工程化且完全-功能定制的糖蛋白
专利汇可以提供工程化且完全-功能定制的糖蛋白专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文描述了体外和体内产生糖基化蛋白的组合物和方法。所述方法包括使用宿主细胞来产生糖基化蛋白。本文还描述了使用这些方法产生的糖基化蛋白及其用途。，下面是工程化且完全-功能定制的糖蛋白专利的具体信息内容。
1.利什曼虫(Leishmania)宿主细胞，其包含：
a.编码靶标蛋白的重组核酸；和
b.编码异源糖基转移酶的重组核酸。
2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述异源糖基转移酶是N-乙酰氨基葡萄糖转移酶；和/或异源半乳糖基转移酶；和/或异源唾液酸转移酶。
3.根据权利要求2所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含两种或更多种N-乙酰氨基葡萄糖转移酶；和/或两种或更多种异源半乳糖基转移酶；和/或两种或更多种异源唾液酸转移酶。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的宿主细胞，其中所述包含异源唾液酸转移酶的宿主细胞还包含能够产生CMP-NeuAc的异源CMP-Sia生物合成途径蛋白。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的宿主细胞，其中来自N-聚糖生物合成途径的一种或多种内源酶已缺失、突变和/或功能性失活。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的宿主细胞，其中所述利什曼虫(Leishmania)细胞是蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)细胞。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的宿主细胞，其中所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶和/或唾液酸转移酶的氨基酸序列来源于表9中所列的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶或唾液酸转移酶，或其功能同源物、同工型或变体。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的宿主细胞，其中将利什曼虫(Leishmania)信号和/或保留序列加入至所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶和/或唾液酸转移酶，其中所述信号序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶和/或唾液酸转移酶靶向利什曼虫(Leishmania)宿主细胞的内质网，并且其中所述保留序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶和/或唾液酸转移酶保留在高尔基体中。
9.根据权利要求4至8中任一项所述的宿主细胞，其中所述能够产生CMP-NeuAc的CMP-Sia生物合成途径蛋白与表11中所列的CMP-Sia生物合成途径蛋白至少约70％、71％、72％、
73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一或是其任何功能同源物、同工型或变体。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的宿主细胞，其中所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是GnT-I。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的宿主细胞，其中所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是GnT-II。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的宿主细胞，其中所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是GnT-I和GnT-II。
13.根据权利要求1至9中任一项所述的宿主细胞，其中所述半乳糖基转移酶是
B4GALT1。
14.根据权利要求1至9中任一项所述的宿主细胞，其中所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是GnT-I和GnT-II，并且所述半乳糖基转移酶是B4GALT1。
15.根据权利要求1至9中任一项所述的宿主细胞，其中所述唾液酸转移酶是2,6-SiaT或者2,3-SiaT。
16.根据权利要求1至9中任一项所述的宿主细胞，其中所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是GnT-I和GnT-II，所述半乳糖基转移酶是B4GALT1，并且所述唾液酸转移酶是2,6-SiaT或
2,3-SiaT。
17.根据权利要求1至9中任一项所述的宿主细胞，其中所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是GnT-I和GnT-II，所述半乳糖基转移酶是B4GALT1，并且所述唾液酸转移酶是2,6-SiaT或
2,3-SiaT，并且其中所述唾液酸转移酶还包含能够产生CMP-NeuAc的异源CMP-Sia生物合成途径蛋白。
18.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中所述保留序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶和/或半乳糖基转移酶保留在宿主细胞的高尔基体区室的顺面膜囊中。
19.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中所述保留序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶和/或半乳糖基转移酶保留在宿主细胞的高尔基体区室的中间膜囊中。
20.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中所述保留序列将所述半乳糖基转移酶保留在宿主细胞的高尔基体区室的反面膜囊中。
21.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中所述保留序列将所述唾液酸转移酶保留在宿主细胞的高尔基体区室的反面膜囊中。
22.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中所述保留序列将所述唾液酸转移酶和半乳糖基转移酶保留在宿主细胞的高尔基体区室的反面膜囊中。
23.根据权利要求8或10至22中任一项所述的宿主细胞，其中所述信号序列和/或保留序列是来源于蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)的信号序列或保留序列。
24.根据权利要求23所述的宿主细胞，其中加工并除去所述信号序列。
25.根据权利要求8或10至23中任一项所述的宿主细胞，其中所述保留序列是来源于蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)蛋白的胞质-跨膜-干(CTS)序列。
26.根据权利要求25所述的宿主细胞，其中所述CTS序列来源于蜥蜴利什曼虫
(Leishmania tarentolae)MAN1、NTPDase 1或NTPDase 2。
27.根据权利要求25所述的宿主细胞，其中所述CTS序列包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26所示的序列或其功能活性片段。
28.根据权利要求25所述的宿主细胞，其中所述CTS序列包含与SEQ ID NO：24所示的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％的同一性的序列或其功能活性片段；与SEQ ID NO：25所示的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％的同一性的序列或其功能活性片段；或者与SEQ ID NO：26所示的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％的同一性的序列或其功能活性片段。
29.根据权利要求25所述的宿主细胞，其中所述CTS来源于蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)MAN1。
30.根据权利要求25所述的宿主细胞，其中所述CTS序列包含SEQ ID NO：24所示的序列或其功能活性片段。
31.根据权利要求20至22中任一项所述的宿主细胞，其中所述保留序列包含来源于利什曼虫(Leishmania)的GRIP序列或其功能活性片段。
32.根据权利要求31所述的宿主细胞，其中所述GRIP序列包含SEQ ID NO：27所示的序列或其功能活性片段。
33.根据权利要求31所述的宿主细胞，其中所述GRIP序列包含与SEQ ID NO：27所示的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％同一性的序列或其功能活性片段。
34.根据权利要求20至22中任一项所述的宿主细胞，其中所述保留序列包含来源于利什曼虫(Leishmania)蛋白的CTS序列或其功能活性片段，和来源于利什曼虫(Leishmania)的GRIP序列或其功能活性片段。
35.根据权利要求34所述的宿主细胞，其中所述CTS序列来源于蜥蜴利什曼虫
(Leishmania tarentolae)MAN1、NTPDase 1或NTPDase 2。
36.根据权利要求34所述的宿主细胞，其中所述CTS序列包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26所示的序列，并且GRIP序列包含SEQ ID NO：27所示的序列，或其功能活性片段。
37.根据权利要求34所述的宿主细胞，其中所述CTS序列来源于蜥蜴利什曼虫
(Leishmania tarentolae)MAN1。
38.根据权利要求34所述的宿主细胞，其中所述CTS序列包含SEQ ID NO：24所示的序列，并且GRIP序列包含SEQ ID NO：27所示的序列，或其功能活性片段。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的宿主细胞，其中所述靶标蛋白对于利什曼虫(Leishmania)宿主细胞是异源的。
40.根据权利要求39所述的宿主细胞，其中所述靶标蛋白已工程化以包含来自利什曼虫(Leishmania)的信号序列。
41.根据权利要求40所述的宿主细胞，其中所述来自利什曼虫(Leishmania)的信号序列是来自蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)的信号序列。
42.根据权利要求39所述的宿主细胞，其中所述信号序列包含SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29所示的序列或其功能活性片段。
43.根据权利要求39所述的宿主细胞，其中所述信号序列包含SEQ ID NO：28所示的序列或其功能活性片段。
44.根据权利要求39所述的宿主细胞，其中所述信号序列包含与SEQ ID NO：28所示的信号序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％同一性的信号序列或其功能活性片段。
45.根据权利要求41至44中任一项所述的宿主细胞，其中加工所述信号序列并将其从所述靶标蛋白中除去。
46.根据权利要求39至45中任一项所述的宿主细胞，其中所述靶标蛋白包含以下的氨基酸序列：人干扰素-α(INF-α)、干扰素-β(INF-β)、干扰素-γ(INF-γ)、白介素-2(IL2)、嵌合白喉毒素-IL-2(Denileukin diftitox)、白介素-1(IL1)、IL1B、IL3、IL4、IL11、IL21、IL22、IL1受体拮抗剂(阿那白滞素)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、胰岛素、普兰林肽、生长激素(GH)、胰岛素样生长因子(IGF1)、人甲状旁腺激素、降钙素、高血糖素-样肽-1激动剂(GLP-
1)、高血糖素、生长激素-释放激素(GHRH)、胰泌素、促甲状腺激素(TSH)、人骨形态发生蛋白
2(hBMP2)、人骨形态发生蛋白7(hBMP7)、促性腺激素释放激素(GnRH)、角化细胞生长因子(KGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)、成纤维细胞生长因子20(FGF20)、成纤维细胞生长因子21(FGF21)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、神经营养蛋白-3、人促生育素(FSH)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、促黄体素-α、促红细胞生成素、粒性白细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、CTLA4的胞外域(例如，FC-融合蛋白)或者TNF受体的胞外域(例如，FC-融合蛋白)。
47.根据权利要求39至45中任一项所述的宿主细胞，其中所述靶标蛋白是治疗性蛋白。
48.根据权利要求39至45中任一项所述的宿主细胞，其中所述靶标蛋白是抗体。
49.根据权利要求48所述的宿主细胞，其中所述抗体是抗人蛋白抗体。
50.根据权利要求48或49所述的宿主细胞，其中所述抗体具有阿达木单抗(Humira)；类克(Remicade)(英利昔单抗)；ReoPro(阿昔单抗)；Rituxan(利妥昔单抗)；舒莱(巴利昔单抗)；Synagis(帕利珠单抗)；赫塞汀(曲妥珠单抗)；麦罗塔(吉妥珠单抗奥唑米星)；Campath(阿仑珠单抗)；Zevalin(替伊莫单抗替坦(tiuxetan))；索雷尔(奥马珠单抗)；百克沙(托西莫单抗-I-131)；爱必妥(西妥昔单抗)；安维汀(贝伐单抗)；Tysabri(那他珠单抗)；Actemra(托珠单抗)；维克替比(帕尼单抗)；Lucentis(兰尼单抗(ranibizumab))；Soliris(依库珠单抗)；Cimzia(聚乙二醇结合赛妥珠单抗(Certolizumab pegol))；Simponi(戈利木单抗)；
Ilaris(卡那津单抗)；Stelara(优特克单抗)；Arzerra(奥法木单抗)；Prolia(地诺单抗)；
Numax(莫维珠单抗)；ABThrax(瑞西巴库单抗)；Benlysta(贝利木单抗)；Yervoy(普利木单抗)；Adcetris(本妥昔单抗)；Perjeta(帕妥珠单抗)；Kadcyla(曲妥珠单抗-美坦新偶联物(Ado-trastuzumab emtansine))；或者Gazyva(奥比妥珠单抗)的氨基酸序列。
51.根据权利要求48至50中任一项所述的宿主细胞，其中所述抗体是全长抗体、Fab、F(ab')2、scFv或sdAb。
52.根据权利要求39至45中任一项所述的宿主细胞，其中所述靶标蛋白包含酶或其抑制剂的氨基酸序列。
53.根据权利要求52所述的宿主细胞，其中所述靶标蛋白包含以下的氨基酸序列：凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XIII、凝血因子VIIa、抗凝血酶III(AT-III)、蛋白C、组织纤维蛋白溶酶原活化因子(tPA)和tPA变体、尿激酶、水蛭素、链激酶、葡糖脑苷脂酶、阿葡糖苷酶-α、拉罗尼酶(α-L-艾杜糖醛酸酶)、艾杜硫酶(艾杜糖醛酸-
2-硫酸酯酶)、加硫酯酶、半乳糖苷酶-β(人α-半乳糖苷酶A)、肉毒毒素、胶原酶、人脱氧核糖核酸酶-I、玻璃酸酶、木瓜蛋白酶、天冬酰胺酶、尿酸酶(尿酸氧化酶)、谷氨酸羧肽酶(谷卡匹酶)、α1蛋白酶抑制剂(α1抗胰蛋白酶)、乳糖酶、胰酶(脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶)和腺苷脱氨酶。
54.根据权利要求47所述的宿主细胞，其中所述治疗剂蛋白包含以下的氨基酸序列阿巴西普(例如，奥瑞希纳)、阿柏西普(例如，艾力亚)、β半乳糖苷酶(例如，Fabrazyme)、阿必鲁泰(例如，Eperzan)、阿地白介素(例如，Proleukin)、阿法西普(例如，阿密凡夫)、阿糖脑苷酶(例如，Ceredase)、α阿葡糖苷酶(例如，LUMIZYME)、阿利吉仑(例如，泰克特纳)、α-1-蛋白酶抑制因子(例如，Aralast)、阿替普酶(例如，Activase)、阿那白滞素(例如，Kineret)、阿尼普酶(例如，Eminase)、人炭疽免疫球蛋白(例如，ANTHRASIL)、抗血友病因子(例如，百因止)、抗抑制剂混凝剂复合物(例如，Feiba Nf)、抗凝血酶α、人抗凝血酶III、抗胸腺细胞球蛋白(例如，抗胸腺细胞球蛋白)、抗-胸腺细胞球蛋白(马)(例如，ATGAM)、抗-胸腺细胞球蛋白(兔)(例如，ATG-Fresenius)、抑肽酶(例如，特斯乐)、Asfotaseα、门冬酰胺酶(例如，爱施巴)、菊疫病欧文氏菌(erwinia chrysanthemi)门冬酰胺酶(例如，Erwinaze)、贝卡普勒明(例如，REGRANEX)、贝拉西普(belatacept)(例如，Nulojix)、贝拉克坦、比伐卢定(例如，Angiomax)、A型肉毒毒素(例如，保妥适 )、B型肉毒毒素(例如，Myobloc)、本妥昔单抗(例如，Adcetris)、布舍瑞林(例如，Suprecur)、C1酯酶抑制剂(人)、C1酯酶抑制剂(重组)(例如，Ruconest)、聚乙二醇结合赛妥珠单抗(Certolizumab pegol)(例如，Cimzia)、绒促性素α(例如，绒促性素α)、绒毛膜促性腺激素(人)(例如，艾泽(Ovidrel))、绒毛膜促性腺激素(重组)(例如，Ovitrelle)、凝血因子ix(例如，Alprolix)、凝血因子VIIa(例如，诺其(NovoSeven))、人凝血因子X(例如，Coagadex)、凝血因子XIII A-亚基(重组)、胶原酶(例如，Cordase)、Conestatα、促肾上腺皮质激素(例如，H.P.Acthar)、替可克肽(例如，Cortrosyn)、达贝泊汀α(例如，安然爱斯普(Aranesp))、去纤苷(例如，Noravid)、地尼白介素-毒素连接物(denileukin diftitox)(例如，Ontak)、地西卢定、地高辛免疫Fab(羊)(例如，DIGIBIND)、阿法链道酶(例如，百慕时(Pulmozyme))、屈曲可近α(例如，Xigris)、度拉糖肽、艾莫凝血素α(例如，ELOCTA)、依洛硫酸酯酶α、恩夫韦地(例如，FUZEON)、阿法依伯汀(例如，Binocrit)、依泊汀zeta(例如，Retacrit)、依替巴肽(例如，INTEGRILIN)、依那西普(例如，恩利(Enbrel))、艾塞那肽(例如，百泌达(Byetta))、因子IX复合物(人)(例如，AlphaNine)、纤溶酶，也称为胞浆素(例如，Elase)、非格司亭(例如，N.A.)、非格司亭-sndz、促卵泡素α(例如，Gonal-F)、促滤泡素β(例如，Follistim AQ)、加硫酶(例如，Naglazyme)、胃内因子、吉妥珠单抗奥唑米星(例如，麦罗塔)、醋酸格拉替雷(例如，克帕松(Copaxone))、重组高血糖素(例如，诺和生(GlucaGen))、谷卡匹酶(例如，Voraxaze)、短杆菌肽D(例如，新斯波林(Neosporin))、乙型肝炎免疫球蛋白、人降钙素、人破伤风梭菌(clostridium tetani)类毒素免疫球蛋白、人狂犬病病毒免疫球蛋白(例如，Hyperab Rabies人免疫球蛋白)、人Rho(D)免疫球蛋白(例如，Hyp Rho D Inj 16.5％)、人血清白蛋白(例如，亚玛(Albuminar))、人水痘-带状疱疹免疫球蛋白(例如，Varizig)、玻璃酸酶(例如，HYLENEX)、玻璃酸酶(人重组)、替伊莫单抗替坦(tiuxetan)(例如，泽瓦林(Zevalin))、艾杜硫酶(例如，Elaprase)、伊米苷酶(例如，思而赞(Cerezyme))、人免疫球蛋白、门冬胰岛素(例如，NovoLog)、牛胰岛素、德谷胰岛素(例如，诺和达(Tresiba))、地特胰岛素(例如，诺和平(LEVEMIR))、甘精胰岛素(例如，来得时(Lantus))、赖谷胰岛素(例如，艾倍得(APIDRA))、赖脯胰岛素(例如，优泌乐(Humalog))、猪胰岛素(例如，Iletin II)、普通胰岛素(例如，常规优泌林(Humulin R))、猪胰岛素(例如，vetsulin)、低精蛋白胰岛素(例如，诺和灵N(Novolin N))、重组干扰素α-2a(例如，罗扰素(Roferon)A)、干扰素α-2b(例如，INTRON A)、干扰素αcon-1(例如，干复津(INFERGEN))、干扰素α-n1(例如，Wellferon)、干扰素α-n3(例如，Alferon)、干扰素β-1a(例如，Avonex)、干扰素β-1b(例如，贝他费隆(Betaseron))、干扰素gamma-1b(例如，Actimmune)、静脉内免疫球蛋白(例如，Civacir)、拉罗尼酶(例如，Aldurazyme)、来格司亭(例如，格拉诺赛特(Granocyte))、来匹卢定(例如，Refludan)、亮脯利特(例如，Eligard)、利拉鲁肽(例如，Saxenda)、芦西纳坦(例如，Surfaxin)、促黄体素α(例如，乐芮(Luveris))、美卡舍明(例如，N.A.)、尿促性素(例如，贺美奇(Menopur))、甲氧基聚乙二醇-倍他依泊汀(例如，美信罗(Mircera))、美曲普汀(例如，Myalept)、天然α干扰素或multiferon(例如，Intron/罗扰素(Roferon)-A)、奈西立肽(例如，NATRECOR)、奥克纤溶酶(例如，Jetrea)、奥普瑞白介素(例如，Neumega)、OspA脂蛋白(例如，Lymerix)、缩宫素(例如，催产素(Pitocin))、帕利夫明(例如，Kepivance)、胰脂肪酶(例如，Pancrecarb)、牛培加酶(例如，Adagen)、培门冬酶(例如，Oncaspar)、聚乙二醇化非格司亭(例如，Neulasta)、PEG干扰素α-2a(例如，派罗欣(Pegasys))、PEG干扰素α-2b(例如，PEG-Intron)、PEG干扰素β-1a(例如，Plegridy)、聚乙二醇尿酸酶(例如，(Krystexxa))、培维索孟(例如，SOMAVERT)、猪肺磷脂α(例如，固尔苏(Curosurf))、普兰林肽(例如，Symlin)、Preotact(例如， )、硫酸鱼精蛋白(例如，硫酸鱼精蛋白注射剂、USP)、人蛋白S(例如，人蛋白S)、凝血酶原(例如，Feiba Nf)、凝血酶原复合物(例如，Cofact)、凝血酶原复合浓缩物(例如，Kcentra)、拉布立酶(例如，Elitek)、瑞替普酶(例如，Retavase)、利纳西普(例如，Arcalyst)、罗米司亭(Romiplostim)(例如，Nplate)、沙可劳塞酶(例如，Sucraid)、鲑降钙素(例如，Calcimar)、沙格司亭(例如，生白能(Leucomax))、沙妥莫单抗喷地肽(例如，OncoScint)、溶酶体酸性脂肪酶α(例如，Kanuma)、胰泌素(例如，SecreFlo)、舍莫瑞林(例如，乙酸舍莫瑞林)、血清白蛋白(例如，Albunex)、碘化血清白蛋白(例如，Megatope)、西莫托考α(例如，Nuwiq)、Sipuleucel-T(例如，普列威(Provenge))、重组生长激素(例如，NutropinAQ)、重组生长激素(例如，BioTropin)、链激酶(例如，Streptase)、Susoctocogα(例如，Obizur)、阿法他利苷酶(例如，Elelyso)、替度鲁肽(例如，Gattex)、替奈普酶(例如，TNKase)、特立帕肽(例如，Forteo)、替莫瑞林(例如，Egrifta)、凝血调节蛋白α(例如，Recomodulin)、胸腺法新(例如，日达仙(Zadaxin))、甲状球蛋白、促甲状腺素α(例如，Thyrogen)、结核菌素纯化蛋白衍生物(例如，Aplisol)、Turoctocogα(例如，Zonovate)、尿促卵泡素(例如，BRAVELLE)、尿激酶(例如，Kinlytic)、加压素(例如，皮特雷辛(Pitressin))、维拉苷酶α(例如，Vpriv)、阿昔单抗(例如，ReoPro)、阿达木单抗(例如，修美乐(Humira))、阿仑珠单抗(例如，CAMPATH)、阿利库单抗(例如，Praluent)、阿西莫单抗(例如，CEA-Scan)、阿特珠单抗(例如，特善奇(Tecentriq))、巴利昔单抗(例如，舒莱(Simulect))、贝利木单抗(例如，Benlysta)、贝伐单抗(例如，安维汀(Avastin))、博纳吐单抗(例如，Blincyto)、布罗达单抗(例如，Siliq)、卡那津单抗(例如，ILARISE)、卡那津单抗(例如，Ilaris)、卡罗单抗(例如，ProstaScint)、西妥昔单抗(例如，爱必妥(Erbitux))、达昔单抗(daclizumab)(例如，赛尼哌(Zenapax))、达雷木单抗(例如，DARZALEX)、地诺单抗(例如，Xgeva)、达妥昔单抗(例如，unituxin)、依库珠单抗(例如，Soliris)、依法利珠单抗(例如，瑞体肤(RAPTIVA))、埃洛妥珠单抗(例如，EMPLICITI)、依洛尤单抗(例如，瑞百安(Repatha))、戈利木单抗(例如，欣普尼注射剂(Simponi Injection))、替伊莫单抗(例如，泽维宁(Zevalin))、依达赛珠单抗(例如，Praxbind)、英利昔单抗(例如，类克(Remicade))、普利木单抗(例如，YERVOY)、艾克司单抗(例如，Taltz)、美泊利单抗(例如，Nucala)、莫罗单抗(例如，ORTHOCLONE OKT3)、那他珠单抗(例如，Tysabri)、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)(例如，Portrazza)、纳武单抗(例如，欧狄沃(Opdivo))、奥托昔单抗(例如，Anthim)、奥比妥珠单抗(例如，Gazyva)、奥法木单抗(例如，Arzerra)、奥马珠单抗(例如，索雷尔(Xolair))、帕利珠单抗(例如，Synagis)、帕尼单抗(例如，维克替比(Vectibix))、派姆单抗(例如，Keytruda)、帕妥珠单抗(例如，帕捷特(Perjeta))、雷莫芦单抗(例如，Cyramza)、兰尼单抗(ranibizumab)(例如，诺适得(Lucentis))、瑞西巴库单抗(例如，瑞西巴库单抗
(RAXIBACUMAB))、利妥昔单抗(例如，美罗华(Rituxan))、苏金单抗(例如，Cosentyx)、司妥昔单抗(例如，Sylvant)、托珠单抗(例如，雅美罗(ACTEMRA))、托西莫单抗(例如，百克沙(Bexxar))、曲妥珠单抗(例如，赫塞汀(Herceptin))、优特克单抗(例如，Stelara)或维多珠单抗(例如，Entyvio)。
55.根据权利要求39至54中任一项所述的宿主细胞，其中所述靶标蛋白是Fc-融合蛋白。
56.根据权利要求1至55中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞
a.包括Stt3低聚糖转移酶(OST)，和
b.不具有内源N-聚糖延伸。
57.根据权利要求1至56中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是表13中所列的任意的株。
58.根据权利要求1至57中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含如图53所示的具有原核或真核酶的CMP-Neu5Ac途径。
59.用于制备糖基化靶标蛋白的方法，其中所述方法包括培养根据权利要求1至47中任一项所述的宿主细胞，和从所述培养中纯化所述靶标蛋白。
60.从根据权利要求59所述的方法产生的糖基化靶标蛋白的组合物。
61.根据权利要求60所述的糖基化靶标蛋白的组合物，其中所述组合物中的所述靶标蛋白的至少约90％至100％的所述N-连接的糖基化共有序列具有包含以下结构的低聚糖：
其中正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；和
其中Asn是所述靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
62.根据权利要求60所述的糖基化靶标蛋白的组合物，其中所述靶标蛋白上至少约
20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，
55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化是G0-Gn聚糖，其特征为以下结构：
其中正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；和
其中Asn是所述靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
63.根据权利要求60所述的糖基化靶标蛋白的组合物，其中所述靶标蛋白上至少约
20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，
55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化是G0聚糖，其特征为以下结构：
其中正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；和
其中Asn是所述靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
64.根据权利要求60所述的糖基化靶标蛋白的组合物，其中所述靶标蛋白上至少约
20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，
55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化是G1-Gn聚糖，其特征在于以下结构：
其中空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；和
其中Asn是所述靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
65.根据权利要求60所述的糖基化靶标蛋白的组合物，其中所述靶标蛋白上至少约
20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，
55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化是G2或G1聚糖，其特征在于一种或多种以下结构：
其中空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；和
其中Asn是所述靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
66.根据权利要求65所述的糖基化靶标蛋白的组合物，其中进一步修饰所述靶标蛋白上的糖基化以优化所述靶标蛋白在引入对象时的药物动力学性质。
67.根据权利要求66所述的糖基化靶标蛋白的组合物，其中所述靶标蛋白上的糖基化是唾液酸化。
68.根据权利要求67所述的糖基化靶标蛋白的组合物，其中所述靶标蛋白上至少约
20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，
55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化的特征在于以下结构中的一种或多种：
其中菱形代表唾液酸残基，空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；和
其中Asn是所述靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
69.根据权利要求67所述的糖基化靶标蛋白的组合物，其中所述靶标蛋白上至少约
20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，
55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化的特征在于以下结构中的一种或多种：
其中菱形代表唾液酸残基，空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；和
其中Asn是所述靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
70.根据权利要求61至65、68或69中任一项所述的组合物，其中所述N-连接的糖基化共有序列是Asn-X-Ser/Thr；
其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。
71.根据权利要求59所述的方法，其中所述糖基化靶标蛋白分泌至培养基中，并且其中所述糖基化靶标蛋白是如权利要求52至61中任一项所述的糖基化的。
72.根据权利要求71所述的方法，其中从所述培养基中纯化所述糖基化靶标蛋白。
73.根据权利要求72所述的方法，其中通过亲合纯化或离子交换色谱法从所述培养基中纯化所述糖基化靶标蛋白。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述糖基化靶标蛋白含有Fc域并且通过蛋白-A从培养基中亲合纯化。
75.根据权利要求73所述的方法，其中所述糖基化靶标蛋白含有亲合标签并且被亲合纯化。
76.包含通过根据权利要求59或71至75中任一项所述的方法所产生的糖基化靶标蛋白的组合物，其中所述糖基化靶标蛋白群体为至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％均一的。
77.包含通过根据权利要求59或71至75中任一项所述的方法所产生的糖基化靶标蛋白的组合物，其中所述靶标蛋白上90％至100％的所述N-糖基位点被糖基化占据。
78.杂交的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶，其中所述杂交的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶包含a.非来自利什曼虫(Leishmania)的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的催化域；和
b.负责在利什曼虫(Leishmania)的内质网或高尔基体区室中定位和保留的氨基酸序列。
79.根据权利要求78所述的杂交的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶，其中所述利什曼虫
(Leishmania)是蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)。
80.根据权利要求78或79所述的杂交的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶，其中所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶已工程化以包含信号序列和至少一个保留序列，其中所述信号序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶靶向所述蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)宿主细胞的内质网，并且其中所述保留序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶保留在所述内质网或高尔基体中。
81.根据权利要求78所述的杂交的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶，其中所述保留序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶保留在所述高尔基体顺面膜囊中。
82.根据权利要求78所述的杂交的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶，其中所述保留序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶保留在所述高尔基体中间膜囊中。
83.根据权利要求78至82中任一项所述的杂交的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶，其中所述保留序列是胞质-跨膜-干(CTS)序列。
84.根据权利要求78至83中任一项所述的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶，其中所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的氨基酸序列来源于表9所列的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶或其功能同源物、同工型或变体。
85.杂交的半乳糖基转移酶，其中所述杂交的半乳糖基转移酶包含
a.非来自利什曼虫(Leishmania)的半乳糖基转移酶的催化域；和
b.负责在利什曼虫(Leishmania)的内质网或高尔基体区室中定位和保留的氨基酸序列。
86.根据权利要求85所述的杂交的半乳糖基转移酶，其中所述利什曼虫(Leishmania)是蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)。
