微流控装置及其在多细胞分泌检测中的使用方法
阅读：737发布：2021-11-28
专利汇可以提供微流控装置及其在多细胞分泌检测中的使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了鉴定一含有一具有胞外效应的效应细胞的细胞群的方法和装置。在一实施方案中所述方法包括在微型反应器中保留一含有一种或多种效应细胞的细胞群，其中微型反应器的内含物还包括一含有一种或多种读出颗粒的读出颗粒群，在微型反应器内孵育细胞群和读出颗粒群，检测细胞群是否具有胞外效应，其中读出颗粒群或其亚群提供胞外效应的一直接或间接的读出结果，并且基于检测步骤的结果测定在细胞群内是否有一种或多种效应细胞在读出颗粒上施加胞外效应。如果测量到了一胞外效应，回收细胞群进行进一步分析以测定对所述效应负责的一个或多个细胞。，下面是微流控装置及其在多细胞分泌检测中的使用方法专利的具体信息内容。
1.一种鉴定一含有一具有胞外效应的效应细胞的细胞群的方法，包括：
在微型反应器内保留一含有一种或多种效应细胞的细胞群，其中所述微型反应器的内含物还包含一含有一种或多种读出颗粒的读出颗粒群，
在所述微型反应器内孵育所述细胞群和所述一种或多种读出颗粒，
检测所述细胞群是否存在所述胞外效应，其中所述读出颗粒群或其一亚群提供所述胞外效应的一直接或间接的读出结果，且
基于所述检测步骤的结果测定所述细胞群内的一种或多种效应细胞是否显示出所述胞外效应。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述微型反应器是一微流体小室。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述微流体小室是一包括膜阀的微流体结构的部分。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述一种或多种效应细胞含有一抗体分泌细胞(ASC)。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述一种或多种效应细胞含有一浆细胞、B细胞、浆母细胞、通过记忆B细胞扩增产生的一细胞、一杂交瘤细胞、一T细胞、CD8+T细胞，与CD4+T细胞、一经过工程化的产生抗体的重组细胞、一经过工程化的表达一T细胞受体的重组细胞，或其组合。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述细胞群含有从约2个到约500个细胞或从约10个到约50个细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述细胞群含有从约2个到约10个细胞。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述细胞群含有从约50个细胞到约100个细胞。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群含有一种或多种读出小珠、读出细胞、或其一组合。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群含有一蛋白或多肽。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群含有一病毒颗粒、细胞因子、趋化因子、神经递质、生长因子、激素、膜提取物、脂颗粒、稳定的受体、一受体的一胞外结构域、一用一膜提取物功能化的囊泡、一用一膜提取物功能化的小珠、一经过功能化的作为一稳定的可溶性蛋白的G蛋白偶联受体(GPCR)、或其组合。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群的所述读出颗粒具有小于约500纳米的，或从500纳米到50纳米的平均直径。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述读出颗粒群的所述读出颗粒具有从约1微米到约10微米的平均直径。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群含有一种或多种在其表面表达一ATP结合框转运蛋白(ABC转运蛋白)的读出细胞，且所述胞外效应是所述ABC转运蛋白的拮抗、所述ABC转运蛋白的激活，或所述ABC转运蛋白被所述一种或多种效应细胞中的一种结合，或所述一种或多种效应细胞中的一细胞细胞分泌的一分子。
15.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群含有一种或多种在其表面表达一G蛋白偶联受体(GPCR)或一可溶的GPCR的读出细胞，并且所述胞外效应是所述GPCR的拮抗、所述GPCR的激活或所述GPCR被所述一种或多种效应细胞中的一效应细胞结合，或被所述一种或多种效应细胞中的一效应细胞分泌的一分子。
16.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群含有一种或多种在其表面表达一酪氨酸激酶受体(RTK)的读出细胞，并且所述胞外效应是所述RTK的拮抗、所述RTK的激活或所述GPCR被所述一种或多种效应细胞中的一效应细胞结合，或被所述一种或多种效应细胞中的一效应细胞分泌的一分子。
17.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群含有一种或多种在其表面表达一离子通道的读出细胞，并且所述胞外效应是所述离子通道的拮抗、所述离子通道的激活或所述离子通道被所述一种或多种效应细胞中的一效应细胞结合，或所述一种或多种效应细胞中的一效应细胞分泌的一分子。
18.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群含有一种或多种在其表面表达一具有内在的酶活性的受体的读出细胞，并且所述胞外效应是所述具有内在的酶活性的受体的拮抗、所述具有内在的酶活性的受体的激活或所述具有内在的酶活性的受体被所述一种或多种效应细胞中的一效应细胞结合，或所述一种或多种效应细胞中的一效应细胞分泌的一种分子。
19.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群含有一种或多种在其表面表达一细胞因子受体的读出细胞，并且所述胞外效应是所述细胞因子受体的拮抗、所述细胞因子受体的激活或所述细胞因子受体被所述一种或多种效应细胞中的一效应细胞结合，或被所述一种或多种效应细胞中的一效应细胞分泌的一分子。
20.如权利要求15所述的方法，其中所述G蛋白偶联受体是一趋化因子受体、一细胞因子受体、A类GPCR、B类GPCR、粘附GPCR、frizzled GPCR、乙酰胆碱受体、褪黑激素受体、melacortin受体、胃动素受体、溶血磷脂(LPA)受体、腺苷受体、肾上腺素受体、血管紧缩素受体、缓激肽受体、降血钙素受体、钙敏感受体、大麻受体、趋化因子受体、胆囊收缩素受体、补体组分(C5AR1)受体、促肾上腺皮质激素释放因子受体、多巴胺受体、内皮分化基因受体、内皮素受体、类甲酰肽受体、甘丙肽受体、胃泌素释放肽受体、受体饥饿激素受体、胃抑制性多肽受体、胰高血糖素受体、促性腺激素释放激素受体、组胺受体、kisspeptin(KiSS1)受体、白细胞三烯受体、黑色素浓缩激素受体、黑皮质素受体、褪黑激素受体、胃动素受体、神经肽受体、烟酸、类鸦片受体、食欲素受体、孤儿受体、血小板激活因子受体、前动力蛋白受体、催乳素释放肽、前列腺素类受体、蛋白酶激活受体、P2Y(嘌呤能)受体、松弛素受体、分泌素受体、5-羟色胺受体、生长激素抑制素受体、速激肽受体、血管加压素受体、后叶催产素受体、舒血管肠肽(VIP)受体或垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)受体、味觉1受体、代谢型谷氨酸受体、钙敏感受体、脑特异性血管形成抑制剂受体(1、2或3)、钙黏着蛋白受体或一种雌激素受体。
21.如权利要求16所述的方法，其中所述酪氨酸激酶受体(RTK)是ErbB-1、ErbB-2、ErbB-3、ErbB-4、胰岛素受体、血小板衍生生长因子α受体、血小板衍生生长因子β受体、肥大/干细胞生长因子受体(SCFR)、集落刺激因子1受体、CD135、成纤维细胞生长因子受体-1(CD331)、成纤维细胞生长因子受体-2(CD332)、成纤维细胞生长因子受体-3(CD333)、成纤维细胞生长因子受体-4(CD334)、成纤维细胞生长因子受体-6、血管内皮生长因子(VEGF)1受体、VEGF2受体、VEGF3受体、肝细胞生长因子受体、原肌球蛋白受体激酶(Trk)A、Trk B、Trk C、Ephrin(EPH)受体A1、EPH受体A2、EPH受体A3、EPH受体A4、EPH受体A5、EPH受体A6、EPH受体A7、EPH受体A8、EPH受体A9、EPH受体A10、EPH受体B1、EPH受体B2、EPH受体B3、EPH受体B4、EPH受体B5、EPH受体B6、AXL、第IX类RTK受体家族的一成员、间变性淋巴瘤/白细胞酪氨酸激酶(ALK/LTK)受体家族、第XI类RTK受体家族的一成员、神经营养因子酪氨酸激酶、受体相关1受体、盘状结构域受体、第XIV类RTK受体家族的一成员、第XV类RTK受体家族的一个成员、第XVI类RTK受体家族的一成员或一肌肉特异性激酶受体。
22.如权利要求17所述的方法，其中所述离子通道是一GABAA受体、一甘氨酸受体
(GlyR)、一5-羟色胺受体、烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)、锌激活离子通道、离子型谷氨酸受体、AMPA受体、钾盐镁矾受体、NMDA受体或一种ATP门控通道。
23.如权利要求18所述的方法，其中所述具有内在的酶活性的受体是一受体酪氨酸激酶(RTK)、受体丝氨酸-苏氨酸激酶、受体酪氨酸磷酸酶或一受体鸟苷酰环化酶。
24.如权利要求19所述的方法，其中所述细胞因子受体是一I型细胞因子受体、II型细胞因子受体、白细胞介素-1受体、肿瘤坏死因子受体、趋化因子受体、转化生长因子β受体。
25.如权利要求20所述的方法，其中所述趋化因子受体是一白细胞介素-8受体、1型C-C趋化因子受体、C-X-C趋化因子受体、CXC3趋化因子受体或XC趋化因子受体。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述趋化因子是一白细胞介素-8受体、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCR11、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、XCR1(GPR5)或CX3CR1(fractalkine)。
27.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群是一同质性读出颗粒群或一抑制性读出颗粒群。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群包含多种读出小珠。
29.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群包含多种读出细胞。
30.如权利要求1-25和27-29中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群含有一种读出小珠和一种读出细胞。
31.如权利要求1-25和27-30中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群含有多种读出小珠和一种读出细胞。
32.如权利要求1-25和27-30中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群含有一种读出小珠和多种读出细胞。
33.如权利要求26-32中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群或其亚群用一种抗原或表位进行功能化。
34.如权利要求26-32中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群或其亚群用包括一抗体结合部分的分子进行功能化。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述包括一抗体结合部分的分子是蛋白A、蛋白A/G、蛋白G、一结合免疫球蛋白的单克隆抗体、一结合免疫球蛋白的单克隆抗体片段、一结合免疫球蛋白的多克隆抗体、一结合免疫球蛋白的多克隆抗体片段，或其组合。
36.如权利要求29所述的方法，其中所述多种读出细胞是一同质性的或异质性的读出细胞群。
37.如权利要求20所述的方法，其中所述细胞因子受体是以下细胞因子的一种受体：
(IL)-1α、IL-1β、IL-1RA、IL18、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-
12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-2、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白血病抑制因子、制瘤素M、干扰素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、CD154、淋巴毒素β(LTB)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF-β、转化生长因子(TGF)-β、促红细胞生成素、巨核细胞生长发育因子(MGDF)、Fms相关酪氨酸激酶3配体(Flt-
3L)、干细胞因子、集落刺激因子-1(CSF-1)、巨噬细胞刺激因子、4-1BB配体、诱导增殖配体(APRIL)、分化抗原簇70(CD70)、分化抗原簇153(CD153)、分化抗原簇178(CD178)、糖皮质激素诱导的TNF受体配体(GITRL)、CD258、OX40L、CD252、TALL-1、TNF相关诱导凋亡配体(TRAIL)、肿瘤坏死因子凋亡弱诱导分子(TWEAK)或TNF相关激活诱导细胞因子(TRANCE)。
38.如权利要求27或28所述的方法，其中所述读出颗粒群含有多种读出小珠和多种读出细胞。
39.如权利要求1-38中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群或其亚群被固定在所述微型反应器的一表面。
40.如权利要求15-25中任一项所述的方法，其中所述离子通道或细胞表面受体由所述一种或多种读出细胞过表达。
41.如权利要求1-40中任一项所述的方法，还包含将所述细胞群和所述读出颗粒群与多种辅助颗粒一起孵育。
42.如权利要求1-40中任一项所述的方法，其中所述胞外效应是由所述一种或多种效应细胞或其子群分泌的一分子与所述读出颗粒群或其亚群之间的结合相互作用。
43.如权利要求41所述的方法，其中所述胞外效应是由所述一种或多种效应细胞或其子群分泌的一分子与所述多种辅助颗粒中的一种或多种辅助颗粒之间的结合的相互作用。
44.如权利要求41-43中任一项所述的方法，其中所述由所述一种或多种效应细胞分泌的分子在所述孵育步骤中结合到一辅助颗粒。
45.如权利要求42或43所述的方法，其中所述结合相互作用是一抗原-抗体结合特异性相互作用、抗原-抗体结合亲和性相互作用或抗原-抗体结合动力学相互作用，其中所述抗体是一由所述一种或多种效应细胞中的一效应细胞分泌的分子。
46.如权利要求1-41任一项中所述的方法，其中所述胞外效应是凋亡的调节、细胞增殖的调节、一读出颗粒形态外表的改变、一读出颗粒内一蛋白定位的改变、由一读出颗粒表达一种蛋白、一辅助颗粒的生物学活性的中和、由所述效应细胞诱导的一读出细胞的细胞裂解、由所述效应细胞诱导的所述读出细胞的细胞凋亡、读出细胞坏死、一抗体的内化、一辅助颗粒的内化、通过所述效应细胞中的酶的中和、一可溶的信号传导分子的中和或其组合。
47.如权利要求1-46中任一项所述的方法，还包括在基本上一单个平面上维持所述细胞群。
48.如权利要求1-47中任一项所述的方法，还包括在基本上一单个平面上维持所述读出颗粒群。
49.如权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述孵育步骤还包含在含有所述细胞群的微型反应器中交换培养基。
50.如权利要求41所述的方法，其中所述多种辅助颗粒包含一蛋白、肽、生长因子、细胞因子、神经递质、脂、磷脂、氨基酸、一元胺、糖蛋白、碳水化合物、激素、病毒颗粒、抗体、抗体片段、荧光底物、荧光基团或其组合。
51.如权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述孵育步骤为30分钟、1小时、2小时、
4小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、1周、至少约30分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约4小时、至少约6小时、至少约12小时、至少约
24小时、至少约36小时、至少约48小时、至少约60小时、至少约72小时、至少约84小时、至少约96小时或至少约1周。
52.如权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述一种或多种效应细胞，或其子群在所述孵育步骤中分裂。
53.如权利要求29所述的方法，其中所述多种读出细胞或其子群在所述孵育步骤中分裂。
54.如权利要求41所述的方法，其中所述多种辅助颗粒时多种辅助细胞。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述多种辅助细胞或其子群在所述孵育步骤中分裂。
56.如权利要求41所述的方法，其中所述多种辅助颗粒含有一二抗、荧光基团、细胞因子或荧光底物。
57.如权利要求41、50和54-56中任一项所述的方法，其中所述多种辅助颗粒包含一异质性的辅助颗粒群。
58.如权利要求41、50和54-57中任一项所述的方法，其中所述多种细胞因子是一异质性或同质性的细胞因子群。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述细胞因子群含有白细胞介素(IL)-1α、IL-1β、IL-1RA、IL18、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-2、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白血病抑制因子、制瘤素M、干扰素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、CD154、淋巴毒素β(LTB)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF-β、转化生长因子(TGF)-β、促红细胞生成素、巨核细胞生长发育因子(MGDF)、Fms相关酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)、干细胞因子、集落刺激因子-1(CSF-1)、巨噬细胞刺激因子、4-1BB配体、诱导增殖配体(APRIL)、分化抗原簇
70(CD70)、分化抗原簇153(CD153)、分化抗原簇178(CD178)、糖皮质激素诱导的TNF受体配体(GITRL)、CD258、OX40L、CD252、TALL-1、TNF相关诱导凋亡配体(TRAIL)、肿瘤坏死因子凋亡弱诱导分子(TWEAK)或TNF相关激活诱导细胞因子(TRANCE)。
60.如权利要求41和56-59中任一项所述的方法，其中所述多种辅助颗粒含有1-磷酸鞘氨醇、溶血磷脂酸或其组合。
61.如权利要求41和56-60中任一项所述的方法，其中所述多种辅助颗粒包含一荧光底物或被切割时发出荧光的非荧光底物。
62.如权利要求41和56-61中任一项所述的方法，其中所述多种辅助细胞包含成纤维细胞、自然杀伤(NK)细胞、杀伤T细胞、抗原提呈细胞、树突状细胞、重组细胞或其组合。
63.如权利要求41和56-62中任一项所述的方法，其中所述多种辅助颗粒包含多种病毒颗粒。
64.如权利要求41和56-63中任一项所述的方法，其中所述多种辅助颗粒是多种补体途径诱导因子。
65.如权利要求1或2所述的方法，还包含基本上将所述含有所述细胞群的微型反应器与其周围环境隔离。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述微型反应器是一微流体小室，一个或多个膜阀被用来基本上将所述微流体小室与其周围环境隔离。
67.如权利要求53所述的方法，其中至少70％的所述读出细胞是有活力的。
68.如权利要求15-25中任一项所述的方法，其中所述胞外效应是所述细胞表面受体或离子通道的拮抗。
69.如权利要求15-25中任一项所述的方法，其中所述胞外效应是所述受体或离子通道的激活。
70.如权利要求68所述的方法，其中所述细胞表面受体是一GPCR，所述胞外效应是所述GPCR的激活，且激活由胞内cAMP或钙的增加、一报告蛋白的表达或一种蛋白的定位来测量。
71.如权利要求69所述的方法，其中所述细胞表面受体是一GPCR，且拮抗由胞内cAMP或钙的减少、一报告蛋白的表达或一蛋白的定位来测量。
72.如权利要求29所述的方法，其中所述胞外效应是所述多种读出细胞或其亚群的细胞裂解，由所述一种或多种效应细胞或其一亚群诱导。
73.如权利要求29所述的方法，其中所述胞外效应是所述多种读出细胞或其亚群的细胞凋亡或细胞坏死，由所述一种或多种效应细胞或其一亚群诱导。
74.如权利要求55所述的方法，其中至少70％的所述辅助细胞是有活力的。
75.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述胞外效应是通过所述一种或多种效应细胞或其亚群的酶的中和。
76.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述胞外效应是一细胞因子信号传导过程的中和。
77.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述胞外效应是由所述一种或多种效应细胞分泌的一抗体的内化或一辅助颗粒的内化。
78.如权利要求41所述的方法，其中所述胞外效应是通过一种或多种所述读出细胞的一酶的表达，其中所述酶作用于所述多种辅助颗粒或其子群以形成一荧光信号。
79.如权利要求1-78中任一项所述的方法，其中如果所述细胞群内的一种或多种效应细胞在所述读出颗粒群或其亚群上表现出所述胞外效应，所述方法进一步包括回收所述细胞群或其一部分以获得一回收的细胞群。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述回收步骤包含用一微型毛细管刺穿所述含有所述细胞群的微流体小室，所述细胞群含有所述一种或多种在所述读出颗粒群或其亚群上表现出所述胞外效应的细胞，并吸取所述小室的内含物或其一部分以获得一回收的吸取细胞群。
81.如权利要求79所述的方法，其中所述回收步骤包含选择定地处理所述微型反应器并冲洗所述微型反应器的内含物进入到一端口，所述微型反应器包含所述表现出所述胞外效应的细胞群。
82.如权利要求79所述的方法，其中所说微型毛细管具有约5微米到约200微米的直径。
83.如权利要求80或82所述的方法，其中所述微型毛细管具有一具有斜面的尖头。
84.如权利要求80和82-83中任一项所述的方法，其中所述微型毛细管具有一椭圆形、正方形或圆形的横断面。
85.如权利要求80和82-84中任一项所述的方法，其中所述微型毛细管被架载到一显微镜上的一机器人微操作系统上。
86.如权利要求80和82-85中任一项所述的方法，其中所述微型毛细管由机器人控制。
87.如权利要求80和82-86中任一项所述的方法，其中所述微型毛细管具有一单管体、一双管体、一三管体或超过三个管体。
88.如权利要求80和82-87中任一项所述的方法，还包含在一个微流控装置的独立的小室中保留起源自所述回收的细胞群的多个细胞亚群，其中每间所述独立的小室含有一包含一种或多种读出颗粒的读出颗粒群，
在所述小室内孵育所述单个的细胞亚群和所述读出颗粒群，并且
检测所述单个的细胞亚群是否存在第二胞外效应，其中所述读出颗粒群或其一亚群提供所述第二胞外效应的一读出结果，并且所述第二胞外效应与在所述回收的细胞群上测量到的胞外效应是同样的胞外效应或不同的胞外效应，
基于所述检测步骤的结果从所述多个细胞亚群中鉴定一包含一种或多种表现出所述第二胞外效应的细胞的细胞亚群。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述多个细胞亚群中的所述细胞亚群平均含有从约1个细胞到约25个细胞。
90.如权利要求89所述的方法，其中所述多个细胞亚群中的所述细胞亚群平均含有从约1个到约3个细胞或从约1个到约5个细胞。
91.如权利要求88所述的方法，其中所述保留步骤包括
用所述微型毛细管注射所述回收的吸取细胞群到一微流控装置中，其中所述微型毛细管刺穿所述微流控装置的一面壁，
施加压力使回收的吸取细胞群流进所述微流控装置的独立小室中，并且
撤回所述微型毛细管致使所述结构的壁基本上重新封闭所述微流控装置的壁。
92.如权利要求79-87中任一项所述的方法，还包括
在多个容器中保留多个起源自所述回收的细胞群的细胞亚群，其中每个细胞亚群存在于一单个的容器中，
裂解所述单个的细胞亚群以提供裂解的细胞亚群，并且
扩增每个所述裂解的细胞群中的一种或多种核酸。
93.如权利要求92所述的方法，其中所述扩增步骤包含聚合酶链式反应(PCR)、5’快速cDNA末端扩增(RACE)、体外转录或全转录组扩增(WTA)。
94.如权利要求93所述的方法，其中所述PCR是逆转录酶(RT)-PCR或简并寡核苷酸启始的PCR。
95.如权利要求90-92中任一项所述的方法，其中扩增包含扩增一个或多个抗体基因或一个或多个受体基因。
96.如权利要求88-95中任一项所述的方法，其中所述第二胞外效应是一效应细胞或其分泌的蛋白与一读出颗粒之间的一结合相互作用、存在于一读出细胞上的一细胞表面受体的拮抗、存在于一读出细胞上的一细胞表面受体的激活、一ABC转运蛋白的拮抗、一ABC转运蛋白的激活、一离子通道的拮抗、一离子通道的激活、由所述效应细胞诱导的一种读出细胞的细胞裂解、由所述效应细胞诱导的所述读出细胞的细胞凋亡、所述读出细胞的细胞坏死、一抗体的内化、一辅助颗粒的内化、通过所述效应细胞的酶的中和、一可溶的信号传导分子的中和或其组合。
97.如权利要求96所述的方法，其中所述可溶的信号传导分子是一细胞因子。
98.如权利要求88-97中任一项所述的方法，其中如果一细胞亚群内的一种或多种细胞在所述读出颗粒群或其亚群上表现出所述第二胞外效应，回收所述细胞亚群或其一部分以获得一回收的细胞亚群。
99.如权利要求98所述的方法，还包括
在一微流控装置的独立的小室中保留起源自所述回收的细胞亚群的多个细胞亚群，其中每间所述独立的小室包含一包含一个或多个读出颗粒的读出颗粒群，
在所述小室内孵育所述单个的细胞亚群和所述读出颗粒群，并且
检测所述单个的细胞亚群是否存在第三胞外效应，其中所述读出颗粒群或其一亚群提供所述第三胞外效应的一种读出结果，
基于所述检测步骤的结果从所述多个细胞亚群中鉴定一包含一种或多种表现出所述第三胞外效应的细胞的细胞亚群。
100.如权利要求98所述的方法，还包括，
在多个容器中保留起源自所述回收的细胞亚群中的多个细胞亚群，其中每个细胞亚群处于一单个的容器中，
裂解所述细胞亚群以提供裂解的细胞亚群，并且
扩增每个所述裂解的细胞亚群内的一种或多种核酸。
101.如权利要求99所述的方法，其中所述第三胞外效应是一种效应细胞或其分泌的蛋白与一种读出颗粒之间的结合相互作用、存在于一种读出细胞表面的一细胞表面受体的拮抗、存在于一读出细胞表面的一细胞表面受体的激活、一ABC转运蛋白的拮抗、一ABC转运蛋白的激活、一离子通道的拮抗、一离子通道的激活、由所述效应细胞诱导的一读出细胞的细胞裂解、由所述效应细胞诱导的所述读出细胞的细胞凋亡、所述读出细胞的细胞坏死、一抗体的内化、一辅助颗粒的内化、通过所述效应细胞的酶的中和、一可溶的信号传导分子的中和或其组合。
102.如权利要求99或101所述的方法，其中如果一细胞亚群内的一个或多个细胞在所述读出颗粒群或其亚群上表现出所述第三胞外效应，回收所述细胞亚群或其一部分以获取一回收的细胞亚群。
103.如权利要求102所述的方法，还包括，
在多个容器中保留起源自所述回收的细胞亚群中的多个细胞亚群，其中每个细胞亚群处于一单个的容器中，
裂解所述细胞亚群以提供裂解的细胞亚群，并且
扩增每个所述裂解的细胞亚群内的一种或多种核酸。
104.如权利要求103所述的方法，其中所述扩增步骤包括聚合酶链式反应(PCR)、cDNA
5’端快速扩增(RACE)、体外转录或全转录组扩增(WTA)。
105.如权利要求104，其中所述PCR是逆转录(RT)-PCR或简并寡核苷酸启始的PCR。
106.如权利要求103-105中任一项所述的方法，其中扩增包含一个或多个抗体基因的扩增。
107.如权利要求102所述的方法，其中所述回收步骤包含用一微型毛细管刺穿所述含有所述细胞群的微流体小室，所述细胞群含有所述一种或多种在所述读出颗粒群或其亚群上表现出所述第三胞外效应的细胞，并吸取所述小室的内含物或其一部分以获得一个回收的吸取细胞群。
108.如权利要求99所述的方法，其中所述单个的细胞群具有的平均细胞数为从约1个到约10个细胞。
109.如权利要求99所述的方法，还包括将所述单个的细胞亚群和所述读出颗粒群与多个辅助颗粒一起孵育。
110.一种鉴定在一胞外效应上展示出变化的一细胞群的方法，包括
在独立的微流体小室中保留多个单个的细胞群，其中所述单个的细胞群中的至少一个含有一种或多种效应细胞，且所述独立的微流体小室的内含物还包含一个含有一种或多种读出颗粒的读出颗粒群，
在所述微流体小室内孵育所述单个的细胞群和所述一种或多种读出颗粒，
检测所述单个的细胞群是否具有所述胞外效应，其中所述读出颗粒群或其亚群提供所述胞外效应的一种读出结果，
基于所述检测结果从所述多个细胞群中鉴定到一个与所述多个细胞群中剩余的细胞群相比在所述胞外效应上表现出变化的细胞群。
111.如权利要求110所述的方法，其中所述一种或多种效应细胞包含一种抗体分泌细胞(ASC)。
112.如权利要求110或111所述的方法，其中所述一种或多种效应细胞含有一浆细胞、B细胞、浆母细胞、通过记忆B细胞扩增产生的一细胞、一杂交瘤细胞、一种T细胞、CD8+T细胞，与CD4+T细胞、一经过工程化的产生抗体的重组细胞、一经过工程化的表达一T细胞受体的重组细胞，或其组合。
113.如权利要求110-112中任一项所述的方法，其中所述细胞群包含从约2个到约500个细胞。
114.如权利要求113所述的方法，其中所述细胞群含有从约10个到约50个细胞。
115.如权利要求114所述的方法，其中所述细胞群含有从约2个到约10个细胞。
116.如权利要求110-115中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群含有一读出小珠或一读出细胞。
117.如权利要求110-115中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群包含一蛋白或肽。
118.如权利要求110-115中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒含有一信号传导分子、脂、碳水化合物、代谢产物、病毒颗粒、一细胞因子、趋化因子、神经递质、生长因子、激素、膜提取物、脂颗粒、固化的受体、一种受体的胞外结构域、一用膜提取物功能化的囊泡、一用膜提取物功能化的小珠、一经过工程化作为可溶性蛋白稳定存在的G蛋白偶联受体(GPCR)或其组合。
119.如权利要求110-118中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群中所述一种或多种读出颗粒的平均直径小于500纳米，或从约500纳米到约50微米。
120.如权利要求119所述的方法，其中所述读出颗粒群的所述一种或多种读出颗粒的平均直径为从约1微米到约10微米。
121.如权利要求110-120中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群或其亚群被固定于所述微流体小室的一表面上。
122.如权利要求110-120中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群含有一种或多种在其表面表达一种ATP结合框转运蛋白(ABC转运蛋白)的读出细胞，且所述胞外效应是所述ABC转运蛋白的拮抗、所述ABC转运蛋白的激活，或所述ABC转运蛋白被所述一种或多种效应细胞中的一种结合，或被所述一种或多种效应细胞中的一种细胞分泌的一分子。
123.如权利要求110-121中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群含有一种或多种在其表面表达一G蛋白偶联受体(GPCR)或一可溶的GPCR的读出细胞，并且所述胞外效应是所述GPCR的拮抗、所述GPCR的激活或所述GPCR被所述一种或多种效应细胞中的一效应细胞结合，或所述一种或多种效应细胞中的一效应细胞分泌的一种分子。
124.如权利要求110-121中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群含有一种或多种在其表面表达一酪氨酸激酶受体(RTK)的读出细胞，并且所述胞外效应是所述RTK的拮抗、所述RTK的激活或所述GPCR被所述一种或多种效应细胞中的一效应细胞结合，或被所述一种或多种效应细胞中的一效应细胞分泌的一分子。
125.如权利要求110-121中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群含有一种或多种在其表面表达一种离子通道的读出细胞，并且所述胞外效应是所述离子通道的拮抗、所述离子通道的激活或所述离子通道被所述一种或多种效应细胞中的一效应细胞结合，或被所述一种或多种效应细胞中的一效应细胞分泌的一分子。
126.如权利要求110-121中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群含有一种或多种在其表面表达一具有内在的酶活性的受体的读出细胞，并且所述胞外效应是所述具有内在的酶活性的受体的拮抗、所述具有内在的酶活性的受体的激活或所述具有内在的酶活性的受体被所述一种或多种效应细胞中的一效应细胞结合，或被所述一种或多种效应细胞中的一效应细胞分泌的一分子。
127.如权利要求116或123所述的方法，其中所述G蛋白偶联受体是一趋化因子受体、一细胞因子受体、A类GPCR、B类GPCR、粘附GPCR、frizzled GPCR、乙酰胆碱受体、褪黑激素受体、melacortin受体、胃动素受体、溶血磷脂(LPA)受体、腺苷受体、肾上腺素受体、血管紧缩素受体、缓激肽受体、降血钙素受体、钙敏感受体、大麻受体、趋化因子受体、胆囊收缩素受体、补体组分(C5AR1)受体、促肾上腺皮质激素释放因子受体、多巴胺受体、内皮分化基因受体、内皮素受体、类甲酰肽受体、甘丙肽受体、胃泌素释放肽受体、受体饥饿激素受体、胃抑制性多肽受体、胰高血糖素受体、促性腺激素释放激素受体、组胺受体、kisspeptin(KiSS1)受体、白细胞三烯受体、黑色素浓缩激素受体、黑皮质素受体、褪黑激素受体、胃动素受体、神经肽受体、烟酸、类鸦片受体、食欲素受体、孤儿受体、血小板激活因子受体、前动力蛋白受体、催乳素释放肽、前列腺素类受体、蛋白酶激活受体、P2Y(嘌呤能)受体、松弛素受体、分泌素受体、5-羟色胺受体、生长激素抑制素受体、速激肽受体、血管加压素受体、后叶催产素受体、舒血管肠肽(VIP)受体或垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)受体、味觉1受体、代谢型谷氨酸受体、钙敏感受体、脑特异性血管形成抑制剂受体(1、2或3)、钙黏着蛋白受体或一雌激素受体。
128.如权利要求123或127所述的方法，其中所述GPCR是一细胞因子或趋化因子受体。
129.如权利要求124所述的方法，其中所述酪氨酸激酶受体(RTK)是ErbB-1、ErbB-2、ErbB-3、ErbB-4、胰岛素受体、血小板衍生生长因子α受体、血小板衍生生长因子β受体、肥大/干细胞生长因子受体(SCFR)、集落刺激因子1受体、CD135、成纤维细胞生长因子受体-1(CD331)、成纤维细胞生长因子受体-2(CD332)、成纤维细胞生长因子受体-3(CD333)、成纤维细胞生长因子受体-4(CD334)、成纤维细胞生长因子受体-6、血管内皮生长因子(VEGF)1受体、VEGF2受体、VEGF3受体、肝细胞生长因子受体、原肌球蛋白受体激酶(Trk)A、Trk B、Trk C、Ephrin(EPH)受体A1、EPH受体A2、EPH受体A3、EPH受体A4、EPH受体A5、EPH受体A6、EPH受体A7、EPH受体A8、EPH受体A9、EPH受体A10、EPH受体B1、EPH受体B2、EPH受体B3、EPH受体B4、EPH受体B5、EPH受体B6、AXL、第IX类RTK受体家族的一成员、间变性淋巴瘤/白细胞酪氨酸激酶(ALK/LTK)受体家族、第XI类RTK受体家族的一成员、神经营养因子酪氨酸激酶、受体相关1受体、盘状结构域受体、第XIV类RTK受体家族的一成员、第XV类RTK受体家族的一成员、第XVI类RTK受体家族的一成员或一肌肉特异性激酶受体。
130.如权利要求125所述的方法，其中所述离子通道是一GABAA受体、一甘氨酸受体(GlyR)、一5-羟色胺受体、烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)、锌激活离子通道、离子型谷氨酸受体、AMPA受体、钾盐镁矾受体、NMDA受体或一种ATP门控通道。
131.如权利要求126所述的方法，其中所述具有内在的酶活性的受体是一受体酪氨酸激酶(RTK)、受体丝氨酸-苏氨酸激酶、受体酪氨酸磷酸酶或一受体鸟苷酰环化酶。
132.如权利要求127或128所述的方法，其中所述细胞因子受体是以下细胞因子的受体：(IL)-1α、IL-1β、IL-1RA、IL18、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白血病抑制因子、制瘤素M、干扰素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、CD154、淋巴毒素β(LTB)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF-β、转化生长因子(TGF)-β、促红细胞生成素、巨核细胞生长发育因子(MGDF)、Fms相关酪氨酸激酶3配体(Flt-
3L)、干细胞因子、集落刺激因子-1(CSF-1)、巨噬细胞刺激因子、4-1BB配体、诱导增殖配体(APRIL)、分化抗原簇70(CD70)、分化抗原簇153(CD153)、分化抗原簇178(CD178)、糖皮质激素诱导的TNF受体配体(GITRL)、CD258、OX40L、CD252、TALL-1、TNF相关诱导凋亡配体(TRAIL)、肿瘤坏死因子凋亡弱诱导分子(TWEAK)、TNF相关激活诱导细胞因子(TRANCE)或其组合。
133.如权利要求127或128所述的方法，其中所述趋化因子是一种白细胞介素-8受体、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCR11、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、XCR1(GPR5)或CX3CR1(fractalkine)。
134.如权利要求99所述的方法，其中所述读出颗粒群或其亚群用一抗原或表位功进行能化。
135.如权利要求110-121中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群或其亚群用一包括抗体结合部分的分子进行功能化。
136.如权利要求135所述的方法，其中所述包括一抗体结合部分的分子是蛋白A、蛋白A/G、蛋白G、一结合免疫球蛋白的单克隆抗体、一结合免疫球蛋白的单克隆抗体片段、一结合免疫球蛋白的多克隆抗体、一结合免疫球蛋白的多克隆抗体片段，或其组合。
137.如权利要求110-136中任一项所述的方法，还包括在所述独立的微流体小室内将所述单个的细胞群与所述读出颗粒群与多种辅助颗粒孵育。
138.如权利要求110-137中任一项所述的方法，其中所述胞外效应是由所述一种或多种效应细胞或其子群分泌的一分子与所述读出颗粒群或其亚群之间的结合相互作用。
139.如权利要求138所述的方法，其中所述结合相互作用是一抗原-抗体结合特异性相互作用、抗原-抗体结合亲和性相互作用或抗原-抗体结合动力学相互作用，其中所述抗体是由所述效应细胞或其群或亚群分泌的一分子。
140.如权利要求110-137中任一项所述的方法，其中所述胞外效应是凋亡的调节、细胞增殖的调节、一读出颗粒形态外表的改变、一读出颗粒内一蛋白定位的改变、由一读出颗粒表达一种蛋白、一辅助颗粒的中和或其组合。
141.如权利要求110-140中任一项所述的方法，还包括在基本上一单个平面上维持一个或多个所述细胞群。
142.如权利要求110-141中任一项所述的方法，还包括在基本上一单个平面上维持所述读出颗粒群。
143.如权利要求110-142中任一项所述的方法，其中所述孵育步骤还包括在含有所述细胞群的所述微流体小室中交换培养基。
144.如权利要求110-143中任一项所述的方法，其中所述孵育步骤是30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、1周、至少约30分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约4小时、至少约6小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约36小时、至少约48小时、至少约60小时、至少约72小时、至少约84小时、至少约96小时或至少约1周。
145.如权利要求110-143中任一项所述的方法，其中所述一种或多种效应细胞，或其子群在所述孵育步骤中分裂。
146.如权利要求110-145中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群或其子群在所述孵育步骤中分裂。
147.如权利要求146所述的方法，其中至少70％的所述读出细胞具有活力。
148.如权利要求137所述的方法，其中所述多种辅助颗粒是多种辅助细胞。
149.如权利要求148所述的方法，其中所述辅助细胞或其子群在所述孵育步骤中分裂。
150.如权利要求149所述的方法，其中70％的所述辅助细胞具有活力。
151.如权利要求137所述的方法，其中所述多种辅助颗粒包含一蛋白、肽、生长因子、细胞因子、神经递质、脂、磷脂、氨基酸、一元胺、糖蛋白、激素、碳水化合物、病毒颗粒、荧光染料、酶底物或其组合。
152.如权利要求137或151所述的方法，其中所述多种辅助颗粒包含多种细胞因子。
153.如权利要求152所述的方法，其中所述多种细胞因子是一群同质性的细胞因子群。
154.如权利要求152所述的方法，其中所述多种细胞因子是一群异质性的细胞因子群。
155.如权利要求153所述的方法，其中所述同质性的细胞因子群包含(IL)-1α、IL-1β、IL-1RA、IL18、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白血病抑制因子、制瘤素M、干扰素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、CD154、淋巴毒素β(LTB)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF-β、转化生长因子(TGF)-β、促红细胞生成素、巨核细胞生长发育因子(MGDF)、Fms相关酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)、干细胞因子、集落刺激因子-1(CSF-1)、巨噬细胞刺激因子、4-1BB配体、诱导增殖配体(APRIL)、分化抗原簇70(CD70)、分化抗原簇153(CD153)、分化抗原簇178(CD178)、糖皮质激素诱导的TNF受体配体(GITRL)、CD258、OX40L、CD252、TALL-1、TNF相关诱导凋亡配体(TRAIL)、肿瘤坏死因子凋亡弱诱导分子(TWEAK)或TNF相关激活诱导细胞因子(TRANCE)。
156.如权利要求154所述的方法，其中所述异质性的细胞因子群包含(IL)-1α、IL-1β、IL-1RA、IL18、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白血病抑制因子、制瘤素M、干扰素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、CD154、淋巴毒素β(LTB)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF-β、转化生长因子(TGF)-β、促红细胞生成素、巨核细胞生长发育因子(MGDF)、Fms相关酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)、干细胞因子、集落刺激因子-1(CSF-1)、巨噬细胞刺激因子、4-1BB配体、诱导增殖配体(APRIL)、分化抗原簇70(CD70)、分化抗原簇153(CD153)、分化抗原簇178(CD178)、糖皮质激素诱导的TNF受体配体(GITRL)、CD258、OX40L、CD252、TALL-1、TNF相关诱导凋亡配体(TRAIL)、肿瘤坏死因子凋亡弱诱导分子(TWEAK)、TNF相关激活诱导细胞因子(TRANCE)或其组合。
157.如权利要求148所述的方法，其中所述多种辅助细胞包括成纤维细胞、自然杀伤(NK)细胞、杀伤T细胞、抗原提呈细胞、树突状细胞、重组细胞或其组合。
158.如权利要求137所述的方法，其中所述多种辅助颗粒是多种补体通路诱导因子。
159.如权利要求110-158所述的方法，还包括将所述含有所述细胞群的微流体小室与其周围环境基本隔离。
160.如权利要求123-133所述的方法，其中所述胞外效应是所述细胞表面受体或离子通道的拮抗。
161.如权利要求123-133所述的方法，其中所述胞外效应是所述细胞表面受体或离子通道的激活。
162.如权利要求161所述的方法，其中所述细胞表面受体是一GPCR，并且激活由胞内cAMP或钙的增加、一报告蛋白的表达的增加或一蛋白的定位的增加来测量。
163.如权利要求160所述的方法，其中所述细胞表面受体是一GPCR，且拮抗由胞内cAMP或钙的减少、一报告蛋白表达的减少或一蛋白的定位的减少来测量。
164.如权利要求116所述的方法，其中所述胞外效应是由所述效应细胞诱导的所述读出细胞的细胞裂解。
165.如权利要求110-122中任一项所述的方法，其中所述读出颗粒群含有一读出细胞，且所述胞外效应是所述一种或多种效应细胞中的一效应细胞诱导的一读出细胞的细胞凋亡或细胞坏死。
166.如权利要求110-122中任一项所述的方法，其中所述胞外效应是由所述一种或多种效应细胞中的一效应细胞介导的酶的中和。
168.如权利要求110-122中任一项所述的方法，其中所述胞外效应是一细胞因子信号传导过程的中和。
169.如权利要求110-122中任一项所述的方法，其中所述胞外效应是一读出颗粒底物的切割。
170.如权利要求110-169中任一项所述的方法，其中如果一个或多个细胞群在所述胞外效应上表现出所述变化，所述方法还包括回收所述一个或多个细胞群或其一部分以获得一个或多个回收的细胞群。
171.如权利要求170所述的方法，其中所述回收步骤包括用一微型毛细管刺穿所述含有所述一个或多个在所述胞外效应上表现出变化的细胞群的一间或多间微流体小室并吸取所述一间或多间微流体小室的小室内含物或其一部分以获得一个或多个吸取的细胞群。
172.如权利要求171所述的方法，其中所述微型毛细管的直径为约5微米到约200微米。
173.如权利要求171或172所述的方法，其中所述微型毛细管具有一具有斜面的尖头。
174.如权利要求171-173中任一项所述的方法，其中所述微型毛细管具有一椭圆形、正方形或圆形的横断面。
175.如权利要求171-174中任一项所述的方法，其中所述微型毛细管被架载到一显微镜上的一机器人微操作系统上。
176.如权利要求171-175中任一项所述的方法，其中所述微型毛细管由机器人控制。
177.如权利要求171-176中任一项所述的方法，其中所述微型毛细管具有一单管体、一双管体、一三管体或超过三个管体。
178.如权利要求170-177中任一项所述的方法，还包括在一个微流控装置的独立的小室中保留多个起源自所述一个或多个回收的细胞群的多个细胞亚群，其中每间所述独立的小室含有一包含一种或多种读出颗粒的读出颗粒群，
在所述小室内孵育所述单个的细胞亚群和所述读出颗粒群，且
检测所述单个的细胞亚群是否具有第二胞外效应上的变化，其中所述读出颗粒群或其亚群提供所述第二胞外效应的一读出结果，且所述第二胞外效应与在所述回收的细胞群上测量的胞外效应是同样的胞外效应或不同的胞外效应，
