发明领域

本发明提供了对无脊椎动物免疫性、优选地海洋无脊椎动物例如 甲壳动物免疫性、更特别地无脊椎动物抗病毒免疫性的更好的了解。 本发明还提供了在无脊椎动物、优选地海洋无脊椎动物如甲壳动物 (例如虾、龙虾、螃蟹)、软体动物(例如蜗牛、蛤、鱿鱼等)或其它无 脊椎动物中通过给予至少一种双链RNA而诱导非特异性(全身性)免 疫性的方法和材料。

本发明还提供了通过给予至少一种长或短双链RNA而在甲壳动 物或另一种无脊椎动物中诱导非特异性(全身性)免疫应答和序列特 异性RNA干扰应答两者之一或两者的方法和材料。

本发明还提供了通过共同给予至少一种dsRNA和一种非特异性 dsRNA而增强RNA干扰应答的方法和材料，所述至少一种dsRNA 具有一种序列，其提供了对一种含有与其杂交的序列的基因的定向抑 制，所述非特异性dsRNA作为“佐剂”起作用，因为其给予会促进(增 强)由给予所述第一种序列特异性dsRNA引发的免疫应答。所述共同 给予涵盖了以任何顺序将所述序列特异性dsRNA和非特异性dsRNA 联合或分别给予。

本发明还特别涉及dsRNA在调节内源性海洋无脊椎动物基因、 例如软体动物或甲壳动物基因如参与免疫、生长、生殖和一般健康状 况或“健壮性”的基因以及感染海洋无脊椎动物优选软体动物和甲壳 动物的病原体的必需基因的表达中的应用。这类基因包括例如STAT、 IKB以及NFKB和STAT信号传导途径的其它推定成分。这类基因还 包括编码神经递质、激素和包括蜕皮抑制激素、性腺抑制激素和甲壳 动物高血糖激素在内的代谢途径的基因。这类基因还包括编码抗微生 物肽或产生这些肽(包括crustins和penaeidins)的调节物的基因。潜在 地，可以使用dsRNA减量调节任何期望的海洋无脊椎动物例如软体 动物或甲壳动物基因的表达。例如，可以在基因组文库例如用对照和 病毒(WSSV或TSV)感染的虾组织产生的抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization)文库中鉴别推定的靶基因。潜在靶基因的其 它特异性实例包括VP28、核糖核苷酸还原酶、血蓝蛋白、VP26、VP19、 胸苷酸激酶和DNA聚合酶。

优选地，本发明涉及给予一种dsRNA，所述dsRNA具有与甲壳 动物基因或通常感染甲壳动物的病原体的基因相同的序列，或者与甲 壳动物基因或通常感染甲壳动物的病原体的基因呈高序列相同性，例 如至少75％、更优选至少85-90％、更优选90-99％相同性的序列。在 虾的情况中，这类病原体包括病毒如白斑综合征病毒(White spot syndrome virus)、Taura综合征病毒(Taura syndrome virus)、传染性皮 下和造血器官坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV)、对虾杆状病毒(Baculovirus of penaeid shrimp， BP)、对虾弹状病毒(Rhabdovirus of penaeid shrimp，RPS)、鳃相关病毒 (Gill-associated virus，GAV)、黄头病毒(Yellow head virus，YHV)、淋巴 器官相关病毒(Lymphoid organ-associated virus，LOVV)、类淋巴器官 细小样病毒病(Lymphoidal parvolike viral disease，LPV)、肝胰腺细小病 毒(Hepatopancreatic parvovirus HPV)、杆状病毒中肠腺坏死病毒 (Baculoviral midgut gland necrosis virus，BMN)、草虾杆状病毒 (Monodon baculovirus，MBV)、呼肠孤病毒样病毒病(Reo like virus diseases，REO)、弹状病毒(Rhabdovirus，RPS)和新兴病毒，它们的必 需基因可以通过本领域技术人员已知的任何手段进行测序。(新兴病 毒是指尚未鉴别的或后来例如通过重组或突变从已知病毒产生的病 毒。新兴病毒可通过例如与病毒的已知基因组和野生型虾的基因组经 例如扣除杂交(subtractive hybridization)进行对比而被分离和鉴别。)

更特别地，本发明提供了在任何无脊椎动物特别是海洋甲壳动物 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)和其它虾中诱导序列非依赖性一 般抗病毒保护和潜在地抗其它寄生物如细菌、真菌、微孢子虫 (microsporidian)、单孢子虫(haplosporidian)和簇孢虫(gregarine)的保护 的方法和材料。

另外，本发明首次证明无脊椎动物免疫系统与脊椎动物免疫系统 类似，可以以病毒相关分子模式识别dsRNA，导致激活先天抗病毒 应答。

另外，本发明提供了用于将至少一种dsRNA送递至甲壳动物、 软体动物或其它无脊椎动物优选为虾中的生物送递载体，其中所述生 物送递载体是一种生物体，如酵母或微藻类(microalgae)，其稳定地或 短暂地表达dsRNA并且所述生物体可以被甲壳动物或其它无脊椎动 物安全地摄食。在一个优选的实施方案中，本发明提供了重组酵母 (yeast)，例如酵母菌属(Saccharomyces)，或者重组微藻类，例如衣藻 属(Chlamydomonas)、小球藻属(Chlorella)、节旋藻属(Arthrospira)(螺 旋藻属(Spirulina))等，它们表达在诱导型或组成型启动子控制下的至 少一种异源dsRNA。

相关领域的描述

本发明涉及通过使用dsRNA分子调节、优选地抑制基因表达的 定向和非定向方法。实现基因表达的抑制的方法是本领域熟知的。这 类方法包括使用反义核酸、三螺旋方法、共抑制和RNA干扰或RNA 沉默。

使用反义核酸以使干扰工程化

反义技术在各种方案中是最常被描述的实现基因特异性干扰作 用的方法。对于反义策略，将与感兴趣的基因的信使RNA互补的单 链核酸按照化学计量导入细胞。基于反义的方法的一些问题涉及送 递、稳定性和剂量要求。一般地，细胞不具有摄取单链核酸的机制， 因此对未修饰的单链材料的摄取是非常低效的。在等待被摄入细胞 时，所述单链材料易被降解。因为反义干扰要求干扰材料以相对高浓 度(处于或高于内源性mRNA的浓度)积聚，需要送递的量是效果的主 要制约因素。其结果是，开发反义技术的大部分努力集中在产生修饰 的核酸，这些修饰的核酸针对核酸酶消化是稳定的，并且能容易地扩 散进细胞中。基因治疗所用的反义干扰或其它全生物体应用受到如下 限制：即需要从非天然类似物合成大量寡核苷酸，这种合成的成本的 限制，以及即使有高剂量，但是在每一细胞中难以维持足够浓度的均 匀的干扰材料集合的限制。

使干扰工程化的三螺旋方法

使干扰工程化的第二种方法基于三螺旋核酸结构。这一方法依赖 于某些核酸群体采取三链结构的稀有能力。在生理条件下，核酸基本 上全部是单链或双链的，极少形成三链结构。但是一段时间以来已知 某些简单的富含嘌呤或嘧啶的序列可以在极端pH条件下在体外(即 在试管中)形成三链分子。这类结构在生理条件下通常是非常短暂的， 从而简单地送递设计用于产生三链结构的未修饰的核酸不产生干扰 作用。与反义技术一样，用于体内应用的三链技术的开发集中于开发 修饰的核酸，所述核酸更稳定且更容易被细胞在体内吸收。开发这一 技术的另一目的是产生修饰的核酸，以便三链材料的形成在生理pH 下有效进行。

共抑制现象及其在遗传工程中的应用

基因特异性干扰的第三种方法是统称为“共抑制”的一系列操作 程序。这一方法首先在植物中被描述，并且指转基因导致一未连锁的 但同源的基因沉默的能力。最近，类似于共抑制的现象已在两种动物 即秀丽隐杆线虫(C.elegans)和果蝇中报道。共抑制首先是偶然被观察 到的，报道来自一些使用转基因试图实现一潜在有用的基因座的过表 达的研究小组。在一些情况中，所述过表达是成功的，但是在许多其 它情况下，结果与预期的相反。在那些情况下，转基因植物实际上显 示内源基因表达降低。迄今为止对于植物中转基因介导的共抑制已经 给出了若干机理，但是所有这些机理预测均停留在假说阶段，目前没 有提出该过程的明确的机理描述。所建议的解释共抑制的模型可分成 两个不同的类别。在一类建议中，假设了在两个不同染色体位点之间 发生了DNA或染色质水平的直接物理相互作用，一种尚未鉴别的机 制然后导致从头甲基化以及随后的基因表达的抑制。

RNA干扰或RNA沉默

抑制细胞或动物中靶基因表达的另一方法是RNA干扰(RNAi)或 RNA沉默。该方法包括将具有部分或全部双链特征的RNA(dsRNA) 导入细胞中或导入其胞外环境中。抑制是特异的，因为来自靶基因的 一部分的核苷酸序列被选择以产生双链抑制性RNA。这一方法(1)在 产生基因表达的抑制方面是有效的，(2)特异于靶基因，(3)使得抑制 许多不同类型的靶基因的表达。

例如，所述靶基因可以是来自所述细胞的基因、内源基因、转基 因、或在感染细胞后存在于细胞中的病原体的基因。取决于特定的靶 基因和送递的双链RNA材料的剂量，该方法可提供所述靶基因功能 的部分或全部丧失。

在一些授权专利和许多最近公开的专利申请中已经报道了通过 RNA干扰或RNA沉默而用于抑制靶基因表达的方法和材料。参见例 如Fire等人的美国专利6,506,559；Liu等人的美国专利6,326,193； Graham等人的WO99/49029；以及Graham等人的美国专利6,573,099。

根据上述，Graham的专利(转让给Benitec)的RNA干扰方法和材 料需要使用分离的DNA构建体，所述DNA构建体包含至少两个拷 贝的相应于表达待被延迟、阻抑或抑制的靶基因的序列，这些拷贝均 与一单个启动予以有义方向可操纵地连接。相反，Fire专利的RNA 干扰方法使用任何双链分子，其中第一链基本上由相应于靶基因的核 苷酸序列的一种核糖核苷酸序列组成，第二链与靶基因的核苷酸序列 互补，从而这两条链杂交形成抑制靶基因表达的双链RNA分子。

RNA干扰在机理上是一个两步过程。在第一个步骤中，dsRNA 引发沉默应答，导致dsRNA被裂解成21-23个核苷酸长的小干扰 RNA。裂解由一种RNase-III家族核酸酶Dicer完成。在第二个步骤 中，siRNA被掺入一种定向复合物RISC(RNA诱导的沉默复合物)中， 所述定向复合物破坏与整合的siRNA同源的mRNA(Silver etal， Trends in Mol.Med.8(11)：505-508(2002))。

最近已报道RNA干扰是探查基因功能的有力工具并且具有开发 新的抗病毒治疗剂的潜力(Silver etal(文献同上))。但是，尽管所述 RNAi途径已被认定为一种保守的生物学过程，但是其是一种尚未被 充分了解的过程，并且其在不同物种中引起不同作用。例如，尽管 dsRNA在包括一些原生动物、动物、植物和真菌在内的生物体中可 以诱导同源RNA的降解，导致转录后基因沉默，但是在一些物种中， RNA介导的过程可导致翻译阻抑、DNA甲基化、异染色质形成和 DNA消除。在一些情况中，“触发物”双链RNA的扩增是有效沉默 所需的(Cerutti et al，Trends in Genetics 19(1)：39-46(2003))。

目前大多数RNAi研究集中于dsRNA对靶基因表达水平的序列 特异性作用。但是，还已知的是在脊椎动物中给予dsRNA引起全身 性(非序列特异性)免疫应答。例如，Sledz etal，Nature Biol.Advance Online Publication报道了在哺乳动物系统中通过给予短干扰RNA而 激活干扰素系统。具体地，Sledz et al(文献同上)产生了一些特异于 lamin和GAPDH基因的21个核苷酸长的dsRNA，他们报道这些 dsRNA诱导了干扰素介导的JAK-Stat途径的激活以及IFN刺激的基 因的全局增量调节(文献同上)。这一全身性应答作用据报道是由 dsRNA依赖性蛋白激酶(PKR)介导的，这种蛋白激酶由siRNA激活并 且是应答siRNA而增量调节IFN-β所需的。

尽管无脊椎动物免疫系统已经在抗细菌和抗真菌应答方面被很 好地研究，但是还没有细胞或分子水平的有关针对病毒的无脊椎动物 免疫应答的信息。相反，在哺乳动物中，抗病毒和抗细菌的先天应答 包括部分重叠的但是不同的途径，其中干扰素系统包括最主要的先天 抗病毒应答。

已知干扰素(IFN)包括一系列细胞因子，它们应答病毒感染和其 它入侵而表达，并且调节大量的细胞和系统性应答以控制病毒繁殖 (参见Levy et al.，Cytokine Growth Factor Rev.12：143-156(2001)和 Goodbum et al.，J.Gen.Virol.81：2341-2364(2000)的综述)。当通过循 环IFN诱导细胞时，通过Janus激酶/信号转导物和转录激活物(Janun kinase/Signal Transducer and Activator of Transcription，JAK/STAT)系 统的信号转导导致诱导几百个基因(de Veer et al.，L. Leuc.Proc.Biol. 69：912-20(2001)；Ehrt et al.，J.Exp.Med.194：1123-40(2001))。IFN诱 导型基因包括编码RNA依赖性蛋白激酶(PKR)、Mx蛋白、寡腺苷酸 合成酶(OAS)和IFN本身的基因。这种自扩增系统可以不仅由IFN触 发，而且也可由病毒成分直接触发。INF应答的强诱导物是双链RNA (dsRNA)，其是一种作为病毒基因组复制以及具有广泛二级结构的病 毒RNA的结果而在病毒感染过程中经常发生的分子(参见Jacobs et al.，Virology 219：339-49(1996)的综述)。在哺乳动物中，dsRNA被 TLR3受体识别，激活髓样分化因子88(Myd88)依赖性和非依赖性信 号转导级联，导致IFNβ表达。dsRNA还通过直接激活PKR诱导细胞 内抗病毒应答，导致通过真核翻译起始因子2a(eIF2a)的磷酸化而抑制 细胞和病毒蛋白合成(Meurs et al.，Cell 62：379-90(1999))。现已广泛 认可的是无脊椎动物中缺乏这些dsRNA诱导的免疫应答，对这一结 论的支持是在几种完全测序的无脊椎动物基因组中缺乏与IFN或IFN 应答的主要效应子(例如PKR、Mx、OAS)具有结构同源性的基因 (Adams et al.，Science 287：2187-95(2000)；The C.elegans Sequencing Consortium Science 282：2012-80(1998)；Dehol et al.，Science 298：2157-2167(2002)；Hot et al.，Science 298：129-49(2002))。

最近，随着dsRNA介导的翻译后基因沉默(PTGS或RNAi)的发 现，体内dsRNA生物学性质的复杂性变得越来越清楚。这一现象在 植物和动物、脊椎动物和一些无脊椎动物如线虫类(Fire et al.，Nature 391：806-11(1998))、和昆虫(Misquitta et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9-0：451-6(1999))、以及哺乳动物(Svoboda et al.，Devel.127：4147-56 (2000))中均观察到。这一过程包括用RNAase III Dicer将dsRNA加工 成21-25bp长的短双螺旋，已知称为短干扰RNA(siRNA)(Burnstein et al.，Nature 409：363-6(2001))。这些siRNA被用于识别同源mRNA 并触发其被与RNA诱导的沉默子复合物(RISC)相关的RNA酶活性降 解(Hammond et al.，Nature 404：293-6(2000)；Hammond et al.，Science 293：1146-50(2001))。已经猜想RNAi代表一种古老的抗病毒机制， 其用于抑制病毒基因产物在被感染的细胞中表达，因为病毒dsRNA 通常在感染过程中发生。例如，在植物和动物病毒中均存在逃避RNAi 途径的病毒策略(Li et al.，Science 296：1319-21(2002)；Li et al.，Proc. Nati.Acad.Sci.，USA 101：1350-5(2004)；和Silhavy et al.，EMBO J.， 21：3070-80(2002))。

尽管dsRNA的导致内源性RNA降解的序列特异性作用是广泛保 守的，并且可能存在于大多数无脊椎动物中，但是长期以来一直认为 dsRNA对抗病毒免疫性的序列非依赖性诱导仅限于脊椎动物。

非常出乎意料地，本发明人发现至少在海虾凡纳滨对虾中给予非 特异性dsRNA(与任何已知内源性无脊椎动物基因均不显示同源性的 dsRNA)产生了普遍的抗病毒应答，并且基于这些结果，可能在其它 甲壳动物和无脊椎动物中也是如此。本发明首次提供了证据表明无脊 椎动物能应答一种真实的病毒相关分子结构(dsRNA)而展示诱导型 抗病毒免疫性。这一创造性发现提示无脊椎动物中的先天抗病毒免疫 性具有脊椎动物抗病毒应答，包括由dsRNA诱导的免疫应答的一些 分子特征。