87.根据权利要求85或86所述的杂交的半乳糖基转移酶，其中所述半乳糖基转移酶已工程化以包含信号序列，其中所述信号序列将所述半乳糖基转移酶靶向蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)宿主细胞的内质网，并且其中所述保留序列将所述半乳糖基转移酶保留在内质网或高尔基体中。
88.根据权利要求87所述的杂交的半乳糖基转移酶，其中所述保留序列将所述半乳糖基转移酶保留在所述高尔基体顺面膜囊中。
89.根据权利要求87所述的杂交的半乳糖基转移酶，其中所述保留序列将所述半乳糖基转移酶保留在所述高尔基体中间膜囊中。
90.根据权利要求87所述的杂交的半乳糖基转移酶，其中所述保留序列将所述半乳糖基转移酶保留在所述高尔基体反面膜囊中。
91.根据权利要求87至89中任一项所述的杂交的半乳糖基转移酶，其中所述保留序列是胞质-跨膜-干(CTS)序列。
92.根据权利要求87至89中任一项所述的杂交的唾液酸转移酶，其中所述保留序列是GRIP序列。
93.根据权利要求87至89中任一项所述的杂交的唾液酸转移酶，其中所述保留序列是CTS序列和GRIP序列。
94.根据权利要求87至93中任一项所述的半乳糖基转移酶，其中所述半乳糖基转移酶的氨基酸序列来源于表9所列的半乳糖基转移酶或其功能同源物、同工型或变体。
95.杂交的唾液酸转移酶，其中所述杂交的唾液酸转移酶包含
a.非来自利什曼虫(Leishmania)的唾液酸转移酶的催化域；和
b.负责在利什曼虫(Leishmania)的内质网或高尔基体区室中定位和保留的氨基酸序列。
96.根据权利要求95所述的杂交的唾液酸转移酶，其中所述利什曼虫(Leishmania)是蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)。
97.根据权利要求95或96所述的杂交的唾液酸转移酶，其中所述唾液酸转移酶已工程化以包含信号序列，其中所述信号序列将所述唾液酸转移酶靶向蜥蜴利什曼虫
(Leishmania tarentolae)宿主细胞的内质网，并且其中所述保留序列将所述唾液酸转移酶保留在内质网或高尔基体中。
98.根据权利要求97所述的杂交的唾液酸转移酶，其中所述保留序列将所述唾液酸转移酶保留在所述高尔基体反面膜囊中。
99.根据权利要求97或98所述的杂交的唾液酸转移酶，其中所述保留序列是CTS序列。
100.根据权利要求97或98所述的杂交的唾液酸转移酶，其中所述保留序列是GRIP序列。
101.根据权利要求97或98所述的杂交的唾液酸转移酶，其中所述保留序列是CTS序列和GRIP序列。
102.根据权利要求89至101中任一项所述的杂交的唾液酸转移酶，其中所述唾液酸转移酶的氨基酸序列来源于表9所列的唾液酸转移酶或其功能同源物、同工型或变体。
103.根据权利要求83、91、93、99或101中任一项所述的杂交体，其中所述CTS信号包含MAN1、NTPDase 1或者NTPDase 2CTS的氨基酸序列。
104.根据权利要求83、91、93、98或101中任一项所述的杂交体，其中所述CTS信号包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或者SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列。
105.根据权利要求83、91、93、99或101中任一项所述的杂交体，其中所述CTS信号包含MAN1 CTS的氨基酸序列。
106.根据权利要求83、91、93、99或101中任一项所述的杂交体，其中所述CTS信号包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列。
107.根据权利要求92、93、100或101中任一项所述的杂交体，其中所述GRIP信号包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列。
108.编码根据权利要求78至84中任一项所述的杂交的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的核酸。
109.编码根据权利要求85至94中任一项所述的杂交的半乳糖基转移酶的核酸。
110.编码根据权利要求95至102中任一项所述的杂交的唾液酸转移酶的核酸。
工程化且完全-功能定制的糖蛋白
1.相关申请的交叉引用
本发明申请主张2017年6月30日提交的美国临时专利申请No.62/527,466的优先权益，该专利申请的全部内容作为参考并入本文。
2.序列表
本发明申请包含以ASCII格式提交并且以其全部内容作为参考并入本文的序列表。
2018年6月28日创建的所述ASCII拷贝的名称为14197-005-228_ST25_FINAL.txt并且大小为1,065,529字节。
3.技术领域
本文描述了体外和体内产生糖基化蛋白的组合物和方法。所述方法包括使用宿主细胞来产生糖基化蛋白。本文还描述了使用这些方法产生的糖基化蛋白及其用途。
4.背景技术
蛋白糖基化是所有生命领域中普遍存在的翻译后修饰。在动物系统中存在巨大的复杂性，并且聚糖结构具有重要的生物和生理学作用，从在蛋白折叠和质量、控制中的贡献到在大量生物事件，如这些分子的识别、稳定性、作用和周转中的参与(Moremen等人,2012)。治疗性糖蛋白，如单克隆抗体、酶和激素是生物技术工业中的主要产品(Lagassé,H A Daniel等人,2017；Dimitrov 2012)并且聚糖不均一性的影响越来越被认为是“关键质量属性”。在决定产品质量的诸多性质中，糖基化甚至被认为是最重要的那些：影响蛋白的生物活性、血清半衰期和免疫原性中的一种。聚糖与血清循环时间增加有关，并且多种已批准或正在开发的生物制剂的半衰期不足，从而需要频繁应用才能在延长的时间段内维持治疗浓度。半衰期延长策略对于能够产生药物动力学改善的持久治疗剂是至关重要的
(Kontermann2016)。糖基化似乎还改善了蛋白的溶解度和稳定性，例如，通过降低聚集的倾向，并且由于对蛋白水解降解作用的保护，导致了循环寿命的提高。另外，可以通过导致它们降解的凝集素识别具有不同末端单糖的N-聚糖(Blasko等人,2013；Varki,2017)。因此，糖基化的监测和控制在生物制药生产中是重要的并且是管理机构要求的(Costa等人,
2014；Eon-Duval等人,2012；Reusch and Tejada 2015)。出于这些原因，在多个方面，表达平台的糖工程化日益被认为是改善生物制药的重要策略(Dicker and Strasser2015)。
大部分蛋白药物被所连接的聚糖结构糖基化，从而影响治疗蛋白的性质。一般地，聚糖的数目和组成对于蛋白折叠、溶解度和胞内运输起重要作用。聚糖可以保护蛋白主链以防止免疫原性反应并且不同的细胞识别事件取决于具体聚糖结构的存在。因此，糖基化对于糖蛋白的生物活性具有巨大影响并且在生产期间需要小心控制以实现治疗效力。基于产生宿主的物种、细胞类型和生理状态，重组糖蛋白的糖基化模式千差万别。一般说来，蛋白上聚糖的结构非常不同并且由通过不同的键组装的一组单糖组成。任一个糖基化位点处成熟的聚糖可以简单至单糖，或者复杂至大于200个糖的聚合物，且可能被磷酸酯、硫酸酯、乙酸酯或磷酰胆碱修饰(Stanley2011)。据估计需要约700种蛋白来产生全部多样的哺乳动物聚糖(估计≥7,000种结构)，它们仅由10种单糖组装获得：岩藻糖(Fuc)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、葡糖醛酸(GlcA)、艾杜糖醛酸(IdoA)、甘露糖(Man)、唾液酸(Sia)和木糖(Xyl)(Moremen等人,2012)。
抗体治疗剂
抗体(或免疫球蛋白，Ig)，并且具体地IgG抗体是过去数十年中开发的最成功的治疗剂中的一些(例如，贝伐单抗(bevacizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、英利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)或西妥昔单抗(cetuximab)等)。它们高度特异且具有长血清-半衰期，并且它们通常可以在哺乳动物细胞培养中表达，其已在过去30年中发展并改善。通过两条相同的多肽重链和两条相同的多肽轻链组装抗体分子的基本结构。通过二硫键连接这些链，从而形成了“Y”-形结构。由于它们的重链，人免疫球蛋白分为5类，IgG、IgA、IgD、IgE和IgM。IgG和IgA分别以4种(IgG1-4)和2种亚类(IgA1-2)存在。通过包括轻链和重链的可变区和一个恒定域的抗原-结合片段(Fab)介导特异性抗原识别。通过对应于重链恒定区的另外2个域(CH2和CH3)的结晶片段区(Fc)与效应因子蛋白，如Fc受体(FcRs)的结合起始效应因子功能(图1)。因此，Fab片段由轻链和重链的可变域和恒定域组成，而Fc片段完全由重链的恒定域组成。由于与新生儿Fc受体(FcRn)的pH-依赖性结合，该Fc域还延长了抗体的血清半衰期，这保护蛋白不会在内涵体中降解并使它们循环回到循环系统(Jefferis 2009)。
抗体工程法已用于进一步提高治疗抗体的临床成功，例如，通过改变它们与配体或Fc受体的结合性质，或者通过进一步延长它们的半衰期。典型的方法是引入突变或改变抗体的糖基化。在Fc链中引入突变具有固有的劣势：不再与天然序列一起作用。普遍认为治疗蛋白的糖基化将延长循环半衰期，但是对于抗体，以往糖基化对从循环中清除Ig的速率的影响的研究导致产生了混乱的结果，但是最近的观点表明Fc部分的聚糖结构差异的确影响清除(Millward等人,2008；Liu 2015,2017)。在抗体链的翻译后修饰期间，内质网和高尔基体中的酶可以将碳水化合物链连接至抗体的多肽主链。单个N-连接的聚糖在位置297处的天门冬酰胺处存在于所有IgG亚类的Fc部分中。约20％的IgG抗体在所述分子的其它处含有聚糖。大部分重组抗体药物已工程化或选择以仅包含单个Fc糖基化位点。
当抗体链正确折叠和结合时，位置297处的低聚糖隔离在由CH2域所封闭的内部空间内，并且在低聚糖和抗体的氨基酸之间存在剧烈的非共价相互作用，从而导致了对构象的影响。保守Asn-297位点处存在的低聚糖通常属于岩藻糖基化的双触角复合物
(biantennary complex)类型。然而，在抗体分子中，由于不同的分枝、链长和/或不同的碳水化合物部分的数目，碳水化合物结构(糖形)显著不均一。的确，基于加工程度，所连接的N-连接的低聚糖的结构显著不同，并且所述结构可以包括高-甘露糖以及具有或不具有等分GlcNAc和核心岩藻糖残基的复杂双触角低聚糖(Wright and Morrison,1997)。通常，在给定糖基化位点连接的核心低聚糖结构存在不均一加工，从而即使单克隆抗体也会作为多种糖形存在。重要地，在抗体-产生细胞系之间发生了抗体糖基化中的主要差异，并且还对于在不同培养条件下生长的给定细胞系观察到了差异。的确，哺乳动物N-聚糖生物合成中的每个步骤是<100％有效的并且一些酶竞争底物，从而导致产生了不同的糖形。认识到不均一的糖基化，从而导致了治疗蛋白生产中的问题。例如，聚糖可以影响药物动力学和生物活性(Ferrara等人,2011；Elliott等人,2003；Krapp等人,2003)。由于N-聚糖通常对于蛋白折叠是至关重要的，这些困难不可以简单地通过完全除去N-糖基化位点或在内质网之前或在内质网中干扰糖基化来克服。然而，抗体不需要N-聚糖来正确折叠(Feige等人,2010)，但是糖形的差异导致了不同或不一致的效应因子功能，这可以使所述抗体难以治疗性使用或根据法规要求使用。Fc部分在N-297处的去糖基化可以导致含Fc分子的效应因子功能的消除或者稳定性降低。重要地，非在人中合成的糖形可以是变应原性的、免疫原性的并且加快了通过可以由于反复治疗剂量施用所产生的抗药物抗体对所连接的抗体的胞质清除。
通过Fc域中的变化来改善抗体效力、降低治疗剂量和提高整体临床性能是工程化抗体开发中的下一个挑战。对所述分子的效应因子功能，如抗体-依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体-依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和整体半衰期的影响是改善抗体治疗剂性质的主要目标(图1)(Jennewein and Alter 2017)。预期整体市场积极增长，其在2016至2026年之间的健康年增长率为接近40％。
基于它们所识别的抗体类型，将Fc受体(FcR)分为不同的类型：Fcγ受体(FcγR；结合至IgG)、Fcα受体(FcαR；结合至IgA)、Fcε受体(FcεR；结合至IgE)和新生儿Fc受体(FcRn)。其中，最重要的是“Fcγ”受体。Fcγ受体负责激活受调理微生物的吞噬作用。由于不同的分子结构，基于它们对抗体的亲合力，将Fcγ受体进一步分成不同的种类。这些中的一些包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。FcγRIII(CD16)存在于大多数自然杀伤(NK)细胞、粒性白细胞、单核细胞、巨噬细胞上和T细胞亚型上。编码该受体的基因是FcγRIIIa或者FcγRIIIb。FcγRIIIa是负责NK细胞介导的ADCC的Fc受体。Fcα受体包括两种胞外Ig样域，并且仅具有一个亚组，FcαRI(CD89)。这些构成了多链免疫识别受体(MIRR)和Ig超家族两者的一部分。Fcε受体具有两种类型。所述受体之一是FcεRII(CD23)，它是低亲合力受体，C-型凝集素，而其它的是FcεRI，它是高亲合力受体，Ig超家族中的一类。新生儿受体(FcRn)已知在防止抗体溶酶体降解中起作用，从而提高了治疗抗体的半衰期。酸性内涵体中的FcRn结合至通过转胞吞作用内化的IgG。IgG再循环至细胞表面并在血液pH释放，并防止溶酶体降解。尽管无糖基化对效应因子功能具有重要影响，但是据信IgG-Fc与FcRn的相互作用与Fc糖基化无关。
聚糖决定了马蹄形Fc-片段的“打开”，并且Fc聚糖的截短导致了“封闭”构象。“打开的”IgG-Fc结构对于与FcγRIII的相互作用是最有利的构象，其是对于完全半乳糖基化、但岩藻糖基化的IgG-Fc所观察到的(Krapp等人,2003)。对于FcγRIII和缺少核心岩藻糖的抗体之间的高亲合力结合需要独特的碳水化合物-碳水化合物相互作用。然而，由于“岩藻糖抵触(fucoseclash)”，核心岩藻糖基化防止高亲合力FcγRIII结合。低聚糖部分中的岩藻糖残基已显示空间阻碍治疗抗体与FcγRIIIa的结合(激活Fc受体)(图2A)。去岩藻糖基化在提高Fc受体功能ADCC中起到重要作用。重要地，(Chung等人,2012)显示岩藻糖基化％和ADCC之间存在线性关系。这造成了无核心岩藻糖残基的均一聚糖的优良性质的情况。在过表达GnT-III的细胞系中产生无岩藻糖基化的抗体，其将等分GlcNAc添加至核心β-Man，这是抑制α1,6核心岩藻糖基转移酶并导致岩藻糖基化减少的结构。这种减小导致产生了约
50％无岩藻糖基化的结构，其还通过糖谱 得到确认(图42)。
为了解释先前的数据，(Li等人,2017；Chen等人,2017)的新的研究使用了化学酶法来产生均一的聚糖并且显示高度保留了FcR亲合力，即使使用2,6延伸的双触角唾液酸，其转化为改善的效应因子功能，如ADCC。该数据基于具有和不具有α1,6连接的核心岩藻糖的结构限定且均一的聚糖，其提高了对于FcR结合以及相关下游影响的理解(Li等人,2017；
Sondermann等人,2013)(图2B)。此外，N-聚糖双触角末端的α2,3连接的唾液酸不会导致FcγR亲合力提高，并因此可以认为它通过激活途径上Fc受体功能的缺失而起到抑制性聚糖的作用。由于末端上的唾液酸，因此解释了抗体对于抗-炎的唾液酸相关作用以及循环半衰期的增加。获得性质改善，如更长的循环半衰期和免疫耐受性(例如，避免抗潜在免疫原性治疗mAb的抗药物抗体)，但无缺点，如不均一的糖基化或者抗原结合降低的抗体和含Fc分子将是有利的。此外，功能-定制的N-聚糖将提高分子的靶标下游效应因子功能。
真核细胞内质网(ER)和高尔基体区室中的糖基化过程产生了大部分基于重组糖蛋白的不均一的聚糖结构。由于疗法中所认识到的重要性，近年来已做了大量工作来克服聚糖不均一性和建立用于均一治疗性糖蛋白的有效生产的体内和体外糖工程技术。尽管获得了在几种表达宿主中改变糖基化途径来产生人源化聚糖的进展，但是它可以伴随着健康性、产量或甚至存活力的丧失。重要地，目前尚未报道产生限定的均一N-聚糖的体内系统。
因此，用于产生具有这种限定的均一性且甚至功能-定制的糖基化的这类重组治疗性蛋白的表达技术代表了新的一类具有提高的生物活性和改善的性质的安全且创新的下一代药物。
N-糖基化途径
最突出且表征最好的蛋白糖基化形式是聚糖与新合成的蛋白上天门冬酰胺侧链中酰胺的键合(N-糖基化作用)。通过在脂质载体上组装的保守低聚糖前体(Glc3Man9GlcNAc2)向新生多肽链上暴露的Asn-X-Ser/Thr(其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸)共有序列的转移，在内质网(ER)的腔中起始蛋白的N-糖基化作用。通过杂聚低聚糖转移酶(OST)复合物催化该初始聚糖转移反应，并且该反应应在ER中蛋白折叠之前(Aebi 2013)。在低聚糖转移之后立即通过葡萄糖苷酶I和II切掉两个末端葡萄糖残基，并且具有单葡糖基化聚糖结构(Glc1Man9GlcNAc2)的所得多肽可以与ER-驻留膜-结合凝集素钙联接蛋白或者其可溶性同源钙网蛋白相互作用。这些凝集素支持聚糖-依赖性蛋白质量控制周期中的蛋白折叠。从钙联接蛋白/钙网蛋白循环中释放已获得它们天然构象的分泌性糖蛋白并且所述糖蛋白离开ER至高尔基体。在高尔基体中，对成熟折叠的糖蛋白上的ER-来源的寡甘露糖N-聚糖进行进一步的N-聚糖延伸，其产生了高度多样的复杂的N-聚糖(Stanley 2011)。
昆虫、酵母和植物产生N-聚糖，其与哺乳动物细胞所产生的那些显著不同。内质网中初始Glc2Man9GlcNAc2低聚糖向Man8GlcNAc2的加工显示了在从酵母至哺乳动物的这些物种中显著的相似性，然而在高尔基体中发生了非常不同的加工事件。例如，酵母可以将50或甚至更多个Man残基添加至Man8-9GlcNAc2，然而昆虫细胞通常除去大部分或全部的Man残基以产生寡甘露糖(paucimannosidic)Man3-1GlcNAc2 N-聚糖。植物细胞也除去Man残基以获得Man4-5GlcNAc2，偶尔有复合的GlcNAc或Gal修饰，但是通常添加潜在免疫原性的β1,2-连接的木糖(Xyl)，并且与昆虫细胞一起添加核心α1,3-连接的岩藻糖(Fuc)残基。
动物糖蛋白的N-聚糖通常包括半乳糖、岩藻糖和末端唾液酸。这些糖不存在于酵母和丝状真菌中所产生的糖蛋白上。在人及其它非人真核细胞中，在胞液中合成了全部种类的糖核苷酸前体(例如，UDP-N-乙酰葡萄糖胺、UDP-N-乙酰半乳糖胺、CMP-N-乙酰神经氨酸、UDP-半乳糖、GDP-岩藻糖等)并转运至高尔基体中，在此它们通过糖基转移酶(“Gnt”)连接至核心低聚糖。
糖工程方法
已进行了遗传和代谢工程工作来修饰昆虫、酵母和植物N-聚糖加工途径，并且在昆虫细胞、酵母和植物中获得了唾液酸化的复合物-型N-聚糖，这表明细胞系可以工程化以产生具有潜在治疗价值的哺乳动物-样糖蛋白(Geisler等人,2015a；Strasser 2016；Hamilton等人,2006；Jacobs等人,2009)。测试了其它异源宿主，如苔藓、水草、藻类和蚕的有益糖基化作用，但是这些系统远非最优的(Calow等人,2016；Cox等人,2006；Tada等人,2015)。到目前为止，尚没有预测低等真核生物中特定异源表达的糖基转移酶是否充分翻译，是否具有催化活性或者是否位于分泌途径内的正确细胞器内的可靠方法。此外，糖基化途径中的改变可以改变细胞存活力和/或糖蛋白的位点占据，从而导致产量或产品质量降低。
唾液酸(Sia)是一组N-或O-取代的N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)衍生物，它在从海星到人的后口动物谱系动物中普遍存在。还在一些其它生物，包括某些细菌、原生动物和真菌中鉴别了这些化合物。病原菌和哺乳动物细胞中的唾液酸生物合成是良好理解的。尽管致病生物表面上的唾液酸主要被认为是逃避宿主免疫系统的方式，但是这些相同的唾液酸分子还参与了高等生物中的多个过程，包括蛋白靶向、细胞-细胞相互作用、细胞-底物识别和粘附(Varki 2017；Vimr等人,2004；Schauer 2000)。唾液酸的存在影响糖蛋白的体内半衰期。例如，已在人促红细胞生成素(hEPO)的研究中证明了唾液酸的重要性。该糖蛋白的N-连接的聚糖上的末端唾液酸残基防止hEPO从血液中快速清除，并改善了体内活性。末端为半乳糖残基的无唾液酸化-hEPO(asialo-hEPO)显著降低了体内红细胞生成活性。这种降低是由于通过肝去唾液酸糖蛋白受体对asialo-hEPO的清除增加所造成的(Fukuda等人,1989)。同样地，多种治疗性糖蛋白上的末端唾液酸的不存在可以降低体内效力，并因此需要更频繁的患者剂量施用方案。
一般说来，预期产生哺乳动物和完全人源化的N-聚糖的能力将改变生物技术产业，因为一组新的生物将出现以产生对人体健康有价值的治疗剂。本发明描述了对动质体蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)种中天然和新型N-糖基化途径的分析，从而发现了与保守途径的相关差异以及用于糖工程的开发。将在几个实施例中提供糖工程方法。
由于基于简单的人寡甘露糖的工程化聚糖构建，这种动质体糖工程表达平台导致产生了限定且完全-定制的N-聚糖，以及更廉价、更安全且更一致的具有高度均一的人源化糖基化的治疗剂的生产，显著发展了糖工程化领域。具体且意外独特的N-聚糖生物合成是新颖的并且目前从未描述，其有别于任何其它生物，如毕赤氏酵母(Pichia)或其它真核生物的糖工程方法。此外，与哺乳动物细胞相比，重组株更短的开发时间线以及更快的产生显著增强了该简单，但完全功能-可定制的表达平台对于治疗性蛋白的广泛应用。
5.发明内容
本文描述了包含异源糖基转移酶的单细胞动质体真核宿主细胞，所述异源糖基转移酶包括N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶和唾液酸转移酶。本文所述的宿主细胞能够产生哺乳动物(例如，人)治疗性糖蛋白，其包含均一且功能完全的定制的具有高位点占据的N-聚糖。本文所提供的宿主细胞可以用于表达全长治疗性抗体(例如，抗-CD20(利妥昔单抗))及其它治疗性蛋白(例如，促红细胞生成素)。
本文还提供了核酸和组合文库，其可以用于成功靶向和表达动质体真核宿主细胞中的胞内区室中的哺乳动物酶促活性(如，参与N-乙酰葡萄糖胺延伸、半乳糖苷化和唾液酸化的那些)。该方法提供了工程化宿主细胞，其可以用于表达和靶向参与糖基化的任何所期望的基因。还提供了用于产生唾液酸化糖蛋白的CMP-唾液酸生物合成途径的设计。
在具体的实施方式中，本文提供了利什曼虫(Leishmania)宿主细胞，其包含(a)编码靶标蛋白的重组核酸；和(b)编码异源糖基转移酶的重组核酸。
在某些实施方式中，所述异源糖基转移酶是N-乙酰氨基葡萄糖转移酶；和/或异源半乳糖基转移酶；和/或异源唾液酸转移酶。在一些实施方式中，本文提供了包含两种或更多种N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的宿主细胞。在其它实施方式中，包含异源唾液酸转移酶的宿主细胞还包含能够产生CMP-NeuAc的异源CMP-Sia生物合成途径蛋白。
在另一个实施方式中，本文提供了宿主细胞，其中来自所述N-聚糖生物合成途径的一种或多种内源酶已缺失、突变和/或功能性失活。
在其它实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶和/或唾液酸转移酶的氨基酸序列来源于表9所列的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶或者唾液酸转移酶或其任何功能同源物、同工型或变体。
在其它实施方式中，所述能够产生CMP-NeuAc的CMP-Sia生物合成途径蛋白与表11所列的CMP-Sia生物合成途径蛋白至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、
79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一或其任何功能同源物、同工型或变体。
在另一个实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是GnT-I。在另一个实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是GnT-II。在另一个实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是GnT-I和GnT-II。在另一个实施方式中，所述半乳糖基转移酶是B4GALT1。在某些实施方式中，本文提供了宿主细胞，其中所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是GnT-I和GnT-II，所述半乳糖基转移酶是B4GALT1。在另一个实施方式中，所述唾液酸转移酶是2,6-SiaT或者2,3-SiaT。在某些实施方式中，本文提供了宿主细胞，其中所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是GnT-I和GnT-II，所述半乳糖基转移酶是B4GALT1，并且所述唾液酸转移酶是2,6-SiaT或者2,3-SiaT。在具体的实施方式中，本文提供了宿主细胞，其中所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是GnT-I和GnT-II，所述半乳糖基转移酶是B4GALT1，所述唾液酸转移酶是2,6-SiaT或者2,3-SiaT，并且其中所述唾液酸转移酶还包含能够产生CMP-NeuAc的异源CMP-Sia生物合成途径蛋白。
在某些实施方式中，所述宿主细胞是蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)细胞。在其它实施方式中，所述宿主细胞是表13中所列的任何株。
在某些实施方式中，所述宿主细胞包含如图53所示的具有原核或真核酶的CMP-Neu5Ac途径。
在其它实施方式中，将利什曼虫(Leishmania)信号和/或保留序列加入至N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶和/或唾液酸转移酶，其中所述信号序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶和/或唾液酸转移酶靶向利什曼虫(Leishmania)宿主细胞的内质网，并且其中所述保留序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶和/或唾液酸转移酶保留在内质网或高尔基体中。在另一个实施方式中，所述保留序列将N-乙酰氨基葡萄糖转移酶和/或半乳糖基转移酶保留在宿主细胞的内质网中。在另一个实施方式中，所述保留序列将N-乙酰氨基葡萄糖转移酶和/或半乳糖基转移酶保留在宿主细胞的高尔基体区室的顺面膜囊中。在另一个实施方式中，所述保留序列将N-乙酰氨基葡萄糖转移酶和/或半乳糖基转移酶保留在宿主细胞的高尔基体区室的中间膜囊中。在另一个实施方式中，所述保留序列将半乳糖基转移酶保留在宿主细胞的高尔基体区室的反面膜囊中。在另一个实施方式中，所述保留序列将唾液酸转移酶保留在宿主细胞的高尔基体区室的反面膜囊中。在另一个实施方式中，所述保留序列将唾液酸转移酶和半乳糖基转移酶保留在宿主细胞的高尔基体区室的反面膜囊中。
在另一个实施方式中，本文提供了宿主细胞，其中来自所述N-聚糖生物合成途径的一种或多种内源酶已缺失、突变和/或功能性失活。
在另一个实施方式中，所述信号序列和/或保留序列是来源于任何利什曼虫
(Leishmania)的种的信号序列或保留序列。在其它实施方式中，所述信号序列和/或保留序列是来源于蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)的信号序列或保留序列。
在另一个实施方式中，加工并除去所述信号序列。
在其它实施方式中，所述保留序列是来源于蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)蛋白的胞质-跨膜-干(cytoplasmic-transmembrane-stem，CTS)序列。在另一个实施方式中，CTS序列来源于蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)MAN1、NTPDase 1或NTPDase 2。
在另一个实施方式中，CTS序列包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26所示的序列或其功能活性片段。在另一个实施方式中，所述CTS序列包含与SEQ ID NO：24所示的序列至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％同一的序列或其功能活性片段；与SEQ ID NO：25所示的序列至少约70％、
71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的序列或其功能活性片段；或者与SEQ ID NO：26所示的序列至少约70％、71％、72％、
73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的序列或其功能活性片段。
在另一个实施方式中，所述CTS来源于蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)MAN1。
在另一个实施方式中，所述CTS序列包含SEQ ID NO：24所示的序列或其功能活性片段。在其它实施方式中，所述保留序列包含来源于利什曼虫(Leishmania)的GRIP序列或其功能活性片段。在另一个实施方式中，所述GRIP序列包含SEQ ID NO：27的序列或其功能活性片段。在另一个实施方式中，所述GRIP序列包含与SEQ ID NO：27所示的序列具有至少约70％、71％、
72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的序列或其功能活性片段。在其它实施方式中，所述保留序列包含来源于利什曼虫(Leishmania)蛋白的CTS序列或其功能活性片段，和来源于利什曼虫(Leishmania)的GRIP序列或其功能活性片段。
在其它实施方式中，所述靶标蛋白对于利什曼虫(Leishmania)宿主细胞是异源的。
在另一个实施方式中，所述靶标蛋白已工程化以包含来自利什曼虫(Leishmania)的信号序列。在其它实施方式中，所述信号序列是来自蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)的信号序列。在一些实施方式中，所述信号序列包含SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29所示的序列或其功能活性片段。在具体的实施方式中，所述信号序列包含SEQ ID NO：28所示的序列或其功能活性片段。在另一个实施方式中，所述信号序列包含与SEQ ID NO：28所示的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％的同一性的序列或其功能活性片段。在其它实施方式中，加工所述信号序列并将其从所述靶标蛋白中除去。
在其它实施方式中，所述靶标蛋白包含以下的氨基酸序列：人干扰素-α(INF-α)、干扰素-β(INF-β)、干扰素-γ(INF-γ)、白介素-2(IL2)、嵌合白喉毒素-IL-2(Denileukin diftitox)、白介素-1(IL1)、IL1B、IL3、IL4、IL11、IL21、IL22、IL1受体拮抗剂(阿那白滞素(anakinra))、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、胰岛素、普兰林肽(Pramlintide)、生长激素(GH)、胰岛素样生长因子(IGF1)、人甲状旁腺激素、降钙素、高血糖素-样肽-1激动剂(GLP-1)、高血糖素、生长激素-释放激素(GHRH)、胰泌素、促甲状腺激素(TSH)、人骨形态发生蛋白2(hBMP2)、人骨形态发生蛋白7(hBMP7)、促性腺激素释放激素(GnRH)、角化细胞生长因子(KGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)、成纤维细胞生长因子20(FGF20)、成纤维细胞生长因子21(FGF21)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、神经营养蛋白-3、人促生育素(FSH)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、促黄体素-α、促红细胞生成素、粒性白细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、CTLA4的胞外域(例如，FC-融合蛋白)或者TNF受体的胞外域(例如，FC-融合蛋白)。
在其它实施方式中，所述靶标蛋白是治疗性蛋白。在其它实施方式中，所述靶标蛋白为Fc-融合蛋白。在其它实施方式中，所述靶标蛋白为抗体。
在另一个实施方式中，所述靶标蛋白是抗人蛋白抗体。在其它实施方式中，所述抗体具有以下的氨基酸序列：阿达木单抗(adalimumab)(Humira)；类克(Remicade)(英利昔单抗(Infliximab))；ReoPro(阿昔单抗(Abciximab))；美罗华(Rituxan)(利妥昔单抗
(Rituximab))；舒莱(Simulect)(巴利昔单抗(Basiliximab))；Synagis(帕利珠单抗(Palivizumab))；赫塞汀(Herceptin)(曲妥珠单抗(Trastuzumab))；麦罗塔(Mylotarg)(吉妥珠单抗奥唑米星(Gemtuzumab ozogamicin))；Campath(阿仑珠单抗(Alemtuzumab))；
Zevalin(替伊莫单抗替坦(Ibritumomab tiuxetan))；索雷尔(Xolair)(奥马珠单抗(Omalizumab))；百克沙(Bexxar)(托西莫单抗-I-131(Tositumomab-I-131))；爱必妥(Erbitux)(西妥昔单抗(Cetuximab))；安维汀(Avastin)(贝伐单抗(Bevacizumab))；
Tysabri(那他珠单抗(Natalizumab))；Actemra(托珠单抗(Tocilizumab))；维克替比(Vectibix)(帕尼单抗(Panitumumab))；Lucentis(兰尼单抗(Ranibizumab))；Soliris(依库珠单抗(Eculizumab))；Cimzia(聚乙二醇结合赛妥珠单抗(Certolizumab pegol))；
Simponi(戈利木单抗(Golimumab))；Ilaris(卡那津单抗(Canakinumab))；Stelara(优特克单抗(Ustekinumab))；Arzerra(奥法木单抗(Ofatumumab))；Prolia(地诺单抗
(Denosumab))；Numax(莫维珠单抗(Motavizumab))；ABThrax(瑞西巴库单抗
(Raxibacumab))；Benlysta(贝利木单抗(Belimumab))；Yervoy(普利木单抗
(Ipilimumab))；Adcetris(本妥昔单抗(Brentuximab Vedotin))；Perjeta(帕妥珠单抗(Pertuzumab))；Kadcyla(曲妥珠单抗-美坦新偶联物(Ado-trastuzumab emtansine))；或者Gazyva(奥比妥珠单抗(Obinutuzumab))的氨基酸序列。
在其它实施方式中，所述抗体为全长抗体、Fab、F(ab')2、scFv或者sdAb。在其它实施方式中，所述靶标蛋白包含酶或其抑制剂的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述靶标蛋白包含以下的氨基酸序列：凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XIII、凝血因子VIIa、抗凝血酶III(AT-III)、蛋白C、组织纤维蛋白溶酶原活化因子(tPA)和tPA变体、尿激酶、水蛭素、链激酶、葡糖脑苷脂酶、阿葡糖苷酶-α、拉罗尼酶(α-L-艾杜糖醛酸酶)、艾杜硫酶(艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)、加硫酯酶、半乳糖苷酶-β(人α-半乳糖苷酶A)、肉毒毒素、胶原酶、人脱氧核糖核酸酶-I、玻璃酸酶、木瓜蛋白酶、天冬酰胺酶、尿酸酶(尿酸氧化酶)、谷氨酸羧肽酶(谷卡匹酶)、α1蛋白酶抑制剂(α1抗胰蛋白酶)、乳糖酶、胰酶(脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶)和腺苷脱氨酶。
在另一个实施方式中，所述治疗性蛋白包含以下的氨基酸序列：阿巴西普(Abatacept)(例如，奥瑞希纳(Orencia))、阿柏西普(Aflibercept)(例如，艾力亚(Eylea))、β半乳糖苷酶(Agalsidase beta)(例如，Fabrazyme)、阿必鲁泰(Albiglutide)(例如，Eperzan)、阿地白介素(Aldesleukin)(例如，Proleukin)、阿法西普(Alefacept)(例如，阿密凡夫(Amevive))、阿糖脑苷酶(Alglucerase)(例如，Ceredase)、α阿葡糖苷酶