基于所述检测步骤的结果从所述多个细胞亚群中鉴定出一个或多个在所述第二胞外效应上表现出变化的细胞亚群。
179.如权利要求178所述的方法，其中所述多个细胞亚群平均含有从约1个细胞到约25个细胞。
180.如权利要求178所述的方法，其中所述多个细胞亚群平均含有从约1个细胞到约15个细胞。
181.如权利要求179或180所述的方法，其中所述多个细胞亚群平均含有约1个细胞。
182.如权利要求178所述的方法，其中所述保留步骤包括
用所述微型毛细管将所述被回收的吸取细胞群注射到一微流控装置中，其中所述微型毛细管穿透所述微流控装置的一面壁，
施加压力使所述被回收的吸取细胞群流入所述微流控装置的独立的小室中，且
撤回所述微型毛细管致使所述结构的壁基本上重新封闭所述微流控装置的壁。
183.如权利要求170-177中任一项所述的方法，还包括，
在多个容器中保留起源自所述一个或多个回收的细胞群中的多个细胞亚群，其中每个细胞亚群存在于一单个的容器中，
裂解所述细胞亚群以提供裂解的小亚群，且
扩增在每个所述裂解的细胞亚群内的一种或多种核酸。
184.如权利要求183所述的方法，其中所述扩增步骤包括聚合酶链式反应(PCR)、5’cDNA末端快速扩增(RACE)、体外转录或全转录组扩增(WTA)。
185.如权利要求184所述的方法，其中所述PCR是逆转录酶(RT)-PCR或简并寡核苷酸启始的PCR。
186.如权利要求183-185中任一项所述的方法，其中扩增包括一个或多个抗体基因的扩增。
187.如权利要求178-182中任一项所述的方法，其中所述第二胞外效应是一效应细胞或其产物与一读出颗粒之间的结合相互作用、一读出细胞上存在的一过表达的细胞表面受体的拮抗、一读出细胞上存在的一过表达的细胞表面受体的激活、由所述效应细胞诱导的一读出细胞的细胞裂解、由所述效应细胞诱导的所述读出细胞的细胞凋亡、由所述效应细胞诱导的所述读出细胞的细胞坏死、由所述效应细胞诱导的病毒的中和、由所述效应细胞诱导的酶的中和或一细胞因子信号传导过程。
188.如权利要求178-182和187中任一项所述的方法，其中如果一细胞亚群内的一个或多个细胞在所述读出颗粒上表现出所述第二胞外效应，回收所述细胞亚群或其一部分以获取一回收的细胞亚群。
189.如权利要求188所述的方法，还包括
在一微流控装置的独立的小室中保留多个起源自所述回收的细胞亚群的细胞亚群，其中每间独立的小室含有一包含一个或多个读出颗粒的读出颗粒群，
在所述小室内孵育所述单个的细胞亚群和所述读出颗粒群，且
检测所述单个的细胞亚群是否具有第三胞外效应，其中所述读出颗粒群或其亚群提供一所述第三胞外效应的读出结果，
基于所述检测步骤的结果，测定在一个或多个所述亚群中的细胞在所述一个或多个读出颗粒或其子群上表现出所述第三胞外效应。
190.如权利要求188所述的方法，还包括
在多个容器中保留起源自所述回收的细胞亚群的多个细胞亚群，其中每个细胞亚群存在于一单个的容器中，
裂解所述细胞亚群以提供裂解的细胞亚群，且
扩增在每个所述裂解的细胞亚群内的一种或多种核酸。
191.一种从一包括一种或多种表现出胞外效应的效应细胞的起始细胞群富集表现出一种胞外效应的效应细胞的方法，所述方法包括
在多间微流体小室中保留所述起始群以或取多个细胞亚群，
其中每间小室的效应细胞的平均数大于Y，并且其中所述群中的细胞总数大于X，其中在所述群中的效应细胞所占的一期望份数为1/X，
检测在所述微流体小室中的所述细胞亚群以鉴定出一间或多间包含一个或多个表现出所述胞外效应的效应细胞的小室；且
鉴定一间或多间含有一个或多个表现出所述胞外效应的效应细胞的小室，
从一间或多间被鉴定的小室中回收所述细胞亚群或其一部分以提供一个富集了所述效应细胞的富集细胞群，
其中所述富集了所述效应细胞的富集细胞群所具有的效应细胞的份数为1/Y。
192.如权利要求191所述的方法，其中1/X小于0.05。
193.如权利要求191所述的方法，其中1/X小于0.01。
194.如权利要求191所述的方法，其中1/X小于0.001。
195.如权利要求191或192所述的方法，其中所述胞外效应是结合到一所关注的抗原的一抗体的表达。
196.如权利要求195所述的方法，其中所述起始细胞群是分离自一已经经过免疫或暴露于所述抗原的动物的周边血单核细胞(PBMCs)。
197.如权利要求195所述的方法，其中所述起始细胞群是分离自一已经经过免疫或暴露于所述抗原的动物的B细胞。
198.如权利要求196或197所述的方法，其中所述起始细胞群的来源是已经经过免疫或暴露于所述抗原的动物的全血。
199.如权利要求196-198中任一项所述的方法，其中所述动物是一脊椎动物。
200.如权利要求196-198中任一项所述的方法，其中所述动物是小鼠、兔、绵羊、山羊、美洲驼、大鼠、灵长目动物、犬科动物、猫科动物或鲨鱼。
201.如权利要求196-199中任一项所述的方法，其中所述动物是人。
202.如权利要求1-78中任一项所述的方法，其中所述细胞群起源自从一经过免疫的动物中收集到的一起始细胞群。
203.如权利要求1-78中任一项所述的方法，其中所述细胞群起源自从一未经过免疫的动物中收集到的一起始细胞群。
204.如权利要求202或203所述的方法，其中所述动物是人。
205.如权利要求203或204所述的方法，其中所述起始细胞群包含一种或多种分泌一自身抗体的效应细胞。
206.如权利要求110-169中任一项所述的方法，其中所述多个单个的细胞群起源自从一经过免疫的动物中收集到的一起始细胞群。
207.如权利要求110-169中任一项所述的方法，其中所述多个单个的细胞群起源自从一未经过免疫的动物中收集到的一起始细胞群。
208.如权利要求206或207所述的方法，其中所述动物是人。
209.如权利要求207或208所述的方法，其中所述起始细胞群包含一种或多种分泌一自身抗体的效应细胞。
210.如权利要求9和14-32中任一项所述的方法，其中所述读出细胞是活的或固定的。
211.如权利要求210所述的方法，其中所述胞外效应是一结合相互作用且在所述读出细胞的一胞外蛋白上进行测量。
212.如权利要求210所述的方法，其中所述读出细胞是固定的，所述胞外效应是一结合相互作用且在所述读出细胞的一胞内蛋白上进行测量。
213.如权利要求116和122-133中任一项所述的方法，其中所述读出细胞是活的或固定的。
214.如权利要求213所述的方法，其中所述胞外效应是一结合相互作用且在所述读出细胞的一胞外蛋白上进行测量。
215.如权利要求213所述的方法，其中所述读出细胞是固定的，所述胞外效应是一结合相互作用且在所述读出细胞的一胞内蛋白上进行测量。
216.由此处所述的方法之一鉴定到的一效应细胞。
217.如权利要求216所述的效应细胞，其中所述效应细胞是一抗体分泌细胞。
218.由如权利要求217所述的效应细胞分泌的一单克隆抗体。
微流控装置及其在多细胞分泌检测中的使用方法
[0001] 相关申请的互相参考
[0002] 本申请要求序列号为61/806329、申请日期为2013年3月28号的美国临时申请的优先权，其全部公开内容纳入本申请就各种目的作参考。
[0003] 发明背景
[0004] 细胞是生命的基本单元。没有两个细胞是完全相同的。例如，基因型、表型和/或形态学特性都可以对细胞异质性产生贡献。也确实发现“表面看似完全相同”的无性细胞群中的细胞之间表现出表型差异。细胞差异存在于生命的各个水平中，从细菌细胞到部分分化的细胞(例如，成体干细胞和祖细胞)再到高度分化的哺乳动物细胞(例如免疫细胞)。细胞状态、功能和应答的差异可以产生自多种机制，包括不同的生活史、不同的分化状态、表观变化、细胞周期效应、随机变化、基因组序列差异、基因表达、蛋白表达和相异的细胞相互作用效应。
[0005] 传统的批量细胞分析包括测量蛋白质和RNA的表达，是通过对大量的细胞取平均值来操作的。典型地，单次检测的细胞数大于1000。这种对细胞群取平均值的做法掩盖了存在于一细胞群中的异质性并模糊了细胞群中单个细胞背后的生物学特征。已经有众多实例表明这种平均的测量是不合适的。例如，测量一细胞群中的细胞进程可能会被单个细胞的应答所干扰，这些应答可能是异步的，因此使所述进程的动力学变得模糊。例如，显性的但表型上不同的细胞亚群的存在可以导致对细胞群的测量结果几乎不能反映群中大部分细胞的内部状态。参见例如Altschuler and Wu.(2010)Cell 141,pp.559-563。
[0006] 现有的分离独特类型细胞群的方法常常受限于所述群能达到的纯度。例如，富集的原代多能干细胞群极少能达到超过50％的功能性纯度，纯度常远 低于10％，因此这些细胞的分子识别特征被大量的，并且通常是占绝对多数的来自其他细胞类型的污染所掩盖。许多类型的细胞通过直接接触与分泌因子相互作用，以促进存活、死亡、分化或某些其他功能，且这些相互作用难以分离并难以在包含有大量细胞的一混合体系中进行研究。此外，细胞在基因组序列和/或细胞状态上可能会具有差异，导致表达的mRNA或蛋白质的水平或类型不同。如果对一大群细胞进行分析，具有独特细胞状态的或具有表达所关注的mRNA或蛋白质的特别的细胞，尽管在产业用途上具有较高的价值，要从所述群中分离会非常困难或不可能。
[0007] 为了克服批量细胞群分析的缺陷，已经开发出了单细胞检测平台。例如，微流控装置在过去就已经被用于研究单细胞(Lecault等人(2012).Curr.Opin.Chem.Biol.16,pp.381-390)。Ma等人(Nat Med,17,pp.738-743(2011))将一单细胞条形码芯片应用于同时测量来源于人巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的多种细胞因子(例如IL-10，TNF-β，IFN-γ)，所述巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞获取自健康捐赠者与一转移性黑素瘤病人。微型室阵列也已被用于筛选并选择来自免疫后的人和小鼠的分泌B细胞的抗原特异性抗体(Story等人(2009).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105,pp.17902-17907；Jin等人(2009).Nat.Med.15,pp.1088-1092)。在这种方法中，单个的B细胞在包括有成千上万个微孔(～
10-100μm深)的表面上被排成阵列，所述孔表面通过具有捕获作用的抗体功能化。细胞在孔表面孵育不到3小时后，所述表面用荧光标记的抗原洗涤并扫描以鉴定抗原特异性B细胞。
然后手工从阵列中用微毛细管回收这些细胞以扩增、测序和克隆这些细胞中的抗体编码基因。
10-100μm深)的表面上被排成阵列，所述孔表面通过具有捕获作用的抗体功能化。细胞在孔表面孵育不到3小时后，所述表面用荧光标记的抗原洗涤并扫描以鉴定抗原特异性B细胞。
然后手工从阵列中用微毛细管回收这些细胞以扩增、测序和克隆这些细胞中的抗体编码基因。
[0008] 两相微流控装置也已经被应用于分析单个免疫细胞分泌的蛋白，通过将免疫细胞封装于亚纳升的水滴中被油流分开(Konry等人(2011).Biosens.Bioelectron.26,pp.2702-2710)。这些小滴可以通过一种类似于FACS的流动穿过形式进行分析，这样就提供了一种超高通量探测单细胞分泌蛋白的机会。油包水乳液通过将细胞共封装于微流体产生的琼脂糖珠中也已经被用于研 究细胞旁分泌信号传递(Tumarkin等人(2011)
.Integr.Biol.3,pp.653-662)。微流体小滴的产生由于使封装的单个细胞在暴露于不同组合物时的活性分析成为可能，还已经被用于药物筛选和开发(Brouzes等人(2009)
.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106,pp.14195-14200)。
.Integr.Biol.3,pp.653-662)。微流体小滴的产生由于使封装的单个细胞在暴露于不同组合物时的活性分析成为可能，还已经被用于药物筛选和开发(Brouzes等人(2009)
.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106,pp.14195-14200)。
[0009] 抗体是通过人或动物的免疫系统所天然产生的抵御感染和疾病的分子。这是通过免疫系统能够产生种类众多的抗体这一独特的能力来实现的。每一种抗体都具有识别并结合特定靶标(例如蛋白质，病毒，细菌)的能力。这种无可比拟的特异性也是抗体成为极度有效和低副作用药物的原因，这些药物在临床上已经被批准用于治疗种类广泛的病症，包括癌症、自我免疫病症、炎症、神经病及感染。与传统小分子药物相比，抗体体现出几个优点，包括优异的药物动力学，更少的副作用，更佳的耐受性，以及在临床试验中高得多的成功率(27％对比小分子药物的7％)(Reichert(2009).Mabs 1,pp.387-389.)。正是由于这个原因，抗体到目前为止是增长最快的药物种类，其全球总市值2012年为500亿美元，并以每年9％的速率增长(Nelson等人(2010).Nat.Rev.Drug Disc.9(10),pp.767-774.)。
[0010] 发掘具有最佳治疗属性的抗体，尤其是靶向表面受体的抗体仍然是药物开发中的严重瓶颈。在免疫后的应答中，动物可以生产数以百万计的不同的单克隆抗体(mAb)。每种单克隆抗体由称为抗体分泌细胞(ASC)的单细胞产生，并且每种抗体分泌细胞仅生产一种类型的单克隆抗体。相应地，抗体分析，例如以药物发掘为目的的抗体分析，有助于单细胞分析。然而，即使对抗体分泌细胞进行个别分析，并且不在批量的细胞群中，由于一单个的抗体分泌细胞仅产生少量抗体，用常规的检测方式分析时抗体浓度太稀，使其完全不能被检测到。因此，需要有新的方法研究单个抗体分泌细胞及其分泌的抗体。本发明解决了这一问题及其他的需求。发明概要
[0011] 本发明提供了一种分析可归因于单个效应细胞的胞外效应的微流体平 台。所述效应细胞在一实施方案中为一分泌生物因子的细胞，例如，分泌一抗体(抗体分泌细胞)。在一进一步的实施方案中，所述效应细胞的微流体分析是对包含所述单个效应细胞的细胞群进行的胞外效应分析。
[0012] 一方面，本发明提供了一种鉴定包含一具有胞外效应的效应细胞的细胞群的方法。在一实施方案中，所述方法包括在一微型反应器中保留保留一包含一个或多个效应细胞的细胞群，其中所述微型反应器内还包括一个或多个读出颗粒的读出颗粒群，在所述微型反应器中孵育所述细胞群和所述一个或多个读出颗粒，检测所述细胞群是否有胞外效应存在，其中所述读出颗粒群或其亚群提供所述胞外效应的直接或间接读出结果，以及基于检测步骤的结果确定所述细胞群中是否有一个或多个效应细胞表现出胞外效应。在一进一步实施方案中，所述微型反应器为一微流体小室。在一更进一步实施方案中，所述微流体小室为一包括膜阀门的微流体结构的一部分。
[0013] 在这一方面，所述效应细胞为一分泌生物因子，如一抗体的细胞。在启始时即对所述特异效应细胞或具有特定胞外效应的效应细胞进行鉴定并非必需，只要在特定的微型反应器中检测到所述胞外效应的存在。即在测量所述效应的微型反应器内的部分或全部细胞如果需要作进一步阐明时可被回收，以鉴定所述提供所述胞外效应的特异细胞。
[0014] 在一实施方案中，如果测定一包含一个或多个效应细胞的细胞群表现出所述胞外效应，所述细胞群或其一部分进行回收以获取回收细胞群。回收，在一实施方案中，包括用微毛细管穿透所述包括含有一个或多个表现所述胞外效应的细胞的细胞群的微流体小室并吸取所述室中的内含物或其一部分以获取回收的吸取细胞群。
[0015] 在一实施方案中，如果测定一包含一个或多个效应细胞的细胞群表现出所述胞外效应，所述细胞群或其一部分进行回收以获取回收细胞群，所述回收细胞群被进一步作为细胞亚群进行分析。所述方法，在一实施方案中包括在一微流控装置的多个分隔的小室中保留保留多种源自所述回收细胞群的细胞亚群，其中每个所述分隔的小室包括含有一个或多个读出颗粒的一读出 颗粒群，在小室内孵育所述单个细胞亚群和所述读出颗粒群，以及检测所述单个亚群是否存在另一胞外效应。所述读出颗粒群或其亚群提供所述另一胞外效应的读出结果，并且所述另一胞外效应与测量所述回收细胞群得到的胞外效应为相同或不同的胞外效应。一旦所述细胞亚群经过孵育和检测，所述方法还进一步包括基于检测步骤的结果从所述多种细胞亚群中鉴定得到一细胞亚群，所述多个细胞亚群包含一个或多个在所述读出颗粒群或其亚群上表现出所述另一胞外效应的一个或多个细胞。
[0016] 在另一方面，本发明涉及一种鉴定在胞外效应上表现出变化的细胞群的方法。在一实施方案中，所述方法包括，在多间分隔的微流体小室中保留保留多个单个细胞群，其中所述单个细胞群中的至少一个包括一个或多个效应细胞，并且所述多间分隔的微流体小室还进一步包括一含有一个或多个读出颗粒的读出颗粒群，在所述微流体小室中孵育所述单个细胞群和所述读出颗粒群，检测所述单个细胞群是否存在所述胞外效应，其中所述读出颗粒群或其亚群提供所述胞外效应的读出结果。一旦所述细胞群被孵育并检测，所述方法包括基于所述检测结果从所述多个单个细胞群中鉴定得到一细胞群，其与所述多个单个细胞群中的一个或多个剩余细胞群相比在胞外效应上表现出变化。在一进一步实施方案中，所述一个或多个效应细胞包括一抗体分泌细胞。在另一实施方案中，所述一个或多个效应细胞包括一浆细胞、B细胞、浆母细胞、一产生于记忆B细胞扩增的细胞、一杂交瘤细胞、一T细胞、CD8+T细胞，以及CD4+T细胞、一工程化的用以产生抗体的重组细胞、一工程化的表达T细胞受体的重组细胞，或其组合。
[0017] 在一实施方案中，对一个或多个表现出所述胞外效应或胞外效应变化的细胞群进行回收以获取一个或多个回收细胞群。回收通过例如微毛细管进行。一旦鉴定并回收到一各或多个单个细胞群，所述一个或多个单个细胞群被进一步分析以确定对所述观察到的胞外效应负责的细胞。在一实施方案中，所述方法包括在微流控装置的分隔的小室中保留多个源自所述一个或多个回收细胞群的细胞亚群。每个所述分隔的小室包含一含有一个或多个读出颗粒 的读出颗粒群。所述单个细胞亚群与所述读出颗粒群在所述小室中孵育。检测所述单个细胞亚群是否存在另一胞外效应，其中所述读出颗粒群或其亚群提供所述另一胞外效应的读出结果。所述另一胞外效应与所述回收细胞群测得的胞外效应为相同或不同的胞外效应。基于所述另一胞外效应的检测，一个或多个在另一胞外效应上表现出变化的的细胞亚群得以鉴定。在一实施方案中，所述一个或多个单个细胞亚群随后被回收进行进一步分析。胞外效应在全文都有描述。
[0018] 在一实施方案中，来自一回收细胞群或回收细胞亚群的细胞被作为细胞亚群或亚-亚群被保留于多个容器中，并且每个细胞亚群或细胞亚-亚群存在于单个的容器中。所述单个亚群或亚-亚群被裂解以提供核酸并且对每个裂解的细胞亚群或裂解的细胞亚-亚群的一种或多种核酸进行扩增。在一进一步实施方案中，所述一种或多种核酸包括一抗体基因。
[0019] 在本发明所描述方法的一实施方案中，所述孵育步骤包括分别在所述包含所述单个细胞群或亚群的微型反应器(例如微流体小室)中交换培养基。进行培养基的交换是为了，例如，维持所述小室内细胞的活力或为了提供进行胞外效应检测的试剂，或为了连续进行多个胞外效应检测。
[0020] 在一实施方案中，孵育包括将所述细胞群或细胞亚群与多种辅助颗粒一起孵育。提供所述多种辅助颗粒是作为，例如检测所述胞外效应另外的试剂或用以维持细胞活力。
在一实施方案中，所述多种辅助颗粒包括1-磷酸-鞘氨醇、溶血磷脂酸、生长因子、细胞因子、趋化因子、神经递质、病毒颗粒、二抗、荧光颗粒、一荧光底物、一补体通路诱导因子、一病毒颗粒或一辅助细胞。所述辅助细胞，在一实施方案中，为一成纤维细胞、自然杀伤(NK)细胞、杀伤T细胞、抗原提呈细胞、树突状细胞、重组细胞或上述几项中的组合。
在一实施方案中，所述多种辅助颗粒包括1-磷酸-鞘氨醇、溶血磷脂酸、生长因子、细胞因子、趋化因子、神经递质、病毒颗粒、二抗、荧光颗粒、一荧光底物、一补体通路诱导因子、一病毒颗粒或一辅助细胞。所述辅助细胞，在一实施方案中，为一成纤维细胞、自然杀伤(NK)细胞、杀伤T细胞、抗原提呈细胞、树突状细胞、重组细胞或上述几项中的组合。
[0021] 在一实施方案中，通过本发明所描述的方法和设备所测量的所述胞外效应为一效应细胞或一效应细胞所分泌的蛋白结合至一细胞表面蛋白，与一读出细胞(一类读出颗粒)上的一细胞表面受体的拮抗或激动。在一进一步实 施方案中，所述细胞表面受体是受体酪氨酸激酶(RTK)、一G蛋白偶联受体(GPCR)、受体丝氨酸-苏氨酸激酶、受体酪氨酸磷酸酶或一受体鸟苷酸环化酶。所述GPCR不限于类别或种属。例如，所述GPCR，在一实施方案中，为本发明表3A或3B中所提供的一GPCR。
[0022] 在另一实施方案中，通过本发明所描述的方法和设备所测量的所述胞外效应为一效应细胞或一效应细胞所分泌的蛋白结合一离子通道、一离子通道的拮抗或激动。所述离子通道，在一实施方案中，为一GABAA、甘氨酸(GlyR)、5-羟色胺、烟碱乙酰胆碱(nAChR)、锌激活离子通道、离子型谷氨酸盐、AMPA、钾盐镁矾、NMDA受体或一ATP门控通道。
[0023] 当所述胞外效应是一细胞表面受体或离子通道的结合、激动或拮抗时，所述效应在一实施方案中通过以下指标得以检测：胞内cAMP或钙的增加、一报告蛋白的表达或一表达所述细胞表面受体或离子通道的读出细胞内的一蛋白的定位。
[0024] 所述胞外效应在另一实施方案中是一分泌自一种或多种效应细胞或其一部分的一分子结合到一种或多种读出颗粒或一种或多种辅助颗粒的相互作用、凋亡的调节、细胞增殖的调节、所述读出颗粒表面形态的改变、所述读出颗粒内一蛋白的定位的改变、所述读出颗粒一蛋白的表达、一辅助颗粒的中和可影响到所述读出颗粒或上述几项中的组合。
[0025] 在一些实施方案中，所述胞外效应为一分泌于一效应细胞的一细胞产物的效应。所述胞外效应为一产生自一效应细胞的一蛋白质与一读出颗粒或一辅助颗粒之间的结合相互作用。例如，所述效应细胞在一实施方案中是一抗体分泌细胞(ASC)，所述读出或辅助颗粒包括一表位或一抗原。所述结合相互作用，在一实施方案中，是对一种或多种抗原-抗体结合特异性、抗原-抗体结合亲和力与抗原-抗体结合动力学的测量。在另一实施方案中，所述效应细胞是一分泌一细胞因子的激活T细胞，并且所述读出颗粒包括一种或多种抗体用以捕获所述分泌的细胞因子。
[0026] 上述方法即设备可用于筛选或选择稀有的细胞，例如，在少于细胞群中 细胞1％的细胞，或约1％至约10％或约5％到约10％的所述被筛选或选择的细胞。
[0027] 在另一方面，本发明提供了可通过所述方法发现的功能抗体和受体。在本方面的一实施方案中，负责一胞外效应的一效应细胞的核酸被扩增并测序。所述核酸是一编码一分泌的生物分子(例如，抗体或其片段)的基因，或一编码一细胞受体或其片段的基因，例如一T细胞受体。所述抗体或其片段或细胞受体或其片段可以通过本领域已知的方法进行克隆和/或测序。
[0029] 图1是一种基于微流体多细胞检测的鉴定和选择单个的效应细胞的微流体方法的实施方案流程图。单个的细胞获取自任何动物并且可选地对一效应细胞进行富集。高通量的微流体分析被用于筛选在某些情况下存在于异质性细胞群体中的单个效应细胞分泌的抗体。一轮或多伦微流体分析后，回收细胞并扩增抗体可变区基因用于测序(Vh/VI)和克隆进细胞系。所述流程可在一天内筛选超过100,000个细胞，序列在一周后取得。
[0030] 图2是一种微流体效应细胞富集方法的实施方案流程图。效应细胞首先以25个细胞/室的平均浓度加载并赋予以形成多克隆抗体的混合体系。多克隆体系的筛选用于鉴定在一胞外效应(例如，结合，亲和力，或功能活性)中具有变化的小室。随后回收到四十个阳性小室以取得一富集的细胞群，群中具有4％的效应细胞生产所关注的抗体。然后对所述富集群的效应细胞在另一阵列中在有限的稀释度下进行分析以选取一单个的在所述胞外效应上具有变化的抗体分泌细胞。富集所需的时间为大约4小时，并且整个筛选通量为每次操作100,000。如果需要富集程序可进行两次，并且每次筛选可以利用相同或不同的属性。
[0031] 图3显示一种方法的俯视图和剖视图的示意图，所述方法根据本发明一实施方案鉴定一产生能够特异性结合一靶标读出颗粒的效应细胞的生物分子的效应细胞的存在。
[0032] 图4显示一种方法的俯视图和剖视图的示意图，所述方法鉴定至少一产生特异性结合恶性细胞但不结合正常细胞的生物分子的效应细胞的存在。
[0033] 图5显示一种方法的俯视图和剖视图的示意图，根据本发明一实施方案当效应细胞的一亚群也被赋予作为读出细胞的功能时，所述方法鉴定产生结合一读出细胞的生物分子的一效应细胞的存在。
[0034] 图6是一抗体四聚体的示意图。
[0035] 图7显示一种方法的俯视图和剖视图的示意图，根据本发明一实施方案所述方法筛选一被一已知生物分子结合的靶标表位/分子。
[0036] 图8显示一种方法的俯视图和剖视图的示意图，根据本发明一实施方案所述方法鉴定一产生一抗体的效应细胞的存在，所述抗体特异性结合一靶标表位/抗原。
[0037] 图9显示一细胞裂解分析定量方法的俯视图和剖视图的示意图。
[0038] 图10显示一种方法的俯视图和剖视图的示意图，根据本发明一实施方案所述方法鉴定产生一抗体的一效应细胞的存在，所述抗体特异性结合一靶标表位/抗原。
[0039] 图11显示一细胞裂解分析定量方法的俯视图和剖视图的示意图。
[0040] 图12显示一种方法的俯视图和剖视图的示意图，所述方法鉴定产生一生物分子的一效应细胞的存在，所述生物分子诱导读出细胞的生长。
[0041] 图13显示一种方法的俯视图和剖视图的示意图，所述方法鉴定产生一生物分子的一效应细胞的存在，所述生物分子刺激读出细胞发生凋亡。
[0042] 图14显示一种方法的俯视图和剖视图的示意图，所述方法鉴定产生一生物分子的一效应细胞的存在，所述生物分子刺激读出细胞的自我吞噬。
[0043] 图15显示一种方法的俯视图和剖视图的示意图，所述方法鉴定产生一生物分子的一效应细胞的存在，所述生物分子中和一所关注的细胞因子。
[0044] 图16显示一种方法的俯视图和剖视图的示意图，所述方法鉴定产生一生物分子的一效应细胞的存在，所述生物分子抑制病毒感染细胞的能力。
[0045] 图17显示一种方法的俯视图和剖视图的示意图，根据本发明一实施方 案所述方法鉴定产生一生物分子的一效应细胞的存在，所述生物分子抑制靶标酶的功能。
[0046] 图18显示一种方法的俯视图和剖视图的示意图，所述方法鉴定一效应细胞的存在，所述效应细胞表达一引发另一类效应细胞激活的分子，所述另一类效应细胞相应地分泌分子影响一读出颗粒。
[0047] 图19显示一种方法的俯视图和剖视图的示意图，所述方法鉴定一效应细胞的存在，所述效应细胞分泌一引发另一类效应细胞激活的分子，所述另一类效应细胞相应地分泌分子影响一读出颗粒。
[0048] 图20显示一种方法的俯视图和剖视图的示意图，所述方法从一异质性细胞群中检测到至少一分泌高亲和力抗体的细胞的存在，所述异质性细胞群包含分泌针对同样抗原但亲和力更低的抗体的细胞。
[0049] 图21显示一种方法的俯视图和剖视图的示意图，根据本发明一实施方案所述方法筛选针对一抗原的特异性增强的抗体，其中展示出不同表位的读出颗粒能够通过不同的光学特性区分。
[0050] 图22显示一种方法的俯视图和剖视图的示意图，所述方法同时在一同质性或异质性效应细胞群中鉴定分泌一生物分子的一细胞的存在并分析一种或多种受所述分子影响的胞内化合物。
[0051] 图23是一种方法的俯视图的示意图，所述方法同时在多套读出颗粒上评估一效应细胞的胞外效应。
[0052] 图24是人、兔、小鼠和大鼠的PDGFRα的胞外结构域的序列比对。(顶部)带状图显示两个PDGFRβ的胞外结构域(ECD)与一PDGFBB二聚体形成复合物的结构(引自Shim et al.(2010).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107,pp.11307-11312，此处全文引用)。请注意，给出的是PDGFRβ是因为虽然期望的是PDGFRα的类似结构但缺少这一结构。(底部)人、小鼠、兔和大鼠的PDGFRα的胞外结构域的序列比对。人源的同种异体的可变区用浅色的阴影和“*”标记。巨大的变化表明存在这众多可用于抗体识别的表位，其中兔与人相比的变化最大。
[0053] 图25提供的图像显示多层软光刻微流控芯片的各个层面。(A)一张用多层软光刻技术制作的阀门的光学显微照片。两条交叉的微型管道形成一阀结构，一条是活动液流的“流动管道”(垂直向)，一条是用于打开阀门的控制管道(水平向)。所述流动管道通过一层弹性薄膜与所述控制管道隔离，形成一“夹管阀”。对所述控制管道施压使所述膜发生偏斜，进而关闭了流动管道。(B)一整合了多个阀的装置的部件(填充有绿色和蓝色食品染料)。(C)制造于英属哥伦比亚大学的一装置的部件，其总共拥有16,000个阀、4000个小室和超过
3000个层-层相互连接(箭形符号)。(D)一微流控装置的实例，用硬币显示其尺寸。
3000个层-层相互连接(箭形符号)。(D)一微流控装置的实例，用硬币显示其尺寸。
[0054] 图26是本发明一种装置的示意图。(A)示意图显示用于从单一的抗体分泌细胞中筛选抗体的一微流控装置的结构。(B)4032个分析小室的阵列。每个小室在孵育时都被隔离并且培养基交换可在数分钟内完成。(C)一单个小室的放大图。细胞、读出颗粒与试剂依次注射，通过重力沉降。用自动化的明场/荧光显微镜进行成像。
[0055] 图27是在一装置制造的实施方案中各层的示意图。
[0056] 图28(A)可膨胀小室设计的俯视图和侧视图。小室为圆形，在顶部具有一更大的“边缘”，并被一凹形结构所覆盖，其被一层薄膜隔开。连接小室与流动管道的阀被密封，然后细胞向下加载到流动管道。(B)小室的阀门被打开，施加压力使小室膨胀，使细胞进入小室顶部。(C)关闭阀门密封小室，细胞落入小室底部。通道用新鲜培养基冲洗。(D)打开阀门释放压力，使小室放气回到原始的体积。这一过程的重复可用于交换培养基和/或添加可溶性因子。
[0057] 图29是根据本发明一实施方案的具有细胞栅栏的微流体小室的示意图，注释说明层流将颗粒引导到到所述入口通道一侧到细胞栅栏一侧的应用。
[0058] 图30是根据本发明一实施方案的一具有细胞栅栏的微流体小室的示意图，注释说明限制小室入口的上游以选择性地引导颗粒到所述入口通道一侧的应用。
[0060] 图32是根据本发明一实施方案的一具有细胞栅栏的微流体小室示意图，注释说明一基于颗粒大小选择性分离颗粒的细胞栅栏的应用。
[0061] 图33是一小室的实施方案的俯视图，在所述小室的下表面由一系列交叉的细胞栅栏形成一孔阵列划定多个效应区与读出区(小室的总体大小是300μm x 160μm)。
[0062] 图34是一小室的颗粒陷阱实施方案图(栅距2μm)，所述小室具有两个互相垂直的细胞栅栏，通过一大体上是圆形的部分连接，划定一颗粒陷阱。
[0063] 图35是根据本发明一实施方案的微流体小室示意图，注释位于出口处的微型结构截留所述小室中一定大小的颗粒的应用。
[0064] 图36是一微流体小室的侧视示意图，所述小室包括位于其底部的一端封闭的杯状结构。
[0065] 图37是根据本发明一实施方案的一小室侧视示意图，其中结构原件被排列在所述流动通道中以截留效应细胞和读出颗粒。
[0066] 图38是根据本发明一实施方案的一小室侧视示意图，其中结构原件在小室中按顺序排列根据大小来分隔并截留颗粒。
[0067] 图39是一微流体小室连续、流水线式的排列方式的俯视示意图，其中一多孔膜被用于将效应细胞与读出颗粒分隔开。
[0068] 图40是一微流体小室连续、流水线式的排列方式的俯视示意图，其中一层未功能化的小珠被用于将效应细胞与读出颗粒分隔开。
[0070] 图42是根据本发明一实施方案的一分离颗粒的方法，所述方法使用磁场引导一偶联磁性颗粒的颗粒定位于小室内而对没有偶联磁性颗粒的颗粒影响很小或没有影响。
[0071] 图43是一具有细胞栅栏的小室实施方案的剖视图，所述小室被倾斜从 而使读出颗粒(珠)更易装入所述读出区域中。
[0072] 图44是根据本发明一实施方案的一具有细胞栅栏的微流体小室的示意图，注释说明所述小室的旋转偏向性地引导颗粒到所述栅栏一侧的应用。
[0073] 图45是根据本发明一实施方案的一种方法的示意图，所述方法通过效应细胞和读出颗粒的密度差异将所述效应细胞和读出颗粒分开。
[0075] 图47显示根据本发明一实施方案一小室的俯视示意图，其中效应细胞和读取颗粒通过分别的入口被引进到所述小室中。
[0076] 图48是根据本发明一实施方案的一复合小室的俯视示意图，其中一效应区分室和一读出区分室所出的位置相互之间可通过流体来通信。
[0077] 图49是一分离效应细胞和读出颗粒的方法示意图，所述方法通过表面功能化将依赖于锚定的读出细胞限制在所述小室顶部的读出区，并通过重力将悬浮效应细胞限制在所述小室的底部。
[0078] 图50是一小室的俯视示意图，所述小室被功能化以维持贴壁仅在一边而悬浮细胞通过重力被隔离到相反的一边。
[0079] 图51是一小室的俯视示意图，所述小室被两类抗体所功能化，以隔离在其表面展示有不同种类抗体的颗粒。
[0080] 图52是一连续的、流水线式微流体小室排列方式的俯视示意图，其中每个小室通过一置于小室之间的阀与相邻小室隔开。
[0081] 图53是一连续的、流水线式微流体小室排列方式的俯视示意图，其中每个小室被一“盖子”结构与一所述小室与其相邻的小室共享的流动通道分离。
[0082] 图54与55是平行的、“流水线式”的微流体小室排列方式的俯视示意图，其中相邻小室可共享一共同的入口通道和出口总线通道。
[0083] 图56是一填充有一端封闭的结构的小室应用与微流体小室平行排列的俯视和侧视示意图。
[0084] 图57是填充有一端封闭的结构的小室平行排列的示意图，其可以提供复合小室的功能。
[0085] 图58是一用于细胞回收的微流体设备的图像以及细胞回收过程中的顺序图像。顶部：从左到右。细胞回收过程中的顺序图像的光学显微照片，其中细胞在小室内，毛细管刺穿小室顶(最左边)、吸取细胞后变空的小室以及毛细管分配细胞进入管中(最右边)。底部左边：定制的微流体筛选装置的图像，包括(i)加载在机器人微型操作器上的微毛细管，(ii)用于纳升液流的吸入/分配，(iii)X-Y转换底座，(iv)带有回收管底座的孵育插件，(v)用于获取全阵列图像的扫描X-Y平台，(vi)倒置显微镜，(vii)用于高灵敏度成像的低温Hamamatzu CCD相机(viii)用于毛细管操作的控制螺线管。底部右边：加载与孵育器插件下方的微流体装置放大图，毛细管处于细胞回收的位置。(C)细胞回收过程中的顺序图像的光学显微照片，其中细胞在小室中(顶部左边)、毛细管刺穿小室顶(顶部右边)、吸取细胞后变空的小室(底部左边)以及毛细管分配细胞进入管中(底部右边)。(D)细胞回收的效率。当运行模式I时，多个小室先吸取细胞再进行分配。这一模式用于两步筛选(富集)细胞或用于回收收集的细胞。从每个小室中回收需要约3秒。当运行模式II时，单个小室的内含物被吸取和分配，随后进行4步洗涤以确保单细胞之间没有携带。
[0086] 图59是用到模板转换的单细胞HV/LV方法的示意图。单细胞沉积于微量离心管中，通过靶向重链和轻链的嵌套基因特异性引物产生cDNA。MMLV酶的模板转换活性被用于将模板转换寡核苷酸的反向互补序列附加到所形成的cDNA的3’末端。半巢式PCR，通过复性后与重链和轻链恒定区配对的嵌套引物与一条与所述被拷贝的模板转换寡核苷酸互补的通用引物，被用于扩增cDNA并引入对每一单细胞扩增子特异的混合序列。随后收集扩增子并测序。
[0087] 图60是传统的杂交瘤方法示意图。取自经过免疫的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。这些融合以低效率形成存活的、能够分泌单克隆抗体并能在 培养基中生长的“杂交瘤”。培养并检测收集的杂交瘤以探测抗原特异性细胞的存在，并随后对所述抗原特异性细胞进行亚克隆和扩增以产生足够的单克隆抗体进行功能筛选。这一方法需要合适的融合对象，并很基本上被限制在小鼠和大鼠的应用上，尽管针对兔子也开发了专有的杂交瘤技术。典型的融合产生不到100个稳定的杂交瘤，并且需要9周用于培养和亚克隆。
[0088] 图61是所述微流体小室阵列的剖视图像，所述微流体小室阵列包含于一层薄膜内，膜上标记显示为细胞培养小室、阀以及与通道连接的小室。
[0089] 图62是图61所示的所述微流体装置的小室的示意图。
[0090] 图63显示一具有排列于4个2,048个小室亚阵列的8,192个小室的微流体装置的照片。所述微流体小室阵列直接置于在300微米层厚弹性体内的等渗浴池的下面。
[0091] 图64是图62所示的所述微流体装置的示意图。
[0092] 图65是一能够隔离效应细胞和靶细胞的微流体装置的示意图。
[0093] 图66是一图65的所述微流体装置的一单个单元细胞的示意图。
[0094] 图67是沿图66中垂直的短划线所拍摄的剖视显微图。
[0095] 图68是沿图66中水平的短划线所拍摄的剖视显微图。
[0096] 图69是显示一细胞因子中和检测实施方案的系列示意图。
[0097] 图70A是一小室的实施方案的俯视光学显微图像，所述小室在所述效应区(顶部)右端有五个效应细胞，在读出区(底部)有四个读出颗粒。
[0098] 图70B是图70A中所述小室的实施方案的俯视荧光显微图像，其中所述效应细胞结合部分荧光位于所述效应区右端，所述四个读出颗粒结合荧光位于读出区。
[0099] 图70C是一小室的实施方案的俯视光学显微图像，其中一效应细胞显示在效应区(左边)，一读出颗粒在读出区(右边)。
[0100] 图70D是图70C中所述小室的实施方案的顶视荧光显微图像，其中所述读出颗粒结合荧光位于所述读出区。
[0101] 图70E是一小室的实施方案的俯视光学显微图像，其中两个效应细胞在 所述效应区(左边)，六个读出颗粒在所述读出区(右边)。
[0102] 图70F是图70E中所述小室的实施方案的俯视荧光显微图像，其中所述读出颗粒结合荧光位于所述读出区。
[0103] 图71是从抗体分泌细胞捕获并检测抗体的工作流程示意图。
[0104] 图72：珠免疫捕获检测后对所述克隆进行4.5天的延时摄像所得的荧光图和明场图的实例。
[0105] 图73显示与批量摇瓶与接种于96孔板的单个细胞相比在所述微流体阵列中的CHO抗体分泌细胞培养生长旺盛。
[0106] 图74A是一张微流体小室的明视野显微照片，其中所述一微流体小室中加载有一分泌一抗溶菌酶抗体的杂交瘤细胞HyHEL5(顶部板块)，所述另一微流体小室中没有加载HyHEL5杂交瘤细胞(底部板块)。
[0107] 图74B是图74A所示的所述小室的明视野显微照片，所述小室中除了加载HyHEL5细胞外还加载了4B2杂交瘤细胞，其分泌不结合溶菌酶的“背景”抗体。
[0108] 图74C是图74B所示的所述小室在与荧光标记的溶菌酶孵育后的荧光显微照片。
[0109] 图74D是图18C所示的所述小室与荧光标记的抗IgG抗体孵育后的荧光显微照片。
[0110] 图74E是显示图74C中描述的所述小室的抗体积累与释放的动力学图。
[0111] 图74F是600个小室的随着时间记录的荧光图，所述小室包括HyHEL5与4B2杂交瘤细胞的混合体系在蛋白A与10nM溶菌酶的存在下在生长培养基下孵育。
[0112] 图75A显示三个信号缺失的代表性实例，其中在小室中包含抗体分泌细胞但不包含分泌针对关注的抗原抗体的细胞。
[0113] 图75B显示三个小室的代表性实例，所述小室中包含了多种分泌并非特异性针对所关注抗原的抗体的背景细胞，从中探测到了一单个的分泌一针对所关注的抗原的抗体的细胞。
[0114] 图75C显示小室中荧光信号的直方图，所述小室全都只包括不分泌针对所关注的抗原的抗体的杂交瘤细胞。
[0115] 图75D显示小室中荧光信号的直方图，所述小室包含产生针对一关注的抗原(鸡蛋溶菌酶)的抗体的杂交瘤细胞HyHEL5与产生针对一不同抗原的抗体的杂交瘤细胞DMS-1的混合体系。
[0116] 图76A是单个的杂交瘤细胞(4B2)分泌一针对固定于K562细胞上的人CD45的抗体的示意图。细胞和珠孵育后用一检测抗体染色。
[0117] 图76B显示通过自动图像分析测量的空白小室和包含有单个杂交瘤小室的读出细胞和珠的平均荧光强度。
[0118] 图76C，从左到右：含有一单个杂交瘤细胞的小室。与靶标固定的K562细胞过夜孵育并与蛋白A珠孵育2小时后在同一小室中抗CD45抗体染色后的明场、荧光和叠加的图像。
[0119] 图77A是免疫与结合检测的示意图。小鼠以活的取自卵巢癌细胞(TOV21G)的细胞进行免疫。抗体分泌细胞通过FACS进行分选，然后注射到所述微流控装置中并与用CFSE染色的读出细胞(固定的活的TOV21G细胞)一起孵育。抗体结合通过标记的二抗进行观察。
[0120] 图77B显示在芯片上点样后的将细胞与读出细胞(活的且已固定)。读出细胞用CFSE染色鉴定。抗体结合到固定的活细胞表面通过标记的二抗进行观察。最右边显示一阴性小室，其中所述读出细胞的信号非常低。
[0121] 图78是显示通过ELISPOT观察到的(A)书抗体分泌细胞生长8天后，及(B)人抗体分泌细胞生长5天后的细胞存活与抗体分泌。每个孔所铺的细胞个数已表明。
[0122] 图79显示从用卵巢癌细胞免疫后的小鼠中选取抗体分泌细胞。(A)图显示用PE抗小鼠CD138染色的小鼠脾细胞的荧光激发的细胞筛选。阈值的划定显示CD138+群。(B)ELISPOT显示来自未分选的脾脏对照、CD138-对照与CD138群的抗体分泌。每个孔所铺的细胞个数已表明。(C)图显示ELISPOT计数，所述计数为观察到的细胞数占所铺的每个群的细胞数的百分 比值。
[0123] 图80显示从流感免疫过的兔子中选取抗体分泌细胞。(A)图显示通过ER-Tracker与鼠抗兔IgG来对兔PBMC进行荧光激活的细胞分选。阈值的划定显示内质网与IgG双高群的选择。(B)ELISPOT显示未经分选的PBMC对照、内质网与IgG双高群及无细胞对照的抗体分泌。每个孔所铺的细胞个数已表明。(C)图显示ELISPOT计数，所述计数为观察到的细胞数占所铺的未经分选的PBMC对照细胞数与内质网与IgG双高细胞群的细胞数的百分比值。
[0124] 图81A显示在富集前一抗原特异性的阳性小室的明场(顶部)与荧光(底部)图像的代表性实例。
[0125] 图81B显示在多孔板中培养与过夜回收之后的细胞。
[0126] 图81C显示在富集之后以单细胞的稀释度加载的一抗原特异性的阳性小室的明场(顶部)和荧光(底部)图像的代表性实例。
[0127] 图81D富集前后的H1N1与H3N2阳性小室的频率。
[0128] 图82显示2个小室的明视野显微图像，一个包括多个效应细胞，其中至少一个分泌一抗体(顶部)，而另一小室没有任何效应细胞(底部)。当分泌的抗体存在(顶部)并且在抗体分泌细胞不存在的情况下保持分散时(底部)所述读出颗粒发生聚集。
[0129] 图83显示两个小室的荧光显微图像，一小室包括多个效应细胞，其中至少一个分泌一抗体(顶部)，另一小室没有任何效应细胞(底部)。两个小室都包含读出颗粒(蛋白A珠)，所述读出颗粒已被荧光标记的抗人的抗体染色一测定一胞外效应是否存在。
[0130] 图84A是实施例13中所描述试验的示意图。
[0131] 图84B是含有不同浓度标记抗原的微流体小室的光学显微照片。
[0132] 图84C是不同浓度的标记的抗原(鸡蛋溶菌酶)在与分泌不同亲和力抗体的单个杂交瘤细胞(HyHEL5和D1.3)孵育后不同浓度下的珠荧光强度图。
[0133] 图84D显示对应于图84B图像中的与单个的分泌不同亲和力抗体的 D1.3与HyHEL5细胞孵育并用不同浓度的抗原(鸡蛋溶菌酶)标记后的珠荧光强度。
[0134] 图85显示一微流体阵列的一部分，其中含有的人浆细胞在阀关闭时每个小室保持隔离的状态下孵育后分泌抗H3N2的抗体。
[0135] 图86显示一含有人浆细胞的微流体阵列的一部分，不使用所述分离阀的小室通过流动通道保持连接，浆细胞孵育后分泌抗H3N2的抗体。
[0136] 图87显示亲和力测量的代表性实例，所述实例获取自通过微流体筛选两种单个的产生抗鸡蛋溶菌酶抗体的鼠原代浆细胞。
[0137] 图88的柱状图显示在HyHEL5阳性小室中的小珠的残留的荧光水平在洗涤结束时比其他小室中的要高。
[0138] 图89A是一含有一异质细胞群(红细胞和人B细胞)的小室的明视野俯视显微图实例。
[0139] 图89B是一含有一异质细胞群和一读出颗粒群(蛋白A珠)的小室的明视野俯视显微图实例。
[0140] 图89C是一小室的荧光顶视显微图实例，显示至少在所述异质性细胞群中至少有一细胞分泌人IgG抗体。所述抗体被所述读出颗粒所捕获，所述读出颗粒被与Dylight594结合的抗人抗体染色。
[0141] 图89D是一在所述小室中流入H1N1抗原后含有一异质细胞群和一读出颗粒群的小室的明视野俯视显微图实例。
[0142] 图89E是在所述小室中流入H1N1抗原后一异质性细胞群与一读出颗粒群(蛋白A珠)结合的俯视荧光显微图实例。所述H1N1抗原与Dylight 488结合以从整个IgG染色中区分抗原特异性染色。
[0143] 图89F是一小室在回收所述细胞后的俯视明视野显微图实例。
[0144] 图90显示在多孔板中通过 eXpress CCR4 CHO-K1β-抑制素GPCR检测进行化学发光信号传导检测的实例。
[0145] 图91是实验的代表性示意图。人志愿者接种季节性流感疫苗。回收周边血单核细胞(PBMCs)并用流式细胞术进行分选以富集浆细胞。细胞注射 到微流控装置中并检测H1N1与H3N2特异性。
[0146] 图92是在一含有蛋白A珠的小室中一单个的人浆细胞的实例。在珠上所捕获的分泌的抗体结合到H1N1与H3N2标记的抗原，因此具有交叉反应性。标记的抗人IgG使总体的IgG分泌能够被观察。
[0147] 图93显示一人原代抗体分泌细胞(顶部左边)的实例，其通过珠检测(底部左边)被鉴定为产生一抗流感的抗体并在所述微流控装置过夜孵育时发生分裂。
[0148] 图94是一张Size 2％琼脂糖胶照片，照片中为在一微流控装置中经过单细胞筛选后抗体的重链和轻链基因特异性PCR产物。泳道i至iv显示样品3至6分别扩增得到的重链PCR产物。泳道v显示核酸ladder分子标记。泳道vi至viii显示样品3、5和6分别进行的kappa链PCR扩增。泳道ix显示样品4进行的lambda链PCR扩增。
[0149] 图95A是显示来自两个单个的分泌抗流感抗体的细胞的重链和轻链的扩增凝胶图。
[0150] 图95B显示来自两种分泌抗H1N1和H3N2抗体的可变重链和轻链的氨基酸序列。
[0151] 图95C是对与H1N1和H3N2都交叉反应的重组人单克隆抗体进行的功能验证。
[0152] 图96A显示一小室的实例，所述小室含有一异质性的兔浆细胞群，其中包括至少分泌一抗HIN1抗体的一效应细胞，通过在读出捕获珠上的荧光信号被探测到。
[0153] 图96B显示一小室的实例，所述小室含有一异质性的兔浆细胞群，其中包括至少分泌一抗H3N2抗体的一效应细胞，通过在读出捕获珠上的荧光信号被探测到。
[0154] 图97A显示加载有多种富集的兔浆细胞的4个小室的明场图像。
[0155] 图97B显示在检测到H1N1后图123A中所述小室的荧光图像。所有小室均为阴性，并且不含分泌抗H1N1抗体的细胞。
[0156] 图97C显示检测到H3N2后图123C中所述小室的荧光图像。小室表现出变化的珠强度，但所有小室均为阳性并且包含至少一分泌抗H3N2抗体的细胞。
[0157] 图97D显示在图123C中所述H3N2阳性微流体小室中回收到兔细胞后从中扩增到的重链和轻链凝胶图。
[0158] 图98显示加载有回收细胞的毛细管接近注射端口的图像，在注射之后紧接着立即进行再注射以达到富集。
[0159] 图99显示验证人源抗体序列的实例，所述验证通过克隆、表达和阐明所述抗体的特性进行。
[0160] 图100是显示单个杂交瘤细胞RT-PCR扩增所得条带的凝胶图，所述单个杂交瘤细胞回收自一微流控装置。
[0161] 图101是产生自杂交瘤(D1.3和HyHEL5)的抗鸡蛋溶菌酶抗体与获取自通过一微流控装置筛选到的单个D1.3和HyHEL5杂交瘤细胞序列的重组表达之间的比较图。抗小鼠抗体的捕获珠与杂交瘤或表达D1.3和HyHEL5抗体的重组HEK293细胞的细胞上清液一起孵育、洗涤并与不同浓度的标记的抗体孵育。荧光测量值对最高的抗体浓度下最大的珠强度进行标准化，以验证所述重组产生的抗体的结合特性。
[0162] 图102显示小珠与HEK293细胞(对照)或瞬时表达抗体R05C14的HEK293细胞的上清孵育后再用标记的鸡蛋溶菌酶(10nM)孵育所得到的荧光强度图。在所述序列R05C14获取自一小鼠原代浆细胞后，所述新的小鼠抗体结合鸡蛋溶菌酶得到证实，所述小鼠原代浆细胞在微流体筛选中被鉴定为抗原特异性。
[0163] 图103A是PCR凝胶图像，显示出由实施例25所描述的方法产生的扩增子，所述方法中用到的逆转录温度梯度从60℃至40℃。
[0164] 图103B显示图103A中所示的从400bp至600bp的条带的Sanger测序结果。所述序列被进行比对并确证与所述D1.3重链的可边区序列匹配。
[0165] 图104A-C是一对基于第二代测序所获得的全部IgG进行功能解释的方法的示意图。
[0166] 图105A是使用不同荧光强度的珠进行多元化抗原检测的示意图。
[0167] 图105B是加载于微流体小室中的三类读出颗粒的明场图像。
[0168] 图105C是在微流体小室中具有不同强度与抗原的三种类型的读出小珠的荧光图像。
[0169] 图105D是用兔抗H1N1抗体和抗兔的二抗进行检测后的三类读出小珠的荧光图像，其中仅包覆了H1N1的珠(箭形符号)表现出有信号。