最近，Timmons et al.，(Mol.Biol.Of the Cell 13：2972-2983(July 2003))报道了在一种无脊椎动物系统中，dsRNA能引起基因特异性 RNA干扰应答，其也具有全身性特征，即基因表达的沉默在远离 dsRNA送递位点的细胞中观察到。在秀丽隐杆线虫系统中，Timmons et al.(见上)报道了从组织特异性启动子转录dsRNA的一种秀丽隐杆 线虫转基因株系不呈现全面的全身性RNA干扰表型。他们进一步报 道无关dsRNA分子的外源性送递引起可检测的全身性RNA沉默表 型，但是fed-1或fed-2缺陷的动物不能产生针对摄入的dsRNA的强 全身性沉默应答。Timmons et al(见上)提示这导致了细胞摄入和输出 RNA沉默信号的多重和/或组织特异性机制的可能性。

在本发明之前，关于甲壳动物免疫机制所知甚少。特别是已知甲 壳动物具有一些初步的体液和细胞防御机制。体液免疫反应包括凝 血、前酚氧化酶级联的激活以及抗一些细菌和真菌的抗微生物肽的产 生和释放。细胞防御机制主要涉及循环的血细胞，这些血细胞参与包 囊、吞噬和胞内杀死病原体。甲壳动物吞噬血细胞显示典型的呼吸释 放(respiratory burst)，导致产生活性氧物种。还已知细胞合成一些有 效的抗微生物分子。特别地，青蟹(Callinectes sapidus)和海虾(草虾 (Penaeus monodon))的腮也经过一种尚不清楚的分子途径从血液中清 除一些外来蛋白质。另外，最近，Toll/NFKB途径的一些推定成分被 报道存在于牡蛎和鲎中。但是，这些基因的功能(如果有)仍是未知的， 并且由于缺少证据、特别是考虑到Toll/NFKB基因的功能在不同物种 中的差异而不能被预测。

然而，没有证据提示甲壳动物或其它无脊椎动物能产生针对 dsRNA的非序列特异性免疫应答。实际上，Lee和Soderhall(Fish& Shellfish Immunol.14：421-437(2002))最近的综述文章提供了关于现 在已经了解的甲壳动物先天免疫的详细综述，但是其不包括涉及 dsRNA的任何提示(文献同上)。另外，Smith et al.，Fish&Shellfish Immunol.10：1-20(2003)的一篇最近的文章质疑了甲壳动物中免疫刺 激作为抗病毒感染保护的手段的作用功效，并且指出使用推定的免疫 刺激剂对原种动物保持良好状态的潜在威胁。类似地，这篇文章尽管 引用了据信参与甲壳动物免疫的关键蛋白质，但是其不包含任何关于 甲壳动物能应答dsRNA的提示。

实际上，在本发明之前甲壳动物和其它无脊椎动物物种中dsRNA 的全身性作用是不知道的。另外，在本发明之前也不知道甲壳动物特 别是虾，以及很可能其它海洋无脊椎动物具有引起RNA干扰应答所 需的细胞机制。

发明目的

因此，本发明的一个目的是提供对无脊椎动物、例如甲壳动物免 疫性的更多的了解。(尽管在实验部分本发明举例示出在甲壳动物特 别是虾中的本发明发现，但是预期本发明方法可用于其它无脊椎动 物，特别是与甲壳动物密切相关的无脊椎动物，例如其它海洋无脊椎 动物如有壳和无壳软体动物，例如鱿鱼、蛤、章鱼、蛞蝓、蜗牛等；多 孔动物(海绵)；刺胞动物(水母、珊蝴虫、水螅虫)；栉水母动物(comb jellies)；棘皮动物(海星，蛇尾海星(Brittle Star))和海生蠕虫。但是本发 明包括其它无脊椎动物，例如昆虫、蜘蛛、蜈蚣和千足虫(millipede))。

本发明的另一目的在于提供在无脊椎动物中通过给予至少一种 双链RNA而抑制基因表达和/或诱导全身性免疫应答，特别是全身性 抗病毒免疫或针对感染无脊椎动物的其它寄生物例如细菌或真菌的 免疫的新方法。

本发明的一个更特殊的目的是提供在无脊椎动物，优选地在海洋 无脊椎动物如甲壳动物，更优选地在虾中通过给予至少一种双链 RNA而诱导非特异性(全身性)保护性免疫应答的方法，所述双链RNA 针对感染这种无脊椎动物的不同病原体，例如病毒、细菌、真菌、线 虫、支原体、微孢子虫、单孢子虫、簇孢虫和最优选地病毒例如甲壳 动物相关病毒诱导保护性、非特异性(全身性)免疫应答。

本发明的另一目的在于提供在甲壳动物优选虾中通过给予至少 一种长双链RNA而诱导抑制所述甲壳动物内源性靶基因或者包含在 感染所述甲壳动物的病原体中的必需基因的表达的序列特异性 dsRNA介导的应答的方法，所述长双链RNA具有基本上相应于包含 在所述甲壳动物或病原体例如病毒中的靶基因的序列，其中所述序列 特异性免疫应答产生针对寄生物例如病毒的序列特异性保护。

本发明的另一目的在于通过给予至少一种双链RNA而在甲壳动 物例如在虾中既诱导非特异性(全身性)免疫应答又诱导抑制或防止 靶基因表达的序列特异性RNA干扰应答，其中所述靶基因是甲壳动 物的基因或者一种必需的病原体基因，并且其中所述全身性免疫应答 和所述序列特异性dsRNA应答的组合赋予针对通常感染所述甲壳动 物的病原体例如病毒、细菌、真菌、线虫、支原体、单孢子虫、小孢 子虫或簇孢虫的保护作用，其中至少一种所述被给予的dsRNA具有 基本上相应于或相同于所述甲壳动物或感染所述甲壳动物的病原体 中含有的靶基因所包含的序列。例如，推定的靶基因可以在基因组文 库例如用对照和病毒(WSSV或TSV)感染的虾组织产生的抑制消减杂 交文库中鉴别。潜在的靶基因的其它具体例子包括VP28、核糖核酸 还原酶、血蓝蛋白、VP26、VP19、胸苷酸激酶和DNA聚合酶。

其具体的例子包括相应于参与免疫、生长、生殖和一般健康或“健 壮性”的甲壳动物基因和病原体的必需基因。这些基因包括例如 STAT、IKB和NFKB和STAT信号传导途径的其它推定成分。这些 基因也包括编码神经递质、激素和包括蜕皮抑制激素、性腺抑制激素、 甲壳动物高血糖激素的代谢途径的基因。这些基因还包括编码抗微生 物肽或用于产生这些肽(包括crustin和penaeidin)的调节物的基因。 潜在地，dsRNA可用于减量调节任何期望的甲壳动物基因的表达。

本发明的另一优选目的是通过共给予非特异性dsRNA(例如，聚 C:G)和序列特异性dsRNA(靶向一特定基因)而增强RNA干扰的功 效，由此所述非特异性dsRNA作为一种“佐剂”并增强所述序列特 异性dsRNA对靶基因表达的作用。

在优选的实施方案中，dsRNA被给予一种甲壳动物或其它海洋 无脊椎动物，优选地被给予虾，所述病原体是一种虾病毒，例如白斑 综合征病毒(WSSV)、Taura综合征病毒(TSV)、传染性皮下和造血器 官坏死病毒(IHHNV)，对虾杆状病毒(BP)，对虾弹状病毒(RPS)， 腮相关病毒(GAV)，黄头病毒(YHV)，淋巴器官相关病毒(LOW)，类 淋巴器官细小样病毒病(LPV)，肝胰腺细小病毒(HPV)，杆状病毒中 肠腺坏死病毒(BMN)，草虾杆状病毒(MBV)，呼肠孤病毒样病毒病 (REO)，弹状病毒(RPS)和新兴病毒，它们的必需基因可以通过本领 域技术人员已知的任何手段进行测序。(如以前所述，新兴病毒是指 尚未鉴别的或稍后通过重组或突变产生的病毒，它们可以通过与野生 型虾基因组进行比较(例如通过扣除杂交)而被分离或鉴别。)

本发明的再一目的是使用功能基因组学鉴别参与无脊椎动物免 疫，特别是海洋无脊椎动物免疫，及优选地甲壳动物(例如虾)免疫应 答、生长、生殖和一般健康状况或健壮性、特别是虾免疫应答的基因 的推定的直向同源物，例如STAT样和I-KB激酶样基因。

本发明的一个特殊目的是产生具有推定的免疫调节基因的受损 的或缺失的表达的无脊椎动物细胞或动物，优选地甲壳动物细胞或动 物，以证实基因功能及其在提供针对病毒和/或其它内源性寄生物的 保护方面的作用。

本发明的另一目的是鉴别增量调节或减量调节参与海洋无脊椎 动物例如甲壳动物免疫性、生长、生殖和一般健康状况或“健壮性” 的基因例如STAT样基因和I-KB激酶样基因的化合物，以及确定这 些基因在甲壳动物抗病毒免疫性和炎症中的作用。

本发明的再一目的是鉴别在通过给予至少一种双链RNA或病毒 感染而引起诱导非特异性(全身性)免疫应答后，被增量调节或减量调 节的特异的无脊椎动物基因，优选地海洋无脊椎动物例如甲壳动物基 因和更优选地虾基因。这些基因例如STAT样、Toll、NFKB和“细 胞因子样”基因的功能分析将促进对先天性无脊椎动物免疫、特别是 甲壳动物免疫的更多的了解，另外将使得能鉴别调节这些基因的表达 并因此可用于调节先天性无脊椎动物免疫应答的化合物。

本发明的另一目的是产生生物送递载体，优选地微生物生物送递 载体如微藻类和酵母，它们表达异源dsRNA和/或表达引起一般免疫 应答(generic immune response)的至少一种长dsRNA，所述异源dsRNA 例如是特异于感染甲壳动物的病原体(例如甲壳动物相关病毒、细菌、 小孢予虫、单孢子虫或簇孢虫)的必需基因或者特异于内源性甲壳动 物基因(例如参与免疫、生长、生殖和一般健康状况或“健壮性”的 基因)的dsRNA。

本发明的一个特殊目的是提供表达至少一种如下的dsRNA和/或 表达引起一般免疫应答的至少一种长dsRNA的酵母(优选地酵母菌属) 或者微藻类，所述dsRNA例如是特异于感染甲壳动物的病原体(例如 甲壳动物相关病毒、细菌、小孢子虫、单孢子虫或簇孢虫)的必需基 因或者特异于内源性甲壳动物基因(例如参与免疫、生长、生殖和一 般健康状况或“健壮性”的基因)的dsRNA，其中所述表达优选地在 诱导型启动子的调节下。

本发明的另一目的是将期望的dsRNA送递至海洋无脊椎动物， 例如甲壳动物或软体动物，优选地虾中，所述送递通过将所述甲壳动 物例如虾与含有所述dsRNA的培养基或包含至少一种表达所述 dsRNA和/或表达引起一般免疫应答的至少一种长dsRNA的微生物， 优选地酵母或微藻类接触而实现，所述dsRNA例如是特异于感染甲 壳动物的病原体(例如甲壳动物相关病毒、细菌、小孢子虫、单孢子 虫或簇孢虫)的必需基因或者特异于内源性甲壳动物基因(例如参与 免疫性、生长、生殖和一般健康状况或“健壮性”的基因)的dsRNA， 其中所述表达优选地在诱导型启动子的调节下。

附图详细描述

图1：在凡纳滨对虾中dsRNA介导全身性和序列特异性mRNA 耗竭：虾(1-2g)用25μg dsRNA(组a)或用10μg dsRNA或盐水(组b或 c)经肌内注射。组a：3只虾(各1-2g)用25μg dsRNA经肌内注射， 注射后48小时处死动物，来自肝胰腺的合并的总RNA用Northern 印迹分析。泳道1含有来自血蓝蛋白dsRNA注射的动物的总RNA。 使用所指示的探针并杂交而影印印迹。来自PJV627样mRNA的推定 的降解产物用星号(*)指示。组b：虾(1-2g)用跨越IKBK EST克隆的 376bp的10μg dsRNA或用盐水注射，然后在不同时间点取样，以提 取腮总RNA。RT-PCR扩增的转录物的335bp区域不与用于合成 dsRNA的区域重叠。HaeIII-消化的φ×174 DNA用作标准。阴性对照 (-)是cDNA模拟样品，其中没有包括RNA模板或者没有反转录酶。 指出了以注射后天数(D1至D7)表示的动物被取样时的时间，以及每 组中使用的引物。组C：虾(1-2g)用跨越STAT EST克隆370bp的10μg dsRNA或用盐水注射，然后在不同时间点取样，以提取腮总RNA。 RT-PCR扩增的转录物的314bp区域不与用于合成dsRNA的区域重 叠。对照和标记如组b。

图2：WSSV基因的dsRNA针对WSSV感染保护凡纳滨对虾： 虾(1-2g)用盐水或特异性dsRNA与1∶3,000,000 w/v稀释度的含有 WSSV的组织提取物一起肌内注射。阴性对照用类似w/v稀释度的无 特异性病原体的虾(SPF)提取物注射。为进行经口感染，动物用 dsRNA注射，然后喂以0.01g WSSV感染的肌肉组织或SPF组织2 小时。在组a中，每只动物使用12μg鸭v、核糖核苷酸还原酶(RR)、 DNA聚合酶(DP)或vp28(28)dsRNA。在组b中，鸭vdsRNA也以每 只动物12μg使用，而RR dsRNA以每只动物12或1.2μg使用，如 图所示。

图3含有单链及双链vp19 RNA的琼脂糖凝胶电泳实验。由体外 转录合成的两条单链(S1和S2)退火形成dsRNA(D)。每一泳道上样约 2μg。

图4比较了在用WSSV病毒攻击后编码WSSV的5个基因的 dsRNA或它们的混合物对存活率的作用。

图5：dsRNA在虾中诱导抗病毒状态。虾(1-2g)用盐水(阳性 和阴性 对照)或8μg所示dsRNA肌内注射。dsRNA注射后72小时， 动物(n＝38-42)经肌内注射TSV(组a)或WSSV(组b和c)而感染，如 下文“材料和方法”一节所述。在组a中，阳性对照和dsRNA处理 的虾中TSV剂量增加1000倍(从1×10-8至1×10-5w/v稀释度)的效果也 在虚线的死亡率曲线中示出。dsRNA制剂是鸭Igv.的309bp部分 (登录号#AJ312200)；来自鲶鱼IgH基因座的克隆BAC6的1316bp 基因组非编码区 (登录号#CC936713)；猪IgG cDNA的1079bp 部分 (登录号#U03778)；和细菌人工染色体(BAC)克隆载体 pBeloBAC11(Kim et al.，Genomics 34：213-8，1996)的1184bp片段 通过比较dsRNA处理组的最终累积死亡率和阳性对照组中的最终累 积死亡率，使用chi-平方统计法评价所观察到的抗病毒保护的显著 性：组a)鸭Igv dsRNA(χ2＝6.05，0.01＜p＜0.025)；鸭Igv dsRNA TSV×1000(χ2＝0.75，不显著)；组b)鸭Igv dsRNA(χ2＝5.29， 0.01＜p＜0.005)；猪Ig dsRNA(χ2＝12.93，p＜0.001)；pBeloBAC11 dsRNA (χ2＝8.67，0.001＜p＜0.005)；鱼非编码dsRNA(χ2＝15.39，p＜0.001)。组c 显示来自对照感染的虾和dsRNA处理的/WSSV感染的虾的造血组织 切片的伊红/苏木精染色和抗WSSV免疫染色的比较。切片在病毒感 染后72小时获得。标尺为20μm。

图6的实验示出dsRNA抗WSSV感染的保护作用可用剂量滴 定。

图7：抗病毒状态的诱导是RNA所致：虾(2-3g)用盐水(阳性 和阴性 对照)或dsRNA肌内注射。这一初始注射后72小时，用 WSSV单独或者与dsRNA混合感染动物。a)动物(n＝26-31)各用50μl 含有来自鸭v.的10-15μg dsRNA的溶液注射，并用WSSV阳性提取 物攻击。72-0组 在病毒感染前72小时和0小时(共注射)接受 dsRNA，72组 仅在感染前72小时接受dsRNS，0组 仅接受与 WSSV接种物混合的dsRNA。b)虾(n＝20-28)保持在一个再循环系 统中(参见“材料和方法”)，在病毒攻击前72小时用dsRNA注射， 然后用与WSSV阳性提取物混合的dsRNA再注射。阳性 和阴性 对照与组a描述的一致。在每一情况下使用鸭v.的dsRNA并且每次 注射施加10-15μg。dsRNA用苯酚和氯仿 RNeasy柱(Qiagen) 纯化，或者用RNeasy柱纯化并用RNA酶混合物(RNA酶A，RNA酶 T1，和RNA酶V1，得自Ambion)处理 使用Fisher′s确切概率检 验(Fisher′s Exact Test)通过对比dsRNA处理组的最终累积死亡率和阳 性对照组的最终累积死亡率来评价所观察到的抗病毒保护的显著性：： a)72-0处理(p＝0.0003)；72处理(p＝0.0001)；组b)dsRNA柱 (p＝0.0017)；dsRNA溶剂(p＝0.0003)。