(Alglucosidasealfa)(例如，LUMIZYME)、阿利吉仑(Aliskiren)(例如，泰克特纳(Tektuma))、α-1-蛋白酶抑制因子(例如，Aralast)、阿替普酶(Alteplase)(例如，Activase)、阿那白滞素(Anakinra)(例如，Kineret)、阿尼普酶(Anistreplase)(例如，Eminase)、人炭疽免疫球蛋白(例如，ANTHRASIL)、抗血友病因子(例如，百因止(Advate))、抗抑制剂混凝剂复合物(例如，Feiba Nf)、抗凝血酶α、人抗凝血酶III、抗胸腺细胞球蛋白(例如，抗胸腺细胞球蛋白)、抗-胸腺细胞球蛋白(马)(例如，ATGAM)、抗-胸腺细胞球蛋白(兔)(例如，ATG-Fresenius)、抑肽酶(Aprotinin)(例如，特斯乐(Trasylol))、Asfotaseα、门冬酰胺酶(例如，爱施巴(Elspar))、菊疫病欧文氏菌(erwinia chrysanthemi)门冬酰胺酶(例如，Erwinaze)、贝卡普勒明(Becaplermin)(例如，REGRANEX)、贝拉西普(belatacept)(例如，Nulojix)、贝拉克坦(Beractant)、比伐卢定(Bivalirudin)(例如，Angiomax)、A型肉毒毒素(Botulinum Toxin)(例如，保妥适 )、B型肉毒毒素(例如，Myobloc)、本
妥昔单抗(Brentuximab vedotin)(例如，Adcetris)、布舍瑞林(Buserelin)(例如，Suprecur)、C1酯酶抑制剂(人)、C1酯酶抑制剂(重组)(例如，Ruconest)、聚乙二醇结合赛妥珠单抗(Certolizumab pegol)(例如，Cimzia)、绒促性素α(例如，绒促性素α)、绒毛膜促性腺激素(人)(例如，艾泽(Ovidrel))、绒毛膜促性腺激素(重组)(例如，Ovitrelle)、凝血因子ix(例如，Alprolix)、凝血因子VIIa(例如，诺其(NovoSeven))、人凝血因子X(例如，Coagadex)、凝血因子XIII A-亚基(重组)、胶原酶(例如，Cordase)、Conestatα、促肾上腺皮质激素(例如，H.P.Acthar)、替可克肽(Cosyntropin)(例如，Cortrosyn)、达贝泊汀(Darbepoetin)α(例如，安然爱斯普(Aranesp))、去纤苷(Defibrotide)(例如，Noravid)、地尼白介素-毒素连接物(Denileukin diftitox)(例如，Ontak)、地西卢定(Desirudin)、地高辛(Digoxin)免疫Fab(羊)(例如，DIGIBIND)、阿法链道酶(Domase alfa)(例如，百慕时(Pulmozyme))、屈曲可近(Drotrecogin)α(例如，Xigris)、度拉糖肽(Dulaglutide)、艾莫凝血素(Efmoroctocog)α(例如，ELOCTA)、依洛硫酸酯酶(Elosulfase)α、恩夫韦地(Enfuvirtide)(例如，FUZEON)、阿法依伯汀(Epoetin alfa)(例如，Binocrit)、依泊汀(Epoetin)zeta(例如，Retacrit)、依替巴肽(Eptifibatide)(例如，INTEGRILIN)、依那西普(Etanercept)(例如，恩利(Enbrel))、艾塞那肽(Exenatide)(例如，百泌达(Byetta))、因子IX复合物(人)(例如，AlphaNine)、纤溶酶(Fibrinolysin)，也称为胞浆素(例如，Elase)、非格司亭(Filgrastim)(例如，N.A.)、非格司亭-sndz、促卵泡素(Follitropin)α(例如，Gonal-F)、促卵泡素(Follitropin)β(例如，Follistim AQ)、加硫酶(Galsulfase)(例如，Naglazyme)、胃内因子、吉妥珠单抗奥唑米星(例如，麦罗塔)、醋酸格拉替雷(Glatiramer)(例如，克帕松(Copaxone))、重组高血糖素(例如，诺和生(GlucaGen))、谷卡匹酶(Glucarpidase)(例如，Voraxaze)、短杆菌肽(Gramicidin)D(例如，新斯波林
(Neosporin))、乙型肝炎免疫球蛋白、人降钙素、人破伤风梭菌(clostridium tetani)类毒素免疫球蛋白、人狂犬病病毒免疫球蛋白(例如，Hyperab Rabies人免疫球蛋白)、人Rho(D)免疫球蛋白(例如，Hyp Rho D Inj 16.5％)、人血清白蛋白(例如，亚玛(Albuminar))、人水痘-带状疱疹免疫球蛋白(例如，Varizig)、玻璃酸酶(例如，HYLENEX)、玻璃酸酶(人重组)、替伊莫单抗替坦(Ibritumomab tiuxetan)(例如，泽瓦林(Zevalin))、艾杜硫酶
(Idursulfase)(例如，Elaprase)、伊米苷酶(Imiglucerase)(例如，思而赞(Cerezyme))、人免疫球蛋白、门冬胰岛素(Insullin aspart)(例如，NovoLog)、牛胰岛素、德谷胰岛素(Insulin Degludec)(例如，诺和达(Tresiba))、地特胰岛素(Insulin detemir)(例如，诺和平(LEVEMIR))、甘精胰岛素(Insulin Glargine)(例如，来得时(Lantus))、赖谷胰岛素(Insulin glulisine)(例如，艾倍得(APIDRA))、赖脯胰岛素(Insulin Lispro)(例如，优泌乐(Humalog))、猪胰岛素(例如，Iletin II)、普通胰岛素(例如，常规优泌林(Humulin R))、猪胰岛素(例如，vetsulin)、低精蛋白胰岛素(Insulin,isophane)(例如，诺和灵N(Novolin N))、重组干扰素α-2a(例如，罗扰素(Roferon)A)、干扰素α-2b(例如，INTRON A)、干扰素αcon-1(例如，干复津(INFERGEN))、干扰素α-n1(例如，Wellferon)、干扰素α-n3(例如，Alferon)、干扰素β-1a(例如，Avonex)、干扰素β-1b(例如，贝他费隆(Betaseron))、干扰素gamma-1b(例如，Actimmune)、静脉内免疫球蛋白(例如，Civacir)、拉罗尼酶(Laronidase)(例如，Aldurazyme)、来格司亭(Lenograstim)(例如，格拉诺赛特(Granocyte))、来匹卢定(Lepirudin)(例如，Refludan)、亮脯利特(Leuprolide)(例如，Eligard)、利拉鲁肽(Liraglutide)(例如，Saxenda)、芦西纳坦(Lucinactant)(例如，Surfaxin)、促黄体素(Lutropin)α(例如，乐芮(Luveris))、美卡舍明(Mecasermin)(例如，N.A.)、尿促性素(Menotropins)(例如，贺美奇(Menopur))、甲氧基聚乙二醇-倍他依泊汀(例如，美信罗(Mircera))、美曲普汀(Metreleptin)(例如，Myalept)、天然α干扰素或multiferon(例如，Intron/罗扰素(Roferon)-A)、奈西立肽(Nesiritide)(例如，NATRECOR)、奥克纤溶酶(Ocriplasmin)(例如，Jetrea)、奥普瑞白介素(Oprelvekin)(例如，Neumega)、OspA脂蛋白(例如，Lymerix)、缩宫素(Oxytocin)(例如，催产素(Pitocin))、帕利夫明(Palifermin)(例如，Kepivance)、胰脂肪酶(例如，Pancrecarb)、牛培加酶(Pegademase)(例如，Adagen)、培门冬酶(Pegaspargase)(例如，Oncaspar)、聚乙二醇化非格司亭(Pegfilgrastim)(例如，Neulasta)、PEG干扰素(Peginterferon)α-2a(例如，派罗欣(Pegasys))、PEG干扰素α-2b(例如，PEG-Intron)、PEG干扰素β-1a(例如，Plegridy)、聚乙二醇尿酸酶(Pegloticase)(例如，(Krystexxa))、培维索孟(Pegvisomant)(例如，SOMAVERT)、猪肺磷脂(Poractant)α(例如，固尔苏(Curosurf))、普兰林肽(Pramlintide)(例如，Symlin)、Preotact(例如， )、硫酸鱼精蛋白(Protamine sulfate)(例如，硫酸鱼精蛋白注射剂、USP)、人蛋白S(例如，人蛋白S)、凝血酶原(Prothrombin)(例如，Feiba Nf)、凝血酶原复合物(例如，Cofact)、凝血酶原复合浓缩物(例如，Kcentra)、拉布立酶(Rasburicase)(例如，Elitek)、瑞替普酶(Reteplase)(例如，Retavase)、利纳西普(Rilonacept)(例如，Arcalyst)、罗米司亭(Romiplostim)(例如，Nplate)、沙可劳塞酶(Sacrosidase)(例如，Sucraid)、鲑降钙素(例如，Calcimar)、沙格司亭(Sargramostim)(例如，生白能(Leucomax))、沙妥莫单抗喷地肽(Satumomab Pendetide)(例如，OncoScint)、溶酶体酸性脂肪酶α(例如，Kanuma)、胰泌素(例如，SecreFlo)、舍莫瑞林(Sermorelin)(例如，乙酸舍莫瑞林)、血清白蛋白(例如，Albunex)、碘化血清白蛋白(例如，Megatope)、西莫托考(Simoctocog)α(例如，Nuwiq)、Sipuleucel-T(例如，普列威(Provenge))、重组生长激素(例如，NutropinAQ)、重组生长激素(例如，BioTropin)、链激酶(例如，Streptase)、Susoctocogα(例如，Obizur)、阿法他利苷酶(Taliglucerase alfa)(例如，Elelyso)、替度鲁肽(Teduglutide)(例如，Gattex)、替奈普酶(Tenecteplase)(例如，TNKase)、特立帕肽(Teriparatide)(例如，Forteo)、替莫瑞林(Tesamorelin)(例如，Egrifta)、凝血调节蛋白α(例如，Recomodulin)、胸腺法新(Thymalfasin)(例如，日达仙(Zadaxin))、甲状球蛋白、促甲状腺素α(例如，Thyrogen)、结核菌素纯化蛋白衍生物(例如，Aplisol)、Turoctocogα(例如，Zonovate)、尿促卵泡素(例如，BRAVELLE)、尿激酶(例如，Kinlytic)、加压素(例如，皮特雷辛(Pitressin))、维拉苷酶(Velaglucerase)α(例如，Vpriv)、阿昔单抗(Abciximab)(例如，ReoPro)、阿达木单抗(Adalimumab)(例如，修美乐(Humira))、阿仑珠单抗(Alemtuzumab)(例如，CAMPATH)、阿利库单抗(Alirocumab)(例如，Praluent)、阿西莫单抗(Arcitumomab)(例如，CEA-Scan)、阿特珠单抗(Atezolizumab)(例如，特善奇(Tecentriq))、巴利昔单抗(Basiliximab)(例如，舒莱(Simulect))、贝利木单抗(Belimumab)(例如，Benlysta)、贝伐单抗(Bevacizumab)(例如，安维汀(Avastin))、博纳吐单抗(Blinatumomab)(例如，Blincyto)、布罗达单抗(Brodalumab)(例如，Siliq)、卡那津单抗(Canakinumab)(例如，ILARISE)、卡那津单抗(Canakinumab)(例如，Ilaris)、卡罗单抗(Capromab)(例如，ProstaScint)、西妥昔单抗(Cetuximab)(例如，爱必妥(Erbitux))、达昔单抗(daclizumab)(例如，赛尼哌(Zenapax))、达雷木单抗(Daratumumab)(例如，DARZALEX)、地诺单抗(Denosumab)(例如，Xgeva)、达妥昔单抗(Dinutuximab)(例如，unituxin)、依库珠单抗(Eculizumab)(例如，Soliris)、依法利珠单抗(Efalizumab)(例如，瑞体肤(RAPTIVA))、埃洛妥珠单抗(Elotuzumab)(例如，EMPLICITI)、依洛尤单抗(Evolocumab)(例如，瑞百安(Repatha))、戈利木单抗(Golimumab)(例如，欣普尼注射剂(Simponi Injection))、替伊莫单抗(Ibritumomab)(例如，泽维宁(Zevalin))、依达赛珠单抗(Idarucizumab)(例如，Praxbind)、英利昔单抗(Infliximab)(例如，类克(Remicade))、普利木单抗(Ipilimumab)(例如，YERVOY)、艾克司单抗(Ixekizumab)(例如，Taltz)、美泊利单抗(Mepolizumab)(例如，Nucala)、莫罗单抗(Muromonab)(例如，ORTHOCLONE OKT3)、那他珠单抗(Natalizumab)(例如，Tysabri)、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)(例如，Portrazza)、纳武单抗(Nivolumab)(例如，欧狄沃(Opdivo))、奥托昔单抗(Obiltoxaximab)(例如，Anthim)、奥比妥珠单抗(Obinutuzumab)(例如，Gazyva)、奥法木单抗(Ofatumumab)(例如，Arzerra)、奥马珠单抗(Omalizumab)(例如，索雷尔(Xolair))、帕利珠单抗(Palivizumab)(例如，Synagis)、帕尼单抗
(Panitumumab)(例如，维克替比(Vectibix))、派姆单抗(Pembrolizumab)(例如，Keytruda)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)(例如，帕捷特(Perjeta))、雷莫芦单抗
(Ramucirumab)(例如，Cyramza)、兰尼单抗(ranibizumab)(例如，诺适得(Lucentis))、瑞西巴库单抗(例如，瑞西巴库单抗(RAXIBACUMAB))、利妥昔单抗(Rituximab)(例如，美罗华(Rituxan))、苏金单抗(Secukinumab)(例如，Cosentyx)、司妥昔单抗(Siltuximab)(例如，Sylvant)、托珠单抗(Tocilizumab)(例如，雅美罗(ACTEMRA))、托西莫单抗(Tositumomab)(例如，百克沙(Bexxar))、曲妥珠单抗(Trastuzumab)(例如，赫塞汀(Herceptin))、优特克单抗(Ustekinumab)(例如，Stelara)或维多珠单抗(Vedolizumab)(例如，Entyvio)。
在其它实施方式中，所述宿主细胞包含(a)Stt3低聚糖转移酶(OST)，和(b)不具有内源N-聚糖延伸。
另一个实施方式包括用于制备糖基化靶标蛋白的方法，其中所述方法包括培养宿主细胞和从所述培养中纯化所述靶标蛋白。
另一个实施方式包括糖基化靶标蛋白的组合物。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有至少约90％至100％的所述组合物中的靶标蛋白的N-连接的糖基化共有序列具有包含以下结构的低聚糖：
其中正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是所述靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约
20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，
55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化是G0-Gn聚糖，其特征为以下结构：
其中正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化是G0聚糖，其特征为以下结构：
其中正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化是G1-Gn聚糖，其特征为以下结构：
其中空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是所述靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化是G2聚糖，其特征为以下结构：
其中空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是所述靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化是G1聚糖，其特征为以下结构：
其中空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是所述靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化是G1聚糖，其特征为以下结构：
其中空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是所述靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，进一步修饰所述靶标蛋白上的糖基化以优化所述靶标蛋白在引入对象时的药物动力学性质。在另一个实施方式中，所述靶标蛋白上的糖基化是唾液酸化的。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化的特征在于以下结构：
其中菱形代表唾液酸残基，空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是所述靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化的特征在于以下结构：
其中菱形代表唾液酸残基，空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是所述靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化的特征在于以下结构：
其中菱形代表唾液酸残基，空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是所述靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化的特征在于以下结构：
其中菱形代表唾液酸残基，空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是所述靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化的特征在于以下结构：
其中菱形代表唾液酸残基，空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是所述靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化的特征在于以下结构：
其中菱形代表唾液酸残基，空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是所述靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化的特征在于以下结构：
其中菱形代表唾液酸残基，空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是所述靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化的特征在于以下结构：
其中菱形代表唾液酸残基，空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是所述靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化的特征在于以下结构：
其中菱形代表唾液酸残基，空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是所述靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化的特征在于以下结构：
其中菱形代表唾液酸残基，空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是所述靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化的特征在于以下结构：
其中菱形代表唾液酸残基，空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是所述靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化的特征在于以下结构：
其中菱形代表唾液酸残基，空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是所述靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述N-连接的糖基化共有序列是Asn-X-Ser/Thr；其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白被分泌至培养基中，并且其中所述糖基化靶标蛋白是糖基化的。在某些实施方式中，从培养基中纯化所述糖基化靶标蛋白。在另一个实施方式中，通过亲合纯化或离子交换色谱法从培养基中纯化所述糖基化靶标蛋白。在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白含有Fc域并且是通过蛋白-A从培养基中亲合纯化的。在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白含有亲合标签并且是亲合纯化的。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白群体是至少约90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％均一的。在其它实施方式中，所述靶标蛋白上
90％至100％的N-糖基位点被糖基化占据。
在具体的实施方式中，本文提供了杂交的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶，其中所述杂交的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶包含(a)非来自利什曼虫(Leishmania)的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的催化域；和(b)负责在利什曼虫(Leishmania)的高尔基体区室中定位和保留的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述杂交的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶来自蜥蜴利什曼虫
(Leishmania tarentolae)。
在其它实施方式中，所述杂交的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶已工程化以包含信号序列和至少一种保留序列，其中所述信号序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶靶向蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)宿主细胞的内质网，并且其中所述保留序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶保留在内质网或高尔基体中。
在另一个实施方式中，所述杂交的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶保留在内质网中。在另一个实施方式中，所述杂交的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶保留在高尔基体顺面膜囊中。在另一个实施方式中，所述杂交的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶保留在高尔基体中间膜囊中。
在其它实施方式中，所述杂交的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是胞质-跨膜-干(CTS)序列。
在某些其它实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶来源于表9中所列的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶，或其功能同源物、同工型或变体。
在具体的实施方式中，本文提供了杂交的半乳糖基转移酶，其中所述杂交的半乳糖基转移酶包含(a)非来自利什曼虫(Leishmania)的半乳糖基转移酶的催化域；和(b)负责在利什曼虫(Leishmania)的内质网或高尔基体区室中定位和保留的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，所述杂交的半乳糖基转移酶来自蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)。
在其它实施方式中，所述杂交的半乳糖基转移酶已工程化以包含信号序列，其中所述信号序列将所述半乳糖基转移酶靶向蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)宿主细胞的内质网，并且其中所述保留序列将所述半乳糖基转移酶保留在内质网或高尔基体中。
在某些实施方式中，所述杂交的半乳糖基转移酶将所述半乳糖基转移酶保留在内质网中。在某些实施方式中，所述杂交的半乳糖基转移酶将所述半乳糖基转移酶保留在高尔基体顺面膜囊中。在另一个实施方式中，所述杂交的半乳糖基转移酶将所述半乳糖基转移酶保留在高尔基体中间膜囊中。在另一个实施方式中，所述杂交的半乳糖基转移酶将所述半乳糖基转移酶保留在高尔基体反面膜囊中。在其它实施方式中，所述杂交的半乳糖基转移酶是胞质-跨膜-干(CTS)序列。在其它实施方式中，所述杂交的唾液酸转移酶是GRIP序列。
在某些实施方式中，所述杂交的唾液酸转移酶是CTS序列和GRIP序列。
在其它实施方式中，所述半乳糖基转移酶来源于表9中所列的半乳糖基转移酶，或其功能同源物、同工型或变体。
在具体的实施方式中，本文提供了杂交的唾液酸转移酶，其中所述杂交的唾液酸转移酶包含(a)非来自利什曼虫(Leishmania)的唾液酸转移酶的催化域；和(b)负责在利什曼虫(Leishmania)的内质网或高尔基体区室中定位和保留的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，所述杂交的唾液酸转移酶来自蜥蜴利什曼虫(Leishmania
tarentolae)。
在某些实施方式中，所述杂交的唾液酸转移酶已工程化以包含信号序列，其中所述信号序列将所述唾液酸转移酶靶向蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)宿主细胞的内质网，并且其中所述保留序列将所述唾液酸转移酶保留在内质网或高尔基体中。
在某些实施方式中，所述杂交的半乳糖基转移酶将所述半乳糖基转移酶保留在内质网中。在另一个实施方式中，所述杂交的唾液酸转移酶将所述唾液酸转移酶保留在高尔基体反面膜囊中。在另一个实施方式中，所述杂交的唾液酸转移酶是CTS序列。在其它实施方式中，所述杂交的唾液酸转移酶是GRIP序列。在其它实施方式中，所述杂交的唾液酸转移酶是CTS序列和GRIP序列。
在某些其它实施方式中，所述杂交的唾液酸转移酶来源于表9中所列的唾液酸转移酶，或其功能同源物、同工型或变体。
在其它实施方式中，本文提供了编码所述杂交的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的核酸。在其它实施方式中，本文提供了编码所述杂交的半乳糖基转移酶的核酸。在某些实施方式中，本文提供了编码所述杂交的唾液酸转移酶的核酸。
5.1术语和缩写
当结合数值使用时，术语“约”是指参考数值±1、±5或±10％内的任何数值。
如本文所使用的，术语“对象”是指动物(例如，鸟类、爬行动物和哺乳动物)。在另一个实施方式中，对象是哺乳动物，包括非灵长类(例如，骆驼、驴、斑马、牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长类(例如，猴子、黑猩猩和人)。在某些实施方式中，对象是非人动物。在一些实施方式中，对象是农畜或宠物(例如，狗、猫、马、山羊、绵羊、猪、驴或鸡)。在具体的实施方式中，对象是人。术语“对象”和“患者”在本文中可以互换使用。
缩写“α[数值]”、“α[数值],[数值]”、“β[数值]”或“β[数值],[数值]”表示糖苷键或糖苷连接，其是将碳水化合物残基连接至另一基团的共价键。当两个碳具有相同立体化学时形成α-糖苷键，而当两个碳具有不同立体化学时形成β-糖苷键。
6.附图说明
图1：从(Jennewein and Alter 2017)修改获得的抗体组合多样性驱动抗体效应因子功能。通过抗体Fc域的两种改变来修饰IgG Fc：(i)糖基化的选择(36种选择)和(ii)亚类的选择(4种亚类)，从而产生了144种理论组合和相联系的功能状态。基于抗体-聚糖组合，可以引起多种不同的功能反应，包括抗炎性反应的诱导；功能反应，如抗体-依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、抗体-依赖性细胞毒性(ADCC)；或者炎性应答，包括补体激活和细胞因子分泌。
缩写：IL，白介素。
图2A、2B和2C：根据(Sondermann等人,2013)修改获得的通过IgGFc片段的糖基化的结构变化。图2A：通过唾液酸化，所提议的Fc片段内的结构变化的动画。非半乳糖化的(G0F)Fc-片段维持了允许FcγR结合的开放构象。三角形代表岩藻糖和低结合。图2B：在完全α2,
6-唾液酸化的Fc(G2FS2)中，α1,3-臂与Cγ2域的蛋白核心结合，从而引起了封闭构象。所得的具有改变的三级结构的Fc片段的闭合构象显示了DC-SIGN的结合位点，然而用于FcγR的被阻断。图2C：根据(Chen等人,2017；Li等人,2017)，可以修改模型，从而在缺少岩藻糖的糖工程化N-聚糖上具有开放构象，其使得以更高的亲合力结合至FcγR。当无岩藻糖的N-聚糖被唾液酸双触角封端时，构象变化可以是打开且压紧的。通过两个聚糖闩锁
(glycanlatches)稳定Fc结构以维持正确的Fc构象，但是所述Fc结构是通过不同的聚糖残基介导的。Chen的结果表明了N-糖基化作用在维持Fc结构完整性中的作用并且显示了具有末端唾液酸调节的聚糖-聚糖相互作用中不同模式的可能性。
图3A和3B：蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)中内质网(ER)N-聚糖生物合成的生物信息学评价和与根据(Varki 2009)修改获得的保守途径的比较。图3A：用叉号和删除线表示蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)中缺少的基因。图3B：主要从酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)突变体的研究中鉴别了催化生物合成中每个步骤的酶。受每个酵母突变影响的基因被称为ALG基因(用于糖基化作用中改变的)。多萜醇-P-P-
GlcNAc2Man9Glc3的合成。位于ER膜的胞质面的多萜醇(红色波形曲线)磷酸酯(Dol-P)接受来自细胞质中UDP-GlcNAc的GlcNAc-1-P以产生Dol-P-P-GlcNAc。在“翻转”穿过ER膜至腔侧之前，通过所指示的ALG酶使Dol-P-P-GlcNAc延伸为Dol-P-P-GlcNAc2Man5。在ER膜的腔面上，从Dol-P-Man添加4个甘露糖残基，从Dol-P-Glc添加3个葡萄糖残基。还在ER的胞质面上制备Dol-P-Man和Dol-P-Glc，并且它们“翻转”到腔面。用对号表示蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)中存在的同源物，用叉号显示缺少的同源物。预期man3结构将翻转并直接转移至多肽，而不会进一步甘露糖基化，这是因为ALG12、6、8、9和10缺少，并且认为ALG3含有功能缺失突变。ALG5(多萜基-磷酸β-葡萄糖基转移酶)缺少。OST仅由Stt3组成(表4)。
图4A、4B和4C：内质网(ER)N-聚糖生物合成、修剪和向蛋白受体转移的生物信息学评价。图4A：用叉号表示生物合成中ALG同源物的缺少，并且删除线表示减少的Man3前体。尽管假定缺少任何Man4或Man5前体物质(由于缺少ALG3、9、11、12)和葡糖基化前体物质(由于缺少ALG6、8和10和ALG5)，但是存在修剪酶(GCS1、GNAB、MAN1)(用删除线表示缺少的酶)，如图
4B所示。图4C：预期仅最终的聚糖Man3将通过Stt3转移至蛋白受体的N-共有位点。未预期折叠中间产物Glc1Man9GlcNAc2作为所负责的凝集素的配体用于质量控制。
图5：基于(Moremen等人,2012)，蛋白N-糖基化和蛋白折叠质量控制的生物信息学评价。a)在糖蛋白生物合成期间，初生多肽翻译之后是它们通过SEC61孔的移位和聚糖通过低聚糖转移酶(OST)从脂质-连接的中间产物向肽受体序列子的同时转移。OST的STT3亚基中的一个裂沟搜索Asn-X-Ser/Thr受体序列子，而相邻的裂沟结合聚糖供体。b)在转移之后，立即通过α-葡糖苷酶I(GIsI)和α-葡糖苷酶IIα-β杂二聚体(GIsIIα/β)发生通过Glc除去的聚糖修剪。含Glc1Man9GlcNAc2结构的折叠中间产物是凝集素钙联接蛋白(蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)中缺少)或者钙网蛋白(蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)中缺少)的配体，其与ERp57复合起作用。与凝集素解离之后是进一步的Glc切割。通过ATP-驱动的侣伴蛋白BiP(也称为GRP78)提供了其它侣伴蛋白辅助。正确折叠的糖蛋白包装用于向高尔基体转运。c)通过折叠感应分子UDP-Glc:糖蛋白葡萄糖基转移酶(UGGT1，在蜥蜴利什曼虫
(L.tarentolae)中缺少)识别不完全折叠的糖蛋白。然后，通过将Glc残基添加回到聚糖结构来使它们再糖基化并再整合至钙联接蛋白循环中。d)通过Man修剪(通过ERα-甘露糖苷酶I(ERManI，＝MAN1，存在于蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)中)或者GolgiManIA、GolgiManIB和GolgiManIC(未显示)的活性，然后通过ER降解-增强α-甘露糖苷酶-样1(EDEM1)、EDEM2和EDEM3(其与在酵母中也称为Mnl1的Htm1同源，全部在蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)中缺少)的活性，对末端错误折叠的糖蛋白进行内质网(ER)处理。修剪的聚糖结合ER凝集素OS9或XTP3B(未显示)并且使用胞液泛素结合蛋白的驱动力和含valocin蛋白(VCP；也称为TER ATP酶；在酵母中被称为Cdc48、Ufd1或Npl4)的ATP酶功能，通过derlin 1(DER1)、DER2和DER3的复合物(SEL1L复合物；在酵母中为Hrd3)移位到胞液中。通过胞液PNG酶(在蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)中缺少)使肽去糖基化并通过蛋白酶体149降解。用叉号表示同源物缺少的蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)，并且在方框中显示本发明的同源物。对于比较的详细信息，还参见表8。
图6：与野生型蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)相比，从(Kellokumpu等人,
2016)修改获得的哺乳动物N-糖基化途径。示意性动画显示了通过内质网(ER)和高尔基体中的糖基转移酶的N-聚糖的顺序加工。通常认为所参与的酶(糖基转移酶和糖苷酶)在一定时间，以所指明的顺序，通过往返于不断增长的低聚糖链来添加或除去糖残基，从而相继单独起作用，左侧(“哺乳动物”)。图6的右侧代表野生型蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)，其与哺乳动物系统相比，具有减少的前体和不同的成熟的N-聚糖。
图7：与野生型蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)相比，从(Kellokumpu等人,
2017)修改获得的哺乳动物N-糖基化途径。哺乳动物途径的示意性动画通过将在糖工程化利什曼虫(Leishmania)中产生所指示的聚糖的糖工程化步骤补充了图6。
图8：所提议的蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)中的N-糖基化生物合成途径。
N-聚糖前体在胞质侧作为Man3组装，然后翻转至ER腔。然后，该Man3聚糖通过Stt3(通常存在的OST复合物的仅有的部分)直接转移。受体蛋白N-糖基位点上最终的聚糖是Man3，其转移至高尔基体顺面膜囊。在高尔基体顺面膜囊中，异源酶催化糖基转移酶反应，从而构建了人双触角N-聚糖。这些是来自哺乳动物或昆虫来源的Gnt-I和Gnt-II，其添加了前两个GlcNAc残基。通过它们在以下方框中的文字缩写描述了相应的糖形。在高尔基体反面膜囊中，在利什曼虫(Leishmania)中表达的来自哺乳动物来源的GalT和SiaT酶催化反应以完成N-聚糖，然后其成为均一、无岩藻糖的，但双触角唾液酸化的人源化聚糖，基于α2,3或α2,6连接的唾液酸(Neu5Ac)，其介导了不同的预期功能。
图9：在三个不同的wt株中，来自总蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)细胞沉淀颗粒的PNGase F或者PNGase A释放的和RF标记的N-聚糖或者空白处理的N-聚糖的UPLC分离和通过MS的m/z确定。通过MS检测(Man)3(GlcNAc)2＝Man3，其计算m/z＝1222.7166；[M+Na]+1244.6985；[M+K]+1260.6724。在所有沉淀样品颗粒中观察到Man3，当通过PNGase F或者PNGase A释放时，RT为9.16；9.27；9.34，但在空白处理样品中不是。空白处理样品显示株中的污染(中间和底部图)，例如，来自细胞壁糖脂的污染(具有聚己糖特征)。在RT 15.76，在FLR迹线中观察到另一个峰，但是尽管获得了优良的MS光谱，但是不能鉴别该化合物。通常，在FLR迹线中观察到的背景不多，但是在较早的RT(<8min RT，未显示)MS迹线背景非常多。
