐醇合成途径中产物中的应用。
[0005] 本发明提供的黄腐醇相关蛋白，其名称为XNRP1，是如下A1)、A2)或A3)：
[0008] A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
[0009] 为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0010] 表1、标签的序列
[0011]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
[0012] 上述A2)中的XNRP1蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0013] 上述A2)中的XNRP1蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0014] 上述A2)中的XNRP1蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。其中，序列2所示的DNA分子编码序列1所示的XNRP1蛋白质。
[0015] 本发明还提供了与XNRP1相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：
[0016] B1)编码XNRP1的核酸分子；
[0017] B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
[0018] B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
[0019] B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
[0020] B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
[0021] B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
[0022] B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。
[0023] 上述生物材料中，所述核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)：
[0024] b1)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；
[0025] b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码XNRP1的cDNA分子或基因组DNA分子；
[0026] b3)在严格条件下与b1)限定的核苷酸序列杂交，且编码XNRP1的cDNA分子或基因组DNA分子。
[0027] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0028] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码XNRP1蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的XNRP1蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码XNRP1蛋白质且具有XNRP1蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0029] 这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0030] 上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
[0031] 上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
[0032] 上述生物材料中，B2)所述的含有编码XNRP1蛋白质的核酸分子的表达盒(XNRP1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达XNRP1蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动XNRP1基因转录的启动子，还可包括终止XNRP1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
[0033] 可用现有的表达载体构建含有所述XNRP1基因表达盒的重组载体。
[0034] 上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为CHS_H1-pESC-His载体或pESC-His载体。所述CHS_H1-pESC-His载体为将pESC-His载体的SpeI和Pac I识别序列间的DNA片段替换为CHS_H1基因(查尔酮合成酶基因，序列表中序列6)得到的重组载体。