图8.聚C-G而非聚I-C或聚C诱导抗病毒状态。虾(1-2g，n＝38-42) 用8μg(组a)或7μg(组b)所示的合成dsRNA类似物注射，72小时后 用WSSV感染。所有RNA类似物均购自Sigma-Aldrich，在400mM NaCl，10mM Tris-Cl，pH 7.4中重配，并如下文“材料和方法”中所述 退火和定量。在组b的实验中包括鸭v.的dsRNA以用于比较。使用 chi-平方统计法评价相对于阳性对照的所观察到的抗病毒保护的显著 性：组a)聚CG(χ2＝16.92，p＜0.001)；组b)鸭Igv dsRNA(χ2＝32.17，p ＜0.001)；聚CG(χ2＝35.05，p＜0.001)。

图9含有的实验结果示出向vp19 dsRNA中添加聚C:G增强所见 的抗WSSV感染的保护水平。

图10示意性图示了含有在诱导型(半乳糖)启动子控制下表达的 dsRNA、选择标记(URA，AMP)和期望基因的载体的构建，所述载体 被导入酵母菌中，随后在半乳糖诱导条件下选择和表达所述基因和 dsRNA。

图11示意性绘出将图8所示的酵母表达载体导入酵母菌细胞中， 并选择优化的表达条件、表达时间、半乳糖浓度和终止子，对照质粒 的构建以及AMP基因的除去。

图12示出Northern分析结果，其证实酵母菌当被含有WSSV的 vp19或ZF序列的载体转化时表达WSSV编码的RNA。在这些实验 中，用Northern印迹分析了从转化的酵母中提取的几微克总RNA， 使用特异于vp19、ZF或酵母肌动蛋白的探针作为阳性对照。结果证 实酵母表达WSSV相关RNA。

图13显示出Northern印迹分析结果，其证实用本发明的dsRNA 载体转化的酵母表达dsRNA(当用含有ZF序列的载体转化时)。在这 些实验中，经Northern印迹分析了10微克从用表达ZF的载体转化 的酵母中提取的总RNA。使用特异于每条链的探针(左：反义；右： 有义)，如Northern印迹结果所证明的，两种探针均检测到它们相应 的靶，证实特异于ZF的dsRNA被表达。另外分子量标准(每一凝胶 的右边)使得可以估计存在于每一RNA样品中的WSSV ZF RNA的量 (约50纳克)。

发明详述

在更详细描述本发明之前，提供了如下解释。另外，所有术语和 短语均是相关领域技术人员公认的含义

本发明应用化合物，特别是dsRNA、寡核苷酸及其修饰的衍生 物调节编码靶基因的核酸分子的功能或作用。这通过提供与编码所述 靶基因的一或多个核酸分子特异性杂交的dsRNA，或者提供可包含 或不包含与任何靶基因同源的区域并激发一般免疫应答的长 dsRNA(大约50个核苷酸，优选100个核苷酸或更长)而实现。如本 文所用，术语“靶核酸”和“编码靶基因的核酸分子”是指涵盖了编 码该基因的DNA，包括从这种DNA中转录的前mRNA和mRNA(或 其一部分)，及衍生自这种RNA的cDNA。

待干扰的DNA功能可包括复制和转录。复制和转录例如可以从 内源细胞模板、载体、质粒构建体或其它结构中进行。待干扰的RNA 功能可包括如所述RNA易位至蛋白质翻译位点、所述RNA易位至 细胞内远离RNA合成位点的位点、蛋白质从所述RNA中翻译，所 述RNA的剪接产生一或多个RNA物种，及由所述RNA进行或促进 的催化活性或包含所述RNA的复合物形成。这种干扰靶核酸功能的 一个优选结果是调节靶基因的表达。在本发明中，“调节”和“表达 的调节”是指编码基因的核酸分子例如DNA或RNA的量或水平增 加(刺激)或降低(抑制)。抑制通常是表达调节的优选形式，mRNA通 常是优选的靶核酸。

在本发明中，“杂交”是指寡聚化合物的互补链的配对。在本发 明中，优选的配对机制包括氢键合，其可以是寡聚化合物链的互补核 苷或核苷酸碱基(核碱基(nucleobase))之间的沃森—克里克 (Watson-Crick)、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键合。例如，腺嘌呤 和胸腺嘧啶是互补的核碱基，其通过氢键的形成而配对。杂交可以在 各种情况下发生，例如在高、低和中等严格条件下发生。

“低严格条件”例如是两个核酸序列在42℃，在10％甲酰胺，5 ×Denhardt′s溶液，6×SSPE，0.2％SDS中杂交。

“中等严格条件”是指在42℃，在50％甲酰胺，5×Denhardt′s 溶液，5×SSPE，0.2％SDS中杂交，随后在65℃在0.2×SSPE，0.2％SDS 中洗涤。

“高严格条件”是指在42℃在50％甲酰胺，5×Dehhardt′s溶液， 5×SSPE，0.2％SDS中杂交，随后在65℃在0.1×SSPE，和0.1％SDS 中洗涤。

当dsRNA化合物与靶核酸的结合干扰所述靶核酸的正常功能导 致活性丧失时，所述dsRNA化合物是可特异性杂交的。需要足够程 度的互补性以避免反义化合物与非靶核酸序列在希望得到特异性结 合的条件下进行非特异性结合，所述条件即在进行体内分析或治疗性 处理情况中在生理条件下，及在体外分析情况中进行分析的条件下。

“非特异性”或“非序列特异性”dsRNA是指与被给予dsRNA 的无脊椎动物或者与感染所述无脊椎动物的寄生物的基因组不具有 任何显著的已知序列相同性的dsRNA，所述无脊椎动物例如是海洋 无脊椎动物，如甲壳动物、软体动物，优选虾。一个实例是聚C:G。 优选“非特异性dsRNA”是长dsRNA，即长度为至少50个核苷酸， 优选至少200-500个核苷酸或更长。在优选的实施方案中，所述 dsRNA具有促进(增强)由靶向(抑制)特定靶基因表达的序列特异性 dsRNA激发的RNA干扰应答的能力，所述靶基因例如是甲壳动物基 因或感染所述甲壳动物的寄生物的必需基因。

在本发明中，短语“严格杂交条件”或“严格条件”是指本发明 的化合物与其靶序列杂交，而且与极少量其它序列杂交的条件。严格 条件是序列依赖性的并且在不同情况及在本发明中是不同的，寡聚化 合物与靶序列杂交的“严格条件”是通过所述寡聚化合物的性质和组 成及进行研究的分析而确定。严格杂交条件例如上述。

本文所用术语“互补”是指寡聚化合物的两个核碱基之间的精确 配对的能力。例如，如果在寡核苷酸(寡聚化合物)某位点的核碱基能 与在靶核酸(所述靶核酸是DNA，RNA或寡核苷酸分子)某位点的核 碱基氢键合，则认为所述寡核苷酸与所述靶核酸之间的氢键合的位置 是互补位置。当每个分子中足够数目的互补位置由可彼此氢键合的核 碱基占据时，寡核苷酸及进一步的DNA、RNA、或者寡核苷酸分子 是彼此互补的。因此，“可特异性杂交”和“互补”是用于表示足够 数目的核碱基的足够程度的精确配对或互补性，由此在寡核苷酸与靶 核酸之间发生稳定及特异性结合。

本领域已知本发明的dsRNA的序列不需要与其靶核酸100％互 补以可特异性杂交。另外，寡核苷酸可以与一或多个节段杂交，从而 插入或相邻节段不参与杂交(例如环结构或发夹结构)。优选本发明的 dsRNA与靶核酸内的靶区域包含至少70％序列互补性，更优选包含 90％序列互补性，更优选地与被定向的靶核酸序列内的靶区域有95％ 序列互补性。例如，20个核碱基中有18个与靶区域互补并因此特异 性杂交的dsRNA化合物呈现90％互补性。在这个实例中，剩余的非 互补核碱基可以成簇或散在于互补的核碱基中，不需要彼此连续或与 互补核碱基连续。同样，长度为18个核碱基，其中包括侧翼为两个 与所述靶核酸完全互补的区域的4个非互补核碱基的dsRNA化合物 与所述靶核酸的整体互补性为77.8％，因此包含在本发明范围内。反 义化合物与靶核酸的区域的互补性百分比可以通过本领域已知的 BLAST程序(basic local alignment search tools)和PowerBLAST程序 (Altschul et al.，J.Mol.Biol.，1990，215，403-410；Zhang and Madden， Genome Res.，1997，7，649-656)常规确定。

在本发明中，术语“寡聚化合物”或“寡聚核酸分子”是指包含 多个单体单位的聚合物或寡聚物。在本发明中，术语“寡核苷酸”是 指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的寡聚物或聚合物，或者其 模拟物、嵌合物、类似物和同系物。这个术语包括由天然发生的核碱 基、糖和核苷内共价键(主链)组成的寡核苷酸，以及具有相似功能的 非天然发生部分的寡核苷酸。通常优选这种修饰或取代的寡核苷酸而 非优选天然形式，因为这种修饰或取代的寡核苷酸具有希望的性质如 增强的细胞摄取、增强的靶核酸亲和性及在存在核酸酶时的增加的稳 定性。

dsRNA寡核苷酸是本发明化合物的优选形式，本发明涵盖了如 下述的寡核苷酸类似物和模拟物。

本发明中，将dsRNA化合物“定向(targeting)”于特定的核酸分 子可以是多步骤的程序。所述程序通常始于鉴别功能待被调节的靶核 酸。这种靶核酸可以是例如其表达与特定病症或疾病状态相关的细胞 基因(或者从所述基因中转录的mRNA)，或者优选得自感染性物质(例 如病毒)的核酸分子。

定向程序通常还包括确定靶核酸内发生结合相互作用，并由此导 致希望的作用(例如调节表达)的至少一个靶区域、节段或位点。在本 发明中，术语“区域”是指具有至少一个可鉴别的结构、功能或特性 的靶核酸的一部分。在靶核酸的区域内是节段。“节段”是指靶核酸 内较小的区域或亚部分。本发明所用“位点”是指靶核酸内的位置。

因此，如本领域所已知，翻译起始密码子典型是5′-AUG(在转录 的mRNA分子中；在相应的DNA分子中是5′-ATG)，翻译起始密码 子也称作“AUG密码子”、“起始密码子”或“AUG起始密码子”。 少部分基因含有具有RNA序列5′-GUG、5′-UUG或5′-CUG的翻译起 始密码子，5′-AUA，5′-ACG和5′-CUG已经示出在体内发挥作用。 因此，术语“翻译起始密码子”和“起始密码子”可涵盖许多密码子 序列，即使在每种情况中起始氨基酸典型是甲硫氨酸(在真核生物中) 或甲酰甲硫氨酸(在原核生物中)。本领域还已知真核和原核基因可具 有两或多个可变起始密码子，任一个均可优先用于在特定细胞类型或 组织中或者在特定条件下起始翻译。在本发明中，“起始密码子”和 “翻译起始密码子”是指在体内用于起始从基因中转录的mRNA的 翻译的密码子，不管这种密码子的序列如何。本领域还已知基因的翻 译终止密码子(或终止密码子)可具有三个序列之一的序列，即 5′-UAA，5′-UAG和5′-UGA(相应的DNA序列分别是5′-TAA，5′-TAG 和5′-TGA)。

术语“起始密码子区域”和“翻译起始密码子区域”是指这种 mRNA或基因的一部分，涵盖了翻译起始密码子每一方向(即5’或3’ 方向)的大约25至大约50个连续核苷酸。相似地，术语“终止密码 子区域”和“翻译终止密码子区域”是指这种mRNA或基因的一部 分，其涵盖了翻译终止密码子每一方向(即5’或3’方向)的大约25至 大约50个连续核苷酸。因此，“起始密码子区域”(或者“翻译起始 密码子区域”)和“终止密码子区域”(或者翻译终止密码子区域)均是 本发明的反义化合物可以有效靶定的区域。

本领域已知开放读框(ORF)或“编码区”是指翻译起始密码子与 翻译终止密码子之间的区域，其也是可被有效靶定的区域。在本发明 中，优选的区域是涵盖了基因开放读框(ORF)的翻译起始或终止密码 子的基因内区域。

其它靶区域包括5’非翻译区(5′UTR)，本领域已知其是指mRNA 翻译起始密码子5’方向中的一部分，因此包括mRNA的5’帽位点与 翻译起始密码子之间的核苷酸(或者基因上的相应核苷酸)，本领域已 知3’非翻译区(3′UTR)是指mRNA翻译终止密码子3’方向中的一部 分，因此包括mRNA的翻译终止密码子与3’末端之间的核苷酸(或者 基因上的相应核苷酸)。所述mRNA的5’帽位点包含与mRNA的5’ 末端残基通过5’-5’三磷酸键结合的一个N7-甲基化的鸟嘌呤残基。 mRNA的5’帽区域被认为包括5’帽结构自身以及与所述帽位点相邻 的50个核苷酸。靶定5’帽区域也是优选的。

尽管一些真核mRNA转录物被直接翻译，但一些含有称作“内 含子”的一或多个区域，在翻译之前从转录物中切离。剩余的(并因 此翻译的)区域称作“外显子”，它们被剪接至一起形成连续的mRNA 序列。靶定剪接位点(即内含子-外显子连接点或者外显子-内含子连接 点)在一些情况中是特别有用的，所述情况是异常剪接与疾病相关或 者特定的剪接产物的过量产生与疾病相关。由于重排或缺失所致的异 常融合连接点也是优选的靶位点。通过不同基因来源的两个(或多 个)mRNA的剪接过程产生的mRNA转录物称作“融合转录物”。也 已知内含子可以使用靶定于例如DNA或前mRNA的反义化合物而被 有效靶定。

本领域也已知可变RNA转录物(alternative RNA transcript)可以从 DNA的相同基因组区域中产生。这些可变转录物通常称作“变体”。 更特别地，“前mRNA变体”是从相同基因组DNA中产生的转录物， 在其起始或终止位置与从相同基因组DNA中产生的其它转录物不 同，并且它们含有内含子和外显子序列。

在剪接期间切离一或多个外显子或内含子区域或其一部分的基 础上，前mRNA变体产生较小的“mRNA变体”。因此，mRNA变 体是加工的前mRNA变体，每个独特的前mRNA变体由于剪接的结 果必须总是产生一个独特的mRNA变体。这些mRNA变体也称作“可 变剪接变体”。如果不发生前mRNA变体的剪接，则该前mRNA变 体与mRNA变体相同。

本领域也已知变体可以通过使用可变信号起始或终止转录而产 生，也已知前mRNA和mRNA可具有多于一个的起始密码子或终止 密码子。使用可变起始密码子的源自前mRNA或mRNA的变体称作 该前mRNA或mRNA的“可变起始变体”。使用可变终止密码子的 那些转录物称作该前mRNA或mRNA的“可变终止变体”。一种特 殊类型的可变终止变体是“聚A变体”，其中通过转录机制经可变选 择“聚A终止信号”之一获得多个转录物，从而产生在独特的聚A 位点终止的转录物。在本发明中，本文描述的变体类型也是优选的靶 核酸。

靶核酸上优选的反义化合物杂交的位置在下文称作“优选的靶节 段”。如本文所用术语“优选的靶节段”是指dsRNA化合物定向的靶 区域的至少8个核碱基部分。不希望限于理论，现在确信这些靶节段 代表可进行杂交的靶核酸部分。

本文阐述了一些优选的靶节段的特异序列，但本领域技术人员意 识到这些只是例证并描述了本发明范围内的特殊的实施方案。普通技 术人员可以鉴别另外的优选靶节段。

包含选自例证的优选靶节段内的至少8个连续核碱基的一段序 列的长度为8-80个核碱基的靶节段被认为是适于被靶定的。靶节段 可包括包含例证的优选靶节段之一的5’末端的至少8个连续核碱基 的DNA或RNA序列(剩余的核碱基是同一DNA或RNA的一段连续 序列，其从靶节段的5’末端上游开始并持续直至所述DNA或RNA 含有大约8-80个核碱基)。相似优选的靶节段由包含例证的优选靶 节段之一的3’末端的至少8个连续核碱基的DNA或RNA序列代表 (剩余的核碱基是同一DNA或RNA的一段连续序列，其从靶节段的 3’末端下游开始并持续直至所述DNA或RNA含有大约8-80个核碱 基)。本领域技术人员利用本文例证的优选靶节段能不用过度实验而 可鉴别进一步优选的靶节段。

本发明的双链RNA化合物可进行化学修饰(Fire et al.，Nature， 1998，391，806-811；Timmons and Fire，Nature 1998，395，854； Timmons et al.，Gene，2001，263，103-112；Tabara et al.，Science， 1998，282，430-431；Montgomery et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 1998，95，15502-15507；Tuschl et al.，Genes Dev.，1999，13，3191-3197； Elbashir et al.，Nature，2001，411，494-498；Elbashir et al.，Genes Dev. 2001，15，188-200)。如本领域所已知，核苷是碱基-糖的组合物。核 苷的碱基部分通常是杂环碱基。这种杂环碱基的两个最常见的类别是 嘌呤和嘧啶。核苷酸是进一步包括与核苷的糖部分共价连接的一个磷 酸根基团的核苷。对于包括戊呋喃糖的那些核苷，所述磷酸根基团可 以与所述糖的2’、3’或5’羟基成分连接。在形成寡核苷酸中，所述磷 酸根基团与相邻的核苷彼此共价连接形成线性聚合化合物。接着，这 个线性聚合化合物的各个末端可以进一步连接形成环形化合物，然 而，线性化合物通常是优选的。另外，线性化合物可具有内在的核碱 基互补性，并因此可以一定方式折叠以产生完全或部分双链的化合 物。在寡核苷酸内部，所述磷酸根基团通常形成寡核苷酸的核苷酸间 主链。RNA和DNA的通常的键或主链是3’-5’磷酸二酯键。