图10A和10B：在SfGnT-I、TbGnT-I或TbGnT-II体外活性测定之后，2-AB标记的N-聚糖反应产物的HPLC分离。在游离寡甘露糖(paucimannose)(Man3)作为底物的体外测定中使用了来自表达SfGnT-I、TbGnT-I或者TbGnT-II的重组蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)的免疫富集(图10A)或溶解部份(图10B)。在HPLC上分离了干净的和2AB标记的反应产物并与标准品，Man3-2AB、G0-Gn(NGA3-N)和G0(NGA2)相比较。RT 76.7'的峰值表示异源GnT-I酶的活性，其用星号标记。
图11A和11B：在MGAT1体外活性测定之后，2-AB标记的N-聚糖反应产物的HPLC分离。在对于以下物质的体外测定中使用来自SN的免疫富集的MGAT1或者来自表达MGAT1的重组蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)的沉淀颗粒以及溶解部份和裂解液：(图11A)对于2AB-标记的高甘露糖(Man5)，已知的N-糖基化途径中MGAT1的常用生物合成受体，或者(图11B)对于作为底物的2AB-寡甘露糖(Man3)，其在利什曼虫(Leishmania)N-聚糖途径中的高尔基体中模拟用于延伸的Man3受体。作为阴性对照，在反应中使用来自wt蜥蜴利什曼虫
(L.tarentolae)细胞的裂解液。在HPLC上分离了干净的2AB标记的反应产物并与标准品，图
11A)Man5或者图11B)Man3；G0-Gn(NGA2-N，绿色)相比较。用星号标记的峰值表示异源GnT-I酶的活性。
图12A和12B：在MGAT2体外活性测定之后，2-AB标记的N-聚糖反应产物的HPLC分离。在对于以下物质的体外测定中使用来自SN的免疫富集的MGAT2以及来自重组蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)的沉淀颗粒：对于2AB-标记的G0-Gn(NGA2-N)，已知的N-糖基化途径中MGAT2的常用生物合成受体(图12A)，或者对于作为底物的2AB-寡甘露糖(Man3)，其在利什曼虫(Leishmania)N-聚糖途径中的高尔基体中模拟用于延伸的Man3受体(图12B)，其不通过MGAT2延伸。在HPLC上分离了干净的2AB标记的反应产物并与标准品，Man3、G0-Gn(NGA2-N)和G0(NGA2)相比较。用星号标记的峰值表示异源GnT-II酶的活性。
图13A、13B和13C：在SfGnT-II体外活性测定之后，2-AB标记的N-聚糖反应产物的HPLC分离。在对于以下物质的体外测定中使用来自表达SfGnT-II的重组蜥蜴利什曼虫
(L.tarentolae)的粗裂解液：对于作为底物的2AB-寡甘露糖(Man3)，其在利什曼虫(Leishmania)N-聚糖途径中的高尔基体中模拟用于延伸的Man3受体(图13A)；对于2AB-标记的G0-Gn(NGA2-N)，已知的N-糖基化途径中Gnt-II的常用生物合成受体(图13B)或者对于
2AB标记的Man5，非GnT-II的底物(图13C)。在HPLC上分离了干净的2AB标记的反应产物并与标准品，Man3、G0-Gn(NGA2-N)和Man5相比较。用星号标记的峰值表示异源GnT-II酶的活性。
图14A、14B和14C：在B4GALT1体外活性测定之后，2-AB标记的N-聚糖反应产物的HPLC分离。图14A：在对于2AB-G0-Gn(NGA2-N)的体外测定中使用了来自重组蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)的免疫富集的B4GALT1。在HPLC上分离了干净的2AB标记的反应产物并与标准品，G0-Gn(NGA2-N)、G1(NA2G1)、NA2(G2)相比较。用星号标记的峰值表示异源GalT酶的活性。图14B显示了商品化NGA2-N(G0-Gn)标准品的组成的示意性糖形表示和B4GALT1体外测定之后的预期反应结局，其显示在两个不同的分枝上形成了G1-Gn。图14C表示当使用G0(NGA2)作为GalT的底物时的预期反应产物。
图15：全甲基化的PNGase F所释放的wt和糖工程化的蜥蜴利什曼虫(Leishmania
tarentolae)的N-聚糖的m/z范围1000-2200的MALDI-TOF MS图谱。在m/z峰上方注释糖形。
图16：所鉴别的糖形的MALDI-TOF/TOF MS裂解图谱。来自wtSt10569的m/z 1171.6的图谱(＝Man3)(顶部)，来自表达SfGnT-I的重组株St11707的图谱的m/z 1416.7(＝G0-Gn)(中间)和来自共表达SfGnT-I和SfGnT-II的重组St12320的图谱的m/z 1661.8(＝G0)(底部)中存在的碎片离子确认了Man3(顶部)、G0-Gn(中间)和G0(底部)的全甲基化N-聚糖。
图17A、17B和17C：图17A显示了来自重组糖工程化蜥蜴利什曼虫(Leishmania
tarentolae)细胞沉淀颗粒的PNGase F释放的和RF-标记的N-聚糖或者空白处理的N-聚糖的UPLC分离和通过MS的m/z确定，短划线代表在空白样品中可见的背景峰。RF-标记的N-聚糖来源于：16.260-使用PNGase F的St11707(SfGnT-I)；16.261-St11707(SfGnT-I)-空白；
16.263-St12525(SfGnT-I和SfGnT-II)-PNGase F和16.264-St12767(SfGnT-I和MGAT2)-PNGase F并叠加。用加粗箭头表示m/z确认的聚糖峰。图17B显示了来自St 13065的N-聚糖(MGAT1和MGAT2)，在上方用[M+H]m/z＝1222Man3，m/z＝1425G0-Gn，m/z＝1628(G0)和m/z＝
1587(G1-Gn)示意性注释的峰中确认了St13066(SfGnT-I和B4GalT1)m/z的图17C。未标记的峰还存在于空白水解液中并且包含推定的细胞壁糖脂片段(虚线箭头，“背景”)。
图18：在糖工程化的利什曼虫(Leishmania)中表达的重组hEPO的N-聚糖延伸。重组表达GnT-I候选SfGnT-I以使天然N-聚糖延伸至G0-Gn。单独表达(St11521)或与SfGnT-I共表达(St11895)重组靶标蛋白人促红细胞生成素(rhEPO)。通过利什曼虫(Leishmania)分泌途径分泌rhEPO并从培养上清液中纯化。两种纯化的EPO样品的考马斯亮蓝染色的SDSPAGE。一旦添加GlcNAc延伸至高分子量，则分子量改变。
图19：通过肽图谱的rhEPO位点占据。浅灰色：糖肽富集步骤中流经部份的EPO肽。灰色：
存在于流经部份中和富集的糖肽部份中的肽。深灰色：在用PNGase A+F去糖基化之后，富集的糖肽部份中以其脱酰氨基形式中存在的覆盖N-糖基化位点N24和N38的EPO肽。未在其非糖基化形式中检测到该肽。在本研究中，未明确检测到具有N-糖基化位点N83的肽(既不在其非糖基化形式中，也不在其去糖基化形式中)。加粗表示N-糖基化位点。显示了SEQ ID NO：108。
图20：具有所鉴别的N-聚糖的rhEPO的糖肽。显示了N-糖基化N24和N38位点。显示了SEQ ID NO：109。
图21A和21B：天然分泌的糖蛋白的鉴定。图21A)在方框中总结了工作流程并且考马斯亮蓝染色的SDS PAGE显示了ConA富集之后的洗脱谱图(E1至E5)。主要的蛋白处于60至
80kDa之间。洗脱被用于N-聚糖的释放并且使用肽图谱，使用蛋白质组学方法鉴别2AB标记和蛋白。图21B：显示了所鉴别的蛋白以及通过表示概率>96％的序列覆盖度所鉴别的肽的数目。
图22A和22B：天然分泌的糖蛋白转化酶的处理的N-末端的鉴定。图22A：在方框中总结了工作流程。将St10881的上清液用(NH4)2SO4沉淀并使用ConA纯化。在考马斯亮蓝染色的SDS PAGE中显示了ConA洗脱部分E1至E8。在尺寸排阻色谱之后，收集除rhEPO以外最显著的分泌蛋白并进行EDMAN N末端测序。图22B显示了通过肽图谱所鉴别的转化酶的序列，其中浅灰色标记表示所发现的肽。圆圈表示来自EDMAN N末端测序的加工的N-末端DGVPYEx(SEQ ID NO：157)。显示了SEQ ID NO：110。
图23：当基因融合至来自转化酶的转化酶分泌序列时，分泌rhEPO。以用于分泌移位的两种不同的信号肽表达EPO以分泌至上清液。将TCA沉淀的上清液上样至SDS PAGE，其对应于15OD的细胞，将其进行免疫印迹(左图)或者考马斯亮蓝染色(右图)。在SN测试中，在表示它们N-糖基化形式的分子量处发现了具有LMSAP分泌信号(St11376)或者来自转化酶(St11377)的两种rhEPO变体，它们分别用5个不同的单克隆进行测试。
图24A和24B：天然高尔基体定位的蛋白的域预测。大部分高尔基体定位的糖基转移酶是II型膜蛋白，其具有短N末端胞质域、约20个氨基酸的a-螺旋TM域、干域和位于分泌途径的腔中的C末端球状催化域。(Kellokumpu等人,2016)图24A显示了具有分泌信号和位于N-末端的CTS以及之后的球状/催化域的Gnt(Gnt-x)或SfGnT-I的代表。图24B显示了通过生物信息学比较所鉴别的来自蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)的天然和假定的高尔基体蛋白MAN1、LtaNTPDase1和2，并在示意性条状图下方列出了预测的CTS域的氨基酸序列。在LTAR_
110005600.1(之前的名称方案：LtaP11.0070)中鉴别了GRIP域并且在条状图下方显示了该C末端氨基酸序列。显示了SEQ ID NO：24-27。
图25A、25B和25C：Gnts和用于改善的高尔基体靶向、保留以及均或杂二聚化的杂交设计的域预测。将Gnt-X表示为白色条状图，它是作为实例所显示的Sf-Gnt-I。在所示实例MGAT1中，深灰色中是Gnt-Y。下方数字表示在Gnt-y/MGAT1的CTS之后用于杂交设计的融合点。图25B显示了从作为核苷酸序列基因融合至Gnt-X/SfGnT-I的N-末尾截短的核苷酸(Δ
90、Δ110、Δ130、Δ150个氨基酸)的Gnt-Y/MGAT1的N-末端开始的90、110、130或150个氨基酸。将全长(FL)Gnt-Y(MGAT1)融合至Gnt-X/SfGnT-I(顶部)的FL或者N-末端CTS截短的Gnt-X/SfGnT-I(底部)，如图25C所示。
图26A和26B：rhEPO或SfGnT-I重组细胞的生长行为以及rhEPO或SfGnT-I随时间的表达和定位。在表达rhEPO(St11357)或者SfGnT-I(St11521)的细胞的静态培养相对于振荡培养中监测生长-在图中显示了随时间的生长(OD)和形状，如图26A所示。在TCA沉淀的上清液(SN)以及完整细胞提取物(WCE)中，使用抗-Strep抗体，通过免疫印迹确定rhEPO或SfGnT-I随时间的表达速率以及它们的定位(图26B)。
图27A和27B：SfGnT-I、TbGnT-I和TbGnT-II的定位。检测Strep标签的Sf-GnT-I的免疫印迹，其从培养SN中TCA沉淀，载量对应于15OD，或者通过链霉亲和素从用TritonX溶解的细胞裂解液中亲合富集(图27A)。通过免疫印迹，在粗部分和Triton-X溶解部分中检测锥虫(Trypanosoma)来源的和HA-标签的TbGnT-I和TbGnT-II(图27B)。
图28A和28B：SfGnT-I的杂交Gnt变体的定位。将天然SfGnT-I或者SfGnT-I的Man1-CTS或者LTaNTPDase1或2CTS的杂交表达，并从培养SN(图28A)，或者从使用triton(TrX+)或不使用triton(TrX-)的粗裂解液沉淀，或者从不溶性部分(Ins)中均质化(图28B)。
图29：MGAT1的定位和亲合-富集。通过免疫印迹，在来自重组细胞培养SN或者沉淀颗粒的亲合富集部分的纯化部分中(Purif.)检测HA-标签的MGAT1。Elu是用于体外测定的洗脱部分。对于定位，在用triton(TrX+)或者不用triton(TrX-)的裂解液或者在从不溶性部分(Insol.fr.)或者从碎片均质化的裂解液中检测到MGAT1。
图30：SfGnT-II的定位和亲合-富集。通过免疫印迹，在来自重组细胞培养SN或者沉淀颗粒的亲合富集部分的纯化部分中(Purif.)检测HA-标签的SfGnT-II。Elu是用于体外测定的洗脱部分。对于定位，在用triton(TrX+)或者不用triton(TrX-)的裂解液或者在从不溶性部分(Insol.fr.)或者从碎片均质化的裂解液中检测到SfGnT-II。
图31A和31B：MGAT2的定位和亲合-富集。通过免疫印迹，在来自重组细胞培养SN或者沉淀颗粒(Pell)的亲合富集部分(W，洗；Elu，洗脱)的纯化部分中(Purif.)检测HA-标签的MGAT2。使细胞生长96h或72h。Elu是用于体外测定的洗脱部分。对于定位，在用triton(TrX+)或者不用triton(TrX-)的裂解液或者在从不溶性部分(Insol.fr.)或者从碎片均质化的裂解液中检测到SfGnT-II(图31A)。通过抗-HA免疫印迹显示了不同传代的沉淀细胞培养SN中的MGAT2的定位和表达水平(图31B)。
图32：定制的Fc聚糖介导所期望的下游效应因子功能。免疫-激活聚糖介导如ADCC、ADCP和CDC的效应。使用用于Fc分子或抗体表达的糖工程化利什曼虫(Leishmania)平台定制了上方所指示的聚糖以用于介导免疫激活、免疫抑制和/或PK优化。如果用α2,6连接的Neu5Ac对双触角聚糖封端，则功能将为激活，但是如果用α2,3连接的Neu5Ac封端，则功能将为免疫-抑制。在(Chen等人,2017；Li等人,2017)中讨论了支持证据。如果不依赖于它们特异的键，通过唾液酸对双触角N-聚糖封端，则将由于唾液酸的存在通过提高循环半衰期来改善PK。此外，预期α2,6连接的Neu5Ac的免疫耐受性益处将避免潜在免疫原性治疗剂的抗药物抗体(ADA)的产生。底部的免疫抑制聚糖是核心α1,6岩藻糖基化聚糖，它是来自CHO细胞平台的典型聚糖衍生物(无末端唾液酸)。
图33：重组利妥昔单抗(抗-CD20单克隆抗体)的氨基酸序列。加粗显示了具有修饰的转化酶分泌序列的轻链(LC)和重链(HC)的蛋白序列，并且加粗并加下划线显示了Fc N-糖基化位点。显示了SEQ ID NO：111和112。
图34：用于在蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)中稳定整合的含有重组利妥昔单抗(抗-CD20单克隆抗体)的表达盒。相关区域的示意图，5'ssu是用于通过同源重组到编码18S rRNA的ssu-基因座的位点特异性整合的5'同源性位点；5'UTR是5'未翻译末端重复，其含有剪接前导受体序列；含有转化酶分泌信号的对于利什曼虫(Leishmania)密码子优化的轻链序列；IR1，含有用于多腺苷酸化的3'UTR和用于下游基因的5'UTR的第一基因间区；
含有转化酶分泌信号的对于利什曼虫(Leishmania)密码子优化的重链序列；IR2，含有用于多腺苷酸化的3'UTR和用于下游抗性标志物(sat)的5'UTR的第二基因间区，在它之后是其
3'UTR和用于向基因组位点特异性重组的3'同源性(3'ssu)区。KpnI是用于获得从供体大肠杆菌(E.coli)维持质粒上切除的用于转染线性化DNA的所述表达盒的限制性内切酶。
图35：从分泌利妥昔单抗_LMTB的重组蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)表达和纯化全长单克隆抗体。在顶部，作为方框描述了工作流程。显示了收获的上清液和透滤并5×浓缩的SN的考马斯亮蓝-染色的SDSPAGE(左图)。蛋白A洗脱(右图)显示了两种主要的考马斯亮蓝染色形式，一种在非还原条件(“non”)在SDS PAGE上作为FL利妥昔单抗迁移，一种作为降解产物在约100kDa迁移。在还原条件下(“红色”)，降解产物HC和LC分离。疏水相互作用色谱(HIC)洗脱显示当在非还原或在还原条件下分离时，这两种形式的分离。对SDS PAGE凝胶进行考马斯亮蓝染色。
图36A和36B：从重组利什曼虫(Leishmania)纯化获得的利妥昔单抗_LMTB与在CHO细胞中表达的相同蛋白的商业产品 的比较。图36A：考马斯亮蓝染色的SDS PAGE显
示在非还原条件下，不使用或使用(+)PNGase F处理来释放N-连接的聚糖的FL抗体。图36B显示了抗体分子、域和二硫桥键的示意图。用碳水化合物表示N糖基位点。在动画分子左侧，显示了利什曼虫(Leishmania)来源抗体的均一Man3 N-聚糖，然而在右侧，显示了来源于CHO表达的抗体的预期N-聚糖的微不均一性。
图37：从重组利什曼虫(Leishmania)纯化获得的利妥昔单抗_LMTB与在CHO细胞中表达的相同蛋白的商业产品 的毛细管凝胶电泳和比较。CGE显示在非还原条件下，
不使用(-)或使用(+)PNGase F处理来释放N-连接的聚糖的FL抗体。
图38A和38B：从重组利什曼虫(Leishmania)纯化获得的利妥昔单抗_LMTB(图38B)与在CHO细胞中表达的相同蛋白的商业产品 (图38A)的尺寸排阻色谱和比较。
图39A和39B：从重组利什曼虫(Leishmania)纯化获得的利妥昔单抗_LMTB(图39B)与在CHO细胞中表达的相同蛋白的商业产品 (图39A)的使用RF的N-聚糖谱和比较。
通过PNGase F释放N-聚糖并用RF标记。显示了UPLC分离，对于峰上方注释的N-聚糖确认了m/z值。
图40：从重组利什曼虫(Leishmania)纯化获得的利妥昔单抗_LMTB与在CHO细胞中表达的相同蛋白的商业产品 的使用全甲基化的N-聚糖谱和定量比较。通过PNGase
F释放N-聚糖并全甲基化。计算N-聚糖的相对强度(％)以建立每个光谱的N-聚糖谱。对此，确定了去同位素N-聚糖峰强度之和并设置为100％。然后，相对于该值确定了每个聚糖的相对强度(％)。黑色柱：利妥昔单抗_LMTB，灰色柱： Roche。对于峰上方注释的N-聚糖确认了m/z值，包括通过它们的碎片光谱的确认。
图41A和41B：从重组利什曼虫(Leishmania)纯化获得的利妥昔单抗_LMTB(图42B)与在CHO细胞中表达的相同蛋白的商业产品 (图42A)的使用全甲基化的N-聚糖谱和
比较。3次不同采集时来自 (图48A)和2次独立采集时来自利妥昔单抗_LMTB(图
42B)的通过PNGase F释放的全甲基化N-聚糖的MALDI-TOF MS光谱。
图42：从重组利什曼虫(Leishmania)纯化获得的利妥昔单抗_LMTB、在CHO细胞中表达的相同蛋白的商业产品 和糖工程化第三代抗-CD-20 Roche的N-
聚糖的微不均一性和定量比较。通过PNGaseF释放N-聚糖并全甲基化。计算N-聚糖的相对强度(％)以建立每个光谱的N-聚糖谱。对此，确定了去同位素N-聚糖峰强度之和并设置为
100％。然后，相对于该值确定了每个聚糖的相对强度(％)。灰色柱：利妥昔单抗_LMTB，深灰色柱： Roche，浅灰色柱： Roche。对于峰上方注释的N-聚糖确认
了m/z值，包括通过它们的碎片光谱的确认。
图43A和43B：从重组利什曼虫(Leishmania)纯化获得的利妥昔单抗_LMTB的抗原结合的功能性测试。图43A显示了 或利妥昔单抗_LMTB相对于对照IgG1κ的FACS柱状
图。将表达CD20抗原的Raji细胞用于测试抗-CD20抗体的功能性。染色序列为指定浓度的FcR封闭、IgG1封闭、第一抗体 利妥昔单抗_LMTB或阴性对照IgG1κ，然后是第
二抗体抗-IgG1 APC。在设门后，每个样品代表10000-13000个细胞的分析。箭头表示平均荧光迁移，其指示抗-CD20抗体与Raji细胞表面上的CD20抗原的结合。图43B显示了以逐渐升高的浓度，在膜上染色的作为GST融合蛋白在大肠杆菌(E.coli)中CD20重组表达的结果。将不同浓度的 或者利妥昔单抗_LMTB，或者对照抗体(抗-麦芽糖结合蛋白、来自
大肠杆菌(E.coli)的抗GroEL热休克蛋白或者抗His IgG抗体)，或者不使用第一抗体用于培育所述膜条。清洗后，第二抗体是抗人IgG-HRP。
图44：从重组利什曼虫(Leishmania)纯化获得的利妥昔单抗_LMTB与在CHO细胞中表达的相同蛋白的商业产品 的示意图和比较总结。对于利妥昔单抗_LMTB(右侧)和
对于 (左侧)，显示了HC和LC的N末端序列、C末端氨基酸以及聚糖谱。在两种样
品中鉴别了所有所指示的二硫桥键。
图45：不同动质体的使用全甲基化的N-聚糖谱和定量比较。在通过PNGase F去脂之后释放束形短膜虫(Crithidia fasciculata)、Crithidia deanei(Angomonas)和达氏植生滴虫(Phytomonas davidi)的N-聚糖并全甲基化。计算N-聚糖的相对强度(％)以建立每个光谱的N-聚糖谱。对此，确定了去同位素N-聚糖峰强度之和并设置为100％。然后，相对于该值确定了每个聚糖的相对强度(％)。对于峰上方注释的所有N-聚糖确认了m/z值，包括通过它们的碎片光谱的确认。
图46A和46B：SfGnT-I的杂交Gnt变体的定位。表达图46B示意性显示的天然SfGnT-I或SfGnT-I催化域的杂交体，并从培养SN或从使用triton X的粗裂解液(WCE)中沉淀，如图46A所示。
图47A和47B：表达不同Gnt-I(图47A)和不同Sf-Gnt-I杂交体(图47B)的利什曼虫
(Leishmania)的使用RF的N-聚糖定量和比较。通过PNGase F释放来自细胞沉淀颗粒的总N-聚糖并用RF标记。以G0-Gn转化％显示UPLC峰的相对定量，其表示用于糖工程化的第一GlcNAc的体内添加。误差线表示几次独立实验的标准偏差。对于含有G0-Gn和Man3的UPLC峰确认m/z值，而在空白和PNGase F释放样品之间不存在其它的峰差异。
图48A和48B：显示了利什曼虫(Leishmania)中表达的不同的唾液酸转移酶的定位(图
48A)和相对活性(图48B)。通过抗HA免疫印迹，与细胞培养SN相比，从来自triton溶解的细胞裂解液的亲合浓缩部分(elu)检测HA-标签的唾液酸转移酶。Elu是用于体外测定的洗脱部分(图48A)。
图49A、49B、49C和49D：利什曼虫(Leishmania)中表达的HA亲合-富集的唾液酸转移酶的2-AB标记的G2标准品的体外活性。图49A：鼠科ST6GAL1；图49B：大鼠ST6GAL1，图49C：含有优化的转化酶分泌信号的细菌CstI，图49D：鼠科ST3GAL3。显示了使用HA富集的唾液酸转移酶的G2标准品的体外反应，并且与商业标准品G2和唾液酸化的G2S2(虚线箭头)进行RT比较。用箭头表示体外反应并且用星号表示所得的聚糖峰。
图50A、50B、50C、50D和50E：利什曼虫(Leishmania)表达并富集的mST6GAL1可以使折叠的全长mAb的半乳糖化的N-聚糖唾液酸化。图50A：从细胞裂解液HA亲合富集表达鼠科ST6的利什曼虫(Leishmania)并测试其对于2AB标记的G2标准品(确定为100％(图50B))和对MabTheraFc N-聚糖(图50C)的活性。通过RF MS，对于mAb(浅灰色)以及体外反应之后，使用空白裂解液(黑色柱)或者蛋白A纯化的Mabthera的HA富集的mST6GAL1(深灰色柱)评价N-聚糖组成(图50D)。在图50E中显示了总结的总唾液酸化的单和双触角聚糖。
图51：利什曼虫(Leishmania)表达和富集的mST6GAL1可以使折叠的全长mAb的半乳糖化的N-聚糖唾液酸化，如通过与ST6反应叠加的空白反应的N-聚糖RF-MS谱所运行的UPLC上所示的。
图52A和52B：用Sf-Gnt-I和MGAT2稳定转染的并且游离表达利妥昔单抗的糖工程化株在利妥昔单抗上产生了G0 N-聚糖。使株在1L中生长，通过蛋白A从上清液中纯化分泌的利妥昔单抗(图52A)，并用于PNGaseF和RF-MS分析(图52B)并对Man3半定量。
图53：示意性地显示了使用可以重组添加至利什曼虫(Leishmania)中用于糖工程化的原核和真核酶的CMP-Neu5Ac途径。
7.发明详述
本发明涉及单细胞动质体真核宿主细胞，其已通过天然宿主细胞的性质以及与一组糖基转移酶(包括N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶和唾液酸转移酶)的异源表达的组合进行修饰以产生均一且功能完全的定制的在治疗蛋白上具有高位点占据的N-聚糖，从而成为用于哺乳动物(例如，人)治疗糖蛋白的生产的宿主-株。
本发明提供了核酸分子和组合文库，其可以用于成功靶向并将哺乳动物酶促活性(如，参与N-乙酰葡萄糖胺延伸、半乳糖苷化和唾液酸化的那些)表达至动质体真核宿主细胞中的胞内区室中。还提供了用于产生唾液酸化糖蛋白的CMP-唾液酸生物合成途径的设计。
7.1宿主细胞
在某些实施方式中，本发明提供了工程化宿主细胞，其可以用于表达和靶向参与糖基化的任何所期望的基因。本发明提供了真核宿主细胞，其已通过一组糖基转移酶(包括N-乙酰葡萄糖胺转移酶、半乳糖基转移酶和唾液酸转移酶)的异源表达进行修饰以产生功能-定制且均一的位于蛋白上的N-聚糖，从而成为用于哺乳动物(例如，人)治疗糖蛋白的生产的宿主-株。
本发明还提供了工程的化宿主细胞，其可以用于表达和靶向全长治疗抗体。所述新型宿主细胞在糖蛋白(如促红细胞生成素或抗-CD20(利妥昔单抗))上合成、表达和分泌均一且功能-定制的N-聚糖。
本文所述的本发明不局限于本文所公开的具体的酶、基因、质粒和构建体的使用。技术人员可以使用参与N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶、唾液酸转移酶和CMP-Sia生物合成途径酶的合成的基因的任何同源物、变体和衍生物。
在具体的实施方式中，本文提供了利什曼虫(Leishmania)宿主细胞，其包含(a)编码靶标蛋白的重组核酸；和(b)编码异源糖基转移酶的重组核酸。在某些实施方式中，所述异源糖基转移酶是N-乙酰氨基葡萄糖转移酶；和/或异源半乳糖基转移酶；和/或异源唾液酸转移酶。在一些实施方式中，本文提供了包含两种或更多种N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的宿主细胞。在其它实施方式中，包含异源唾液酸转移酶的宿主细胞还包含能够产生CMP-NeuAc的异源CMP-Sia生物合成途径蛋白。
在一个方面，本文提供了能够产生糖基化蛋白的利什曼虫(Leishmania)宿主细胞，其中所述利什曼虫(Leishmania)宿主细胞包含(i)天然OST或异源/重组OST；(ii)编码异源N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶、唾液酸转移酶和CMP-Sia生物合成途径酶或其修饰形式的核苷酸；和(iii)编码重组靶标蛋白和重组靶标蛋白的修饰形式的核苷酸。在其它实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶和/或唾液酸转移酶的氨基酸序列来源于表9所列的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶或者唾液酸转移酶或其任何功能同源物、同工型或变体。
在另一个实施方式中，本文提供了宿主细胞，其中来自所述N-聚糖生物合成途径的一种或多种内源酶已缺失、突变和/或功能性失活。在其它实施方式中，通过alg基因编码所述宿主细胞中已缺失、突变和/或功能性失活的内源酶。在另一个实施方式中，本文提供了宿主细胞，其中编码来自所述N-聚糖生物合成途径的内源酶的一种或多种基因已缺失、突变和/或功能性失活。在另一个实施方式中，使用本领域中已知的任何标准技术(例如，通过位点特异性同源重组或随机突变)使编码来自N-聚糖生物合成途径的内源酶的基因缺失、突变和/或功能性失活。在某些实施方式中，所述宿主细胞是不包括来自N-聚糖生物合成途径的一种或多种内源酶的利什曼虫(Leishmania)株。
在某些实施方式中，所述利什曼虫(Leishmania)宿主细胞是蜥蜴利什曼虫
(Leishmania tarentolae)细胞。在具体的实施方式中，本文提供了蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)宿主细胞，其包含(a)编码靶标蛋白的重组核酸；和(b)编码异源糖基转移酶的重组核酸。在某些实施方式中，所述异源糖基转移酶是N-乙酰氨基葡萄糖转移酶；和/或异源半乳糖基转移酶；和/或异源唾液酸转移酶。在一些实施方式中，本文提供了包含两种或更多种N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的宿主细胞。在其它实施方式中，包含异源唾液酸转移酶的宿主细胞还包含能够产生CMP-NeuAc的异源CMP-Sia生物合成途径蛋白。
在一个方面，本文提供了能够产生糖基化蛋白的蜥蜴利什曼虫(Leishmania
tarentolae)宿主细胞，其中所述蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)宿主细胞包含(i)天然OST或异源/重组OST；(ii)编码异源N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶、唾液酸转移酶和CMP-Sia生物合成途径酶或其修饰形式的核苷酸；和(iii)编码重组靶标蛋白和重组靶标蛋白的修饰形式的核苷酸。在其它实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶和/或唾液酸转移酶的氨基酸序列来源于表9所列的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶或者唾液酸转移酶或其任何功能同源物、同工型或变体。
在另一个实施方式中，本文提供了宿主细胞，其中将利什曼虫(Leishmania)信号和/或保留序列加入至N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶和/或唾液酸转移酶，其中所述信号序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶和/或唾液酸转移酶靶向利什曼虫(Leishmania)宿主细胞的内质网，并且其中所述保留序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶和/或唾液酸转移酶保留在内质网或高尔基体中。在另一个实施方式中，所述保留序列将N-乙酰氨基葡萄糖转移酶和/或半乳糖基转移酶保留在宿主细胞的内质网中。在另一个实施方式中，所述保留序列将N-乙酰氨基葡萄糖转移酶和/或半乳糖基转移酶保留在宿主细胞的高尔基体区室的顺面膜囊中。在另一个实施方式中，所述保留序列将N-乙酰氨基葡萄糖转移酶和/或半乳糖基转移酶保留在宿主细胞的高尔基体区室的中间膜囊中。在另一个实施方式中，所述保留序列将半乳糖基转移酶保留在宿主细胞的高尔基体区室的反面膜囊中。在另一个实施方式中，所述保留序列将唾液酸转移酶保留在宿主细胞的高尔基体区室的反面膜囊中。在另一个实施方式中，所述保留序列将唾液酸转移酶和半乳糖基转移酶保留在宿主细胞的高尔基体区室的反面膜囊中。在另一个实施方式中，加工并除去所述信号序列。在其它实施方式中，所述保留序列是来源于蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)蛋白的胞质-跨膜-干(CTS)序列。在另一个实施方式中，CTS序列来源于蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)MAN1、NTPDase 1或NTPDase 2。在另一个实施方式中，CTS序列包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26所示的序列或其功能活性片段。在另一个实施方式中，所述CTS来源于蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)MAN1。在另一个实施方式中，所述CTS序列包含SEQ ID NO：24所示的序列或其功能活性片段。在其它实施方式中，所述保留序列包含来源于利什曼虫(Leishmania)的GRIP序列或其功能活性片段。在另一个实施方式中，所述GRIP序列包含SEQ ID NO：27的序列或其功能活性片段。在其它实施方式中，所述保留序列包含来源于利什曼虫(Leishmania)蛋白的CTS序列或其功能活性片段，和来源于利什曼虫(Leishmania)的GRIP序列或其功能活性片段。
在另一个实施方式中，本文提供了利什曼虫(Leishmania)宿主细胞，其包含(a)编码靶标蛋白的重组核酸；和(b)编码N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的重组核酸。在另一个实施方式中，本文提供了利什曼虫(Leishmania)宿主细胞，其包含(a)编码靶标蛋白的重组核酸；和(b)编码半乳糖基转移酶的重组核酸。在另一个实施方式中，本文提供了利什曼虫(Leishmania)宿主细胞，其包含(a)编码靶标蛋白的重组核酸；和(b)编码唾液酸转移酶的重组核酸。在其它实施方式中，包含异源唾液酸转移酶的宿主细胞还包含能够产生CMP-NeuAc的异源CMP-Sia生物合成途径蛋白。
在另一个实施方式中，本文提供了利什曼虫(Leishmania)宿主细胞，其包含(a)编码靶标蛋白的重组核酸；(b)编码N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的重组核酸；和(c)编码半乳糖基转移酶的重组核酸。在另一个实施方式中，本文提供了利什曼虫(Leishmania)宿主细胞，其包含(a)编码靶标蛋白的重组核酸；(b)编码N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的重组核酸；和(c)编码唾液酸转移酶的重组核酸。在另一个实施方式中，本文提供了利什曼虫(Leishmania)宿主细胞，其包含(a)编码靶标蛋白的重组核酸；(b)编码唾液酸转移酶的重组核酸；和(c)编码半乳糖基转移酶的重组核酸。在其它实施方式中，包含异源唾液酸转移酶的宿主细胞还包含能够产生CMP-NeuAc的异源CMP-Sia生物合成途径蛋白。
在另一个实施方式中，本文提供了利什曼虫(Leishmania)宿主细胞，其包含(a)编码靶标蛋白的重组核酸；(b)编码N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的重组核酸；(c)编码半乳糖基转移酶的重组核酸；和(d)编码唾液酸转移酶的重组核酸。在其它实施方式中，包含异源唾液酸转移酶的宿主细胞还包含能够产生CMP-NeuAc的异源CMP-Sia生物合成途径蛋白。
在另一个实施方式中，本文提供了蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)宿主细胞，其包含(a)编码靶标蛋白的重组核酸；和(b)编码N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的重组核酸。在另一个实施方式中，本文提供了利什曼虫(Leishmania)宿主细胞，其包含(a)编码靶标蛋白的重组核酸；和(b)编码半乳糖基转移酶的重组核酸。在另一个实施方式中，本文提供了利什曼虫(Leishmania)宿主细胞，其包含(a)编码靶标蛋白的重组核酸；和(b)编码唾液酸转移酶的重组核酸。在其它实施方式中，包含异源唾液酸转移酶的宿主细胞还包含能够产生CMP-NeuAc的异源CMP-Sia生物合成途径蛋白。
在另一个实施方式中，本文提供了蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)宿主细胞，其包含(a)编码靶标蛋白的重组核酸；(b)编码N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的重组核酸；和(c)编码半乳糖基转移酶的重组核酸。在另一个实施方式中，本文提供了利什曼虫
(Leishmania)宿主细胞，其包含(a)编码靶标蛋白的重组核酸；(b)编码N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的重组核酸；和(c)编码唾液酸转移酶的重组核酸。在另一个实施方式中，本文提供了利什曼虫(Leishmania)宿主细胞，其包含(a)编码靶标蛋白的重组核酸；(b)编码唾液酸转移酶的重组核酸；和(c)编码半乳糖基转移酶的重组核酸。在其它实施方式中，包含异源唾液酸转移酶的宿主细胞还包含能够产生CMP-NeuAc的异源CMP-Sia生物合成途径蛋白。
在另一个实施方式中，本文提供了利什曼虫(Leishmania)宿主细胞，其包含(a)编码靶标蛋白的重组核酸；(b)编码N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的重组核酸；(c)编码半乳糖基转移酶的重组核酸；和(d)编码唾液酸转移酶的重组核酸。在其它实施方式中，包含异源唾液酸转移酶的宿主细胞还包含能够产生CMP-NeuAc的异源CMP-Sia生物合成途径蛋白。
在某些实施方式中，术语“异源的”表示来自不同物种。例如，宿主细胞中的“异源糖基转移酶”是来源于宿主细胞以外的物种的糖基转移酶。在某些实施方式中，术语“异源的”表示来自不同的株。例如，宿主细胞中的“异源糖基转移酶”是来源于宿主细胞以外的株的糖基转移酶。在更具体的实施方式中，术语“异源的”表示来自不同的属。例如，宿主细胞中的“异源糖基转移酶”是来源于宿主细胞以外的属的糖基转移酶。
在某些实施方式中，与本文所提供的方法和组合物一起使用的糖基转移酶是从其野生型基因基因修饰的糖基转移酶。在更具体的实施方式中，这种糖基转移酶具有相同的种或相同的株。在其它实施方式中，这种糖基转移酶具有不同的属、种或株。
7.2糖基转移酶的亚细胞定位