[0170] 图105E显示在H1N1检测后三类珠的信号，所述三类珠包覆有不同的流感毒株并且基于它们的荧光强度得以区分。
[0171] 图106A显示在放线菌素D存在时L929细胞对毒性应答作为TNF-α浓度的函数。
[0172] 图106B显示在TNF-α和放线菌素D存时用微流体装置中培养的L929细胞进行的凋亡与坏死检测试验。
[0173] 图107A显示TNF-α功能检测的延时荧光显微图像。(A)上板块：TNF-α配体不存在时荧光定位于细胞质。中板块：被10ng/mL TNF-α激活时，观察到荧光从细胞质转移到细胞核的变化。下板块：除10ng/mL TNF-α配体外，当还存在一含有中和TNF-α配体的抗体的细胞上清液时，所述荧光定位仍位于细胞质。
[0174] 图107Β是表现出细胞核荧光定位的被激活的细胞的频率图。所述细胞数的定量如图所示。
[0175] 图108显示在第0天、1天和3天时单个微流体小室内的SKBR3细胞群的光学显微图。SKBR3细胞中包含一LC3-GFP报告载体。
[0176] 图109A显示一小室的明场图像，所述小室包含一被CEF肽激活后与IFNγ捕获珠一起孵育的外周血单核细胞群。
[0177] 图109B显示一小室的荧光图像，所述小室包含至少一被CEF肽激活后分泌IFNγ的激活T细胞。
[0178] 图109C显示一个小室的明场图像，所述小室包含一个通过CEF肽激活后培养了5天的T细胞克隆。
[0179] 图109D显示在一经过CEF肽刺激的周边血单核细胞群中与ELISPOT相比通过微流体分析来测量抗原特异性T细胞具有更高的灵敏度。
[0180] 图110是来源于3个细胞存活PDGFRa功能性胞外效应检测中的亚阵列中的小室的荧光显微图像，显示出(A)在不存在配体时或(B)25ng/mL PDGF-AA存在48小时后表达PDGFRα和组蛋白2Β-YFP的YFP荧光值读出结果。插入图显示单个微流体小室的放大图。图110C显示一富集的小鼠脾细胞(2个细胞，黑色箭形符号)群与一活的读出细胞群(国表达PDGFRA的BaF3，白色箭形符号)和包含至少一效应抗体分泌细胞在微流控装置中培养12、24、36和48小时后的显微图。
[0181] 图111显示获取自一基于平板的检测的荧光图像，所述检测中 eXpress CCR4 CHO-K1β-抑制素GPCR报告细胞与不同浓度的激动剂CCL22孵育，随后与不同浓度的底物C12FDG孵育。GPCR CCR4的激活使β半乳糖苷酶被补偿，进而将底物切割为发荧光的产物。
[0182] 图112A显示一基于微流体的GPCR信号传导检测的明场与荧光图像，其中eXpress CCR4 CHO-K1β-抑制素GPCR报告细胞加载到一微流控装置上，与底
物C12FDG孵育90分钟，随后与不同浓度的激动剂CCL12孵育90分钟。GPCR CCR4的激活使β半乳糖苷酶被补偿，进而将底物切割为发荧光的产物。
物C12FDG孵育90分钟，随后与不同浓度的激动剂CCL12孵育90分钟。GPCR CCR4的激活使β半乳糖苷酶被补偿，进而将底物切割为发荧光的产物。
[0183] 图112B显示 eXpress CCR4 CHO-K1β-抑制素GPCR报告细胞与底物C12FDF和不同浓度的激动剂CCL12孵育后的荧光强度测量值，如图112A所示。
[0184] 发明详述
[0185] 如本发明所提到，单数形式不定冠词“一”和定冠词“所述”包含了复数指示物，除非在上下文中清楚地作出另外的说明。因此，例如，所指为“一 件事物”时包含了指代多于一件该事物。本发明所引用参考文献并不表示承认这些文献为本发明的现有技术。
[0186] 本发明所用到的“读出”，指报告一胞外效应的方法。一“读出颗粒群”可以包括一个或多个读出颗粒，如本发明所述。
[0187] 本发明所用到的“胞外效应”是一直接的或间接的作用于一读出颗粒上的且发生在一效应细胞胞外的效应，包括但不限于细胞增值的提高、生长减缓、凋亡、裂解、分化、感染、结合(例如，与一细胞表面受体或一表位结合)、形态变化、信号传导级联放大的诱导或抑制、酶活抑制、病毒的抑制、细胞因子抑制和补体的激活。如本发明所提供，在一实施方案中的所述胞外效应是分泌自所关注的分泌自一效应细胞的一生物分子结合到一读出颗粒。在另一实施方案中，所述胞外效应是一读出细胞或辅助细胞的一诸如凋亡的应答。
[0188] 本发明所提供的方法用于鉴定一效应细胞或包含一在表现出胞外效应上的变化的一效应细胞群。所述在胞外效应上的变化是与对照相比(阴性对照或阳性对照)或与一种或多种其他细胞群相比的变化。
[0189] 本发明所指的一“异质性群”，尤其是关于一异质性颗粒或细胞群，意为包括至少两种具有相异特性的颗粒或细胞的颗粒或细胞群。例如，在一实施方案中所述特性为形态、大小、荧光报告分子的类型、一不同的细胞、表型、基因型、细胞分化类型、所表达的一种或多种RNA或一功能属性。
[0190] 本发明所指的“亚群”意为一更大的颗粒(细胞)群中的一部分。在一实施方案中一群细胞通过，例如将单个细胞亚群分离到单个的微流体小室中而被划分为多个亚群。此外，一单个的细胞亚群可被进一步分成多个亚群，例如，在多个微流体小室或其他反应容器内。一亚群还可以是一更大的、位于同一微流体小室内的群的颗粒的一部分。一亚群包含一种或多种颗粒，并且当多种颗粒存在于一亚群中时，所述多种颗粒中的单个颗粒相互之间可以是同质性或异质性的。
[0191] 在一实施方案中“细胞截留器”连续地或间断地划定至少一效应区和 至少一读出区。所述截留器可以是一结构原件诸如一阀、一细胞栅栏、一外部场或场梯度(例如重力、磁、电磁、加速度等)中的定向、所述一通过一电极或光学组件或磁性探头、表面修饰(例如纹理化、包被等)产生的一局部场的定向和/或定位有助于或抑制细胞贴壁，或通过所述小室内的一溶液的特定的重力产生，或通过上述一种或多种的组合产生。
[0192] 本发明所用到的“包被”可以是任何对所述小室表面的进行的附加，其促进或抑制一效应细胞或一读出颗粒贴附与所述小室的表面。所述包被选自以下的一种或多种：一细胞、一聚合物刷、一聚合物水凝胶、自组装单分子层(SAM)、光接枝分子、一具有细胞结合特性(例如激动蛋白、纤维连接蛋白、整合蛋白、蛋白A、蛋白G等的细胞结合域)的蛋白或蛋白片段。更加通常地，使用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-(丝氨酸)(RGD(S))肽序列基序。多聚L赖氨酸也被广泛用作一用PDMS包被的聚合物，通过静电相互作用，一具有细胞结合特性的磷脂、一具有细胞结合特性的胆固醇、一具有细胞特性结合的糖蛋白与一具有细胞结合特性的糖脂，提高细胞的贴壁性；。另外通过生物素标记的分子对PDMS表面的进行功能化是一简单、具有高度吸引力而又灵活的手段。众所周知牛血清白蛋白(BSA)由于具有疏水域很容易通过疏水效应吸附到疏水的PDMS表面上，使得所述小室中基于链霉亲和素的结合物(蛋白、DNA、多聚物、荧光集团)的直接偶联称为可能。基于聚乙二醇的多聚物因其生物污损特性被知晓，并能够用于包被PDMS表面(吸附，共价接枝)，防止细胞贴壁。多聚(对二甲苯)，例如聚对二甲苯C也可通过化学蒸发沉积(CDV)沉积到PDMS表面并防止细胞贴壁。
[0193] 本发明所用到的“分离的”指一特定的小室不允许被分析的一效应细胞和/或读出颗粒被所述微流控装置中其他小室的一种或多种颗粒或细胞大量地污染的条件。这样的分离可通过，例如，在复合小室的情况下密封一小室或一组小室，限制小室间的液流通信或限制小室间的液流来达成。
[0194] 本发明所用到的“入口”或“出口”包含流体流进和流出一小室所经过的小孔。可通过入口或出口或同时通过两者来限制液流以将一小室从其周 边环境隔离。可能有一或多个阀控制流动，或者流动可通过限制所述液流通道进行控制，所述液流通道通向所述入口和出口，并具有一层防止流动的膜(例如，一层控制膜或隔离膜)。可选择地，流动可通过液流通过所述装置的速率进行调控。所述入口或出口还可以向所述装置提供液流以递送一效应细胞或读出颗粒，或其他在分析中所需要的由流动来携带的组分。在某些实施方案中，所述入口和出口可通过一单个的位于所述小室顶部的小孔来提供，所述小室上液流从一入口端六道一出口端。
[0195] 本发明所用到的“磁铁”包括任何铁磁性或顺磁性材料。本发明所用到的“顺磁性”意味着包括含有铁、镍、铬或钴，或其组合物的材料以及各种合金，这样所述磁性材料被吸引到一块磁铁上或者其自身就是一块磁铁。例如，一磁性材料可由铁磁性不锈钢制成或可由稀土磁铁或一具有磁铁属性的不锈钢制成。一磁铁还可通过在一确定的形状和方向上用磁流体制成。一磁铁还可通过一线圈或其他设计为通电后即产生磁场的电激活装置来实施。
[0196] 本发明所用到的“孔阵列”指一小室内任何能够限制一效应细胞和/或一读出颗粒运动的结构的阵列，所述限制通过定位一种或他种读出颗粒或效应细胞到一特定的读出区或效应区实现，其中一个区(即效应区或读出区)可以由其中颗粒的种类来定义。例如，一孔阵列的实施方案如图33所示，其中一系列相交的细胞栅栏在所述小室的一表面上形成一孔阵列。
[0197] 本发明所用到的“颗粒陷阱”指能够在空间上将一效应细胞或一个或多个读出颗粒(小珠)限定在一特定的空间位置以在检测中限制运动的结构。一“细胞栅栏”是一类“颗粒陷阱”。在一实施方案中，一颗粒陷阱被用于限定效应细胞，在这种情况下可被称为一“效应细胞陷阱”。在某些实施方案中，一颗粒陷阱会被用于限定读出颗粒，在这种情况下可被称为一“读出颗粒陷阱”，7或一“读出细胞陷阱”，如可能为这种情况。在一实施方案中，一“颗粒陷阱”允许被其困住的颗粒具有一固定的位置。具有一固定的位置可以简化成像及图像分析。一种或多种读出颗粒具有一固定的位置还具有限制或控制一效应细胞和一读出颗粒之间扩散距离的优点。具有一固定的位置 还可防止效应细胞与读出颗粒间相互作用。
[0198] 本发明所用到的“纹理化的表面”可以是任何类型的提高或降低细胞对所述小室表面粘附的表面修饰的类型。例如，所述表面进行下述中的一种或多种纹理化：突起、压痕、粗糙、突起、挂钩、聚乙二醇、孔、沟、脊、粒、编制、网、疏水性、亲水性等。
[0199] 人体在任意时刻都会制造数百万到数十亿种抗体，每种都通过一不同的单个的被称为“抗体分泌细胞”(ASC)的浆细胞产生。每个ASC的直径根据来源约为7μm到15μm，大约是一根人的头发直径的十分之一，并且只产生微量的抗体。在人体内数十亿不同的ASC中，只有非常稀有的少数制造适合用作治疗药物的抗体。当采用传统的方式进行分析时这少量的抗体太过稀释，使其完全不能被检测到。由于这个原因，现在的抗体发掘需要每种ASC被分离，融合到一永生的癌细胞上形成一杂交瘤并生长，最终产生成千的完全相同的细胞，产生足够量的抗体以供检测(见图60)。例如，见McCullough与Spier(1990)，生物技术中的单克隆抗体：理论与实践篇，第2章，剑桥大学出版社，本发明中全文引用以供参考。这个过程不仅效率低到令人难以置信(开始时的免疫细胞99.9％丢失)，并且非常缓慢和昂贵，需要至少3个月的实验室阶段才能进行治疗功能的测试。因此，发掘具有最优治疗特性的抗体是药物开发中的一主要的并且尚未解决的瓶颈。
[0200] ASC是终端分化细胞，不能在培养基中直接扩增。如上所述的现有的克服这一问题的方法效率非常低，仅能捕获到众多抗体中的微小的一部分(典型地<0.1％)。这些方法还被局限用于啮齿动物，并且非常耗时和昂贵，需要数月的实验室阶段才能进行治疗测试。如下文说明，本发明通过使直接在抗体和ASC上的功能检测成为可能克服了这些限制，并且不限来源。
[0201] 为了提高抗体筛选的速度和通量，已经发展了多种技术，但这些技术是以牺牲信息来达到目的的。具体地，现有的技术被限制在基于结合、亲和力与特异性来进行抗体的选择。虽然这对于研究应用已经足够，很多治疗应用需要高亲和力抗体而不仅仅是结合到靶标就可以了。相反地，治疗应用需要 诱导所需要的生物应答(例如，细胞信号传导的激动剂/拮抗剂；免疫应答的激活；凋亡诱导；细胞生长或分化的抑制)的抗体。目前，所有高通量抗体发掘技术都要求这一功能的阐明在下游进行，即在抗体的结合被评测后，且使用到的方法甚至与所述杂交瘤方法相比都繁琐、代价高昂并且通量低。因此，40年前开发的杂交瘤法现在仍是治疗用抗体发掘的支柱方法。
[0202] 本发明一方面利用了微流体平台的小反应体积和大规模平行检测能力以筛选具有所关注的特性的细胞群，本发明中称之为一“胞外效应”。每个细胞群可选地包含一种或多种效应细胞。所述胞外效应并不限于一特定的效应；相反，其可以是一结合特性(特异性，亲和性)或一功能特性，例如激活或拮抗一细胞表面受体。在一实施方案中，所述胞外效应是通过一特定效应细胞的分泌产物所施加的效应。
[0203] 本发明所提供的所述整合微流控装置和方法部分基于小即灵敏这一概念-每个装置都包括了数千个纳升级体积的细胞分析小室，每个小室比传统的基于平板的检测小100,000倍。在这些纳升级小室中，每种单个的效应细胞在几分钟内产生高浓度分泌的生物分子。例如，每种单个的ASC在几分钟内产生高浓度的抗体。在一实施方案中，这种浓度效应被利用来实施基于细胞的鉴定抗体的筛选试验，所述抗体由单个的原代ASC生产，具有特异的一种或多种功能特性，如调控(例如，激活或拮抗)细胞表面受体活性。本发明提供的可使用的功能检测及方法与装置在下文进行了具体描述。重要的是，本发明所提供的筛选方法并非一定要鉴定一具有某一特定特性的特定的效应细胞或效应细胞亚群，只要在某一特定的含有一细胞群的微流体小室检测到所述胞外效应的存在。所述检测到所述效应的小室内的部分或全部细胞可被回收来阐明其特性以鉴定到对所述胞外效应负责的特定的一种或几种细胞。由于完全不再需要在筛选前进行细胞培养，本发明所提供的单细胞方法第一次使在仅仅几天内从任何物种以每次运行超过100,000个细胞的通量直接筛选功能性抗体成为可能(图1)。
[0204] 本发明所提供的所述微流控装置和方法与目前可用的策略相比在评测 一单个细胞的胞外效应，例如由一种单个的ASC分泌的抗体的一胞外效应上提供了优势。例如，本发明所述的装置规模大小可以调整，使得试剂的消耗量减少且通量增加以提供一大型的单细胞检测平台来进行通过其他方法无法实现的或成本太高以至于无法进行的研究。而且，目前可用的单细胞检测平台的分析需要在传统的管中进行多步细胞处理与加工的步骤以产生产物用于下游分析，例如qPCR。本发明所包含的微流体细胞处理与加工因此为提高的通量和降低的成本提供了重要途径，而且还通过小体积限制提高了准确度和灵敏度。
[0205] 本发明不希望被理论所束缚，其提供的纳升级微流体小室所赋予的浓度的提高和迅速的扩散混合，连同精准的细胞处理和操作(例如，培养基条件的时空控制)使单细胞，诸如免疫细胞(例如，B细胞，T细胞和巨噬细胞)的分析成为可能，所述细胞的主要功能包括分泌不同的效应蛋白，如抗体和细胞因子。
[0206] 本发明所描述的实施方案提供了微流体系统和方法，能够对来自包括一种或多种效应细胞的细胞群的分泌产物进行多细胞检测，随后回收所述细胞群进行后续分析。在一些实施方案中，所述细胞群是异质性细胞群。即，一群中的两个或多个细胞在基因型、表型或其他特性上不同。而且，当多个细胞群在一装置上平行进行检测时，至少两个细胞群互相是异质性的(例如，细胞数量，细胞类型等)。在本发明所描述的检测中，一包含一种或多种读出颗粒的读出颗粒群作为检测试剂(例如，表达一细胞受体的读出细胞，读出小珠，传感器，可溶性的酶等)与一包含一种或多种效应细胞的细胞群接触，并且所述一种或多种效应细胞的分泌产物的浓度足以使一种读出信号(例如，一荧光信号)被检测到。在一些实施方案中，所述读出信号是一被所述群中的一种或多种效应细胞所诱导的生物应答/功能效应(例如，凋亡)反映在一种或多种读出颗粒上(例如，读出细胞)。例如，为检测到一产生自某一ASC的抗体，所述ASC或一包含一种或多种ASC的细胞群连同读出颗粒以及，可选地，辅助检测试剂一起被隔绝在一装置的小间内，然后进 行检测(小室具有约100皮升到约50纳升的体积，例如约1纳升到到5纳升)。重要的是，因为在一实施方案中效应细胞是稀少的细胞，不是所有被本发明描述的方法所检测过的细胞群都会从启始就含有一效应细胞。例如，在一实施方案中，当数千个细胞群在一台装置上进行检测时，所述小室中只有一部分会含有一效应细胞。本发明所提供的方法可以鉴定到含有所述效应细胞的所述小室。
[0207] 本发明与前面描述过的微流体方法相比采取了一种不同的手段。后者采取的手段是以最大化单个小室内单细胞数量的密度来对单细胞进行加样(例如，当使用液滴或微孔时)。这通过限制稀释度分离单细胞来实现，随后对含有一单细胞的部分小室或空间进行分析。这一策略牺牲了通量，因为最适合的单细胞点样是通过大约每孔1个细胞的平均密度来实现的。类似地，这些方法中所述的空间通常也不允许在一间小室内多于几个细胞，并且在很多情况下设计为空间上只能容纳一单细胞。除通量降低外，所述在一单个的微流体小室中分离并检测一单细胞的方法还产生了几个技术上的挑战。例如，达到足够的细胞浓度以从异质性群中得到有意义的读出结果和保持单个细胞存活，鉴于营养的耗尽、通气的需要、不必要的蒸汽渗透效应、控制不好的培养基条件以及移出废物的需要，可能对完成可靠的、可重复的单细胞微流体检测构成严重的问题。在很多功能检测中，像细胞生长抑制，需要使所述效应细胞与所述读出细胞存活数天。这样一种检测在基于微孔的系统和液滴中是不可行的。然而，如本发明所讨论，本发明提供了一用于跨时数天检测的强有力的平台。
[0208] 本发明所述装置和检测提供单细胞检测，其中一种或多种效应细胞存在于多个单个的细胞群中位于单个微流体小室内。所述细胞群被检测其分别具有的在每间小室内施加胞外效应的能力，因此与前述方法相比提供了更高的总通量。重要的是，一单个的效应细胞的效应可从一更大的细胞群中被检测到，例如从一异质性细胞群中。通过采用在一间单个微流体小室中进行多细胞检测的方法，本发明所述的实施方案能够以大于或等于以前报道过的通量 的100倍运行。一旦检测到一细胞群在一读出颗粒上具有胞外效应，或与另一细胞群相比具有胞外效应上的变化，所述细胞群在一实施方案中会被回收并作为单个的细胞亚群进行进一步分析(例如，所述回收细胞群以有限的稀释度进行检测)以测定群内的那一种或多种效应细胞对所述胞外效应负责。
[0209] 本领域已知的设计为容纳超过一单细胞的方法和设备具有局限性，使其不适合用于本发明所述的检测类型，例如，维持细胞在活力状态、无法选择性回收所关注的效应细胞、一个装置内的蒸发、压力的可变性、交叉污染、装置的构造限制其成像能力(例如，在不同焦平面提供颗粒，降低的分辨率)以及通量的缺失(WO2012/072822及Bocchi等人(2012)，均全文纳入以供参考)。
[0210] 本发明所述实施方案部分涉及到功能性效应细胞检测(在本发明中也被称为胞外效应检测)，其可以在一间单个的微流体小室内从一异质性细胞群中检测到一所关注的单个效应细胞。特别地，在一小室含有一异质性细胞群，所述细胞群的每个细胞都分泌抗体(即一异质性ASC群在一间单个微流体小室内)，或仅所述群里的一部分细胞分泌抗体，而其中又只有一效应细胞或一效应细胞亚群分泌一抗体在一种或多种读出颗粒上产生所需要的胞外效应的情况下，本发明所述的实施方案提供了一种用于测量和检测所述所需要的胞外效应的方法。一旦一间小室被鉴定发现包含一显示所述效应的细胞群，所述细胞群被回收并进行下游分析，例如，以有限的稀释度将所述细胞群分成多个亚群。如下所述，在一实施方案中，一个或多个表现出一胞外效应的异质性细胞群被回收并进一步在有限稀释度下进行筛选(例如，每次检测从1个到约25个细胞)，以测定所述胞外效应应该归因于那种细胞。
[0211] 在一实施方案中，一微流体检测在多种存在于单个的微流体小室内的细胞群上进行，以测定所述细胞群内的一效应细胞是否分泌一抗体或其他生物分子以抑制一读出细胞生长。在这一实施方案中，即使存在一异质性细胞群包含有多种分泌不影响所述读出细胞生长的抗体的ASC，所述读出细胞的生长仍会受到相同程度的抑制，并且所述微流体小室仍然可被鉴定为含有所需 要的效应细胞和分泌产物。随后所述小室的内含物可被回收用于进一步的微流体分析，或试验台分析，例如，有限稀释所述效应细胞以测定那种效应细胞表现出所述效应。抗体序列也可通过本领域技术人员所知晓的方法获取。
[0212] 在一实施方案中，通过本发明所描述的方法提供新的抗体。例如，通过本发明所描述的方法可鉴定并回收一种或多种ASC，并且其抗体基因可被测序并克隆。
[0213] 当单细胞以大约1个细胞每间小室的密度被加载到单个小室内的时候，本发明所提供的装置每次实验可筛选大约1000个单细胞(例如，ASC)。一种或多种所述单细胞可以是ASC或一不同类型的效应细胞。尽管与杂交瘤发相比已高出大约10倍，在很多情况下还是需要筛选数万乃至数十万个细胞。这种情况的实例包括不能获得高纯度的ASC时(例如，ASC分子标记/抗体不清楚的物种或免疫应答较弱的情况)，或结合的抗体虽多但具有所需要的属性的抗体极为稀少时(如对一受体的封闭)。然而，在鉴定到一个或多个细胞群包含一种或多种表现出所述关注的胞外效应的效应细胞后，在一实施方案中所述细胞会被再次分析，但稀释度有限，例如，作为在单个的微流体小室中的单细胞，或在单个的小室中的更小的细胞群(与第一次筛选相比)，以测定对所述胞外效应负责的所述单个效应细胞。这种两步筛选法的一实施方案如图2所示。一旦一种或多种效应细胞得以鉴定，其遗传信息可被扩增并测序。在一实施方案中，所述遗传信息包含一新的抗体基因。
[0214] 在如图2所示的实施方案中，一微流体阵列以约25个细胞每间小室的密度进行点样，使一台单独的装置中总共含有约100,000个细胞。随后所述小室被隔离并孵育，在每间小室中产生独特的抗体的多克隆混合体系。然后这些抗体被进行筛选以鉴定表现出所需要的胞外效应的小室，例如，抗原结合、高结合性亲和力、抗原特异性或一种或多种功能特性。然后回收每个阳性小室的内含物。在一实施方案中，每个群的回收用一单个的微毛细管进行，所述小室的内含物在所述微毛细管中汇集，并以有限的稀释度重新加载到同一台装置上，或加载到一台不同的装置上。如图2所示实施方案中，所述来 自一号阵列的细胞以大约
1个细胞每间小室的密度被重新加载到不同的小室中。所述来自回收群的细胞随后被重新筛选是否具有同样的或不同的胞外效应。来自所述第二阵列的所述阳性小室的内含物随后被回收以鉴定所关注的抗体的序列，例如，通过第二代测序和/或PCR。在一实施方案中，所述抗体序列被测序并克隆，因此，在一实施方案中，本发明所提供的方法可以发掘新的抗体基因。
1个细胞每间小室的密度被重新加载到不同的小室中。所述来自回收群的细胞随后被重新筛选是否具有同样的或不同的胞外效应。来自所述第二阵列的所述阳性小室的内含物随后被回收以鉴定所关注的抗体的序列，例如，通过第二代测序和/或PCR。在一实施方案中，所述抗体序列被测序并克隆，因此，在一实施方案中，本发明所提供的方法可以发掘新的抗体基因。
[0215] 在另一实施方案中，表现所述胞外效应的细胞群通过一整合的系统进行回收，所述整合的系统具有微流体阀，使小室可以单独被处理(例如，Singhal等人(2010).Anal.Chem.82，pp.8671-8679，全文纳入本申请以供参考)。值得注意的是，本发明本发明不限于在“阵列一”(图2)所述阳性小室内含物上进行的胞外效应检测的类型。例如，在一些实施方案中，需要进一步通过实验台方法来检测来自“阵列一”的所述阳性小室的内含物，而不是通过另一次微流体检测。实验台方法包括，例如，RT-PCR与第二代测序。
[0216] 对于本发明所描述的所述单细胞与多细胞微流体检测，本发明提到一“小室”，其中的一细胞群可选地包含一种或多种效应细胞，被检测是否具有一胞外效应，例如，一功能效应或一结合效应。然而，本领域技术人员为认识到本发明提供的装置提供了一大规模平行的系统，其包括了成千上万间小室，并且检测分析在一台装置上的全部或绝大部分小室中，或在一亚阵列的全部小室中对多种单个细胞群进行，所述多种单个细胞群可选地包含一种或多种效应细胞。由于某些效应细胞非常稀少，在存在于一间微流体小室中时并非所有细胞群都会包含一效应细胞。用以单独或一起处理多间小室的流体的构造，如多路复用器，如下所述。
[0217] 本发明所提供的部分实施方案提供以下特征中的一种或多种：
[0218] 能加载或浓缩一包含一种或多种效应细胞的细胞群到一间微流体小室内，所述小室具有小体积以检测所述效应细胞产物，并能在所述小室内共定位一读出颗粒(读出小珠、读出细胞等)，所述读出颗粒用于检测一单个的效应细胞的产物(例如，分泌的蛋白)，其具有所需要的特性。
[0219] 能维持一细胞群的活力和/或生长，通过本发明所描述的等渗浴进行辅助，以及在培养基的浓度为以前所报道过的用传统的培养方法或用以前描述过的微流体装置导致的细胞存活和生长较差的浓度时能交换单个细胞周围的培养基。
[0220] 能在一间小室中在一段时间内浓缩效应细胞产物，这段时间内在所述效应细胞分别在所在的微流体小室状态变差或生长超出之前，足够对一所需要的效应细胞产物的特性进行测量。
[0221] 能选择性地交换培养基成分或向细胞团添加检测试剂，同时在所述微流体小室内维持细胞群。
[0223] 能将回收到的细胞群转移到另一通量较低的筛选中，使来自所述异质性细胞群中，或来自一克隆中，或来自多个产生于所述异质性细胞群中每种单个细胞的多个克隆中的每种单个细胞的一效应细胞产物能够得以分析。
[0224] 能直接分析来源于回收的单细胞的异质性细胞群的聚集的遗传物质，然后使用这些信息或遗传物质来鉴定与所关注的细胞相关的基因。、
[0225] 在一些实施方案中，提供了一种富集表现出一胞外效应的效应细胞的方法，所述效应细胞来自于一包含一种或多种表现出所述胞外效应的效应细胞的起始细胞群。在一实施方案中，所述方法包括在多个微流体小室内截留所述起始细胞群，以获取多个细胞亚群。每个小室的平均效应细胞数大于Y，所述群中的细胞总数大于X，且群中期望的效应细胞所占的部分为1/X。对所述微流体小室内的细胞亚群进行一胞外效应检测以鉴定出一个或多个包含一种或多种表现出所述胞外效应的效应细胞的小室。基于所述胞外效应检测的结果，一个或多个小室随后被鉴定为包含一种或多种表现出所述胞外效应的效应细胞。所述鉴定到的小室的内含物随后被回收以提供一富集的细胞群。所述针对所述效应细胞进行了富集的细胞群所含有的效应细胞的部分为1/Y。在一进一步的实施方案中，1/X少于0.05，或少于0.01，或少于0.001。 所述胞外效应可以是一种或多种本发明所描述的胞外效应。在一实施方案中，所述起始细胞群是周边血单核细胞(PBMCs)，分离自一经过免疫或已经接触过一抗原的动物。在另一实施方案中，所述起始细胞群是一群B细胞，分离自一经过免疫或已经接触过一抗原的动物。而在另一实施方案中，所述起始细胞群的来源是来自一经过免疫或已经接触过一抗原的动物的全血。
[0226] 如本发明所提供，在一方面，本发明所述装置与方法被用于检测一可选地包含一种或多种效应细胞的细胞群是否存在一胞外效应。在另一方面，本发明所提供的装置与方法可以鉴定与其他细胞群相比在一胞外效应上表现出变化的一细胞群。在这一方面，多个单个的细胞群被截留在分隔的微流体小室中，其中所述单个的细胞群中的至少一包含一种或多种效应细胞，并且所述分隔的微流体小室进一步包含一包含一种或多种读出颗粒的读出颗粒群。对所述细胞群进行检测以发现是否存在所述胞外效应，其中所述读出颗粒群或其亚群提供所述胞外效应的一读出结果。随后一来自于所述多个细胞群中的细胞群可被鉴定为与所述多个细胞群中剩余的一种或多种细胞群相比在所述胞外效应上表现出变化。一旦一细胞群被鉴定为在所述胞外效应上表现出变化，即对所述细胞群进行回收并可在有限的稀释度下进行进一步检测以鉴定所述群内的对所述胞外效应负责的一种或多种细胞。
[0227] 本发明中可以被分析的细胞群不局限于某一特定的类型。例如，在一实施方案中在微型反应器内被分为多个单个细胞群的一起始细胞群可以是分离自一经过免疫或已经接触过一抗原的动物的周边血单核细胞(PBMCs)。在另一实施方案中，所述起始细胞群是分离自一经过免疫或已经接触过一抗原的动物的B细胞。所述起始细胞的来源可以是来自于所述经过免疫或已经接触过一抗原的动物的全血。
[0228] 本发明所用到的一“效应细胞”指一能够施加一胞外效应的细胞。所述胞外效应是作用在一读出颗粒上的直接或间接的效应，如下详述。所述胞外效应归因于所述效应细胞，或由所述效应细胞分泌的一分子，例如，一信号传导分子、代谢产物、一抗体、神经递质、激素、酶、细胞因子。在一实施 方案中，所述效应细胞是一分泌或展示一蛋白(例如，T细胞受体)的细胞。在本发明所描述的实施方案中，所述胞外效应通过使用一读出颗粒来阐明，例如，一读出细胞或一读出小珠，或一读出颗粒群或亚群。例如，在本发明所描述的一实施方案中，所述胞外效应是一存在于一读出细胞或读出小珠上的细胞表面受体、离子通道或ATP结合框(ABC)转运蛋白的激活或拮抗。在一实施方案中，所述效应细胞是一抗体分泌细胞(ASC)。本发明所用到的一ASC指任何产生并分泌一抗体的细胞类型。浆细胞(也被称为“浆B细胞”，“组织浆细胞”和“效应B细胞”)是终端分化的细胞，并且是一类ASC。其他为本发明的目的可以被看作是“效应细胞”的其他ASC包括浆母细胞、通过记忆B细胞的扩增产生的细胞、表达重组单克隆抗体的细胞系、杂交瘤细胞系。在另一实施方案中，所述效应细胞是一分泌一蛋白的细胞。其他能够被看作效应细胞的细胞类型包括T细胞(例如，CD8+T细胞，以及CD4+T细胞)、造血细胞、衍生自人或动物的细胞系、重组细胞系，例如，一工程化的产生抗体的重组细胞系、一工程化的表达一T细胞受体的重组细胞系。
[0229] 单个的、可选地包含一种或多种效应细胞的细胞群通过检测来测定所述各个细胞群与另一单个或其中的多个细胞群相比是否包含表现出一胞外效应，或在胞外效应上表现出变化的一效应细胞。如上所述，当细胞群在一装置上进行平行检测时，并非全部细胞群都会包含一效应细胞，并且本发明所述描述的方法可以鉴定一含有一种或多种效应细胞的细胞群。此外，一包含有一效应细胞的细胞群不需要包括多种效应细胞，也不需要一定仅仅是效应细胞的群。相反地，在本发明所描述的一实施方案中，非效应细胞被包含在所述群中。所述非效应细胞可以是所述群中的大部分或小部分。一包含一效应细胞的异质性群不需要包括多种效应细胞。相反地，一异质性细胞群只要两个细胞相互异质，就是异质性的。一细胞群可以包含零种效应细胞、一种效应细胞或多种效应细胞。类似地，一细胞亚群可以包含零种效应细胞、一种效应细胞或多种效应细胞。
[0230] 所述胞外效应在一实施方案中是与一抗原的结合相互作用，或一功能效应。例如，在一实施方案中，所述胞外效应是一细胞表面受体的激活或拮抗、一离子通道的激活或拮抗或一ABC转运蛋白的激活或拮抗、凋亡的调控、细胞增殖的调控、一读出颗粒的形态表现的改变、一读出颗粒内部一蛋白质定位的改变、一读出颗粒表达一蛋白、一辅助颗粒的生物学活性的中和、由一效应细胞诱导的一读出细胞的细胞裂解、由所述效应细胞诱导的一读出细胞的细胞凋亡、所述读出细胞的细胞坏死、一读出细胞对一抗体的内化、一读出细胞对一辅助颗粒的内化、所述效应细胞对酶活的中和，一可溶解的信号传导分子的中和，或其中的一组合。
[0231] 分泌一结合于所关注靶标的一生物分子(例如，抗体)的效应细胞的存在和鉴定在一些实施方案中很快即可确证，在这些实施方案中所述效应细胞存在于一包含多种分泌抗体的效应细胞的异质性细胞群中，所分泌的抗体对所关注靶标并不是特异性的。在一实施方案中，这在一间单个的微流体小室内通过如下操作来实现：首先在所述小室内在一种或多种读出颗粒(例如，小珠)上捕获全部或绝大部分所述群分泌的抗体，所述一种或多种读出颗粒已功能化用于捕获抗体(例如，用蛋白G或蛋白A功能化)，将荧光标记的抗原添加到所述小室内并对所述颗粒成像以探测抗原结合到固定化的抗体所引起的荧光的增强是否发生。可靠的检测需要对被捕获到小珠上的抗体的最小数量的作出估计，这可通过进行实验测量单细胞的抗体分泌来获得。在一实施方案中，可以检测到分泌自大约500个细胞的一异质性细胞群中的一单细胞分泌的抗原特异性抗体。在本发明的情况下，存在与一间单个微流体小室内的一细胞群可包含约2个到约500个细胞，例如，约2个到约250个ASC。如上所述，一细胞群可包括不是效应细胞的细胞，并且并非所有细胞群都会包括一效应细胞。在传统的富集方法(例如，FACS)不能被用来获取一大体上纯的相同细胞类型的细胞群时尤其如此。
[0232] 对于一异质性细胞群而言，并非要求其中的所有细胞都相互间异质，只要在所述群中至少有两个细胞相互异质即可，例如，一效应细胞与一非效应 细胞。一异质性细胞群由少至两个细胞组成。一细胞群或细胞亚群可由一单细胞组成。原则上，一异质性细胞群可包括任何数量的在要求的所述胞外效应检测的期间能够被维持在活力状态的细胞，例如，本发明所提供的胞外效应检测中的一种。在一实施方案中，一细胞群中的细胞数为从1个细胞到约500个细胞每间小室。在一实施方案中，要求对单个细胞或读出颗粒成像时，所选择的一群中的细胞数要不能覆盖所述小室的底板，这样所成像的细胞可以排列成一单层。可选择地，所述细胞群包括一定数量的不足以形成双层来覆盖所述小室表面的细胞。
[0233] 在一些实施方案中，在一单个的微流体小室或微型反应器内的一细胞群内可以存在更大的细胞群而不会抑制源自所述特定的群内的一单个的效应细胞或少量效应细胞的一效应被检测到。例如，在一实施方案中，一细胞群内的细胞数从2到约900，或从约10到约900，或从约100到约900。在另一实施方案中，一细胞群内的细胞数从2到约800，或从约10到约800，或从约100到约800。在另一实施方案中，一细胞群内的细胞数从2到约700，或从约10到约700，或从约100到约700。在另一实施方案中，一细胞群内的细胞数从2到约600，或从约
10到约600，或从约100到约600。在另一实施方案中，一细胞群内的细胞数从2到约500，或从约10到约500，或从约100到约500。在另一实施方案中，一细胞群内的细胞数从2到约400，或从约10到约400，或从约100到约400。在另一实施方案中，一细胞群内的细胞数从2到约300，或从约10到约300，或从约100到约300。在另一实施方案中，一细胞群内的细胞数从2到约
200，或从约10到约200，或从约100到约200。在另一实施方案中，一细胞群内的细胞数从2到约100，或从约10到约100，或从约50到约100。在另一实施方案中，一细胞群内的细胞数从2到约90，或从约10到约90，或从约50到约90。而在另一实施方案中，一细胞群内的细胞数从2到约80，或从10到约80，或从2到约70，或从10到约70，或从2到约60，或从10到约60，或从2到约50，或从10到约50，或从2到约40，或从10到约40，或从2到约30，或从10 到约20，或从2到约10。在一些实施方案中，一细胞群内的大多数细胞是效应细胞。
10到约600，或从约100到约600。在另一实施方案中，一细胞群内的细胞数从2到约500，或从约10到约500，或从约100到约500。在另一实施方案中，一细胞群内的细胞数从2到约400，或从约10到约400，或从约100到约400。在另一实施方案中，一细胞群内的细胞数从2到约300，或从约10到约300，或从约100到约300。在另一实施方案中，一细胞群内的细胞数从2到约
200，或从约10到约200，或从约100到约200。在另一实施方案中，一细胞群内的细胞数从2到约100，或从约10到约100，或从约50到约100。在另一实施方案中，一细胞群内的细胞数从2到约90，或从约10到约90，或从约50到约90。而在另一实施方案中，一细胞群内的细胞数从2到约80，或从10到约80，或从2到约70，或从10到约70，或从2到约60，或从10到约60，或从2到约50，或从10到约50，或从2到约40，或从10到约40，或从2到约30，或从10 到约20，或从2到约10。在一些实施方案中，一细胞群内的大多数细胞是效应细胞。
[0234] 在本发明的一方面，一被本发明所提供的方法所分析的细胞或细胞群包含一种或多种效应细胞，例如，一抗体分泌细胞(ASC)或多种ASC。在一实施方案中，细胞被分开到几千个微流体小室中的多个细胞群中，并且单个的包含一种或多种效应细胞的细胞群(例如，在单间微流体小室内)被检测是否具有一胞外效应。一个或多个单个的细胞群被鉴定并回收，如果在所述一个或多个群中的一效应细胞表现出所述胞外效应或在一胞外效应上的变化。所述胞外效应由使用者测定，并且在一实施方案中，是与一抗原、细胞表面受体、ABC转运蛋白或一离子通道的一结合相互作用。
[0235] 尽管本发明提供的方法基于一结合相互作用，例如，抗原亲和性和特异性，可用于鉴定一单个的效应细胞(单独存在或存在于一异质性的群中)，本发明并不限制于此。相反地，在一实施方案中，一细胞群的鉴定通过一直接的功能检测来进行。相应地，本发明的一方面包括了方法和装置，其能够直接在一分泌一“功能性抗体”的细胞群发掘一ASC，而无需在起始筛选所述“功能性抗体”是否具有结合特性，如对一抗原靶标的亲和性和选择性。
[0236] 沿这些路线，在一方面，提供了可通过本发明的所述方法发现的功能性抗体和受体。在这方面的一实施方案中，对一胞外效应细胞负责的一效应细胞的核酸被扩增并测序。所述核酸是一编码分泌一生物分子(例如，抗体，或其片段)的基因，或一编码一细胞受体或其片段的基因，例如，一T细胞受体。所述抗体或其片段或细胞受体或其片段可通过本领域已知的方法被克隆和/或测序。例如，在一实施方案中，一可通过本发明所提供的方法和装置被发现的分泌一功能性抗体的ASC是通过结合到所靶向的细胞表面的蛋白来调控细胞信号传导的，所述所靶向的细胞表面的蛋白是诸如一离子通道受体、ABC转运蛋白、一G蛋白偶联受体(GPCR)、一受体酪氨酸激酶(RTK)或一内在具有酶活性的受体如内在的鸟苷酸环化酶活性。
[0237] 在本发明的一方面，一包含一种或多种效应细胞的细胞群在一微型反应 器，例如，微流体小室中，基于在所述小室中进行的一胞外效应检测的结果得以鉴定。如果在所述微型反应器内测到一胞外效应或胞外效应的变化，所述细胞群被回收并分析以测定所述效应细胞或存在于对所述效应负责的群中的效应细胞(例如，见图2)。在所述效应细胞分泌抗体的实施方案中，编码所述产生自一种或多种ASC的抗体的DNA序列随后可被测定并紧接着进行测序。在一实施方案中，所述抗体DNA序列被克隆并表达与细胞系中以提供单克隆抗体的永生化的来源，用于进一步的验证与临床前测试。
[0238] 如本发明所述，一异质性细胞群典型地包括的群中的细胞数从2到约1000，或从2到约500，或从2到约250，或从2到约100.。一异质性细胞群所描述的一群细胞包含至少两个在基因型、蛋白质表达、mRNA表达、或分化状态上具有本质上区别的细胞，其中至少一个是一效应细胞。特别地，一异质性细胞群，在一实施方案中，包括两个或多个效应细胞(例如，从约个到约250个细胞)，所述效应细胞包含或表达不同的免疫球蛋白基因、包含或表达不同的衍生自免疫球蛋白基因的基因、包含或表达不同的衍生自T细胞受体基因的基因、分泌不同的免疫球蛋白、分泌不同的衍生自免疫球蛋白的蛋白、分泌或表达不同的衍生自T细胞受体蛋白的蛋白。
[0239] 在一实施方案中，一细胞群包含一群基因工程化的表达可结合一种靶标表位的分子文库的细胞、基因工程化的表达基因或衍生自关注的cDNA文库的基因片段的细胞、用报告各种生物学功能的报告分子基因工程化的细胞以及衍生自永生化系或原代来源的细胞。值得注意的是，来源自一单细胞的克隆，在一实施方案中，相互之间是异质性的，由于例如，基因沉默、分化、基因表达改变、形态改变等。此外，衍生自永生化系或原代来源的细胞不是一单细胞完全相同的克隆，并被认为是相互之间是异质性的。相反地，一克隆细胞群起源自一单细胞，并且未经过遗传修饰、RNA转导、DNA转导、病毒感染、分化，或其他意在使所述细胞显著地在功能上或分子上不同的其他操作。但是，衍生自一单细胞的多个细胞，如果自然经历了体细胞高频突变或通过工程化经历了体细胞高频突变(例如，通过诱导活化诱导的胞嘧啶 脱氨酶的表达等)，就不被认为是克隆，因此这些细胞当一起存在时，被认为是一异质性细胞群。
[0240] 如全文所提供，在一方面，方法与设备被提供用于检测多种单个细胞群，其中每个细胞群可选地包含一种或多种效应细胞，目的在于鉴定到一个或多个细胞群，所述细胞群包括至少一具有一胞外效应的效应细胞，所述胞外效应体现在一读出颗粒群或其亚群上，例如，分泌一具有所需要的特性的生物分子。在一实施方案中，一旦所述细胞群被鉴定，即对其进行选择性回收以获得一回收细胞群。在一实施方案中，如果鉴定到多个细胞群，则将其回收并汇总，的到一回收细胞群。所述回收细胞群与所述起初加载到所述装置上的起始细胞群相比富集了效应细胞，因为前者与后者相比效应细胞的百分比更大。
[0241] 通过对所述回收细胞群的亚群进行检测来发现另一胞外效应是否存在于一读出颗粒群上，其中所述读出颗粒群或其亚群提供所述另一胞外效应的一读出结果。所述胞外效应可以是所述鉴定到的细胞群上的已经检测过的同样的胞外效应，或一不同的胞外效应。在一进一步的实施方案中，所述鉴定到的群中的每个亚群包含约1个到约10个细胞。在一更进一步的实施方案中，所述鉴定到的群的每个亚群平均包含1个细胞。一个或多个展示出所述胞外效应的亚群随后被鉴定并回收以获得一回收细胞亚群，其在一实施方案中富集有效应细胞。如果多个细胞亚群在一实施方案中得到鉴定，对它们进行回收和汇总以获得一回收细胞亚群。所述回收细胞亚群的遗传信息可被分离、扩增和/或测序。
[0242] 本发明不限于能够通过根据本发明所述方法得以检测的效应细胞或细胞群的类型。可用于本发明的效应细胞的类型的实例如上所提供，包括来自任何物种的原代抗体分泌细胞(例如，人、小鼠、兔等)、原代记忆细胞(例如，可检测IgG、IgM、IgD或其他展示于细胞表面的免疫球蛋白或扩增/增殖成浆细胞)、T细胞、选择后或直接在融合后的杂交瘤融合体、一转染(稳定或瞬时)有一个或多个单克隆抗体(mAbs)库的细胞系(例如，通过Fab 区域突变体文库使一鉴定到的mAb的亲和力成熟，或通过鉴定到的具有Fc区域突变的mAb的效应功能最优化，或转染有扩增自HC/LC可变区的重链(HC)和轻链(LC)组合的细胞系，其中所述HC/LC可变区获取自一人/动物/文库或表达mAb的细胞组合(属性阐明或为阐明以寻找协同效应等))。
[0243] 浆细胞(也被称为浆B细胞、“组织浆细胞”和“效应B细胞”是终端分化的细胞，并且是一类可通过本发明的所述装置和方法进行检测的ASC。其他为本发明的目的可以被看作是“效应细胞”的其他ASC包括浆母细胞、通过记忆B细胞的扩增产生的细胞、表达重组单克隆抗体的细胞系、分泌细胞因子的原代造血细胞、T细胞(例如，CD8+T细胞，以及CD4+T细胞)、在其表面展示蛋白或多肽的树突状细胞、分泌蛋白的重组细胞系、杂交瘤细胞系、一工程化的产生抗体的重组细胞系、一工程化的表达一T细胞受体的重组细胞系。
[0244] 应了解用于本发明的所述细胞群不限于来源，相反地，它们可衍生自任何动物，包括人或其他哺乳动物，或可选择地，来自体外组织培养。细胞可直接进行分析，例如，在从收集自某一来源后直接分析，或在富集到一具有所需要的特性(如分泌结合到一特定抗原的抗体)的细胞群后再进行分析，所述富集通过本领域已知的各种方法进行，例如，流式细胞术。在一实施方案中，在从一动物来源收集之前，所述动物进行一次或多次免疫。在一实施方案中，在加样到本发明所提供的装置中的一种上以前，先用流式细胞术富集效应细胞，并且所述流式细胞术是荧光活化细胞分选(FACS)。当所用的起始细胞群已经进行过效应细胞，例如，ASC的富集，并且作为单个的细胞群被保留在单个的微流体小室内的时候，所述单个的细胞群不需要完全由效应细胞构成。相反地，其他细胞类型可以作为大部分或小部分存在。此外，一个或多个所述单个细胞群可以包含零个效应细胞。
[0245] 已有几种本领域技术人员已知的富集衍生自动物的ASC的方法，可用本发明所提供的所述方法和装置进行分析以富集一起始细胞群。例如，在一实施方案中，通过利用表面分子标记CD19+CD20lowCD27hiCD38hi，FACS被 用于富集人ASC(Smith等人(2009).Nature Protocols 4,pp.372-384,全文纳入本申请以供参考)。在另一实施方案中，一细胞群通过基于对展示表面分子标记的细胞的阳性或阴性选择的磁性免疫捕获法被富集。在另一实施方案中，在进行本发明所提供的方法中的一种之前或在加载一起始细胞群到本发明所提供的装置中的一种上之前，一噬菌斑检测(Jerne等人(1963).Science 140,p.405，全文纳入本申请以供参考)、ELISPOT检测(Czerkinsky等人(1983).J.Immunol.Methods 65,pp.109-121，全文纳入本申请以供参考)、液滴检测(Powel等人(1990).Bio/Technology 8,pp.333-
337，全文纳入本申请以供参考)、细胞表面荧光偶联免疫吸附检测(Yoshimoto等人(2013),Scientific Reports,3,1191，全文纳入本申请以供参考)或一细胞表面亲和基质检测(Manz等人(1995).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92,pp.1921-1925，全文纳入本申请以供参考)被用于富集ASC。
337，全文纳入本申请以供参考)、细胞表面荧光偶联免疫吸附检测(Yoshimoto等人(2013),Scientific Reports,3,1191，全文纳入本申请以供参考)或一细胞表面亲和基质检测(Manz等人(1995).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92,pp.1921-1925，全文纳入本申请以供参考)被用于富集ASC。
[0246] 在多个实施方案中，一细胞群内的两个或多个效应细胞产生并分泌细胞产物，例如，对一读出颗粒群或其亚群具有直接或间接效应的抗体。对于本发明所提供的装置，需要注意的是并非所有装置上的小室都一定要包括一细胞群和/或一读出细胞群，例如，空置的小室或部分填充的的小室也可以存在。此外，如全文所提供，在一单个的小室内可以仅仅是所述细胞群内的细胞的子群，或一产生并分泌抗体的群内的一单个的细胞。在一些实施方案中，所述微流体小室内的细胞群不包含一效应细胞。这些小室通过对每个细胞群进行一种或多种胞外效应检测可以被鉴定发现。
[0247] 在部分实施方案，要求有一种或多种辅助颗粒，可以在所述微型反应器，例如，微流体小室内包括一种或多种辅助细胞，以支持所述细胞群中的一种或多种细胞的活力和/或功能，或实施一种胞外效应检测。例如，在一实施方案中，一辅助细胞，或多种辅助细胞包含一成纤维细胞、自然杀伤(NK)细胞、杀伤T细胞、抗原提呈细胞、树突状细胞、重组细胞或一上述细胞中的组合。
[0248] 一辅助颗粒或细胞，或一包含同样的辅助颗粒或细胞的群，在一实施方 案中，与所述细胞群一起被投放到微型反应容器，例如，微流体小室内。换言之，在一实施方案中辅助细胞是投放到微流体小室中的细胞群的一部分。可选择地或可附加地，所述一种或多种辅助颗粒或辅助细胞被加载于载有一效应细胞或多种效应细胞的异质性细胞群的、所述一种或多种微型反应器(例如，单个或多个微流体小室)的之前或之后的一间小室。
[0249] 着本发明所指的“辅助颗粒”意味这任何颗粒，包括但不限于一蛋白、蛋白片段、具有以下功能的细胞：(i)支持一效应细胞的活力和/功能；(ii)促进一胞外效应；(iii)促进一胞外效应的测量；或(iv)检测一效应细胞的一胞外效应。
[0250] 辅助颗粒包括但不限于蛋白、多肽、生长因子、细胞因子、神经递质、脂、磷脂、碳水化合物、代谢产物、信号传导分子、氨基酸、一元胺、糖蛋白、激素、病毒颗粒或以上所述当中的组合。在一实施方案中，一种或多种辅助颗粒包含1-磷酸鞘氨醇、溶血磷脂酸或其组合。
[0251] 在一实施方案中，作为一辅助细胞的实例，一群成纤维细胞(不分泌抗体)被包括在一富集了效应细胞(例如，ASC)的细胞群内以提高所述效应细胞(例如，ASC)的活力。在另一实施方案中，一群NK细胞可被作为辅助细胞添加以实施一依赖抗体的细胞介导的细胞毒性检测，其中所述NK细胞在表面结合一抗体时会攻击并裂解所述靶细胞。在功能性细胞检测在一种或多种细胞群中进行的实施方案中，应了解所述一种或多种细胞群内的效应细胞在所述微流控装置的一间小室中在一段较长的时间内需要保持存活。未达到此目的，在一实施方案中，辅助颗粒和/或辅助细胞被用于维持所述细胞群的活力，所述细胞群可选地包含一种或多种效应细胞。如下所解释，还可使用辅助颗粒，例如，辅助细胞来维持或提高一读出细胞群或其亚群的活力，所述读出细胞群或其亚群可以是一单个读出细胞。
[0252] 本发明所描述的实施方案的一优点是在单个微型反应器(例如，微流体小室)内对超过一效应细胞的分析，和/或在其他细胞存在时对单个或几个效应细胞的分析使检测的通量大大提高，因此鉴定并且筛选到了所要求的效应 细胞，而这些效应细胞通过其他方法会因为太稀少而不能有效地检测。在很多情况下富集所要求的细胞类型的方法有限，或这种富集具有有害的效应如降低了所检测细胞的活力，在这些情况下本发明具有优势。本发明的一已经构建的实施方案以3500间细胞分析小室阵列为特点。当这个装置以平均每间小室30个细胞进行操作时，总的检测通量为每次实验105,000个细胞。这一通量可用于筛选成千上万个占所述总细胞群少于，例如，1％的效应细胞。
[0253] 例如，抗体分泌细胞无需通过基于表面分子标记的富集即可被鉴定并分离得到。在分离自免疫后的周边血单核细胞(PBMCs)，ASC的频率可能在0.01％到1％之间。以装置每次运行筛选105,000个细胞的通量可以不经过进一步纯化直接就筛选到几百个ASC。由于FACS纯化ASC可能降低细胞活力，这一点尤其重要。这一点因为可能无法获得富集所关注宿主物种ASC的试剂也同样重要。的确，在经过免疫后，在周边血单核细胞(PBMCs)中的抗体分泌细胞的频率可达到0.1％待1％之间，并因此可通过本发明所提供的微流体阵列被检测到，例如，一3500间小室的微流体阵列，以每间小室30个细胞的平均密度进行加样。这样，由于分离周边血单核细胞(PBMCs)可在任何物种上无需特定的捕获试剂即可操作，部分现有的方法即可用来快速并经济地从任何物种中筛选分泌所关注抗体的细胞。