本发明中有用的修饰的dsRNA化合物的特异性实例包括含有修 饰的主链或非天然核苷酸间键的寡核苷酸。如本说明书所解释，具有 修饰的主链的寡核苷酸包括主链中保留磷原子的那些寡核苷酸及主 链中不具有磷原子的那些寡核苷酸。对于本说明书目的及有时本领域 所提及，在其核苷酸间主链中不具有磷原子的修饰的寡核苷酸也可认 为是寡核苷酸。

含有磷原子的优选的修饰的寡核苷酸主链包括例如硫代磷酸酯， 手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲 基及其它烷基磷酸酯包括3′-亚烃基磷酸酯、5′-亚烃基磷酸酯和手性 磷酸酯、亚磷酸酯、氨基磷酸酯包括3′-氨基磷酸酯和氨基烷基氨基 磷酸酯、硫逐氨基磷酸酯、硫逐烷基磷酸酯、硫逐烷基磷酸三酯、具 有正常3’-5’键的硒代磷酸酯和硼代磷酸酯、这些物质的2’-5’键合类 似物、及具有反向极性的那些物质，其中一或多个核苷酸间键是3′ -3′，5-5′或者2′-2′键。具有反向极性的优选寡核苷酸在3’末端核 苷酸键包含一个3’-3’键，即一个可以是脱碱基的反向核苷残基(核碱 基缺失或被一个羟基基团代替)。本发明也包括各种盐、混和的盐和 游离酸形式。

教导制备上述含磷键的美国专利包括但非限于美国专利No. 3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897； 5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676； 5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126； 5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361； 5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697和5,625,050， 每个专利均并入参考。

不包括磷原子的修饰的寡核苷酸主链的实例具有由短链烷基或 环烷基核苷间键、混和的杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或者一或 多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的主链。这些主链包括具有吗啉 代(morpholino)键(部分从核苷的糖部分中形成)的主链；硅氧烷主链； 硫化物、亚砜和砜主链；甲乙酰(formacetyl)和硫甲乙酰(thioformacetyl) 主链；亚甲基甲乙酰和硫甲乙酰主链；核糖乙酰(riboacetyl)主链；含 链烯主链；氨基磺酸盐主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼主链；磺酸和 磺胺主链；酰胺主链；及其它具有混和的N，O，S和CH2成分的主 链。

教导上述寡核苷酸制备的美国专利包括但非限于美国专利No. 5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033； 5,264,562；5,264,564；5,405,93S；5,434,257；5,466,677；5,470,967； 5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289； 5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312； 5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269和5,677,439，每个专利 均并入参考。

或者，寡核苷酸模拟物其中一些核苷酸单位的糖和核苷间键(即 主链)由新的基团代替。保留核碱基单位以与合适的靶核酸杂交。一 种这样的化合物，示出具有极佳的杂交性质的寡核苷酸模拟物，称作 肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖主链由含酰胺的主 链代替，特别是由氨基乙基甘氨酸主链代替。保留核碱基并将其直接 或间接与主链的酰胺部分的氮杂(aza)氮原子结合。教导PNA化合物 制备的美国专利包括但非限于美国专利No.5,539,082；5,714,331和 5,719,262，每个专利均并入参考。关于PNA化合物的进一步教导可 见于Nielsen et al.，Science，1991，254，1497-1500。

例如，本发明的dsRNA可包含具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸 及具有杂原子主链的寡核苷，特别是美国专利No.5,489,677所述的 --CH2--NH--O--CH2--、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[称作亚甲基(甲基 亚氨基)或MMI主链]、--CH2--O--N(CH2)--CH.sub.2-、 -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2--[其中天然磷酸 二酯主链以--O--P--O--CH2-表示]，美国专利No.5,602,240的酰胺主 链，及美国专利No.5,034,506所公开的具有吗啉代主链结构的寡核 苷酸。

另外，本发明的修饰的寡核苷酸也可以含有一或多个取代的糖组 分。例如，寡核苷酸在2’位置可包含如下基团之一：OH；F；O-、 S-或N-烷基；O-、S-、或N-链烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O- 烷基，其中所述烷基、链烯基和炔基可以是取代的或未取代的C1- C10烷基或C2-C10链烯基和炔基，更特别地是是取代的或未取代 的O[(CH2)nO]mCH3O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2，其中n和m 是从1至大约10的数字。另外，优选的寡核苷酸在2’位置包含如下 的一个基团：C1-C10较低烷基、取代的较低烷基、链烯基、炔基、 烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、 Br、CN、CF3 OCF3 SOCH3 SO2CH3 ONO2 NO2 N3 NH2杂环烷基、 杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA 切割基团、报道基团、嵌入剂、改良寡核苷酸的药物代谢动力学性质 的基团、或者改良寡核苷酸的药物动力学性质的基团、及具有相似性 质的其它取代物。

其它潜在的修饰包括2′-甲氧基(2′-O--CH3)、2′-氨基丙氧基 (2′-OCH2CH2CH2NH2)、2′-烯丙基(2′-CH2-CH＝CH2)、2′-O-烯丙基 (2′-O--CH2-CH＝CH2)和2′-氟(2′-F)。2′-修饰可以在阿拉伯糖(arabino) (上)位置或核糖(ribo)(下)位置。在寡核苷酸的其它位置也可以进行 相似修饰，特别是在3’末端核苷酸或2’-5’连接的寡核苷酸中的糖的 3′位置及在5；末端核苷酸的5’位置。寡核苷酸也可以具有糖模拟物， 如环丁基组分代替戊呋喃糖。教导制备这种修饰的糖结构的美国专利 包括但非限于美国专利No.4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044； 5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811； 5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873； 5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；及5,700,920，每个专 利均以其全文并入参考。

另一种可能的糖修饰包括闭锁的核酸(LNAs)，其中2’-羟基与糖 环的3’或4’碳原子连接，从而形成双环糖组分。所述连接优选是一 个methelyne(--CH2)n基团连接2’氧原子和4’碳原子，其中n是1或 2。LNAs及其制备在WO98/39352和WO 99/14226中描述。

寡核苷酸也可包括核碱基(在本领域通常简便称作“碱基”)修饰 或取代。如本文所用，“未修饰的”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基 腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧 啶(U)。修饰的核碱基包括其它合成的和天然的核碱基如5-甲基胞嘧 啶(5-me-C)、5-羟基甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、 腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基及其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2- 丙基及其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、 5-卤尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(--C-C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶及嘧啶碱 基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶 (假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤素、8-氨基、8-硫代、8-硫烷基、8-羟 基及其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤素特别是5-溴、5-三氟甲基 及其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F- 腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌 呤和7-脱氮腺嘌呤及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。进一步修饰的 核碱基包括三环嘧啶如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶[5，4-b][1，4] 苯并噁-2(3H)- 酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶[5，4-b][1，4]benzothiazin--2(3H)-酮)、取代 的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶[5，4-b][1，4] 苯并噁 -2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶[4，5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H- 吡啶[3′，2′：4，5]吡咯[2，3-d]嘧啶-2-酮)。修饰的核碱基还包括其中嘌呤或 嘧啶碱基由其它杂环例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤核苷、2-氨基 吡啶和2-吡啶酮置换的那些核碱基。进一步核碱基包括美国专利No. 3,687,808所公开的那些、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering，858-859页，Kroschwitz，J.I.，ed.John Wiley&Sons， 1990所公开的那些，Englisch et al.，Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613所公开的那些，及Sanghvi，Y.S.，第15章， Antisense Research and Applications，289-302页，Crooke，S.T.and Lebleu，B.ed.，CRC Press，1993所公开的那些。这些核碱基中的某 些对于增加本发明的化合物的结合亲和性是特别有用的。这些核碱基 包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包 括2-氨基丙腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧 啶取代示出使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃，是目前优选的碱基 取代，更特别的是当与2′-O-甲氧基乙基糖修饰组合时更为优选。

教导制备上述修饰的核碱基以及其它修饰的核碱基的美国专利 包括但非限于美国专利No.3,687,808，以及美国专利No.4,845,205； 5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187； 5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469； 5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,830,653；5,763,588； 6,005,096；及5,681,941，每个专利均并入参考。

另外，本发明的寡核苷酸可以与增强所述寡核苷酸的活性、细胞 分布或细胞摄取的一或多个组分或缀合物化学连接。这些组分或缀合 物可包括与功能基团如伯羟基或仲羟基基团共价结合的缀合基团。本 发明的缀合基团包括嵌入剂、报道分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、 聚醚、增强寡聚物药物动力学性质的基团、及增强寡聚物药物代谢动 学性质的基团。典型的缀合基团包括胆固醇、脂质、磷脂、生物素、 吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素、和染料。 本发明中增强药物动力学性质的基团包括改善摄取、增强降解抗性、 和/或加强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。本发明中增强药物代 谢动力学性质的基团包括改善本发明化合物的摄取、分布、代谢或排 泄的基团。代表性的缀合基团在1992年10月23日申请的国际专利 申请PCT/US92/09196及美国专利No.6,287,860中公开，所述文献均 以全文并入参考。缀合组分包括但非限于脂质组分如胆固醇组分、胆 酸、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇、硫胆固醇、脂肪族链例如癸二 酸或十一烷基残基、磷脂例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙胺1，2-二 -O-十六烷基-rac-glyc-ero-3-H-磷酸酯、聚胺或聚乙二醇链、或者金刚 烷乙酸、棕榈基组分、或者十八胺或己胺-羰基-氧胆固醇组分。

本发明的dsRNA化合物也可以与其它分子、分子结构或化合物 混合物例如脂质体、受体定向分子、口服配制品、直肠给予配制品、 局部给予配制品或其它配制品混和、包囊化、缀合或以其它方式缔合， 以帮助摄取、分布和/或吸收。教导制备这种有助于摄取、分布和/或 吸收的配制品的代表性美国专利包括但非限于美国专利 No.5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158； 5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556； 5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619； 5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295，5,527,528； 5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,530,575；及5,595,756，每个专 利均并入参考。

本发明的混合物进一步涵盖了任何生物学可接受的盐、酯、或者 这种酯的盐、或者任何其它化合物，所述化合物在给予无脊椎动物的 基础上能提供(直接或间接)生物学活性代谢物或其残基。

术语“生物学可接受的盐”是指生理学和药物学可接受的本发明 化合物的盐，即保留亲代化合物的希望的生物学活性但是不产生不希 望的毒性作用的盐。

本发明还包括包含本发明的dsRNA化合物的生物学组合物和配 制品。本发明的药物组合物可以根据希望局部治疗还是全身治疗及治 疗的区域而以多种方式给予。给予方式可以是局部、口服或非肠道给 予。非肠道给予包括注射或灌注。

在本发明中，“共同给予”是指以任一顺序单独或组合给予两种 不同的化合物，优选dsRNA。优选这种dsRNA可以包含于下文的生 物送递载体中。

本发明的dsRNA配制品包括但非限于溶液、乳液、泡沫和含脂 质体的配制品。本发明的药物组合物和配制品可包含一或多种渗透增 强剂、载体、赋形剂或其它活性或非活性成分。

乳液典型是一种液体以液滴状形式分散于另一种液体中的非均 质系统，所述液滴通常直径超过0.1μm。乳液除了分散相之外可以含 有其它成分，及在水相、油相中都可以存在或其自身作为分离相存在 于溶液中的活性药物。微乳液包括在本发明的实施方案中。乳液及其 应用为本领域所熟知，进一步在美国专利No.6,287,860中描述，该 专利以其全文并入参考。

本发明的配制品包括脂质体配制品。如本发明所用，术语“脂质 体”是指由排列在球形双分子层中的两亲性脂类组成的小泡。脂质体 是单层或多层小泡，具有由亲脂性物质形成的膜，及含有待送递的组 合物的水性内部。阳离子脂质体是正电荷的脂质体，确信其与负电荷 的核酸分子相互作用形成稳定的复合物。确信pH敏感的或负电荷的 脂质体俘获(entrap)核酸分子而不是与其复合。阳离子和非阳离子脂 质体已经用于送递核酸至细胞。

脂质体也包括“空间稳定的”脂质体，本文所用这个术语是指包 含一或多个特定脂质的脂质体，当掺入脂质体时，所述特定脂质导致 与缺少这种特定脂质的脂质体相比循环寿命增强。空间稳定的脂质体 例如是这样一种脂质体，其形成小泡的脂质部分包含一或多种糖脂或 者是用一或多种亲水聚合物如聚乙二醇组分(PEG)产生的。脂质体及 其应用进一步在美国专利No.6,287,860中描述，该专利以其全文并 入参考。

本发明的配制品和组合物也可以包括表面活性剂。在药物产品、 配制品和乳液中应用表面活性剂为本领域所熟知。表面活性剂及其应 用进一步在美国专利No.6,287,860中描述，该专利以其全文并入参 考。

本发明的dsRNA配制品可使用各种渗透增强剂以实现有效送递 核酸，特别是寡核苷酸。除了有助于非亲脂性药物穿过细胞膜之外， 渗透增强剂还增强亲脂性药物的渗透性。渗透增强剂可以被分类为属 于5种大类之一，即表面活性剂、脂肪酸、胆盐、螯合剂和非螯合性 非表面活性剂。渗透增强剂及其应用进一步在美国专利No.6,287,860 中描述，该专利在此以其全文并入参考。

本领域技术人员意识到所述配制品通常根据其指定应用即给予 途径而设计。

局部给予的优选配制品包括其中本发明的寡核苷酸与局部送递 剂如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性 剂混和的那些配制品。优选的脂质和脂质体包括中性(例如二油酰磷 脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂 酰胆碱)、带负电(例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子(例如 二油酰四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。

对于局部或其它给予方式，本发明的寡核苷酸可以包在脂质体特 别是阳离子脂质体内形成包囊(capsule)，或者可以与其形成复合物。 或者，寡核苷酸可以与脂质特别是阳离子脂质复合。

口服的组合物和配制品包括散剂或颗粒、微粒、纳米颗粒、于水 或非水性基质中的混悬剂或溶液、包囊、凝胶胶囊、小袋、片剂或小 片剂。增稠剂、矫味剂、稀释剂、乳化剂、分散剂或结合剂可以是所 希望的。

非肠道给予的组合物和配制品可包括无菌水溶液，其也可包含缓 冲液、稀释剂和其它合适的添加剂，例如但非限于渗透增强剂、载体 化合物及其它药物可接受的载体或赋形剂。

另外，本发明的dsRNA组合物可含有多于一种的dsRNA化合物， 例如第一种dsRNA定向于第一种核酸，一或多种其它dsRNA化合物 定向于第二种核酸，或者是非定向的dsRNA(与靶基因无已知同源的 序列)。同样，本发明的组合物可含有定向于相同核酸靶位的不同区 域的两或多种dsRNA化合物。两或多种组合的化合物可以一起或相 继使用。

dsRNA至少在海洋无脊椎动物如甲壳动物及很可能其它无脊椎 动物中诱导免疫应答的发现源于设计为用于获得关于无脊椎动物免 疫的更多知识，特别是用于获得关于调节甲壳动物基因表达和免疫的 基因和途径的知识的实验，及源于根据在虾中潜在性诱导序列特异性 免疫应答以提供针对通常感染虾的病毒病原体的保护作用的手段的 设想的实验，所述感染虾的病毒病原体例如是白斑综合征病毒 (WSSV)，Taura综合征病毒(TSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒 (IHHNV)，对虾杆状病毒(BP)，对虾弹状病毒(RPS)，腮相关病毒 (GAV)，黄头病毒(YHV)，淋巴器官相关病毒(LOW)，类淋巴器官细 小样病毒病(LPV)，肝胰腺细小病毒(HPV)，杆状病毒中肠腺坏死病 毒(BMN)，草虾杆状病毒(MBV)，呼肠孤病毒样病毒病(REO)，弹状 病毒(RPS)和新兴病毒。

特别地，本发明人进行了评价通常感染甲壳动物特别是虾的一些 病毒中含有的各种基因的作用的实验，通过合成并给予相应于虾病毒 特别是WSSV和TSV中靶基因的dsRNA进行实验。另外，本发明 人进行了评价特异的虾基因(推定的NFKB和STAT信号传导途径的 成分)及其它内源基因是否能通过给予具有相应于推定参与虾免疫的 基因的序列的dsRNA而被调节(抑制)的实验。另外，本发明人进行 了评价特别的生物送递载体特别是酵母作为将dsRNA导入甲壳动物 的手段的可行性的实验。

本发明人特别研究了在全身性感染过程中定向于WSSV中包膜 蛋白VP28及其它选择的基因表达的dsRNA的作用。最初选择VP28 基因，因为认为VP28通过推定的跨膜结构域锚定至WSSV的包膜， 所述多肽的剩余部分暴露于病毒颗粒的外面。基于VP28的初级结构 的这个理论通过观测到当具有VP28抗体的传染性WSSV制备物注射 进凡纳滨对虾时阻止其潜能而得以支持。因此，这个基因的表达是 WSSV感染甲壳动物即虾的能力所必需的。