在一些实施方式中，将利什曼虫(Leishmania)信号和保留序列加入至N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶和/或唾液酸转移酶，其中所述信号序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶和/或唾液酸转移酶靶向利什曼虫(Leishmania)宿主细胞的内质网，并且其中所述保留序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶和/或唾液酸转移酶保留在内质网或高尔基体中。在一些实施方式中，将利什曼虫(Leishmania)信号和保留序列加入至N-乙酰氨基葡萄糖转移酶和唾液酸转移酶，其中所述信号序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶和唾液酸转移酶靶向利什曼虫(Leishmania)宿主细胞的内质网，并且其中所述保留序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶和唾液酸转移酶保留在内质网或高尔基体中。在一些实施方式中，将利什曼虫(Leishmania)信号和保留序列加入至N-乙酰氨基葡萄糖转移酶和半乳糖基转移酶，其中所述信号序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶和半乳糖基转移酶靶向利什曼虫(Leishmania)宿主细胞的内质网，并且其中所述保留序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶和半乳糖基转移酶保留在内质网或高尔基体中。在一些实施方式中，将利什曼虫(Leishmania)信号和保留序列加入至唾液酸转移酶和半乳糖基转移酶，其中所述信号序列将所述唾液酸转移酶和半乳糖基转移酶靶向利什曼虫(Leishmania)宿主细胞的内质网，并且其中所述保留序列将所述唾液酸转移酶和半乳糖基转移酶保留在内质网或高尔基体中。
在其它实施方式中，将利什曼虫(Leishmania)信号和保留序列加入至N-乙酰氨基葡萄糖转移酶，其中所述信号序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶靶向利什曼虫(Leishmania)宿主细胞的内质网，并且其中所述保留序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶保留在内质网或高尔基体中。在其它实施方式中，将利什曼虫(Leishmania)信号和保留序列融合至N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的N末端。在另一个实施方式中，将利什曼虫(Leishmania)信号和保留序列融合至N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的C末端。在其它实施方式中，未将利什曼虫(Leishmania)信号和保留序列融合至N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的N末端。在其它实施方式中，未将利什曼虫(Leishmania)信号和保留序列融合至N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的C末端。
在其它实施方式中，将利什曼虫(Leishmania)信号和保留序列融合至N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的多肽内的一个或多个氨基酸。
在其它实施方式中，将利什曼虫(Leishmania)信号和保留序列加入至半乳糖基转移酶，其中所述信号序列将所述半乳糖基转移酶靶向利什曼虫(Leishmania)宿主细胞的内质网，并且其中所述保留序列将所述半乳糖基转移酶保留在内质网或高尔基体中。在其它实施方式中，将利什曼虫(Leishmania)信号和保留序列融合至半乳糖基转移酶的N末端。在另一个实施方式中，将利什曼虫(Leishmania)信号和保留序列融合至半乳糖基转移酶的C末端。在其它实施方式中，未将利什曼虫(Leishmania)信号和保留序列融合至半乳糖基转移酶的N末端。在其它实施方式中，未将利什曼虫(Leishmania)信号和保留序列融合至半乳糖基转移酶的C末端。在其它实施方式中，将利什曼虫(Leishmania)信号和保留序列融合至半乳糖基转移酶的多肽内的一个或多个氨基酸。
在其它实施方式中，将利什曼虫(Leishmania)信号和保留序列加入至唾液酸转移酶，其中所述信号序列将所述唾液酸转移酶靶向利什曼虫(Leishmania)宿主细胞的内质网，并且其中所述保留序列将所述唾液酸转移酶保留在内质网或高尔基体中。在其它实施方式中，将利什曼虫(Leishmania)信号和保留序列融合至唾液酸转移酶的N末端。在另一个实施方式中，将利什曼虫(Leishmania)信号和保留序列融合至唾液酸转移酶的C末端。在其它实施方式中，未将利什曼虫(Leishmania)信号和保留序列融合至唾液酸转移酶的N末端。在其它实施方式中，未将利什曼虫(Leishmania)信号和保留序列融合至唾液酸转移酶的C末端。
在其它实施方式中，将利什曼虫(Leishmania)信号和保留序列融合至唾液酸转移酶的多肽内的一个或多个氨基酸。
在另一个实施方式中，所述保留序列将N-乙酰氨基葡萄糖转移酶和/或半乳糖基转移酶保留在宿主细胞的内质网中。在另一个实施方式中，所述保留序列将N-乙酰氨基葡萄糖转移酶和/或半乳糖基转移酶保留在宿主细胞的高尔基体区室的顺面膜囊中。在另一个实施方式中，所述保留序列将N-乙酰氨基葡萄糖转移酶和/或半乳糖基转移酶保留在宿主细胞的高尔基体区室的中间膜囊中。在另一个实施方式中，所述保留序列将半乳糖基转移酶保留在宿主细胞的高尔基体区室的反面膜囊中。在另一个实施方式中，所述保留序列将唾液酸转移酶保留在宿主细胞的高尔基体区室的反面膜囊中。在另一个实施方式中，所述保留序列将唾液酸转移酶和半乳糖基转移酶保留在宿主细胞的高尔基体区室的反面膜囊中。
在另一个实施方式中，所述信号序列和/或保留序列是来源于任何利什曼虫
(Leishmania)的种的信号序列或保留序列。在其它实施方式中，所述信号序列和/或保留序列是来源于蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)的信号序列或保留序列。
在其它实施方式中，所述保留序列是来源于蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)蛋白的胞质-跨膜-干(CTS)序列。在另一个实施方式中，CTS序列来源于蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)MAN1、NTPDase 1或NTPDase 2。在另一个实施方式中，CTS序列包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26所示的序列或其功能活性片段。
在另一个实施方式中，所述CTS来源于蜥蜴利什曼虫(Leishmaniatarentolae)MAN1。在另一个实施方式中，所述CTS序列包含SEQ ID NO：24所示的序列或其功能活性片段。在其它实施方式中，所述CTS序列与来源于蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)MAN1的CTS具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％的同一性。在另一个实施方式中，所述CTS序列包含与SEQ ID NO：24所示的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％的同一性的序列或其功能活性片段。
在另一个实施方式中，所述CTS来源于蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)
NTPDase 1。在另一个实施方式中，所述CTS序列包含SEQ ID NO：25所示的序列或其功能活性片段。在其它实施方式中，所述CTS序列与来源于蜥蜴利什曼虫(Leishmania
tarentolae)NTPDase 1的CTS具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在另一个实施方式中，所述CTS序列包含与SEQ ID NO：25所示的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、
77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的序列或其功能活性片段。
在另一个实施方式中，所述CTS来源于蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)
NTPDase 2。在另一个实施方式中，所述CTS序列包含SEQ ID NO：26所示的序列或其功能活性片段。在其它实施方式中，所述CTS序列与来源于蜥蜴利什曼虫(Leishmania
tarentolae)NTPDase 2的CTS具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在另一个实施方式中，所述CTS序列包含与SEQ ID NO：26所示的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、
77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的序列或其功能活性片段。
在其它实施方式中，所述保留序列包含来源于利什曼虫(Leishmania)的GRIP序列或其功能活性片段。在另一个实施方式中，所述GRIP序列包含SEQ ID NO：27的序列或其功能活性片段。在其它实施方式中，所述保留序列与来源于利什曼虫(Leishmania)的GRIP序列或其功能活性片段具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在另一个实施方式中，所述GRIP序列包含与SEQ ID NO：27所示的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、
79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的序列或其功能活性片段。
在其它实施方式中，所述保留序列包含来源于利什曼虫(Leishmania)蛋白的CTS序列或其功能活性片段，和来源于利什曼虫(Leishmania)的GRIP序列或其功能活性片段。在另一个实施方式中，所述保留序列包含与来源于利什曼虫(Leishmania)蛋白的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％的同一性的CTS序列或其功能活性片段，和与来源于利什曼虫(Leishmania)的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％的同一性的GRIP序列或其功能活性片段。
在另一个实施方式中，所述靶标蛋白已工程化以包含来自利什曼虫(Leishmania)的信号序列。在其它实施方式中，所述信号序列是来自蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)的信号序列。在一些实施方式中，所述信号序列包含SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29所示的序列或其功能活性片段。在具体的实施方式中，所述信号序列包含SEQ ID NO：28所示的序列或其功能活性片段。在另一个实施方式中，所述信号序列包含与SEQ ID NO：28所示的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％的同一性的序列或其功能活性片段。在其它实施方式中，加工所述信号序列并将其从所述靶标蛋白中除去。
7.3N-乙酰氨基葡萄糖转移酶
在具体的实施方式中，本文提供了杂交的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶，其中所述杂交的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶包含(a)非来自利什曼虫(Leishmania)的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的催化域；和(b)负责在利什曼虫(Leishmania)的内质网中或者在高尔基体区室中定位和保留的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述杂交的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶来自蜥蜴利什曼虫
(Leishmania tarentolae)。
在其它实施方式中，所述杂交的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶已工程化以包含信号序列和至少一种保留序列，其中所述信号序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶靶向蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)宿主细胞的内质网，并且其中所述保留序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶保留在内质网或高尔基体中。
在另一个实施方式中，所述杂交的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶保留在内质网中。在另一个实施方式中，所述杂交的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶保留在高尔基体顺面膜囊中。在另一个实施方式中，所述杂交的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶保留在高尔基体中间膜囊中。
在其它实施方式中，所述保留序列是胞质-跨膜-干(CTS)序列。在另一个实施方式中，CTS序列包含MAN1、NTPDase 1或NTPDase 2的氨基酸序列。在另一个实施方式中，CTS序列包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26所示的序列或其功能活性片段。在另一个实施方式中，所述CTS包含MAN1的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述CTS序列包含SEQ ID NO：24所示的序列或其功能活性片段。在其它实施方式中，所述GRIP序列包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是GnT-I。在另一个实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是GnT-II。在另一个实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是GnT-I和GnT-II。在某些其它实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶来源于表9所列的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶或其功能同源物、同工型或变体。可以根据本文所述的宿主细胞和方法使用本领域中已知的任何N-乙酰氨基葡萄糖转移酶或编码它的核酸。
在具体的实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是智人(Homo sapiens)的N-乙酰葡糖氨基转移酶1。在另一个实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是智人(Homo sapiens)的甘露糖基(α-1,6-)-糖蛋白β-1,2-N-乙酰葡糖氨基转移酶。在某些实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是与智人(Homo sapiens)的种的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶同源的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶。例如，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶或编码它的核酸与智人(Homo sapiens)的N-乙酰葡糖氨基转移酶1或者甘露糖基(α-1,6-)-糖蛋白β-1,2-N-乙酰葡糖氨基转移酶约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是草地贪夜蛾(Spodoptera
frugiperda)的N-乙酰葡糖氨基转移酶1。在另一个实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的N-乙酰葡糖氨基转移酶2。在某些实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是与草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的种的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶同源的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶。例如，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶或编码它的核酸与草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的N-乙酰葡糖氨基转移酶1或者N-乙酰葡糖氨基转移酶2约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是布氏锥虫(Trypanosoma
brucei)的N-乙酰葡糖氨基转移酶1。在另一个实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是布氏锥虫(Trypanosoma brucei)的N-乙酰葡糖氨基转移酶2。在某些实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是与布氏锥虫(Trypanosoma brucei)的种的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶同源的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶。例如，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶或编码它的核酸与布氏锥虫(Trypanosoma brucei)的N-乙酰葡糖氨基转移酶1或者N-乙酰葡糖氨基转移酶2约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是褐家鼠(Rattus norvegicus)的N-乙酰葡糖氨基转移酶2。在某些实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是与褐家鼠(Rattus norvegicus)的种的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶同源的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶。
例如，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶或编码它的核酸与褐家鼠(Rattus norvegicus)的N-乙酰葡糖氨基转移酶2约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是倭黑猩猩(Pan paniscus)的甘露糖基(α-1,6-)-糖蛋白β-1,2-N-乙酰葡糖氨基转移酶。在某些实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是与倭黑猩猩(Pan paniscus)的种的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶同源的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶。例如，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶或编码它的核酸与倭黑猩猩(Pan paniscus)的甘露糖基(α-1,6-)-糖蛋白β-1,2-N-乙酰葡糖氨基转移酶约70％、75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是家犬(Canis lupus
familiaris)的甘露糖基(α-1,6-)-糖蛋白β-1,2-N-乙酰葡糖氨基转移酶。在某些实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是与家犬(Canis lupus familiaris)的种的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶同源的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶。例如，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶或编码它的核酸与家犬(Canis lupus familiaris)的甘露糖基(α-1,6-)-糖蛋白β-1,2-N-乙酰葡糖氨基转移酶约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是黄牛(Bos taurus)的甘露糖基(α-1,6-)-糖蛋白β-1,2-N-乙酰葡糖氨基转移酶。在某些实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是与黄牛(Bos taurus)的种的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶同源的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶。例如，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶或编码它的核酸与黄牛(Bos taurus)的甘露糖基(α-1,6-)-糖蛋白β-1,2-N-乙酰葡糖氨基转移酶约70％、75％、80％、85％、90％、
95％、96％、97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是小家鼠(Mus musculus)的甘露糖苷乙酰葡糖氨基转移酶2。在某些实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是与小家鼠(Mus musculus)的种的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶同源的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶。例如，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶或编码它的核酸与小家鼠(Mus musculus)的甘露糖苷乙酰葡糖氨基转移酶2约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是褐家鼠(Rattus norvegicus)的甘露糖基(α-1,6-)-糖蛋白β-1,2-N-乙酰葡糖氨基转移酶。在某些实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是与褐家鼠(Rattus norvegicus)的种的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶同源的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶。例如，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶或编码它的核酸与褐家鼠(Rattus norvegicus)的甘露糖基(α-1,6-)-糖蛋白β-1,2-N-乙酰葡糖氨基转移酶约
70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是原鸡(Gallus gallus)的甘露糖基(α-1,6-)-糖蛋白β-1,2-N-乙酰葡糖氨基转移酶。在某些实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是与原鸡(Gallus gallus)的种的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶同源的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶。例如，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶或编码它的核酸与原鸡(Gallus gallus)的甘露糖基(α-1,6-)-糖蛋白β-1,2-N-乙酰葡糖氨基转移酶约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是热带爪蟾(Xenopus
tropicalis)的甘露糖基(α-1,6-)-糖蛋白β-1,2-N-乙酰葡糖氨基转移酶。在某些实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是与热带爪蟾(Xenopus tropicalis)的种的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶同源的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶。例如，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶或编码它的核酸与热带爪蟾(Xenopus tropicalis)的甘露糖基(α-1,6-)-糖蛋白β-1,2-N-乙酰葡糖氨基转移酶约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是斑马鱼(Danio rerio)的甘露糖基(α-1,6-)-糖蛋白β-1,2-N-乙酰葡糖氨基转移酶。在某些实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是与斑马鱼(Danio rerio)的种的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶同源的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶。例如，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶或编码它的核酸与斑马鱼(Danio rerio)的甘露糖基(α-1,6-)-糖蛋白β-1,2-N-乙酰葡糖氨基转移酶约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
在某些实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是冈比亚按蚊(Anopheles
gambiae)的AgaP_AGAP004397(GI：1274542)。在某些实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是与冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)的种的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶同源的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶。例如，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶或编码它的核酸与冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)的AgaP_AGAP004397(GI：1274542)约70％、75％、80％、85％、90％、
95％、96％、97％、98％或99％同源。
在某些实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的AgaP_AGAP004397(GI：1274542)。在某些实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是与冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)的种的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶同源的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶。例如，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶或编码它的核酸与冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)的AgaP_AGAP004397(GI：1274542)约70％、75％、80％、85％、90％、
95％、96％、97％、98％或99％同源。
在某些实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的gly-20(GI：179562)。在某些实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是与秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的种的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶同源的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶。例如，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶或编码它的核酸与秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的gly-20(GI：179562)约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％或99％同源。
在某些实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是拟南芥(Arabidopsis thaliana)的β-1,2-N-乙酰葡糖氨基转移酶II。在某些实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是与拟南芥(Arabidopsis thaliana)的种的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶同源的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶。例如，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶或编码它的核酸与拟南芥(Arabidopsis thaliana)的glyβ-1,2-N-乙酰葡糖氨基转移酶II约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％或99％同源。
在某些实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的gly-20(GI：179562)。在某些实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是与秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的种的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶同源的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶。例如，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶或编码它的核酸与秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的gly-20(GI：179562)约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％或99％同源。
在某些实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是壁虎(Gekko japonicus)的所预测的α-1,3-甘露糖基-糖蛋白2-β-N-乙酰葡糖氨基转移酶(XP_015280466.1)。在某些实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是与壁虎(Gekko japonicus)的种的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶同源的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶。例如，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶或编码它的核酸与壁虎(Gekko japonicus)的XP_015280466.1约70％、75％、80％、85％、90％、
95％、96％、97％、98％或99％同源。
在其它实施方式中，本文提供了编码杂交的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的核酸。
7.4半乳糖基转移酶
在具体的实施方式中，本文提供了杂交的半乳糖基转移酶，其中所述杂交的半乳糖基转移酶包含(a)非来自利什曼虫(Leishmania)的半乳糖基转移酶的催化域；和(b)负责在利什曼虫(Leishmania)的内质网或高尔基体区室中定位和保留的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，所述杂交的半乳糖基转移酶来自蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)。
在其它实施方式中，所述杂交的半乳糖基转移酶已工程化以包含信号序列，其中所述信号序列将所述半乳糖基转移酶靶向蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)宿主细胞的内质网，并且其中所述保留序列将所述半乳糖基转移酶保留在内质网或高尔基体中。
在某些实施方式中，所述杂交的半乳糖基转移酶将所述半乳糖基转移酶保留在内质网中。在某些实施方式中，所述杂交的半乳糖基转移酶将所述半乳糖基转移酶保留在高尔基体顺面膜囊中。在另一个实施方式中，所述杂交的半乳糖基转移酶将所述半乳糖基转移酶保留在高尔基体中间膜囊中。在另一个实施方式中，所述杂交的半乳糖基转移酶将所述半乳糖基转移酶保留在高尔基体反面膜囊中。
在其它实施方式中，所述保留序列是胞质-跨膜-干(CTS)序列。在其它实施方式中，所述杂交的半乳糖基转移酶是GRIP序列。在某些实施方式中，所述杂交的半乳糖基转移酶是CTS序列和GRIP序列。在另一个实施方式中，CTS序列包含MAN1、NTPDase 1或NTPDase 2的氨基酸序列。在另一个实施方式中，CTS序列包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：
26所示的序列或其功能活性片段。在另一个实施方式中，所述CTS包含MAN1的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，所述CTS序列包含SEQ ID NO：24所示的序列或其功能活性片段。在其它实施方式中，所述GRIP序列包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列。
在其它实施方式中，所述半乳糖基转移酶来源于表9所列的半乳糖基转移酶或其功能同源物、同工型或变体。可以根据本文所述的宿主细胞和方法使用本领域中已知的任何半乳糖基转移酶或编码它的核酸。
在具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶是智人(Homo sapiens)的β-1,4-半乳糖基转移酶1(B4GALT1)。在某些实施方式中，所述半乳糖基转移酶是与智人(Homo sapiens)的种的半乳糖基转移酶同源的半乳糖基转移酶。例如，所述半乳糖基转移酶或编码它的核酸与智人(Homo sapiens)的β-1,4-半乳糖基转移酶1约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶是黑猩猩(Pan troglodyte)的β-1,4-半乳糖基转移酶1。在某些实施方式中，所述半乳糖基转移酶是与黑猩猩(Pan troglodyte)的种的半乳糖基转移酶同源的半乳糖基转移酶。例如，所述半乳糖基转移酶或编码它的核酸与黑猩猩(Pan troglodyte)的β-1,4-半乳糖基转移酶1约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶是恒河猴(Macaca mulatta)的β-1,4-半乳糖基转移酶1。在某些实施方式中，所述半乳糖基转移酶是与恒河猴(Macaca mulatta)的种的半乳糖基转移酶同源的半乳糖基转移酶。例如，所述半乳糖基转移酶或编码它的核酸与恒河猴(Macaca mulatta)的β-1,4-半乳糖基转移酶1约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶是家犬(Canis lupus familiaris)的β-1,