[0254] 在一实施方案中，来自人的基准水平的ASC通过本发明所提供的所述方法和装置得以鉴定。虽然动物可通过免疫来产生针对大多数抗原的新的抗体，这一同样的操作不能在人身上广泛采用，除非是批准的疫苗。然而，已经天然地与一抗原接触过，或在其整个生命期的某个时间点接种过疫苗的人，典型地，具有较低水平的针对所述抗原的抗体分泌细胞。本发明可被用于从大量的细胞中(例如，每次装置运行超过100,000个细胞)鉴定并分离极端稀少的分泌特异性抗体的效应细胞。这些方法在本发明中被用于发现功能性抗体，例如，作为自我免疫疾病和癌症的治疗药物，其中可能存在自身抗体。
[0255] 如全文所提供，本发明部分涉及在单个微流体小室内以大规模平行的方式进行胞外效应检测。进行所述检测以测量并检测通过一种或多种存在与一 细胞群内的效应细胞所施加的胞外效应。一读出颗粒群或其亚群提供所述胞外效应的一读出结果。例如，本发明所描述的方法可以含有在高达250个不施加所述胞外效应的细胞的背景下鉴定一包含一施加所述胞外效应的效应细胞的异质性细胞群，例如，分泌对一所需要的抗原特异性的一抗体。
[0256] 本发明所用到的“读出颗粒”意指任何颗粒，包括一小珠或细胞，例如，一功能化的小珠或一细胞，这种细胞报告一功能或特性或被用于一检测以测定一效应细胞的一胞外效应(例如，功能或特性)，或一效应细胞的一产物如一抗体。如本发明所述，一“读出颗粒”在一单个的微流体小室内可以作为一单个的读出颗粒存在或存在于一同质性或异质性的读出颗粒群中。在一实施方案中，一读出颗粒是一功能化的小珠结合一种或多种分泌自一效应细胞的或裂解后释放自一效应细胞或辅助细胞的生物分子(例如，一种或多种抗体)。一单个的读出颗粒可以被功能化以捕获一种或多种不同类型的生物分子，例如一种蛋白和/或核酸，或一种或多种不同的单克隆抗体。在一实施方案中，所述读出颗粒是一小珠或一细胞，所述细胞能够结合产生自一产生和/或分泌抗体的效应细胞的抗体。在一些实施方案中，一效应细胞也可以是一读出颗粒，例如，当一群内的一效应细胞的分泌产物对一更大的，或不同的所述效应细胞的亚群具有一效应时，或，可选择地，当一效应细胞的分泌产物被同样的细胞所捕获以读出捕获物的读出结果时。
[0257] 本发明所用到的一“读出细胞“是一类读出颗粒，当一单细胞或一含有一或多种效应细胞，例如，一或多种分泌抗体的效应细胞的细胞群存在时会表现出应答。在多个实施方案中，所述读出细胞是一展示出对一分泌的分子具有特异性的一表面抗原或受体(GPCR或RTK)的细胞。在一实施方案中，所述分泌的分子结合到一读出细胞上就是所述胞外效应。所述读出细胞可以通过荧光标记和/或具有荧光报告分子在结合时被激活。
[0258] 如上所述，在一些实施方案中，一依照本发明所描述的方法的细胞群包含一种ASC或多种ASC，并且所述读出颗粒群或其亚群展示出一种或多种靶标表位。所述读出颗粒群在一实施方案中是一群功能化的小珠，通过一特 定的表位或多种表位来捕获抗体。可选择地或附加地，所述读出颗粒群对一抗体的Fc区域具有特异性，因此对具有不同表位的抗体之间不加区分。所述读出颗粒群或其亚群，在一实施方案中，被荧光偶联的含有所述靶标表位的分子标记用以进行，例如一ELISA检测。基于荧光的抗体和细胞因子小珠检测为本领域已知，见，例如Singhal等人(2010).Anal.Chem.82,pp.8671-8679, Assays(Life Technologies),BDTM Cytometric Bead Array，所公开的内容为本发明所全文采纳以供参考。这些方法可用于本发明以测定一效应细胞是否在一读出颗粒上具有一胞外效应。
[0259] 此外，如本发明所述，构建了单个的微型反应器(例如，微流体小室)使试剂交换在所述单个的小室内称为可能，而小室之间的交叉污染被消除或基本上消除。这使得在一单间小室内检测多种胞外效应称为可能，例如，在一单间小室内的多种抗原结合效应和/或功能效应，例如，通过交换抗原及二抗来分别标记各个结合复合物，随后进行成像。在这些连续的检测实施方案中，所述检测可以用相同的荧光基团进行，每步反应在一步洗涤步骤后连续地进行。可选择地，不同的荧光基团可以以连续或平行的方式在一微型反应器内被用于检测不同的胞外效应。
[0260] 在另一实施方案中，所述读出颗粒群是一读出细胞群，其中至少部分所述读出细胞在其表面展示出一靶标表位。在一实施方案中，所述读出颗粒群或其一亚群是存活的并具有活力的。在另一实施方案中，所述读出细胞群或其一亚群是固定的。如上述讨论中所承认，当检测抗体结合时，“抗体结合”即被认为是一种或多种效应细胞的所述胞外效应。抗体结合可通过，例如用一种或多种荧光标记的二抗对所述细胞进行染色被检测到。在另一实施方案中，一抗体结合到一读出颗粒或读出细胞的所述靶标表位上导致一读出细胞的死亡，或某些其他读出细胞的应答，如本发明所讨论(例如，分泌的生物分子，一条细胞信号传导通路的激活或抑制)。
[0261] 一群中的读出细胞可通过，例如诸如形态、大小、表面粘附性、运动性、荧光应答之类的特点进行区分。例如，在一实施方案中，一读出细胞群在其 表面，或细胞内进行了标记以测定所述读出细胞是否表现出一如检测的使用者所选择的应答。例如，一钙黄绿素、羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)报告分子、GFP/YFP/RFP报告分子可被用于标记一种或多种报告细胞，包括胞外受体和胞内蛋白即其他生物分子。
[0262] 在一些实施方案中，所述读出颗粒群是一异质性的读出颗粒群，其可以是一异质性的读出细胞群。例如，当一种或多种ASC存在于一细胞群内时，所述群内的单个的读出颗粒可以展示出不同的靶标表位，或展示出两种不同的细胞受体(例如，一GPCR或RTK或其组合)。相应地，所述胞外效应的特异性，例如，对一靶标表位的抗体的特异性，或一特异性的细胞表面受体的抑制，可以进行评测。在另一实施防范中，在一细胞群内的一效应细胞是一ASC，并且所述读出颗粒群包含一异质性的小珠群，其非选择姓地捕获所有抗体(例如，Fc区域特异性)，以及一对一独特的靶标抗原具有特异性的小珠群。
[0263] 在一实施方案中，提供了辅助颗粒以促进一胞外效应的测量，或促进一胞外效应的结果的读出。如全文所描述，一胞外效应包括通过一胞外细胞分泌产物(例如，抗体)表现出的一效应。例如，在一实施方案中，一天然杀伤(NK)细胞被提供作为一辅助颗粒以促进一读出细胞裂解后的测量。在这一实施方案中，所述胞外效应包括当一分泌自所述效应细胞的抗体结合到前述读出细胞上时，通过所述自然杀伤(NK)细胞裂解一结合到一特定的表位或细胞受体的读出细胞。
[0264] 在一些实施方案中，辅助颗粒包括蛋白、蛋白片段、肽、生长因子、细胞因子、神经递质(例如，神经调质或神经肽)、脂、磷脂、氨基酸、一元胺、糖蛋白、激素、病毒颗粒，或当一效应细胞分泌产物结合到一读出细胞上时一激活补体通路所需要的因子，以及上述中的一组合。在一实施方案中，一种或多种辅助颗粒是1-磷酸鞘氨醇、溶血磷脂酸或其组合。多种可通过本发明所提供的装置和方法可测量的胞外效应，包括结合所述抗体的所述读出细胞的裂解，在下文中作详细讨论。
[0265] 例如，可用作辅助颗粒的细胞因子包括趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子。在一些实施方案中所述辅助颗粒通过读出细胞产生。在一些实施方案中，一趋化因子被用作一辅助颗粒并且是如下表1所提供的细胞因子中的一种或多种。在另一实施方案中，一种或多种下述细胞因子被用作一辅助颗粒：白细胞介素(IL)-1α、IL-1β、IL-1RA、IL18、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-
14、IL-15、IL-16、IL17、IL-18、IL-19、IL-20、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白血病抑制因子、制瘤素M、干扰素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、CD154、淋巴毒素β(LTB)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF-β、转化生长因子(TGF)-β、促红细胞生成素、巨核细胞生长发育因子(MGDF)、Fms相关酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)、干细胞因子、集落刺激因子-1(CSF-1)、巨噬细胞刺激因子、4-1BB配体、诱导增殖配体(APRIL)、分化抗原簇
70(CD70)、分化抗原簇153(CD153)、分化抗原簇178(CD178)、糖皮质激素诱导的TNF受体配体(GITRL)、LIGHT(也被称为TNF配体超家族成员14、HVEM配体、CD258)、OX40L(也被称为CD252，是CD134的配体)、TALL-1、TNF相关诱导凋亡配体(TRAIL)、肿瘤坏死因子凋亡弱诱导分子(TWEAK)、TNF相关激活诱导细胞因子(TRANCE)或以上中的一组合。
14、IL-15、IL-16、IL17、IL-18、IL-19、IL-20、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白血病抑制因子、制瘤素M、干扰素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、CD154、淋巴毒素β(LTB)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF-β、转化生长因子(TGF)-β、促红细胞生成素、巨核细胞生长发育因子(MGDF)、Fms相关酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)、干细胞因子、集落刺激因子-1(CSF-1)、巨噬细胞刺激因子、4-1BB配体、诱导增殖配体(APRIL)、分化抗原簇
70(CD70)、分化抗原簇153(CD153)、分化抗原簇178(CD178)、糖皮质激素诱导的TNF受体配体(GITRL)、LIGHT(也被称为TNF配体超家族成员14、HVEM配体、CD258)、OX40L(也被称为CD252，是CD134的配体)、TALL-1、TNF相关诱导凋亡配体(TRAIL)、肿瘤坏死因子凋亡弱诱导分子(TWEAK)、TNF相关激活诱导细胞因子(TRANCE)或以上中的一组合。
[0266]
[0267]
[0268]
[0269]
[0270]
[0271] 在一实施方案中，一辅助颗粒是一细胞因子或其他可操控用以刺激所述读出细胞的一应答的其他因子。例如，读出细胞可以与一种或多种效应细胞一起孵育，然后用一可操控用以影响所述读出细胞的细胞因子脉冲刺激。可选择地或附加地，可操控分泌细胞因子的细胞以影响提供给所述小室作为辅助细胞的读出微粒。在一实施方案中，所述分泌的细胞因子被一效应细胞分泌产物所中和是通过所述读出细胞上所述细胞因子期望效果的缺失来检测的。在另一实施方案中，提供一辅助颗粒，所述辅助颗粒是一可操控的病毒，用以感染一种或多种读出细胞，并且所述病毒的中和通过被所述病毒感染的读出细胞的减少被检测到。
[0272] 值得注意地，并且通过上面提供的关于辅助颗粒的讨论也应该很明显，通过本发明提供的所述装置和方法所能够测量和检测的所述胞外效应不限于一抗体结合到一靶标表位。相反地，本发明所描述的一胞外效应，在一实 施方案中，是一功能效应。所述功能效应在一实施方案中是凋亡、细胞增殖的调控、所述读出颗粒形态表现的改变、多种读出颗粒聚集的改变、一蛋白在所述读出颗粒中定位的改变、所述读出颗粒对一蛋白的表达、所述读出颗粒对一蛋白的分泌、细胞信号传导级联放大的触发、一效应细胞分泌的分子被读出细胞内化、一可操控用以影响所述读出颗粒的辅助颗粒的中和。
[0273] 一旦一胞外效应在包含一细胞群的一微型反应器(例如，微流体小室)内被鉴定，所述群即被回收并对所述回收细胞群的亚群进行下游检测，以测定哪一种(几种)效应细胞对所测量到的胞外效应负责。所述下游检测在一实施方案中是一微流体检测。在一进一步的实施方案中，所述下游检测与第一次胞外效应检测在同样一装置上进行。然而，在另一实施方案中，所述下游检测在一不同的装置上进行，或通过非微流体方法，例如，一实验台上的单细胞逆转录(RT)PCR反应进行。鉴定到的和回收到的效应细胞的抗体基因序列在一实施方案中被分离、克隆并表达以提供新的功能性抗体。
[0274] 尽管单个ASC的功能性效应可通过本发明提供的所述方法和装置测量，亲和性，结合力与特异性也可以作为一效应细胞的“效应”被测量，例如，一效应细胞分泌产物的一效应。例如，Dierks等人(2009).Anal.Biochem.386,pp.30-35(全文纳入本申请以供参考)提供的结合检测可以被本发明所提供的装置用于测定一ASC是否分泌一结合于一特定靶标的抗体。
[0275] 在另一实施方案中，所述胞外效应是对于一抗原或细胞受体的亲和性，并且由Singhal等人(2010)Anal.Chem.82,pp.8671-8679(全文纳入本申请就各种目的作参考)提供的方法被用于检测所述胞外效应。
[0276] 在一实施方案中，多种胞外效应的平行分析在一微型反应器(例如，微流体小室)内通过采用多类读出颗粒进行。可选择地或附加地，多种功能效应的平行分析在单个微流体装置中通过在至少两间不同的小室内采用不同的读出颗粒进行。
[0277] 在一实施方案中，所述读出颗粒是一酶，其作为可溶性分子存在，或结合于所述微流体小室的表面或结合于另一在所述小室的读出区内的物理底 座。在这种情况下，一抗体的结合抑制所述读出颗粒的酶活性，在一实施方案中，通过报告所述酶活性的信号的减少来检测，包括一荧光信号或比色信号或沉淀反应。
[0278] 在多个实施方案中，测定一细胞群内的一效应细胞或多种效应细胞是否在一群读出颗粒或其亚群上具有一胞外效应牵涉到对所述包含所述细胞群的微流体小室进行可见光和/或荧光显微。相应地，本发明的一实施方案牵涉到在单个平面上维持所述读出颗粒群以便通过显微术促进所述颗粒的成像。在一实施方案中，在一间小室内的一读出颗粒群被维持在单个平面上，通过所述装置的材料或其一部分(例如，玻璃或PDMS)成像，以产生一张或多张所属小室的高分辨率图像。在一实施方案中，一张高分辨率图像是一张可以与通过标准显微操作所得到的图像相比较的图像，所述标准显微操作具有类似的光学设备(目镜和物镜，光源和反差机制等)。
[0279] 根据本发明的一方面，提供了一鉴定包含一种或多种在一胞外效应上表现出变化的效应细胞的一细胞群的方法。在一实施方案中，所述方法包括在分隔的微型反应器(例如，微流体小室)中保留多种单个的细胞群，其中至少一所述单个的细胞群包含一种或多种效应细胞，且所述分隔的微流体小室的内含物还包含一包含一种或多种读出颗粒的读出颗粒群。所述细胞群与所述读出颗粒群在所述微型反应器内孵育，然后检测所述细胞群是否存在所述胞外效应。所述读出颗粒群或其亚群提供一所述胞外效应的直接或间接的读出结果。基于所述检测的结果，可以测定一来自于多种包含一种或多种效应细胞的多个细胞群中的一细胞群是否表现出所述胞外效应。
[0280] 在一些实施方案中，一个或多个所述单个的细胞群和所述读出颗粒群被分别置于一微型反应器内的一“效应区”和“读出区”内。然而，本发明并不限于此。在一实施方案中，当采用了效应区与读出区时，每种区域基本上都是通过被置于其中的细胞的属性所定义的。即，所述一种或多种效应细胞被隔离到所述效应区，而所述一种或多种读出颗粒被隔离到所述读出区。所述效应区通过流体与所述读出区进行通信。相应地，在一些实施方案中，当 提供给一小室的一细胞群和读出颗粒密度较低时，例如，每间小室少于两个效应细胞和读出颗粒时，所述读出颗粒从一效应细胞的物理分离即已完成。然而要认识到，本发明无需一定在一间小室内不连续的区域内实施。通过本发明明显可见，这种分离对进行本发明所展示的所述胞外效应检测并非必需。
[0281] 所述细胞群和读出颗粒群能自发地装载于一微型反应器(如通过不同的进口或在一混合物中通过一单个的进口)。可选择地，所述效应细胞和读出颗粒连续地装载于一微型反应器(如，微流体小室)。本领域技术人员应理解，所述细胞群能在所述读出颗粒装载于所述小室之前或之后提供于一微型反应器。然而，可能所述读出颗粒群和细胞群作为一混合物被提供。
[0282] 本发明所公开的装置和方法为在多个细胞群上进行一种或多种胞外效应检测提供了有力的平台，例如，从在一胞外效应上展示出变化的多个细胞群中鉴定到一细胞群。所述变化可归因于所述细胞群内的一种或多种效应细胞。每个细胞群都被限制在一单间微流体小室内，并且一台装置的每间小室内所进行的所述效应细胞检测可以相同(例如，全部是细胞毒性检测，全部是结合检测等)或不同(例如，一是结合检测，一是凋亡检测)。所述装置上的特定小室的可行性，例如，含有不同的读出颗粒与进行细胞效应检测的试剂，使得多样的方法称为可能。
[0283] 本发明所述微流控装置包括多间小室，其中的每间都有能力容纳一细胞群与一读出颗粒群以测定所述细胞群内是否有任何效应细胞在一读出颗粒群或其亚群上展示出一胞外效应。一读出颗粒群可有一单个的读出颗粒组成。如下所提供，本发明所提供的装置被设计与建造用于在一装置上检测多个细胞群，例如，当几百到几千个细胞群在一装置上进行检测以鉴定到一个或多个在所述胞外效应上表现出变化的细胞群。至少所述细胞群中的一部分互相异质。所述变化，例如，是与所述多个细胞群中其他群所展示出的所述胞外效应相比的变化。例如，在一实施方案中，提供了一从多个细胞群中鉴定到一个或多个细胞群的方法，其中所述筛选到的细胞群与剩余的细胞群相比具有一胞外效应的变化。所述胞外效应的变化可以通过，例如，与所述剩余的 多个细胞群或其中一部分群相比荧光强度的不同来探测。
[0284] 根据本发明的一方面，提供了从多个在一胞外效应上表现出变化的一细胞群中鉴定到一细胞群的方法，其中所述胞外效应通过一种或多种分泌自一种或多种效应细胞的可溶因子结合到一读出颗粒群或其亚群上来诱导。所述读出颗粒群可以时一同质性或异质性群。在一实施方案中，本发明所提供的一方法牵涉到在一微流控装置的不同小室内保留单个的读出颗粒群。所分析的读出颗粒的数量可以不同，并根据与针对如前列举的细胞群的考虑相类似的考虑进行测定。
[0285] 一单个的读出颗粒群与细胞群被保留于本发明所提供的所述微流控装置的一单间小室内。可选地，所述小室基本上与所述微流控装置的其他也包含单个细胞群和一读出颗粒群的小室被隔离开，例如，以最大程度减少小室间的污染。然而，对实施本发明所提供的方法而言隔离并不是必要的。在一实施方案中，当需要隔离时，隔离包括液流的隔离，并且小室的液流隔离通过物理上密封小室，例如，通过使用阀环绕所述小室进行。然而，在另一实施方案中隔离不是通过物理上密封所述小室来实现，而是通过限制小室间的液流通信以排除所述微流控装置的一间小室与另一间小室之间的污染。
[0286] 一旦一间或多间小室被隔离，而所述小室每间包含一可选地含有一种或多种效应细胞与一读出颗粒群的细胞群，所述一间或多间小室特定地与所述一间(或多间小室)内的所述细胞群进行孵育。应当了解，在添加读出颗粒前，和/或在读出颗粒被添加到一间包含一细胞群的小室内以后，可以进行一步初始的孵育步骤。
[0287] 例如，一孵育步骤可以包括一培养基的交换，以保持所述细胞群健康，或一洗涤步骤。孵育还可以包括添加用于进行一胞外效应分析的辅助颗粒。
[0288] 一孵育步骤，在一实施方案中，包括控制所述小室的一种或多种特性，例如，湿度、温度、和/或pH值以维持细胞活力(效应细胞，辅助细胞或读出细胞)和/或维持所述小室内的一细胞的一种或多种功能属性，如分泌、表面分子标记表达、基因表达、信号传导机制等。在一实施方案中，一孵育步 骤包括使一灌注液流在整个所述小室内流动。所述灌注液流的选择取决于在所述特定的小室内效应细胞和/或读出细胞的类型。例如，在一实施方案中，一灌注液流被选来维持细胞活力，例如，补充耗竭的氧气或移除废产物，或被选来维持细胞状态，例如补充基本的细胞因子，或被选来辅助检测所需要的效应，例如，添加荧光检测试剂。灌注还可以被用于交换试剂，例如，以连续的方式检测多种胞外效应。
[0289] 在另一实施方案中，孵育一细胞群包括使一灌注液流在所述整个小室内流动以诱导一读出颗粒(例如，读出细胞)的一细胞应答。例如，所述孵育步骤在一实施方案中包括添加一含有信号传导细胞因子的液流至一间包含所述细胞群的小室内。所述孵育步骤可以是周期性的，连续的或其组合。例如，使一灌注液流在所述整个小室内流动是周期性的或连续的，或其组合。在一实施方案中，一孵育液流(例如，灌注液流)的流动速率通过整合的微流体微型阀与微型泵进行控制。在另一实施方案中，一孵育液体的所述液流是通过压力驱动的，例如，通过使用压缩空气、注射泵或重力来调节所述液流。
[0290] 一旦向一装置内的单个的小室提供了一细胞群和一读出颗粒群，就采用一种方法来测定所述细胞群内的一细胞是否在所述读出颗粒群或其亚群上表现出一胞外效应。所述细胞群和读出颗粒群和/或其亚群，依据情况，随后被检查以测定一群中的一种或多种细胞是否表现出所述胞外效应，或如果与其他细胞群相比，是否在所述胞外效应上有变化。在所述小室内鉴定表现出所述胞外效应或其变化的特定的一种或多种细胞并非必要，只要所述胞外效应的存在和/或变化在所述小室内被检测到。在一实施方案中，一旦一细胞群被鉴定为表现出一胞外效应或所述胞外效应的变化，所述细胞群被回收进行进一步的阐明以鉴定对所述胞外效应或其变化负责的所述特定的一种或多种效应细胞。在另一实施方案中，一旦所述细胞群被鉴定为表现出一胞外效应或所述胞外效应的变化，对其进行回收并且从对所述细胞群的核酸扩增并测序。
[0291] 所述胞外效应在一实施方案中是由一种或多种效应细胞产生的蛋白与一读出颗粒，例如，一小珠或一细胞之间的结合相互作用。在一实施方案中，所述群中的一种或多种所述效应细胞是一抗体产生细胞，所述读出颗粒包括一具有一靶标表位的抗原。所述胞外效应在一实施方案中是一抗体与一抗原的结合，而所述胞外效应上的变化是，例如，与一对照小室或与所述多种群中其他的群相比更强的结合。可选择地，所述胞外效应上的变化是一分泌一抗体的效应细胞的存在，所述抗体对一特定抗原具有调整的亲和力。即，所述结合相互作用测量的是一种或多种抗原-抗体结合特异性、抗原-抗体结合亲和性与抗原-抗体结合动力学。可选择地或附加地，所述胞外效应是一凋亡的调节、细胞增殖的调节、一读出颗粒外表形态的改变、一读出颗粒中一蛋白定位的改变、一蛋白被一读出颗粒表达、一辅助颗粒的生物学活性的中和、由所述效应细胞诱导的一读出细胞的裂解、由所述效应细胞诱导的所述读出细胞的细胞凋亡、读出细胞坏死、一抗体的内化、一辅助颗粒的内化、酶活被所述效应细胞中和、一可溶性信号传导分子的中和或上述中的组合。在一些实施方案中，每间小室至少提供两类不同的读出颗粒，其中一类读出颗粒不包括所述靶标表位。
[0292] 不同类型的读出颗粒可通过一种或多种特征进行区分，如荧光标记、不同的荧光强度等级、形态、大小、表面染色和在所述小室中的定位。
[0293] 一旦与一包含一种或多种效应细胞的细胞群一起孵育，对所述读出颗粒群或其亚群进行检查以测定所述细胞群内的一种或多种细胞是否在一种或多种读出颗粒上表现出所述胞外效应，所述胞外效应是直接的还是间接的，或表现出的是所述胞外效应上的一变化。在所述被检测的胞外效应上具有变化的细胞群被检测得到，并且随后被回收进行下游分析。重要的是，如全文中所提供，鉴定所述在一种或多种读出颗粒上具有特定胞外作用的特定的效应细胞并非必要，只要所述胞外效应的存在在一特定的微型反应器(例如，微流体小室)中被检测到。
[0294] 在一些实施方案中，所述在所述细胞群内的一种或多种效应细胞分泌生 物分子，例如，抗体，并且这些因子的所述胞外效应在一种或多种读出颗粒(例如，读出细胞)上进行评估，以检测出一展示所述胞外效应的细胞群。然而，所述胞外效应并不仅限于一分泌的生物分子的一效应。例如，在一实施方案中，所述胞外效应是一T细胞受体的一效应，例如，结合于一抗原。
[0295] 在一实施方案中，一读出颗粒群是一异质性的读出细胞群，并包含经过工程化的表达一cDNA文库的读出细胞，所述cDNA文库编码细胞表面蛋白。抗体与这些细胞的结合被用于回收并且，可能地，分析分泌结合于一靶标表位的抗体的细胞。
[0296] 在一些实施方案中，测量一读出颗粒群或其亚群上的一胞外效应的方法包括向测量所述效应的小室中添加一种或多种辅助颗粒。例如，至少一种在抗体结合到所述读出细胞上时激活补体所需要的因子可以被作为一辅助颗粒提供。如上述所提供，一自然杀伤细胞或其多种，在一实施方案中正在测量细胞裂解时作为一辅助细胞被添加到一小室中。本领域技术人员基于所述正在采用的检测决定将能够决定哪些辅助颗粒是必需的。
[0297] 在一些实施方案中，一种或多种读出颗粒包括一表现或表达一标抗原的读出细胞，这种情况下一自然杀伤细胞，或其多种作为一种或多种“辅助细胞”提供给所述小室，所述辅助细胞促进所述被测量的功能效应(裂解)。所述辅助细胞可以在所述读出颗粒被加载到所述小室之前或之后与所述细胞群、所述一种或多种读出颗粒一起提供给所述小室。在采用了一自然杀伤细胞的实施方案中，所述自然杀伤细胞靶向一种或多种读出细胞，所述读出细胞上已经结合了一产生自一效应细胞的抗体。所述胞外效应因此可包括通过所述自然杀伤细胞裂解所述一种或多种读出细胞。可通过活力染料、膜完整性染料、荧光染料的释放、酶学检测等测量裂解。
[0298] 在一些实施方案中，所述胞外效应是一可操作用于影响所述读出颗粒的辅助颗粒(或辅助试剂)的中和，所述读出颗粒是，例如，一可操作用于刺激至少一读出细胞的一应答的细胞因子(辅助颗粒)。例如，还可以进一步提供分泌细胞因子的可操作用于影响所述读出颗粒的细胞给所述小室。由一 效应细胞分泌的细胞因子的中和可通过所期望的所述读出细胞上的效应，例如增殖的缺失来探测。在另一实施方案中，所述辅助颗粒是一可操作用于感染所述读出细胞的病毒，并且所述病毒的中和通过所述读出细胞被病毒感染的降低来探测。
[0299] 在一些实施方案中，一类效应细胞的所述胞外效应可诱导一类不同效应细胞的激活(例如，抗体或细胞因子的分泌)，其随后可以引起在至少一读出细胞中的应答。
[0300] 如全文所提供，本发明所提供的方法和装置被用于鉴定在一读出颗粒上表现出一胞外效应的变化的一效应细胞。所述效应细胞可以作为一单个的效应细胞在一微流体小室中存在，或在一单间小室中的一细胞群里。所述胞外效应，例如，可以是所述效应细胞的一分泌产物的一胞外效应。在所述效应细胞存在于一更大的细胞群中的情况下，所述胞外效应首先归因于所述细胞群，对所述群进行分离并分析所述分离的群的亚群以测定所述胞外效应的细胞基础。然后可以分离展示所述胞外效应的亚群并进一步在有限的稀释度下进行分析，例如作为单个细胞分析，或进行核酸分析。在一实施方案中，一分离的细胞群的一亚群包含一单细胞。
[0301] 在一实施方案中，所述细胞群包含一分泌单克隆抗体的ASC。在一实施方案中，一基于读出小珠的检测被用于一探测效应细胞存在的方法，所述效应细胞是存在于一种或多种其他的不分泌所述抗体的细胞的背景下的一分泌所述抗体的效应细胞。例如，在一实施方案中采用了一基于小珠的检测，所述检测被用于一在一细胞群内探测一ASC的方法，所述ASC分泌的抗体结合一所关注的靶标表位，除所述ASC外还存在一种或多种其他的ASC分泌不结合所述所关注的靶标表位的抗体。
[0302] 在另一实施方案中，对一抗体特异性地结合一靶细胞的能力进行了评测。如图3所指，所述检测包含至少两汇总读出颗粒，例如，读出细胞181和186，此外还有至少一效应细胞182(ASC)。读出细胞181在其表面上表达一已知的所关注的靶标表位，即，靶标表位183(天然地或通过基因工程)，而读出 细胞186不表达。所述两类读出细胞181和186可以通过一可区分的荧光标记、其他染色或形态进行相互区分并与所述效应细胞182区分。效应细胞182和效应细胞181与186在同一间小室内分泌抗体184。被效应细胞182分泌的抗体184通过靶标表位183结合到效应细胞181上，但不结合到效应细胞186。一二抗被用于检测所述抗体
184选择性地与读出1细胞181的结合。然后对所述微流体小室进行成像以测定抗体184结合到所述读出细胞181和/或读出细胞186是否已经发生。
184选择性地与读出1细胞181的结合。然后对所述微流体小室进行成像以测定抗体184结合到所述读出细胞181和/或读出细胞186是否已经发生。
[0303] 这种检测还可以通过高分辨率显微术来评测抗体在所述读出细胞表面或内部的结合位置。在这一实施方案中，所述读出颗粒包括不同类型的颗粒(例如，多类细胞)或通过不同方法(例如，通过通透和固定)制备的颗粒/细胞来评测结合特异性和/或定位。例如，这种检测可以被用于鉴定结合活细胞上一靶标的天然构象的与固定细胞上变性的构象的抗体。这种检测或者可被用于测定一表位在一靶标分子上的定位，首先用针对已知表位的抗体封闭所述分子的其他部分，不同的读出颗粒群具有不同的被封闭的表位。
[0304] 在另一实施方案中，提供单个的异质性读出颗粒群(例如，一包含恶性和正常细胞的读出细胞群)和多个单个的细胞群给本发明所提供的的一装置的多个微流体小室(例如，超过1000间小室)，其中所述细胞群中至少一包含一效应细胞。例如，如图4所指，在读出细胞群中通过结合到一种或多种恶性读出细胞425与不结合健康的读出细胞426被用来鉴定一所关注的细胞群，所述细胞群包含一种或多种效应细胞，产生一所关注的抗体，即，效应细胞427，产生对所述群中的一种或多种所述恶性细胞具有特异性的抗体428。在一小室中的两类读出细胞425和426可至少通过一特性进行区分，例如，荧光标记、不同的荧光强度、形态、大小、表面染色和在所述微流体小室内的位置。所述细胞然后在所述单间的小室内进行孵育和成像以测定是否一个或多个所述小室包括一施加所述胞外效应的细胞群，即，一分泌一结合到一恶性读出细胞但不结合一健康读出细胞的抗体的ASC。
[0305] 如果存在与一间小室中，所述包含一种或多种分泌一结合到所述恶性读 出细胞425但不结合健康细胞426的抗体的细胞群，随后在所述小室中可被回收并提取所述抗体的序列，或在所述群的单个细胞上进行其他的下游检测，例如，一检测测定所述群中的效应细胞是否具有所需要的结合特性。相应地，提供了通过本发明所描述的一种或多种方法所发现的新的功能抗体。在所述恶性读出细胞425上的表位可能是已知的或未知的。在后一种情况下，针对所述抗体的表位可通过下面描述的方法鉴定。
[0306] 在一实施方案中，一单一种类的细胞可以作为一效应细胞和一读出细胞。如图5所指，这个检测在一单一种类细胞的一异质性细胞亚群中进行，即，效应细胞430和读出细胞431，两者都已经被功能化以在其表面捕获一所关注的分子432，例如通过针对一靶向一表面分子标记及所关注的分子432的四聚体的抗体433，或通过一在所述细胞上的亲和阵列来结合生物素标记的抗体。如图6所指，一四聚体抗体复合物由一结合所述细胞的抗体(A)435和一结合分泌自所述细胞的抗体(B)436组成，其中抗体A和B被结合抗体A和B的Fc部分的两个抗体437所连接。这种四聚体抗体复合物在现有技术中已经有描述(Lansdorp等人(1986).European Journal of Immunology 16,pp.679-683，本申请全文纳入以供各种目的参考)并且可以购买获得(Stemcell Technologies，温哥华，加拿大)。通过这些四聚体，所述分泌的抗体被捕获并连结到所述细胞的表面，这样使所述效应细胞也作为读出颗粒发挥功能。一旦被固定到细胞的表面这些抗体即可以被检测是否有结合，例如通过添加荧光标记的抗原。例如，在一种情况下，试图鉴定包括分泌结合到特定靶标的单克隆抗体细胞的小室时，所述分泌自效应细胞的抗体可以在这些效应细胞的表面被捕获，而其他的在所述小室中通过适当的捕获试剂捕获。如图5所指，因此可以理解效应细胞430还能作为一读出细胞发挥功能，即，所述分泌一所关注的分子432的效应细胞可以比读出细胞431更有效地捕获所述所关注的分子。
[0307] 在一实施方案中，一胞外效应检测在多间微流体小室中用一异质性读出颗粒群(例如，一异质性读出细胞群)和在每间小室中用一基本上同质的细 胞群一起平行进行，所述基本上同质的细胞群中的每个效应细胞产生同样的抗体。在一进一步实施方案中，所述读出颗粒是基因工程化的表达一蛋白质或蛋白质片段文库的读出细胞以测定所述分泌自所述效应细胞的靶标表位。如图7所指，所述检测的一实施方案包括多种分泌抗体191的效应细胞190。所述检测还包括一异质性读出细胞群，包含读出细胞192、193、194和195，分别展示表位196、197、198和199。效应细胞190分泌抗体191，其扩散到读出细胞192、193、194和195。抗体191通过靶标表位198结合到读出细胞194，但不结合读出细胞192、193或195。一二抗可用于检测191对读出细胞194的选择性结合。
[0308] 包括结合读出细胞194(或另一表位)的抗体191的细胞群随后可被从所述装置中回收并进行进一步检测。
[0309] 在一实施方案中，提供了一功能性检测以测定在一细胞群内的一单个的ASC是否激活一靶细胞的裂解，即，激活抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。ADCC是细胞介导的一免疫防御，其中一免疫系统的效应细胞裂解一靶细胞，靶细胞膜的表面抗原已经结合有特异性的抗体，即，在本发明所提供的一间特定的微流体小室中由一ASC分泌的抗体。经典的ADCC通过自然杀伤(NK)细胞介导。然而，巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞也可以介导ADCC，并且在本发明汇总可被提供作为辅助细胞用于一ADCC胞外效应检测。
[0310] 本发明提供的ADCC检测的一实施方案包括一包含一或多种效应细胞的细胞群、一读出细胞群(在其表面具有一所关注的表位)和作为辅助细胞的NK细胞。进行所述检测以测定来自所述细胞群的一ASC是否会诱导所述NK细胞攻击并裂解所述靶细胞。如图8所指，所述经过注释的实施方案包括包含ASC 200和201的细胞群，其分别分泌抗体202和203.所述经过注释的实施方案还包括一异质性的包含读出细胞204和205的读出细胞群，所述读出细胞204和205分别展示表位206和207。ASC 200和201分泌抗体202和203，其扩散至读出细胞204和205。抗体202通过靶标表位207结合 至读出细胞205，但不结合到读出细胞204。抗体
203不结合到读出细胞204或205。NK细胞208检测到读出细胞205已经被抗体202结合后便继续杀死读出细胞205，而不会杀死没有被结合的读出细胞204。
203不结合到读出细胞204或205。NK细胞208检测到读出细胞205已经被抗体202结合后便继续杀死读出细胞205，而不会杀死没有被结合的读出细胞204。
[0311] 本领域技术人员将会理解所述NK细胞可在所述效应细胞与所述读出细胞一起孵育时或孵育后被添加到所述小室中，只要其被添加到所述小室的方式能够促进与所述读出细胞的接触。所述NK细胞可来自一异质性辅助细胞群，例如周边血单核细胞。所述NK细胞可来自一动物或人衍生细胞系，并工程化以增加ADCC活性。本领域技术人与将还会理解这一检测可以用其他类型能够介导ADCC的造血细胞进行，例如，巨噬细胞、嗜酸性粒细胞或中性粒细胞。这里，巨噬细胞、嗜酸性粒细胞或中性粒细胞就是所述检测中的辅助细胞。能够介导ADCC的细胞类型还可以是衍生自动物或人的细胞系，通过工程化来增强ADCC活性或结合抗体到靶标细胞上时报告信号。在后一种情况，所述靶标细胞是辅助颗粒而所述介导ADCC的细胞是所述读出颗粒。
[0312] 一ADCC胞外效应检测可对一单个的效应细胞、一同质性细胞群、或一异质性细胞群进行，如图8所示。类似地，一ADCC检测可以用一单个的读出细胞、一同质性读出细胞群或一异质性读出细胞群进行，如图8所示。然而在很多情况下需要用多种读出细胞进行一ADCC检测以避免检测到因一读出细胞的随机死亡而引起的假阳性。
[0313] 细胞裂解，在一实施方案中，通过克隆形成能力检测、添加一膜完整性染料、胞内荧光分子的丧失或溶液中胞内分子的释放进行鉴定。所述释放的生物分子可在溶液中直接被测量或被捕获到读出颗粒上进行测量。在一些情况下，还添加额外的辅助颗粒，如用于一氧化还原检测的底物或用于一酶检测的底物。如图9所指，一包含分泌第一种生物分子502的效应细胞500和另一种不分泌第一种生物分子502的效应细胞501的细胞群在一异质性读出颗粒群的存在下进行孵育，所述异质性读出颗粒群包括读出细胞503和读出颗粒504，以及一种辅助颗粒(例如，自然杀伤细胞505)。第一种生物分子502结合到读出细胞503引发了自然杀伤细胞505的招募，导致了读出细胞 503裂解。细胞裂解时，第二种生物分子506从读出细胞503中释放并被读出颗粒504所捕获，所述读出颗粒504是一类不同的读出颗粒，被功能化以捕获第二种生物分子506，例如，通过分子507。分子507，在一实施方案中，是一蛋白、一抗体、一酶、一反应基团和/或一核酸。被捕获的第二种生物分子506可以是存在与读出细胞503内的任何分子，如一蛋白、酶、碳水化合物或一核酸。在一实施方案中，第二种生物分子506结合到读出颗粒504上通过一荧光检测、一分光光度检测、一生物发光检测或一化学发光检测进行定量。所述检测直接在读出颗粒504上进行或间接地在周围的溶液中进行，例如，如果被捕获的生物分子506是一将一底物转换为具有不同光学特性的产物的酶时。所述检测在本发明所提供的一装置上的多间小室内进行，以测定这些小室中是否包含一种效应细胞分泌一诱导细胞裂解的生物分子。
[0314] ADCC检测是本领域已知的，并且组分可购买获得。例如，用于流式细胞术的Guava Cell Toxicity Kit(Millipore)、ADCC Reporter Bioassay Core Kit(Promega)、ADCC Assay(GenScript)、LIVE/DEAD Cell Mediated Cytotoxicity Kit(Life Technologies)以及DELFIA细胞毒性检测可被用于本发明所提供的装置。
[0315] 在另一实施方案中，所述胞外效应检测是一补体依赖的细胞毒性(CDC)检测。在一CDC实施方案中，提供了一种方法鉴定在一细胞群中一ASC(或一ASC所分泌的抗体)的存在，其在可溶因子的存在下结合一读出细胞，所述可溶因子对诱导所述读出细胞通过经典的补体途径裂解是必要和/或充分的。相应地，所述检测意图测定一分泌自一ASC的抗体是否通过经典的补体途径侧记一种或多种靶细胞的裂解。
[0316] 一CDC检测包括至少一效应细胞和至少一读出细胞，并且一CDC实施方案如图10所描述。所述实施方案包括了一细胞群，其包括效应细胞210与效应细胞211，两者分别分泌抗体212和213。所述经过注释的实施方案还包括一异质性的读出颗粒群，包含读出细胞214和读出细胞215，两者分别展示表位216和217。效应细胞210和211分泌抗体212和213，其扩散 到读出细胞214和215。抗体212通过靶标表位217结合到读出细胞215，但不结合到读出细胞214。抗体213不结合到读出细胞214或215中任一种。酶C1218、一辅助颗粒和一对通过经典补体途径诱导细胞裂解所必要的可溶因子结合到所述读出细胞215与抗体212的复合物，而不结合没有被结合的读出细胞214。酶C1208结合到读出细胞215与抗体212的复合物触发了经典的补体途径，牵涉到了更多的对通过经典补体途径诱导细胞裂解必要的可溶因子(未示出)，导致读出细胞215的破裂和死亡。
[0317] 所述诱导所述读出细胞(例如，对所述检测必要的辅助颗粒)裂解的必要的可溶因子在所述效应细胞与所述读出细胞一起孵育时或一起孵育后进行添加，只要其被添加到所述小室的方式促进与所述读出细胞的接触。本发明提供的CDC检测可对一单个的效应细胞、一同质性效应细胞群或一异质性读出细胞群进行，如图8所描述。。类似地，所述CDC检测能在一单个读出细胞、一同质的读出细胞群或一异质的读出细胞群中进行，如图8所示。然而，在很多情况下需要用一读出细胞群进行所述CDC检测以避免检测到因一读出细胞的随机死亡所引起的假阳性。
[0318] 通过补体途径的细胞裂解根据本领域技术人员所已知的方法进行定量。例如，细胞裂解通过克隆形成能力检测、添加一膜完整性染料、胞内荧光分子的丧失或溶液中胞内分子的释放进行定量。所述释放的生物分子在溶液中或被捕获到读出颗粒上直接测量。在一些情况下，还添加额外的辅助颗粒，如用于一氧化还原检测的底物或用于一酶检测的底物。如图11所指，例如，一细胞群，包括一分泌第一种生物分子512的效应细胞510和另一不分泌第一种生物分子512的效应细胞511，所述细胞群在一种或多种异质性读出颗粒，例如，读出细胞513和读出颗粒514的存在下和辅助颗粒515(例如，补体蛋白)的存在下进行孵育。生物分子512在辅助颗粒515的存在下结合到读出细胞513导致了读出细胞513裂解。细胞裂解时，第二种生物分子516被释放并被捕获到一读出颗粒514上，读出颗粒514是另一类读出颗粒，经过功能化以捕获生物分子516，例如，通过分子517。分子517可一是一类 或多类分子，如一蛋白、一抗体、一酶、一反应基团和/或一核酸。被捕获的生物分子516类型不限。相反地，被捕获的生物分子516可以是读出细胞513内的任何分子，如蛋白、酶、染料、碳水化合物或核酸。第二种生物分子516结合到读出颗粒514上通过一荧光检测、一分光光度检测、一生物发光检测或一化学发光检测进行定量。应理解所述检测可直接在读出颗粒514上或间接地在周围溶液中进行，例如，如果被捕获的生物分子516是一将一底物转化为一具有不同光学特性的产物的酶时。
[0319] 在另一实施方案中，提供了一检测以测定一效应细胞，单独地或在一细胞群内，是否调节细胞生长。特定地，所述检测被用于测定所述效应细胞是否分泌一生物分子，例如，一调节读出细胞生长速率的细胞因子或抗体。如图12所指，所述经过注释的实施方案包括一细胞群，含有效应细胞220和效应细胞221，分别分泌生物分子222和223。所述经过注释的实施方案还包括一同质性的包含读出细胞224的读出细胞群。效应细胞220和221分泌生物分子222和223，其扩散到读出细胞224。生物分子222结合到读出细胞224，诱导读出细胞224生长(由穿孔线表示)，而生物分子223不结合读出细胞224。所述小室的显微成像被用于评测所述读出细胞224相对于其他没有与所述生物分子接触的小室中的细胞的生长情况。
[0320] 一细胞生长调节检测可通过一可选地包含一种或多种效应细胞的细胞群进行。如上述所提到，在一些实施方案中，并非所有的细胞群都会含有效应细胞，因为其稀少和/或难以在最初加载到本发明所提供的一装置上的起始细胞群中富集。本发明通过鉴定包含一种或多种效应细胞的细胞群可以鉴定到这些稀少的细胞。
[0321] 所述细胞生长调节检测还可以用一单个的读出细胞或在一单间小室内的一异质性读出细胞群进行。然而，在很多情况下，需要用一同质性读出细胞群进行所述细胞生长调节检测，使生长速率的测量更加精确。
[0322] 所述细胞生长调节检测，在一实施方案中，被进行改造用于筛选产生抑制细胞生长生物分子的细胞。在另一实施方案中，所述方法被改造用于筛选 产生调节，即，增加或降低读出细胞增殖速率的分子的细胞。生长速率，在一实施方案中，通过对可见光显微图像的手工或自动细胞计数、表达一荧光的细胞的总荧光强度、标记有稀释的染料(例如，CFSE)的细胞的平均荧光强度、细胞核染色或其他本领域技术人员所知道的方法进行测量。
[0323] 可通过购买或的测量增殖的检测包括 Cell Viability Assay，CellTraceTM CFSE Cell Proliferation Kit和CellTraceTM Violet Cell Proliferation Kit(均来自Life Technologies)，其中每种都可用于本发明所描述的方法和装置。
[0324] 在另一实施方案中，提供了一凋亡功能检测以筛选一包含一种或多种效应细胞的细胞群，所述一种或多种效应细胞诱导另一种细胞，即，一读出细胞或一辅助细胞的凋亡。在一实施方案中，所述方法被用于鉴定一效应细胞的存在，所述效应细胞分泌一生物分子，例如，一诱导一读出细胞或辅助细胞凋亡的细胞因子或一抗体。如图13所指，所述经过注释的实施方案一细胞群，包含效应细胞230和效应细胞231，分别分泌生物分子232和生物分子
233。所述经过注释的实施方案还包括一同质性读出细胞群，包含读出细胞234。效应细胞
230和效应细胞231分泌生物分子232和233，其扩散到读出细胞234。生物分子232结合到读出细胞234并诱导读出细胞234凋亡，而生物分子233不结合到所述读出细胞。所述小室的显微成像，在一实施方案中，可通过结合使用染色或其他本领域所知的凋亡分子标记(例如，膜联蛋白5，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记，线粒体膜电势破坏等)被用于评测凋亡。在一实施方案中，通过可购买获得的染料或试剂盒测量细胞死亡而不是凋亡，例如，用碘化丙啶(PI)， Viability/Cytotoxicity Kit(Life
Technologies)或 Cell-Mediated Cytotoxicity Kit(Life
Technologies)。
233。所述经过注释的实施方案还包括一同质性读出细胞群，包含读出细胞234。效应细胞
230和效应细胞231分泌生物分子232和233，其扩散到读出细胞234。生物分子232结合到读出细胞234并诱导读出细胞234凋亡，而生物分子233不结合到所述读出细胞。所述小室的显微成像，在一实施方案中，可通过结合使用染色或其他本领域所知的凋亡分子标记(例如，膜联蛋白5，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记，线粒体膜电势破坏等)被用于评测凋亡。在一实施方案中，通过可购买获得的染料或试剂盒测量细胞死亡而不是凋亡，例如，用碘化丙啶(PI)， Viability/Cytotoxicity Kit(Life
Technologies)或 Cell-Mediated Cytotoxicity Kit(Life
Technologies)。
[0325] 在一实施方案中，对一包含一单个的效应细胞的细胞群、一可选地包含一种或多种效应细胞的细胞群或一包含一种或多种效应细胞的细胞群进行一凋亡检测。在一实施方案中，所述凋亡检测用一单个的读出细胞、或一异 质性的读出细胞群进行。然而，在很多情况下，需要用一同质性读出细胞群进行所述凋亡检测以更加精确地评测凋亡。
[0326] 在另一实施方案中，本发明所提供的所述微流控装置被用于筛选一效应细胞，所述效应细胞分泌一生物分子，例如，一诱导一读出细胞自我吞噬的细胞因子或抗体。本方法的一实施方案如图14所示。如图14所指，所述经过注释的实施方案包括一细胞群，包含效应细胞441和效应细胞442，其中效应细胞441分泌生物分子443。所述经过注释的实施方案还包括一异质性读出细胞群，其包括第一展示靶标表位449的读出细胞444和另一类缺乏所述靶标表位的读出细胞445。效应细胞441分泌生物分子443，其扩散到第一类读出细胞444和第二类读出细胞445。生物分子443结合到第一类读出细胞444并诱导第一类读出细胞444的自我吞噬，而生物分子443不结合到第二类读出细胞445。所述小室的显微成像，在一实施方案中，被用于评测自我吞噬作用，所述评测通过本领域已知的经过自我吞噬作用报告分子工程化的细胞系(例如，进行FlowCellectTMGFP-LC3 Reporter Autophagy Assay Kit(U20S)(EMD Millipore)，PremoTMAutophagy Tandem Sensor RFP-GFP-LC3B Kit(Life Technologies))进行。
[0327] 在一实施方案中，自我吞噬试验在一含有一单个效应细胞的细胞群、一任选的含有一种或多种效应细胞的细胞群、或一含有一种或多种效应细胞的细胞群中实施。在一实施方案中，一自我吞噬试验在一单个读出细胞、或者以异质的读出细胞群或一同质的读出细胞群实施。所述试验，在一实施方案中，与一同质的读出细胞群实施。
[0328] 在一实施方案中，提供了一方法鉴定一效应细胞的存在或筛选一种效应细胞，所述效应细胞分泌一生物分子，例如，一抗体，或影响一已知生物分子的能力，例如，一细胞因子，以诱导一读出细胞发生应答。所述应答不限于类型。例如，所述应答在一实施方案中选自细胞死亡、细胞增殖、一报告分子的表达、形态的改变或其他某个由所述方法的操作者选择的方法。所述方法的一实施方案如图15所提供。如图15所指，所述经过注释的实施方案 包括一细胞群，包含效应细胞240和效应细胞241，分别分泌生物分子242和243。所述经过注释的实施方案还包括一同质性读出细胞群，包含读出细胞244。效应细胞240和241分泌抗体242和243扩散到所述小室中的培养基内。所述小室用细胞因子245施以脉冲刺激，以此阻止它们结合到读出细胞244。相应地，观察不到所预期的应答，表明效应细胞240和241之一在分泌一抗体，所述抗体能够中和细胞因子245刺激所述读出细胞244产生应答的能力。
[0329] 在一实施方案中，一细胞因子中和检测被用于鉴定一效应细胞的存在，所述效应细胞产生一生物分子靶向一存在于所述效应细胞上的所述细胞因子的受体。这里，一抗体，例如，抗体242结合到读出细胞244上细胞因子245的受体246阻断了所述细胞因子与所述受体间的相互作用，这样就不会刺激任何应答。所述细胞因子受体，在另一实施方案中，是“溶解的”或“稳定的”，例如，是一经过Heptares 平台工程化的细胞因子受体。