然而，这个基因仅是例证性的，因为本发明广泛地涵盖了使用 dsRNA特异性或全身性地调节内源基因表达或者包含于其它海洋无 脊椎动物和无脊椎动物寄生物优选甲壳动物寄生物中的必需基因，所 述dsRNA例如相应于参与免疫、生长、生殖和一般健康状况或健壮 的甲壳动物基因的dsRNA，所述甲壳动物基因如STAT、IKB及其它 推定的NFKB和STAT信号传导途径的成分。这些基因还包括编码神 经递质、激素和代谢途径包括蜕皮抑制激素、性腺抑制激素和甲壳动 物高血糖激素的那些基因。这些基因还包括编码抗微生物剂或产生这 种肽包括crustin和penaeidin的调节剂的那些基因。潜在地，dsRNA 可用于减量调节任何希望的海洋无脊椎动物例如甲壳动物基因的表 达。例如，推定的靶基因可以在基因组文库中鉴别，例如使用对照物 和病毒(WSSV或TSV)感染虾组织产生的抑制消减杂交文库。其它潜 在的靶基因特别例如包括VP28、核苷酸还原酶、血蓝蛋白、VP26、 VP19、胸苷酸激酶、和DNA聚合酶。

特别地，本发明人首先进行了实验以研究注射相应于WSSV和 在凡纳滨对虾EST集合中鉴别的虾表达的基因的dsRNA可能的抗病 毒作用，所述集合包括从WSSV攻击实验中制备的扣除杂交文库 (PCR Select，Clontech)。这些实验包括构建并注射相应于虾IKBK基 因、STAT基因、和血蓝蛋白基因、及WSSV VP28、核苷酸还原酶 小亚基、和DNA聚合酶基因的dsRNA，以及编码鸭(绿头鸭(Anas platyrhynchos))的免疫球蛋白一部分的对照dsRNA(以评价dsRNA的 可能的序列非依赖性作用)。

这些dsRNA研究结果(在实施例中详细论述)首次示出用相应于 病毒病原体(WSSV)中含有的基因的dsRNA处理甲壳动物即虾有效 地针对病毒(WSSV)感染保护所述虾。另外，这些dsRNA研究进一步 确定虾靶内源基因(血蓝蛋白、STAT和IKappa B激酶催化亚基)通过 给予定向于所述基因的dsRNA而以序列特异性方式被减量调节。所 述减量调节的序列特异性通过在所有dsRNA处理的虾中对照基因(核 糖体蛋白mRNA)的未受影响的表达，及STAT dsRNA处理的动物中 IKBK mRNA的正常表达而证实，反之亦然。

这些实验结果首次表明虾中RNAi方法的存在，并确定使用 dsRNA相关的治疗法的抗病毒策略在海洋无脊椎动物水产业，例如 甲壳动物水产业中的可行性。这个发现具有重要的商业意义，因为已 知有20多种病原性病毒感染虾物种并导致全世界虾水产业重大的经 济损失。因此，根除或减轻这种虾病原性病毒的可行性抗病毒策略具 有重大的潜在商业重要性(因为每年病毒相关的虾损失有数十亿美 元)。

然而，如前所述，本发明人这些dsRNA研究具有广泛的目的， 特别是本发明人想通过研究海虾凡纳滨对虾获得更多的关于无脊椎 动物例如甲壳动物的免疫系统的知识，及dsRNA应答两种病毒，Taura 综合征病毒(TSV)和白斑综合征病毒(WSSV)，感染的效应。

这些研究的基本原理部分基于如下观测：1)甲壳动物是海洋(尤 其是沿海)环境的必要成分；2)某些甲壳动物物种，尤其是海虾具有 重要商业意义并且广泛水产业化；3)甲壳动物对许多病毒感染高度 敏感，这对水产业具有破坏性作用并导致未知的环境后果；及4)关于 甲壳动物对病毒的免疫反应了解的很少。

由于在本发明之前对甲壳动物免疫的了解很少，因此本发明人使 用功能性基因组方法以快速获得在激发虾免疫反应中可能重要的虾 基因的遗传信息。特别地，基于功能性基因组研究结果，选择两个基 因进行研究：STAT样基因和I-KB-激酶样基因(IKK)，它们因为被用 于鉴别它们的免疫功能而成为RNAi研究的焦点。选择这些基因，因 为已知其推定的直向同源物在其它动物例如哺乳动物和昆虫中对免 疫应答非常重要的信号转导途径中具有作用。

基于其序列，假定这两个虾基因是在脊椎动物中表达的STAT样 家族成员及IKB激酶复合物的催化亚基的直向同源物，它们编码虾 免疫应答的成分，及更特别地编码虾抗病毒应答的成分。为了测试这 个假说，进行RNA干扰实验以潜在地消除这些基因的表达，从而研 究对虾免疫生理学的作用及对病毒感染的抗性。基因表达是否被消除 不可预测，因为甚至不知道甲壳动物是否能通过RNA干扰途径应答 dsRNA。

这些dsRNA实验的结果表明这些内源虾STAT和IKBK基因通 过给予dsRNA被以序列特异性方式减量调节。尽管这种减量调节是 不完全的，因为STAT和IKBK mRNA的痕迹均可通过RT-PCR检测 到，但是这些结果首次表明干扰RNA可用于甲壳动物系统特别是虾 中，作为研究和消除特异性甲壳动物基因例如推定参与先天免疫应答 的基因的功能的手段。另外，这些研究表明RNA干扰可用于产生内 源基因表达削弱或缺失的海洋无脊椎动物如甲壳动物，例如虾。

另外，非常出乎意料地，这些实验表明给予不具有与任何内源性 虾或虾病毒基因同源的序列的至少一种长的双链RNA，即长于21- 25个核苷酸，优选50个核苷酸或更长的双链RNA，导致诱导全身性 免疫应答，这授予针对不同病毒病原体的一般保护作用，即授予针对 不同病原体的保护作用的免疫应答。换句话说，所述dsRNA以非序 列特异性方式授予针对不同病原体的一般保护作用。

另外出乎意料地，其它实验表明共同给予长的非特异性dsRNA (例如聚C:G)和序列特异性dsRNA(例如调节含有同源序列的靶基因 的表达)，加强序列特异性dsRNA激发的RNAi应答。这在给予较低 浓度序列特异性dsRNA，同时仍激发希望的基因调节应答中是有利 的。考虑到合成希望的dsRNA所相关的巨大花费，这种益处具有显 著的商业意义。另外，这个发现由于可导致更长时间的RNAi应答是 有益的。

当注射代表选择的虾和病毒基因及非特异性对照基因(例如鸭免 疫球蛋白基因)的dsRNA并且动物被施以病毒攻击时，无脊椎动物例 如虾中dsRNA的全身性抗病毒作用最初是在海虾凡纳滨对虾的免疫 应答的RNA干扰研究期间观测到的。完全出乎意料地，观测到注射 任何dsRNA，即不仅是特异于靶病毒或宿主基因的dsRNA，也是与 任何已知甲壳动物或病毒基因无同源性的dsRNA，均导致对Taura综 合征病毒(TSV)或白斑综合征病毒(WSSV)攻击的存活率增加。这些结 果非常令人震惊，因为尽管已知脊椎动物对病毒感染产生强力的先天 免疫应答(主要是通过dsRNA激活干扰素系统所致)，在无脊椎动物 中从未见到或者甚至想到存在与脊椎动物干扰素相似的一般可诱导 的抗病毒防御机制。本发明的结果提示dsRNA是抗病毒免疫的一种 古老激发物，dsRNA可激发无脊椎动物特别是甲壳动物如虾中的全 身性免疫。

更特别地，在给予特异于靶病毒基因的dsRNA和非特异于任何 已知靶病毒或宿主基因的dsRNA之后，对比凡纳滨对虾中抗TSV和 WSSV的抗病毒应答。观测到编码鸭(绿头鸭)免疫球蛋白v重链部分 的与任何虾、TSV或WSSV基因无已知同源性的dsRNA诱导针对 TSV和WSSV的免疫应答。相反，dsDNA和单链RNA(聚C)不激发 这种应答或授予抗病毒保护作用。为了证实对dsRNA的这种全身性 非序列特异性应答存在的正确性，本发明人进一步给予相应于各种脊 椎动物免疫球蛋白基因(鸭v，猪γ)、鱼非编码基因组DNA、细菌载 体序列的dsRNA、及合成的dsRNA。

再次令人惊奇地，观测到所有这些dsRNA均诱导保护性抗病毒 应答。相反，聚IC(具有与胞嘧啶配对的肌苷碱基的dsRNA)、dsDNA 和ssRNA(聚C)、和RNA酶处理的dsRNA不赋予任何抗病毒保护作 用。聚IC在虾中不能诱导抗病毒保护作用提示在无脊椎动物中引发 对dsRNA的识别和免疫应答的免疫机制与脊椎动物中的不同。基于 这些结果假设无脊椎动物例如甲壳动物通过一种类似于脊椎动物中 存在的但具有根本差异的dsRNA介导的免疫应答引发针对dsRNA 的先天免疫应答。

观察到的相似性包括1)其具有针对不同病毒的活性，和2)其 以序列非依赖性方式由dsRNA引发。至少一种显著差异是在甲壳动 物系统中观察到的免疫应答看起来不涉及干扰素系统。

具体地，在脊椎动物中dsRNA由Toll样受体3(TLR-3)识别，该 受体至少部分通过干扰素B启动子激活干扰素系统。最终，这一干 扰素应答导致诱导几百个基因，一些基因具有抗病毒活性，另一些调 节细胞生长及调节适应性免疫应答。在哺乳动物中，dsRNA也结合 并直接激活RNA依赖性蛋白激酶(PKR)，其通过真核翻译起始因子 2α(eIF2α)的磷酸化导致蛋白质合成的抑制。但是，无脊椎动物不具 有干扰素免疫系统。因此，在甲壳动物中引起的针对dsRNA的免疫 应答必定涉及一种尚未被完全了解的不同的免疫调节系统。

海洋无脊椎动物如甲壳动物例如虾对通过序列特异性和非序列 特异性(全身性免疫应答)机制应答dsRNA给予的发现对于在海洋业 例如虾水产业中进行疾病控制的基础研究和有效策略具有重要应用。 特别地，特异于靶基因的dsRNA可用于分子遗传研究中作为在虾中 反向遗传工具，例如在生殖生物学和免疫学的研究中。另外，使用基 于dsRNA的抗病毒治疗技术的发展将有助于减轻虾及其它甲壳动物 的疾病和病原体特别是病毒、细菌、真菌、小孢子虫，单孢子虫和簇 孢虫病原体的新手段。另外，dsRNA可以作为诱导例如抗病毒或其 它无脊椎动物病原体的全身性保护性免疫应答的手段而给予。

因此，基于前述内容，本发明广泛涉及在无脊椎动物例如海洋无 脊椎动物如软体动物或甲壳动物优选虾中，使用dsRNA诱导全身性、 非序列特异性免疫应答和/或诱导序列特异性基因表达调节(抑制)免 疫应答。

另外，本发明广泛涉及使用非序列特异性dsRNA，特别是长 dsRNA，通过共同给予增强由序列特异性dsRNA激发的应答。

一般地，本发明的方法包括给予或共同给予一定量的至少一种 dsRNA或者一些dsRNA的混合物，所述一些dsRNA例如与靶基因 序列互补并杂交，并优选长度为至少大约21-25个核苷酸或者呈现 与靶基因无已知同源性，以及优选长度为至少50-100个核苷酸，任 选可包含修饰的核苷酸，所述给予量足以激发针对特定疾病或病原体 例如病毒、细菌、支原体或真菌的保护性RNAi和/或免疫应答。如 所论述的，本发明的一个新的方面是足够大小的dsRNA不需要具有 与任何宿主基因或病原体基因具有序列同源性的序列以激发全身性 保护性免疫应答或者加强序列特异性dsRNA激发的特异性RNA干 扰。因此，给予的非特异性dsRNA可衍生自任何来源，例如病毒、 细菌、或其它无脊椎动物来源、或者来自脊椎动物例如哺乳动物、两 栖动物、禽类、植物来源的爬虫动物、或者可以是合成的dsRNA， 例如希望的核苷酸的均聚物或杂聚物。在实施例中，表明了细菌 dsRNA，合成的dsRNA及不同的脊椎动物dsRNA在虾中均激发全身 性免疫应答，非特异性dsRNA(聚C:G)加强序列特异性(WSSV) dsRNA激发的RNAi应答。

激发非特异性免疫应答的给予的dsRNA优选是长dsRNA，即优 选长度为至少50个核苷酸，更优选为至少100-500个核苷酸、1000 -5000个核苷酸、无已知上限。其一个实例是聚C:G或者另一种相 似的天然或修饰的核苷酸的聚合物。相反，激发序列特异性应答(减 量调节相应于靶基因的基因)的dsRNA可以短至21-25个核苷酸， 如果希望则可更长。

优选在甲壳动物或其它海洋无脊椎动物中激发序列特异性RNAi 应答的给予的dsRNA包含这样的序列，其经鉴别或呈现与靶基因具 有充分序列相同性，例如至少70％-80％，优选至少80-90％，或者 至少90-95％相同性，从而其与靶基因例如内源性甲壳动物基因或 者包含于感染甲壳动物的寄生物中的基因特异性杂交，并且调节，优 选抑制或阻断其表达。优选所述靶基因表达的调节授予希望的表型效 果或者授予针对特定病原体的免疫性。优选地，序列特异性dsRNA 包含如上述与本申请中鉴别的靶基因的充分同源或者更特异于在本 申请中特异性鉴别的核酸序列。

dsRNA以足以授予非序列特异性免疫应答或序列特异性基因减 量调节的量给予，例如剂量范围是至少大约0.0001mg-0.001mg， 优选至少大约0.001-0.01mg，更优选为至少大约0.1-0.5mg，无已 知上限。已经观测到将100μg dsRNA注射进虾中不产生毒性。给予 模式可以是产生保护性免疫应答的任何手段。例如，所述dsRNA可 以注射给予(静脉内、皮下、肌内等)、可以口服给予、可以通过浸没 或经皮送递。物理方法包括直接注射进宿主细胞或者胞外注射进无脊 椎动物中，例如在虾的尾部。

特别优选的送递手段是生物送递系统，例如酵母或微藻类或可被 甲壳动物摄取的并表达希望的dsRNA的其它微生物细胞，例如特异 于感染甲壳动物的病毒基因的生物送递系统。例如，酵母菌可以用表 达定向于WSSV或TSV基因的dsRNA的载体转化。相似地，微藻 类例如衣藻属(Chlamydomonas)、小球藻属(Chlorella)、节旋藻属 (Arthrospira)(螺旋藻属(Spirulina))、红球藻属(Haematococcus)、拟球 藻属(Nannochloropsis)、骨条藻属(Skeletonema)、角毛藻属 (Chaetocerus)、四片藻属(Tetraselmis)或等鞭金藻属(Isochrysis)的基因 组可以用使得dsRNA在其中表达的载体转化(见Sineshchekar et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 99(13)：86889-97(June25，2002)；Koblenz et al.，J.Cell Sci.116(Pt.13)：2635-46(July，2003))。DsRNA通过甲 壳动物或其它无脊椎动物摄取食物中包含的或导入培养基中的微生 物而给予，或者如果所述dsRNA通过生物送递载体分泌进培养基中 则可以由甲壳动物吸收。预期所述生物送递载体例如酵母或微藻类的 摄取促进所述dsRNA的稳定性(防止其被内源水解酶降解)，因为其 经过甲壳动物肠道并使其导入甲壳动物循环系统，从而产生免疫应 答。

然而，虽然优选生物送递方法，但本发明包含先前所述的其它送 递系统和组合物。

本发明的dsRNA可以在体内或体外合成。细胞的内源RNA聚合 酶可以介导在体内转录，或者克隆的RNA聚合酶可用于在体内或体 外转录。为从在体内的转基因中或从表达构建体中转录，可以使用调 节区域(例如启动子、增强子、沉默子、剪接供体和受体、聚腺苷酸 化)转录所述RNA链。抑制可以通过在器官、组织或细胞类型中特异 性转录；环境条件的刺激(例如感染、应激、温度、化学诱导剂)；和 /或在发育阶段或年龄使转录工程化而定向。所述RNA链可以是或不 是聚腺苷酸化的；所述RNA链可以或不能由细胞翻译装置翻译为多 肽。所述RNA可以是通过人工或自动反应而化学或酶促合成的。所 述RNA可以是通过细胞RNA聚合酶或者噬菌体RNA聚合酶(例如 T3、T7、SP6)合成的。本领域已知表达构建体的使用和产生。sup.32， 33，34(还参见WO 97/32016；美国专利No.5,593,874、5,698,425、 5,712,135、5,789,214、和5,804,693所述；以及本文所引用的参考文 献)。如果所述RNA是化学合成或在体外酶促合成的，则该RNA在 导入细胞之前可进行纯化。例如，RNA可以通过用溶剂或树脂提取、 沉淀、电泳、层析或这些方法的组合从混合物中纯化。或者，所述 RNA可以不纯化或最小程度纯化使用以避免由于样品处理而损失。 所述RNA可以干燥贮存或者溶解于水溶液中。所述溶液可以含有缓 冲液或者盐以促进双链体的退火和/或稳定。