[0035] 所述重组载体可含有序列表中序列2。所述重组载体具体可为CHS_H1/XNRP1-pESC-His，所述CHS_H1/XNRP1-pESC-His为将CHS_H1-pESC-His的EcoRI和Not I识别序列间的DNA片段替换为XNRP1基因得到的重组载体，所述CHS_H1/XNRP1-pESC-His能表达CHS_H1和XNRP1。
[0036] 上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，酵母可为酵母细胞DD104。
[0037] 所述重组微生物具体可为将所述重组载体导入所述微生物中得到的微生物。
[0038] 上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
[0039] 本发明还提供了XNRP1或所述生物材料在提高黄腐醇合成途径中产物稳定性中的应用。
[0040] 本发明还提供了XNRP1或所述生物材料在制备提高黄腐醇合成途径中产物稳定性产品中的应用。
[0041] 本发明还提供了稳定黄腐醇合成途径中产物的产品，所述产品包括XNRP1或所述生物材料。
[0042] 所述产品可以XNRP1或所述生物材料作为其活性成分，还可将XNRP1或所述生物材料与其他具有相同功能的物质组合在一起作为其活性成分。
[0043] 本发明还提供了稳定黄腐醇合成途径中产物的方法，所述方法包括：利用XNRP1或所述生物材料实现稳定黄腐醇合成途径中产物。
[0044] 本发明中，所述产物可为查尔酮和/或脱甲基黄腐醇。
[0046] 图1为啤酒花中黄腐醇生物合成途径。其中，查尔酮为柚皮素查尔酮。
[0047] 图2为XNRP2与XNRP1对NC/N和DMX的含量变化的影响。CCL1/CHS_H1/PT1L、CCL1/CHS_H1/PT1L/XNRP2和CCL1/CHS_H1/PT1L/XNRP1分别表示DD104-CK、DD104-XNRP2和DD104-XNRP1提取物。
[0048] A为LC-Q-TOF-MS分析DD104-CK，DD104-XNRP2和DD104-XNRP1三种重组酵母细胞培养48h所产生的各产物的种类和色谱图。
[0049] B和C为DD104-CK，DD104-XNRP2和DD104-XNRP1提取物中NC/N和DMX的含量变化比较图。**，P<0.01(t-test)。
[0050] 图3为体外实验检测XNRP1与DMX和NC结合能力结果。
[0051] A.LC-Q-TOF-MS分析XNRP1-His和XNRP2-His纯化蛋白与黄腐醇途径中间产物DMX的结合能力。
[0052] B.DMX、6PN和8PN中DMX所占比例。
[0053] C.XNRP1与黄腐醇途径中产物DMX的结合能力检测结果。
[0054] D.XNRP1与黄腐醇途径中产物NC的结合能力检测结果。
[0055] 图4为啤酒花XNRP1和XNRP2的体外酶活分析。
[0056] A.查尔酮异构酶以柚皮素查尔酮(NC)为底物催化的反应，NC通常为非豆科植物中查尔酮异构酶的底物。
[0057] B.查尔酮异构酶以异甘草素(Isoliquiritigenin,IL)为底物催化的反应，IL通常为豆科植物中查尔酮异构酶的底物。
[0058] C.LC-MS分析XNRP1和XNRP2在PH6.4情况下以NC和IL为底物催化的产物。
[0059] D.LC-MS分析XNRP1和XNRP2在PH7.5情况下以NC和IL为底物催化的产物。
[0060] 图5为XNRP1和XNRP2基因在各组织中的表达情况。
具体实施方式
[0062] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0063] 下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
[0064] 下述实施例中的酵母细胞DD104(基因型MATαerg9-1erg20-2ura3his3leu2ade2)(Polyprenol formation in the yeast Saccharomyces cerevisiae:effect of farnesyl diphosphate synthase overexpression.Anna Szkopihska et al.，Journal of Lipid Research，38：962-668,1997)公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0065] 下述实施例中的pESC-Leu载体、pESC-His载体和pESC-Ura载体均为安捷伦科技有限公司(Catalog number 217455,Agilent Technologies Inc,USA)产品。