[0330] 针对所述细胞因子的应答，在一实施方案中，通过显微测量本领域已知的相关信号传导来确证，包括但不限于细胞死亡、细胞生长、一荧光报告蛋白的表达、一细胞组分的定位、一细胞形态的改变、运动性、趋化作用、细胞聚集等。在一实施方案中，含有效应细胞小室的应答与缺少效应细胞的小室进行比较以测定所述应答是否被抑制。如果一应答被抑制，则收集所述小室内的效应细胞进行进一步分析。
[0331] 在一实施方案中，在一单个的微型反应器内对一细胞群进行一细胞因子检测，所述细胞群包含一单个的效应细胞、一可选地包含一种或多种效应细胞的细胞群或一包含一种或多种效应细胞的细胞群。当然，所述方法可在多间微型小室内对多个细胞群平行实施。在一实施方案中，所述细胞因子检测用一单个的读出细胞或一异质性的读出细胞群来进行。在一实施方案中，所述方法用一同质性的读出细胞群来实施以更加精确地评测所述读出细胞的刺激状况，或相反地，其刺激缺失的状况。
[0332] 可通过购买获得的用于这种检测的细胞因子依赖或细胞因子敏感细胞 系的实例包括但不限于TF-1、NR6R-3T3、CTLL-2、L929细胞、A549、HUVEC(人脐带静脉表皮细胞)、BaF3、BW5147.G.1.4.OUAR.1(均可获取自ATCC)、 CHO细胞(DiscoveRx)及TANGO细胞(Life Technologies)。本领域技术人员会理解原代细胞(例如，淋巴细胞，单核细胞)也可被用作一细胞因子检测的读出细胞。
[0333] 在一实施方案中，一信号传导检测被用于鉴定一包含一种或多种效应细胞的细胞群，所述一种或多种效应细胞分泌一种分子(例如，一抗体或细胞因子)，对一读出细胞的受体具有激活的活性。结合所述受体后，所述读出细胞群上的效应可包括一信号传导通路的激活，通过一荧光报告分子得以观察、一细胞内荧光报告分子的转移、生长速率的改变、细胞死亡、一形态改变、分化、所述读出细胞表面上所表达的蛋白的改变等。
[0334] 几种工程化的报告细胞系可通过购买获得并且可用于实施这一检测。实例包括PathHunter (DiscoverRx)、TANGOTM细胞(Life Technologies)与EGFP报告细胞(ThermoScientific)。
[0335] 在一实施方案中，进行一病毒中和检测来鉴定和/或选择一细胞群，所述细胞群包含一种或多种效应细胞，所述效应细胞分泌一生物分子，例如，一影响一病毒感染一靶标读出细胞或靶标辅助细胞能力的抗体。这个方法的一实施方案如图16所示。如图16所指，所述经过注释的实施方案包括一细胞群，包含效应细胞250和效应细胞251，分别分泌生物分子，例如，抗体252和253。所述经过注释的实施方案还包括一同质性的包含读出细胞254的读出细胞群。效应细胞250和251分泌生物分子，例如，抗体252和253，其扩散到所述小室内的培养基中。然后所述小室用病毒255(辅助颗粒)进行脉冲刺激，所述病毒正常地感染读出细胞254。抗体252或253结合到病毒255，以此阻止病毒结合到读出细胞254。相应地，没有观察到所预期的感染，表明效应细胞250或251之一分泌了一能够中和病毒255的抗体。
[0336] 一病毒中和检测也可用于鉴定一效应细胞的存在，所述细胞细胞产生一生物分子结合到所述读出细胞上的所述病毒的受体。这里，一抗体，例如， 抗体252结合到读出细胞254的病毒255的受体256阻断了所述病毒与所述受体间的相互作用，这样就观察不到感染。
[0337] 病毒感染的评测可通过本领域已知的方法来进行。例如，病毒可经过工程化改造包含荧光蛋白，所述荧光蛋白在感染后被所述读出细胞表达、在病毒感染时所述荧光蛋白在所述读出细胞内的表达上调、从一读出细胞或辅助细胞中分泌蛋白，所述蛋白在病毒感染期间数量增多的读出细胞上被捕获并测量、一读出细胞或辅助细胞的死亡、一读出细胞或辅助细胞的形态改变，和/或读出细胞的凝集。
[0338] 在一实施方案中，在一单个的微型反应器内，对一包含一单个效应细胞的细胞群、一可选地包含一种或多种效应细胞的细胞群或一包含一种或多种效应细胞的细胞群进行一病毒中和检测。在一实施方案中，所述病毒中和检测用一单个的读出细胞或一异质性读出细胞群来进行。在一实施方案中，所述方法用一同质性读出细胞群来进行以更精确地评测所述产生应答的读出细胞的刺激，或相反地其刺激的缺失。当然，所述方法可在多间微型小室内对多个细胞群平行进行。
[0339] 例如，可通过购买获得的用于病毒中和检测的细胞系为MDCK细胞(ATCC)和CEM-NKR-CCR5细胞(NIH资助试剂项目)，其可被用于被发明所描述的方法和装置。
[0340] 在另一实施方案中，进行一酶中和检测以测定一效应细胞是否展示或分泌一抑制一靶标酶的生物分子。所述方法的一实施方案如图17所提供。如图17所指，所述经过注释的实施方案包括一细胞群，包括效应细胞280和效应细胞281，分别分泌生物分子，例如，蛋白质282和283。所述经过注释的实施方案还包括一同质性的读出颗粒群，例如，小珠284，一靶标酶285与其偶联。然而，在另一实施方案中，所述靶标酶285被连结到所述装置的表面，或被溶解。蛋白质282和283通过培养基扩散，并且蛋白质282结合到靶标酶285上，这样抑制了其活性，而蛋白质283不结合到所述靶标酶上。在一实施方案中，在所述小室中的一底物上检测所述酶的活性，或相反地其 缺失通过本领域已知的方法进行评测，包括但不限于荧光读出结果、分光光度读出结果、沉淀等。
[0341] 在另一实施方案中，每间小室对一包含一单个效应细胞的细胞群、一可选地包含一种或多种效应细胞的细胞群或一包含一种或多种效应细胞的细胞群进行一酶中和检测。在一实施方案中，所述酶中和检测在一单间小室内用一单个的读出颗粒来进行。在一实施方案中，对多个细胞群进行一酶中和检测一鉴定一针对所述检测具有变化的细胞群。
[0342] 在另一实施方案中，提供了一检测方法来鉴定一效应细胞的存在，所述效应细胞展示或分泌一生物分子，所述生物分子引起另一类效应颗粒的激活，而其相应地分泌一对一读出颗粒具有效应的分子。相应地，在这一实施方案中，对单个的微流体小室提供一细胞群。这一方法的一实施方案如图18所提供。如图18所指，所述经过注释的实施方案包括一细胞群，其包括一在其表面展示一分子461(例如，一抗体，一表面受体，一主要组织相容性复合物分子等)的效应细胞460，所述效应细胞460激活一相邻的不同类额效应细胞，这里是效应细胞462，所述效应细胞462诱导另一类分子463(例如，细胞因子，抗体)的分泌并被所述读出颗粒464所捕获。在这一实例中，所述读出颗粒464被一抗体465或对所述分泌分子463特异性的受体所功能化。
[0343] 在另一实施方案中，所述效应细胞，在被一辅助颗粒激活后，可以在表型上表现出多种改变，如增殖、活力、形态、运动性或分化。这里所述效应细胞也是一读出颗粒。这种效应可通过所述辅助颗粒和/或通过所述激活的效应细胞自分泌蛋白产生。
[0344] 如图19所指，所述经过注释的实施方案包括一细胞群，其包含分泌一分子471(例如，抗体，细胞因子等)的效应细胞470，所述效应细胞470激活另一不同类型的效应细胞，这里是效应细胞472。效应细胞472一旦激活，分泌另一类分子473(例如，细胞因子，抗体)被读出颗粒474所捕获。在这一实例中，所述读出颗粒474被一抗体475或对所述分泌分子473具有 特异性的受体所功能化。
[0345] 如本发明所提供，低解离速率的单克隆抗体在对同样的抗原也具有特异性但解离速率更快的单克隆抗体的大背景(在同一间小室内)存在下可以被检测到。然而，亲和性也可通过本发明所提供的装置和方法进行测量，因此，结合速率也能够被测量。这些测量除了所述捕获试剂(如小珠)的结合能力外还取决于所述光学系统的敏感性。为了检测特异性，所述捕获试剂(读出颗粒)可以设计以呈现所关注的表位，这样其只结合具有所需要的特异性的抗体。
[0346] 如图20所指，所述经过注释的实施方案包括一同质性细胞群，分泌特异性针对相同的抗原但亲和力不同的抗体。这一检测被用于鉴定一细胞群内的一效应细胞，所述细胞群包含至少一产生一高亲和力抗体的效应细胞。效应细胞450和451分泌针对一靶标表位(未示出)的低亲和力抗体453和454，而效应细胞452分泌针对所述靶标表位的高亲和力抗体455。抗体453、454和455被一读出颗粒群所捕获，所述读出颗粒群包含读出小珠456。所述读出小珠随后与一荧光标记的结合所有抗体的抗原(未示出)一起孵育。当用一未标记的抗原(未示出)洗涤时，所述荧光标记的抗原只有当读出小珠在其表面展示出高亲和力抗体455时才会保留。
[0347] 如图21所指，另一经过注释的实施方案包括效应细胞260，其分泌生物分子，如抗体261。所述经过注释的实施方案还包括一含有光学上可区分的读出颗粒的异质性读出颗粒群，例如小珠262和263分别展示出不同的靶标表位264和265。抗体261在所述小室内扩散，结合到表位264但不结合265。抗体261在一实施方案中偏好性地结合到抗原264通过小珠262而非小珠263的荧光所观察到。
[0348] 在所述经过注释的实施方案中，小珠262和263在形状上可通过光学区分开以评测交叉反应性。然而，读出颗粒也可通过其他方法区分，例如，一种或多种特征如荧光标记(包括不同的荧光波长)、不同的荧光强度级别(例如，在所述微流体小室中使用具有不同荧光强度、形态、大小、表面染色和 定位的StarfireTM小珠)。
[0349] 在一实施方案中，当隔离到单独的读出区时，例如，通过细胞栅栏，小珠262和263在光学上可以区分。可选择地，不同颜色的荧光基团可被用于在光学上区分读出小珠。
[0350] 可选择地，特异性可通过包含另一抗体与所述分泌抗体竞争结合所述靶标表位来测量。例如，在一实施方案中，一结合于一展示出所述抗原的分泌抗体通过荧光标记的二抗被鉴定到。后续添加的一未标记的竞争性抗体产生于一不同宿主，且已知其结合到所述抗原上一已知的靶标表位。只有当所述分泌的抗体与所述竞争性抗体结合到同样的靶标表位上时，才会因所述分泌抗体被替代而导致荧光减少。可选择地，通过添加一多种抗原的混合体系来测定特异性，如果所述分泌抗体具有地特异性，其与所述分泌抗体竞争结合所述靶标表位。可选择地，通过在一小珠上捕获所述分泌抗体，然后用差异标记的抗原来评测所述分泌抗体的结合特性来测量特异性。
[0351] 本发明所描述的特异性测量，当对一包含两种或多种分泌结合所述靶标之一的抗体的效应细胞的细胞群进行时，在本质上是多克隆测量。
[0352] 在本发明的多种实施方案中，一鉴定一分泌一生物分子的效应细胞存在的方法与所述效应细胞的一种或多种包内化合物是否存在的分析相偶联。如图22所指，一细胞群包含至少一类分泌一所关注的生物分子522(例如，一抗体，或一细胞因子)的效应细胞520和另一类不分泌所关注的生物分子的效应细胞521，两者在一包含读出颗粒523的读出颗粒群的存在下进行孵育，所述读出颗粒523经过功能化以捕获所述关注的生物分子。在孵育一段时间后，所述包括效应细胞类型520和521的细胞群被裂解以释放所述区内细胞的胞内内含物。读出颗粒523也被功能化以捕获一所关注的胞内生物分子524(例如，一核酸、一蛋白和一抗体等)。细胞裂解可通过本领域技术人员已知的不同方法来完成。
[0353] 在一实施方案中，提供了多种方法来鉴定具有所需要的结合特性的分泌的生物分子的多克隆混合体系。检测与检测产生针对一靶标表位、靶标分子 或靶标细胞类型的抗体的效应细胞异质性混合体系的操作相同。在所述混合体系的背景下结合所述靶标可以与在只有单个效应细胞的背景下结合所述靶标相比较以测定，例如，混合体系是否提供了增强的效应。
[0354] 本发明所提供的组合了所述结合和/或功能性检测的多功能分析可通过拥有多个读出区域、多个效应区域、多类读出颗粒或其中某种组合来进行。例如，灌注步骤可以在胞外效应检测之间进行以交换用于不同功能实验的试剂。
[0355] 图23提供一多功能检测的一实施方案。如图23所指，一间同时在三组读出颗粒上评估一效应细胞的所述胞外效应的微流体小室在410整体上示出。微流体小室410包括细胞栅栏420和421，其将所述小室分隔成四个区。虽然细胞栅栏420和421在本实施例中被描绘成互相成直角，本领域技术人员能够理解所述栅栏的精确的定位可以多种多样，只要能够建立起四个区。而且，本领域技术人员能够理解细胞栅栏并非进行一多功能检测(连续地或平行地)所必需。在一实施方案中，一不是细胞栅栏的结构被用于建立区域，只要所述不同区域可投放细胞群和读出颗粒。在另一实施方案中，所述多功能检测在没有细胞栅栏或结构下进行。相反地，每个检测在所述小室中同时或连续地，例如，使用发出不同波长的光的荧光分子进行。
[0356] 在图23描绘的实施方案中，分别分泌效抗体419和423的效应细胞411和422被投放到小室410的左上区域，以此划定效应区415。读出颗粒412、413和414被投放到剩下的区域，以此分别划定读出区416、417和418。读出颗粒412、413和414，在一实施方案中，构成一异质性读出颗粒群。例如，在一实施方案中，读出颗粒412和414是展示出同样抗原不同表位的大小不同的小珠，并且读出颗粒413是在一自然杀伤细胞424存在下展示出所述抗原的细胞。相应地，一能够选择性地结合某一表位并诱导自然杀伤细胞杀死读出细胞的效应细胞存在与否可在一单间小室内同时作出评估。
[0357] 可选择地，读出细胞412、413和414完全相同并且可以对一单间小室内单独一组效应细胞所赋予的一胞外效应进行多次独立的测量。可选择地， 颗粒412和414可以区分并且所述检测是连续地进行。
[0358] 在一实施方案中，对一种或多种胞外效应的存在进行了分析。本领域技术人员根据所述效应能够认识到可能会需要所述组合的胞外效应的存在或缺失。类似地，也可能所述需要的特性包括一类或多类胞外效应的存在或一类不同的胞外效应的缺失。例如，在一实施方案中，一多功能检测被用于鉴定一分泌一抗体的效应细胞，所述抗体结合一读出细胞上的一受体表位，但不诱导相应的信号传导途径的激活。
[0359] 在一实施方案中，一多功能检测在一间包含多个效应区的小室中进行，所述效应区通过，例如，引入不同的效应细胞或效应细胞的组合到不同的区域内形成。例如，在一实施方案中，产生对一把表抗原亲和力已知的抗体的不同细胞群被引入到一间小室的不同效应区内。在所述混合体系的背景下结合所述靶标可以与在只有单个效应细胞的背景下结合所述靶标相比较。相应地，这种多效应区的用途可以在一单间小室内筛选多种组合。
[0360] 在本发明所提供的检测的一实施方案中，在读出颗粒与一细胞群在一间微流体小室中一起孵育后，采用荧光测量以测定在所述细胞群内的细胞是否表现出一胞外效应。在这一实施方案中，所述读出颗粒群被荧光标记并且荧光的改变与所述胞外效应的存在和/或大小相关。所述读出颗粒群可以直接或间接被荧光标记。如全文所提供，在一些实施方案中，辅助颗粒(例如，辅助细胞)被提供给一间小室以辅助促进得到荧光读出结果。本领域技术人员应知道，需要仔细设计检测，使读出颗粒和效应细胞在一焦平面上以能够进行精确成像和荧光测量。
[0361] 在一实施方案中，读出颗粒的应答通过自动化高分辨率显微术进行监控。例如，成像可通过Axiovert 200(Zeiss)上的20X(0.4N.A.)物镜或DMIRE2(Leica)机动倒置显微镜。通过本发明所提供的自动纤维系统可以在大约30分钟内对4000个小室的阵列进行完整的成像，包括一明场和三个荧光通道。这个平台可以被改造以适应多种芯片设计，如Lecault等人(2011)Nature Methods 8,pp.581-586所描述，此处全文纳入本发明以供各种目的参考。重 要地是，本发明所使用的成像方法在效应为阳性的小室内能够取得足够的信号同时对细胞的光损害减到最低程度。
[0362] 在一实施方案中，本发明所述提供的所述效应细胞检测得益于长期的细胞培养，因此需要所述留在装置中的效应细胞是具有活力的健康的细胞。应了解在一用到读出细胞或辅助细胞的效应细胞检测中，它们也需要维持健康的状态，具有活力的和健康。本发明所提供的所述流体结构能够仔细并精确地控制培养基条件，以维持效应细胞和读出细胞的活力，这样功能检测才能够进行。例如，一些细胞类型需要自分泌或旁分泌因子，其依赖于分泌产物的积累。例如，CHO细胞的生长速率高度依赖于其接种密度。将一单个CHO细胞限定在4纳升的小室中相当于250,000个细胞/毫升的接种密度，这可以与传统的大规模培养相比。
如图73所示，单个CHO细胞在一微流控装置内的生长速率高于接种到多孔板上。由于它们在高集中密度生长旺盛，CHO细胞可能并不需要进行多天的灌注。然而，其他细胞类型，尤其是那些依赖细胞因子的(例如ND13细胞，BaF3细胞，造血干细胞)，典型地在大规模培养时达不到高浓度并在所述微流控装置中可能需要频繁滋养以防止细胞因子耗尽。所述细胞因子可添加到所述培养基中或通过滋养细胞产生。例如，已经显示骨髓衍生体细胞和嗜酸性粒细胞支持浆细胞的生存，因为它们产生IL-6和其他因子(Wols等人(2002)，Journal of Immunology 169,pp.4213-21；Chu等人(2011)，Nature Immunology,2,pp.151-159，此处全文纳入本发明以供参考)。这里可调控所述灌注频率以充分积累旁分泌因子同时阻止营养耗尽。
如图73所示，单个CHO细胞在一微流控装置内的生长速率高于接种到多孔板上。由于它们在高集中密度生长旺盛，CHO细胞可能并不需要进行多天的灌注。然而，其他细胞类型，尤其是那些依赖细胞因子的(例如ND13细胞，BaF3细胞，造血干细胞)，典型地在大规模培养时达不到高浓度并在所述微流控装置中可能需要频繁滋养以防止细胞因子耗尽。所述细胞因子可添加到所述培养基中或通过滋养细胞产生。例如，已经显示骨髓衍生体细胞和嗜酸性粒细胞支持浆细胞的生存，因为它们产生IL-6和其他因子(Wols等人(2002)，Journal of Immunology 169,pp.4213-21；Chu等人(2011)，Nature Immunology,2,pp.151-159，此处全文纳入本发明以供参考)。这里可调控所述灌注频率以充分积累旁分泌因子同时阻止营养耗尽。
[0363] 一方面，本发明提供了一种方法测定一可选地包含一种或多种效应细胞的细胞群是否施加一胞外效应影响于一种读出颗粒(例如，一含有一细胞表面受体的细胞)。所述效应细胞可以存在于一抑制性细胞群、一同质性群或作为一单细胞存在。在一实施方案中，所述效应细胞是一抗体分泌细胞。所述一种或多种胞外特性，在一实施方案中，包含一作用于一读出颗粒的胞外效应，例如，一读出细胞上的细胞表面受体的抑制(拮抗)或激活(激动) (例如，分泌自一抗体分泌细胞的抗体的激动剂和/或拮抗剂特性)。在一进一步的实施方案中，所述胞外效应是一作用于跨膜蛋白的激动剂或拮抗剂效应，其在一进一步的实施方案中是一G蛋白偶联受体(GPCR)、一受体酪氨酸激酶(RTK)、一离子通道或一ABC转运蛋白。在一进一步的实施方案中，所述受体是一细胞因子受体。可以对一作用于除GPCR和RTK外的代谢型受体上的胞外效应进行评测，例如，一作用于一鸟苷酰环化酶受体受体的胞外效应可以通过将一细胞群与一表达鸟苷酰环化酶受体的读出细胞群一起孵育来进行评测。
[0364] 在使用到一读出细胞的实施方案中，所述读出细胞可以是活的或固定的。对于一固定的读出细胞，所述胞外效应在一实施方案中，是一作用于所述固定的读出细胞的一胞内蛋白的效应。胞外效应还可以在一活的或固定的读出细胞的胞外蛋白上，或一活细胞的分泌蛋白上进行测量。
[0365] 在另一实施方案中，一读出细胞表达以下类型的细胞受体中的一种，并且所述胞外效应检测测量所述细胞受体的结合、激动或拮抗：受体丝氨酸/苏氨酸激酶，组氨酸激酶相关受体。
[0366] 在一特定的受体(例如，受体丝氨酸/苏氨酸激酶、组氨酸激酶相关受体或GPCR)是一孤儿受体的实施方中，即，激活所述特定受体的配体是未知的，本发明所提供的方法可以通过对表达所述孤儿受体的读出细胞进行一胞外检测来发现所述特定的孤儿受体的一配体，所述胞外检测鉴定出一细胞群或多个亚群含有一效应细胞在所述表达所述孤儿受体的读出细胞上的胞外效应具有变化。
[0367] 在一实施方案中，所述细胞表面蛋白时一跨膜离子通道。在一进一步实施方案中，所述离子通道是一配体门控离子通道并且在所述微流体检测中测量的所述胞外效应是通过所述离子通道开关的调控，例如，通过激动剂结合打开所述离子通道或通过拮抗剂的结合关闭/封闭所述离子通道。所述拮抗剂或激动剂可以是，例如，一所述包含一种或多种效应细胞的异质性细胞群中的一种或多种效应细胞分泌的一生物分子(例如，抗体)。本发明所描述的 胞外检测可被用于测量一效应细胞的所述胞外效应，其作用于一表达cys环超家族配体门控离子通道的细胞、一离子型谷氨酸受体和/或一ATP门控离子通道。阴离子cys环离子门控通道的特定实例包括GABAA受体和甘氨酸受体(GlyR)。阳离子cys环离子门控通道的特定实例包括5-羟色胺(5-HT)受体、烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)和锌激活离子通道。前述的一种或多种通道可通过一读出细胞表达以测定一效应细胞通过激活或拮抗所述离子通道是否分别对所述细胞具有一胞外效应。粒子流测量典型地在较短的时间段内发生(即，几秒钟)并且其实施需要精确的流体控制。可购买获得离子通道检测的实例包括Fluo-4-Direct Calcium Assay Kit(Life Technologies)，FLIPR Membrane Potential Assay Kit(Molecular Devices)。表达离子通道的细胞系也可通过购买获得(例如，PrecisIONTM细胞系，EMD Millipore)。
[0368] 在一实施方案中，所述细胞表面蛋白时一ATB结合框(ABC)转运蛋白，并且所测量的胞外效应是一底物的跨膜转运。所述读出颗粒可以是衍生自表达所述蛋白的细胞的膜囊泡(例如，GenoMembrane ABC Transporter Vesicles(Life Technologies))，其可被固定于小珠上。例如，所述ABC转运蛋白可以是一通透性糖蛋白(耐受多种药物的蛋白)并且所述效应可通过读出细胞内钙黄绿素的荧光强度进行测量。可通过购买获得VybrantTMMultidrug Resistance Assay Kit(Molecular Probes)来实施这一检测。
[0369] 一胞外效应还可以在一表达一离子型谷氨酸受体，如AMPA受体、钾盐镁矾受体(GluK类)或NMDA受体(GluN类)的读出细胞上进行评测。类似地，一胞外效应还可以在一表达一ATP门控通道或磷脂酰肌醇4-5-二磷酸(PIP2)门控通道的读出细胞上进行评测。
[0370] 如全文所提供，本发明提供了一种方法鉴定在一胞外效应上展示出变化的一细胞群。在一实施方案中，所述方法包括在分隔的多间微流体小室中保留多个单个的细胞群，其中所述单个的细胞群中的至少一包含一种或多种效应细胞，并且所述分隔的多间微流体小室的内含物还包括一包含一种或多种读出颗粒的读出颗粒群，孵育所述微流体小室中的所述单个的细胞群和所述 读出颗粒群，检测所述单个的细群是否存在所述细胞效应，其中所述读出颗粒群或其亚群提供所述胞外效应的一读出结果。在一实施方案中，所述胞外效应是一作用于一受体酪氨酸激酶(RTK)的效应，例如，结合到所述RTK、所述RTK的拮抗或所述RTK的激动。RTK是多种多肽生长因子、细胞因子与激素的高亲和性细胞表面受体。至今已经在在人类基因组中鉴定到了大约六十种受体激酶蛋白(Robinson et al.(2000).Oncogene 19,pp.5548-5557，此处全文纳入本发明以供各种目的参考)。RTK已经被表明调控细胞过程并在发育和多累癌症进程中具有作用(Zwick et al.(2001).Endocr.Relat.Cancer 8,pp.161-173，此处全文纳入本发明以供各种目的参考)。
[0371] 当所述胞外效应是作用于一RTK的胞外效应时，本发明并不限于一特定的RTK类型或成员。已经鉴定得到大约20类不同的RTK，并且作用于其中任何一类的成员的胞外效应都可通过本发明所提供的方法和装置进行筛选。表2提供了不同的RTK类型和每一类的代表性成员，每个成员应表达在一读出颗粒上，例如，读出细胞或囊泡上时都可以应用。在一实施方案中，本发明提供一种方法平行地筛选多个细胞群以鉴定一个或多个包含一效应细胞的群，所述效应细胞在表2所提供的亚类中的一类中的一RTK上具有一胞外效应。在一实施方案中，所述方法还包括分离一个或多个包含具有所述胞外效应的ASC的细胞群以提供一分离的细胞群，并进一步将所述分离的亚群在有限的稀释度下进行一种或多种额外的胞外效应检测以鉴定出具有所述胞外效应的ASC。所述额外的胞外效应检测可以通过本发明所提供的一微流体方法或通过实验台检测进行。可选择地，一旦鉴定到一细胞群具有一在RTK上表现出胞外效应的细胞，所述细胞群就被回收、裂解并且扩增其核酸。在一进一步的实施方案中，所述核酸是一个或多个抗体基因。
[0372] 在一实施方案中，本发明涉及到鉴定一含有一效应细胞的细胞群，所述效应细胞通过，例如，一分泌产物，例如，一抗体拮抗或激活一RTK(即，所述胞外效应)。所述效应细胞以一单独的效应细胞存在，或存在于一包含一种或多种效应细胞的细胞群中。
[0373]
[0374]
[0375]
[0376]
[0377]
[0378] 在一实施方案中，所述RTK是一血小板衍生生长因子受体(PDGFR)，例如，PDGFRα。PDGF是一可溶性生长因子(A、B、C和D)家族，组合形成多种同型和异型二聚体。这些二聚体被两个紧密相关的受体，PDGFRα和PDGFRβ，以不同的特异性所识别。特别地，PDGFα选择性地结合到PDGFRα并且已经表明在纤维化疾病，包括肺纤维化、肝硬化、硬皮病、肾小球硬化症和心脏纤维化(见Andrae等人(2008).Genes Dev.22,pp.1276-1312，此处全文纳入本申请以供参考)中驱动疾病引起的间充质应答。还已经表明小鼠中PDGFRα组成性激活在多种器官中导致进行性纤维化(Olson等人(2009).Dev.Cell 16,pp.303-313，此处全文纳入本申请以供参考)。因此抑制PDGFRα的疗法对治疗纤维化具有较高的潜力，而纤维化是一牵涉多达疾病中40％的条件，并且代表了在老龄化人群中的一个巨大的从未遇到过的问题。虽然已经开发了抗体(伊马替尼和尼洛替尼)作为PDGFRα的抑制剂，每种都有脱靶效应，会结合到其他主要的RTK上，包括c-kit和Flt-3，导致多种副作用。因此，尽管伊马替尼和尼洛替尼能够有效地抑制PDGFRα和PDGFRβ，它们的副作用使其在纤维化疾病的治疗中不可接受，这凸显出了高特异性抗体抑制剂的潜力。本发明通过在一实施方案中提供了多种抗体，其与伊马替尼和尼洛替尼相比具有对PDGFRα更高的特异性，从而克服了这一问题。
[0379] PDGFRα在以前就已经被确立为纤维化治疗的一靶点。两种进入早期临床试验的用于治疗癌症的抗人PDGFRα的单克隆抗体拮抗剂正在开发中(例如，见Shah等人(2010).Cancer 116,pp.1018-1026，此处全文纳入本 申请以供参考)。本发明所提供的方法促进了一结合到所述PDGFRα的效应细胞分泌产物的鉴定。在一进一步实施方案中，所述分泌产物在癌症和纤维化模型中阻断了人源和鼠源PDGFRα的活性。
[0380] 所述效应细胞检测的一实施方案测定一效应细胞分泌产物是否结合到，所述实施方案是基于使用存活与生长都严格依赖于所述细胞因子IL-3的悬浮细胞系(例如，32D和Ba/F3)，但这种“IL-3依赖”可以通过表达和激活几乎任何酪氨酸激酶来治愈。这一手段最初被Dailey和Baltimore用来评估BCR-ABL融合原癌基因并且已经被广泛用于高通量筛选小分子酪氨酸激酶抑制剂(例如，见Warmuth等人(2007).Curr.Opin.Oncology 19,pp.55-60；Daley和Baltimore(1988).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85,pp.9312-9316，每篇都全文纳入本申请以供各种目的参考)。为监测信号传导，PDGFRα和PDGFRβ(均为人源或鼠源的形式)在32D细胞(读出细胞)中表达，这种细胞是一天然不表达两种受体中任一种的鼠源造血干细胞系。这使得每条通路被分开成为可能，而用其他手段则难以实现因为两种受体通常共表达。在32D细胞中表达人PDGFRa/b在前期已被证实可以产生一功能性PDGF诱导的促有丝分裂的应答(Matsui等人(1989).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86,pp.8314-8318，此处全文纳入本申请以供参考)。在IL-3不存在时，32D细胞完全不分裂，但PDGF刺激表达RTK的细胞则解除了对IL-3的需要，并导致了快速的促有丝分裂的应答，可在显微镜下检测到。所述可检测到的应答，在一实施方案中，是细胞增殖、一形态改变、运动性/趋化性增强或在一拮抗剂存在时细胞死亡/凋亡。一光学复用法，在一实施方案中，被用于同时测量本发明所提供的一装置中PDGFRα和PDGFRβ应答的抑制/激活。在另一实施方案中，本发明所提供的一装置中PDGFRα和PDGFRβ应答的抑制/激活通过两种胞外检测进行测量，在同一间微流体小室中连续进行。
[0381] 人源/鼠源PDGFRa和PDGFRb全长cDNA(北京义翘神州生物技术有限公司)，在一实施方案中，在32D细胞(ATCC；CRL-11346)中用经过修饰的pCMV表达载体表达，其中还包括一段IRES序列连接GFP或RFP， 这样形成两类“读出细胞”，每类可以通过荧光成像进行区分。所述读出细胞的特征被阐明以优化培养基和培养条件，测定对PDGF配体的剂量应答，并阐明应答的形态学和动力学。悬浮细胞(如32D或Ba/F3)的应用提供的优势在于单细胞通过成像分析很容易被鉴定，并且在体积比吸附细胞上更小(在投影区域)，这样一单间小室能够容纳≥100个读出细胞才达到汇合。在另一实施方案中，没有用到32D细胞、Ba/F3细胞，而是使用另一依赖于IL-3的与32D特性类似的小鼠细胞系来作为读出细胞。32D和Ba/F3细胞均衍生自骨髓，在针对ASC优化的培养基中生长良好，并且也分泌IL-6，其是维持ASC的一关键的生长因子(例如，见Cassese等人(2003).J.Immunol.171,pp.1684-1690，此处全文纳入本发明以供参考)。
[0382] 已经开发了用于评估PDGFR作用的前临床模型。特别地，本发明提供了两种心脏纤维化模型。第一种基于缺血性损伤(异丙肾上腺素诱导的心脏损伤；ICD)而第二种基于冠状动脉连接诱导的心肌梗塞(MI)。损伤时，所述纤维化应答通过PDGFRα+/Sca1+阳性祖细胞的快速扩增被启动，其占针对损伤应答增殖的细胞的超过50％，随后这些子代增殖到产生低水平PDGFRα/低水平Sca1成肌纤维细胞的基质中。通过RT-qPCR检测基因表达显示多个与纤维化基质沉积有关的分子标记表达，包括α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)和I型胶原蛋白(Col1)，其在(Sca1+)祖细胞中可以被检测到，但在所述分化群中显著上调。在一实施方案中，鉴定到一细胞群包含一效应细胞，其分泌的一单克隆抗体减少了祖细胞的扩增，导致纤维化减少。这种胞外效应检测通过监控两种独立的分子标记进行：Sca1+/PDGFRα+阳性祖细胞的早期增殖和ColI驱动的GFP。特定地，在MI后，首先通过在PDGFRα+/Sca1+阳性祖细胞中表达GFP，然后在逐渐出现的成肌纤维细胞群中以更高的强度表达GFP来阐明纤维应答的特征。
[0383] 本发明提供了以平行的方式筛选多个细胞群的方法和装置，以鉴定一个或多个具有一胞外效应的，或与所述多个细胞群中的另一群相比在一胞外效应上具有变化的细胞群。所述鉴定到的细胞群包含一种或多种效应细胞，其 对所述胞外效应负责。所述胞外效应，例如，是一作用于一GPCR上的胞外效应，例如，GPCR结合、激动或拮抗。如本发明所描述，所述胞外效应无需归因于所述群中的每个细胞，或者甚至是多个细胞。相反地，本发明所提供的方法可以检测到一单个效应细胞的一胞外效应，而所述效应细胞存在于一异质性群中，所述异质性群包含几十到几百个细胞(例如，从大约10个到大约500个细胞，或从大约10个到大约100个细胞)，或包含从大约2个到大约100个细胞，例如，从大约2个到大约10个细胞。
[0384] GPCR是七个跨膜受体的一超家族，在人类基因组中包括超过800个成员。每种GPCR的氨基末端都置于细胞的胞外侧，而C末端尾部朝向胞质溶胶。在细胞内GPCR结合到异型三聚体G蛋白上。在激动剂结合时，所述GPCR发生构象改变，导致所述结合的G蛋白被激活。这些受体中的大约一半是嗅觉受体，其他的对应于各种不同的受体，从钙和代谢产物到细胞因子和神经递质。本发明，在一实施方案中，提供了一种方法用于选择一种或多种在一GPCR上具有一胞外效应的ASC。所述GPCR在本发明中没有限制。相反地，任何筛选GPCR的方法都可以用于本发明。
[0385] 天然地与特定的GPCR相结合的G蛋白的类型决定了所传导的细胞信号传导的级联放大。对于Gq偶联受体来自受体激活的信号是胞内钙水平的上升。对于Gs偶联受体，观察到胞内cAMP上升。对于占所有GPCR 50％的Gi偶联受体，激活导致cAMP产生的抑制。对于所述效应细胞的特性是一Gi偶联的GPCR被激活的实施方案，有时需要用一非特异性的腺苷酸环化酶激活剂来刺激所述读出细胞。在一实施方案中，所述腺苷酸环化酶激活剂是毛喉素。这样，通过一种或多种效应细胞激活所述Gi偶联受体将阻碍毛喉素诱导的cAMP上升。相应地，毛喉素在本发明所提供的一种或多种GPCR胞外效应检测中被用作一辅助颗粒。
[0386] 本发明，在一实施方案中，提供了方法测定一细胞群内的一效应细胞(例如，一ASC)是否具有一种作用于一GPCR的胞外效应。所述GPCR存在于一微流体小室内的一种或多种读出颗粒上，并且所述胞外效应在一实施方 案中是结合到所述GPCR、显示出亲和性或特异性、抑制或激活。所述GPCR可以是一稳定的GPCR，如通过Heptares Therapeutics(稳定的GPCR， technology)的方法所制得的GPCR。所述效应细胞(例如，ASC)，在一实施方案中，在一间微流体小室内作为一单细胞存在或存在于一同质性或异质性细胞群中。在一实施方案中，本发明所提供的方法和装置被用于鉴定一个或多个细胞群，每个群包含一种或多种ASC，其分泌一种或多种抗体对表3A和/或表3B的GPCR中的一种，或PCT国际公布文本WO 2004/040000(此处全文纳入本申请以供参考)所公开的GPCR中的一表现出一胞外效应。例如，在一实施方案中，所护GPCR术语以下类型中的一种：A类、B类、C类、粘附、frizzled。
[0387] 在另一实施方案中，所述胞外效应是一针对一表皮分化的效应，G蛋白偶联(EDG)受体。所述EDG受体家族包括11种GPCR(S1P1-5和LPA1-6)，其对脂类信号传导负责并且结合溶血磷脂酸(LPA)和鞘氨醇1-磷酸(S1P)。通过LPA和S1P的信号传导在健康和疾病中调控了多种功能，包括细胞增殖、免疫细胞激活、迁移、侵袭、炎症和血管发生。针对这一家族生产有效的和特异的小分子抑制剂几乎没有取得成功，使得单克隆抗体成为一非常有吸引力的备选方案。在一实施方案中，所述EDG受体是S1P3(EDG3)，S1PR1(EDG1)，其中后者已经被表明可以在几类癌症中激活NF-κB和STAT3，包括乳腺癌、淋巴癌、卵巢癌和黑色素瘤，并在免疫细胞运输和癌症病灶转移中发挥重要作用(Milstien和Spiegel(2006).Cancer Cell 9,pp.148-15，此处全文纳入本申请以供参考)。近期一中和S1P配体的单克隆抗体(Sonepcizumab)已经进入了二期临床试验，用于治疗晚期实体瘤(NCT00661414)。在一实施方案中，本发明所提供的方法和装置被用于鉴定和分离一ASC，其分泌的一抗体比Sonepcizumab的亲和力要高，或者其分泌的一抗体对S1P的抑制程度比Sonepcizumab要高。
在另一实施方案中，所述胞外效应是一针对所述LPA2(EDG4)受体的效应。LPA2在甲状腺、结肠、胃和乳腺癌中，以及在多种卵巢癌中表达，这些癌症中LPA2对LPA 的敏感性和有害效应作出了主要的贡献。
在另一实施方案中，所述胞外效应是一针对所述LPA2(EDG4)受体的效应。LPA2在甲状腺、结肠、胃和乳腺癌中，以及在多种卵巢癌中表达，这些癌症中LPA2对LPA 的敏感性和有害效应作出了主要的贡献。
[0388] 在一实施方案中，检测细胞群是否对一存在于一读出颗粒上的一趋化因子受体表现出一胞外效应。在一进一步的实施方案中，所述趋化因子受体是C-X-C 4型趋化因子受体(CXCR-4)，也被称为融合素或CD184。CXCR4结合SDF1α(CXCL12)，一较强的招募免疫细胞的趋化因子，也被称为C-X-C基序趋化因子12(CXCL12)。通过DNA免疫来产生92种针对这一靶标的杂交瘤，其中75种表现出不同的链使用情况和表位识别(Genetic Eng and Biotech news，2013年8月)，显示杂交瘤选择仅仅捕获了可用的抗体多样性中的一小部分。通过所述CXCR4/CXCL12轴线进行的信号传导已经被表明在肿瘤细胞生长、血管发生、细胞存活中起到关键作用，并且被表明参与介导产生CXCL12的器官中的二次病灶转移，像肝脏和骨髓(Teicher and Fricker(2010).Clin.Cancer Res.16,pp.2927-2931，此处全文纳入本申请以供参考)。
[0389] 在另一实施方案中，筛选细胞群是否能够对趋化因子受体CXCR7施加一效应，其近期被发现结合SDF1α。不像CXCR4是通过正常的G蛋白偶联进行信号传导，CXCR7独特地通过β抑制素传递信号。
[0390] 在另一实施方案中，所述GPCR是蛋白酶激活受体(PAR1、PAR3和PAR4)，其是一类通过凝血酶介导的对暴露的N末端进行切割而被激活的GPCR，并参与纤维化。在另一实施方案中，所述GPCR是如下表3A或表3B中GPCR的一种。
[0391] 在一胞外效应是一作用于一GPCR的效应的实施方案中，本发明不限于特定的GPCR。例如，表达特定GPCR的通过工程化来提供结合、激活或抑制的读出结果的细胞系可通过购买获得，例如，购自Life Technologies( 和TangoTM细胞系)、DiscoveRx、Cisbio、Perkin Elmer等，并且在本发明中可以用作读出细胞。
[0392] 在一实施方案中，来自以下受体家族之一的一GPCR在本发明中一种或多种读出细胞上被表达，并且对于一种或多种以下GPCR测量胞外效应：乙酰胆碱受体、腺苷受体、肾上腺受体、血管紧缩素受体、缓激肽受体、降血 钙素受体、钙感觉受体、大麻受体、趋化因子受体、胆囊收缩素受体、补体组分(C5AR1)、促肾上腺皮质激素释放因子受体、多巴胺受体、内皮分化基因受体、内皮素受体、类甲酰肽受体、甘丙肽受体、胃泌素释放肽受体、受体饥饿激素受体、胃抑制性多肽受体、胰高血糖素受体、促性腺激素释放激素受体、组胺受体、kisspeptin(KiSS1)受体、白细胞三烯受体、黑色素浓缩激素受体、黑皮质素受体、褪黑激素受体、胃动素受体、神经肽受体、烟酸、类鸦片受体、食欲素受体、孤儿受体、血小板激活因子受体、前动力蛋白受体、催乳素释放肽、前列腺素类受体、蛋白酶激活受体、P2Y(嘌呤能)受体、松弛素受体、分泌素受体、5-羟色胺受体、生长激素抑制素受体、速激肽受体、血管加压素受体、后叶催产素受体、舒血管肠肽(VIP)受体或垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)受体。
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[0403] 在一实施方案中，通过如下表4中提供的一种或多种检测来检测一效应细胞对一表达一GPCR的读出细胞是否具有一胞外效应。在另一实施方案中，一读出颗粒群包含一囊泡或一用一膜提取物功能化的小珠(可购自Integral Molecular)，或一稳定的溶解的GPCR(例如，Heptares)。
[0404] GPCR可以被磷酸化并与被称为抑制素的蛋白相互作用。三种测量抑制素激活的主要方法是：(i)显微术-通过一荧光标记的抑制素(例如，GFP或YFP)；(ii)通过酶补偿；(iii)通过TANGOTM报告系统(β-内酰胺酶)(Promega)。在一实施方案中，在一读出细胞或多种读出细胞中采用所述TANGOTM报告系统。这一技术用一GPCR与一转录因子通过一可切割的连接子相连。所述抑制素与一残缺的蛋白酶融合。一旦所述抑制素结合到所述GPCR上，局部的高浓度蛋白酶和所述连接子导致所述连接子的切割，释放所述转录因子到核中激活转录。所述β-内酰胺酶检测可以在活细胞上操作，不需要细胞裂解，并且可以在激动剂孵育后短至6小时内进行成像。
[0405] 在一实施方案中，一可以普遍用于检测GPCR信号传导的拮抗剂和激动剂的β抑制素GPCR检测被用于本发明缩提供的方法和装置中鉴定一分泌一结合到一GPCR上的生物分子的效应细胞(Rossi等人(1997).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94,pp.8405-8410，此处全文纳入本申请以供各种目的参考)。 这一检测是基于一β半乳糖苷酶(β-Gal)酶补偿技术，现在已被DiscoveRx商业化。所述GPCR靶标与β-Gal酶的一段N末端小片段同框融合。GPCR激活时，另一融合蛋白，含有与β-Gal的N末端序列连接的β抑制素结合到GPCR，导致一具有功能的β-Gal酶。所述β-Gal酶随后迅速将不发荧光的底物2-β-D-半乳糖苷(FDG)转换为荧光素，提供了大量的扩增和优异的敏感性。在这一实施方案中，读出细胞(带有GPCR)没有上芯片时就预先加载可穿透细胞的前底物(乙酰化FDG)，其通过酯酶切割乙酸基团被转换为不能穿透细胞的FDG。尽管荧光蛋白被活跃地转运到活细胞外，通过在一间微流体小室内实施这一检测所述荧光产物得到浓缩，与基于孔板的检测相比提供了大幅度提高的敏感性。DiscoveRx已经验证了这一检测策略，在微孔的形式中对多种GPCR进行了应用。
[0406] 在一实施方案中，一效应细胞对一GPCR的激活以微流体形式通过检测在一种或多种读出细胞内细胞质中的钙的增加进行测定。在一进一步的实施方案中，所述细胞质中的钙的增加通过一种或多种钙敏感染料进行检测。钙敏感染料在钙不存在时具有低水平的荧光，一旦被钙结合后荧光特性即发生上调。所述荧光信号在一分钟时达到峰值并在5到10分钟的窗口期可以被检测。因此，要通过荧光钙检测活性，所述检测和激动剂的添加是紧密偶联的。为了实现这种偶联，所述效应细胞同时与所述读出细胞群和一种或多种钙敏感染料相接触。在一实施方案中，所述一种或多种钙敏感染料是由FLIPRTM calcium assay(Molecular Devices)提供的一种。
[0407] 重组表达的水母发光蛋白水母素，在一实施方案中，被用于一功能性GPCR筛选，即一胞外效应检测，其中所述胞外效应是一GPCR的调节。水母素是一钙敏感的报告蛋白，当添加一腔肠素衍生物时产生一发光信号。GPCR与一靶向线粒体版本的脱辅基水母素共表达的工程化细胞系可通过购买获得(Euroscreen)。在一实施方案中，所述一种或多种可购自Euroscreen的细胞系在一评测一效应细胞的一胞外效应或一胞外效应上的变化的方法中被用作一群读出细胞。
[0408] 在一实施方案中，一GPCR上的胞外效应通过将一ACTOne细胞系(Codex Biosolutions)作为一群读出细胞进行测量，其表达一GPCR和一环核苷酸门控(CNG)通道。
在这一实施方案中，所述胞外效应检测用到了含有一外源的环核苷酸门控(CNG)通道的细胞系。所述通道被水平升高的胞内cAMP缩激活，其导致产生粒子流(通常可经过钙应答性染料检测到)和细胞膜去极性，可以用一荧光膜电势(MP)染料检测到。所述ACTOne cAMP检测可以用荧光微型酶标仪测量cAMP改变的终点和动态过程。
在这一实施方案中，所述胞外效应检测用到了含有一外源的环核苷酸门控(CNG)通道的细胞系。所述通道被水平升高的胞内cAMP缩激活，其导致产生粒子流(通常可经过钙应答性染料检测到)和细胞膜去极性，可以用一荧光膜电势(MP)染料检测到。所述ACTOne cAMP检测可以用荧光微型酶标仪测量cAMP改变的终点和动态过程。
[0409] 一报告基因检测，在一实施方案中，被用于测定一效应细胞是否调节一特定的GPCR。在这一实施方案中，所述GPCR的调节即为所评测的所述胞外效应。一报告基因检测，在一实施方案中，是基于一GPCR第二信使，如钙(AP1或NFAT应答原件)或cAMP(CRE应答原件)以激活或抑制置于一最小启动子上游的一应答原件，其相应地调控操作者所选取的蛋白的表达。所述报告基因的表达，在一实施方案中，与一转录因子的一应答原件相偶联，所述转录因子通过一GPCR的信号传导被激活。例如，报告基因的表达可以被偶联于以下转录因子之一的一应答原件：ATF2/ATF3/AFT4、CREB、ELK1/SRF、FOS/JUN、MEF2、GLI、FOXO、STAT3、NFAT、NFκB。在一进一步的实施方案中，所述转录因子是NFAT。报告基因检测可通过购买获得，例如购自SA Biosciences。
[0410] 报告蛋白为本领域已知，包括，例如，β-半乳糖苷酶、荧光素酶(例如，见Paguio等人(2006).“Using Luciferase Reporter Assays to Screen for GPCR Modulators,”Cell Notes Issue 16,pp.22-25；Dual-GloTMLuciferase Assay System Technical Manual#TM058；pGL4 Luciferase Reporter Vectors Technical Manual#TM259，均全文纳入本申请以供各种目的参考)、GFP、YFP、CFP、β-内酰胺酶。用于测量GPCR信号传导的报告基因检测可通过购买获得并可被用于本发明所提供的方法和装置中。例如，Life Technologies公司的 检测可用于本发明。
[0411] 在一实施方案中，在一报告细胞内对一G蛋白进行过表达以强制性地使 一偶联cAMP的GPCR通过钙离子传递信号。这被称为强制偶联。
[0412] 在一实施方案中，一偶联Gq蛋白的细胞系在本发明所描述的方法中被用作一读出细胞系。在一实施方案中，所述Gq偶联的细胞系通过β-内酰胺酶报告GPCR的信号传导。例如，一基于细胞的GPCR报告细胞系( Life Technologies)。所述报告细胞系可以是分裂被抑制的细胞或包括正常的分裂的细胞。
[0413] cAMP应答原件结合蛋白(CREB)是如上所提到的一转录因子，并且被用于一Gs和/或Gi偶联的GPCR的实施方案中。在一进一步的实施方案中，毛喉素被用作一辅助颗粒。所述购自SA Biosciences的CRE报告基因可以以质粒或慢病毒的形式用于驱动GFP表达，并且可以用于本发明所提供的所述方法和装置中。例如，在一实施方案中采用所述可购自SA Biosciences的检测系统产生一读出细胞l(http://www.sabiosciences.com/reporter_assay_product/HTML/CCS-002G.html)。Life Technologies也有表达特定GPCR的CRE应答细胞系，并且这些和读出细胞一样可被用于本发明所描述的方法中。
[0414] 在一实施方案中，通过检测一种或多种读出细胞内cAMP水平的上升或下降来检测存在于一细胞群中的一种或多种效应细胞是否能够激活或抑制一存在于所述一种或多种读出细胞上的GPCR。基于ELISA的检测、同质性时间分辨荧光(HTRF)(见Degorce等人(2009).Current Chemical Genomics 3,pp.22-32，所公开的内容全文纳入本申请中以供参考)和酶补偿法都可以与本发明所提供的所述微流控装置和检测一起用于测定读出细胞内的cAMP水平。这些cAMP检测方法中的每一都需要细胞裂解以释放cAMP进行检测，因为实际所要测量的是所述环化AMP。
[0415] 测量全细胞内的cAMP与测量膜内腺苷酸环化酶活性的检测可通过购买获得(例如，见Gabriel等人(2003).Assay Drug Dev.Technol.1,pp.291-303；Williams(2004).Nat.Rev.Drug Discov.3,pp.125-135，均全文纳入本申请以供参考)，并且可以用于本发明所提供的所述装置和方法中。即，一间或 多间微流体小室内的细胞群可根据这些方法进行检测。
[0416] Cisbio International(Codolet，法国)已经开发出了一基于时间分辨的荧光共振能量转移技术的敏感的高通量同质cAMP检测(HTRF，见Degorce等人(2009).Current Chemical Genomics 3,pp.22-32，所公开的内容全文纳入本申请以供参考)，可被用于在本发明中筛选一对GPCR表现出一效应的效应细胞。所述方法是细胞产生的天然cAMP与一cAMP标记的染料(cAMP-d2)之间的竞争性免疫检测。所述cAMP-d2的结合通过标记有穴状化合物的抗cAMP单克隆抗体进行观察。特异的信号(即能量转移)与样品中所述cAMP的浓度成反比，在这里样品是指在一读出细胞中被一效应细胞或一效应细胞分泌产物所激活的cAMP的含量。在cAMP被测量时，首先读出细胞被裂解以释放出游离的cAMP进行检测。这种检测已经在Gs-(β2-肾上腺素能、组胺H2、黑皮质素MC4、CGRP和多巴胺D1)和Gi/o偶联(组胺H3)受体上得到验证。