RNA可以直接导入细胞中(即细胞内导入)；或者细胞外导入腔、 胞间隙、生物体循环系统中，口服导入，或者通过将生物体浸泡在含 有所述RNA的溶液中而导入。口服导入的方法包括将所述RNA与 所述生物体的食物混和在一起，以及用作食物的物种(酵母或微藻类) 经工程化为表达所述RNA，然后用于喂养待影响的生物体的工程化 方法。或者，可以将所述甲壳动物或其它海洋无脊椎动物浸没于含有 所述dsRNA的新鲜或盐化水中。也可以使用导入核酸的物理方法， 例如直接注射进细胞或者细胞外注射进生物体中。从重组构建体中表 达RNA的转基因生物体可以通过将该构建体导入合子、胚胎干细胞、 或衍生自所述甲壳动物的其它多能细胞中而产生。

本领域已知工程化酵母和微藻类以表达异源基因的方法。然而， 在本发明之前，还未知酵母中异源的导入的dsRNA的表达情况。关 于这点，未知酵母是否能在可检测水平稳定表达dsRNA。dsRNA的 表达特别复杂，因为dsRNA在体内(例如在微生物体内)也许不稳定， 因为细胞典型地表达多个核酸酶作为调节核酸代谢和基因表达的机 制，所述机制包括单链RNA(ssRNA)和dsRNA的降解。例如，在酿 酒酵母(S.cerevisiae)的基因组中，发现6个核糖核酸酶(如Rpp1、 Pan3、Pan2、Rnh1、Rnt1和Rny1)潜在地降解单链和/或双链RNA。 在其它生物体如大肠杆菌中，ssRNA和dsRNA的降解也是由核糖核 酸酶起作用的，但仅有大肠杆菌核糖核酸酶III能降解 dsRNA(Calin-Jageman and Nicholson2003b；Calin-Jageman and Nicholson 2003a)。因此在大肠杆菌中，dsRNA的表达可以基于核糖 核酸酶III基因的缺失而实现(Sun et al.2001)。令人惊奇地，如实施 例的结果所表明，核糖核酸酶基因没有被改变的酵母菌细胞在半乳糖 诱导条件下表达可检测水平的dsRNA(WSSV dsRNA)。因此，可由甲 壳动物如虾安全摄取的酵母菌或其它酵母提供一种合适的送递 dsRNA的手段。已知适于异源基因表达的酵母的其它实例包括毕赤 氏酵母属(Pichia)、Yarrowia、假丝酵母属(Candida)、汉逊氏酵母属 (Hansenula)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，等等。

在本发明实施例中，使用半乳糖诱导型启动子调节酵母菌中 dsRNA表达。然而，可以利用在特定宿主细胞中起作用的任何启动 子。在酵母中起作用的组成型和可调节启动子例如包括PH081、 PH02、PH04、及其它酸性磷酸酶和碱性磷酸酶诱导型启动子、GLA1、 GAL2、GAL4、GAL7、GAL10及其它半乳糖调节的启动子、磷酸 甘油酸激酶启动子，等等。

在一个优选实施方案中，酵母可以用编码不同dsRNA的两种不 同载体转化或转染，从而可以抑制不同基因的表达或者获得归因于给 予特异于相同病原体基因的不同dsRNA的累加或协同结果。尽管本 发明用特异于WSSV基因的dsRNA例证，但是预期可以使用酵母送 递系统送递dsRNA至其它动物，例如其它无脊椎动物，优选其它海 洋无脊椎动物。

相似地，当微藻类用作生物送递系统时，可以被导入饲料、培养 基或者与甲壳动物接触。预期微藻类也可以发挥生物稳定剂作用并使 得希望的dsRNA通过肠道稳定送递至靶循环系统，例如甲壳动物优 选虾的循环系统。

本领域也熟知导入手段及在微藻类中表达异源核酸序列的载体 (见例如2004年3月11日公开的US 200400478281；2003年1月30 日公开的US 20030022359；2003年2月13日公开的US 20030033626； 2003年10月2日公开的US 20030186856及2003年11月13日公开 的US 20030211089，所述文献均全文并入参考)。

也参见Sineshchekov et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 99 (131：8689-94(June 20，2002)；Koblenz et al.，J.Cell Sci.，116(pt. 13)：2635-46(2003)所述，其教导了在微藻类中表达dsRNA以消除 (knock down)内源微藻类基因(视紫红质，中心体蛋白(centrin)基因)表 达，及Leona Banares et al.，Trends Biotechnol.22(i)：43-52(2004)所述， 其对在intero-微藻类中DNA转化的手段进行了综述。如同酵母一样， 微藻类可以转化为表达一或多种dsRNA，所述微藻类可以针对特异 性靶基因，例如病毒，或者可以编码非特异性的长dsRNA，并且所 述微藻类诱导一般(全身性)免疫应答，例如一般抗病毒免疫。

导入核酸的物理方法进一步包括注射含有所述RNA的溶液、用 由所述RNA覆盖的粒子轰击、将细胞或生物体在所述RNA的溶液 中浸泡、或者在存在所述RNA的情况下电穿孔细胞膜。病毒构建体 包装进病毒颗粒将实现表达构建体有效导入细胞中及该表达构建体 编码的RNA转录。可以使用本领域已知将核酸导入细胞中的其它方 法，如脂质介导的载体转运、脂质体送递、化学物质如磷酸钙介导的 转运、附着于载体成分，等等。因此，所述RNA可以与表现如下一 或多种活性的成分一起导入：增强细胞摄取RNA、促进双链体的退 火、稳定退火的链、或者另外增加靶基因的抑制。

本发明的一个重要方面是发现可含有修饰的和非天然发生的核 苷酸的任何序列，优选至少50个核苷酸或更长，的dsRNA可用于在 甲壳动物中诱导全身性免疫应答，本发明另一重要方面是关于将 dsRNA给予甲壳动物例如虾，所述dsRNA具有与被定向的甲壳动物 基因或者通常感染甲壳动物的病原体中包含的基因相同的序列或具 有与所述基因高水平序列相同性的序列(给予具有定向于特定甲壳动 物或病原体基因的序列的干扰RNA)。优选地，所述dsRNA包含一 个至少21-25个核苷酸的区域，其与靶基因例如病毒或内源基因的 相应区域有至少70％、优选至少80-90％、95％或更高的序列相同性。

所述dsRNA特别例如包括相应于参与免疫、生长、生殖和一般 健康状况或“健壮性”的甲壳动物基因及病原体必需基因的dsRNA。 这种基因包括例如STAT、IKB及NFKB和STAT信号传导途径的其 它推定的成分。这种基因还包括编码神经递质、激素和代谢途径包括 蜕皮抑制激素、性腺抑制激素、甲壳动物高血糖激素的那些基因。这 些基因还包括编码抗微生物剂或产生这些肽包括crustin和penaeidin 的调节剂的那些基因。可以使用潜在的dsRNA以减量调节任何希望 的甲壳动物基因的表达。例如，可以在基因组文库中鉴别推定的靶基 因，所述基因组文库例如使用对照和病毒(WSSV或TSV)感染的虾组 织产生的抑制消减杂交文库。潜在的靶基因的其它特异性实例包括 VP28、核苷酸还原酶、血蓝蛋白、VP26、VP19、胸苷酸激酶、和 DNA聚合酶。

优选地，本发明包括给予一种dsRNA，所述dsRNA具有与甲壳 动物基因或通常感染甲壳动物的病原体基因相同的或呈现高度序列 相同性例如至少75％，优选至少85-90％，更优选90-99％相同性 的序列。在虾的情况中，这些病原体包括病毒如白斑综合征病毒、 Taura综合征病毒、传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)、对虾 杆状病毒(BP)、对虾弹状病毒(RPS)、腮相关病毒(GAV)、黄头病毒 (YHV)、淋巴器官相关病毒(LOW)、类淋巴器官细小样病毒病(LPV)、 肝胰腺细小病毒(HPV)、杆状病毒中肠腺坏死病毒(BMN)、草虾杆状 病毒(MBV)、呼肠孤病毒样病毒病(REO)、弹状病毒(RPS)和新兴病 毒，它们的必需基因可以通过本领域技术人员可获得的任何手段测 序。

感染虾的细菌病原体包括弧菌物种(Vibrio spp.)、分枝杆菌物种 (Micobacteria spp.)、坏死性肝胰腺炎(NHP)和立克次氏体或立克次氏 体样病原体。感染虾的真菌包括尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、 链壶菌(Lagenidium)或离壶菌(Sirolpidium)。感染虾的其它寄生物包括 小孢子虫、单孢子虫和簇孢虫。

所述序列特异性dsRNA的优选有效量与上述相同。所述序列特 异性dsRNA的大小是长度为从至少20至50,000个核苷酸，优选长 度为从大约20个核苷酸至大约5000个核苷酸，更优选长度为从大约 20至500个核苷酸。

特异于靶基因的RNA可用于在任何海洋无脊椎动物例如甲壳动 物中减量调节基因表达。甲壳动物例如包括虾、螃蟹、螯虾、和龙虾。 虾特别例如日本毛虾(Akiami past shrimp)、波罗的海对虾(Baltic prawn)、墨吉对虾(banana prawn)、蓝虾(blue shrimp)、丰年虾(brine shrimp)、褐对虾(brown tiger prawn)、卡拉斯对虾(caramote prawn)、 eastern king prawn、eastern school shrimp、中国对虾(fleshy prawn)、 沼虾(freshwater prawn)、虾、罗氏沼虾(giant river prawn)、斑节对虾 (giant tiger prawn)、刀额新对虾(greasy back shrimp)、短沟对虾(green tiger prawn)、日本对虾(Karuma prawn)、新对虾(metapenaeus shrimp)、 northern white shrimp、palemonid shrimp和白虾(whiteleg shrimp)。

本发明涵盖的螃蟹物种特别例如包括青蟹(blue crab)、中国河蟹 (Chinese river crab)、gazami crab、Indo-Pacific shrimp crab、海蟹、梭 子蟹(portunus swimcrab)、多刺蜘蛛蟹(spinous spider crab)和 swimcrab。

本发明涵盖的螯虾特别例如包括多瑙河螯虾(Danube crayfish)、 Euro-American crayfish、马龙螯虾(Maron crayfish)、Noble crayfish、 赤抓龙虾(red claw crayfish)、克氏螯虾(red swamp crayfish)、信号螯虾 (signal crayfish)、和yabby crayfish。

最后，本发明涵盖的龙虾特别例如包括扁虾(flathead lobster)、日 本龙虾(Japanese Spiny lobster)、mud spiny lobster、Palinurid spiny lobster、龙虾(spiny lobster)、和热带龙虾(tropical spiny lobster)。

在本发明优选的实施方案中，用诱导非特异性(全身性)免疫的长 dsRNA与通过RNA干扰以序列特异性方式抑制靶基因表达的另一种 dsRNA组合处理甲壳动物例如虾。

在本发明的另一个优选实施方案中，用至少一种序列特异性 dsRNA和另一种非特异性dsRNA在控制剂量条件下处理甲壳动物例 如虾，从而所述非序列特异性dsRNA发挥“佐剂”作用并加强由序 列特异性dsRNA激发的、作用于一种基因表达的RNAi应答，所述 基因含有与序列特异性dsRNA包含的序列相同或基本相似的序列。 优选地，相对于序列特异性dsRNA，非特异性dsRNA的量包含使序 列特异性dsRNA激发的应答加强至少10倍的量，从而使得其剂量减 小而不削弱效力。

本发明另一有意义的方面包括使用具有RNA干扰的功能性基因 组鉴别参与免疫调节和病毒免疫的甲壳动物基因。这些基因从已知的 EST文库中鉴别或者可以从新的文库中鉴别，例如从病毒感染的甲壳 动物中产生的文库，其由通过病毒感染而增量调节或减量调节的基因 组成。

优选的基因来源是在www.marinegenomics.org报道的EST文库， 其代表性地含有几千个虾基因序列，并且随着更多的虾基因成为已知 而不断更新。这些推定的基因的可用性使得可以设计可用于抑制其表 达并鉴别其功能的dsRNA。优选地，选择的基因是在其它动物例如 哺乳动物或昆虫中表达的免疫调节基因的直向同源物。然而，本发明 广泛涵盖了使用RNA干扰以确定任何海洋无脊椎动物例如甲壳动物 靶基因的功能。

基因的功能例如通过当所述基因被干扰dsRNA减量调节时观测 表型改变而评定，所述改变例如造血作用、炎症、生长、生殖、分化、 病毒感染抗性、颜色等的改变。理想地，靶基因表达被抑制至少80 -90％、优选95-99％。观测到表型改变并假定了基因功能后，基因 功能可以通过构建缺少并因此不表达特定靶基因的转基因甲壳动物 而潜在证实。

在鉴别靶基因的功能后，所述基因或相应的基因产物可自身用作 靶位以鉴别调节(增量或减量调节)其表达的化合物，例如抗体、小分 子、核酸和蛋白质。在优选的实施方案中，所述靶基因是免疫调节基 因，所述化合物增强免疫性，例如激发或促进抗病毒免疫或疾病抗性。

可以使用微阵列技术(microarray technology)鉴别在甲壳动物例 如虾中在特定条件下增量调节或减量调节的基因，所述特定条件例如 当暴露于dsRNA或被病毒感染时、在应激条件下、营养剥夺、在胚 发生和生殖期间等条件下。基于此对这些基因进行测序，基于这些序 列构建dsRNA，评价由于其表达削弱而引起的表型改变。在优选的 实施方案中，鉴别了促进生长、分化、生殖和全面良好状态的甲壳动 物基因。

如下实施例示出了本发明的特殊实施方案。然而它们不以任何方 式限制本发明的实施。

实施例

材料和方法

动物和实验病毒感染：这些研究中使用的生物分析系统、实验动 物、白斑综合征病毒(WSSV)和Taura综合征病毒(TSV)接种物已经 在别处描述。简而言之，将虾(凡纳滨对虾)在260ml组织培养瓶中单 独培育并在2-3天时间内适应环境，每天更换100％水(人工海水， Marine Environment.)，每天喂食半粒商购饲料颗粒。如所说明的(见 图2b)，将虾保持在与具有恒定水流和空气供应的再循环系统连接的 10加仑水槽(10-15只虾/槽)。适应环境后，将虾通过肌内注射dsRNA 处理，并通过肌内注射被感染的虾的0.45μm过滤提取物而感染。在 TSV的情况中，终稀释液为1×10-8或1×10-5，在WSSV情况中，终 稀释液为46×10-8(重量/体积稀释液)。选择1×10-8(在TSV情况中) 和4-6×10-8(在WSSV情况中)稀释液，作为在大量实验和滴定测试中 持续导致60％-90％死亡率的剂量。阴性对照中注射相同稀释的无 特定病原体的虾提取物。除非特别说明，则注射体积为20μl。每日记 录死亡率，水的更换和喂食方案如上述。

dsRNA：使用T3和T7噬菌体RNA聚合酶(Promega)从线性化的 质粒构建体中在体外转录ssRNA，然后将DNA模板通过加入比例为 1U/μg模板的DNaseI(Promega)而降解。然后将转录体使用标准方法 通过有机溶剂提取而纯化，或者通过二氧化硅基质吸附(RNeasy， Qiagen)而纯化。将互补RNA链在存在400mM NaCl，10mM Tris-Cl， pH 7.4中混和，并通过在75℃温育15分钟、在65℃温育15分钟及 在室温温育15分钟而退火。dsRNA的形成通过在琼脂糖凝胶电泳中 大小改变而监测，dsRNA的浓度通过分光光度测定。用于体外转录 的DNA模板是pBluescript载体(Stratagene)，其具有鸭(绿头鸭)免疫 球蛋白γ链(登记号#AJ312200)的309bp部分；来自鲶鱼斑点叉尾鮰 (Ictalurus punctatus)IgH基因座的BAC6克隆(登记号#CC936713)的 1316bp的基因组非编码区；野猪(Sus scrofa)IgG cDNA(登记号 #U03778)的1079bp部分；或者细菌人工染色体(BAC)克隆载体 pBeloBAC11的1184bp片段。聚C.G、聚I.C和聚C是商购的dsRNA 和ssRNA直向同源物(Sigma-Aldricli)。

组织学和免疫组织化学：将完整的虾在Davidson′s溶液(33％乙 醇、22％福尔马林、11.5％乙酸)中固定24小时，然后移至70％乙醇 中直至通过苏木精/伊红染色(33)进行组织学分析及使用抗WSSV单 克隆抗体检测系统(Diagxotics)进行免疫组织化学分析。

本申请要求申请日为2004年4月22日的美国临时申请 60/564,295、申请日为2003年7月2日的美国系列申请号60/484,531、 申请日为2003年9月25日的发明名称为“在甲壳动物和其它无脊椎 动物中诱导非特异性免疫应答的方法和组合物”的临时申请客户文档 号为100383.52749PV的临时申请(系列号60/505,715)和申请日为 2003年8月29日的美国临时申请60/498,603的优先权，所有申请全 文引入本文作参考。