[0067] 下述实施例中的半乳糖缺陷型液体培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为6.7g/L无氨基酸的酵母氮源，20g/L半乳糖，1.3g/L氨基酸缺失培养基。
[0068] 其中，酵母氨基酸缺失培养基为固体粉末，各组成成分及其配比为：2.5g 1-腺嘌呤半硫酸盐：1.2g L-精氨酸：6.0g L-天冬氨酸：6.0g L-谷氨酸：1.8g L-赖氨酸：1.2g L-甲硫氨酸：3.0g L-苯丙氨酸：22.5g L-丝氨酸：12g L-苏氨酸：2.4g L-色氨酸：1.8g L-酪氨酸：9.0g L-缬氨酸。
[0069] 实施例1、XNRP1和XNRP2在黄腐醇合成途径中的应用
[0070] 本实施例提供了两种来自于啤酒花(Freshops公司)的两种蛋白质，其名称分别为XNRP1和XNRP2，XNRP1的氨基酸序列为序列表中序列1，其在啤酒花中的编码基因为序列表中序列2所示的DNA分子(将该DNA分子记为XNRP1基因)；XNRP2的氨基酸序列为序列表中序列3，其在啤酒花中的编码基因为序列表中序列4所示的DNA分子(将该DNA分子记为XNRP2基因)。
[0071] 一、本实施例在酵母细胞中重组了黄腐醇合成通路，以检测XNRP1和XNRP2在黄腐醇合成中的功能，具体方法如下：
[0072] 1、酵母表达载体的构建
[0073] 将pESC-Leu载体的Not I和Pac I识别序列间的DNA片段替换为CCL1基因(CoA连接酶基因，序列表中序列5)，保持其他序列不变，得到重组载体，将该重组载体命名为CCL1-pESC-Leu，CCL1-pESC-Leu能表达序列8所示的CCL1；
[0074] 将pESC-His载体的SpeI和Pac I识别序列间的DNA片段替换为CHS_H1基因(查尔酮合成酶基因，序列表中序列6)，保持其他序列不变，得到重组载体，将该重组载体命名为CHS_H1-pESC-His，CHS_H1-pESC-His能表达序列9所示的CHS_H1；
[0075] 将pESC-Ura载体的BamH I和Sal I识别序列间的DNA片段替换为PT1L基因(芳香类异戊烯基转移酶基因，序列表中序列7)，保持其他序列不变，得到重组载体，将该重组载体命名为PT1L-pESC-Ura，PT1L-pESC-Ura能表达序列10所示的PT1L；
[0076] 将CHS_H1-pESC-His的EcoRI和Not I识别序列间的DNA片段替换为XNRP1基因，保持其他序列不变，得到重组载体，将该重组载体命名为CHS_H1/XNRP1-pESC-His，CHS_H1/XNRP1-pESC-His能表达CHS_H1和XNRP1；
[0077] 将CCL1-pESC-Leu的BamH I和NheI识别序列间的DNA片段替换为XNRP2基因，保持其他序列不变，得到重组载体，将该重组载体命名为CCL1/XNRP2-pESC-Leu，CCL1/XNRP2-pESC-Leu能表达CCL和XNRP2。
[0078] 2、重组酵母细胞的制备
[0079] 将步骤1的CCL1-pESC-Leu、CHS_H1-pESC-His和PT1L-pESC-Ura导入酵母细胞DD104中，得到含有CCL1、CHS_H1和PT1L的核苷酸序列的重组酵母细胞，将该重组酵母细胞命名为DD104-CK，作为对照。
[0080] 将步骤1的CCL1-pESC-Leu、CHS_H1/XNRP1-pESC-His和PT1L-pESC-Ura导入酵母细胞DD104中，得到含有XNRP1、CCL1、CHS_H1和PT1L的核苷酸序列的重组酵母细胞，将该重组酵母细胞命名为DD104-XNRP1。
[0081] 将步骤1的CCL1/XNRP2-pESC-Leu、CHS_H1/XNRP1-pESC-His和PT1L-pESC-Ura导入酵母细胞DD104中，得到含有XNRP2、CCL1、CHS_H1和PT1L的核苷酸序列的重组酵母细胞，将该重组酵母细胞命名为DD104-XNRP2。
[0082] 3、重组酵母细胞黄腐醇通路中物质分析
[0083] 分别检测步骤1得到的重组酵母细胞DD104-CK、DD104-XNRP1和DD104-XNRP2中表达的黄腐醇通路中蛋白，具体步骤如下：
[0084] 1)重组酵母细胞的诱导表达
[0085] a)将重组酵母细胞接种到5mL葡萄糖缺陷型液体培养基中，30℃,230rpm震荡培养过夜，OD600检测酵母浓度，使OD600大于1.0；
[0086] b)收集酵母细胞，用ddH2O重悬菌体，5,000g离心5min，多次重复以洗去多余的葡萄糖缺陷型液体培养基；然后用10mL半乳糖缺陷型液体培养基重悬酵母菌体，使OD600为0.4,30℃,饲喂香豆酸(p-Coumaric acid)(香豆酸在培养基中的浓度为500μM)，230rpm震荡培养48小时，得到酵母培养液。
[0087] 2)重组酵母细胞中化合物的提取
[0088] a)检测酵母菌的浓度并作记录。然后吸取5mL步骤1)得到的酵母培养液，进行超声破碎(超声30s，静止20s，重复6次)，得到破碎产物；