[0417] 基于荧光极化的cAMP检测试剂盒也可通过购买获得，例如，购自Perkin Elmer、Molecular Devices和GE Healthcare，且每种都可以在本发明所提供的方法和装置中用作一效应细胞检测。相应地，本发明的一实施方案包括基于cAMP荧光极化检测的结果选择一效应细胞和/或包含一种或多种效应细胞的细胞群。所述方法在一实施方案中被用于测定所述效应细胞在一特定的GPCR上是激活(激动)还是抑制(拮抗)。
[0418] 在一实施方案中，Perkin Elmer的AlphaScreenTMcAMP检测，一敏感的需要激光激活的基于小珠的化学发光检测被用于本发明所提供的装置以筛选一效应细胞，所述效应细胞对一读出细胞具有一种效应，特定地，为一GPCR的激活或抑制。
[0419] DiscoveRx(http：//www.discoverx.com)提供一同质性高通量cAMP检测试剂盒HitHunterTM，其基于一专利酶(β半乳糖苷酶)补偿技术，使用荧光或发光底物(Eglen和Singh(2003).Comb Chem.High Throughput Screen 6,pp.381-387；Weber等人(2004).Assay Drug Dev.Technol.2,pp.39-49； Englen(2005).Comb.Chem.High Throughput Screen 8,pp.311-318，均全文纳入本申请以供参考)。这种检测可在本发明中进行实施以检测一效应细胞，所述效应细胞在一表达GPCR的读出细胞上具有一胞外效应或具有一胞外效应的变化。
[0420] 还可以检测产生于GPCR受体激活或抑制的细胞事件来测定一效应细胞在一读出细胞上的特性(例如，一抗体产生细胞的激活或拮抗能力)。例如，在Gq偶联受体的情况下，当所述GPCR被激活时，所述Gq蛋白被激活，引起磷脂酶C切割膜磷脂。这一切割导致三磷酸肌醇(IP3)产生。游离的IP3结合到其内质网上的靶点导致钙的释放。钙激活特定的钙应答转录载体，如活化T细胞核因子(NFAT)。这样，通过监测NFAT的活性或表达，即可确立一读出细胞内的所述GPCR的直接或间接的读出结果。例如，见Crabtree和Olson(2002).Cell 109,pp.S67-S79，此处全文纳入本申请以供参考。
[0421] 一旦激活，全部GPCR中的超过60％会被内化。在一实施方案中，所述受体在配体存在与不在时的分布用一带标签的GPCR(典型地通过在C末端添加GFP标签)进行成像。在配体刺激时正常情况下均匀分布的受体通常会表现为被胞吞的点。
[0422]
[0423]
[0424]
[0425] 一实施方案的一单个抗体分泌细胞(ASC)/抗体筛选途径的工作流程如图1所示。在这一实施方案中，一宿主动物用一靶标抗原进行免疫并在最终免疫增强后一周从脾、血液、淋巴结和/或骨髓中收集细胞。然后这些样品可选地通过流式细胞术(例如FACS)或通过已经确定的表面分子标记(如果有的话)用磁珠纯化或使用微流体富集法富集ASC。所得到的ASC富集群随后被加载到一纳升容积小室的微流体阵列中，加样浓度选为每间小室达到从大约一个到大约500个细胞，或从大约一个到大约250个细胞。取决于富集前的步骤，单个的小室将包含多个ASC，单个ASC或零个ASC。小室随后通过关闭微型阀进行隔离并孵育，使抗体在小室狭小的空间内得以分泌。 因为ASC典型地以每秒1000个分子的速率分泌抗体，而本发明所提供的单个小室的容积在2nL的级别，在3小时内即可使每种分泌的单克隆抗体的浓度达到10nM(每中ASC分泌一唯一的单克隆抗体)。在一进一步的实施方案中，随后使用整合微流体控制进行试剂的投送和交换以实施基于图像的效应细胞检测，其结果通过自动化荧光显微镜和实时图像处理给出。接下来分泌具有所需要特性(例如，结合、特异性、亲和性、功能)的抗体的单个ASC或含有一种或多种ASC的细胞群从单个小室中被回收。然后对所述回收细胞群在有限的稀释度下进行进一步分析。当一单个的ASC被提供给一间小室并被回收时，也可以进行对所述单个的ASC的进一步分析。例如，在一实施方案中，所述进一步分析包括单细胞RT-PCR扩增配对的HV和LV以进行序列分析并克隆到细胞系中。
[0426] 在另一实施方案中，在一动物被免疫并且细胞从脾、血液、淋巴结和/或骨髓中被收集后，所述细胞构成一起始细胞群，其被直接加载到本发明所提供的微流控装置的单个小室中，即，作为多个细胞群，其中在每间微流体小室中存在着单个的细胞群。随后在所述单个小室中对所述单个细胞群进行一胞外效应检测以测定所述单个的细胞群中是否存在细胞群包含一种或多种效应细胞对一胞外效应负责。
[0427] 尽管一宿主动物可以在微流体分析前用一靶标抗原进行免疫，本发明并不仅限于此。例如，在一实施方案中，从一宿主(包括人)的脾、血液、淋巴结或骨髓中收集细胞，紧接着进行ASC富集。可选择地，不进行富集的步骤，细胞直接加载到本发明所提供的一装置的小室中，即，作为多个细胞群，其中单个的细胞群存在于每间小室内。
[0428] 本发明所提供的方法可以从任何物种的宿主中选择抗体。这对于治疗性抗体的发现提供了两个关键优势。第一，能够在除小鼠和大鼠以外的物种中操作使得可以选择与小鼠蛋白具有高度同源性的单克隆抗体，以及人类蛋白的与小鼠交叉反应的单克隆抗体，并因此可以被用于容易得到的临床前小鼠模型。第二，对小鼠的免疫通常会导致以几个表位的免疫显性为特点的应答 反应，致使产生的抗体多样性低；因此扩展到其他的物种大大提高了识别不同表位的抗体的多样性。相应地，在本发明所描述的实施方案中，小鼠、大鼠和兔子被用于免疫，随后从这些经过免疫的动物中选择ASC。在一实施方案中，对兔子用一抗原进行免疫，并用本发明所提供的方法和装置从所述免疫的兔子中选择ASC。作为本领域技术人员会认识到，兔子提供的优势在于亲和成熟的机制清楚，其利用基因转换来产生更丰富的抗体多样性、更大的体积(更丰富的抗体多样性)即离人类更远的进化举例(更多识别的表位)。
[0429] 所述免疫的策略，在一实施方案中是一蛋白、细胞和/或DNA免疫。例如，对于PDGFRα，获取自一哺乳动物细胞系表达产物或购买自商业渠道(Calixar)的胞外结构域被用于免疫动物。对于CXCR4，在一实施方案中，使用了类病毒颗粒(VLP)制剂，一购自商业渠道(Integral Molecular)的具有高水平表达天然构象GPCR的纳米颗粒。基于细胞的免疫通过在一细胞系(例如，对小鼠/大鼠用32D-PDGFRa细胞系，对兔子用一兔成纤维细胞系(SIRC细胞))；包括的操作流程中将一新细胞系用于最终的加强免疫以富集特异性的单克隆抗体。多种已建立的DNA免疫操作流程也可用于本发明。DNA免疫已经成为复杂的膜蛋白免疫的首选方法，因为其1)不需要蛋白的表达与纯化，2)保证了抗原的天然构象，3)降低了对其他细胞膜抗原的非特异性免疫应答的潜在风险，及4)对一些具有挑战性的靶点已经被证明有效(Bates等人(2006).Biotechniques 40,pp.199-208；Chambers and Johnston(2003).Nat.Biotechnol.21,pp.1088-1092；Nagata等人(2003).J.Immunol.Methods 280,pp.59-
72；Chowdhury等人(2001).J.Immunol Methods 249,pp.147-154；Surman等人(1998).J.Immunol.Methods 214,pp.51-62；Leinonen等人(2004).J.Immunol.Methods 289,pp.157-167；Takatasuka等人(2011).J.Pharmacol.and Toxicol.Methods 63,pp.250-
257，均全文纳入本申请以供各种目的参考)。所有免疫都根据动物护理要求和已经确立的操作流程进行。
72；Chowdhury等人(2001).J.Immunol Methods 249,pp.147-154；Surman等人(1998).J.Immunol.Methods 214,pp.51-62；Leinonen等人(2004).J.Immunol.Methods 289,pp.157-167；Takatasuka等人(2011).J.Pharmacol.and Toxicol.Methods 63,pp.250-
257，均全文纳入本申请以供各种目的参考)。所有免疫都根据动物护理要求和已经确立的操作流程进行。
[0430] 抗PDGFRα抗体以前已经在大鼠、小鼠和兔子体内生产过，并且PDGFRa 的胞外结构域的比较显示出几个变异较大的位点(图24)。因此预期从这一抗原可以获得比较好的免疫应答反应。抗CXCR4单克隆抗体也在以前通过脂颗粒与DNA免疫两种方法产生，所以这一靶点也可能产生较好的免疫应答反应。如果需要，我们会研究使用CroEI或GM-CSF的共表达(共表达或作为一融合蛋白)作为分子佐剂，以及测试不同的佐剂和免疫方案(Takatsuka等人(2011).J.Pharmacol.and Toxicol.Methods 63,pp.250-257 Fujimoto et al.(2012).J.Immunol.Methods 375,pp.243-251，此处全文纳入本申请以供各种目的参考)。
[0431] 本发明所提供的装置基于多层软光刻(MSL)微流控芯片(Unger等人(2000).Science 7,pp.113-116，全文纳入本申请以供参考)。MSL是一制造方法，通过小容积反应提供更高的灵敏度；高度的可扩展性和平行化；旺盛的细胞培养；灵活性与复杂检测所需的流体操作控制；以及降低的成本和试剂消耗。
[0432] 每次装置的运行所分离的效应细胞数(即，一装置每间小室内的细胞数)是加载到一装置上的一细胞悬液中细胞浓度、所述细胞悬液中所述被选择的特定的效应细胞的频率以及一装置上小室总数的函数。阵列数达到并超过40,000间细胞检测小室的装置正在构想中。
[0433] 在所有的微流控芯片技术中，MSL因其快速而廉价的制造具有成千的整合微型阀而独一无二(Thorsen等人(2002).Science 298,pp.58-584，此处全文纳入本申请以供参考)。这些阀可被用于建造更高等级的流体组件包括混合仪、蠕动泵(Unger等人(2000).Science 7,pp.113-116)和流体复合结构(Thorsen等人(2002).Science 298,pp.58-584；Hansen和Quake(2003).Curr.Opin.Struc.Biol.13,pp.538-544，此处全文纳入本申请以供参考)，因此能够实现高等级的整合与在芯片上操作液体(Hansen等人(2004)
.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101,pp.14431-1436；Maerkl和Quake(2007).Science 315,pp.233-237，此处均全文纳入本申请以供参考)(图25)。
.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101,pp.14431-1436；Maerkl和Quake(2007).Science 315,pp.233-237，此处均全文纳入本申请以供参考)(图25)。
[0434] 图25A显示一张通过MSL制作的一阀门的光学显微图。两条交叉的微 型通道，一条活动液流的“流动通道”(垂直向)和一条用于打开阀门的控制通道(水平向)形成一阀结构。所述流动通道通过一层弹性薄膜与所述控制通道隔离形成一夹管阀。对所述控制管道施压使所述膜发生偏斜，进而关闭了流动管道。图25B显示)一整合了多个阀的装置的部件(填充有绿色和蓝色食品染料)。图25C是一总共拥有16,000个阀、4000个小室和超过3000个层-层相互连接(箭形符号)的装置的部件。图25D显示一微流控装置的实例，用硬币显示其尺寸。
所示装置是对所述MSL制造技术进行注释说明。
所示装置是对所述MSL制造技术进行注释说明。
[0435] 一装置的所述检测小室，在一实施方案中具有的平均容积为从约100pL到约100nL。例如，在一实施方案中，在一间含有一细胞群的微流体小室内检测一效应细胞的一种或多种特性，其中所述微流体小室的容积是约100pL、约200pL、约300pL、约400pL、约
500pL、约600pL、约700pL、约800pL、约900pL、约1nL。在另一实施方案中，所述微流体小室的容积是约2nL。在另一实施方案中，检测一细胞群中一效应细胞的一特性的所述微流体小室的容积是从约100pL到约100nL、从100pL到约50nL、100pL到约10nL、100pL到约1nL、从约
50pL到约100nL、从约50pL到约50nL、从约50pL到约10nL或从约50pL到约1nL。而在另一实施方案中，检测一细胞群中一效应细胞的一特性的所述微流体小室的容积是约10nL、约20nL、约30nL、约40nL、约50nL、约60nL、约70nL、约80nL、约90nL或约100nL。
500pL、约600pL、约700pL、约800pL、约900pL、约1nL。在另一实施方案中，所述微流体小室的容积是约2nL。在另一实施方案中，检测一细胞群中一效应细胞的一特性的所述微流体小室的容积是从约100pL到约100nL、从100pL到约50nL、100pL到约10nL、100pL到约1nL、从约
50pL到约100nL、从约50pL到约50nL、从约50pL到约10nL或从约50pL到约1nL。而在另一实施方案中，检测一细胞群中一效应细胞的一特性的所述微流体小室的容积是约10nL、约20nL、约30nL、约40nL、约50nL、约60nL、约70nL、约80nL、约90nL或约100nL。
[0436] 所述MSL的制造过程利用了成熟的光刻技术及微电子制造技术的进步。MSL的第一步是用电脑绘图软件绘制一副流动和控制通道的设计图，然后在高分辨率掩膜上打印出来。覆盖有光刻胶的硅(Si)晶片被暴露于紫外光下，其在某些区域通过所述掩膜被滤掉。取决于所述光刻胶是负性的还是正性的，被暴露(负性)或未被暴露(正性)的任一类区域发生交联并且所述光刻胶会多聚化。所述未多聚化的光刻胶在显影液中可溶并且随后被洗掉。通过组合不同的光刻胶和用不同速度的旋涂包覆，硅晶片被赋予了多种不同图样的形状和高度，这样就划分了各个通道和小室。所述晶片随后被用作转移所述图样至聚二甲硅氧烷(PDMS)的模具。在一实施方案中，在用PDMS 制模前和划定光刻胶层面后，模具用帕利灵包覆(化学蒸汽沉积的聚对亚苯基二亚甲基多聚物障碍)以减少制模时PDMS的粘附、提高模具的耐用性并使小的特征可以复制。
[0437] 在MSL中，用不同的模铸造的不同的PDMS层互相堆积被用于在重叠的“流动”和“控制”层中形成通道。这两(或更多)层通过将一灌封预聚物组分与一固化剂组分按互补化学当量比进行混合耳结合到一起以实现硫化。为制作一简单的微流控芯片，从包含所述流动层的模具中铸造出一“厚”层(例如，在从约200-2000μm之间)，从包含所述控制层的模具中铸造出一“薄“层(例如，在从约25-300μm之间)。在两层都部分硫化后，所述流动层从其模具上被揭下来，并相对所述控制层进行排列(当控制层仍在其模具上时，通过视觉观察)。让所述控制与流动层进行黏合，例如在80℃黏合约15-60分钟。然后将所述双层厚片从所述控制模具上剥离，并且钻出入口与出口孔，所述双层厚片黏合到一空白PDMS层(即一没有任何结构特征的PDMS平面层)。在给予了更多时间黏合后，所述已完成的装置被加载到一片载玻片上。所述装置中的液流通过芯片外计算机可编程的螺线管进行控制，其开启了施加给所述控制层通道中的液流的压力。当对这些控制通道施加压力时，在所述重叠的互相垂直的控制和流动线路之间的具有韧性的膜偏斜进入所护流动通道，有效地用阀门调节了液流。这些阀的不同组合可以被用于生产蠕动泵、多路复用器控制并分离所述芯片的不同区域。
[0438] 对于所述流动层，用于控制液流进出所述检测小室的检测小室和通道通过所述光刻胶层来划定。本领域技术人员可以理解，一光刻胶层的厚度可部分通过旋涂包覆的速度与所选用的特定的光刻胶所控制。大部分所述检测小室，在一实施方案中，通过SU-8 100特征所划定，其直接位于所述硅晶片上。如本领域技术人员所知，SU-8是一常用的基于环氧树脂的负性光刻胶。可选择地，其他本领域技术人员所知的光刻胶可被用于划定具有如上所述高度的小室。在一些实施方案中，所述检测小室具有的高度和宽度分别为50-500μM和50-500μM，如所述SU-8特征所划定。
[0439] MSL制造技术可以制造范围值很广的装置密度和小室容积。对于本发明所提供的装置，在一实施方案中，在一台单个的整合装置中提供了从约2000到约10,000个效应细胞分析小室。所述效应细胞分析小室，在一实施方案中，具有的平均容积为从约1nL到约4nL，例如，从约1nL到约3nL，或从约2nL到约4nL。所述效应细胞分析小室，在一实施方案中，以串联的方式进行连接，如图26所描绘。这里举例说明，一具有以串联的方式进行连接的4032个单个的分析小室(平均容积2.25nL)的装置每次运行所达到的筛选通量为大约100,000个细胞(图8)。本发明所提供的装置中所使用的整合微流体阀门可以隔离小室，并且可以用程序来控制从多个入口中选择试剂进行洗涤，例如，从2个到约32个入口、从2个到约20个入口、从2个到约15个入口、从2个到约10个入口、从2个到约9个入口、从2个到约8个入口、从2个到约7个入口或从2个到约6个入口。还提供了更多的入口以控制阀门压力(图26)。
[0440] 本发明提供的装置利用了基于重力的细胞和/或颗粒固定化。基于重力的固定化可以灌注非贴壁类型细胞，并且一般可以在小室内交换缓冲液与试剂。每间小室都具有立方体的形状，在顶部有一条入口通道穿过(图26)。例如，本发明所提供的一间小室，在一实施方案中，具有以下的尺寸：50-250μm╳50-250μm╳50-250μm；长╳宽╳高，例如，150μm╳100μm╳150μm；长╳宽╳高。加样时，颗粒(例如，细胞或小珠)跟随着流线通过小室顶部，但当流动停止时掉落到所述小室的底部。由于层流的特性，所述流动速率在接近小室底部时可以忽略不计。这使得所述小室阵列可以灌注，并且可以通过组合的对流/扩散来交换试剂，而不会影响小室中非贴壁细胞(或小珠)的位置。
[0441] 重要的是，本发明所提供的装置可以长期培养并维持细胞，无论是效应细胞、辅助细胞或所述多种读出细胞。小室的微流体阵列被制造在一层厚的PDMS弹性体膜(例如，从约150μm到约500μm厚，约200μm厚，约300μm厚，约400μm厚或约500μm厚)内，膜上覆盖有一培养基池，例如，如以 前所描述的1mL培养基(Lecault等人(2011).Nature Methods 8,pp.581-
586，此处全文纳入本申请以供各种目的参考)。所述培养基池(等渗浴)到所述细胞小室的邻近性有效地阻断了蒸发(通过可以透气的PDMS材料)并保证了旺盛的细胞活力以及当细胞没有充分分化时生长超过数天，并且对于在纳升体积中实现具有与μL体积方式相同的生长速率和细胞应答的长期培养至关重要。图27显示本发明所使用的所述装置几个层面的示意图。
586，此处全文纳入本申请以供各种目的参考)。所述培养基池(等渗浴)到所述细胞小室的邻近性有效地阻断了蒸发(通过可以透气的PDMS材料)并保证了旺盛的细胞活力以及当细胞没有充分分化时生长超过数天，并且对于在纳升体积中实现具有与μL体积方式相同的生长速率和细胞应答的长期培养至关重要。图27显示本发明所使用的所述装置几个层面的示意图。
[0442] 本发明所提供的所述装置的膜设计还能够通过用一微毛细管刺穿所述膜的上半部分从任一小室中选择性回收细胞。
[0443] 本发明所提供的所述装置的结构的设计使得效应细胞的所述可溶的分泌产物在另外的组分，如辅助颗粒或细胞信号传导配体添加到所述小室的时候不会被冲走。另外，本发明所提供的装置可以让组分被添加到一间小室而不会引入一装置的单个小室之间分泌产物(例如，抗体)的交叉污染。在小室被串联的实施方案中，培养基的交换需要冲洗整个阵列。冲洗整个阵列，在一实施方案中，导致每间小室中抗体的流失并将交叉污染引入到下游小室。然而，当分泌产物结合到一间小室的表面或结合到一结合在表面上的一读出颗粒时，交叉污染和/或分泌产物的流失并不是一严重的问题，因为分泌产物被固定了。
[0444] 在一实施方案中，交叉污染和/或分泌产物的流失通过使用一如图28A-D所示的“可膨胀小室”设计来减低到最小程度。每间小室具有一单个入口，并连接到一段被一微型阀门控制的短的“进入通道”。每间小室的顶部被一凹形结构覆盖，其通过一层薄膜(～10μm)从所述小室被分开，这样当对所述小室施压时体积可以显著扩大。在一实施方案中，小室可膨胀到2╳体积，例如，2nL到4nL或1nL到2nL或2.5nL到5nL。在另一实施方案中，小室可膨胀到1.5╳体积，例如，根据应用从2nL到约3.5nL。颗粒(细胞或小珠)，在一实施方案中，通过向所述小室充气被加载进可膨胀小室中，使所述颗粒在重力下沉降，然后对小室放气。类似地，一相继充气、扩散混合和放气的过程可以洗涤所述小室的内含物和/或交换培养基。这一手段使得添加可溶性 配体时不会损失分泌常务，因为其仅被稀释了不到50％。可膨胀小室还消除了潜在的交叉污染，因为所述小室是串联的。这种结构的简单性使得可以整合密集的阵列，并且在一实施方案中可应用于在一平方英寸多一点的面积上具有10,000间小室的装置中。
[0445] 在一实施方案中，本发明所提供的所述微流控装置在抑制惰性效应的流动条件下进行操作并受到粘度的支配。这一液流方式的特征在于低雷诺数Re＝ρdu/η，其中ρ是流体的密度，d是所述通道的特征性长度，u是所述流动的特征性速率，而η是流体的黏度。在低雷诺数下所述液流的流线变得可以预测并且可以被设计成所想要的效果。例如，如图29和30所指，如果目的是仅加载效应细胞40到所述小室41的左边，在一实施方案中所述小室在设计上带有一限制性上游，例如，通过图30中所述小室的偏转器42形成，所述偏转器优选地将效应细胞引导至所述所述入口通道43的左边。在效应细胞40在流动中进入所述小室41时，其继续进入到所述小室的左边，紧随所述流动的流线，只要选择运输的时间使得所述效应颗粒不会大量地跨过流线扩散。类似地，在一实施方案中，读出颗粒通过使用一条连接到所述入口通道的辅助通道被引导至所述小室的右部，致使所述读出颗粒定位在所述入口通道的右边。在另一实施方案中，所述读出颗粒通过一条不同的通向所述小室的通道被引入，包括所述出口通道。本领域技术人员应理解所述层流特征的设计在引导颗粒到所述小室的一特定区域中提供了很大的灵活性，如果在一间小室内需要特定的位置排布。
[0446] 在一间特定的小室中将效应细胞与读出颗粒分隔开还可以通过一结构原件的应用来实现，通过在一条或多条所述装置的流动通道中操控所述流动、随机加样、一磁场、一电场或介电场、一重力场、影响粘附的所述微流体小室一表面的修饰，及所述效应细胞和所述读出颗粒的相对浮力，或以上的组合。
[0447] 在一实施方案中，效应细胞和/或读出细胞通过一所述小室内的结构原件被限定在一间小室或一间小室的一部分(例如，一效应区或读出区)。
[0448] 本发明所用到的“效应区”是一间微流体小室的一区域，其中一效应细胞，一效应细胞群(或其亚群)被保留在内。
[0449] 本发明所用到的“读出区”是一间微流体小室的一区域，其中一读出颗粒与效应细胞被分隔开，并且可以检测到所述效应细胞的一功能。例如，当一“效应区”和一“读出区”是一微流控装置的三维区域时，其可以是单个的小室(例如，一间复合小室)，其中所述小室之间通过液流互相通信。
[0450] 如本发明所述，在一实施方案中，一种或多种结构原件被用于在一间或多间小室中分布效应细胞和/或读出颗粒。在一进一步的实施方案中，所述一种或多种结构原件被用于将效应细胞和/或读出颗粒保留到一间小室的限定的区域，例如，一效应区和/或一读出区。在一些实施方案中，这类结构原件结合一种场(例如，重力、介质、磁等)使用来实现保留的功能。例如，在一实施方案中，一细胞栅栏被用于将细胞(效应或读出)困在一间小室的某个位置。细胞栅栏以前已在PCT申请公开文本No.2012/162779中进行描述，并且其公开被全文纳入本申请以供各种目的参考。本发明所用到的“细胞栅栏”指在一间微流体小室内作用为限制细胞和读出颗粒的运动但可以允许其他细胞产物运动的任何结构。
[0451] 在用到细胞栅栏的实施方案中，每个栅栏由一更薄的SU-8 2010特征定义，其坐落于所述SU-8 100特征顶上。这一结构如图31所描绘。细胞栅栏的制造以前已在PCT申请公开文本No.2012/162779中进行描述，其空开被本申请全文纳入以供各种目的参考。在一实施方案中，一细胞栅栏被用于捕获一效应细胞或一可选地包含一种或多种效应细胞的细胞群，微流体小室通过SU-8 100负性光刻胶(典型地高度为160μm)按照标准流程进行划定，除了最后一步显影被省略外。具体地，与SU-8 100光刻胶一起旋涂的一硅晶片在后曝光烘焙后冷却，SU-8 2010被旋涂到所述未显影的SU-8 100顶上，典型地，高度为10-20μm，而不对所述光刻胶进行显影。所述SU-8 2010的厚度决定了所述栅栏的高度。每间小室的深度为两层光刻胶高度的结合。
[0452] 在可选的细胞栅栏实施方案中，所述SU-8 100层被充分显影，且所述 晶片被另一层高于第一层的SU-8 100包被，这样区别变成了所述栅栏的高度。
[0453] 本发明所述的结构原件可利用重力在一间小室的不同侧保留效应细胞和读出细胞；这时重力被指向所述小室的底面并提供一股力量阻碍所述细胞升过所述栅栏。应注意，所述显微颗粒可能受到布朗运动的支配，导致其以随机的方式扩散越过栅栏。然而，一颗粒通过布朗运动自发地升过栅栏的几率是通过玻尔兹曼分布测定的，并且与玻尔兹曼因子e-E/KT成比例，其中E是升高所述颗粒到与所述栅栏高度相等的高度的势能(E＝颗粒的体积╳所述颗粒的密度与所述液体的密度之差╳所述栅栏的高度)，K是玻尔兹曼常数，T是所述液体的温度。因此，本领域技术人员能够设计并制造一栅栏的高度，使一颗粒自发地“扩散”越过栅栏的几率小到忽略不计。本领域技术人员还应该理解一高度确定的栅栏对某些颗粒(例如，小珠或细胞)提供了一障碍，这取决于通过所述栅栏的所需要的势能，但不会对液体中具有适当低的表观质量的颗粒形成障碍。例如，一高度为约20μm的栅栏不允许一细胞自发地通过扩散通过，但实质上对蛋白的扩散不形成障碍。在一实施方案中，用重力结合一结构原件来保留细胞。然而，其他的力，如磁梯度力、介质力、离心力、流动力或光学力可类似地被使用。
[0454] 结构原件也可通过提供一机械性障碍防止通过来有效保留效应细胞或读出颗粒。例如，一栅栏达到一间小室顶的缝隙‘d’的大小之内，其中‘d’比所有的效应细胞或读出颗粒的直径都要小，这种栅栏可以用作一障碍，而无需应用另一种力。这一结构也可以被设计成为通过设计所述缝隙‘d’使得一类颗粒可以通过而另一类不能来选择性地将效应细胞或颗粒分开到一间小室的不同侧。如图32所指，例如，在一实施方案中，效应细胞120具有一10微米的直径，一所述效应细胞和读出颗粒121(具有1微米的直径)的混合物被加载到一间小室的一侧，该侧与另一侧被一具有5微米缝隙(测量至所述小室的顶)的栅栏122隔开。通过适当地倾斜所述装置，所述1微米读出颗粒121被转移到所述小室的另一侧，而所述效应细胞120留在另一侧。这 样，所述效应细胞被置于一间小室的所述效应区内而所述读出颗粒被分隔到所述读出区内。
[0455] 一间小室中的孔也可被用于隔离检测试剂、效应细胞和/或读出细胞。例如，代表性的装置性状如图33和34所示。在一实施方案中，一间小室被设计为具有一孔阵列，其中小孔在一间小室的底部被划定(图33)。孔可以是任何性状，并基于所述效应细胞或设计为与其结合的读出颗粒而被设计。方形和圆形孔都可以用于本发明所描述的所述装置上，并且通常地，任何多边形的孔可在一间小室上。已经制造了多种具有方形和圆形孔的原型，以及方形和圆形的“柱”。效应细胞和读出细胞按一定浓度加载进所述装置中，在所述浓度下一间小室内的每个孔都含有细胞或读出颗粒的一亚群。例如，在一实施方案中，对一间小室内的每个孔进行处理使其含有一到零个效应细胞。这一设计可以在空间上限制所述颗粒/细胞。在用到离散的“效应区”和“读出区”的实施方案中，一效应细胞定义其所在的孔为一“效应区”，且一读出颗粒定义其所在的孔为一“读出区”。
[0456] 图34示出一“小珠陷阱”实施方案，可被用于本发明的装置。这一设计在空间上将多种读出颗粒(例如，多种小珠或读出细胞)或细胞群限制在一间小室内的一特定的空间位置上。这一设计克服了与小珠或颗粒相关的、通过其他方式在检测中会移动的问题，由此简化了下游成像和图像分析。所述读出颗粒具有固定的位置由于效应细胞和读出颗粒之间的扩散距离能够得到更好的控制也具有优势。
[0457] 一小珠陷阱(如图34所示)的操作，在一实施方案中，如下进行：读出颗粒被加载到一间小室里，然后让其通过重力沉降到所述小室的底部，而所述小室超右上角倾斜(即，由相互垂直的细胞栅栏和大体上圆形的颗粒陷阱围起来的朝右上象限开口的区域)。在所述读出颗粒或颗粒已沉降到所述小室的底部后，所述装置可以朝相反方向倾斜(沿着同样的轴)使得所述读出颗粒或颗粒沿着所述小室的底部滑动或滚动进入所述位于所述小室中心的圆形“陷阱”特征。如上述所提到，可采用同样的方法和装置来抑制效应 细胞。
[0458] 在一实施方案中，效应细胞和读出颗粒用微加工结构被置于一间小室内的一效应区和读出区，所述微加工被设计成保留一类或多类颗粒(例如，细胞)。例如，在一实施方案中，所述效应细胞或读出颗粒流可被设计成与微加工杯状结构相交叉，所述杯状结构被设计成可以保留颗粒但不能使所述流动通过。可以将这样的结构设计成为使其只能容纳一固定数量的颗粒或细胞，或容纳大小限定在一范围内的颗粒或细胞，使得所述结构对不同类型的颗粒具有选择性。这样的陷阱可基本上置于所述小室内或置于所述小室的进口或出口。
[0459] 在另一实施方案中，如图35所指，效应细胞81通过重力被提供给一间小室的底部，而读出颗粒82通过一陷阱结构84被置于所述小室的出口83，所述陷阱结构构造于所述出口通道里。
[0460] 根据本发明一实施方案，提供了在一小室的底部的一个或多个凹形结构(本发明中也被称为“杯状结构”)来将效应细胞与读出颗粒分隔开。如图36所指，例如，在一间小室362的底部提供了一端封闭的杯状结构361，所述小室的宽度比所述效应细胞363的平均直径小但比所述读出颗粒364的平均直径大。在这种构型中，读出颗粒364沉到所述杯状结构
361的底部，而效应细胞363被保留在所述杯状结构入口之上。在一些实施方案中，所述杯状结构361的底部可通过一带孔的膜和下方的通道结构接触以扩大与一端封闭的杯状结构中覆盖效应细胞的读出颗粒的流体通路。
361的底部，而效应细胞363被保留在所述杯状结构入口之上。在一些实施方案中，所述杯状结构361的底部可通过一带孔的膜和下方的通道结构接触以扩大与一端封闭的杯状结构中覆盖效应细胞的读出颗粒的流体通路。
[0461] 在一实施方案中，结构原件被置于一流动通道或小室中以保留一种或多种颗粒或细胞。如图37所指，结构原件371(或功能化的表面补丁等)可被置于所述流动通道(并不一定要是一微孔)内以保留一种或多种效应细胞372和/或一种或多种读出颗粒373。例如，陷阱结构可以设计成保留具有特定物理特性(例如，大小)颗粒或细胞，或者可以是非特定的(效应细胞和读出颗粒的随机分布)。阀374可被用于分隔毗邻的小室。
[0462] 在如上所述设计的扩展中(例如，图37)，所述流动通道中的结构原件 被设计成保留效应细胞和读出颗粒互相接近。如图38所指，在一实施方案中，一单元包括一效应细胞陷阱381以限制一效应细胞382和微型结构383以保留一种或多种读出颗粒384。直径小于所述细胞陷阱缝隙的读出颗粒通过所述细胞陷阱并被保留在所述微型结构383中，其位于效应细胞陷阱331的下游。所述效应细胞陷阱381中直径大于缝隙385的效应细胞被保留下来，如上所讨论。在另一实施方案中，微型结构被设计成能清楚界定不同类型读出颗粒(或效应细胞)的举例和位置。
[0463] 除了如效应细胞和读出颗粒之间的栅栏这样的障碍，带孔的膜也可作为一障碍并且因此也可以用于本发明。例如，如图39所示，在一实施方案中，一带孔的膜391(也被称为一扩散通道)被构造于容纳效应细胞395的效应细胞小室392和容纳读出颗粒394的读出颗粒小室393之间，提供了一水平向排列。在这种水平向排列中，所述带孔的膜391，在一实施方案中，被一筛阀或一流体通道替代，所述流体通道具有一小于所述效应细胞或读出颗粒直径的横断面。筛阀以前已经在美国专利申请公开文本No.2008/0264863加以描述，其公开被本申请全文纳入以供各种目的参考。
[0464] 在另一实施方案中，一带孔的膜被构造于PDMS层之间以提供一垂直的排列。在这一实施方案中，在一PDMS层中提供一效应区，在另一PDMS层中提供一读出区。垂直的排列的一个优势在于所述效应区和所述读出区之间的间隔被清楚地界定。
[0465] 在PDMS装置中包含带孔的膜以前已经被报道，例如，在Aran等人(2010).Lab Chip 10,pp.548-552；Cheuh等人(2007).Anal.Chem.79,pp.3504-3508中，所公开的内容本申请全文纳入以供各种目的参考。在一实施方案中，一带孔的膜根据下述实施方案之一被制造。
在另一实施方案中，一PDMS层通过添加一不易混合的液体到所述PDMS未固化的成分中变得多孔。在烘焙步骤中，所述不易混合的液体蒸发。在另一实施方案中，一PDMS膜在固化后通过激光消融或其他去除技术进行穿孔。更进一步在另一实施方案中，在一个或多个微型结构上铸造一PDMS膜，其高度超过了所述膜的厚 度以使所述PDMS膜变得多孔。
在另一实施方案中，一PDMS层通过添加一不易混合的液体到所述PDMS未固化的成分中变得多孔。在烘焙步骤中，所述不易混合的液体蒸发。在另一实施方案中，一PDMS膜在固化后通过激光消融或其他去除技术进行穿孔。更进一步在另一实施方案中，在一个或多个微型结构上铸造一PDMS膜，其高度超过了所述膜的厚 度以使所述PDMS膜变得多孔。
[0466] 在一实施方案中，一保留一种或多种效应细胞和/或读出颗粒的结构是一临时的和/或可去除的结构。在一实施方案中，如图40所注释，读出颗粒401(例如，小珠)相对于一筛阀402堆积(一只阻断所述通道部分横断面的阀)。然一层非功能性小珠403相对于所述读出颗粒401堆积，提供了一障碍。然后提供一层效应细胞404，相对于所述非功能性小珠层403堆积。根据图40可以理解，效应细胞404，在一实施方案中，通过所述供样通道405所提供。测量一种或多种效应细胞404在一种或多种读出颗粒401上的效应的效应细胞检测，在一实施方案中，通过下总线通道406来进行。临时结构的一个优点是小室内含物可以被回收，且在一些实施方案中，通过所述下总线通道打开一个或多个所述筛阀可选择性地被回收。
[0467] 除了微加工保留方法或领域外，水凝胶，如琼脂糖可以被使用以定位效应细胞和/或读出颗粒。例如，在一实施方案中，读出颗粒和/或效应细胞可被加载到液体琼脂糖中，例如，光敏琼脂糖，其在芯片上固体化。因此，所述效应细胞或读出细胞的运动是有限制性的，这简化了成像的过程而仍然可以让扩散性转运进行。在重新融解所述琼脂糖时，在一实施方案中为选择性重新融解，效应细胞用本发明所讨论的方法进行回收。在另一实施方案中，固定的细胞通过一微型操作仪或一种机器人的方法进行选择性回收。
[0468] 在一实施方案中，在一小室内的一特定的区域，或者在一实施方案中在一间小室内，将效应细胞与读出颗粒隔离是通过一特异性流型、随机加样、一磁场、一电场或介电场、一重力场、对所述微流体小室的一表面的修饰及选择所述效应细胞与所述读出颗粒的一特定的相对浮力，或以上的组合来实现。例如，在一实施方案中，所述细胞群用磁性颗粒标记或所述读出颗粒带有磁性，这样一间特定小室的顶部表面提供磁场时可以吸引所述细胞群活所述读出颗粒向上，并且当所述细胞被磁性标记时远离所述读出颗粒，或者当读出颗粒被磁性标记时远离细胞。在另一实施方案中，用来孵育所述细胞群和读出颗粒的所述流体的特定重力可以基于所述效应细胞和读出细胞的相 对浮力被选择来促进它们的分离。某些颗粒和细胞抑制方法在下文会更加详细地进行讨论。
[0469] 效应细胞和读出颗粒，在一实施方案中，通过对一间小室的一面或多面壁进行功能化被分布于所述小室内。在一实施方案中，所述表面功能化通过接枝、共价连接、吸附或其他将一种或多种分子连接到所述小室表面的方法，或修饰所述小室的表面进行，这样细胞或颗粒对所述小室表面的粘附力被改变。用于本发明的这种功能化的非排他性的实例有蛋白的非特异性吸附、蛋白的化学偶联、聚合物的非特异性吸附、聚合物的静电吸附、小分子的化学偶联、核酸的化学偶联、表面氧化等。PDMS表面的功能化在以前已经进行描述，并且这些方法可以被用在本发明中来功能化本发明所提供的装置的表面(例如，见Zhou et al.(2010).Electrophoresis 31,pp.2-16，全文纳入本申请以供各种目的参考)本发明所述的表面功能化，在一实施方案中，选择性地结合一类效应细胞(例如，存在于一细胞群中的一效应细胞)，或选择性地结合一类读出颗粒。在另一实施方案中，所述表面功能化被用于抑制存在于一间小室内的所有读出颗粒。
[0470] 而在另一实施方案中，一表面功能化或多种不同的表面化在一装置的一小室内从空间上进行界定。可选择地，一表面功能化或多种表面功能化覆盖整个小室。这两个实施方案都可用于让效应细胞和读出颗粒分布到一间微流体小室内清楚的位置。例如，在整间小室都被一结合所有类型引进读出颗粒的分子所功能化的实施方案中，所述颗粒通过如上所述的方法被指引到所述装置的不同区域，在那里它们被固定化在所述表面上。在另一实施方案中，整间小室可被功能化以仅仅结合一特定类型的读出颗粒。这时，所有的颗粒，在一实施方案中，首先通过本发明所述的方法之一被指引到一区域，导致颗粒的一子群粘附到位于所述功能化区域的小室表面，随后向一不同区域施加一种力量，其仅取代不结合所述功能化表面的颗粒。而在另一实施方案中，所述装置的区域(例如，不同的小室或一单间小室内的区域)被不同的分子所功能化，所述分子选择性地结合效应细胞和/或读出颗粒的不同的子群，这 样诱导所述效应细胞和/或读出颗粒与基本上所述整间小室表面相互作用导致不同类型的颗粒或细胞分配到不同的区域内。如本发明所述，意图将所述表面功能化单独或结合其他本发明所述的方法一起用于效应细胞和读出颗粒操作。可能存在多种颗粒和细胞抑制方法的组合，结合多种流体外形。
[0471] 在另一实施方案中，效应细胞和/或读出颗粒通过磁场被置于一间小室内。应理解为了用磁力定位一效应细胞和/或一读出细胞，所述效应细胞和/或读出细胞首先通过结合于它们的磁性颗粒或被暴露于结合于它们的磁性颗粒功能化。在一实施方案中，所述磁场在外部创建，即通过在所述微流控装置外使用一磁铁、一电磁铁、一螺线管或其他方法。在另一实施方案中，如图41所指，所述磁场通过一整合于所述装置或与所述装置分开的一磁性结构90在局部产生。所述磁场，在一实施方案中在不同时间施用，并且在一实施方案中，所述磁场结合所述颗粒的加载一起施用，以影响应答于磁场的效应细胞和/或效应颗粒的所述位置。
[0472] 本领域技术人员应理解可通过购买获得用于分离和/或纯化生物样品的小珠或纳米颗粒可用于本发明提供的所述装置和方法中。例如，“Dynabeads”(Life Technologies)是超顺磁性、均匀的球状多聚物颗粒，并且在一实施方案中被作为读出颗粒用于本发明所提供的装置和方法中。偶联有特异性结合不同靶标表位或细胞类型小分子的磁性颗粒在本领域已是众所周知，并且也可以用于本发明所提供的装置和方法。当一具有非均匀特性的磁场存在时，这样的磁性颗粒会受制于一被指向所述磁场的梯度的力量。这种梯度力，在一实施方案中，被应用于在一间小室内定位颗粒。
[0473] 如图42所描绘的实施方案所指，应理解一种梯度力可以被特定地施用于一颗粒子群以偏好性地指在一间小室内引一亚类，即颗粒100。在一实施方案中，这种梯度力在颗粒进入所述小室前被施用以将其定位到所述入口通道的一指定位置，由此导致颗粒加载到所述小室的一特定区域。在另一实施方案中，所述梯度力在所述颗粒加载到所述小室中之前，之中或之后被施用。
[0474] 除了流力以外，流体中的一细胞或颗粒(例如，效应颗粒或读出颗粒) 可受制于衍生自一外部场的“体力”。本发明所提供的所述微流控装置的定向，在一重力场内科被用于指引效应细胞和读出颗粒到一间装置小室的一特定区域。如图43所注释，一种这样的方法牵包含在实体上沿一栅栏的轴线倾斜所述整个微流控装置和样品架，并等待足够的时长让各种颗粒按重力沉降到栅栏两侧的任意一侧。在一实施方案中，所述倾斜角度为从约30度到约50度，例如从约30度到约45度。然而，应理解这一角度根据加载的所述细胞或颗粒、所述流速和所述溶液的粘度可以进行调整。应理解一装置沿不同方向进行倾斜依所述倾斜的时机和所述颗粒的引入可用于指引多群颗粒到多重清晰的区域。
[0475] 本领域技术人员应理解在一间小室内用重力来指引颗粒可通过多步完成。如图44所指，通过举例，一装置基本上被倒置，并且所述颗粒51通过翻转所述装置被指引到一间小室顶的一边。接下来，所述装置被迅速转回竖直的位置，这样所述颗粒在所述装置归位的过程中不会移动太远。所述颗粒随后沉降到所述小室的底部，但由于栅栏50的存在仍维持在所述小室的右边。这样，所述小室顶上的特征可被用来分开不同类型的颗粒，接着转移所述颗粒到各间小室的底部而基本上不改变所述小室内颗粒在侧部的定位。本领域技术人员应理解，如上所述的为了定位颗粒而翻转所述装置的时间部分取决于所述颗粒掉落通过所述液体的速率以及能够被接纳用于精确定位的最大位移。一颗粒掉落穿过一流体的速率的方向与所述重力场的方向一样，并且可以根据以下方程进行计算，该方程为本领域技术人员所知晓：
[0476] U＝V颗粒*(ρ颗粒–ρ液体)*g*γ-1
[0477] 其中V颗粒定义所述颗粒的体积，g是重力加速度，γ是所述颗粒的阻力系数。对于一球状颗粒，γ通过斯托克斯阻力方程可较为准确地估算为：
[0478] γsphere＝6πηr
[0479] 在本发明的一些实施方案中，重力被用于定位一间小室内的颗粒，所述颗粒的有效大小和/或密度通过使用更小的结合于所述颗粒表面的颗粒来操纵。例 如，所述效应细胞可以与铁磁性微型珠接触，所述铁磁性微型珠被功能化以结合所述效应细胞，由此导致所述效应细胞具有高得多的有效密度和具有略微更大的阻力系数，其净效果为使细胞更快地穿过重力场掉落。
[0480] 还在本发明范围内的，并且与使用重力定位颗粒相关的，是使用流体内所述颗粒的浮力来指引液流和效应细胞以及读出颗粒的定位。如图45所指，例如，在一实施方案中，效应细胞74和读出颗粒73具有不同的密度，所述效应细胞74的密度大于所述小室77内液体的密度，所述读出颗粒的密度小于所述液体的密度，并且所述装置被置于一重力场内，所述重力场从顶75到底76在所述小室中方向朝下，所述效应细胞和所述读出细胞分别被分流至所述装置的底部和顶部，由此界定所述小室77的效应区和读出区。在一实施方案中，这种效应通过向所述液体中添加组分进行控制，所述组分改变改变密度和/或所述颗粒的修饰，或所述读出颗粒73和效应细胞74的选择，使其具有适当的密度差。应注意，通过在所述小室中交换培养基所述颗粒的分流可进行可逆地调控。这样一种交换在本发明的范围内。
[0481] 效应细胞和/或读出颗粒，在一实施方案中，通过使用一静电场和/或介电场被分流到一间小室的不同区域，所述静电场和/或介电场赋予所述颗粒一种力量。这些场，在一实施方案中，在外部对所述装置产生。在另一实施方案中，所述静电场和/或介电场通过在所述微流控装置内的一种或多种微加工电极在局部产生。这种电极可在所述装置所被假设的金属基座上被界定、整合到所述装置的单独一层里或通过将微流体通道内灌满导电液体来界定。有很多在微流控装置内整合电极的实例，并且多种整合的方法和形状对本领域技术人员也会是显而易见的。例如，由Li等人(2006).Nano Letters 6,pp.815-819，此处全文纳入本申请以供参考，所公开的电极可以用于本发明。
[0482] 在一实施方案中，一介电场被施用于本发明所述的装置之一，所述介电场被设计为具有一频率，该频率导致具有差异属性的颗粒具有一差动力，其导致所述颗粒根据差异属性分开。如图46所示为一利用介电场在一间小室内定位效应细胞和读出颗粒的实例，所述介电场由如图46所示的一整合电 极产生。在这一实施方案中，效应细胞110穿过一坐落于所述装置顶部的入口通道112被加载到一间在底部具有一栅栏结构111的小室内。加载所述效应细胞110后，一电极113倍用来产生一具有梯度的介电场，其导致一种力量作用于所述效应细胞110。这种力量被指引朝向所述小室的一边，导致所述效应细胞110选择性地掉落(在重力的影响下)进入所述小室的效应区。然后用读出颗粒和一位于所述小室另一边(读出区)的一电极重复这一过程可用来加载所述读出颗粒到所述读出区。这样的电介质操作提供了一可以用于多种构造和过程的目的分流效应细胞和读出颗粒。
[0484] 而在另一实施方案中，通过所述小室的形状的适当设计和所述加样密度，效应细胞和/或读出颗粒被高效地随机加载到一间微流体小室的所述效应区和读出区。例如，图33示出一具有45微孔阵列的一微流体小室，其被建造在所述小室的底部，具有大约2纳升的体积。加载效应细胞和读出颗粒到所述微流体小室的所述微孔内，在一实施方案中，通过如上所述使用重力来完成。如果效应细胞和读出颗粒的数量被保持的足够低，那么存在一种较低的可能性，即两个效应细胞和/或读出细胞被定位于所述微流体小室内的同样的微孔中。
[0485] 每间小室的所述效应细胞和读出颗粒的数量可以进行选择，使得具有一间同时有一读出颗粒和一效应细胞的小室的概率非常低。作为一实例，在一实施方案中，对效应细胞和读出颗粒的浓度进行选择，使得每间小室中平均有三种类型。假定所述微孔内的颗粒为随机分布，则一间小室的一给定微孔中具有k个两种类型中的任一颗粒的几率由泊松统计学给出如下：
[0486] P(一个微孔中超过一个)＝λke-λ/k！
[0487] 其中λ＝所述微流体小室的每个微孔中的颗粒平均数，在本例中为(3+3)/45＝0.133。因此，本实施方案在一个微孔中具有0或1个颗粒的可能性是：
[0488] P(k＝0)＝e-0.133＝87.5％,and P(k＝1)＝11.7％。
[0489] 因此，在本实施方案中具有超过一个颗粒的几率被给出为P(k>1)＝100％-87.5％-11.7％＝0.83％。那么在一间给定的小室内具有另个包含超过一个颗粒的微孔的几率可根据二项统计学给出如下：
[0490] P(无含有超过一个颗粒的孔)＝(1-0.0083)45＝69％。
[0491] 因此，在本例中大约70％的所述小室将无含有超过一个颗粒的微孔。应理解这一分析代表了可用小室部分的下限，因为当一些小室在至少一个微孔具有超过一个颗粒时用其他小室仍将可能进行有用的测量。
[0492] 进一步考虑，所述微孔可以被设计成具有一定尺寸，使其无法容纳超过一个颗粒。这时，加样后倾斜所述装置可用来确保所有颗粒都被包含在所述装置的一微孔内，并且没有微孔具有超过一个颗粒。还应理解，不同类型的颗粒，包括不同的效应或读出颗粒，可先后或一起进行加样，取决于所述检测的设计。最后，应理解，这一形状，尽管用到了微孔，仍保持了小室隔离的优点，因为所述微孔阵列被包含在一间小室内，所述小室具有与其他小室相隔离的能力。
[0493] 如上述所提到，上述所述的一种或多种方法，在一实施方案中被结合使用以实现将分别位于一间微流体小室的一效应区和读出区的可选地包含一种或多种效应细胞的细胞群和一读出颗粒群分隔开。另外，上述方法中的一种或多种，在一实施方案中，被用于实现将一细胞亚群从一原始的细胞群分隔开，或将一读出颗粒亚群从一读出区的群分隔开，例如，在一微流体小室的一效应区或读出区的特定区域。
[0494] 效应细胞和读出颗粒，在一实施方案中，通过一共同的入口被投放到一间小室并且在进入小室时被分隔开。可选择地，效应细胞和读出颗粒通过独立的特定针对所述效应区和读出区的入口被引入到所述小室。如图47所指，一间小室298根据本发明一实施方案被示出。效应细胞290通过效应细胞入口292被引入到效应区291，而读出颗粒293通过读出颗粒入口295被引入到所述小室的读出区294。在所述注释的实施方案中，效应区291和读出区 294分别具有出口296和297，然而本发明并不局限于此。具体地，所述效应区291和读出区
294，在另一实施方案中，具有一共同的出口。
294，在另一实施方案中，具有一共同的出口。
[0495] 在另一实施方案中，一复合小室(即一含有多间分室的小室)被用来提供一效应区和读出区。一复合小室300的一实施方案如图48所示。在一实施方案中，包含一种或多种效应细胞301的一细胞群通过所述细胞入口304被投放到效应区302，其由复合小室300的效应细胞分室303界定。类似地，读出颗粒305通过读出颗粒入口308被投放到读出区306，其分别由复合小室300的读出颗粒分室307界定。在所述注释的实施方案中(图48)，效应细胞分室303和读出颗粒分室307通过孔311相互之间有流体通信。阀312，在一实施方案中，在孔311中被提供以使得所述孔可被可逆地封口。
[0496] 在一实施方案中，粘附力被用来在一些实施方案中将效应细胞从读出颗粒分离。例如，熟练的技术人员可由如图49所示的实施方案所指导。在图49中，小室480用一包被溶液功能化以使得依赖锚定的读出颗粒能够粘附。然后所述小室被倒置以加载依赖锚定的读出细胞481直到其粘附于顶部表面482。所述小室480然后再一次被倒置以加载一细胞悬液
483，其能够通过重力沉降到所述小室480的底部表面484，有效地分离了所述细胞群和所述依赖锚定的读出细胞481到分别的效应和读出区内。所述细胞群，在一实施方案中，包含一种或多种效应细胞。