本申请还涉及如下资助：1)USDA对Oceanic Institute Administered US Marine Shrimp Farming Program和the South Carolina Department of Natural Resources Division for the FY03 Gulf Coast Shrimp Project的资助(USDA/CSREES Award No.2002-38808-01345 2)，2)National Science Foundation对Medical University of South Carolina的资助(Award No.MCB 0315393)3)National Marine Fisheries Service对South Carolina Department of Natural Resources的资助 (Award No.NA03NMF4720362和NAO7FL0498)。

dsRNA序列

dsRNA序列

1)在非特异性dsRNA免疫诱导中测试的 鸭v：

CTGGCAGGGCGGCGTGTCCTACGCCTGCATGGTGGTCCACGAAGGGTTGCCCATGAG

GT

TCACCCAACGGCCTCTCCAGAAGACCCCCGAGCTGGACATCTCCACCGCCCTCTGCC

CG

GACGCCGGCGACCAAGAACTGGACGGGCTCTGGGCCACCATCGCCGTCTTCATCACC

CT

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鲶鱼基因组DNA：

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细菌载体序列：

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猪IgG：

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CC

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CG

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2)在抗WSSV序列特异性RNAi保护作用中测试的 RR(WSSV核糖核酸还原酶的小亚基)：

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vp28(WSSV的包膜蛋白)：

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CC

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实施例1：使用dsRNA介导的遗传干扰以阻断海虾凡纳滨对虾 中病毒感染

在这个实施例中，示出用代表在WSSV基因组中编码的基因的 dsRNA处理虾有效地针对WSSV感染保护虾。这些结果首次提供了 虾中RNAi途径的证据，开启了在水产业中开发使用dsRNA相关治 疗的抗病毒策略的可能性。

虾和WSSV：这些研究中使用的生物分析系统、实验动物和 WSSV接种体在别处描述。简而言之，将凡纳滨对虾(1-2g)单独在 260ml组织培养瓶中培育并适应环境3天，每天100％更换水(人工海 水，Marine Environment)；每天喂食小片(大约半粒)商购饲料。然后 将动物经肌内注射dsRNA处理，如所说明的通过注射或经口用WSSV 感染。每日记录死亡率，如上述更换水和进行饲养。

WSSV和虾EST及dsRNA的制备：包括从WSSV攻击实验中 制备的抑制消减杂交文库(PCR Select，Clontech)的凡纳滨对虾EST 集合(http：//www.marinegenomics.org)用作WSSV和虾表达基因的来 源。这个研究中使用的所有EST均已保藏在National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库中。编码虾信号转导子和转 录激活子(STAT)及I-kappB激酶催化亚基(IKBK)部分的EST的登记号 为CA991435和CA9914534。代表血蓝蛋白和PJV627样蛋白部分的 EST的序列可在www.marinegenomics.org获得(凡纳滨对虾ID号分别 为1405和1263)。PJV627是来自日本对虾(Marsupenaeus japonicus) [Rojtinnakorn，2002#430]的一种未知功能的EST。WSSV基因vp28、 核苷酸还原酶的小亚基及DNA聚合酶的EST也可见于 www.marinegenomics.org(凡纳滨对虾ID号分别为6321、6390和 5789)。将全部或部分EST插入体亚克隆进pBluescript(Strategene)、 pGEM-TEZ(Promega)、或pCR4-TOPO(Invitrogen)中，以在标准条件 下使用SP6或T3和T7噬菌体启动子进行双向体外转录。单链RNA 转录物使用有机溶剂提取并用标准方法进行乙醇沉淀。互补链在 10mM Tris-Cl，400mM NaCl，pH7.5中在75℃温育15分钟、65℃温 育15分钟及在室温温育15分钟而退火。通过琼脂糖凝胶电泳中大小 改变监测dsRNA的形成，通过分光光度法测定dsRNA的浓度。用于 合成dsRNA的IKBK EST的节段相应于CA991434的第15-390位， 用于产生STAT dsRNA的STAT EST的节段相应于CA991435的第14 -383位。全长EST用于产生血蓝蛋白、PJV627样蛋白及所有WSSV 基因dsRNA。作为dsRNA的序列非依赖性抗病毒作用的对照，使用 编码鸭(绿头鸭)免疫球蛋白v(登记号#AJ312200)的309bp片段的构建 体。

表达分析：处死动物并解剖，将组织保存在RNA later(Ambion) 中并在-20℃贮存直至使用。总RNA使用Rneasy试剂盒(Qiagen)分 离。为进行Northern分析，将RNA通过甲醛-琼脂糖电泳解离，移至 尼龙膜上，并如所描述的用32p-标记的DNA探测。将膜使用标准程 序洗涤，通过放射自显影术获得数据。探针从全长EST插入体中制 备。为进行RT-PCR，使用Powerscript RT(Clontech)制备单链cDNA 并用寡dT引发，然后将RT反应稀释2倍，并将1μl用作PCR模板， 使用基因特异性引物进行PCR。PCR条件是94℃2分钟、(94℃30 秒，65℃30秒，72℃1分钟)循环26次，72℃2分钟。使用如下引 物检测STAT mRNA：正向引物CTG TCT GAG CGA AAC TTC ACA 和反向引物AAG TCA GCG ATC ACA TCA GCT。IKBK mRNA使用 如下引物检测：正向引物CCA GCA ACT AGA AGG CTC ACT和反向 引物CGG TTC TTG CTG CAT CTT GCA。核糖体蛋白S3AmRNA使 用如下引物检测：正向引物CCA GAA TGA GAC TGA TGC TGA和 反向引物CAC GGG TGA TAA TGT CTA CCA。

结果

dsRNA触发虾中相关细胞mRNA的特异性耗竭：基于RNAi途 径的广泛保守，我们假定凡纳滨对虾中存在与RNAi相似的机制。为 测试这个假说，注射部分虾基因的dsRNA并通过Northern印迹分析 和RT-PCR分析靶定mRNA的相对水平。图1a示出注射血蓝蛋白 dsRNA显著降低肝胰腺中血蓝蛋白mRNA水平。这种mRNA耗竭是 序列特异性的，因为注射编码不相关基因(PJV627样蛋白)的dsRNA 对血蓝蛋白表达无作用，并且注射血蓝蛋白dsRNA的虾表达正常水 平的这种不相关mRNA(图1a)。还很明显的是用dsRNA靶定这种未 知功能的基因不导致相应mRNA的可检测的耗竭。可以观测到与这 种无效靶定mRNA相关的低分子量杂交信号，提示这是得自推定的 RNAi机制的激活的中间降解产物。相似的中间体基于诱导RNAi在 果蝇细胞中观测到[9]。看起来合理的是dsRNA诱导mRNA耗竭的效 力是基因特异性的，并可能受转录和翻译调节、亚细胞区室化及其它 特异于每个mRNA的特性的独特机制的影响。

我们已经进一步证实特异性mRNA表达的减量调节在虾系统中 其它基因及在其它组织中可完成(图1，b和c)。我们注射代表虾的信 号转导子和转录激活子(STAT)和IkappaB激酶催化亚基(IKBK)cDNA 部分的dsRNA。RT-PCR示出与注射盐水的动物相对比，相应mRNA 从dsRNA处理的动物的腮中耗竭。这种减量调节的序列特异性通过 所有动物中核糖体蛋白mRNA的表达未受影响(图1，b和c)及STAT dsRNA处理的动物中IKBK mRNA正常表达而证实，反之亦然(数据 未示出)。然而相关dsRNA诱导的mRNA耗竭是不完全的，在dsRNA 处理后STAT和IKBK mRNA的痕迹仍可通过RT-PCR检测到。在 dsRNA诱导的mRNA表达水平和mRNA耗竭效率中观测到也有一些 个体差异。

编码部分WSSV基因的dsRNA的针对WSSV感染的保护作用： 关于注射相关dsRNA对特异性基因表达的作用的数据提示RNAi样 途径存在于凡纳滨对虾中。我们相信如果这种途径可以使用病毒特异 性基因的dsRNA诱导，抗病毒保护作用可以通过阻断复制和/或发病 机制所需的病毒基因产物的表达而实现。图2a示出用编码部分WSSV 基因的dsRNA处理的动物获得强力的抗WSSV感染的保护。如先前 所报道，dsRNA以序列非依赖性方式在虾中诱导抗病毒状态；然而 这种保护作用受到限制，可以被相对高病毒剂量压制(见图2中鸭v)。 注射编码特异WSSV基因的dsRNA与不相关dsRNA序列处理的动 物相比，提供高得多的存活率。这些数据提示dsRNA激活虾中RNAi 途径，能阻断病毒基因的表达并产生抗病毒保护作用。令人感兴趣地， 阻断这些研究中测试的三个WSSV基因中的任一个，提供相似的强 抗病毒保护作用。选择这三个候选基因是因为它们很可能是WSSV 生活周期中必需的；核苷酸还原酶(RR)的小亚基和DNA聚合酶对于 基因组复制是重要的推定早期酶，vp28是包膜的结构成分，对于 WSSV的致病原性被认为是重要的。与观测到RNAi看起来在虾中全 身性地发挥作用相一致(图1)，肌内注射RR的dsRNA不仅通过相同 途径提供抗感染保护作用，而且通过将WSSV阳性组织给予动物提 供剂量依赖性方式的抗感染保护作用(图2b)。

实施例2：编码4个WSSV基因的dsRNA产生的抗WSSV保护 作用的进一步鉴定

任务1目的是提供选择的WSSV基因的初始对比。基于EST克 隆的性质和基因在病毒复制中的预期作用，可以发现dsRNA在产生 保护性作用中的效力的差异。这些实验将确定产生dsRNA的方法并 使得可以从我们的WSSV EST集合中评价一些最重要的克隆。

克隆4个WSSV基因(vp26、vp19、胸苷酸激酶、DNA聚合酶) 及产生长dsRNA

方法

使用6个而不是4个WSSV基因。这些是vp19(包膜蛋白， GenBank登记号#AA069661)、vp26(核壳蛋白，GenBank登记号 #AA069663)、vp28(包膜蛋白，GenBank登记号AAL33423)、VF(未 知功能的病毒蛋白，GenBank登记号#AAL33255)、DNA聚合酶(参 与病毒基因组复制的酶，GenBank登记号NP_478036)、及ZF(推定的 锌指转录因子，登记号NP_477987)。基于其已知或猜测的功能选择这 些基因作为潜在的靶位；已经提示两个蛋白质(vp19和vp28)是在病毒 感染宿主细胞中起作用的并且是生产疫苗的靶位的包膜蛋白 (Witteveldt J，Vlak JM，Van Hulten MC.Protection of Penaeus monodon against white spot syndrome virus using a WSSV subunit vaccine.(Fish Shellfish Immunol.2004 May；16(5)：571-9))；vp26蛋白质已知是核壳 的成分；DNA聚合酶应是病毒基因组复制所需要的；ZF在控制WSSV 基因组表达中具有推定作用。因此，这些基因代表WSSV中至少4 种独特功能并因此代表了通过RNAi介导的减量调节进行针对感染的 保护的一些靶位。将所述基因从我们的EST集合中通过PCR扩增并 亚克隆进具有相反方向的噬菌体启动子的载体中(得自Invitrogen的 pCR4，其中感兴趣的插入体两侧是T7和T3启动子)。将质粒DNA 纯化、线性化并用于体外转录RNA。将所述RNA纯化、退火、通过 凝胶电泳定性检测、并定量。修改的RNA合成方案如下，其使得可 以按比例扩大合成反应从而产生毫克量级的RNA。

结果和讨论

上述鉴别的基因除了vp19和胸苷酸激酶的基因之外均从EST集 合中成功扩增并克隆进感兴趣的载体中。将编码vp19的基因通过 PCR从WSSV感染的虾组织中扩增。所有克隆的基因的相同性通过 测序核实，重组构建体的功能性通过体外转录检测。单链RNA和退 火的dsRNA产物通过琼脂糖凝胶电泳分析，如图3所示。典型的体 外转录反应产生大约25μg dsRNA/1μg DNA模板。

结论

1.病毒基因的克隆和体外转录方法已经被应用并标准化。

2.利用本发明应用的技术应该可以从选择的任何虾病毒的感兴 趣的基因中产生dsRNA，所述病毒的EST克隆或序列信息是可获得 的。

实施例3：用于抗WSSV感染的保护的单独及组合的dsRNA制 备物

方法

测试前文实施例的5个基因保护虾免于WSSV感染的能力。如 下进行实验：1)通过喂食WSSV感染的虾组织给予攻击剂量的病毒 (每天5％体重)，进行2天。对照(未感染的)动物喂食相同量的未感染 的虾组织(每日5％体重)，进行2天。选择这种致死剂量的病毒经口 攻击，而不是注射LD90剂量的WSSV，因为其更代表真实世界环境 的病毒攻击模式并且因为其提供更加严格的虾抗性测试。WSSV基因 的保护作用未与非特异性dsRNA(例如鸭IgY)的保护作用对比。将使 用非特异性刺激的这个研究中获得的结果与使用病毒特异性序列的 初始结果进行对比，非常清楚使用WSSV基因的dsRNA可以达到高 几倍的保护作用。另外，特异性(vp19)和非特异性(polyC:G)dsRNA 的保护效果对比包括在实施例5的表和图9中示出的实验中。在开始 经口攻击之前4-6小时肌内注射dsRNA(12μg)。使用Kruskal-Wallis 方法使用单向ANOVA进行统计学分析。

在所有实验中，将动物在由25个水槽组成的再循环系统中攻击。 每个水槽的水排出至一个集流贮水槽中，所述水经5μm过滤，之后 流经生物滤膜。将所述水经1μm过滤并用40W UV消毒器(9×105 W/cm2s)处理，之后再回置于每个水槽中。将动物每天喂食1-2粒商 购饲料。定期更换滤膜。盐度保持在30ppt，温度保持在27℃。在所 有病毒攻击之前有48小时适应环境时间。监测死亡率并每日除去死 亡动物。每个水槽有10只动物(1-3g)，每次处理三个水槽。

结果和讨论

5个选择的WSSV基因的效力在保护作用实验中变化(图4)：ZF 和vp19基因提供良好的保护作用(好于未感染的动物：80-86％存 活)，而其它三个基因(vp26、vp28和VF)提供较小的保护作用(40- 52％)。测试所有5个基因的dsRNA混合物，发现在10天内提供中 等的保护作用，70％存活率。所有基因和dsRNA混合物除了VF之外 与阳性对照物显著不同(P＝0.072)。当与WSSV阳性处理相比时， Vp19、ZF和MIX(P＜0.001)与阴性对照物相比产生略微更显著的存活 率(P＝0.003)。阴性组中的死亡率出乎预料，但通过PCR测试表明不 是由于偶然的WSSV感染所致。阴性组中的死亡率不影响结果的解 释和显著性。最具保护作用的基因vp19和ZF与最低保护作用的基 因VF显著不同(分别P＝0.011和P＝0.016)。

结论

1.通过肌内注射给予12μg编码vp19和ZF的dsRNA提供对致死 性的经口病毒攻击的基本完全的保护作用。测试的其它3个基因具有 保护作用但效力较低。

2.5个dsRNA的混合物提供保护作用，效力是单独给予5个基 因的中间值。

实施例4：dsRNA在海洋无脊椎动物(虾)中诱导一般性抗病毒免 疫

当测试RNAi介导的信号转导途径的减量调节对Taura综合征病 毒(TSV)攻击结果的作用时，我们首先观查到为虾注射dsRNA提供了 抗病毒保护作用。我们的实验方法是注射纯化的相关dsRNA，然后 用TSV攻击动物以探究其中感兴趣的基因被减量调节的动物是否展 示对病毒的易感性增加。令人惊奇地，注射任何dsRNA，无论是代 表虾基因还是非特异性dsRNA对照物，均引起对TSV攻击的存活率 增加(数据未示出)。这个最初的观测结果促使我们研究dsRNA在虾 中具有与在脊椎动物中一样的诱导抗病毒程序的可能性。

为探究是否dsRNA在虾中诱导一般性抗病毒应答，我们分析了 dsRNA处理对单链RNA病毒TSV(Bonami et al.，J.Gen.Virol.78 (Pt.2)：313-319(1997))感染的作用，及对复合物包膜的双链DNA病毒 WSSV(Mang et al.，J.Virol.75：11811-20(2001))感染的作用。与模拟 处理的动物相比，用dsRNA处理的动物中观测到累积死亡率降低50 -75％(图1a，b)。当给予虾显著高剂量的TSV时，抗病毒保护作用 水平降低(至大约12％)(图5a)，提示与任何免疫应答一样，dsRNA在 虾中诱导的抗病毒保护作用可以被增加量的感染物质压制。图3概括 的实验中用于针对TSV和WSSV起保护作用的dsRNA从鸭免疫球 蛋白γ重链基因中转录。这个序列与任何已知虾基因或者与WSSV (登记号#NC_003225)或TSV(登记号NC_003005)的基因组无相似性。 因此，观测到的由鸭dsRNA诱导的抗病毒应答不可能参与序列特异 性RNAi方法，并因此可代表针对两种不相关病毒的更一般性的抗病 毒机制。

实验中使用的攻击系统，包括培养基和饲养条件，虽然高度标准 化，但是相应于累积死亡率的绝对值不完全一致。确信这种可变性可 归因于使用的虾的批次中的差异。由于实验需要相对年幼的虾(1-3g 平均体重)，但在长时期内使用单一批次的虾是不可行的。

初步实验(数据未示出)提示1μg的鸭dsRNA接近于诱导抗WSSV 感染需要的最小有效剂量，100μg的dsRNA可以注射进1-2g的虾 中，不引起明显的毒性迹象。因此，在本发明报道的研究中使用7- 15μg中等剂量以研究在虾中dsRNA诱导的抗病毒应答的特性。

dsRNA剂量对针对病毒保护作用的作用：下表概述了在WSSV 感染之前注射不同剂量鸭v dsRNA的实验结果。表中示出了最终累 积死亡百分比(CPM)数值。  dsRNA(μg/l-2g虾)  CPM  1  71  0.2  84  0.04  90  0.008  97  0.0016  95  0.00032  100  0(阳性对照)  100  0(阴性对照)  0