4-半乳糖基转移酶1。在某些实施方式中，所述半乳糖基转移酶是与家犬(Canis lupus familiaris)的种的半乳糖基转移酶同源的半乳糖基转移酶。例如，所述半乳糖基转移酶或编码它的核酸与家犬(Canis lupus familiaris)的β-1,4-半乳糖基转移酶1约70％、75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶是黄牛(Bos taurus)的β-1,4-半乳糖基转移酶1。在某些实施方式中，所述半乳糖基转移酶是与黄牛(Bos taurus)的种的半乳糖基转移酶同源的半乳糖基转移酶。例如，所述半乳糖基转移酶或编码它的核酸与黄牛(Bos taurus)的β-1,4-半乳糖基转移酶1约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶是小家鼠(Mus musculus)的β-1,4-半乳糖基转移酶1。在某些实施方式中，所述半乳糖基转移酶是与小家鼠(Mus musculus)的种的半乳糖基转移酶同源的半乳糖基转移酶。例如，所述半乳糖基转移酶或编码它的核酸与小家鼠(Mus musculus)的β-1,4-半乳糖基转移酶1约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶是褐家鼠(Rattus norvegicus)的β-1,4-半乳糖基转移酶1。在某些实施方式中，所述半乳糖基转移酶是与褐家鼠(Rattus norvegicus)的种的半乳糖基转移酶同源的半乳糖基转移酶。例如，所述半乳糖基转移酶或编码它的核酸与褐家鼠(Rattus norvegicus)的β-1,4-半乳糖基转移酶1约70％、75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶是原鸡(Gallus gallus)的β-1,4-半乳糖基转移酶1。在某些实施方式中，所述半乳糖基转移酶是与原鸡(Gallus gallus)的种的半乳糖基转移酶同源的半乳糖基转移酶。例如，所述半乳糖基转移酶或编码它的核酸与原鸡(Gallus gallus)的β-1,4-半乳糖基转移酶1约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶是热带爪蟾(Xenopus tropicalis)的β-1,
4-半乳糖基转移酶1。在某些实施方式中，所述半乳糖基转移酶是与热带爪蟾(Xenopus tropicalis)的种的半乳糖基转移酶同源的半乳糖基转移酶。例如，所述半乳糖基转移酶或编码它的核酸与热带爪蟾(Xenopus tropicalis)的β-1,4-半乳糖基转移酶1约70％、75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述半乳糖基转移酶是斑马鱼(Danio rerio)的β-1,4-半乳糖基转移酶1。在某些实施方式中，所述半乳糖基转移酶是与斑马鱼(Danio rerio)的种的半乳糖基转移酶同源的半乳糖基转移酶。例如，所述半乳糖基转移酶或编码它的核酸与斑马鱼(Danio rerio)的β-1,4-半乳糖基转移酶1约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％或99％同源。
在其它实施方式中，本文提供了编码杂交的半乳糖基转移酶的核酸。
7.5唾液酸转移酶
在具体的实施方式中，本文提供了杂交的唾液酸转移酶，其中所述杂交的唾液酸转移酶包含(a)非来自利什曼虫(Leishmania)的唾液酸转移酶的催化域；和(b)负责在利什曼虫(Leishmania)的内质网或高尔基体区室中定位和保留的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，所述杂交的唾液酸转移酶来自蜥蜴利什曼虫(Leishmania
tarentolae)。
在某些实施方式中，所述杂交的唾液酸转移酶已工程化以包含信号序列，其中所述信号序列将所述唾液酸转移酶靶向蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)宿主细胞的内质网，并且其中所述保留序列将所述唾液酸转移酶保留在内质网或高尔基体中。在另一个实施方式中，所述杂交的唾液酸转移酶将所述唾液酸转移酶保留在高尔基体反面膜囊中。
在另一个实施方式中，所述保留序列是CTS序列。在其它实施方式中，所述保留序列是GRIP序列。在其它实施方式中，所述保留序列是CTS序列和GRIP序列。在另一个实施方式中，CTS序列包含MAN1、NTPDase 1或NTPDase 2的氨基酸序列。在另一个实施方式中，CTS序列包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26所示的序列或其功能活性片段。在另一个实施方式中，所述CTS包含MAN1的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述CTS序列包含SEQ ID NO：24所示的序列或其功能活性片段。在另一个实施方式中，所述GRIP序列包含SEQ ID NO：27的序列或其功能活性片段。
在另一个实施方式中，所述唾液酸转移酶是2,6-SiaT或者2,3-SiaT。在某些其它实施方式中，所述杂交的唾液酸转移酶来源于表9所列的唾液酸转移酶或其功能同源物、同工型或变体。可以根据本文所述的方法使用能够将一个或多个唾液酸残基添加至N-糖基化共有序列(例如，Asn-X-Ser(Thr)，其中X可以是除Pro之外的任何氨基酸)中与连接至Asn残基(或者其它相关残基)的N-聚糖相连的单糖(例如，半乳糖)的任何唾液酸转移酶或编码它的核酸，例如，可以将其引入本文所述的宿主细胞。可以根据本文所述的宿主细胞和方法使用本领域中已知的任何唾液酸转移酶或编码它的核酸。
在具体的实施方式中，所述唾液酸转移酶是智人(Homo sapiens)的β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1。在另一个具体的实施方式中，所述唾液酸转移酶是智人(Homo sapiens)的β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶4。在某些实施方式中，所述唾液酸转移酶是与智人(Homo sapiens)的唾液酸转移酶同源的唾液酸转移酶。例如，所述唾液酸转移酶或编码它的核酸与智人(Homo sapiens)的β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1或者β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶4约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述唾液酸转移酶是小家鼠(Mus musculus)的β-半乳糖苷α-2,
6-唾液酸转移酶1。在另一个具体的实施方式中，所述唾液酸转移酶是小家鼠(Mus musculus)的β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶3。在某些实施方式中，所述唾液酸转移酶是与小家鼠(Mus musculus)的唾液酸转移酶同源的唾液酸转移酶。例如，所述唾液酸转移酶或编码它的核酸与小家鼠(Mus musculus)的β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1或者β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶3约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述唾液酸转移酶是褐家鼠(Rattus norvegicus)的β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1。在某些实施方式中，所述唾液酸转移酶是与褐家鼠(Rattus norvegicus)的种的唾液酸转移酶同源的唾液酸转移酶。例如，所述唾液酸转移酶或编码它的核酸与褐家鼠(Rattus norvegicus)的β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1约70％、75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述唾液酸转移酶是空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)的α-
2,3-唾液酸转移酶。在某些实施方式中，所述唾液酸转移酶是与空肠弯曲菌
(Campylobacter jejuni)的种的唾液酸转移酶同源的唾液酸转移酶。例如，所述唾液酸转移酶或编码它的核酸与空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)的α-2,3-唾液酸转移酶约
70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述唾液酸转移酶是空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)的α-
2,3/8-唾液酸转移酶。在某些实施方式中，所述唾液酸转移酶是与空肠弯曲菌
(Campylobacter jejuni)的种的唾液酸转移酶同源的唾液酸转移酶。例如，所述唾液酸转移酶或编码它的核酸与空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)的α-2,3/8-唾液酸转移酶约
70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述唾液酸转移酶是多杀杆菌(Pasteurella multocida)的α-
2,3/2,6-唾液酸转移酶(AAY89061.1)。在某些实施方式中，所述唾液酸转移酶是与多杀杆菌(Pasteurella multocida)的种的唾液酸转移酶同源的唾液酸转移酶。例如，所述唾液酸转移酶或编码它的核酸与多杀杆菌(Pasteurella multocida)的α-2,3/2,6-唾液酸转移酶约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述唾液酸转移酶是美人鱼发光杆菌(Photobacterium
damselae)的α-2,6-唾液酸转移酶(BAA25316.1)。在某些实施方式中，所述唾液酸转移酶是与美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)的种的唾液酸转移酶同源的唾液酸转移酶。例如，所述唾液酸转移酶或编码它的核酸与美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)的α-2,6-唾液酸转移酶约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或
99％同源。
在具体的实施方式中，所述唾液酸转移酶是美人鱼发光杆菌(Photobacterium
damselae)的假想α-2,6-唾液酸转移酶(WP_005298232.1)。在某些实施方式中，所述唾液酸转移酶是与美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)的种的唾液酸转移酶同源的唾液酸转移酶。例如，所述唾液酸转移酶或编码它的核酸与美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)的α-2,6-唾液酸转移酶约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或
99％同源。
在具体的实施方式中，所述唾液酸转移酶是鳆发光杆菌(Photobacterium
leiognathi)的假想α-2,6-唾液酸转移酶(BAF91416.1)。在某些实施方式中，所述唾液酸转移酶是与鳆发光杆菌(Photobacterium leiognathi)的种的唾液酸转移酶同源的唾液酸转移酶。例如，所述唾液酸转移酶或编码它的核酸与鳆发光杆菌(Photobacterium
leiognathi)的α-2,6-唾液酸转移酶约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述唾液酸转移酶是鳆发光杆菌(Photobacterium
leiognathi)的假想α-2,6-唾液酸转移酶(BAI49484.1)。在某些实施方式中，所述唾液酸转移酶是与鳆发光杆菌(Photobacterium leiognathi)的种的唾液酸转移酶同源的唾液酸转移酶。例如，所述唾液酸转移酶或编码它的核酸与鳆发光杆菌(Photobacterium
leiognathi)的α-2,6-唾液酸转移酶约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述唾液酸转移酶是发光杆菌种(photobacterium sp.)的假想α-2,6-唾液酸转移酶(BAF92026.1)。在某些实施方式中，所述唾液酸转移酶是与发光杆菌种(photobacterium sp.)的种的唾液酸转移酶同源的唾液酸转移酶。例如，所述唾液酸转移酶或编码它的核酸与发光杆菌种(Photobacterium sp.)的α-2,6-唾液酸转移酶约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
在某些实施方式中，本文提供了编码杂交的唾液酸转移酶的核酸。
7.6CMP-Sia生物合成途径
在其它实施方式中，包含异源唾液酸转移酶的宿主细胞还包含能够产生CMP-NeuAc的异源CMP-Sia生物合成途径蛋白。
在其它实施方式中，所述能够产生CMP-NeuAc的CMP-Sia生物合成途径蛋白与表11所列的CMP-Sia生物合成途径蛋白至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、
79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一或是其任何功能同源物、同工型或变体。可以根据本文所述的宿主细胞和方法使用本领域中已知的任何唾液酸生物合成酶或编码它的核酸。
在具体的实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是小家鼠(Mus musculus)的UDP-GlcNAc
2-表异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶。在另一个实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是小家鼠(Mus musculus)的CMP-唾液酸转运蛋白。在某些实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是与小家鼠(Mus musculus)的种的唾液酸生物合成酶同源的唾液酸生物合成酶。例如，所述唾液酸生物合成酶或编码它的核酸与小家鼠(Mus musculus)的UDP-GlcNAc 2-表异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶或者CMP-唾液酸转运蛋白约70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，
97％，98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是智人(Homo sapiens)的UDP-N-GlcNAc
2-表异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶。在具体的实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是智人(Homo sapiens)的N-乙酰神经氨酸磷酸合酶。在另一个实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是智人(Homo sapiens)的Neu5Ac-9-P磷酸酶。在具体的实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是智人(Homo sapiens)的CMP-唾液酸合成酶。在其它实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是智人(Homo sapiens)的CMP-Neu5Ac转运蛋白。在某些实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是与智人(Homo sapiens)的种的唾液酸生物合成酶同源的唾液酸生物合成酶。例如，所述唾液酸生物合成酶或编码它的核酸与智人(Homo sapiens)的UDP-N-GlcNAc 2-表异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶、N-乙酰神经氨酸磷酸合酶、Neu5Ac-9-P磷酸酶、CMP-唾液酸合成酶或者CMP-Neu5Ac转运蛋白约70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或
99％同源。
在具体的实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是褐家鼠(Rattus norvegicus)的UDP-N-GlcNAc 2-表异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶。在某些实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是与褐家鼠(Rattus norvegicus)的种的唾液酸生物合成酶同源的唾液酸生物合成酶。例如，所述唾液酸生物合成酶或编码它的核酸与褐家鼠(Rattus norvegicus)的UDP-N-GlcNAc 2-表异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶约70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，
97％，98％或99％同源。在其它实施方式中，所述褐家鼠(Rattus norvegicus)的UDP-N-GlcNAc 2-表异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶具有来自涎尿患者的GNE/MNK的点突变(Son等人,2011)。
在具体的实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria
meningitidis)的CMP-唾液酸合成酶。在另一个实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-表异构酶。在具体的实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的CMP-唾液酸合酶。在某些实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是与脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的种的唾液酸生物合成酶同源的唾液酸生物合成酶。例如，所述唾液酸生物合成酶或编码它的核酸与脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的CMP-唾液酸合成酶、UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-表异构酶或CMP-唾液酸合酶约70％，75％，80％，85％，90％，
95％，96％，97％，98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是大肠杆菌(Escherichia coli)K1的CMP-唾液酸合成酶。在另一个实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是大肠杆菌
(Escherichia coli)K1的UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-表异构酶。在具体的实施方式中，所述唾液酸生物合酶是大肠杆菌(Escherichia coli)K1的CMP-唾液酸合酶。在某些实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是与大肠杆菌(Escherichia coli)K1的种的唾液酸生物合成酶同源的唾液酸生物合成酶。例如，所述唾液酸生物合成酶或编码它的核酸与大肠杆菌(Escherichia coli)K1的CMP-唾液酸合成酶、UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-表异构酶或CMP-唾液酸合酶约70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)的GNPE，N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸2'-表异构酶(CAM09378.1)。在另一个实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)的N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸2'-表异构酶。在具体的实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)的N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸2'-表异构酶合酶。在某些实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是与N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸2'-表异构酶种类的唾液酸生物合成酶同源的唾液酸生物合成酶。例如，所述唾液酸生物合成酶或编码它的核酸与空肠弯曲菌
(Campylobacter jejuni)的N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸2'-表异构酶约70％，75％，80％，
85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria
meningitidis)的GNPE，N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸2'-表异构酶(AAY27727.1)。在另一个实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸2'-表异构酶。在具体的实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸2'-表异构酶合酶。在某些实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是与空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)的唾液酸生物合成酶同源的唾液酸生物合成酶。例如，所述唾液酸生物合成酶或编码它的核酸与脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸2'-表异构酶约70％，75％，
80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同源。
在具体的实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是CgNal，乳发酵短杆菌
(Corynebacterium glutamicum)的N-乙酰神经氨酸裂解酶(NP_601846.1)。在另一个实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是CgNal，乳发酵短杆菌(Corynebacterium glutamicum)的N-乙酰神经氨酸裂解酶。在具体的实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是CgNal，乳发酵短杆菌(Corynebacterium glutamicum)的N-乙酰神经氨酸裂解酶。在某些实施方式中，所述唾液酸生物合成酶是与CgNal，N-乙酰神经氨酸裂解酶的种的唾液酸生物合成酶同源的唾液酸生物合成酶。例如，所述唾液酸生物合成酶或编码它的核酸与乳发酵短杆菌
(Corynebacterium glutamicum)的CgNal，N-乙酰神经氨酸裂解酶约70％，75％，80％，
85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同源(Ji等人,2015)。
7.7利什曼虫(Leishmania)和动质体株
如本文所使用的，所述宿主细胞是利什曼虫(Leishmania)细胞。在某些实施方式中，所述宿主细胞是蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)细胞。在其它实施方式中，所述宿主细胞是来自表13的利什曼虫(Leishmania)的株。
在某些实施方式中，所述宿主细胞是埃塞俄比亚利什曼虫(Leishmania aethiopica)细胞。在某些实施方式中，所述宿主细胞是埃塞俄比亚利什曼虫(Leishmania aethiopica)复合种的一部分。在某些实施方式中，所述宿主细胞是aristidesi利什曼虫(Leishmania aristidesi)细胞。在某些实施方式中，所述宿主细胞是deanei利什曼虫(Leishmania deanei)细胞。在某些实施方式中，所述宿主细胞是杜氏利什曼虫(Leishmania donovani)复合种的一部分。在某些实施方式中，所述宿主细胞是杜氏利什曼虫(Leishmania donovani)细胞。在某些实施方式中，所述宿主细胞是恰氏利什曼虫(Leishmania chagasi)细胞。在某些实施方式中，所述宿主细胞是婴儿利什曼虫(Leishmania infantum)细胞。在某些实施方式中，所述宿主细胞是赫氏利什曼虫(Leishmania hertigi)细胞。在某些实施方式中，所述宿主细胞是硕大利什曼虫(Leishmania major)复合种的一部分。在某些实施方式中，所述宿主细胞是硕大利什曼虫(Leishmania major)细胞。在某些实施方式中，所述宿主细胞是martiniquensis利什曼虫(Leishmania martiniquensis)细胞。在某些实施方式中，所述宿主细胞是墨西哥利什曼虫(Leishmania mexicana)复合种的一部分。在某些实施方式中，所述宿主细胞是墨西哥利什曼虫(Leishmania mexicana)细胞。在某些实施方式中，所述宿主细胞是帕氏利什曼虫(Leishmania pifanoi)细胞。在某些实施方式中，所述宿主细胞是热带利什曼虫(Leishmania tropica)复合种的一部分。在某些实施方式中，所述宿主细胞是热带利什曼虫(Leishmania tropica)细胞。
在某些实施方式中，所述宿主细胞属于动质体的波豆虫科(bodonidae family)。在具体的实施方式中，所述宿主细胞是舞行波豆虫(Bodo saltans)细胞。在某些实施方式中，所述宿主细胞属于动质体的ichthyobodonidae科。在某些实施方式中，所述宿主细胞属于动质体的锥虫科(trypanosomatidae family)。
在某些实施方式中，所述宿主细胞属于锥虫科的芽短膜虫属(blastocrithidia
family)。在某些实施方式中，所述宿主细胞属于锥虫科的blechomonas属(blechomonas family)。在某些实施方式中，所述宿主细胞属于锥虫科的匐滴虫属(herpetomonas family)。在某些实施方式中，所述宿主细胞属于锥虫科的jaenimonas属(jaenimonas family)。在某些实施方式中，所述宿主细胞属于锥虫科的lafontella属(lafontella family)。在某些实施方式中，所述宿主细胞属于锥虫科的leishmaniinae属
(leishmaniinae family)。在某些实施方式中，所述宿主细胞属于锥虫科的novymonas属(novymonas family)。在某些实施方式中，所述宿主细胞属于锥虫科的paratrypanosoma属(paratrypanosoma family)。在某些实施方式中，所述宿主细胞属于锥虫科的植物单胞菌属(phytomonas family)。在某些实施方式中，所述宿主细胞属于锥虫科的sergeia属(sergeia family)。在某些实施方式中，所述宿主细胞属于锥虫科的strigomonadinae属(strigomonadinae family)。在某些实施方式中，所述宿主细胞属于锥虫科的锥虫属(trypanosoma family)。在某些实施方式中，所述宿主细胞属于锥虫科的wallacemonas属(wallacemonas family)。在某些实施方式中，所述宿主细胞属于锥虫科的芽短膜虫属(blastocrithidia family)。
7.8其它工程化利什曼虫(Leishmania)宿主细胞
在某些实施方式中，将用于本文的宿主细胞工程化以包含异源核酸，例如，编码一种或多种载体蛋白的异源核酸和/或编码一种或多种蛋白的异源核酸，例如，编码一种或多种蛋白的基因。在另一个具体的实施方式中，使用本文所提供的插入方法将异源核酸引入本文所述的宿主细胞。
在某些实施方式中，可以将其它修饰引入(例如，使用重组技术)本文所述的宿主细胞。
例如，可以以使它们失活/无功能的方式(即，无论如何，缺失/修饰的宿主细胞核酸不编码功能蛋白或者不编码蛋白)，在宿主细胞背景(基因组)中使编码构成可能竞争或干扰糖基化途径(例如，竞争或干扰参与重组引入宿主细胞的糖基化的一种或多种异源基因)的一部分的蛋白的宿主细胞核酸(例如，基因)缺失或修饰。在某些实施方式中，当使核酸从本文所提供的宿主细胞的基因组中缺失时，它们被所期望的序列，例如，用于糖蛋白产生的序列替换。这种替换可以通过本文所述的一种或多种插入方法，其中插入宿主细胞的异源插入DNA可以替换从所述宿主细胞中缺失的基因的功能。
在某些实施方式中，本文所提供的宿主细胞包含基因缺失，其中所关心的DNA序列已在基因缺失位点插入宿主细胞基因组。在具体的实施方式中，本文所提供的宿主细胞是具有基因缺失的利什曼虫(Leishmania)。
7.9核酸向宿主细胞的引入
本领域中已知的任何方法可以用于将核酸(例如，其基因片段)引入宿主细胞，例如，蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)。
在某些实施方式中，使用质粒将异源核酸引入本文所述的宿主细胞，例如，通过质粒(例如，表达载体)在宿主细胞中表达所述异源核酸，并且通过转染、感染或电穿孔、通过热冲击的化学转化、自然转化、噬菌体转导或缀合将质粒引入修饰的宿主细胞。在具体的实施方式中，通过稳定转染将所述质粒引入修饰的宿主细胞。
在具体的实施方式中，使用转染、感染或电穿孔、通过热冲击的化学转化、自然转化、噬菌体转导或缀合将线性化异源核酸引入本文所述的宿主细胞。在其它实施方式中，通过同源重组将异源核酸位点-特异性地整合至宿主细胞基因组。
7.10糖基化靶标蛋白的产生方法
本文提供了用于产生N-糖基化靶标蛋白的方法。
在一个实施方式中，本文提供了使用本文所述的宿主细胞体内产生糖基化靶标蛋白的方法。在具体的实施方式中，本文提供了用于产生糖基化靶标蛋白的方法，所述方法包括(i)在适合于蛋白质产生的条件下培养本文所提供的宿主细胞和(ii)分离所述靶标蛋白。
在具体的实施方式中，所述宿主细胞包含(a)编码靶标蛋白的重组核酸；和(b)编码异源糖基转移酶的重组核酸。在某些实施方式中，所述异源糖基转移酶是N-乙酰氨基葡萄糖转移酶；或者异源半乳糖基转移酶；或者异源唾液酸转移酶。在某些实施方式中，所述宿主细胞是利什曼虫(Leishmania)细胞。
在某些实施方式中，通过所提供的宿主细胞所产生的靶标蛋白是治疗性蛋白，即在疾病或病症的治疗中使用的蛋白。例如，通过本文所提供的宿主细胞产生的靶标蛋白可以是酶、细胞因子或抗体，其中所述靶标蛋白已糖基化，例如，唾液酸化。在以下7.12节中提供了靶标蛋白的非限制性列表。
7.11培养细胞的方法
本文提供了培养宿主细胞的方法。
在一个实施方式中，使用本领域中已知的任何标准培养技术培养宿主细胞。例如，通常使细胞在富集培养基，如脑心浸液、胰蛋白胨大豆肉汤或酵母提取物中生长，其均含有5ug/ml的氯高铁血红素。另外，作为静态或振荡培养，培育在26℃，避光进行2-3d。在一些实施方式中，重组细胞系的培养含有适当的选择试剂。表9中提供了选择试剂的非限制性列表。
7.12靶标蛋白
根据本文所述的方法，本领域中已知的任何蛋白(或者对应于蛋白的肽/多肽)可以用作靶标蛋白。本领域技术人员将容易地理解可以使用本领域中已知的方法容易地推出已知蛋白以及新鉴别的蛋白的核酸序列，并因此将编码任何所关心的蛋白的核酸引入本文所提供的宿主细胞(例如，通过表达载体，例如，质粒，例如，通过同源重组的位点特异性整合)将很好地处于本领域技术人员的能力之内。
在其它实施方式中，所述靶标蛋白包含以下的氨基酸序列：人干扰素-α(INF-α)、干扰素-β(INF-β)、干扰素-γ(INF-γ)、白介素-2(IL2)、嵌合白喉毒素-IL-2(地尼白介素-毒素连接物(Denileukin diftitox))、白介素-1(IL1)、IL1B、IL3、IL4、IL11、IL21、IL22、IL1受体拮抗剂(阿那白滞素)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、胰岛素、普兰林肽、生长激素(GH)、胰岛素样生长因子(IGF1)、人甲状旁腺激素、降钙素、高血糖素-样肽-1激动剂(GLP-1)、高血糖素、生长激素-释放激素(GHRH)、胰泌素、促甲状腺激素(TSH)、人骨形态发生蛋白2(hBMP2)、人骨形态发生蛋白7(hBMP7)、促性腺激素释放激素(GnRH)、角化细胞生长因子(KGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)、成纤维细胞生长因子20(FGF20)、成纤维细胞生长因子21(FGF21)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、神经营养蛋白-3、人促生育素(FSH)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、促黄体素-α、促红细胞生成素、粒性白细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、CTLA4的胞外域(例如，FC-融合蛋白)或者TNF受体的胞外域(例如，FC-融合蛋白)。在具体的实施方式中，根据本文所述的方法和宿主细胞使用的靶标蛋白是酶或抑制剂。可以用作靶标蛋白的示例性的酶和抑制剂无限制地包括凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XIII、凝血因子VIIa、抗凝血酶III(AT-III)、蛋白C、组织纤维蛋白溶酶原活化因子(tPA)和tPA变体、尿激酶、水蛭素、链激酶、葡糖脑苷脂酶、阿葡糖苷酶-α、拉罗尼酶(α-L-艾杜糖醛酸酶)、艾杜硫酶(艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)、加硫酯酶、半乳糖苷酶-β(人α-半乳糖苷酶A)、肉毒毒素、胶原酶、人脱氧核糖核酸酶-I、玻璃酸酶、木瓜蛋白酶、天冬酰胺酶、尿酸酶(尿酸氧化酶)、谷氨酸羧肽酶(谷卡匹酶)、α1蛋白酶抑制剂(α1抗胰蛋白酶)、乳糖酶、胰酶(脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶)和腺苷脱氨酶。
在具体的实施方式中，根据本文所述的方法和宿主细胞使用的靶标蛋白是细胞因子。
可以用作靶标蛋白的示例性细胞因子无限制地包括干扰素-α(INF-α)、干扰素-β(INF-β)、干扰素-γ(INF-γ)、白介素-2(IL2)、嵌合白喉毒素-IL-2(地尼白介素-毒素连接物(Denileukin diftitox))、白介素-1(IL1)、IL1B、IL3、IL4、IL11、IL21、IL22、IL1受体拮抗剂(阿那白滞素)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)。
在具体的实施方式中，根据本文所述的方法和宿主细胞使用的靶标蛋白是激素或生长因子。可以用作靶标蛋白的示例性激素和生长因子无限制地包括胰岛素、普兰林肽、生长激素(GH)、胰岛素样生长因子(IGF1)、人甲状旁腺激素、降钙素、高血糖素-样肽-1激动剂(GLP-1)、高血糖素、生长激素-释放激素(GHRH)、胰泌素、促甲状腺激素(TSH)、人骨形态发生蛋白2(hBMP2)、人骨形态发生蛋白7(hBMP7)、促性腺激素释放激素(GnRH)、角化细胞生长因子(KGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)、成纤维细胞生长因子20(FGF20)、成纤维细胞生长因子21(FGF21)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、神经营养蛋白-3、人促生育素(FSH)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、促黄体素-α、促红细胞生成素、粒性白细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