483，其能够通过重力沉降到所述小室480的底部表面484，有效地分离了所述细胞群和所述依赖锚定的读出细胞481到分别的效应和读出区内。所述细胞群，在一实施方案中，包含一种或多种效应细胞。
[0497] 在如图50所描绘的实施方案中，一提高细胞粘附的包被溶液530在具有层流的T形连接533通过使所述包被溶液与另一溶液532，例如，磷酸缓冲盐溶液流动被引入到小室531的半边，并通过重力(箭形符号表示)被指引到有粘附的包被535的一侧。在结合一段时间后，未结合的读出细胞534从所述小室531中被冲走。然后加载一细胞群536到所述小室531。所述细胞群536通过重力被保持在所述小室531的对侧537，而所述粘附的读出细胞534仍留在具有包被535的一侧。所述细胞群，在一实施方案中，包含一种或多种效应细胞。
[0498] 如图51所描绘的实施方案所指，两种溶液，例如含有一针对靶标A的抗体(抗A抗体)的溶液A540和含有一针对靶标B的抗体(抗B抗体)的溶液B541从T形连接543的不同侧被加载到小室542，并能够包被所述功能化的小室542的表面(例如，蛋白A包被的PDMS)。通过层流，所述小室542的第一半544被所述抗A抗体包被，而所述第二半545被所述抗B抗体包被。两类不同的颗粒，第一类在其表面展示抗原A的颗粒546和第二类在其表面展示抗原B的颗粒547随后被引入到小室542。两类颗粒的分离可通过先在一边，然后在另一边倾斜小室542来完成，这样一旦一颗粒到达包被有针对其展示的抗原的抗体的部分就会留在所述小室合适的一侧。
[0499] 一旦一小室被加载了一细胞群和一读出颗粒或读出颗粒群，以及可选地另外的用于对所述细胞群进行检测的试剂，所述小室，在一实施方案中，通过流体从所述微流控装置的一间或多间剩余的小室被隔离。在一实施方案中，隔离所述小室通过在物理上对其封口来实现，例如，用一种或多种阀通过流体来将所述小室从其周围环境隔离。本领域技术人员应理解，本发明所述的一阀是通过一“控制通道”所控制，并且通过对所述控制通道施加足够的压力，一特定的阀可被打开。在一实施方案中，一间给定的小室的分部(例如，一效应区和一读出区)，或一间复合小室(即，一间包含多个分室或孔的小室)的一间分室通过物理上封闭所述分部或分室被相互隔离，以通过流体隔离所述分部或分室，例如，通过一个或多个阀。
[0500] 在另一实施方案中，将一间小室从其周围环境隔离不通过在物理上将所述小室封闭来实现。相反地，隔离是通过限制小室之间的流体通信来排除所述微流控装置的一间小室和另一件小室之间明显的污染来实现的。例如，不使用一种或多种阀，毗邻的小室通过不易混合的流体相，如一种油来封闭小室的入口和/或出口而被分开。可选择地，小室被设计成具有入口和出口使得进出小室的扩散足够慢，以至于不会显著地阻碍在特定小室内部的所述分泌产物效应的分析。
[0501] 多种小室的排列在全文中已有描述。
[0502] 图52示出用于本发明实施方案的一间小室的结构。所述结构包括小室311(构造于所述“流动层”)，其排列成一列，其中每间小室与其相邻小室通过一阀312(“控制通道”层)被隔离。在另一实施方案中，阀位于每间小室上面(一“盖子小室”)，如图53所注释，致使其在芯片上的特征密度比所述列结构更高。在如图53左边所描绘的实施方案中，所述小室321的宽度比所述圆形的供样通道323的宽度更窄(例如，用以投送效应细胞和/或读出颗粒)，其中所述阀322封闭了所述小室的周边。圆形的通道，如本发明所详细讨论，通过在某些种类的光刻胶，如Megaposit SRP220系列(Microchem)和AZ 40 XT(MicroChemicals)上铸PDMS模来制造。在如图53右边所描绘的实施方案中，所述小室321的宽度超过所述供样通道的宽度。在这一实施方案中，小室通过一单个阀322倍隔离，所述阀322自动地关闭每间小室的入口和出口。
[0503] 重要的是，本发明所述微流控装置不限于串联排列的小室，这些串联排列的小室以一“流过”的模式被使用，小室被排成列，其中一间小室的出口与一间毗邻的下游小室的入口相连。相反地，本发明提供并包括了了一些不同的小室的排列和填充模式。例如，在一实施方案中，小室被平行排列，这样多间小室通过同样的供样通道被自发地使用。在一进一步的实施方案中，平行小室阵列被用在“一段封闭的”填充模式中(即其中所述小室不包含出口)。
[0504] 图54和55示出本发明的多种平行小室排列的实施方案。在这些实施方案中，每列小室331(图54)小室331(图55)共享一入口通道332和出口总线通道333。在这些构造中，小室间的交叉污染用阀334来预防。图55示出一实施方案，其中一间小室的一效应区335可通过流体与同样一间小室331的所述读出区336隔离。具体地，如图55所注释，所述小室331，在一实施方案中，包含一间符合小室，其中一效应区335通过可封闭的通道337(例如，可以用一阀337封闭)与一读出区336隔离。单个小室间的污染，在一实施方案中，被减少，因为每间小室的分泌产物不会通过位于所述装置上更下游的小室所转运。重要的是，所述供样通道内的试剂可以被替换，同 时小室仍然保持隔离，消除了在串联排列的小室中可能发生的梯度效应的风险。
[0505] 在一些实施方案中，例如，如图56所注释，一可以通过一阀控制的一间小室和一通道之间的单一的连接可以作为一入口和一出口发挥作用，取决于所述流动的方向是进入还是流出所述小室。如图56所指，一间小室341通过一单个的被一阀344所控制的连接通道343与一供样通道342相连。这时所述小室的壁由具有弹性的透气材料制成。这使所述小室可以“一端封闭”地由所述连接通道343通过在所述小室341内将空气压进所述PDMS材料而被填充。这一结构的俯视图如图56左下方所提供，其中所述小室341通过一单个的连接通道343与所述供样通道342相连。一阀344可通过流体被打开以将所述小室341从所述供样通道342隔离。图56左上方的图示出同样结构的横断面。
[0506] 一旦所述小室341被填充，流动仍然可以通过调节所施加到所述小室上的压力被指引进入(图56，右上)或流出(图56，右下)所述小室341，着导致所述小室341在体积上扩增或压缩。所述调节和改变所述小室体积的能力在检测所述小室341内的颗粒345(例如，细胞)中具有优势。例如，在一实施方案中，通过将颗粒345置入所述供样通道342中，向所述供样通道342中施加一高于所述供样通道341中压力的压力，然后向所述小室341打开所述阀344以使得所述液流进入所述小室341进而将颗粒345引入到所述小室341中。在另一实施方案中，所述阀344先被打开，然后所述供样通道342的压力增加。一旦进入所述小室341，所述颗粒345，例如效应细胞或读出颗粒，将在重力的影响下掉落到所述小室的底部。
[0507] 在一进一步的实施方案中，所述供样通道342的压力随后被降低，致使所述小室341松弛变形回到其原始的体积，使所述流动被向所述小室以外指引。由于所述颗粒345(例如效应细胞和/或读出颗粒)位于所述小室341的底部，它们基本上从所述流动中被去除并在压力减小时保持所述小室中。调节供样通道342的压力还可以被用于周期性向所述小室
341中添加新鲜培养 基以维持所述细胞的活力和生长，无论是效应细胞还是读出细胞。在这一实施方案中，所述小室341用新鲜培养基充入膨胀，所述新鲜培养基通过扩散与已经在所述小室中的培养基混合。一旦混合，在所述小室341内的液体的一部分被移除，且这个过程根据使用者的需要被重复。重要的是，通过在随后的培养基添加的步骤之间将所述小室
341相对所述供样通道关闭后冲洗所述供样通道(如通过阀344)，一阵列内的一小室的内含物不会污染在所述小室阵列中的其他小室。
341中添加新鲜培养 基以维持所述细胞的活力和生长，无论是效应细胞还是读出细胞。在这一实施方案中，所述小室341用新鲜培养基充入膨胀，所述新鲜培养基通过扩散与已经在所述小室中的培养基混合。一旦混合，在所述小室341内的液体的一部分被移除，且这个过程根据使用者的需要被重复。重要的是，通过在随后的培养基添加的步骤之间将所述小室
341相对所述供样通道关闭后冲洗所述供样通道(如通过阀344)，一阵列内的一小室的内含物不会污染在所述小室阵列中的其他小室。
[0508] 同样的这种调节供样通道压力的方法，在一实施方案中，被用于向一间小室中添加试剂，所述试剂对于观察和测量小室内一种或多种效应细胞对一种或多种读出颗粒的效应是必要或充分的。例如，如下文详述，一含有一种或多种效应细胞的细胞群在一实施方案中被检测所述一种或多种效应细胞是否能够中和一细胞因子。这时，首先可以在一小室中加载一细胞群，例如一含有一种或多种分泌抗体的效应细胞的细胞群。所述抗体在所述小室内被检测是否能够中和一细胞因子。例如，在一实施方案中，所述细胞因子中和的效应通过向所述小室提供读出颗粒来测量，其中所述读出颗粒包括应答于所述细胞因子的细胞，例如通过表达一荧光蛋白。在一实施方案中，单个的小室首先被隔离并孵育，使所述抗体累积到足够量。然后一定体积的包含所述细胞因子的培养基通过膨胀所述小室被添加到所述小室中，由此使所述抗体保留在所述小室中并杜绝了小室之间的交叉污染。所述小室，在一进一步的实施方案中，随后被孵育并进行了另外的体积交换，这对于测定所述小室是否含有一分泌能够中和所述细胞因子的抗体的效应细胞来说是必要的。
[0509] 上述策略也可以不通过使用调节所述小室体积的机制来实现。例如，一间小室，在一实施方案中，构造上具有两间分开的隔间(例如，分开的小室，或分室或在一单个小室内的孔)，其被独立地用试剂冲洗，且也可在所述装置上与其他小室隔离。用新鲜培养基或含有其他某一检测所需的组分或试剂的培养基进行的培养基交换，在一实施方案中，通过以下方式进行：将一间小室的一隔间，例如一“试剂隔间”与其他隔间相隔离，其中所述“其他隔 间”包含效应细胞和读出颗粒，冲洗所述试剂隔间，然后重新连接所述隔间以通过扩散或其他手段，如在所述两个隔间之间使用泵来混合。
[0510] 如本发明所讨论，一间小室的一效应区和读出区，在一实施方案中，通过流体相互通过一个或多个阀隔离。这种结构可以进一步延伸到填充有一端封闭结构的并且相互之间有通信的小室。如图57所述注释，将所述效应区351和所述读出区352分开，例如，通过阀353，提供了能够分别对之进行处理的优势；每个区内的试剂可以被独立地交换并且/或者随后可以对所述效应细胞和读出颗粒进行检测。应注意，所述通道中的所述一端封闭结构的部分没有在图57中画出来。
[0511] 如全文所提供，在一方面，本发明涉及一种方法，所述方法鉴定一含有一具有一胞外效应的效应细胞的细胞群，并且在另一方面提供了鉴定在一胞外效应上具有变化的一细胞群的方法。一旦测定了所述细胞群表现出所述胞外效应，或一胞外效应的变化，所述细胞群或其部分被回收以获得一回收细胞群。回收，在一实施方案中，包括使用一微型毛细管刺穿含有所述包含一种或多种表现出胞外效应的细胞的微流体小室，并且吸取所述小室的内含物或其一部分以获取一回收的吸取细胞群。
[0512] 所述回收细胞群，一旦被回收，在一实施方案中，即进行进一步分析，例如从所述回收细胞群中鉴定一单个的效应细胞或一效应细胞亚群，其对所述胞外效应上的变化负责。所述回收细胞群可以在有限的稀释下作为亚群进行分析其是否有第二胞外效应，其可以与所述第一胞外效应相同或不同。具有所述第二胞外效应的细胞群然后可以被回收进行进一步分析，例如在一微流控装置上，或通过实验台上的方法，例如RT-PCR和/或第二代测序分析是否具有第三胞外效应。
[0513] 从一间(或多间)特定小室中回收一种或多种细胞的多种方法可以用于本发明。
[0514] 本发明所提供的所述装置的所述PDMS膜设计通过用一微型毛细管刺穿上层的膜可以选择性地从任何小室中回收细胞。在一实施方案中，从一间 小室中回收细胞部分基于Lecault等人(2011).Nature Methods 8,pp.581-586提出的方法进行，此处全文纳入本申请以供各种目的参考。位于某一小室上方的所述膜用所述微型毛细管刺穿，且细胞被吸取(图58，顶部)。同样的微型毛细管可被用于回收一装置上上的多个细胞群。然后回收细胞群可在微型离心管中沉积以进行进一步分析，例如，RT-PCR分析或在同一微流控装置或一不同的微流控装置上进行一进一步的功能检测。
[0515] 在一实施方案中，一旦从被鉴定的小室中回收到了功能细胞，它们以有限的稀释度被重新引入到同样装置上的一不同区域(例如，每间小室一单个细胞或比所述启始检测更小的群)以测定哪一种(或几种)对所述胞外效应上的变化负责，即，通过在所述回收细胞上进行另一胞外效应检测(例如，见图2)。
[0516] 在一实施方案中，一个或多个细胞群用一微型毛细管通过吸取所述含有所述细胞群的小室的内含物进行回收，以提供一回收的吸取细胞群。在一进一步的实施方案中，回收的吸取细胞群用所述微型毛细管重新注射到一微流控装置中，其中所述微型毛细管刺穿所述微流控装置的一面壁。然后向所述微型毛细管施加压力使所述回收的吸取细胞群流仅所述微流控装置的分开的小室内，然后收回所述微型毛细管使所述微流体结构的壁基本上重新封闭。
[0517] 在一实施方中，回收是自动化的，并用到了一机器人微型毛细管仪器(图58，底部)。然而，回收还可以用一微型毛细管来手动操作完成。本发明所提供的回收方法可以从100间小室中在15分钟内以>95％的效率进行回收。可选择地，所述回收的效应细胞可以被引入到第二个装置中或通过实验台上的方法进行分析，以测定对所述胞外效应上的变化负责的某一种或多种细胞的特性。
[0518] 如上在一实施方案中所述，一微型毛细管被用于从一间微流体小室中回收一个或多个细胞群(或亚群，取决于一微流体富集过程是否发生)，并吸取所述小室的内含物或其一部分以获取一回收的吸取细胞群。在所述一个或多个细胞群(或亚群)中的细胞基本上通过吸取所述小室内含物到所述微型 毛细管中被回收，以提供一回收的吸取细胞群(或亚群)。所述微型毛细管在一实施方案中直径为从约5μm到约200μm。在一进一步的实施方案中，所述微型毛细管直径为从约5μm到约200μm，或从约5μm到约150μm，或从约5μm到约100μm，或从约5μm到约75μm，或从约5μm到约50μm，或从约50μm到约150μm，或从约100μm到约200μm，或从约150μm到约200μm。
[0519] 在一些实施方案中，所述微型毛细管具有一具有斜面的尖头。在一些实施方案中，所述微型毛细管具有一椭圆形、正方形或圆形的横断面。此外，如图58所示，所述微型毛细管在一些实施方案中被加载到一台显微镜的机器人微型操作系统上以提供一自动化的回收设备。
[0520] 在一实施方案中，本发明所提供的所述微型毛细管具有一单个的管体。然而，所述微型毛细管在其他实施方案中具有多重管体，例如，双管体、三管体或超过三个管体。
[0521] 一个或多个细胞还可以用微流体阀选择性地被回收，使用所述微流体阀是为了唯一地处理所述指定的小室并引导液流将所述单个细胞或多个细胞从所述小室冲洗到一出口以回收。细胞对所述装置底层的粘附力，在一实施方案中，可以通过本领域技术人员所知道的方法被最小化，例如，用胰酶净化或包被所述微流体底层。在另一实施方案中，多间含有所关注的细胞的小室通过一单个的端口被同时回收，例如，通过使用可处理的阀阵列来控制液流。在另一实施方案中，小室中不被关注的细胞首先从所述装置中被去除，通过洗涤或裂解。包括所关注的细胞在内的所述装置剩下的内含物随后通过冲洗到一要求的端口进行回收。
[0522] 在一实施方案中，一含有一展示出一胞外效应上的变化的效应细胞的小室的内含物从所述装置中通过吸取进行回收，例如，通过使用一构造上具有合适的尺寸和形状的微型毛细管。在一些实施方案中，所述回收方法包括用所述微型毛细管刺穿所述含有所关注细胞的小室的顶部并吸取所关注的细胞。在一实施方案中，所述在刺穿完成后膜重新封闭或基本上重新封闭。在 另一实施方案中，回收一间含有一展示出一胞外效应上变化的效应细胞(例如，一种或多种ASC)的小室的内含物通过以下方式进行：首先切开所述小室的一面壁以创建一进入点，然后用一微型毛细管通过吸取提取细胞。而在另一实施方案中，所述用于检测所述胞外效应的微流控装置被建造成以下形式：所述小室通过剥去一面壁上的材料而被暴露，由此留下一开放式的微孔阵列。被鉴定的小室(即含有一展示出一胞外效应上的变化的效应细胞的小室)随后从分别的小室中吸取内含物。为了促进微流体孔内含物的精确提取，吸取工具如微型毛细管，在一实施方案中，被加载到一机器人微型操作仪上，或一手动微型操作仪上(图58)。然而，在其他实施方案中吸取通过手动操作进行。
[0523] 在一些情况下，需要从一给定小室中提取一细胞的子群。例如，本发明所提供的方法可以从一间微流体小室的一特定区域去除细胞，例如，一读出区或一效应区。在一实施方案中，本发明所提供的回收方法包括以连续的方式吸取分别的单个细胞。
[0524] 在一实施方案中，从一或多个微流体小室中回收一或多种细胞包括磁性分离/回收的步骤。譬如，在一实施方案中，一微流体小室暴露于与在所述小室中的一或多个细胞贴合的一磁性微粒(或很多磁性微粒)中，贴合可选择性地与单个细胞，在所述(多个)壁中的细胞亚群，或者非选择性地，如与所有细胞磁性贴合。在这种情况下，并非将细胞吸取入一微型毛细管中，细胞用磁性微粒标记加载于产生一磁场梯度的磁性探针上。所述探针，在一实施方案中，被设计以产生能被开关的磁场，从而使细胞与其贴合而移除，然后在沉淀中被分离(EasySep Selection Kit,StemCell Technologies)。
[0525] 收集自小室的单个细胞或多个细胞，在一实施方案中，被沉积到一个或多个容器中进行进一步分析，例如，开放的微孔、微滴、管、培养皿、平板、陪替式培养皿、酶联免疫吸附斑(ELISPOT)平板、第二个微流控装置、同一微流控装置(在一不同区域)等。容器的选择由本领域技术人员基于下游分析和/或储存的性质来确定。
[0526] 在一些实施方案中，可选择地，或除了回收一单细胞或多个细胞外，细胞衍生产物或胞内物质回收自所关注的微流体小室。例如，在一实施方案中，如果一间微流体小室被鉴定为具有一在一胞外效应上表现出变化的细胞，所述小室的分泌产物被回收用于下游分析(例如测序分析)。在另一实施方案中，所述细胞或多个细胞在所述微流控装置上被裂解，例如，在所述进行第一次检测的小室内，并且回收所述裂解液。在一实施方案中，所述裂解液进一步在芯片上进行处理以，例如，从所述一种细胞或多种细胞中分离蛋白质、mRNA或DNA。单个小室内的所述一种细胞或多种细胞的RNA，在一实施方案中通过使用微流体阀冲洗一间指定的小室而被选择性地回收，所述冲洗使用一试剂，其导致所述RNA从所述细胞中被释放。这种物质随后在所述出口端口处被收集。在另一实施方案中，在所有的孔或一部分空中的所述细胞用一裂解试剂进行裂解，然后一间给定的小室或一部分小室的内含物被回收。
在另一实施方案中，一间或多间所关注的小室内的所述细胞在小珠存在时被裂解，所述小珠捕获从所述细胞中释放出来的RNA，接下来通过，例如上述的细胞回收技术回收所述小珠。这时，所述RNA还可以用一逆转录酶在回收前或回收后被转化为cDNA。一如何完成在芯片上的mRNA分离、cDNA合成与回收的实例可以在下述文献中找到：Anal.Chem 78(2006),pp.3084-3089，其内容全文纳入本申请以供各种目的参考。
在另一实施方案中，一间或多间所关注的小室内的所述细胞在小珠存在时被裂解，所述小珠捕获从所述细胞中释放出来的RNA，接下来通过，例如上述的细胞回收技术回收所述小珠。这时，所述RNA还可以用一逆转录酶在回收前或回收后被转化为cDNA。一如何完成在芯片上的mRNA分离、cDNA合成与回收的实例可以在下述文献中找到：Anal.Chem 78(2006),pp.3084-3089，其内容全文纳入本申请以供各种目的参考。
[0527] 从一间或多间所关注的小室中回收细胞或细胞衍生物质后，这些物质或细胞被分析以鉴定或阐明所述分离物或所述单细胞或多种细胞。如上所提到，进一步分析可通过一微流体检测(例如见图2)，或一实验台上的检测进行。本发明可以进行多轮微流体分析以，例如，从一回收细胞群中鉴定一展示出第二胞外效应、第三胞外效应和第四种胞外效应的一细胞亚群。通过在回收细胞群上重复所述胞外效应检测，所述方法的使用者就一种或多种所关注的功能性特征获取了高度富集的细胞群。
[0528] 在一实施方案中，一个或多个表现出所述胞外效应或所述胞外效应上的变化的细胞群被回收以获取一个或多个回收细胞群。一个或多个单个的细胞 群被鉴定并回收。所述一个或多个单个的细胞群被进一步分析以测定对所观察到的胞外效应负责的所述一个或多个细胞。在一实施方案中，所述方法包括在一微流控装置的分开的小室中保留多个起源于所述一个或多个回收细胞群的细胞亚群。每间所述分开的小室包含一含有一种或多种读出颗粒的读出颗粒群。所述单个的细胞亚群被检测是否具有第二胞外效应的变化，其中所述读出颗粒群活其亚群提供了第二胞外效应的一读出结果。第二胞外效应是与在所述回收细胞群上测量的所述胞外效应同样或不同的胞外效应。基于第二胞外效应检测，一个或多个单个的细胞亚群被鉴定为表现出在第二胞外效应上表现出变化。所述一个或多个单个的细胞亚群在一实施方案中，随后被回收进行进一步分析。第二胞外效应检测是本发明所述的胞外效应检测中的一种。
[0529] 一个或多个单个的细胞亚群通过，例如，一微型毛细管被回收，如以上所详细描述。所述微型毛细管，在一实施方案中，被用于将回收细胞亚群重新注射到同一微流控装置，或一不同的微流控装置，以进一步富集一展示出一胞外效应的细胞群。例如，多个起源自所述回收细胞亚群的细胞亚群，在一实施方案中，被保留在一微流控装置的多间分开的小室内，其中每间所述分开的小室包含一含有一种或多种读出颗粒的读出颗粒群。所述细胞亚群与所述读出颗粒群在所述微流体小室内一起孵育，并且所述细胞亚群被检测是否具有第三胞外效应。所述读出颗粒群或其亚群提供第三胞外效应的一读出结果。基于所述检测步骤的结果，测定一个或多个所述细胞亚群内一种或多种细胞是否具有第三胞外效应。所述一个或多个细胞亚群随后可以由本发明所述被回收。
[0530] 在一实施方案中，来自一回收细胞群或回收细胞亚群或多个细胞群或细胞群的细胞被作为细胞亚群保留在多个容器中。术语细胞亚群意指一已经回收的细胞亚群的一亚群。然而，本领域技术人员应认识到一细胞亚群可以分成进一步的亚群，并且为了清楚表达这一区别并非必需使用术语“亚-亚群”。每个细胞亚群存在于一单独的容器中。所述单个的细胞亚群或亚-亚群被裂 解以提供每个裂解的细胞亚群内的一种或多种核酸或裂解的细胞亚-亚群被扩增。在一进一步的实施方案中，所述一种或多种核酸包含一抗体基因。
[0531] 包括微流体分析在内的几种方法可被用于这种下游分析，取决于所述细胞的性质、原始筛选中细胞的数量，及所述分析的意图。在一实施方案中，一群效应细胞被回收自一间小室，或者多个群被回收自多间小室，所述多种细胞中的每种细胞都被隔离进入一单个的容器(例如单个的微流体小室)，并且在每种效应细胞上单独地进行分析。所述单独细胞分析可以使用微流体分析(图2)，或一实验台分析。在另一实施方案中，一群效应细胞被回收自一间小室或多个群被回收自多间小室，所述细胞群被重新引入到同一微流控装置上的另一区域(或另一装置)，且所述细胞以有限的稀释度被分离，即作为“细胞亚群”，例如，所述细胞以每间小室一单细胞的密度被分离，或从每间小室约两个到约十个细胞，兵进行第二胞外效应检测。所述下游分析(微流体或其他)可以再任何大小的细胞亚群上进行，例如，与所述起始胞外效应检测的大小相同，或群的大小更小，例如一单细胞、两个细胞、从约2个细胞到约20个细胞，从约两个细胞到约25个细胞。读出颗粒被重新引入到含有所述细胞亚群的小室中，且进行第二胞外效应检测。所述包括在所述胞外效应上展示处变化的一细胞亚群的小室的内含物被收集进行进一步分析。所述进一步分析可以使微流体分析(例如通过进行第三胞外效应检测，单细胞PCR)，或一实验台分析(例如PCR，第二代测序)。
[0532] 在一实施方案中，通过在有限的稀释度下分配多个细胞到多个细胞培养小室中在培养中扩增单个的被回收的效应细胞以获取所述回收的细胞的克隆。例如，在一实施方案中对一通过工程化表达一抗体库的细胞系的多个效应细胞存在于一间或多间所关注的小室内，所述一间或多间小室的细胞进行有限的稀释以分离在所述小室中的单个效应细胞。所述单个效应细胞随后被用来获取每个分别的效应细胞的克隆群。然后可以对一个或多个克隆群进行分析，通过测量所述分泌的抗体的特性(例如通过ELISA或一功能性检测)来评测哪种效应细胞产生所关注的抗体。
[0533] 可选择地或附加地，细胞从一间微流体小室中被分离，通过，例如有限的稀释被分离，并扩增以获得足够的材料进行一个或多个所关注的基因的测序或扩增与纯化，例如一编码一所关注的抗体的基因。而在另一实施方案中，细胞从一间微流体小室中被分离，通过，例如有限的稀释被分离，并被用于单细胞DNA或mRNA扩增，通过，例如聚合酶链式反应(PCR)或逆转录酶(RT)-PCR，然后测序以测定一个或多个所关注的基因的序列。而在另一实施方案中，所关注的细胞从一间或多间微流体小室中被回收，通过，例如有限的稀释被分离，随后被用于多个所关注的基因的单细胞DNA或mRNA扩增，随后将这些基因克隆到另一类细胞中进行后续的表达和分析。
[0534] 在一实施方案中，所述回收的细胞群或亚群可以被分离并用于一体内分析，例如通过将它们注射到一动物体内，或在培养中扩增随后将所述细胞进行一种或多种前面已经在所述微流控装置上进行过的功能性检测。
[0535] 在一实施方案中，在一胞外效应上展示出变化的一细胞群或亚群被回收(例如在第一种或第二种微流体胞外效应检测后)并且所述细胞的一种或多种核酸被扩增。在一实施方案中，扩增通过聚合酶链式反应(PCR)、5’cDNA末端快速扩增(RACE)、体外转录或全基因组扩增(WTA)进行。在一进一步的实施方案中，扩增通过逆转录(RT)-PCR进行。RT-PCR可以在所述细胞群中的单个细胞或多个细胞上进行。尽管单细胞RT-PCR作为一种分析方法正变得越来越常见，抗体基因的扩增由于多基因使用和可变性仍提出不小的挑战。两种从单细胞中回收抗体基因的主要手段包括用简并引物的RT-PCR和5’cDNA末端快速扩增(RACE)PCR。在一实施方案中，所述RT-PCR方法基于基因特异性模板转换RT，随后紧接半巢式PCR与第二代扩增子测序。
[0536] 用于被鉴定具有一胞外效应上的改变的效应细胞的一RT-PCR方法的一实施方案如图59所示。所述示意图示出一单细胞HV/LV方法，用到了模板转换逆转录与多重引物。在这一实施方案中，单个细胞被沉积到微量离心管底部，并且cDNA由靶向重链和轻链恒定区的多重基因特异性引物产生。 MMLV酶的模板转换活性被用于将一段模板转换寡核苷酸的反向互补序列附加到所产生的cDNA的3’端(Huber等人1989.J.Biol.Chem.264,pp.4669-4678；Luo和Taylor(1990).J.Virology 64,pp.4321-4328；每篇均全文被本申请引用以供各种目的参考)。半巢式PCR(共同的3’引物和位于所述RT引物区内的多重巢式引物)在重链和轻链的恒定区用到了多重引物，并用到了一条与所拷贝的链转换寡核苷酸互补的通用引物，所述半巢式PCR被用于扩增cDNA并引入特异于每个单细胞扩增子的索引序列。所述产生的单细胞扩增子被收集并测序。
[0537] 在一些情况下，一回收的细胞群在从所述微流控装置中被回收后，不被进一步分离成单细胞。例如，如果分离自一间小室的多个细胞包含一分泌一所关注的抗体的细胞(例如，存在于一群一个或多个分泌其他抗体的另外的细胞中)，所述多个细胞，在一实施方案中，在培养中扩增以产生所述多个细胞的克隆群，其中一些产生所需要的产物(即所关注的抗体)。在另一实施方案中，多个分离自一微流体孔的细胞被裂解(在所述微流控装置上或回收后)，随后扩增收集的核酸群并进行测序分析。这时，对获取的所述序列进行的生物信息学分析可用于推测，可能地还使用其他来源的信息，所述序列中的那一条可能编码所关注的蛋白(例如，一抗体)。重要的是，本发明所提供的所述分析方法与大量细胞的批量分析相比被大大简化，因为回收的细胞数量有限。这一有限数量的细胞降低了所述细胞群内的基因组信息的复杂程度。
[0538] 在一实施方案中，所述多个细胞的扩增的DNA序列被用于创建序列文库，其根据本领域技术人员已知的方法被重组表达于一永生化细胞系中。然后可对这一细胞系进行分析，可能地首先分离克隆，以鉴定所关注的基因。在一些情况下这些文库被用于筛选产生一所关注的蛋白复合物的基因组合。例如，在一实施方案中，在所关注的细胞中表达的基因包括抗体的重链和轻链基因以鉴定具有所需要的特性的基因配对。这样的分析的复杂性由于在原始筛选中所分析的细胞数量较小而被大大简化。例如，如果在原始筛选中有 10个细胞，仅有100种可能的抗体重链和轻链配对。通过比较，大批样品典型地具有成千不同的抗体序列，对应于数百万可能的配对。
[0539] 在一些情况下，回收的细胞可包含不同类型的细胞，其可以通过本领域技术人员已知的方法进行分离。例如，如果所述微流体小室包含抗体分泌细胞与用于维持所述抗体分泌细胞的成纤维细胞，所述抗体分泌细胞，在一实施方案中，在回收后通过亲和捕获方法从所述成纤维细胞被分离。实施例
[0540] 本发明通过引用下述实施例作进一步注释。然而，应注意这些实施例，与上述实施方案类似其注释说明作用而不应被理解为以任何方式限制本发明的范围。
[0541] 实施例1-微流控装置的制造
[0542] 微流控装置通过如Lecault等人(2011).Nature Methods 8,pp.581-586中所描述的流程或这一流程的改进版(例如修饰烘焙时间或固化流程)以获取多个层面包括，从底部载玻片到顶部，一间流动小室，一控制层，一张膜和浴层(图27)。一装置的横断面和所述小室的一3D示意图，流动通道和控制通道分别如图61和图62所示。如本发明所描述，当以控制通道与一流动通道相交时形成一夹管阀，其通过对所述控制通道施压被关闭。在某些情况下添加一覆盖层来关闭所述浴层，或省略所述覆盖层形成一开放浴层，如图63中所述装置内的浴层所示。
[0543] 实施例2-微流控装置通过选择与重新注射富集细胞
[0544] 如图63所示微流控装置被用于进行一能够重新注射以富集细胞的效应细胞(抗体分泌细胞)选择检测。如图64所示，所述装置包括六个入口端口1030，六个控制端口1031用于控制每个入口，四个重新注射端口，其中一个是1032，及一个单一的输出端口1033。所述装置包括8192个相同单元小间的一阵列，其中之一如图2B和图61所描绘。每个单元小间含有一间100μm宽、160μm长和160μm高的小室。每间小室的体积约2.6nL。所述装 置被分为4个亚阵列，其中一个由1032所示(图64)。每个亚阵列包含所述总共8192个单元小间中的2048个。每个亚阵列具有其自己的亚阵列阀1034，其使得每个亚阵列可以通过流体进行处理而不依赖其他亚阵列。每个亚阵列具有一单个的重新注射端口1035。所述重新注射端口是直径为大约300μm、深度大约160μm和体积大约11.3nL的圆形小室。所述重新注射端口被一微型毛细管刺穿以注射试剂或颗粒到所述四个亚阵列中的一个或多个中。
[0545] 实施例3-微流控装置分隔效应细胞和读出细胞
[0546] 设计一微流控装置使其能够让读出细胞被保留在分开的、独立的小室中不接触效应细胞，并且使这些小室的内含物能够在需要时根据要求被混合。这种构造被用于进行效应细胞检测，例如，细胞因子中和检测。当含有所述效应细胞的小室被一流体灌注，例如，当提供新鲜培养基以长时间维持活力时，所述结构对防止一效应细胞分泌产物(如抗体)被完全冲走特别有用。这种构造还可以用于限制所述效应细胞与所述胞外效应检测所需要的培养基条件接触的时间(例如，当一毒性细胞因子被用作一辅助颗粒时)。
[0547] 如图65所示，这一装置由六个入口端口1040、九个控制端口1041和1042、两个出口端口1043和1044及396个单元小间的一阵列构成，所述单元小间每个都与1045相同并在图66中作出了更加详细的注释。每个单元小间包含两间圆形的小室。每间小室的直径为210μm，高度为180μm且体积为5.6nL。典型地，这些小室中的一间含有一种或多种效应细胞并且其他小室含有一种或多种读出细胞。一流动通道连接所述两间小室。这一流动通道可以通过所述“扩散阀”1050关闭。当所述扩散阀1050打开时，所述两间小室的内含物可以通过扩散混合。当所述扩散阀1050关闭时，所述小室相互之间被隔离。两个流动通道通过串联地方式使所述装置中的单元小间互相连接。这些流动通道之一流经小室1，另一个流经小室2。这两个流动通道通过“主阀1”1051和“主阀2”1052关闭以将每个单元小间的所述小室与每个其他单元小间的所述小室隔离。这两个阀的独立地打开与关闭，使小室1或小室2能够独立地进行关注。图66的所述装置在垂直平面与水平平面(虚线) 的横断面分别如图67和图68所示。
[0548] 一可通过所述装置进行的细胞因子中和功能性检测的实施例如图69所示。板块A示出含有至少一效应细胞的顶部小室和含有多个读出细胞的底部小室。两间小室都含有相等浓度的细胞因子，所述浓度为维持读出细胞的活力所需要。所有阀均关闭。关闭的阀被标注为黑色阴影，打开的阀被标注为水平的阴影线。板块B显示已经经过了一段时间并且所述的至少一效应细胞已经分泌了抗体。在这一注释的特定情况下，所述抗体结合到所述效应小室内的所述细胞因子，将其中和。板块C显示所述扩散阀1050已被打开。游离的细胞因子从底部小室朝顶部小室扩散。被中和的细胞因子从顶部小室朝底部小室扩散。板块D显示已经经过了足够长的时间，每间小室中游离的被中和的细胞因子的浓度已经基本上达到平衡。然后所有的阀均被开动并锁定。在含有读出细胞的底部小室中的细胞因子的有效浓度现在大约是所述启始浓度的一半。板块E显示效应细胞已经被含有另外的细胞因子的新鲜培养基灌注。所述灌注已从顶部小室中去除了所述被中和的细胞因子。所述过程每隔几小时重复一次，最终导致细胞因子的完全耗尽及读出细胞的死亡。在其他情况下所述在读出细胞上的细胞因子中和效应包括一条信号通路的激活或抑制、生长抑制、分化或形态上的改变。然后在所述读出细胞上的效应通过本领域技术人员所知的方法进行测量。
[0549] 实施例4-细胞栅栏小室的整合
[0550] 具有细胞栅栏来捕获一单个效应细胞或一含有一种或多种效应细胞的异质性细胞群的装置按下述方法制造。
[0551] 具有细胞栅栏的PDMS装置通过从一可重复使用的流动通道模具和可重复使用的控制通道铸模进行制造。所述流动通道模具在一硅晶片基底上包含多层光刻胶。本发明所用到的所述装置的小室的主体通过一SU-8 100特征来界定，其直接坐落于所述硅晶片上。细胞栅栏当被制造后，通过一更薄的SU-8 2010特征进行界定，其坐落于所述SU-8 100特征上，示意图如图31所描绘。
[0552] 大部分微流体小室都用SU-8 100负性光刻胶(典型地高度为160μm)根据标准流程制造，除了最后一步，显影，被省略。所述镜片在曝光后的烘焙后冷却，并且随后SU-8 2010在所述未显影的SU-8 100上面旋涂，典型地厚度为10-20μm。所述SU-8 2010的厚度决定了所述栅栏的高度。每间小室的深度是两层光刻胶层的高度的结合。
[0553] 在可选择的制造程序中，所述SU-8 100层被充分显影，然后所述晶片被另一层SU-8 100包覆，其比第一层要更高，这样高度差即成为所述栅栏的高度。
[0554] 然后所述模具用帕利灵包覆(化学蒸发沉积的聚对亚苯基二亚甲基聚合物屏障)以减少PDMS在铸模期间的粘附，提高模具的耐久性并使得可以用前述帕利灵包覆产生的小的特征能够复制。
[0555] 制造了一些原型装置以测定合理的栅栏的宽度-高度组合。制造了一原型的流动曾模具以测定可被成功制造的尺寸大小。这一模具由多间具有栅栏的小室构成，所述栅栏的宽度在同一模具中各不相同。另外，所述栅栏和所述小室的高度在制造过程中可以变化(通过调整旋涂的速度)。所述原型模具仅含有小室用于制造测试。
[0556] 需要两个光刻掩模板，一个用来界定所述小室(SU-8 100)的主体，而另一个用来界定所述栅栏(SU-8 2010)。然而，可以使用一物理掩模板，包含两套特征。
[0557] 制造了一原型栅栏小室，其中所述小室的W的完整宽度被固定在300μm。在大部分现有的装置上所述小室的典型的宽度为160μm。起初，这些小室的每一半被做成类似的大小以使得所述效应区和读出区各自都具有分别的入口和出口。L是所述小室的长度。对于每一个唯一的X值，有三间小室具有L＝160μm(长度)和另有意见具有L＝2000μm。长度被延长的小室被包括在内使所述最终的PDMS模具可以容易地被切割成垂直于所述栅栏，这样所述横断面可以进行成像。
[0558] 启始时制造了一个单个模具，提供了一套小室和栅栏高度的数据。表5总结所述原型模具的尺寸：
[0559]
[0560] 表6列举了模具上的栅栏的宽度及哪些已经制造成功：
[0561]
[0562] 上述表格显示实际的栅栏宽度结果大于设计值。
[0563] 制造的失败只有在PDMS铸模后才能明显可见。对于所述更小的栅栏宽度，通过在显微镜下观察难以确定所述光刻胶模具的质量。栅栏制造失败是因为构成所述栅栏的PDMS完全位于所述模具内或从所述小室底部部分剥离。例如，一宽度为15μm的栅栏失败了。使用这一特定的设计和上述方法能够被制造的最小宽度为17.5μm。
[0564] 在所述原型装置的PDMS铸模过程中观察到所述栅栏经常从所述小室底部脱裂。这一脱裂似乎在所述栅栏与所述小室的壁相交的90度角处开始。这一90度角为应力集中。对设计进行修改以包括45度小室来减少这些应力集中并由此提高PDMS铸模的能力。这一设计上的改变使所述栅栏宽度被降 低到17.5μm以下，其是在所述测试模具上可能的最大尺寸。所述栅栏的宽度被降低到10μm的设计值。实际的测量值12μm与在所述原型模具上所达到的值相比与设计值接近得多。
[0565] 本实施例中的栅栏与液流平行。然而，并不存在内在的原因使栅栏不能被制造成与所述液流相互垂直或相对于所述液流呈斜线。类似地，本实施例中的小室是对称的。然而，本发明并不仅限于此。
[0566] 具有一细胞栅栏、一效应区和一读出区的单个的微流体小室通过一倾斜法被加载一细胞群和读出颗粒，以指引所述效应细胞到所述效应区或所述读出颗粒到所述读出区。
[0567] 图70A、70C和70E显示显示具有细胞栅栏的微流体小室的光学显微图像，并且图70B、70D和70F显示在荧光显微镜下的相同的小室。在所述读出区内的所述小珠(读出颗粒)显示效应细胞产物在所述小珠上聚集，尽管相对所述效应细胞和所述效应区有一段距离，其总体上是一致的。
[0568] 实施例5-抗体分泌细胞的旺盛的微流体生长
[0569] 多个产生一人源IgG抗体的重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(效应细胞)以2M细胞/mL的浓度被加载于所述微流控装置中。分泌的抗体在一2小室孵育过程中被捕获到蛋白A包被的小珠上(平均直径：4.9μm)，接着添加兔抗人IgG(H+L)的Dylight594-偶联的F(ab’)2片段并洗涤(图71)。拍摄明场和荧光图像以对抗体分泌和捕获进行定量。随后细胞在所述装置中培养4.5天以产生克隆群，并且分泌大量抗体的克隆从所述装置中被回收用以进行进一步扩增。
[0570] 图72显示在抗体探测效应细胞检测进行后一CHO克隆的延时成像。所述读出小珠通过黑色箭形符号标注而所述细胞通过白色箭形符号标注。图73显示在摇瓶(n＝3次实验，每次实验重复三次，接种密度2.5×105个细胞ml-1)中、在96孔板中作为单细胞(n＝3次实验，每次实验重复三次，每板27-36个克隆)中或在所述微流体阵列(n＝3次实验，每次实验追踪50个克隆)中培养的CHO细胞的生长曲线(误差条，标准偏差)。在所述微流体阵列中 扩增的CHO细胞表现出与批量摇瓶培养相当的且超过在96孔板中单个细胞培养的生长速率。
[0571] 实施例6-在一异质性ASC群存在时单个ASC检测的灵敏度
[0572] 数学建模被用于测定在一间体积为4.1nL的小室内小珠上的抗体捕获的总效率作为时间的函数和作为所述小珠数量的函数。这一CHO细胞系的平均分泌速率在批量样品上被测出为大约300个蛋白质每秒。这一分泌速率与原代抗体分泌细胞所期望的分泌速率相当，所述原代抗体分泌细胞被估计每秒分泌100到2000个抗体之间。因此，基于这些测量值测定出离细胞最远的小珠在两小时的孵育期内预期捕获大约4000个抗体，并通过荧光检测。
[0573] 在如图74A到74D所述实施例中，所关注的靶标(抗原)是鸡蛋白溶菌酶(HEL)。向一装置上加载衍生自两个杂交瘤细胞系，HyHel5和4B2的效应细胞。HyHel5杂交瘤细胞分泌一结合HEL的单克隆抗体，而4B2杂交瘤细胞分泌不结合HEL的单克隆抗体。如图7A所指，顶部板块显示一HyHel5细胞被加载到一装置的一间小室中，所述装置具有约700个检测小室。HyHel细胞启始的加载密度为致使每10间小室中大约有1个细胞。底部板块显示一间小室，其中没有加载HyHel5细胞。一旦被加载到所述装置中，被加载的HyHel5细胞的位置被记录下来。如图74B所指，所述4B2细胞被加载到所述小室中，加载的平均比率为所述两个细胞系被加载到所述装置中后每间小室平均有25个细胞，对应于HyHel5细胞浓度额250倍。
[0574] 然后清洗所述装置的小室，并将用兔多克隆抗小鼠IgG抗体(读出颗粒)功能化的小珠加载到所述小室内。所述小室随后被隔离并孵育，致使由每间小室中所述细胞产生的抗体被捕获到那间小室中的小珠上。如图74C所指，荧光标记的HEL(10nM)在所述孵育步骤中被包含在培养基中，并拍摄荧光图像来鉴定具有被HyHel5结合的小珠的小室及监测所述小珠上HyHel5抗体的积累。从图74C中可见，荧光仅在顶部板块被检测到，表明只有具有HyHel5细胞的小室在与荧光标记的HEL抗原孵育时才在小珠上产生较强的荧光信号。如图74D所指，所述装置随后与荧光标记的多克隆抗IgG抗体孵 育以鉴定具有被IgG结合的小珠的小室，所述IgG分泌自HyHel5细胞或4B2细胞。所有的小室在暴露于荧光标记的抗IgG抗体时都产生了荧光信号，表明两个细胞系的抗体在所有小室中都被捕获。用荧光标记的HEL孵育后，所述小室用不含有标记的HEL抗原的培养基冲洗，并拍摄图像以监测在所述小室中HyHel5-HEL的解离动力学，如图74E所示。图74F显示600间包含如上所述的HyHel5和4B2杂交瘤细胞与蛋白A小珠和10nM溶菌酶一起孵育的荧光值随时间的变化。包含HyHel5细胞的小室通过其基线以上的荧光值很容易被区分，显示这一系统能够检测到分泌一抗原特异性单克隆抗体的稀少的细胞。
[0575] 在一不同的实施例中，一群分泌针对鸡蛋溶菌酶(HEL)的HyHel5杂交瘤细胞以有限的稀释度被加载到所述微流控装置中。对所述装置进行成像以测定在每间小室中是否存在HyHel5细胞。分泌抗体并不结合HEL的DMS-1杂交瘤细胞随后以每间小室约5个细胞的平均浓度被加载到同一阵列中。细胞与读出抗体捕获小珠(包被有兔抗小鼠抗体的蛋白A小珠)一起孵育，通过用1nM标记有Alexa-488的溶菌酶溶液冲洗来测量溶菌酶特异性的抗体的分泌。加载HyHel5细胞后获取的明场图像(顶部)、与DMS-1细胞与小珠孵育后拍摄的明场图像(中间)和相应的荧光图像(底部)显示了三间只含有DMS-1细胞的(图75A)或含有由单个HyHel5细胞和多个DMS-1细胞组成的混合物的(图75B)具有代表性的小室。示出了只含有DMS-1细胞的小室(图75C)或含有HyHEL5与DMS-1细胞的小室(图75D)的荧光强度的分布。在所述HyHEL5细胞群中分泌针对鸡蛋溶菌酶的抗体的细胞甚至在多个分泌非抗原特异性抗体的DMS-1细胞存在时也被检测到。
[0576] 实施例7-用基于小珠和细胞的结合检测从单细胞中选择单克隆抗体
[0577] 杂交瘤单效应细胞(4B2)被加载到一微流控装置的单个小室中，被分泌的抗体(针对抗人CD45的IgG)用一基于小珠和基于细胞的读出结合检测进行测量。这个实验中的读出细胞是K562细胞，其内源表达人CD45膜受体并用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)在固定前染色以与所述效应细 胞区分。单个效应细胞被提供到所述装置的单个的小室，并与多个读出K562细胞一起孵育过夜。接下来，所述效应细胞与读出蛋白A小珠一起再孵育2小时，随后用一检测抗体(荧光标记的抗小鼠IgG)染色，其结合所述被分泌的IgG抗人CD45抗体。然后测量单个小室的荧光。所述实验的一示意图如图76A中所提供。
[0578] 图76B是读出细胞和读出小珠的平均荧光强度图，其通过对空的小室和含有一单个杂交瘤效应细胞的小室进行自动化图像分析而被测量。图76C(从左到右)显示具有一个单个杂交瘤细胞的一单间小室(左板块)。本实施例中所述杂交瘤细胞过夜后分裂。剩下的板块显示在与固定后的靶标K562细胞孵育过夜并与蛋白A小珠(标记有合适的多克隆抗小鼠IgG抗体)孵育2小后同一间小室内抗CD45抗体染色的荧光图和叠加图。本领域技术人员人员应理解这一检测可经过修改后用活读出细胞和/或不同类的读出细胞进行。
[0579] 实施例8-基于细胞的免疫与细胞结合检测
[0580] 用来自一人卵巢癌细胞系(TOV21G)的固定的细胞对小鼠进行免疫(图77A)。抗体分泌细胞通过FACS进行分选，然后被注射到所述微流控装置中并与经CFSE染色的读出细胞(固定的与活的TOV21G细胞)一起孵育。抗体结合用一标记的二抗进行观察。图77B显示本实验的结果。从左到右：在芯片上加样后胞质与读出细胞(活细胞与固定的细胞)。读出细胞用CFSE染色进行鉴定。结合到或细胞和固定细胞表面的抗体通过一标记的二抗(抗小鼠IgG)进行观察。最右边显示一间在读出细胞上的信号非常低的阴性小室(无效应细胞)。
[0581] 实施例9-细胞活力与分泌的维持
[0582] 优化维持ASC效应细胞的细胞活力与分泌的条件5-8天。图78显示在含有10ng/mL的IL-6的完全RPMI中生长了8天的小鼠ASC(图78A)和生长了5天的人ASC(图78B)根据ELISPOT得到的细胞生存和抗体分泌的结果。
[0583] 免疫步骤如下，小鼠被皮下注射鸡蛋白溶菌酶和铝胶佐剂(Accurate Chemical&Scientific Corporation)3次，每隔2周1次。用流感疫苗在采血前1周免疫人。免疫步骤根据英属哥伦比亚大学批准的流程进行。分离小鼠脾细胞，用PE抗小鼠CD138(BD Pharmingen)并通过FACS分筛CD138+细胞群(进一步的描述见实施例10)。分离人周边血单核细胞(PBMCs)并用分子标记染色，所述分子标记如Wrammert等人(2008)，Nature Letters
453,pp.667-671所述，其公开全文纳入本申请以供各种目的参考。
453,pp.667-671所述，其公开全文纳入本申请以供各种目的参考。
[0584] 酶联免疫斑(ELISPOT)检测在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜内衬的96孔微型板(Millipore)内进行。所述PVDF膜用70％乙醇预先浸湿，并用PBS洗涤。板用羊抗小鼠IgG(H+L)(Jackson Immunoresearch)或兔抗人IgG(H+L)(Jackson Immunoresearch)抗体(1:
1000/100mL/孔)包被过夜，用PBS洗涤3-4次。然后添加细胞37℃孵育20h。通过含有0.1％Tween的PBS(PBS-Tween)洗涤3-4次去除细胞，板与碱性磷酸酶羊抗小鼠IgG(H+L)(Jackson Immunoresearch)(1:1000/100mL/孔)孵育。在PBS-Tween洗涤3-4次后，板与BCIP/NBT发色剂(Sigma-Aldrich B6404-100ML)孵育。用一正置显微镜和CCD相机对斑进行计数。
1000/100mL/孔)包被过夜，用PBS洗涤3-4次。然后添加细胞37℃孵育20h。通过含有0.1％Tween的PBS(PBS-Tween)洗涤3-4次去除细胞，板与碱性磷酸酶羊抗小鼠IgG(H+L)(Jackson Immunoresearch)(1:1000/100mL/孔)孵育。在PBS-Tween洗涤3-4次后，板与BCIP/NBT发色剂(Sigma-Aldrich B6404-100ML)孵育。用一正置显微镜和CCD相机对斑进行计数。
[0585] 实施例10-富集浆细胞的方法
[0586] 抗体分泌细胞在已知分子标记的物种中进行富集，具体地，小鼠的CD138浆细胞分子标记(图79)。首先，用5╳106卵巢癌细胞(TOV-21G)根据批准的动物护理协议通过腹膜内注射免疫小鼠3次，每次间隔一周。小鼠脾细胞用PE抗小鼠CD138(BD Pharmingen)染色，并通过FACS分筛CD138+和作为一阴性对照的CD138-(图79A)。如实施例9所描述进行ELISPOT来检测经过分筛的与未经分筛的细胞群中的抗体分泌(图79B)。观察到与未经分筛的脾细胞相比，CD138+群的ASC增加了20倍(图79C)。尽管这里没有进行，富集还可以单独通过可购买获得基于磁力的富集试剂盒(例如StemCell Technologies，Miltenyi)或结合FACS分筛来完成。
[0587] 使用ER-TrackerTM(Life Technologies)在兔子中从缺少已知分子标记的物种中富集抗体筛选细胞浆细胞(图80)。根据已经批准的动物护理协议， 用流感病毒疫苗皮内注射免疫兔子4次，每次间隔1周，随后在采血前1周加强注射。兔PBMC用ER-Tracker(Life 高 低Technologies)和小鼠抗兔IgG(Jackson Immunoresearch)染色，并通过FACS分筛ER IgG的群(图80A)。如实施例9中所述进行ELISPOT来检测ER高IgG低的群与未分筛的PBMC对照的抗体分泌(图80B)。与未分筛的PBMC相比，观察到ER高IgG低的群在抗体分泌上有6倍的增加(图