在独立的实验中，滴定较高剂量的dsRNA以确定多于1μg的 dsRNA对WSSV攻击下的存活率是否有作用(阳性或阴性)。获得的 累积死亡率百分比数值在下表中概述。  dsRNA(μg/l-2g虾)  CPM  14  8  5  10  1.6  5  0(阳性对照)  63  0(阴性对照)  3

这两个分析中即使实验条件保持相同，对于阳性对照和保护组， CPM绝对值均有些变化。然而dsRNA的保护作用一致。总之，这些 剂量应答模式提示大约1μg的dsRNA(对于鸭)始终保护1-2g的虾针 对WSSV的-LD100感染。也提示了1μg可能接近于保护作用阈值， 因此确定在进一步的实验中使用7-15μg，因为在虾中注射100μg dsRNA无任何毒性迹象。

在用4种不同类型不相关的dsRNA序列处理后，用WSSV攻击 虾证实dsRNA诱导的抗病毒状态是序列非依赖性的。我们使用衍生 自脊椎动物免疫球蛋白基因(鸭和猪)、鱼非编码基因组DNA和细菌 载体序列(pBeloBAC11载体)的序列。这些序列的每一个均诱导抗 WSSV感染的保护作用(图5b)。为确定dsRNA处理是否抑制病毒感 染或者导致WSSV诱导的死亡率降低而不影响病毒在宿主中积聚， 对用或未用dsRNA预处理的WSSV攻击的虾进行组织学分析。当对 感染后36和72小时的对照组和dsRNA处理组的虾测试WSSV颗粒 的积聚和经典组织损害的发生时，观测到巨大差异(数据未示出，图 5c)。对照感染的动物的组织切片显示在胃和表皮上皮组织(未示出) 以及造血组织(图5c)的细胞核中巨大的嗜碱性粒状病毒包涵体。这些 特征在经dsRNA处理而保护的动物中不存在。这些观测结果提示 WSSV在dsRNA处理的虾中不能显著积聚，可能是由于抗病毒保护 系统的诱导所致。总之，这些数据支持了dsRNA以序列非依赖性方 式在虾中诱导抗病毒应答的结论

最小保护剂量

方法

为测试dsRNA的剂量针对WSSV攻击提供的保护作用，采用如 下实验设计。选择分别提供最强和最弱保护作用的两个dsRNA物种， vp19和VF，进行“足量”(10μg)和降低的10倍稀释液(1和0.1μg) 作用测试。在经口用WSSV感染的组织攻击之前4-6小时肌内给予 dsRNA，在10天内监测存活率。使用Kruskal-Wallis方法确定统计学 差异。

结果和讨论

结果(图6)证实了vp19是较好的抗病毒攻击保护剂，结果也示出 这两个基因的保护作用可以被削弱。尽管1μg剂量的vp19提供几乎 与10μg剂量一样好的保护作用(80％对90％)，0.1μg的保护作用降低 至36％。所有vp19的剂量(10、l和0.1μg)与阳性对照组均在统计学 意义上不同(分别为P＜0.00l，＜0.001，及＜0.023)。0.1μg剂量与其它 两个剂量相比保护作用显著较低(P＝0.002)。在VF dsRNA的情况中， 这3个剂量水平的保护作用为72％、46％和38％。所有这些剂量(10、 1&0.1μg)的保护作用也与阳性对照显著不同(P＜0.001，0.013，0.016)。 统计学分析示出最高剂量的VF与较高剂量的vp19相似(10μgP＝ 0.009，lμgP＝0.010)，较低VF剂量与最低vp19剂量是一类(P＝0.002 至0.003)。

结论

1.证实了在l0和1μg剂量，与VF相比vp19具有较高保护作用。

2.dsRNA保护作用的效力随着稀释而被削弱，在0.1μg剂量对 于vp19和VF来说均为大约36-38％。

抗病毒状态的诱导归因于RNA：先天免疫的一些强力诱导剂在 相对低的浓度对于敏感细胞可以发挥强力作用。我们考虑到dsRNA 处理的动物对病毒攻击的相对抗性可能是由于dsRNA制备物中的污 染物所致，所述污染物(例如LPS、DNA)可以是在有机溶剂提取期间 与dsRNA一起纯化的。另外，我们考虑到RNA制备物中存在的化合 物可能直接使研究中使用的病毒失活，甚至在dsRNA处理与注射病 毒之间间隔72小时。为解决这些问题，我们进行了一系列实验，其 中将动物用于两步dsRNA应用方案：首先，如前述在病毒攻击之前 72小时为动物注射dsRNA，然后应用与病毒制备物混和的额外剂量 的dsRNA。我们认为如果dsRNA制备物中的污染物是造成病毒直接 失活的原因，则在用与dsRNA制备物混和的病毒接种体注射的虾中 会观测到高存活率。图7示出在病毒攻击前72小时单一dsRNA剂量 对虾的抗WSSV保护作用与两次应用dsRNA(在注射前72小时时及 注射病毒/dsRNA混合物时)的程度相似。另外，相对于用dsRNA预 处理72小时或双重处理，当dsRNA仅是作为与病毒接种体的混合物 而注射时，观察到低保护作用(死亡率降低小于10％)。这些结果表明 dsRNA或推定的污染物对病毒的直接失活作用不能说明观测到的抗 病毒保护作用。另外，图7b示出RNA酶处理破坏本发明制备物提供 的抗病毒保护作用，并且通过两种不同方法(有机溶剂提取或二氧化 硅基质吸附)从体外转录反应中纯化的dsRNA具有相似的诱导所述抗 病毒应答能力。总之，这些结果表明完整的RNA(而不是dsRNA制 备物中存在的其它化合物)是虾中观测到的抗病毒免疫的诱导剂。

是聚C-G而非聚I-C或聚C诱导所述抗病毒状态：聚I-C是脊 椎动物中先天抗病毒应答的强诱导剂，并且是在这些系统中研究 dsRNA的生物学的普通实验工具。我们探究了这种及其它合成的商 购RNA在虾中也诱导抗病毒应答的可能性。图8示出聚I-C不能诱 导抗WSSV感染的保护作用，而另一种dsRNA类似物：聚C-G是抗 病毒保护作用的高效诱导剂。这个结果提示脊椎动物与虾之间dsRNA 识别机制中的差异，并进一步支持了dsRNA不依赖于其制备或纯化 的方法而在虾中可诱导抗病毒应答的观点。重要地，合成的ssRNA 聚C不能诱导抗病毒保护作用，提示与其脊椎动物对应物相同，虾 的抗病毒系统能区别ssRNA和dsRNA。

虾中dsRNA诱导的抗病毒应答的精确分子性质依然有待阐明。 无脊椎动物物种中识别和应答dsRNA的分子机制的鉴定提供了对先 天抗病毒免疫进化的洞察。猜想dsRNA诱导的全身性抗病毒应答存 在于其它无脊椎动物中。这种应答在其他无脊椎动物中的普遍存在对 于在无脊椎动物中使用RNAi进行反向遗传分析(reverse genetic analysis)具有重要意义。

实施例5：非特异性dsRNA对由特异性(WSSV)dsRNA引起的 保护作用的辅助作用

方法

基因特异性dsRNA制备物的成本和复杂性对于商品化是重要的 阻碍。为此，设计实验以确定加入非特异性dsRNA(聚C:G)是否能补 偿特异性WSSV dsRNA的活性在稀释时的丧失。因此，将0.012-1μg 之间不同量的vp19的dsRNA与聚C:G混和以保持1μg的恒定剂量， 如表1所示。在经口开始攻击之前4-6小时注射vp19/聚C:G混合 物至虾中，在10天内监测存活率。使用Kruskal-Wallis方法使用单向 ANOVA进行统计学分析。

表1  处理  VP19 dsRNA(μg/动物)  聚CG(μg/动物)  阳性  0  0  阴性  0  0  1000  1.000  0  333  0.333  0.667  111  0.111  0.889  37  0.037  0.963  12  0.012  0.988  0  0  1.000

结果

如图9所示，用1μg vp19 dsRNA和0.333μg vp19 dsRNA加上 0.667μg聚C:G处理的虾示出基本相同的86-92％存活率(P＝0.574)。 0.111μg vp19 dsRNA处理组示出70％存活率，0.037和0.012μg vp19 dsRNA(及分别0.963或0.988μg聚C:G)处理组示出20-30％存活率， 而1μg聚C:G处理的动物示出不足6％的存活率。当vp19剂量从 0.111μg降低至0.037μg时，观测到保护作用显著降低(P＜0.001)。

结论

实验累积结果提示向编码WSSV基因的dsRNA中加入聚C:G使 得从病毒攻击下存活的虾的比例增加大约2倍。这是非常重要的，因 为预期生产病毒基因特异性dsRNA的成本比生产聚C:G的成本高得 多。导致作用增强的原因还不清楚，但也许与一般化的抗病毒应答的 增量调节相关。

清楚地表明了编码WSSV基因(vp19)的dsRNA比非特异性 dsRNA(聚C:G)具有更高的效力(显著，P＜0.001)。

实施例6：在酵母菌中可诱导地表达病毒dsRNA的酵母表达载 体的构建

构建质粒，所述质粒含有GAL1(半乳糖诱导型启动子)、与其可 操纵地连接的希望的基因(WSSV的vp19或ZF序列)、两个可选择的 标记(URA(尿嘧啶基因)和AMP(氨苄青霉素基因))、与希望的dsRNA 连接的希望的基因，产生当导入酵母菌中时可以在选择条件(尿嘧啶 阴性)下选择并且当在半乳糖诱导条件下培养时表达希望的基因的载 体(见图10)。如图11所示，任选地进一步进行酵母实验以选择具有 最佳表达水平和表达时间的菌株，及具有优化dsRNA产生的培养参 数的菌株。

如图12中包含的结果所示，当用含有WSSV的VP19或ZF序 列的表达载体转化时，酵母菌转化体表达可检测水平的WSSV编码 的dsRNA。在这个实施例中，从转化的酵母中提取10μg总RNA并 通过使用vp19、ZF或酵母肌动蛋白(作为阳性对照)的探针经Northern 印迹进行分析。这些结果表明WSSV相关的RNA在酵母中表达，并 例证了在Northern分析中的检测特异性。

如图13中包含的结果所进一步显示，当用含有WSSV的ZF序 列的载体转化时，酵母表达双链RNA。在这些实验中，通过Northern 印迹分析具有ZF表达载体的10μg总RNA。使用RNA每条链(反义 链，左侧；有义链，右侧)的探针，均检测到了其各自的靶位。因此， 这些结果证实酵母表达WSSV ZF序列的两条链。另外，如图13所 示，标准(每个凝胶的右侧)使得每个样品中存在接近量的WSSV ZF RNA(大约50ng)。

尽管希望酵母以可检测水平表达希望的dsRNA，但这个结果还 是未曾合理地预料到，因为任何表达的dsRNA均很可能被内源RNA 酶降解。基于这些结果，酵母应该提供合适的手段以将希望的dsRNA 送递至甲壳动物，例如虾或其它无脊椎动物。

实施例7：在海虾中调节抗病毒免疫的信号转导途径的功能基因 组学方法

凡纳滨对虾是世界上最广泛培育的虾品种，并且是研究甲壳动 物免疫的重要模型。已知有多于一打的病原性病毒感染虾，这提供了 研究无脊椎动物先天抗病毒应答(无脊椎动物免疫性的一个传统上被 忽视的方面)的独特的机会。通过鉴定这些病毒应答基因，我们的目 的是获得对参与虾与病毒之间关系的途径的种类的了解。为此，我们 使用对照物和白斑综合征病毒(WSSV)-感染的虾组织产生并鉴定了 抑制消减杂交(SSH)文库。分离自SSH文库的克隆的表达分析表明具 有推定的免疫功能的一些基因在WSSV感染期间被调节。控制虾 -WSSV系统的分子机制的新颖性是被低估的，这是由于基因中很大 一部分无法基于序列分析而与它们的功能联系起来。我们已经产生了 含有2800个虾单基因(unigene)的凡纳滨对虾cDNA微阵列，以分析 这些动物中与抗病毒应答相关的基因表达中的改变。利用这个虾 cDNA微阵列进行基因表达的总体分析，结合使用RNAi的靶定沉默， 将提供对甲壳动物中控制抗病毒应答以及其它表型应答的分子事件 的洞察。

结论

在此呈递的数据示出dsRNA在海洋无脊椎动物中引起抗病毒感 染的保护作用。这首次提供了可诱导的、一般的抗病毒免疫应答可以 在无脊椎动物中表达的证据。其它研究提示微生物产物(例如LPS、β- 葡聚糖)以及某些病毒蛋白可以增强虾中抗病毒抗性(Chang et al.， Fish Shellfish Immunol.15：297-310(2003)；Hwang et al.，Deu.Comp. Immunol.23：54552(1999)；Song et al.，Dev.Biol.Stand.900：413-21 (1997)；Takahashi et al.，Fish Shellfish Immunol.10：555-8(2000)； Witteveldt et al.，J.Virol.78：2057-61(2004))。然而，我们的结果以3 种方式进一步增加了关于甲壳动物抗病毒免疫的知识。首先，这些结 果论证了抗病毒免疫应答针对两种不相关病毒TSV和WSSV。基于 这些结果提出的初步假说是dsRNA在虾中诱导一般性抗病毒应答。 其次，这些结果示出虾的抗病毒免疫系统以分子模式应答dsRNA， 无论dsRNA的序列及碱基成分如何(除了在聚I-C的情况中)。第三， 这些结果提示脊椎动物和无脊椎动物先天抗病毒免疫之间可能的进 化联系(dsRNA的识别)。

虽然对无脊椎动物尤其昆虫中抗细菌和抗真菌应答的分子基础 已知较多(综述见(Hetro et al.，J.Infect.Dis.187 Suppl 2：5227-334 (2003))，但没有对于在任何无脊椎动物中抗病毒感染的免疫机制的信 息。基于分析4个完整的无脊椎动物基因组(即黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)、秀丽隐杆线虫 (Caenorhabditis elegans)、和海鞘(Ciona intestinalis))，似乎清楚无脊椎 动物缺少与脊椎动物干扰素同源的抗病毒机制。然而，缺少同源基因 不能排除无脊椎动物中存在与脊椎动物相似的免疫系统。例如，最近 论证了甲壳动物对寄生物感染的抗原特异性免疫记忆(Kurtz et al.， Nature，425：37-8(2003))。这是令人惊奇的，因为在无脊椎动物中确 实不存在与基于T和B淋巴细胞及抗原受体基因重排的脊椎动物系 统同源的真实的适应性免疫系统。在后生动物进化期间的遗传多样性 及新基因功能的获得可能已经产生了抗病毒免疫的趋同进化。因此， 针对功能而非序列同源性可能是在分子水平了解抗病毒免疫的进化 的关键。

dsRNA在无脊椎动物中诱导抗病毒程序的实证开启了发现先天 免疫的新的分子机制的可能性。如果虾表达与IFN或IFN诱导的抗 病毒免疫效应子如PKR或Mx同源的基因将会是令人惊奇的，因为 在其它节肢动物的基因组缺少这些基因。令人感兴趣地，免疫应答性 寡腺苷酸合成酶已经在无脊椎动类群海绵中鉴别(Grebenjok et al.，Eur J.Biochem 269：1382-92(2002)；Kuusksalv et al.，Eur.J.Biochem 232：351-7(1995))，并且不排除这些基因存在于甲壳纲动物中并在抗 病毒免疫中发挥作用的可能性。另一方面，与已知调节脊椎动物干扰 素应答同源的信号转导途径在节肢动物中确实存在。在果蝇中， JAK/STAT系统调节造血作用和性别确定(综述见(Ziedler et al.， Oncogene 19：2598-606(2000))，并且还控制一些免疫功能基因(例如含 有硫酯的蛋白质和Turandot A)的表达(Christophides et al.， Science298：159-65(2002))。在冈比亚按蚊中，已经描述了2个STAT 同系物，其中一个已被示出应答免疫攻击而易位于核中(Barillas-Mury et al，EMBO.J.18：959-6(1999))，我们自己的研究工作在虾中鉴别了 至少一种STAT同系物(NCBI登记号#CA991435)。哺乳动物TLR-3 识别dsRNA导致干扰素应答激活的发现开启了TLR/NF.B盒(cassette) 也参与无脊椎动物抗病毒免疫的可能性，特别是在本发明报道的 dsRNA诱导的应答中

dsRNA诱导的免疫应答在其它无脊椎动物分类单元中的普遍存 在是仍需要探究的重要问题。例如，了解人体疾病的无脊椎动物载体 (例如蚊子)的抗病毒防御机制对公众卫生具有重要意义。另外， dsRNA介导的遗传干扰(RNAi)是许多无脊椎动物模型中广泛应用的 反向遗传工具。当解释使用RNAi的研究时，可能需要考虑到dsRNA 诱导免疫应答的可能性。

注意本发明非限于本文描述的实施方案和上述的实施例，本领域 技术人员在不偏离所附权利要求的范围和精神的前提下可对本发明 作各种改变和修改。