[0089] b)向步骤a)的破碎产物中加入5mL含有1.5μM PIVP的乙酸乙酯(PIVP作为黄腐醇通路中进行定量分析的内标)。涡旋5min，静止15min。
[0090] c)步骤b)结束后，3,000g离心10min，取上清4mL于干净的玻璃管中，常温下氮气吹干，得到沉淀。
[0091] d)步骤c)结束后，向沉淀中加入500μL甲醇复溶，经0.22μm微孔滤膜过滤(有机尼龙膜)后分别得到DD104-CK提取物、DD104-XNRP1提取物和DD104-XNRP2提取物进行LC-Q-TOF-MS分析。
[0092] 3)LC-Q-TOF-MS分析
[0093] LC-Q-TOF-MS分析各重组酵母提取物，利用sigma公司的标准品N(柚皮素，Naringenin)、6PN和8PN，以及NC(柚皮素查尔酮，Naringenin chalcone，ChromaDex公司)和DMX(武汉Chemfaces公司)为标准品。
[0094] 液相色谱条件：
[0095] a)进样量1μL。
[0096] b)梯度溶液：
[0097] 溶液A,含有0.05％(体积百分比)甲酸、10％(体积百分比)乙腈和5mM甲酸铵的水溶液；
[0098] 溶液B,含有0.05％(体积百分比)甲酸、90％(体积百分比)乙腈和5mM甲酸铵的水溶液。
[0099] c)梯度程序：总流速为0.4mL/min；
[0100] 0～15min，溶液B的体积百分比由20％匀速升到90％，溶液A的体积百分比由80％匀速降至10％；
[0101] 15～17min，溶液B的体积百分比为90％，溶液A的体积百分比为10％。
[0102] 质谱条件：
[0104] 结果如图2所示。结果显示，在体外饲喂香豆酸(p-Coumaric acid)的条件下其提取物中含有脱甲基黄腐醇(DMX)，6PN和8PN。由于DMX不稳定，会自动环化成6PN和8PN，因此需计算DMX与6PN、8PN的总和以得知DMX的量。DD104-CK提取物中DMX的含量为2.0±0.31μmol/L/OD；而DD104-XNRP2在相同条件下得到的提取物中DMX含量为4.59±0.98μmol/L/OD，为DD104-CK提取物的2.3倍；而DD104-XNRP1在相同条件下得到的提取物中DMX含量为1.38±0.32μmol/L/OD，为DD104-CK提取物的0.7倍。表明，XNRP2可以提高黄腐醇合成途径中DMX的产量，而XNRP1可以降低游离DMX含量。
[0105] 另外，由于NC不稳定，会自动环化成N，因此，需测定N与NC的总含量以得知生成的NC的量。DD104-CK提取物中N/NC的含量(即N与NC的总含量)为34±3.06μmol/L/OD；而DD104-XNRP2在相同条件下得到的提取物中N/NC的含量为43.97±5.8μmol/L/OD，为DD104-CK提取物的1.4倍；而DD104-XNRP1在相同条件下得到的提取物中N/NC的含量与DD104-CK提取物没有显著差异，也就是说，DD104-XNRP2的NC的产量为DD104-CK的1.4倍，DD104-XNRP1的NC的产量与DD104-CK没有显著差异。表明，XNRP2可以提高黄腐醇合成途径中中间产物NC的产量。
[0106] 二、XNRP1蛋白能够与DMX结合
[0107] 为进一步检测DD104-XNRP1提取物中游离DMX产量的下降是否为XNRP1蛋白与DMX的结合引起的，具体进行了如下实验：
[0108] 1、重组载体的构建
[0109] 将pEasy-Blunt-E2载体(C端带有His tag，Trangen公司)与序列2所示的DNA分子(XNRP1基因)连接，得到重组载体，将该重组载体命名为XNRP1-pEasy，XNRP1-pEasy能表达XNRP1融合His tag的融合蛋白(记为XNRP1-His)。
[0110] 将pEasy-Blunt-E2载体(C端带有His tag)与序列表中序列4所示的DNA分子(XNRP2基因)，得到重组载体，将该重组载体命名为XNRP2-pEasy，XNRP2-pEasy能表达XNRP2融合His tag的融合蛋白(记为XNRP2-His)。
[0111] 2、蛋白的表达与纯化
[0112] 将XNRP1-pEasy导入大肠杆菌BL21(+)菌株，得到重组载体BL21(+)-XNRP1；将XNRP2-pEasy导入大肠杆菌BL21(+)菌株，得到重组载体BL21(+)-XNRP2；将pEasy-Blunt-E2载体导入大肠杆菌BL21(+)菌株，得到重组载体BL21(+)-CK，作为对照。按照如下方法表达纯化蛋白质：
[0113] a)挑取单克隆菌落加入5mL含有相应抗生素的LB培养基中，37℃,230rpm过夜培养。
[0114] b)按照1:100在200mL的含有相应抗生素抗生素的LB培养基中扩摇，至OD600约0.4～0.6。
[0115] c)冰上冷却菌液，加入终浓度1mM IPTG，16℃,180rpm振荡培养12h。
[0117] e)9,000g,4℃离心10min，取上清，加入800μL Ni-NTA Agarose，4℃冷室慢速旋转结合1h。