在具体的实施方式中，根据本文所述的方法和宿主细胞使用的靶标蛋白是受体。可以用作靶标蛋白的示例性受体无限制地包括人CTLA4的胞外域(例如，融合至Fc)和可溶性TNF受体(例如，融合至Fc)。
在其它实施方式中，所述靶标蛋白是治疗性蛋白。在其它实施方式中，所述靶标蛋白是批准的生物药物。在另一个实施方式中，所述治疗性蛋白包含以下的氨基酸序列：阿巴西普(例如，奥瑞希纳)、阿柏西普(例如，艾力亚)、β半乳糖苷酶(例如，Fabrazyme)、阿必鲁泰(例如，Eperzan)、阿地白介素(例如，Proleukin)、阿法西普(例如，阿密凡夫)、阿糖脑苷酶(例如，Ceredase)、α阿葡糖苷酶(例如，LUMIZYME)、阿利吉仑(例如，泰克特纳)、α-1-蛋白酶抑制因子(例如，Aralast)、阿替普酶(例如，Activase)、阿那白滞素(例如，Kineret)、阿尼普酶(例如，Eminase)、人炭疽免疫球蛋白(例如，ANTHRASIL)、抗血友病因子(例如，百因止)、抗抑制剂混凝剂复合物(例如，Feiba Nf)、抗凝血酶α、人抗凝血酶III、抗胸腺细胞球蛋白(例如，抗胸腺细胞球蛋白)、抗-胸腺细胞球蛋白(马)(例如，ATGAM)、抗-胸腺细胞球蛋白(兔)(例如，ATG-Fresenius)、抑肽酶(例如，特斯乐)、Asfotaseα、门冬酰胺酶(例如，爱施巴)、菊疫病欧文氏菌(erwinia chrysanthemi)门冬酰胺酶(例如，Erwinaze)、贝卡普勒明(例如，REGRANEX)、贝拉西普(belatacept)(例如，Nulojix)、贝拉克坦、比伐卢定(例如，Angiomax)、A型肉毒毒素(例如，保妥适 )、B型肉毒毒素(例如，Myobloc)、本妥昔单抗(例如，Adcetris)、布舍瑞林(例如，Suprecur)、C1酯酶抑制剂(人)、C1酯酶抑制剂(重组)(例如，Ruconest)、聚乙二醇结合赛妥珠单抗(Certolizumab pegol)(例如，Cimzia)、绒促性素α(例如，绒促性素α)、绒毛膜促性腺激素(人)(例如，艾泽(Ovidrel))、绒毛膜促性腺激素(重组)(例如，Ovitrelle)、凝血因子ix(例如，Alprolix)、凝血因子VIIa(例如，诺其(NovoSeven))、人凝血因子X(例如，Coagadex)、凝血因子XIIIA-亚基(重组)、胶原酶(例如，Cordase)、Conestatα、促肾上腺皮质激素(例如，H.P.Acthar)、替可克肽(例如，Cortrosyn)、达贝泊汀α(例如，安然爱斯普(Aranesp))、去纤苷(例如，Noravid)、地尼白介素-毒素连接物(denileukin diftitox)(例如，Ontak)、地西卢定、地高辛免疫Fab(羊)(例如，DIGIBIND)、阿法链道酶(例如，百慕时(Pulmozyme))、屈曲可近α(例如，Xigris)、度拉糖肽、艾莫凝血素α(例如，ELOCTA)、依洛硫酸酯酶α、恩夫韦地(例如，FUZEON)、阿法依伯汀(例如，Binocrit)、依泊汀zeta(例如，Retacrit)、依替巴肽(例如，INTEGRILIN)、依那西普(例如，恩利(Enbrel))、艾塞那肽(例如，百泌达(Byetta))、因子IX复合物(人)(例如，AlphaNine)、纤溶酶，也称为胞浆素(例如，Elase)、非格司亭(例如，N.A.)、非格司亭-sndz、促卵泡素α(例如，Gonal-F)、促滤泡素β(例如，Follistim AQ)、加硫酶(例如，Naglazyme)、胃内因子、吉妥珠单抗奥唑米星(例如，麦罗塔)、醋酸格拉替雷(例如，克帕松(Copaxone))、重组高血糖素(例如，诺和生(GlucaGen))、谷卡匹酶(例如，Voraxaze)、短杆菌肽D(例如，新斯波林(Neosporin))、乙型肝炎免疫球蛋白、人降钙素、人破伤风梭菌(clostridium tetani)类毒素免疫球蛋白、人狂犬病病毒免疫球蛋白(例如，Hyperab Rabies人免疫球蛋白)、人Rho(D)免疫球蛋白(例如，Hyp Rho D Inj 16.5％)、人血清白蛋白(例如，亚玛(Albuminar))、人水痘-带状疱疹免疫球蛋白(例如，Varizig)、玻璃酸酶(例如，HYLENEX)、玻璃酸酶(人重组)、替伊莫单抗替坦(tiuxetan)(例如，泽瓦林(Zevalin))、艾杜硫酶(例如，Elaprase)、伊米苷酶(例如，思而赞(Cerezyme))、人免疫球蛋白、门冬胰岛素(例如，NovoLog)、牛胰岛素、德谷胰岛素(例如，诺和达(Tresiba))、地特胰岛素(例如，诺和平(LEVEMIR))、甘精胰岛素(例如，来得时(Lantus))、赖谷胰岛素(例如，艾倍得(APIDRA))、赖脯胰岛素(例如，优泌乐(Humalog))、猪胰岛素(例如，Iletin II)、普通胰岛素(例如，常规优泌林(Humulin R))、猪胰岛素(例如，vetsulin)、低精蛋白胰岛素(例如，诺和灵N(Novolin N))、重组干扰素α-2a(例如，罗扰素(Roferon)A)、干扰素α-2b(例如，INTRON A)、干扰素αcon-1(例如，干复津(INFERGEN))、干扰素α-n1(例如，Wellferon)、干扰素α-n3(例如，Alferon)、干扰素β-1a(例如，Avonex)、干扰素β-1b(例如，贝他费隆(Betaseron))、干扰素gamma-1b(例如，Actimmune)、静脉内免疫球蛋白(例如，Civacir)、拉罗尼酶(例如，Aldurazyme)、来格司亭(例如，格拉诺赛特(Granocyte))、来匹卢定(例如，Refludan)、亮脯利特(例如，Eligard)、利拉鲁肽(例如，Saxenda)、芦西纳坦(例如，Surfaxin)、促黄体素α(例如，乐芮(Luveris))、美卡舍明(例如，N.A.)、尿促性素(例如，贺美奇(Menopur))、甲氧基聚乙二醇-倍他依泊汀(例如，美信罗(Mircera))、美曲普汀(例如，Myalept)、天然α干扰素或multiferon(例如，Intron/罗扰素(Roferon)-A)、奈西立肽(例如，NATRECOR)、奥克纤溶酶(例如，Jetrea)、奥普瑞白介素(例如，Neumega)、OspA脂蛋白(例如，Lymerix)、缩宫素(例如，催产素(Pitocin))、帕利夫明(例如，Kepivance)、胰脂肪酶(例如，Pancrecarb)、牛培加酶(例如，Adagen)、培门冬酶(例如，Oncaspar)、聚乙二醇化非格司亭(例如，Neulasta)、PEG干扰素α-2a(例如，派罗欣(Pegasys))、PEG干扰素α-2b(例如，PEG-Intron)、PEG干扰素β-1a(例如，Plegridy)、聚乙二醇尿酸酶(例如，(Krystexxa))、培维索孟(例如，SOMAVERT)、猪肺磷脂α(例如，固尔苏(Curosurf))、普兰林肽(例如，Symlin)、Preotact(例如， )、硫酸鱼精蛋白(例如，硫酸鱼精蛋白注射剂、USP)、人蛋白S(例如，人蛋白S)、凝血酶原(例如，Feiba Nf)、凝血酶原复合物(例如，Cofact)、凝血酶原复合浓缩物(例如，Kcentra)、拉布立酶(例如，Elitek)、瑞替普酶(例如，Retavase)、利纳西普(例如，Arcalyst)、罗米司亭(Romiplostim)(例如，Nplate)、沙可劳塞酶(例如，Sucraid)、鲑降钙素(例如，Calcimar)、沙格司亭(例如，生白能(Leucomax))、沙妥莫单抗喷地肽(例如，OncoScint)、溶酶体酸性脂肪酶α(例如，Kanuma)、胰泌素(例如，SecreFlo)、舍莫瑞林(例如，乙酸舍莫瑞林)、血清白蛋白(例如，Albunex)、碘化血清白蛋白(例如，Megatope)、西莫托考α(例如，Nuwiq)、Sipuleucel-T(例如，普列威(Provenge))、重组生长激素(例如，NutropinAQ)、重组生长激素(例如，BioTropin)、链激酶(例如，Streptase)、Susoctocogα(例如，Obizur)、阿法他利苷酶(例如，Elelyso)、替度鲁肽(例如，Gattex)、替奈普酶(例如，TNKase)、特立帕肽(例如，Forteo)、替莫瑞林(例如，Egrifta)、凝血调节蛋白α(例如，Recomodulin)、胸腺法新(例如，日达仙(Zadaxin))、甲状球蛋白、促甲状腺素α(例如，Thyrogen)、结核菌素纯化蛋白衍生物(例如，Aplisol)、Turoctocogα(例如，Zonovate)、尿促卵泡素(例如，BRAVELLE)、尿激酶(例如，Kinlytic)、加压素(例如，皮特雷辛(Pitressin))、维拉苷酶α(例如，Vpriv)、阿昔单抗(例如，ReoPro)、阿达木单抗(例如，修美乐(Humira))、阿仑珠单抗(例如，CAMPATH)、阿利库单抗(例如，Praluent)、阿西莫单抗(例如，CEA-Scan)、阿特珠单抗(例如，特善奇(Tecentriq))、巴利昔单抗(例如，舒莱(Simulect))、贝利木单抗(例如，Benlysta)、贝伐单抗(例如，安维汀(Avastin))、博纳吐单抗(例如，Blincyto)、布罗达单抗(例如，Siliq)、卡那津单抗(例如，ILARISE)、卡那津单抗(例如，Ilaris)、卡罗单抗(例如，ProstaScint)、西妥昔单抗(例如，爱必妥(Erbitux))、达昔单抗(daclizumab)(例如，赛尼哌(Zenapax))、达雷木单抗(例如，DARZALEX)、地诺单抗(例如，Xgeva)、达妥昔单抗(例如，unituxin)、依库珠单抗(例如，Soliris)、依法利珠单抗(例如，瑞体肤(RAPTIVA))、埃洛妥珠单抗(例如，EMPLICITI)、依洛尤单抗(例如，瑞百安(Repatha))、戈利木单抗(例如，欣普尼注射剂(Simponi Injection))、替伊莫单抗(例如，泽维宁(Zevalin))、依达赛珠单抗(例如，Praxbind)、英利昔单抗(例如，类克(Remicade))、普利木单抗(例如，YERVOY)、艾克司单抗(例如，Taltz)、美泊利单抗(例如，Nucala)、莫罗单抗(例如，ORTHOCLONEOKT3)、那他珠单抗(例如，Tysabri)、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)(例如，Portrazza)、纳武单抗(例如，欧狄沃(Opdivo))、奥托昔单抗(例如，Anthim)、奥比妥珠单抗(例如，Gazyva)、奥法木单抗(例如，Arzerra)、奥马珠单抗(例如，索雷尔(Xolair))、帕利珠单抗(例如，Synagis)、帕尼单抗(例如，维克替比(Vectibix))、派姆单抗(例如，Keytruda)、帕妥珠单抗(例如，帕捷特(Perjeta))、雷莫芦单抗(例如，Cyramza)、兰尼单抗(ranibizumab)(例如，诺适得(Lucentis))、瑞西巴库单抗(例如，瑞西巴库单抗
(RAXIBACUMAB))、利妥昔单抗(例如，美罗华(Rituxan))、苏金单抗(例如，Cosentyx)、司妥昔单抗(例如，Sylvant)、托珠单抗(例如，雅美罗(ACTEMRA))、托西莫单抗(例如，百克沙(Bexxar))、曲妥珠单抗(例如，赫塞汀(Herceptin))、优特克单抗(例如，Stelara)或维多珠单抗(例如，Entyvio)。
在其它实施方式中，所述靶标蛋白为抗体。在另一个实施方式中，所述靶标蛋白是抗人蛋白抗体。
在其它实施方式中，所述抗体具有以下的氨基酸序列：阿达木单抗(Humira)；类克(Remicade)(英利昔单抗)；ReoPro(阿昔单抗)；美罗华(Rituxan)(利妥昔单抗)；舒莱(Simulect)(巴利昔单抗)；Synagis(帕利珠单抗)；赫塞汀(Herceptin)(曲妥珠单抗)；麦罗塔(Mylotarg)(吉妥珠单抗奥唑米星)；Campath(阿仑珠单抗)；Zevalin(替伊莫单抗替坦(tiuxetan))；索雷尔(Xolair)(奥马珠单抗)；百克沙(Bexxar)(托西莫单抗-I-131)；爱必妥(Erbitux)(西妥昔单抗)；安维汀(Avastin)(贝伐单抗)；Tysabri(那他珠单抗)；Actemra(托珠单抗)；维克替比(Vectibix)(帕尼单抗)；Lucentis(兰尼单抗(ranibizumab))；
Soliris(依库珠单抗)；Cimzia(聚乙二醇结合赛妥珠单抗(Certolizumab pegol))；
Simponi(戈利木单抗)；Ilaris(卡那津单抗)；Stelara(优特克单抗)；Arzerra(奥法木单抗)；Prolia(地诺单抗)；Numax(莫维珠单抗)；ABThrax(瑞西巴库单抗)；Benlysta(贝利木单抗)；Yervoy(普利木单抗)；Adcetris(本妥昔单抗)；Perjeta(帕妥珠单抗)；Kadcyla(曲妥珠单抗-美坦新偶联物(Ado-trastuzumab emtansine))；或者Gazyva(奥比妥珠单抗)的氨基酸序列。
在其它实施方式中，所述抗体为全长抗体、Fab、F(ab')2、scFv或者sdAb。在其它实施方式中，所述靶标蛋白包含酶或其抑制剂的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述靶标蛋白包含以下的氨基酸序列：凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XIII、凝血因子VIIa、抗凝血酶III(AT-III)、蛋白C、组织纤维蛋白溶酶原活化因子(tPA)和tPA变体、尿激酶、水蛭素、链激酶、葡糖脑苷脂酶、阿葡糖苷酶-α、拉罗尼酶(α-L-艾杜糖醛酸酶)、艾杜硫酶(艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)、加硫酯酶、半乳糖苷酶-β(人α-半乳糖苷酶A)、肉毒毒素、胶原酶、人脱氧核糖核酸酶-I、玻璃酸酶、木瓜蛋白酶、天冬酰胺酶、尿酸酶(尿酸氧化酶)、谷氨酸羧肽酶(谷卡匹酶)、α1蛋白酶抑制剂(α1抗胰蛋白酶)、乳糖酶、胰酶(脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶)和腺苷脱氨酶。
在另一个实施方式中，糖基化靶标蛋白分泌至培养基中，并且其中所述糖基化靶标蛋白是糖基化的。在某些实施方式中，从培养基中纯化所述糖基化靶标蛋白。在另一个实施方式中，通过亲合纯化或者离子交换色谱法从培养基纯化所述糖基化靶标蛋白。在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白含有Fc域并且通过蛋白-A从培养基中亲合纯化。在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白含有亲合标签并亲合纯化。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白群体是至少约90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％均一的。在其它实施方式中，所述靶标蛋白上
90％至100％的N-糖基位点通过糖基化作用占据。在其它实施方式中，根据本文所述的方法和宿主细胞使用的靶标蛋白可以是全长蛋白、其截短、蛋白域、区、基序或肽。
在其它实施方式中，所述靶标蛋白为Fc-融合蛋白。
在另一个实施方式中，可以修饰靶标蛋白。在另一个实施方式中，所述靶标蛋白已工程化以包含来自利什曼虫(Leishmania)的信号序列。在其它实施方式中，加工所述信号序列并将其从所述靶标蛋白中除去。在另一个实施方式中，所述靶标蛋白已工程化以包含一个或多个标签。在其它实施方式中，加工所述标签并将其从所述靶标蛋白中除去。
7.13组合物
7.13.1包含宿主细胞的组合物
在一个方面，本文提供了包含本文所述的宿主细胞(参见7.1节)的组合物。这些组合物可以在产生本文所述的糖基化靶标蛋白的方法中使用，例如，可以在适合于蛋白生产的条件下培养所述包含宿主细胞的组合物。随后，可以使用本领域中已知的方法从所述包含宿主细胞的组合物中分离糖基化靶标蛋白。
包含本文所提供的宿主细胞的组合物可以包含适合于本文所述的宿主细胞的维持和存活的其它组分，并且可以另外包含宿主细胞产生蛋白所需或有利的其它组分，例如，诱导型启动子的诱导剂，如阿拉伯糖、IPTG。
7.13.2包含糖基化靶标蛋白的组合物
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述组合物中的靶标蛋白的至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的的N-连接的糖基化共有序列具有包含以下结构的低聚糖：
其中正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是所述靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化是G0-Gn聚糖，其特征为以下结构中的任一个：
其中正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化是G0聚糖，其特征为以下结构：
其中正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化是G1-Gn聚糖，其特征为以下结构中的任一个：
其中空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化是G2聚糖，其特征为以下结构：
其中空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化是G2聚糖，其特征为以下结构：
其中空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化是G2聚糖，其特征为以下结构：
其中空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，进一步修饰所述靶标蛋白上的糖基化以优化所述靶标蛋白在引入对象时的药物动力学性质。在另一个实施方式中，所述靶标蛋白上的糖基化是唾液酸化的。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化的特征在于以下结构：
其中菱形代表唾液酸残基，空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化的特征在于以下结构：
其中菱形代表唾液酸残基，空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化的特征在于以下结构：
其中菱形代表唾液酸残基，空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化的特征在于以下结构：
其中菱形代表唾液酸残基，空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化的特征在于以下结构：
其中菱形代表唾液酸残基，空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化的特征在于以下结构：
其中菱形代表唾液酸残基，空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化的特征在于以下结构：
其中菱形代表唾液酸残基，空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化的特征在于以下结构：
其中菱形代表唾液酸残基，空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化的特征在于以下结构：
其中菱形代表唾液酸残基，空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化的特征在于以下结构：
其中菱形代表唾液酸残基，空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化的特征在于以下结构：
其中菱形代表唾液酸残基，空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在另一个实施方式中，所述糖基化靶标蛋白的组合物具有在所述靶标蛋白上至少约10至20％，20％至30％，25％至35％，30％至40％，35％至45％，40％至50％，45％至55％，50％至60％，55％至65％，60％至70％，65％至75％，70％至80％，75％至85％，80％至90％，85％至95％或90％至100％的糖基化的特征在于以下结构：
其中菱形代表唾液酸残基，空心圆圈代表半乳糖残基，正方形代表N-乙酰葡萄糖胺残基，灰色圆圈代表甘露糖残基；并且其中Asn是靶标蛋白中N-连接的糖基化共有序列的Asn。
在某些实施方式中，除包含本文所述的糖基化靶标蛋白(参见7.12节)之外，本文所述的组合物(例如，药物组合物)包含药物可用的载体。如本文所使用的，术语“药物可用的”是指联邦或州政府管理机构批准的，或者美国药典或其它通常承认的药典中所列的在动物，并且更具体地在人中使用的。在药物可用的载体的背景中，如本文所使用的术语“载体”是指通过其施用药物组合物的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。盐溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，具体地用于可注射溶液。适合的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、水稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。在E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中描述了适合的药物载体的实例。
在某些实施方式中，将本文所述的组合物配制以适合于对象的预定施用途径。例如，本文所述的组合物可以配制以适合于皮下、肠胃外、口服、皮内、透皮、结肠直肠、腹膜内和直肠施用。在具体的实施方式中，可以将所述药物组合物配制用于静脉内、口服、腹膜内、鼻内、气管内、皮下、肌内、局部、皮内、透皮或肺部施用。
在某些实施方式中，本文所述的组合物还包含一种或多种缓冲剂，例如，磷酸盐缓冲液和蔗糖磷酸谷氨酸缓冲液。在其它实施方式中，本文所述的组合物不包含缓冲剂。
在某些实施方式中，本文所述的组合物还包含一种或多种盐，例如，氯化钠、氯化钙、磷酸钠、谷氨酸单钠和铝盐(例如，氢氧化铝、磷酸铝、明矾(硫酸铝钾)或者这些铝盐的混合物)。在其它实施方式中，本文所述的组合物不包含盐。
本文所述的组合物可以与施用说明书一起包含在试剂盒、容器、包装或分配器中。
可以在使用前储存本文所述的组合物，例如，可以冷冻储存所述组合物(例如，在约-20℃或在约-70℃)；在制冷条件下储存(例如，在约4℃)；或者在室温下储存。
7.14预防性和治疗性使用
在一个方面，本文提供了预防或治疗对象中疾病或病症的方法，其包括向所述对象施用本文所述的糖基化靶标蛋白或其组合物。本文还提供了预防对象中疾病或病症的方法，其包括向所述对象施用本文所述的糖基化靶标蛋白或其组合物。
8.具体实施方式
8.1实施例1糖基化途径的生物信息学评价
首先，通过比较染色体组分析发现蜥蜴利什曼虫(Leishmaniatarentolae)甚至与分类学密切相关的硕大利什曼虫(Leishmania major)在早期保守的N-聚糖生物合成步骤中显著不同，如表1、表2、表3、表4、表5、表6和表7所述。缺失alg基因表示N-聚糖前体强烈减少并且前体修剪也减少(图3和图4)(Varki，2009)。尽管ALG3存在，但是与人ALG3的比较显示保守残基127处潜在错义突变为谷氨酰胺，其对应于人ALG3中的功能缺失突变(R171Q)(Sun等人,2005)。
表1前体生物合成
表2修剪
表3 N-聚糖延伸
表4低聚糖转移酶(OST)
表5前体生物合成(Neu5Ac)
表6核苷酸激活的糖合成和转运
表7脂磷酸聚糖修饰酶
根据如图3B所示的意外地独特的生物合成途径，修剪和内质网(ER)质量控制降低(表
1、表2和表8)表明了就高位点占据而言的糖工程修饰的有益性质，同时保留了适当的折叠过程。图5更详细地描述了在不存在通常循环不正确地修剪的N-聚糖前体返回或者未折叠的蛋白至用于蛋白酶体降解的ERAD途径的凝集素介导(钙联接蛋白和钙网蛋白)的途径(Moremen等人,2012)的情况下，用于修正糖蛋白折叠的本发明的侣伴蛋白途径，还如表8所示。重要地，OST复合物仅由Stt3组成，其将前体N-聚糖转运至蛋白受体共有天门冬酰胺(表
4)。在蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)的情况下，通过Stt3转运与任何其它所述的真核生物显著不同的减少的前体，这表明不存在像含有OST复合物的其它真核生物中一样的位点偏爱性或者不存在严格的位点偏爱性。
表8 ER质量控制
作为普遍接受的观点，图6和7显示了在真核细胞的内质网和高尔基体中发生的N-聚糖加工步骤的示意图，这些图是从(Kellokumpu等人,2016)修改获得的。在蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)中，将截短的减少(reduced)的前体转移至蛋白，并且它在沿分泌途径的运输中错过了高尔基体中的任何其它N-聚糖延伸。这已通过GlcNAc转移酶GnT-I和GnT-II、Gal转移酶和唾液酸转移酶的缺少得到结论(图6，表6)。另外，比较数据显示不存在唾液酸生物合成步骤(表5)。不能在蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)中明确鉴别来自密切相关的布氏锥虫(Trypanosoma brucei)TbGnTI(Damerow等人,2014)和TbGnTII(Damerow等人,2016)的高尔基体固有的GlcNAc糖基转移酶。通过免疫荧光显示在C-末端标签化的表位TbGnTI和TbGnTII是高尔基体定位的(Damerow等人,2014；Damerow等人,2016).
由于核苷酸激活的糖供体是糖基转移酶催化的酶促反应所需要的并且需要在高尔基体区室的腔内可获得，因此通过生物信息学方法鉴别了跨膜定位的转运蛋白的存在。鉴别了UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、UDP-糖焦磷酸化酶、UDP-半乳糖4-表异构酶和UDP-Gal/UDP-GlcNAc内向转运蛋白、GDP-Man/UDP-GlcNAc内向转运蛋白、UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc、GDP-Man内向转运蛋白和UDP-Glc内向转运蛋白(Roper and Ferguson2003；Roper等人,2002；
Urbaniak等人,2006；Capul等人,2007)的同源物的存在(表6)。UDP-GlcNAc转运蛋白(克氏锥虫(T.cruzi)TcNST1和布氏锥虫(T.brucei)TbNST1至4、硕大利什曼虫(L.major))存在于蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)中，UDP-Gal转运蛋白(布氏锥虫(T.brucei)TbNST 1和2、硕大利什曼虫(L.major))存在于蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)中。这些结果表示UDP-GlcNAc和UDP-Gal两者均可以转运至高尔基体腔内。因此，LTAR_180008900.1、LTAR_240008400.1、LTAR_340034000.1和LTAR_300033500.1(先前命名方案：LtaP18.0420、LtaP24.0350、LtaP34.3030和LtaP30.2670)表明了GDP-Gal和UDP-GlcNAc在高尔基体腔内的可用性。
8.2实施例2用于糖工程化完全功能-定制的N-聚糖变体的方法
图7和8记录了在蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)中用于产生均一和功能-定制的N-聚糖延伸的糖工程化设计，其用于a)所期望的Fc和Fc受体相互作用的下游效应和b)半衰期提高(药物动力学PK提高)和c)抗炎性质，如2,6连接的Neu5Ac的免疫-耐受性益处，以避免在潜在免疫原性蛋白治疗剂中产生ADA。图8描述了对于蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)N-聚糖生物合成的提议，其显示了导致糖工程化有益性质的主要和新型差异。本发明涉及真核宿主细胞，其已修饰以通过一组糖基转移酶，包括N-乙酰葡萄糖胺转移酶、半乳糖基转移酶和唾液酸转移酶的异源表达在蛋白上产生功能-定制且均一的N-聚糖。
8.3实施例3动质体蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)中减少的和100％均一的N-聚糖的实验证据
在基于预期有益性质选择蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)动质体生物之后，对三种野生型(wt)株(St10569、St10616、St11262)分析了它们的天然N-聚糖。首先，将细胞颗粒变性并对其进行PNGaseA或PNGaseF介导的N-聚糖释放。通过用于N-聚糖快速酶促释放和快速标记的WatersGlycoWorksTM RapiFluor-MSTM N-Glycan对所释放的N-聚糖a)全甲基化或者b)标记。
通过使用RapiFluorTM的荧光标记和UPLC分离，我们仅观察到对应于(Man)3(GlcNAc)2的一种单一N-聚糖形式，其计算m/z＝1222.7166；[M+Na]+1244.6985；[M+K]+1260.6724。对于N-聚糖，在全部三种分离的蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)细胞中仅鉴别了一种均一的N-聚糖，即所谓的寡甘露糖或Man3聚糖，如图9所示。
我们还应用全甲基化以阐明蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)的两种不同wt样品(St10569、St10616)的N-聚糖谱。与方法(将得自去脂细胞颗粒的胰蛋白酶肽的去糖基化，或细胞颗粒去脂后，将完整蛋白的直接去糖基化)无关，在两种株中确认了一种N-聚糖结构的存在。与用于去糖基化的N-糖苷酶无关，获得了对应于基本(Man)3(GlcNAc)2核心的这种N-聚糖。空白对照表明如通过聚己糖特征所示，细胞壁污染聚糖的存在，推测来自脂磷酸聚糖，尽管在提取物的MALDI光谱中观察到了聚己糖污染，但是我们未发现潜在对应于更复杂的N-聚糖的任何离子。值得注意地，未发现假定具有α1,6-或α1,3-连接的岩藻糖的双触角岩藻糖基化聚糖(Gal)2(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2(G2F)(Breitling等人,+
2002)(理论全甲基化质量[M+Na]为2244.1)。光谱不含具有该m/z值的任何离子迹线。还值得一提的是在核心组织及其它复杂的岩藻糖基化、N-乙酰葡萄糖胺基化或半乳糖基化的结构之间未观察到可能的中间产物。也尚未鉴别高尔基体中的N-糖基化途径的前体(例如，Man5GlcNAc2)。如果蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)中N-聚糖的生物合成与其它生物相当，则这一点是非常不寻常的。在用PNGase F或PNGase A去糖基化之后获得的光谱是相同的。因此，不存在以下指示：蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)细胞颗粒的N-聚糖谱含有具有将不会通过PNGase F释放的α1,3-连接的核心岩藻糖的N-聚糖(数据未显示)。
为了进一步确定蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)的N-聚糖如何不同于其它动质体的N-聚糖，通过基因组分析和通过N-聚糖谱进一步研究了束形短膜虫(Crithidia
fasciculata)、达氏植生滴虫(Phytomonas davidi Lafont)和Chrithidia deanei(Angomonas)。与蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)相比，束形短膜虫(C.fasciculata)还含有甘露糖基转移酶ALG3、ALG9和ALG11，其解释了高甘露糖聚糖的实验验证的合成
(Man5GlcNAc2至Man11GlcNAc2)(图45)。此外，束形短膜虫(C.fasciculata)具有钙网蛋白，它是蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)中缺少的质量-控制侣伴蛋白。对于达氏植生滴虫(P.davidi Lafont)，无可用的基因组信息。通过PNGaseF和PNGaseA的N-聚糖谱以及后续的全甲基化和MALDI-TOF显示了具有一个或两个其它戊糖的高甘露糖型聚糖(Man9GlcNAc2)。
C.deanei和蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)的糖基化途径的生物信息学比较显示除
C.deanei中不存在MAN1外，无差异。然而，N-聚糖谱显示核心N-聚糖(Man3GlcNAc2)另外被2个己糖和2个脱氧己糖修饰(图45)。
总的来说，通过不同实验方法，在3个蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)wt株中仅鉴别了一种均一N-聚糖，基本结构为(Man)3(GlcNAc)2。这种通过(Man)3(GlcNAc)2的均一N-糖基化(也称为Man3或寡甘露糖)尚未在任何其它真核生物中观察到并且代表了使用这种生物作为针对保留了高位点占据的均一N-糖基化和糖工程化人源化N-聚糖的治疗性蛋白的表达宿主的新颖特征。
8.4实施例4使天然寡甘露糖N-聚糖体外延长的异源糖基转移酶的鉴定
为了实现人源化的延长的双触角N-聚糖，在蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)中重组表达了适合的Gnt并且从蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)的粗裂解液、膜溶解部份和培养基上清液中亲合富集。对半纯化的酶体外测试它们与辅因子和相关激活的核苷酸糖供体的正确活性。底物是“游离的”N-聚糖、2-氨基苯甲酰胺(2AB)标记的N-聚糖或者仅含寡甘露糖(Man3)的来自wt细胞的粗裂解液。
本发明涵盖了不同和适合的糖基转移酶候选(表9)的表达，在体外测定中对所述候选分析它们的效应，表明在蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)细胞中表达和纯化的来自昆虫或哺乳动物来源的所有测试的异源Gnt候选可以在存在辅因子和它们的激活糖供体的情况下对游离低聚糖底物或者2AB标记的底物发挥它们的活性(图10-14)。
表9 GnT候选
来自分类学密切相关的生物布氏锥虫(Trypanosoma brucei)的GnT-I(“TbGnT-I”)未对含有天然寡甘露糖作为底物的wt裂解液显示出任何活性(图10)。然而，对作为底物的游离寡甘露糖(Man3)观察到微弱的活性(峰重叠)。TbGnT-II对Man3底物未显示出任何活性，这还可以表明GntI的在先活性是必需的。当在体外测定中对游离寡甘露糖使用通过链霉亲和素洗脱半纯化的部分或者溶解部份时，确认了昆虫细胞来源的SfGnT-I活性，其具有与NGA2-N标准品共迁移的不同的峰。对照含有wt裂解液的HA-或Strep-洗脱部分，但对所使用的底物未显示出任何修饰。
从裂解液+/-TritonX(TrX)纯化了hMGAT1，并且来自细胞颗粒的hMGAT1 HA-洗脱部分显示出～100％的2AB-Man5(图11A)和～100％的2AB-Man3(图11B)底物伸长。来自上清液(SN)的HA-富集的MGAT-I洗脱部分仅对2AB-Man5或者2AB-Man3具有最小的活性。作为阴性对照的来自wt的裂解液不影响2AB-Man5的保留时间或者修饰标准品。
当从上清液或膜部份(“颗粒”)HA富集时，rMGAT2有效地将NGA2-N标准品转化为G0(NGA2)形式(图12A)。如所期望的，rMGAT-2不能使2AB-Man3a体外伸长至NGA2-N(图12B)。
MGAT2需要在先的GnT-I活性。根据生产商，NGA2-N标准品包括两种形式，位于α1,3-和α1,6-连接的MAN分枝上的GlcNAc，两者分别约50％。NGA2-N和NGA2的峰为50/50，随后通过rMGAT2的α1,6的体外转化为100％。
SfGnT-II胞内定位并且它在细胞裂解液+/-1％(v/v)TritonX中检测到，表明是膜结合，然而，这不是排它的(图13)。不同于另一个所研究的Gnt候选SfGnT-I，SfGnT-II在SN中的存在较少。由于背景噪声，使用HA-部份的体外活性测定不明确。裂解液中的SfGnT-II显示NGA2-N的转化程度相当低，这可能是由于在粗裂解液中存在的量较少所造成的(图13B)。
具有SN或裂解液(+TrX)的SfGnT-II HA-洗脱部分的体外活性样品对用作底物的2AB-标准品显示出强背景荧光(未显示)。SfGnT-II还需要在先GnT-I活性(图13A)并且不作用于Man5(图13C)。)
底物NGA2-N(绿色，76.8m)用于评价hB4GALT-I的体外活性(图14A)。链霉亲和素纯化的hB4GALT-I将NGA2-N(绿色)转化为假设相等比例的α1-3和α1-6G1-Gn(a)和G1-Gn(b)(图