80C)。
80C)。
[0588] 实施例11-使用流感人体系统的行富集
[0589] 周边血单核细胞(PBMCs)在用流感三价疫苗免疫后7天从一名病人的血液中分离。细胞通过一可购买获得的小珠分离试剂盒(StemCell Technologies)基于CD138表达进行富集，并以每间小室11个细胞的平均密度(即平均包含11个细胞的异质性细胞群)加载到一微流控装置中，总共大约有44,000个细胞。细胞与蛋白A小珠一起孵育2小室，并与颜色不同的荧光标记的H1N1与H3N2孵育。总共有171间H1N1阳性小室与199间H3N2阳性小室(例如图
81A)分别代表了0.39％和0.45％的抗原特异性频率。回收这些小室中的24间小室的内含物并在多孔板内培养过夜(图81B)，然后第二天引入第二个微流控装置。富集后，H1N1阳性与H3N2阳性(图81C)小室的频率分别为7％与6％，这意味着达到了13倍到18倍的富集(图
81D)。
81A)分别代表了0.39％和0.45％的抗原特异性频率。回收这些小室中的24间小室的内含物并在多孔板内培养过夜(图81B)，然后第二天引入第二个微流控装置。富集后，H1N1阳性与H3N2阳性(图81C)小室的频率分别为7％与6％，这意味着达到了13倍到18倍的富集(图
81D)。
[0590] 实施例12-小珠聚集作为抗体分泌的指示剂
[0591] 向一微流控装置的小室内加载分泌人抗体的细胞和非抗体分泌细胞的混合物。细胞与蛋白A小珠一起孵育2小室，然后用标记的二抗染色。含有抗体分泌细胞小室内的小珠形成聚集物(图82)而小珠再没有分泌的抗体时仍保持分散(图83)。
[0592] 实施例13-HEL特异的杂交瘤的亲核测量
[0593] 一群产生一对鸡蛋溶菌酶(HEL)具有高亲和力抗体的杂交瘤效应细胞(HyHEL5)首先以有限的稀释度被引入到一微流控装置。拍摄了一组照片来鉴定含有HyHEL5细胞的小室，然后第二群分泌一对HEL亲和力较低的 抗体的杂交瘤细胞(D1.3)被加载到同一装置上。拍摄了第二组照片，并且鉴定含有一HyHEL5细胞或一D1.3细胞的小室。用一兔抗小鼠抗体包被的蛋白A小珠被引入到所述小室内，并与所述细胞一起孵育2小时。在孵育时段结束时，标记的抗原在100fM与10nM之间以逐渐增加的浓度逐步被引入。图84A显示本实验的一张示意图，而所述具有不同浓度的小室的显微图如图84B所示。所述小珠荧光强度在每一步都进行测量，并且每间小室都相对背景进行标准化。含有HyHEL5的小室基于所述亲和力测量值(图84C)与含有D1.3细胞的小室区分开。含有单个HyHEL5细胞和D1.3细胞的代表性小室的实例曲线及同样是这些小室的图像分别如图84D和图84B所示。HyHEL5与D1.3抗体的亲和力分别是30pM与1.5nM(Singhal等人(2010)，Anal Chem 82,pp.8671-8679，此处全文纳入本申请以供各种目的参考)。
[0594] 实施例14-小室隔离或不隔离鉴定抗原特异性细胞
[0595] 人浆细胞富集自获取于用三价流感病毒疫苗免疫一周后的病人的血液的PBMC。细胞被引入到两个不同的微流控装置中并与蛋白A小珠(读出小珠)孵育2小时。在一装置中(图85)，含有异质性细胞群和读出颗粒的单个的小室在孵育时用一阀相互隔离。在第二个装置中(图86)，所述阀任由其打开。标记的抗原(H1N1与H3N2)在15分钟孵育期结束时被引入到所述装置中，然后所述小室用培养基冲洗。图85和图86显示各个阵列的一个部分的多间小室，H3N2阳性结果用白色箭形符号标记。在没有用到主阀隔离时(图86)，周围小室的背景比主阀关闭时的背景更高(图85)。然而抗体携带不会阻碍清楚地区分阴性小室与阳性小室。所述流动通道的方向由黑色箭形符号指示。
[0596] 实施例15-基于亲和力测量筛选新的小鼠抗体分泌细胞
[0597] 从鸡蛋溶菌酶免疫过的一只小鼠的骨髓中分离浆细胞。大约23,800个细胞被分配到一微流孔装置中的含有6,144间小室的3个亚阵列中(平均密度：～4个细胞/小室)。将细胞与用兔抗小鼠捕获抗体包被的蛋白A小珠孵育2小时，用10nM标记的鸡蛋溶菌酶洗涤并成像。鉴定得到117间抗原特异的 小室，用一微型毛细管回收其内含物并以有限的稀释度重新注射到第四个含有2,048间小室的亚阵列。将所述重新注射的细胞与用兔抗小鼠捕获抗体包被的蛋白A小珠孵育2小室，然后与浓度逐渐增加的标记抗原接触。在各步均拍摄图像并测量所述小珠的荧光强度。图87显示2个单细胞(标记为Mm20与Mm25)分泌具有不同亲和力的抗体的结合曲线的实例。这些细胞按如下步骤回收。
[0598] 鉴定到117间总共含有882个细胞的小室为含有至少一抗体分泌细胞。用一微型毛细管回收全部117间小室的内含物，收集并立刻用如图58所示的回收机器人重新注射到原始装置中剩余的2,048间空的小室中。图98显示所述微型毛细管的照片，其在即可重新注射所述细胞之前位于所述注射端口的附近。在重新注射后，在所述分析小室内总够有682个细胞，代表了被回收的启始群(882个细胞)的77％。
[0599] 立刻再次检测所述重新注射的细胞是否存在一个或多个抗体分泌细胞。鉴定到38间小室含有至少一个抗体分泌细胞(38/117＝32％)。这38间小室中，19间含有单个细胞(117间的16％)。回收全部38间小室的内含物，连同10间对照小室(5间无细胞而5间为非分泌对照)一起进行RT-PCR。所述回收过程总共耗费2小时15分钟，或者每间小室170秒。在48个样品的43个中(90％)，所述小室内的全部细胞均通过视觉确认已经用过毛细管回收。在48个样品中的5个中，至少发现一个细胞粘附在所述小室底部并且未回收。
[0600] 回收得到以下序列。
[0601] Mm20(IGHV1-9*01)IGHD2-4*01，IGHD2-4*01，IGHD2-9*02IGHJ2*01重链核酸序列(SEQ ID NO:1):
[0602] ATGGAATGGACCTGGGTCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTGCAGGTGTCCACTCCTTTTATGATAATTACGTTTTTGACTACTGGGGCCAaggcacCACTctcAC
[0603] Mm20轻链氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)：
[0604] M E W T W V F L F L L S V T A G V H SF Y D N Y V F D Y W G Q G T T L
[0605] Mm20(IGKV4-59*01)IGKJ5*01 轻链核酸序列(SEQ ID NO: 3)：
[0606] ATGGATTCTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCGGTCATACTATCCAGTGGACAGCAGTGGAGTAGAAACCCCACGTTCGGTGCtggacCaAGCtGa
[0607] Mm20轻链氨基酸序列(SEQ ID NO: 4)：
[0608] M D S Q V Q I F S F L L I S A S V I L S S GQ Q W S R N P T F G A G T K L
[0609] >Mm25(IGHV2-9-1*01)IGHD2-3*01 IGHJ3*01重链核酸序列(SEQ ID NO:5)：
[0610] ATGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGGGGGCCAGTGTAGGATGGTTACCCCTTGCTTACTGGGCCAAGG
[0611] Mm25重链氨基酸序列(SEQ ID NO: 6)：
[0612] M Q A V V S T Q S T GC Q CR
M V T P C L L G Q
M V T P C L L G Q
[0613] >Mm25(IGKV6-17*01)IGKJ4*01轻链核酸序列(SEQ ID NO: 7)：
[0614] ATGGAGTCACAGATTCAGGTCTTTGTATTCGTGTTTCTCTGGTTGTCTGGTGTTGACGGACAGCAACATTATAGTACTCCttTCACGTCGGCTcggGaCAAagTG
[0615] Mm25轻链氨基酸序列(SEQ ID NO: 8)：
[0616] M E S Q I Q V F V F V F L W L S G V D GQ Q H Y S T P F T S A R D K V
[0617] 实施例16-HyHEL5杂交瘤细胞的Koff值
[0618] 一HyHEL5杂交瘤的混合物(低Koff)与一D1.3杂交瘤(高Koff)细胞背景在一微流控装置中根据本发明一实施方案进行筛选。有HyHEL5杂交瘤存在的小室在一洗涤各小室的步骤前通过与荧光强度相关的抗体分泌(即在小珠上的荧光积累)与所述洗涤各小室的步骤之后的抗原释放(以测量Koff)被检测到。图88的柱状图显示HyHEL5阳性小孔内小珠的剩余荧光水平在洗涤结束时高于剩余的孔内的水平。
[0619] 实施例17-检测在人类中针对特定抗原的稀少的循环抗体分泌细胞
[0620] 在一实施方案中，本发明被用于筛选极端稀少的细胞，例如在基准水平出现的抗原特异性浆B细胞，即近期未免疫或未经抗原感染。图89A显示一来自一健康病人的含有富集的B细胞和红细胞的异质性细胞群。所述群含有至少一抗体分泌细胞，这通过在读出小珠颗粒上进行全IgG染色所测量(图89B和89C)。另外，这一群包含至少一分泌特异于H1N1的抗体的效应细胞，通过一标记的H1N1抗原结合到所述已经捕获所述抗体的读出小珠上所测量(图89D和89E)。整个筛选的进行中每间小室用到了～30个细胞，小室在一1600间小室的阵列中，总共有48,000个细胞。这使一存在频率为0.000625％的效应细胞可以被检测到。回收所述小室的细胞(图89F)，并扩增所述效应细胞的重链与轻链。
[0621] 还可以进行这一检测以发现丰度更高的细胞，例如在一次天然感染后或用一抗原感染后一周。
[0622] 实施例18-胞外和胞内生物分子的自发分析
[0623] 胞外和胞内组分的分析在一细胞信号通路读出检测的背景下进行评测。工程化的过表达GPCR CXCR4的CHO细胞结合β-半乳糖苷酶片段补偿(DiscoverX)被用于定量配体CCL22与受体的结合。所述受体经由配体的激活导致胞内的β-半乳糖苷酶补偿，这随后通过在β-半乳糖苷酶底物存在时裂解细胞产生一化学发光信号来测量。这一检测的一个实例在多孔板内进行，如图90所示。所述检测根据生产商(DiscoverX)提供的流程进行。激动剂 /配体CCL22在三个不同浓度(100nM、1nM、0.01nM)下与所述细胞一起孵育，然后添加所述裂解/化学发光试剂。用一台Tecan M200酶标仪从各个对应某一浓度的孔中读取光强度化学发光信号。
[0624] 这一检测可以与一细胞结合检测(例如在图77中所示的实验)相结合用于找到对一细胞表面受体具有特异性的拮抗剂抗体。如果需要回收活的，具有活力的效应细胞，在所述微流体小室中实施这一裂解检测需要分隔所述效应细胞与所述读出细胞。这一检测可在如实施例1和2中所述提供的装置里实施。
[0625] 实施例19-从人细胞中筛选抗体并回收序列
[0626] 免疫7天后，从注射了季节性流感疫苗的病人体内采血(图91)。用一可通过购买获得的试剂盒(SepMate，StemCell Technologies)分离PBMC，并用FACS基于在Wrammert等人中描述的分子标记富集浆细胞。(2008)，Nature Letters，453:667-671，此处本申请全文引用，然后以有限的稀释度加载细胞到微流控装置中，与蛋白A微球(直径4.9μm，Bang Laboratories)孵育2小时。引入H1N1和H3N2标记抗原(两种不同的颜色：发射波长分别为488nm和594nm)到所述阵列总，与所述浆细胞孵育15分钟，然后用培养基洗涤微流体小室的所述内含物，成像。检测到含有抗原特异性抗体的小室后，引入标记的抗人抗体(Dylight
594)到所述装置中，孵育15分钟，洗涤抗体以测定IgG分泌细胞的总频率。图92显示一对H1N1和H3N2都具有交叉反应活性的单个浆细胞的实例。抗原特异性细胞可以立即回收，或在所述微流控装置中过夜培养后第二天在回收。细胞保持活力，并且在一些情况下发生分裂(例如图93)。
594)到所述装置中，孵育15分钟，洗涤抗体以测定IgG分泌细胞的总频率。图92显示一对H1N1和H3N2都具有交叉反应活性的单个浆细胞的实例。抗原特异性细胞可以立即回收，或在所述微流控装置中过夜培养后第二天在回收。细胞保持活力，并且在一些情况下发生分裂(例如图93)。
[0627] 如图94所指，回收并裂解来自八间H1N1和/或H3N2(流感特异)阳性小室的细胞和IgG(即非抗原抗原特异性的)。将被裂解的细胞的RNA进行逆转录，然后进行抗体重链和轻链(Kappa/lambda)特异性PCR。八个样品中的四个提供了一重链和轻链均为阳性的PCR扩增结果(具有100％配对的50％的效率)，以及一预期的扩增产物长度～400bp，即样品3(H1N1阳性)、 4(H1N1/H3N2阳性)、5(H1N1/H3N2阳性)和6(IgG阳性，但非抗原特异性)。所述核酸梯度显示100个碱基配对的增加。这些纯化的PCR产物的Sanger测序确证所述序列对人免疫球蛋白的重链，kappa与lambda具有特异性。
[0628] 如图95所指，从获取自经过季节性流感疫苗免疫的病人体内的单细胞中扩增两个人单克隆抗体(Hs-7和Hs-15)的序列。在一微流体检测中基于细胞能够分泌具有针对H1N1和H3N2亚型血凝素的交叉反应活性来选择细胞。如本发明所述通过RT-PCR与测序获取抗体序列(图95A)。两个单克隆抗体都属于同样的克隆型，这一点通过其共用基因、CDR长度与连接序列显而易见。突变用浅一些的灰色显示(图95B)。克隆抗体序列并在HEK293细胞中表达以证实其结合特性。蛋白A小珠与细胞上清液一起孵育3小室，洗涤，与不同浓度的标记的H1N1或H3N2一起孵育然后成像以测量所述小珠的荧光强度。两个单克隆抗体如预期均发生交叉反应，但是与单细胞测量值一致，对H1N1和H3N2具有不同的亲和力。(图95C)。
[0629] Hs7 (IGHV4-39*01) IGHD3-3*02 IGHJ3*02重链核酸序列(SEQ ID NO: 9)：ATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCT
GCGAGACACCCGAAACGTCTAACGGTTTTTGAAGTGGTCAACGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTTTTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCTGCTGACGAGGCACTGAGGACTG
GCGAGACACCCGAAACGTCTAACGGTTTTTGAAGTGGTCAACGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTTTTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCTGCTGACGAGGCACTGAGGACTG
[0630] Hs7 重链氨基酸序列(SEQ ID NO: 10)：
[0631] M K H L W F F L L L V A A P R W V L SA S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A
[0632] Hs7 (IGLV2-14*01) IGLJ3*02轻链核酸序列(SEQ ID NO: 11)：
[0633] ATGGCCTGGGCTCTGCTACTCCTCACCCTCCTCACTCAGGGCACAGGGTCCTGGGCCAGCTTATATACAAGTATCAACGCTTCCATAGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACA
[0634] Hs7轻链氨基酸序列(SEQ ID NO: 12)：
[0635] M A W A L L L L T L L T Q G T G S W AG Q P K A A P S V T L F P P S SHs15
(IGHV4-39*01) IGHD3-3*01 IGHJ3*02 重链核酸序列(SEQ ID NO: 13)：
ATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTTCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC
GCGAGACACCCAAAACGTATCTCGATTTTTGAAGTGGTCAACGCTTTTGATATCtGGGGCCAGGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCTGCTGACGAGGCACTGAGGACTG
(IGHV4-39*01) IGHD3-3*01 IGHJ3*02 重链核酸序列(SEQ ID NO: 13)：
ATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTTCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC
GCGAGACACCCAAAACGTATCTCGATTTTTGAAGTGGTCAACGCTTTTGATATCtGGGGCCAGGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCTGCTGACGAGGCACTGAGGACTG
[0636] Hs15重链氨基酸序列(SEQ ID NO: 14)：
[0637] M K H L W F F L L L V A A P R W V L SA S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A
[0638] >Hs15 (IGLV2-14*01) IGLJ2*01 IGLJ3*01轻链核酸序列(SEQ ID NO: 15)：ATGGCCTGGACTCTGCTATTCCTCACCCTCCTCACTCAGGGCACAGGGTCCTGGGCC
AGCTTATATAGAAGCAGCACCACTTCCGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTACGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACA
AGCTTATATAGAAGCAGCACCACTTCCGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTACGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACA
[0639] Hs15轻链氨基酸序列(SEQ ID NO: 16)： M A W T L L F L T L L T Q G T G S W AR Q P K A A P S V T L F P P S S
[0640] 实施例20-从一群异质性兔细胞群中筛选抗体并回收序列
[0641] 用季节性流感疫苗免疫兔子。通过直接筛选或流式细胞分筛来回收周边血单核细胞(PBMCs)以富集浆细胞。将细胞注射到所述微流控装置中并检测H1N1和H3N2特异性。也可观察到用于基于荧光的检测的蛋白A包被小珠。将细胞与小珠一起孵育2小室，然后引入荧光标记的抗原15分钟，未被结合的抗原用培养基冲走。图96A与96B分别显示出H1N1和H3N2阳性小室的实例。
[0642] 图97A显示在四间抗原特异性信号筛选的微流体小室内的几个兔细胞的明场图像。图97B显示从兔抗体产生细胞中筛选H1N1抗原特异性抗体。信号非常低，因此似乎没有细胞表达H1N1特异性抗体。图97C显示从兔抗体产生细胞中H3N2抗原特异性抗体的结合。信号在小室之间变化，然而全部小室都是H3N2结合阳性。用一自动化机器人和微型毛细管从所述微流体小室中回收细胞后，重链和轻链特异性聚合酶链式反应(PCR)产物跑2％Egel(Invitrogen)。对于4个被测试的样品，可以看见4条重链中的3条和4条轻链中的4条的带(～400/500bp)(图97D)。Sanger测序揭示两条重链的序列是兔重链(www.imgt.org)而一条包含多个峰，暗示在这间小室中可能有不止一细胞是抗体分泌细胞。四条轻链中的两条被确定为兔轻链而另两条包含多个峰。小室1和3的配对重链和轻链显示有可能确定一异质性细胞群中的一单个效应细胞的序列。所述回收的具有单个峰的高变区序列如下所示：
[0643] 重 1(SEQ ID NO: 17)：
[0644]GCTAGCCACCATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCATAGTCTCTG
GAATCGACCTCAGTAGCTATGCAATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGGCTGGAATACATCGGAATCATTAGTAGCAGTGGTATCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGACAATCACCGATCTGCAACCTTCAGACACGGGCACCTATTTCTGTGCCAGAGGGTCTCGTTATAGTGCTTTTGGTGCTTTTGATACCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCAAGCTTNAN
GAATCGACCTCAGTAGCTATGCAATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGGCTGGAATACATCGGAATCATTAGTAGCAGTGGTATCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGACAATCACCGATCTGCAACCTTCAGACACGGGCACCTATTTCTGTGCCAGAGGGTCTCGTTATAGTGCTTTTGGTGCTTTTGATACCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCAAGCTTNAN
[0645] 重3(SEQ ID NO:18)：
[0646]TTTGGCTAGCCACCATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTATGCAATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTAATAATAATGGTGACACATACTACGCGAGCTGGCCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGATCGTGGTAATAGTTATTACTTTGGATTGGACTACTTTAACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCAAGCTTTATAN
[0647] 轻1(SEQ ID NO:19)：
[0648]CTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCTTCGAATTGACCCAGACTCCATCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGTATTAATAGTTGGTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAAGGCATCCAATCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAGAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGNCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAAGCNATTATGCTACTAGTAGTGTTGATTATNATGCTTTCGGCGGAAGGACCGAGGTGGTGGTCAANACTGCGGCNGTANTANTNN N
[0649] 轻3(SEQ ID NO:20)：
[0650]TGCAGCTAGCCACCATGGACACGAGGGCCCCCATCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGGTGTGCCCTTGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTGATAGTTGGTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCGTCCCAGGCTCCTGATCTATTATGCATCCAATCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAATACACTCTCACCATCAGCGGCGTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAGAGGGTTATAGTAGTGGTAATGTTGATAATGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAACTGCGNCCGCTATAN
[0651] 实施例21-人源序列抗体的表达与验证
[0652] 用基于脂质体的转染在HEK293细胞中表达一人源抗MCP1抗体。被表达的抗体从生长培养基中沉淀到蛋白A包被小珠上并用荧光标记的MCP-1抗原测试。重组抗体的亲和力与氨基酸序列相同的产生自可通过购买或的稳定CHO细胞系( PTA-5308TM)的抗体进行比较(图99)。
[0653] 克隆Hu-11K2-3f2-H2。合成重链和轻链高变序列并分别克隆到pFUSEss-CHIg-hG1和pFUSE2-CLIg-hk表达载体中。
[0654] aMCP1-重(SEQ ID NO:21)：
[0655]GAATTCCATGCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCCTGACCATCAGCGACACCTACATGCACTGGGTGCGCCAGGCTCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGGCAGAATCGACCCCGCCAACGGCAACACCAAGTTCGACCCCAAGTTCCAGGGCAGAGTGACCATCACCGCCGACACCAGCACCTCCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCAGAGGCGTGTTCGGCTTCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCATCTGCTAGC
[0656] aMCP1-轻(SEQ ID NO:22)：
[0657]ACCGGTGCCACCATGTACCGGATGCAGCTGCTGAGCTGTATCGCCCTGTCTCTGGCCCTCGTGACGAATTCAGCCATGGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACATGCAAGGCCACCGAGGACATCTACAACCGGCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATTAGCGGAGCCACCAGCCTGGAAACCGGCGTGCCAAGCAGATTTTCCGGCAGCGGCTCCGGCAAGGACTACACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTTTTGGAGCGCCCCCTACACCTTTGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGTACG
[0658] 实施例22-从单细胞中回收小鼠序列后克隆并表达抗体进行验证
[0659] 按顺序以有限的稀释度加载D1.3和HyHEL5到一微流控装置中。在引入各类细胞到所述装置中后拍摄一组照片来记录D1.3和HyHEL5细胞的位置。将细胞与用兔抗小鼠捕获抗体包被的蛋白A小珠和10nM标记的鸡蛋溶菌酶一起孵育2小时。用机器人控制的一微型毛细管回收单个的抗体分泌细胞，转移所述细胞到一管中进行RT-PCR，然后回收所述抗体序列。各个单细胞之间的对照小室也作为负对照被回收。图100显示一幅来自2个单细胞的重链和轻链的凝胶图，对照样品无信号。合成HyHEL5(高亲和力)和D1.3(低亲和力)抗体的重链和轻链的高变区序列，并克隆到pFUSEss-CHIg-mG1和pFUSE2ss-CLIg-mk表达载体中。在HEK293细胞系中产生抗体，并在兔抗小鼠抗体包被的蛋白A小珠上捕获所述抗体。用浓度逐渐增加的荧光标记的溶菌酶测试所述亲和力(图101)。
[0660] D1.3-重(SEQ ID NO:23)：
[0661]ATGCAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACCGTCTCAGGGTTCTCATTAACCGGCTATGGTGTAAACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAATGATTTGGGGTGATGGAAACACAGACTATAATTCAGCT CTCAAATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCACACTGATGACACAGCCAGGTACTACTGTGCCAGAGAGAGAGATTATAGGCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCTAGC
[0662] D1.3-轻(SEQ ID NO:24)：
[0663]ATGGACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTTTCTGCGTCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGGGAATATTCACAATTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATTATACAACAACCTTAGCAGATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGAACACAATATTCTCTCAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGAGTACTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTCGAG
[0664] HyHEL5-重(SEQ ID NO:25)：
[0665]ATGGAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCAGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAAGCTTCTGGCTACACATTCAGTGACTACTGGATAGAGTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTTACCTGGAAGTGGTAGCACTAATTACCATGAGAGATTCAAGGGCAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAACAGCCTGACATCTGAAGACTCTGGCGTCTATTACTGCCTCCATGGTAACTACGACTTTGACGGCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCTAGC
[0666] HyHEL5-轻(SEQ ID NO:26)：
[0667]ATGGATATCGTTCTCACACAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGTTCAAGTGTAAATTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACTTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGA CTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGGGTCGTAACCCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTCGAG
[0668] 实施例23-验证获取自微流体筛选的新的小鼠抗体的序列
[0669] 从一只经过鸡蛋溶菌酶免疫的小鼠中分离脾细胞，在一微流控装置中筛选其抗体。回收来自抗原特异性细胞R05C14的序列，在HEK293细胞中克隆并表达。通过在包被兔抗小鼠抗体的蛋白A小珠上捕获所述抗体，与10nM标记的鸡蛋溶菌酶一起孵育并测量荧光强度确认了抗体的结合(图102)。R05C14-重高变(SEQ ID NO:27)：
[0670]TGGAAGGTGGTGCACACTGCTGGACAGGGATCCAGAGTTCCAGGTCACTGTCACTGGCTCAGGGAAATAGCCCTTGACCAGGCATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTTGGGCAGCAGATCCAGGGGCCAGTGGATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCCTTGGCCCCAGCAGTCCCCGTCCCAGTTTGCACAGTAATATGTGGCTGTGTCCTCAGGAGTCACAGAAATCAACTGCAGGTAGCACTGGTTCTTGGATGTGTCTCGAGTGATAGAGATTCGACCTTTGAGAGATGGATTGTAGTAAGTGCTACCACTGTAGCTTATGTACCCCATATACTCAAGTTTGTTCCCTGGGAATTTCCGGATCCAGCTCCAGTAATCATTGGTGATGGAGTCGCCAGTGACAGAACAGGTGAGGGACAGAGTCTGAGAAGGTTTCACGAGGCTAGGTCCAGACTCCTGCAGCTGCACCTCGAATTCCCA
[0671] R05C14-轻高变(SEQ ID NO:28)：
[0672]TTGGTCCCCCCTCCGAACGTGTACGGCCAGTTGTTACTCTGTTGACAGAAATACATTCCAAAATCTTCAGTCTCCACACTGATGATACTGAGAGTGAAATCCGTCCCTGATCCACTGCCACTGAACCTGGAGGGGATCCCAGAGATGGACTGGGAAGCATACTTGATGAGAAGCCTTGGAGACTCATGTGATTTTTGTTGATACCAGTGTAGGTTGTTGCTAATACTTTGGCTGGCCCTGCAGGAAAGACTGACGCTATCTCCTGGAGTCACAGACAGGGTGTCTG
GAGACTGAGTTAGCACAATATCACCTCTGGAGGCTGAAATCCAGAAAAGCAAAAAA
GAGACTGAGTTAGCACAATATCACCTCTGGAGGCTGAAATCCAGAAAAGCAAAAAA
[0673] 实施例24-效应细胞抗体的序列回收及行扩增
[0674] 用以下流程和引物回收小鼠、人或兔抗体序列。
[0675] 逆转录(RT)和聚合酶链式反应(PCR)的试剂如表7所提供。
[0676]
[0677] 然后进行下述RT-PCR热循环流程：
[0678] RT：72℃3分钟，42℃90分钟，85℃10分钟。
[0679] 热启动：95℃2分钟；变性：95℃15秒；延伸：72℃15秒；退火：按以下温度15秒：72℃3个循环；70℃3个循环；68℃3个循环；66℃3个循环；64℃3个循环；62℃6个循环；60℃20-30个循环。
[0680] 用于RT-PCR实验的引物由如下表8提供：
[0681]
[0682]
[0683]
[0684]
[0685]
[0686] 图103A显示通过如上所述方法产生的PCR扩增子测试从60℃到40℃的温度梯度的逆转录的显微图。模板是200pg(～相当于是个细胞)纯化自杂交瘤细胞(D1.3)的RNA。最右边的泳道显示用KOD聚合酶优化的条件。HV和LV扩增子预期在450到550bp观察到较强的带的区域内；这一区域还包括一些非特异性的产物。如图103B所指，提取从400到600bp的带，并用一条退火到重链上一恒定区的引物进行Sanger测序。测序结果显示了在模板转换寡核苷酸和cDNA之间由MMLV作用形成的连接，在cDNA合成时通过MMLV又添加了CCC加入。比对所述序列，确认与D1.3重链的高变区序列相匹配。
[0687] 实施例25-回收自装置的单细胞的第二代测序
[0688] 一不同的回收抗体序列的方法结合了模板转换和第二代测序。如图59所指，沉积当个细胞到微量离心管，并用靶向重链和轻链恒定区的多重基因特异性引物产生cDNA。利用MMLV酶的模板转换活性向所产生的cDNA的3’端加上一模板转换寡核苷酸的反向互补序列。用半巢式PCR扩增cDNA并引入特异于各单细胞扩增子的索引序列，所述半巢式PCR使用与重链和轻链的恒定区退火的多重引物与一条与被拷贝的模板转换寡核苷酸互补的通用引物。然后收集扩增子并测序。
[0689] 另一从异质性细胞群中回收序列的方法将微流体单细胞抗体分析与Ig-测序相结合(图104A)。免疫后，从动物体内收集ASC；一部分在微流控装 置上分析，而剩下的用来构建一批量扩增子文库用以进行Ig-测序。从所述微流控装置中，总共收集了96个带有索引序列的单细胞(SC)文库和96个带有索引序列的低密度(LD)文库在MiSeq上进行测序。用所述批量文库分析来测定在免疫应答中的HV和LV克隆型，如图104B中的簇所示。SC文库提供丰度很高的克隆型的单克隆抗体的配对链HV和LV序列，所述单克隆抗体被确证是抗原特异的。LD文库提供了HV和LV序列的另外的鉴定，其是抗原特异的或非抗原特异的。通过分析全文库中的HV和LV序列的共同发生LD文库还被用于推断链配对，如图104C所注释。结合状态的信息与特异性序列的链配对可以通过结合状态的分配，如图104B中通过星号(抗原特异)和十字(非特异)表示，和克隆型配对来解释批量样品。
[0690] 实施例26-利用光学编码小珠的多重小珠检测
[0691] 本实施例中的所述基于多重小珠的检测可以在同一间小室中从抗体分泌细胞中测量几种不同的抗原特异性抗体。可以用荧光强度编码小珠(例如Starfire RedTM染料珠，Bangs Laboratories)通过使用一传统的磺基-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)/1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸(EDC)蛋白偶联策略(Pierce)标记各小珠的亚群来追踪不同的抗原特异行抗体。然后可以对Starfire RedTM(从紫外光激发到红光，发射波长最大值在675nm)和抗原特异性荧光信号进行测量和定量。
[0692] 用不同的2012-1013季节性流感特异性抗原包被含有3个荧光编码小珠亚群的Starfire RedTM染料珠(直径5.5mm)(图105A)。小珠(分别从强度最低到强度最高的Starfire RedTM强度)与H1N1(A/California/7/2009(H1N1)pdm09样株)、H3N2(A/Victoria/361/2011(H3N2)样株)和B株(B/Wisconsin/1/2010样株)抗原(Protein Science Corp.)相偶联。
[0693] 按1:1:1的比例混合小珠并注射到一微流控装置中(图105B)。Starfire RedTM染料荧光测量揭示了每个特定亚群小珠的位置，并可以进一步后续追踪抗原特异性抗体结合(图105C)。然后将溶于培养基的兔抗H1N1特异性抗体(北京义翘神州生物技术有限公司)以400pg/mL的浓度流入所述装置 中并孵育45分钟。然后将用Dylight488标记的抗兔IgG(Jackson Immunoresearch)加入到所述装置中并进行荧光成像。在H1N1包被的小珠上(亮度最低的Starfire RedTM小珠，由箭形符号指示)阳性信号清晰可见(图105D)并且在H3N2和B株特异性抗原标记的小珠上未检测到非特异性结合(图105E)。
[0694] 实施例27-微流体凋亡效应物检测
[0695] 实施一功能性胞外效应检测来找到抗体与产生这种抗体的、中和TNF-α或封闭其受体的效应细胞。为了定量TNF-α在靶标L929细胞(读出细胞)上的效应，用DiOC18将所述读出细胞染色并与1μg/mL放线菌素D和不同浓度的TNF-α在多孔板中孵育。24小时后，用碘化丙啶(PI)复染细胞并通过在显微镜下对染上DiOC18的细胞中的染上PI部分的细胞进行计数来测量细胞活性。TNF-α在L929细胞上的剂量应答如图106A所示。
[0696] 在第二个实验中，L929细胞用CFSE染色，加载到一微流控装置中并与10μg/mL放线菌素D和10ng/mLTNF-α一起孵育，并通过延时成像进行追踪。细胞发生了迅速凋亡，这通过24小时的时候PI标记所确证(图106B)。
[0697] 实施例28-微流体细胞信号传导效应物检测
[0698] 开发了一基于核或胞质的荧光定位的TNFα功能性检测用于基于功能的针对TNFα的抗体的筛选。所述读出细胞以前在Tay等人(2010).Nature 466,pp.267-71中已有描述，此处本申请全文引用。TNFα诱导的激活发生时，一荧光标记的NF-κB转录因子亚基从胞质中被转运到细胞核。图107A显示所述TNFα功能性检测的延时荧光图像。TNFα配体不存在时，荧光定位在胞质中(图107Α，上板块)。被TNFα配体(10ng/mL)激活时，观察到荧光从细胞质中改变到细胞核中(图107Α，中板块)。除了TNFα以外，当还存在含有一中和TNFα配体的抗体的细胞上清液时，荧光定位保持在细胞质中(图107Α，下板块)，表明TNFα配体已经被所述抗体有效地中和，因此防止了NF-κB信号传导。各条件下激活细胞的部分如图107Β所示。
[0699] 实施例29-微流体增殖和自噬效应细胞检测
[0700] 加载一过表达HER2且用一LC3-GFP自噬报告基因工程化的人乳腺癌细胞系(SKBR3)到一微流控装置中并培养3天以测定使用这个细胞系作为读出细胞的合理性(图
108)。向单个的微流体小室提供单个的SKBR3细胞群。明场和荧光延时成像显示细胞数随着时间增加(图108)。所述结果表明所述SKBR3细胞在测量一效应细胞阻断SKBR3细胞增殖的能力/倾向的胞外效应检测中适合用作读出细胞。还可能用所述SKBR3细胞系来筛选调节自噬作用的抗体。
108)。向单个的微流体小室提供单个的SKBR3细胞群。明场和荧光延时成像显示细胞数随着时间增加(图108)。所述结果表明所述SKBR3细胞在测量一效应细胞阻断SKBR3细胞增殖的能力/倾向的胞外效应检测中适合用作读出细胞。还可能用所述SKBR3细胞系来筛选调节自噬作用的抗体。
[0701] 实施例30-抗原特异性T细胞的检测和回收
[0702] 如图109所指，加载一个病人的周边血单核细胞(PBMC)到一微流体装置中，并用一衍生自巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒和流感病毒(CEF)多肽的病毒抗原库以10μg/mL刺激过夜。图109A显示加载有PBMC和干扰素γ(IFNγ)捕获小珠的一间微流体小室的明场图像。用CEF多肽刺激时，被激活的抗原特异性T细胞分泌的IFNγ被包被有抗IFNγ抗体的功能化小珠所捕获并用一荧光标记的二抗检测。图109Β是图109Α含有一被激活的抗原特异性Τ细胞的阳性小室的荧光图像。用100U/mL白细胞介素2(IL-2)扩增被激活的细胞5天(图
109C)并接下来回收。同一病人体内的周边血单核细胞中CEF特异性体细胞的频率通过ELISPOT和所述微流体小珠检测进行测量以进行比较。所述微流体检测的敏感度使抗原特异性T细胞的检测的频率高于ELISPOT(图109D)。
109C)并接下来回收。同一病人体内的周边血单核细胞中CEF特异性体细胞的频率通过ELISPOT和所述微流体小珠检测进行测量以进行比较。所述微流体检测的敏感度使抗原特异性T细胞的检测的频率高于ELISPOT(图109D)。
[0703] 实施例31-信号传导的BAF3 PDGFRα检测
[0704] 开发了一细胞存活检测用以进行基于功能的针对PDGFRα抗体的筛选。用CMV启动子驱动的人PDGFRα电穿孔转化一存活与生长不依赖细胞因子IL-3的BaF3悬浮细胞系并产生稳定表达的克隆。在Ba/F3细胞中过表达的PDGFRα代替了IL-3信号传导的需要；在没有IL-3时BaF3细胞分裂被抑制并死亡，但当PDGF配体存在时PDGFRα信号传导拯救了这些细胞，给出了细胞存活与有丝分裂应答，通过显微镜可检测到，包括增殖、形态改变和运动型/趋化性提高。作为一荧光读出结果，BaF3细胞还稳定表达融合到一黄 色荧光蛋白(YFP)上的组蛋白2Β以标记细胞核。图110显示细胞存活PDGFRα功能性检测的验证，在没有配体存在时或25ng/mL PDGF-AA表达48小时时PDGFRα，示出一BaF3克隆和组蛋白2B-YFP。没有配体时，BaF3细胞发生凋亡并失去YFP荧光(可能是凋亡时蛋白降解的结果)(图110A)。在存在PDGF-AA配体时，细胞存活与生长得到拯救，如YFP荧光读出结果所示(图110B)。
[0705] 为了测试抗体分泌细胞能否在这种检测的时长内保持活力，富集小鼠脾细胞的浆细胞，并在一微流控装置中与过表达PDGFRα的BaF3细胞一起共孵育。在实验开始拍摄明场与荧光图像来区分所述效应细胞群与所述读出细胞群(包含H2B-YFP)。在IL-3存在时培养细胞并通过延时摄像48小时进行追踪，这时向所述装置中引入抗小鼠抗体捕获小珠孵育2小时。用一Dylight-594标记的抗体鉴定含有抗体分泌细胞的小室。图110C显示一在实验开始含有2个脾细胞(黑色箭形符号)和2个读出细胞(白色箭形符号)的实例。培养48小时后读出细胞增殖成22个细胞而所述效应细胞群持续分泌抗体。
[0706] 实施例32-利用DiscoverRx细胞的对配体的GPCR应答
[0707] 在DiscoveRx(www.discoverx.com)的 β-抑制素系统中，一段小肽与一所关注的GPCR靶标的胞内序列融合，而一段补偿多肽与另一胞内蛋白(β-抑制素)融合。结合到其特异性的配体后，所述GPCR招募β-抑制素，迫使两个多肽补偿产生一功能性的β-半乳糖苷酶。在传统的非微流体检测中，酶活性，也就是结合到所述GPCR的配体的数量，通过单次添加一试剂鸡尾酒以裂解所述细胞并产生一化学发光产物，然后用传统的酶标仪进行分析来检测。
[0708] 通过使用一基于荧光的底物修改这一检测使其适应于本发明所描述的所述微流体形式。5-十二烷酰氨基荧光素二-β-半乳吡喃糖苷(C12FDG)是一化学修饰的非荧光的β-半乳糖苷酶底物，在被酶切割后变得可以发荧光。其还包含一亲脂尾部，可以使所述底物在细胞膜内扩散并且还可以促进切割 后在细胞内的保留。
[0709] CCR4/CCL22 GPCR激动剂配对( eXpress CCR4 CHO-K1β-抑制素GPCR检测)被用作一改变所述检测使其适应所述C12FDG底物的实例。将细胞与各种浓度的底物与配体一起孵育，然后进行荧光成像。
[0710] 首先在多孔板中测试所述改变的检测。将细胞与各种浓度的C12FDG底物一起孵育90分钟。所述底物在细胞内扩散，且知道被切割后才发出荧光。然后，添加不同浓度的配体/激动剂CCL22，孵育60分钟使补偿在细胞内发生，导致β-半乳糖苷的形成与所述底物的切割，在细胞内产生一荧光产物。然后用基于荧光的显微术对各个对应于一特定条件的孔进行成像(图111)。
[0711] 然后加载细胞到一微流控装置中并与33μM C12FDG底物在细胞培养基中一起孵育。所述底物与所述细胞一起孵育90分钟以使非荧光底物在所述细胞内扩散和积累。在孵育结束时用培养基洗涤细胞10分钟。然后以4中不同的浓度将CCL22激动剂/配体加载到所述装置的4个不同的亚阵列中(亚阵列1：0.01nM，亚阵列2：1nM，亚阵列3：100nM，亚阵列4：无激动剂)。然后用基于荧光的显微术将各间对应于一特定条件的小室成像(图112A)。对每间小室进行图像分析并测量小室内的平均强度。减去背景，结果如图112B中的曲线所示。
[0712] 本申请全文中所引用到的所有文献、专利、专利申请、出版物、产品说明和与流程均被全文引用以供各种目的参考。
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