[0118] f)在4℃，将粗蛋白上清液和Ni-NTA Agarose的混合物加入空柱子(QIAGEN)中，然后用5倍柱体积的Washing Buffer冲洗柱子，使杂蛋白流出。
[0119] g)加入2mL Elution Buffer洗脱重组蛋白，用1.5mL的离心管收集重组蛋白。
[0120] h)蛋白电泳检测蛋白的浓度和纯度。
[0121] 其中，Binding Buffer溶剂为水，溶质及其浓度分别为20mM Tris-HCl(pH7.9),500mM NaCl,10mM咪唑；
[0122] Washing Buffer溶剂为水，溶质及其浓度分别为20mM Tris-HCl(pH7.9),500mM NaCl,20mM咪唑；
[0123] Elution Buffer溶剂为水，溶质及其浓度分别为20mM Tris-HCl(pH7.9),500mM NaCl,250mM咪唑。
[0124] 3、体外结合实验
[0125] 分别检测步骤2得到的XNRP1-His和XNRP2-His与DMX的结合能力，利用BL21(+)菌株得到的蛋白质作为对照。
[0126] 500μL反应体系中含有：50mM Tris-HCl(pH 7.5)，methol 20％(体积百分比浓度)，8μL酵母中提取黄腐醇类化合物(步骤一中的DD104-CK提取物，包括200μMNC/N和5μM DMX)，30μg XNRP1-His或XNRP2-His(每种反应体系一种蛋白质)，余量为水。
[0127] 将反应体系在4℃孵育8小时后，再用MagneHisTM蛋白纯化系统(Promega)将反应体系中的蛋白质重新纯化出来，利用乙酸乙酯将再纯化蛋白和剩余反应缓冲液中的化合物分别提取出来，进行LC-MS分析：
[0128] 利用MagneHisTM蛋白纯化系统(Promega)将反应体系中的蛋白质重新纯化出来按照如下步骤进行：向反应体系中加入10μL磁珠和500μL系统中的抽提缓冲液，4℃孵育半小时，利用磁力架吸附磁珠，将缓冲液吸出后，重新加入1mL抽提缓冲液颠倒重新，重复三次后，吸出900μL缓冲液即为剩余反应溶液，磁珠上带有再纯化蛋白，利用900μL乙酸乙酯分别涡旋抽提剩余反应溶液和带有再纯化蛋白的磁珠，氮气吹干，用200μL甲醇复溶，进行LC-Q-TOF-MS分析，LC-Q-TOF-MS分析步骤同步骤一。
[0129] 结果如图3中A和B所示，1表示对照反应体系得到的剩余反应溶液，2表示XNRP1反应体系得到的剩余反应溶液，3表示XNRP2反应体系得到的剩余反应溶液，4表示对照反应体系得到的带有再纯化蛋白的磁珠，5表示XNRP1反应体系得到的带有再纯化蛋白的磁珠，6表示XNRP2反应体系得到的带有再纯化蛋白的磁珠；N.D.表示无DMX。结果显示，XNRP1-His可以结合DMX，并维持DMX的高比例，表明，XNRP1-His可以提高黄腐醇合成途径中DMX的稳定性；而XNRP2-His不可以结合DMX。
[0130] 三、XNRP1结合DMX、NC的亲和力的测定
[0131] 用Applied Biosystems公司的Step one型号的荧光定量PCR仪测定XNRP1结合TM
DMX、NC的亲和力。利用Thermo fisher公司的试剂盒(Protein Thermal Shift DyeKit，货号4461146)进行测定。
DMX、NC的亲和力。利用Thermo fisher公司的试剂盒(Protein Thermal Shift DyeKit，货号4461146)进行测定。
[0132] 1、XNRP1与DMX的亲和力测定
[0133] 将DMX(武汉Chemfaces公司)利用DMSO溶解为DMX浓度为50mM的DMX母液，然后再利用缓冲液(50mM Tris-HCl，25mM NaCl，pH7.5)将DMX稀释，分别得到浓度为0.122μM，0.244μM，0.488μM，0.97μM，1.95μM，3.9μM，7.8μM，15.6μM，31.25μM，62.5μM，125μM，250μM的DMX工作液。
[0134] 测定XNRP1与DMX的亲和力，20μL亲和力测定体系中含有：5μM步骤二得到的XNRP1-His，8μL Thermo fisher公司的试剂盒中的缓冲液，5μL染料8×ROX，2.5μLDMX工作液，得到亲和力测定体系，每种体系中一种浓度的DMX工作液。混匀后放入荧光定量PCR仪中进行测定。仪器反应程序为20至90℃，以1％的升温速率进行升温，反应结束后得到蛋白溶解曲线。利用Thermo fisher公司的软件分析出各DMX浓度下蛋白的溶解温度，再GraphPad Prism 5进行作图。
[0135] 结果(图3中C)表明：XNRP1的确可以和DMX结合，平衡解离常数(Kd，也叫做亲和常数)为25.08μM。
[0136] 2、XNRP1与NC的亲和力测定
[0137] 将NC(ChromaDex公司)利用步骤1的MST反应缓冲液溶解为NC浓度为50mM的NC母液，然后再利用MST反应缓冲液将NC母液倍比稀释，分别得到NC浓度分别为0.244μM，0.488μM，0.97μM，1.95μM，3.9μM，7.8μM，15.6μM，31.25μM，62.5μM，125μM，250μM，500μM的NC工作液。
[0138] 按照步骤1中的亲和力测定方法，将DMX工作液替换为NC工作液，其他均不变，测定XNRP1与NC的亲和力。
[0139] 结果(图3中D)表明：XNRP1的确可以和NC结合，平衡解离常数(Kd，也叫做亲和常数)为43.56μM。
[0140] 以上实验结果说明，XNRP2可以提高黄腐醇合成途径中DMX以及NC的产量；而XNRP1蛋白能够与DMX和NC结合，提高DMX与NC的稳定性。
[0141] 实施例2、XNRP1和XNRP2的查尔酮异构酶的酶活
[0142] 利用实施例1得到的XNRP1-His和XNRP2-His检测XNRP1和XNRP2是否具有查尔酮异构酶的酶活，500μL查尔酮异构酶酶活检测体系如下：
[0143] 向50mM的Tris-HCl(pH为6.4或7.5，共设置两种pH值)中添加相应物质得到的反应体系，该反应体系中添加的各物质及其终浓度分别为：5％(v/v)乙醇，50μM底物(柚皮素查尔酮或异甘草素，每个反应体系一种底物，柚皮素查尔酮(ChromaDex公司，货号ASB-00014207-010 10mg)；异甘草素(sigma公司，货号I3766-10MG))，0.1mg/mL BSA及1μg XNRP1-His或XNRP2-His，每种反应体系一种蛋白，并利用不添加XNRP1-His和XNRP2-His的体系作为对照。
[0144] 将上述酶活检测体系于25度孵育30分钟。之后用500μL含内标PIVP的乙酸乙酯抽提5分钟，取400μL上清，用氮吹仪吹干，再用800μL甲醇复溶，LC-MS上样检测，所使用标准品为：柚皮素查尔酮(ChromaDex公司，货号ASB-00014207-010 10mg)；异甘草素(sigma公司，货号I3766-10MG)；柚皮素(sigma公司，产品编号52186)；甘草素(Target Mol公司，T3325 10mg)。
[0145] 结果显示，XNRP1和XNRP2均不具备查尔酮异构酶的催化活性，不能将柚皮素查尔酮(NC)环化生成查尔酮(N)，也不能将异甘草素(Isoliquiritigenin,IL)环化生成甘草素(Liquiritigenin,L)(图4)。
[0146] 实施例3、XNRP1和XNRP2基因在各组织中的表达情况分析
[0147] 选取啤酒花的根、茎、幼叶、老叶、苞片、球果和腺毛7个组织，用RNA提取试剂盒提取RNA，反转录成cDNA后，采用荧光定量PCR的方法，以GAPDH为内参基因，确定XNRP1基因和XNRP2基因在各组织中转录水平的相对表达量。
[0148] XNRP1基因所用引物为：5′-GGCAACTGCCCTCAACTC，3′-CCTTAATTCCCATGCCAAGT。
[0149] XNRP2基因所用引物为：5′-ACTTGGACTCCGATGTTGTGA，3′-CCGTATTGGGACCCTTTGA。
[0150] GAPDH基因所用引物为：5 ′-GCACTGGAGCTGCTAAGGCTG，3 ′-CCTGCTGTCACCAATGAAGTCG。
[0151] 结果显示，XNRP1和XNRP2均在腺毛中特异高表达(图5)
[0152] 实施例4、亚细胞定位分析
[0153] 将pJIT163载体的BamH I和Not I识别序列间的DNA片段分别替换为XNRP1基因、XNRP2基因、OMT1基因、CHS_H1基因和CCL1基因，得到五种重组载体，这四种重组载体均能表达相应蛋白质与GFP的融合蛋白质，融合蛋白质的表达均由35S启动子驱动。
[0155] 结果表明，与查尔酮异构酶(CHS_H1)、甲基转移酶(OMT1)、CoA连接酶(CCL1)相同，XNRP1和XNRP2也均定位于细胞质(图6)。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 序列特异性检测和表型确定 | 2020-05-12 | 506 |
| 用于提高表达的细菌前导序列 | 2020-05-13 | 773 |
| 一种抑制caspase-3基因表达的siRNA序列 | 2020-05-13 | 298 |
| 一种抑制bak基因表达的siRNA序列 | 2020-05-13 | 52 |
| 人类肝脏中表达的表达序列标签I组 | 2020-05-11 | 225 |
| 人类肝脏中表达的表达序列标签E组 | 2020-05-11 | 628 |
| 表位序列 | 2020-05-11 | 100 |
| 表达序列 | 2020-05-11 | 388 |
| 增强表达的内含子序列 | 2020-05-11 | 103 |
| 时间序列数据的多表示存储 | 2020-05-12 | 327 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