14B)；所述转化不是100％，因为在76.8m检测到弱(蓝色)峰。然而，预期至少>90％转化。
B4GALT-I样品的“双峰”显示出与来自G1标准品(红色)的“双”峰相同的模式，然而，由于结构中1×GlcNAc较少，其保留时间较短。图14C显示了B4GALT1对G0底物的预期体内功能，其导致产生了G2糖形。
8.5实施例5使天然寡甘露糖N-聚糖在天然蛋白质上体内延长的异源糖基转移酶的鉴定
接着，收集表达糖基转移酶的重组宿主细胞并用PNGaseF处理以释放它们的N-聚糖。将释放的聚糖全甲基化或2AB标记并且分析对天然糖蛋白受体的活性。表达GnT-I(SfGnT-I，St11707)的细胞将寡甘露糖体内转化为34％的NGA2-N(G0-Gn)。由于样品来自粗细胞提取物，因此还包括内质网(ER)定位的糖蛋白，这表示这些蛋白不通过高尔基体运输来用于获得GlcNAc延长。由于需要在先的GnT-I活性，因此仅表达GnT-II候选的细胞(未显示)不能如所预期的使寡甘露糖延伸，这是通过体外分析证实的发现。当与GnT-II酶一起重组共表达GnT-I时(SfGnT-I和SfGnT-II，St12320)，确认了寡甘露糖通过2个GlcNAc向G0形式的延伸(图15和16)。
通过全甲基化和MALDI TOF分析，细胞颗粒样品St10569 P16_378野生型仅含一种N-聚糖结构(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1171.6)。来自蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)St11707基因型ssu::SfGnT-I的样品St11707P16_378中Gnt-I的表达导致存在(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1171.6)和(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1416.7)两种形式，其相对强度分别为66和34％。来自蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)St12320基因型ssu::
SfGnT-I；ssu::SfGnT-II(多克隆)的St12320 P16_378中GnT1和GnT2两者的共表达导致存在三种不同的N-聚糖结构，(Man)3(GlcNAc)2(m/z1171.6)、(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2(m/z
1416.7)和(GlcNAc)2(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1661.8)，其分别为48、15和37％(图15)。
此外，通过MALDI-TOF/TOF MS使对应于N-聚糖结构的离子碎片化。存在于m/z 1171.6光谱中的碎片离子确认N-聚糖结构(Man)3(GlcNAc)2。存在于m/z 1416.7光谱中的碎片离子确认N-聚糖结构(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2。GnT-I催化GlcNAc向(Man)3(GlcNAc)2的α-1,3甘露糖的转移。我们对m/z 1416.7处的离子碎片光谱搜索跨环碎片的存在，从而确认了所添加的GlcNAc的位置，结合至α-1,3甘露糖的GlcNAc的不同的碎片具有m/z 560.26的[M++
Na] 质量。结合至α-1,6连接的甘露糖的GlcNAc的相应跨环碎片具有m/z 546.25和574.28的质量。区分末端GlcNAc的键的跨环碎片在光谱中是不可见的。存在于m/z 1661.8光谱中的碎片离子确认N-聚糖结构(GlcNAc)2(Man)3(GlcNAc)2(图16)。
在细胞颗粒脱脂之后，使用完整蛋白的直接去糖基化来绘制三种不同的蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)样品的N-聚糖谱。如已对先前分析的野生型样品所观察到的，细胞颗粒样品St10569野生型仅含有一种N-聚糖结构(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1171.6)。样品St11707基因型ssu::GnT-I中GnT-I的表达显示了(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1171.6)和(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1416.7)两者。GnT-I催化GlcNAc向存在于天然糖蛋白上的(Man)3(GlcNAc)2的一部分的α-1,3甘露糖的转移。St12320基因型ssu::SfGnT-I；ssu::
SfGnT-II中GnT-I和GnT-II两者的共表达导致存在三种不同的N-聚糖类型，(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1171.6)、(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1416.7)和(GlcNAc)2(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1661.8)。Gnt-II的另外表达催化第二GlcNAc残基向(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2的α-1,6甘露糖的转移。
因此，这些数据确认了当在蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)中异源表达时，昆虫细胞来源的Gnt用于其在糖工程化中的使用的体内活性。另外，还表明了高尔基体腔中UDP-GlcNAc的存在并且确认了来自存在于天然蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)中的激活的核苷酸糖转运蛋白的生物信息学评价的假定。
当使用GlycoWorksTM RapiFluor-MSTM来释放和标记来自St11707和St12525株(其分别单独或者与SfGnT-II一起表达SfGnT-I)的N-聚糖时确认了这些发现，对此根据它们的m/z，鉴别了来自SfGnT-I细胞的G0-Gn和来自SfGnT-I+SfGnT-II细胞的G0聚糖(图17A)。St13065共表达hMGAT1和rMGAT2并且在其天然分泌蛋白上产生G0聚糖，表明两种Gnt是体内活性的(图17B)。
有趣地，在具有组合Strep-三重HA标签、仅具有Strep标签或者具有天然C-末端的SfGnt-I的不同变体中，对总N-聚糖的活性分别在20％至75％，这表明了C末端标签对寡甘露糖向NGA2-N(G0-Gn)体内转化的不利影响(图47B)。
因此，测试了没有任何C末端标签的来自MGAT1文库的异源Gnt-I候选，如表9所示。表达来自不同物种的重组Gnt-I的利什曼虫(Leishmania)将天然Man3 N-聚糖转化为G0-Gn。活性范围在极低效率，如muMGAT1(鼠科)的10％至甚至大于90％，如对于DrMGAT1(斑马鱼(Danio rerio))或者GjMGAT1(壁虎(Gekko japonicus))所示(图47A)。
来源于SfGnT-I活性的聚糖导致产生了G0-Gn聚糖，其中将GlcNAc添加至α1,3Man分枝。
产生了共表达SfGnT-I和hB4GALT1的St13066。GlcNAc用作B4GALT1的体外受体(图14)并且通过G1-Gn(a)的出现(其m/z＝1587.63，作为保留时间15.32min处的峰)体内确认了这种活性(图17C)。
这支持功能性Gnt的选择，另外还支持UDP-GlcNAc和UDP-Gal在蜥蜴利什曼虫
(Leishmania tarentolae)高尔基体区室中的可用性，如根据生物信息学评价所推断的(表
6)。因此，在工程化和共表达Gnt用于功能-定制的N-聚糖的生产的新型蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)宿主细胞中确认了体内糖工程化。
8.6实施例6使天然寡甘露糖N-聚糖在重组人红细胞生成素上体内延长的异源糖基转移酶的鉴定
为了不仅评价Gnt对天然糖蛋白或分泌糖蛋白的活性，与Gnt-I一起共表达了重组靶标蛋白人促红细胞生成素(hEPO)。以用于分泌移位的两种不同的信号肽表达EPO以分泌至上清液。实施了通过肽谱和MS的N-聚糖释放和位点占据分析。当在非糖工程化细胞中表达时，确认了EPO上均一的寡甘露糖，而通过N-聚糖释放和全甲基化确定，与GnT-I共表达的EPO显示约50％的N-聚糖伸长了一个GlcNAc(图18)。
通过胰蛋白酶肽谱分析了位点占据(图19和20)。两种EPO样品的富集的糖肽部份含有对应于具有糖基化位点N24和N38的占据的糖肽[EAENITTGCAEHCSLNENITVPDTK](SEQ ID NO ：109)的离 子。相反，对应于N83的 未占 据的糖肽是可检 测的。肽
[EAENITTGCAEHCSLNENITVPDTK](SEQ ID NO：109)上的两个糖基化位点被N-聚糖占据。野生型蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentola)St11521株中产生的EPO仅含结合至两个N-糖基化位点的(Man)3(GlcNAc)2核心结构。St11895株中EPO和GnT-I的共表达导致N-糖基化位点N24和N38被(Man)3(GlcNAc)2或者(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2中任一个占据。在两种EPO样品中，未发现糖肽[EAENITTGCAEHCSLNENITVPDTK](SEQ ID NO：109)，其中所述两个N-糖基化侧中仅有一个被N-聚糖占据。已发现具有N-糖基化位点N24和N38的肽[21-45]
[EAENITTGCAEHCSLNENITVPDTK](SEQ ID NO：109)仅被两种N-聚糖占据。在野生型利什曼虫(Leishmania)St11521株中所产生的EPO的情况下，m/z 4588处的离子对应于具有两个(Man)3(GlcNAc)2N-聚糖的糖肽。相反，来自St11895株的EPO显示出三种不同的糖肽离子：对应于具有两个(Man)3(GlcNAc)2的N-聚糖的m/z 4588；对应于具有一个(Man)3(GlcNAc)2和一个(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2的糖肽的m/z 4792和对应于具有两个(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2残基的糖肽的m/z4994。对于St11521株(rhEPO)wt，EPO N-糖基化位点N24和N38仅被(Man)3(GlcNAc)2核心N-聚糖占据。对于St11895株(rhEPO+SfgnT1)，EPO和GnT1的共表达导致两个位点被(Man)3(GlcNAc)2或(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2中的任一个占据。未观察到其它结合至这些位点的具有不同N-聚糖结构的N-糖肽离子。
由于我们在所述蛋白的胰蛋白酶消化之后未发现任何明显可归类的肽离子，因此在该研究中不能分析具有N-糖基化位点N83的肽[77-97]GQALLVNSSQPWEPLQLHVDK(SEQ ID NO：
156)。因此，不可能对位点N83的占据做出结论。通过PNGases去糖基化未显示出作为明显可鉴别的离子的具有N-糖基化位点N83的去糖基化肽[77-97][GQALLVDSSQPWEPLQLHVDK](SEQ ID NO：156)的存在。去糖基化肽的理论单同位素质量为2360.24Da。St11895的光谱P2813和St11521的P2814分别在m/z 2361.5和2360.01含有非常弱的分离较差的离子。不可能通过碎片确认这些离子的身份。因此，我们对于处于其非糖基化或者处于其去糖基化形式的这种肽的存在没有确认的指示。
在两种肽质量指纹图谱中，我们未发现处于其非糖基化游离形式的具有N-糖基化位点N24和N38的胰蛋白酶肽[21-45]EAENITTGCAEHCSLNENITVPDTK(SEQ ID NO：109)或者具有N-糖基化位点N83的肽[77-97]GQALLVNSSQPWEPLQLHVDK(SEQ ID NO：156)，这表明了100％的N-糖基化占据。未鉴别到这些肽的漏切。尽管仅鉴别到3个N-糖基位点中的2个被100％占据，但是我们还是假设第三位点被占据，这将与更早期对来源于非糖工程化细胞的EPO所实施的完整蛋白MS相关。
8.7实施例7来自天然分泌蛋白的分泌信号的鉴定
起初，信号肽来源于如(Klatt and Konthur 2012)所述的来自墨西哥利什曼虫
(Leishmania mexicana)的碱性磷酸酶。在本发明中，信号肽来源于通过天然宿主细胞分泌的糖蛋白，其通过使用ConA纯化以及后续蛋白质组学方法和EDMAN N末端测序得到鉴别。在通过MS所鉴别的天然宿主细胞所分泌的糖蛋白中，最明显的蛋白是转化酶(蔗糖水解酶样蛋白)(LTAR_040008100.1；先前命名方案：LtaP04.0290)和GP63变体LTAR_100010400.1(先前命名方案：LtaPcontig00616-1)(图21)，两者均含有N-糖基化共有位点并且具有均一的Man3寡甘露糖N-聚糖。通过EDMAN N末端测序，鉴别了来自所述转化酶的推定分泌信号肽：
DGVPYEx(SEQ ID NO：157)(图22)。DGVPYEx(SEQ ID NO：157)(不同循环中+其它氨基酸可以是可能的：循环1中的K，循环2中的P，循环4中的E)。通过框中这些相应核苷酸与hEPO核苷酸编码序列的基因融合，将重组表达C-末端His或StrepII-标签化EPO的宿主细胞用于纯化分泌的重组EPO(图23)。
8.8实施例8靶向和保留至正确的亚细胞区室
如图6和7所列，在内质网(ER)和高尔基体中发生了糖基转移酶对N-聚糖的顺序加工(kellokumpu等人,2016)。通常认为所参与的酶(糖基转移酶和糖苷酶)在一定时间，以所指明的顺序，通过往返于不断增长的低聚糖链来添加或除去糖残基，从而相继单独起作用。这表明可以通过沿分泌途径的正确定位和保留来改善用于糖工程化的Gnt。大部分高尔基体定位的Gnt是II型膜蛋白，其具有短N末端胞质域(“C”)、约20个氨基酸的a-螺旋TM域(“T”)、干域(“S”)，并且然后是位于分泌途径的腔中的C末端球状催化域(图24A)。它们用于糖基化的功能重要性还可以基于它们作为均聚物或杂聚物的相互作用。它们的普遍性以及蛋白域介导的这些相互作用可以导致对于复合物形成所发生的酶活力改变(Kellokumpu等人,
2016)。因此，将杂交体-Gnt设计用于a)对正确亚细胞区室的改善的靶向和保留(高尔基体中间膜囊和反面膜囊，参见图8)和b)导致更好的用于糖工程化的活性的均和杂二聚化的增强。
图24A显示了典型的II型膜蛋白结构，我们将其解释用于杂交Gnt的设计，如图24B中举例说明的，其中在以下实施例SfGnT-I中，将预测的天然高尔基体蛋白的CTS融合至异源GnT-x的催化域。图24B显示了预期的蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)高尔基体保留和结合蛋白。锥虫(Trypanosoma)和利什曼虫(Leishmania)分泌信号序列不能在哺乳动物中起作用；
类似于革兰氏+细菌(Al-Qahtani等人,1998)，并且信号肽序列要求和切割位点似乎不同于锥虫和高等真核生物(La Flamme,A C等人,1995)。已在其它处综述了锥虫分泌途径的组织(McConville等人,2002b)。布氏锥虫(T.brucei)细胞表面蛋白(GPI-锚定的)含有非常保守的用于分泌的信号肽( and Cross,George A M 2002)。已显示高尔基体反面膜囊网络的靶标序列存在于布氏锥虫(Trypanosoma brucei)中，其中当融合至绿色荧光蛋白的C-末端时，布氏锥虫(T.brucei)GRIP域(GFP-TbGRIP)有效定位至转染的COS细胞的高尔基体。
此外，这些GRIP域在布氏锥虫(T.brucei)和墨西哥利什曼虫(Leishmania mexicana)中起作用，然而在静止期的墨西哥利什曼虫(L.mexicana)中，GRIP运输降低。将GRIP蛋白描述为通常具有螺旋卷曲区，在GFP-GRIP融合蛋白中，这些是从延伸的GRIP区引入的(McConville等人,2002a)。NTPD酶是核苷三磷酸二磷酸水解酶，其水解核苷酸，在寄生虫毒性中起作用并且与脂磷酸聚糖(LPG)延伸有关。在硕大利什曼虫(L.major)中，LmNTPDase1位于高尔基体中，LmjF.15.0030具有TM域，它是推测的CTS基序。显示分泌了LmNTPDase2。LmjF.10.0170具有预测的信号肽(Sansom等人,2014)。
将蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)中的同源物鉴别为NTPDase1＝LTAR_150005200.1(先前命名方案：LtaP15.0020)[对LmjF.15.0030最佳反向匹配(reverse hit)]和NTPDase2＝LTAR_100006700.1(先前命名方案：LtaP10.0140)[对LmjF.10.0170最佳反向匹配]。与硕大利什曼虫(L.major)相反，两种蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)NTPD酶均具有CTS域。我们将5个氨基酸设置为活性区；将10个氨基酸设置为用于杂交序列融合的CTS区。CTS的干区长度通常是不确定的，(Geisler等人,2015b)在TM域之后使用了13个氨基酸。在蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)中异源表达wt Gnt以及杂交结构(Man1-SfGnT-I Strep的CTS；
LtaNTPDase1-SfGnT-I Strep的CTS；TbGnTI-SfGnT-II的CTS)，然后通过粗分级分离实验分析它们的定位。我们还在以下实施例人MGAT1中使用了GnT-y的预测的CTS域，并在以下实施例SfGnT-I中将不同长度融合至受体GnT-x(图25)。测试了这些质粒(表10)的定位(图46)。
通过使用融合至N末端减少的SfGnt-I催化域的长度增加的MGAT1 N末端域(图46B)，观察到了改善的细胞(膜)定位(图46A)。这强化了测试来自蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)的天然高尔基体定位蛋白或者来自异源高尔基体GnT的不同的N末端保留信号的假想(如通过使用MGAT1 N末端保留信号举例说明的)。然而，由于所使用的Strep-三重HA标签，对N-聚糖转化的活性较低并且仅在表达构建体90MG1-SfGnT-I-3HA-Strep的St13561中检测到，当与Sf-GnT-I Strep标签相比时，具有Strep-三重HA标签的天然Sf GnT-I的活性降低约10％(图
46B)。
表10杂交体
实验ID 描述 质粒ID 株ID
P16_383_1 1_90MG1-SFGNT-I-3HA-Strep p5825 St13561
P16_383_2 2_110MG1-SFGNT-I-3HA-Strep p5826 St13562
P16_383_3 3_130MG1-SFGNT-I-3HA-Strep p5827 St13563
P16_383_4 4_150MG1-SFGNT-I-3HA-Strep p5828 St13564
P16_383_5 5_MGAT2-Strep-SFGNT1-3xHA p5830 St13566
P16_407_9 9_MGAT2-Strep-MGhybrSFGNT1-3xHA p5831 St13567
P16_383_6 6_SFGNT-I-3xHA-Strep天然 p5829 St13565
P16_463_17 17_Stt3A_d90 SfGnt-I strep p6173 St14295
首先，我们研究了重组细胞系的一般生长，所述细胞系表达具有分泌肽的重组人红细胞生成素或者含有其天然靶向信号的SfGnT-I。监测OD，并通过显微镜跟踪细胞形状变化。
振荡培养达到较高的OD，并且在72h达到生长/表达的峰值，但是在96h降低。静态培养在96h达到最大生长和表达(OD 1.8)，并且活跃生产延长。在生长期间，蜥蜴利什曼虫
(L.tarentolae)细胞显示形态与细胞周期变化有关(G1>S>G2>M>G1…)(图26A)。通过分离粗细胞颗粒(完整细胞提取物)和上清液的表达和粗定位显示主要分泌EPO并且其不保留在细胞内部。同样，预期的高尔基体酶Sf-GnT-I以截短形式存在于上清液中，表明通过分泌途径的潜在蛋白水解切割或者不适合将其保留在蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)的高尔基体中的CTS(图26B)。此外，尽管SfGnT-I也分泌至SN，但是锥虫(Trypanosoma)来源的酶仅存在于粗部份和Triton-X溶解部份中，表明了膜和高尔基体-定位(图27)。TbGnT-I和TbGnT-II大部分是膜结合的(图27B)。与Tb来源的酶相反，SfGnT-I具有很好的体内和体外活性，因此我们使用Sf-GnT-I作为杂交体设计的催化域。将图24和25中所述的CTS N末端区基因融合至预测的Sf-GnT-I催化域。除图24B所述的CTS变体之外，TbGnT-I CTS也可以用于N-末端融合至功能性GnT-I或GnT-II酶的催化域。设想将所有CTS变体用于所有活性Gnt(GnT-I、GnT-II、GalT、SiaT)的催化域以产生功能性和高尔基体保留的杂交Gnt。
在图28中显示了SfGnT-I全长及其CTS-杂交体的定位。尽管空载体对照未显示出任何条带，但是通过传代3至传代6代的培养SN中的抗-Strep免疫印迹法在50kDa的截短尺寸检测到SfGnT-I-Strep(St11898)，其在38kDa(双条带)、30kDa和20kDa降解，但是在裂解液(+/-TrX)和不溶性细胞碎片中无可检测条带。在47kDa，在p3-p6的SN中检测到(aStrep)CTS-Man1-SfGnT-I-Strep(St11899)，以及在38kDa(双条带)、30kDa和20kDa的降解，但是在裂解液(+/-TrX)和不溶性细胞碎片中无可检测条带。由于既未在膜部份中，也未在SN中检测到CTS-LtaNTPDase1-SfGnT-I-Strep(St11900)，因此它未表达或完全不稳定。在p5、p6的SN中，在47kDa作为弱条带检测到CTS-LtaNTPDase2-SfGnT-I-Strep(St11899)，但是在裂解液(+/-TrX)和不溶性细胞碎片中无可检测条带。这表明定位未改变，因为SfGnT-I似乎具有更朝向催化域的蛋白水解可接近的位点，并且设计和测试了针对CTS中增长的第二策略(图
25、表10、图46A、图47B)。在这些增长的杂交体中细胞定位显著改善，这支持了假想(图
47A)。然而，不可以考虑N-聚糖转化，首先，由于Strep-三重HA标签，当天然SfGntI与SfGntI-Strepo和SfGnt-I Strep-3HA相比时，其不利地影响活性(图47B)，并且第二，推测
110个氨基酸的N末端截短也损害SfGnT-I的催化活性。
当测试天然人Gnt，在p5和p6中表达hMGAT1 3×HA标签的St12239时，在完整细胞提取物(WCE)和SN两者中检测到hMGAT1。还在细胞碎片中检测到MGAT1(图29)。这表示分泌/释放，但是主要从膜部份而不是从SN纯化获得体外活性酶(图11)。
在WCE和SN中检测到了从p10的St12318表达的SfGnT-II(ssu::SfGnT-II-3xHA)，它以极低水平分泌/释放。在TrX-裂解液中检测到SfGnT-II，表明了胞质定位。然而，在TrX+裂解液中强烈检测到SfGNT-II，表明了膜结合(图30)。
观察到在p5和p6的St11897(ssu::MGAT2-3xHA)中rMGAT2相对强表达，其中观察到
rMGAT2分泌至SN，存在于完整细胞提取物中以及rMGAT2的胞内/胞液定位。还在TrX+裂解液和不溶性部分中发现rMGAT2是强烈膜结合的。还在约33-35kDa观察到降解作用(图31)。从SN和TrX+颗粒纯化rMGAT2用于体外活性测试(图12)。
因此，这些新型杂交策略是支持异源和活性Gnt在蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)高尔基体区室中保留所必需的。
8.9实施例9唾液酸生物合成和双触角N-聚糖的唾液酸化
在哺乳动物和细菌中，通过不同途径发生Neu5Ac的合成代谢和分解代谢(Angata and Varki,2002)。两种主要类型的酶可以用于形成Neu5Ac。N-乙酰神经氨酸裂解酶(Neu5Ac裂解酶)通过在可逆反应中催化Neu5Ac切割成N-乙酰甘露糖胺(D-ManNAc)和丙酮酸盐来参与唾液酸的分解代谢。在D-ManNAc和丙酮酸盐的高浓度下，平衡可以转换至Neu5Ac的合成。结合氨基葡萄糖2-表异构酶活性，来自大肠杆菌(E.coli)的Neu5Ac裂解酶可以用于从D-GlcNAc大规模生产Neu5Ac。作为另外一种选择，Neu5Ac合酶，如NeuB可以用于催化ManNAc在磷酸烯醇丙酮酸(PEP)上的缩合反应并直接参与唾液酸的生物合成(Tanner，2005中综述)。
CgNal是用于生产Neu5Ac的来自乳发酵短杆菌(Corynebacterium glutamicum)的N-乙酰神经氨酸裂解酶，它催化从ManNAc和丙酮酸盐的可逆的Neu5Ac醛醇缩合，但是有利于Neu5Ac合成而不是切割(Ji等人,2015)。哺乳动物唾液酸化途径中的起始步骤是激活的糖核苷酸前体CMP-Neu5Ac的生物合成。为了实现该前体从内源存在的代谢产物UDP-GlcNAc的产生，可以使用至少4种酶的作用：(1)GNE，双功能酶，其催化UDP-GlcNAc向ManNAc的转化和ManNAc向ManNAc-6-磷酸的磷酸化；(2)NANS，其使ManNAc-6-磷酸和磷酸烯醇丙酮酸缩合，从而导致产生了Neu5Ac-9-磷酸；(3)作用于Neu5Ac-9-磷酸的特异性磷酸酶；和(4)将核中所得的主要唾液酸激活为CMP-Neu5Ac的CMAS(Castilho等人,2010)。此外，细菌NanE或GNPE(Geisler and Jarvis 2012)也可以有利于从GlcNAc-6-磷酸向前体ManNAc-6-磷酸的形成(图53)。
可以在蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)中重组表达适合的唾液酸转移酶(来自表9)并且从蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)的粗裂解液、膜溶解部份和培养基上清液中亲合富集。然后，对半纯化的酶(图49A)体外测试它们与辅因子和激活的糖核苷酸前体CMP-Neu5Ac的正确活性。图48A显示了就向双触角半乳糖化的底物转移一个唾液酸(＝单触角唾液酸化)或两个唾液酸(双触角唾液酸化)来说，蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)表达的唾液酸转移酶对
2AB标记的G2底物的相对活性。由于保留时间比较(图49)，评价了2AB标记的聚糖上键的确定并确认为α2,6或α2,3连接的唾液酸。图48B显示了该筛选测定中的相对量。在下一个方法中，对主要候选(鼠科mST6GAL1)测试了它们对完全折叠的单克隆抗体(MabThera)的活性(图50A-50E)。尽管从裂解液提取并亲合富集的mST6(图50A)导致了2AB-标记的G2底物
100％的双触角α2,6唾液酸化(图50B)，但是相同酶制剂主要唾液酸化一个分枝(～14％)并且几乎检测不到双触角(0.4％)(图50C和50D)。mST6的HA-洗脱部分转化(唾液酸化)了
14.2％的总N-聚糖(～25％的总半乳糖化的N-聚糖的转化)；rSAP+mST6的HA-洗脱部分转化(唾液酸化)了15.36％的总N-聚糖(～26.5％的总半乳糖化的N-聚糖的转化)。通过HA-标签捕获mST6的珠(未洗脱)转化(唾液酸化)了20.13％的总N-聚糖(～34.7％的总半乳糖化的N-聚糖的转化)。2μM dCTP似乎抑制了mST6的HA-洗脱部分的唾液酸转移酶活性(或者提高了唾液酸酶活性)，从而导致仅4.12％的总N-聚糖转化(唾液酸化)(～6.9％的总半乳糖化的N-聚糖的转化)(图50D)。总的来说，mST6能够以游离(洗脱)或捕获(珠形式)形式使MabThera的半乳糖化的N-聚糖体外唾液酸化，并且rSAP对ST-转化具有轻微积极影响，并且dCTP抑制ST转化。
宿主细胞可以工程化以表达功能性CMP-唾液酸(CMP-Sia)生物合成途径。可以在蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)宿主细胞中使用哺乳动物生物合成和/或细菌生物合成(表11)，如先前在多种其它生物，如毕赤氏酵母(Pichia)、昆虫细胞和植物中所进行的(Aumiller等人,2003；Hamilton等人,2006；Castilho等人,2010)。一旦CMP-NeuAc在蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)宿主细胞的高尔基体中可用，则特异性唾液酸转移酶可以将唾液酸转移至受体底物(例如，β1,4-半乳糖化的双触角N-聚糖)。表9显示了哺乳动物和细菌唾液酸转移酶，图53显示了生物合成途径的预期细胞定位。
表11唾液酸生物合成
提供了将CMP-Sia生物合成途径工程化至非人真核细胞中的方法。所述方法包括哺乳动物来源、细菌来源或两者的几种酶在缺少内源唾液酸化的蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)宿主细胞中的克隆和表达。工程化的CMP-Sia生物合成途径对于体内产生唾液酸化的糖脂、O-聚糖和N-聚糖是有用的。因此，这对于在缺少内源唾液酸化的非人宿主细胞中辅助唾液酸化的治疗性糖蛋白的产生是有用的。
α2,3-或α2,6-唾液酸转移酶在人的反面高尔基体(trans-Golgi)和高尔基体反面膜囊网络(TGN)中用唾液酸对半乳糖残基加帽，从而导致产生了成熟形式的糖蛋白。为了将该加工步骤工程化至天然缺少唾液酸转移酶活性的低等真核宿主细胞及其它宿主细胞中，可以将下列引入宿主细胞(1)α2,3-或者α2,6-唾液酸转移酶活性和(2)在晚高尔基体(late Golgi)中充足供给CMP-N-乙酰神经氨酸。为了在分泌途径(例如，晚高尔基体)中获得足够的α2,3-或α2,6-唾液酸转移酶活性，例如，可以将已知的唾液酸转移酶(例如，来自哺乳动物或细菌来源)的催化域导向低等真核宿主细胞中的分泌途径。同样地，可以工程化转运蛋白以允许将CMP-N-乙酰神经氨酸转运至分泌途径(例如，晚高尔基体)的相同位置。因此，为了确保向相应糖基转移酶充足供给底物，可以在这些宿主细胞中通过代谢工程设计CMP-唾液酸的产生。可以如以上实施例4和5中所述进行所有分析。
8.10实施例10蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)中抗CD20“利妥昔单抗”的表达
如先前所讨论的和图1和2中示意性显示的，通过Fc聚糖的改变来改善抗体的效力、降低治疗剂剂量和提高整体临床表现使得提出了对于不同性质所选择的聚糖组库的设计(图
32)。为了在潜在应用中测试所述概念，选择作为 (Roche)可商购的抗CD20单
克隆抗体利妥昔单抗作为其已知ADCC作用模式的测试实例。图33显示了氨基酸序列、信号肽和所讨论的Asn 297糖基位点。图34显示了整合至蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)宿主细胞中的表达盒。使所得细胞系St12427生长以收获分泌至培养上清液中的抗体分子，其称为“利妥昔单抗_LMTB”。使用过滤的上清液，在2步中进行纯化，第一步是蛋白A捕获纯化，然后是疏水相互作用柱(图35)。
图36A显示了利妥昔单抗_LMTB与来自Roche的商品化对比物 的比较。在
非还原条件下，利妥昔单抗_LMTB显示出与 类似的条带图案，但在某种程度上
强度不同。在两种样品中观察降解产物迹线。PNGaseF消化的蛋白显示 中的不
均一性比利妥昔单抗_LMTB更高，前者具有更长的聚糖。图36B显示了预期差异。毛细管凝胶电泳证实了这些观察结果(图37)。
使用对于单克隆抗体的分离和鉴定特异的尺寸排阻色谱(SEC)柱MAbPac SEC-1，将利妥昔单抗_LMTB的聚集体形成确定为5.8％，相比 为0.3％(图38)。
然后，使用Waters GlycoWorksTM RapiFluor-MSTM程序(图39)或者PNGaseF释放和全甲基化-随后MALDI-TOF(图40和41)进行N-聚糖谱以确定与利妥昔单抗_LMTB相比，
的N-聚糖的不均一性和它们的岩藻糖水平。的确，利妥昔单抗_LMTB具有
100％均一的Man3聚糖，相比之下在CHO产生的抗体 中存在>8种糖形。图40中
所示的基于全甲基化的定量比较显示了主要的岩藻糖基化结构，其对于用于ADCC的Fc介导的受体功能来说是次优的。的确，对于ADCC蛋白工程化和糖工程化的第三代抗CD20抗体Roche已提高了无岩藻糖基化的N-聚糖(图42)。 的全甲基化N-聚
糖谱与蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)中产生的利妥昔单抗和来自Roche的的谱图显著不同。主要结构为等分N-聚糖G0B、G0BF、G1B和G1BF与
的94％相比， 的岩藻糖基化水平为52％。换言之，与
的48％和 的仅6％相比，蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)中产生的利
妥昔单抗_LMTB为100％非岩藻糖基化的。但是与 的14种结构和
的8种结构相比，蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)中产生的利妥昔单抗仅显示出对应于Man3GlcNAc2的1种结构。在CHO细胞中产生的商品化对比物 的全甲基化
N-聚糖谱显示出8种结构，其中典型的岩藻糖基化双触角结构G0F和G1F是主要结构。
这强烈支持在蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)中均一和功能-定制的N-聚糖用于治疗性重组抗体或含Fc分子的糖工程化概念。
此外，将FACS染色用于确定Raji细胞上的CD20抗原结合能力(图43A)并且使用了其中对重组CD20点印并与指定抗体培育的斑点印迹分析(图43B)；在两种测定中，利妥昔单抗_LMTB与 等同地结合其抗原(CD20)。在FACS中，相对于IgG1对照抗体，两种抗体
发出清晰的剂量-依赖性的信号，然而Mabthera的信号似乎有些更强。
图44此外显示了所实施的示意性质量评价，其还列于表12中。
表12利妥昔单抗的质量标准
图52显示了在稳定表达糖基转移酶SfGnt-I Strep和MGAT2-HA的蜥蜴利什曼虫
(Leishmania tarentolae)株(St13418)中从Man3向G0的体内聚糖延伸；和来自pLMTB5026的游离表达的利妥昔单抗。然后，以1L规模，通过蛋白A从2d培养物纯化分泌的利妥昔单抗。
通过PNGaseF和RF-MS分析20ug纯化的利妥昔单抗_LMTB，其显示对于分泌的靶标蛋白(全长单克隆抗体)，体内糖工程化是成功的。
8.11材料和方法
8.11.1株、生长和基因方法
通常，如果不另外说明，则将株(表13)在含有5μg/ml氯高铁血红素(BHIH)的脑心浸液中，在26℃，避光静态或振荡培养2-3d。重组细胞系培养物含有适当的选择试剂(表14)。
表13株
表14选择试剂
如下所述进行产生稳定细胞系的转染以整合所关心的异源基因。表达盒含有1.)通过同源重组用于位点特异性整合的同源位点，2.)含有剪接前导受体序列的5'未翻译末端重复，3.)作为对于利什曼虫(Leishmania)(硕大利什曼虫(L.major)或者蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae))密码子优化的的ORF的所关心的基因，4.)含有用于多腺苷酸化序列的3'UTR和用于下游基因的5'UTR的基因间区；所述下游基因例如，5.)抗性标志物，之后是6.)其
3'UTR和7.)用于位点特异性重组至基因组的3'同源区。
对于向基因组的整合，用侧接限制性内切酶消化5-10μg供体质粒DNA以从载体主链切下表达盒。在30℃进行限制性消化直至完成或o/n，并通过EtOH沉淀纯化DNA(将2体积100％冰冷的EtOH加入至1体积消化的DNA，在冰上培育30min，在4℃，以17500×g离心30min)。用
70％EtOH清洗沉淀颗粒，将所述沉淀颗粒干燥最长15min并在ddH2O中再悬浮。对于环状质粒的优化除去，选择在载体主链具有识别位点的1或2种限制性内切酶并在37℃消化约1h并如上所述通过EtOH纯化。
通过热冲击进行100ng消化的DNA、未消化的对照和ddH2O对照在大肠杆菌(E.coli)DH5α中的转化以检查是否存在仍然完整的质粒DNA。将在冰上融化10-15min的化学感受态DH5α小心与100ng消化的质粒DNA混合，在冰上培育25-30min，然后在42℃热冲击90sec，并在冰上培育5min。加入1ml LB或SOC培养基，并在37℃培育1h。然后，将等份在具有氨苄西林的LB上涂板并在37℃倒置培育o/n。
通过在转染前一天，在BHIH中1:10稀释在26℃静态密集生长的培养物来制备用于转染的利什曼虫(Leishmania)培养物。使用光度计，在单独使用的比色皿中，在600nm测量OD，并且对于最优效率，其范围在0.4-1.0(4-6×10*7个细胞)之间。细胞应处于log-期，这通过不圆且呈滴状形状的细胞的混合群体来指示。更圆的细胞是优选的。一次转染使用10ml培养物，并且始终对一次培养进行电穿孔，对于各个选择标志物，以ddH2O作为阴性对照。对于转染，将培养物在RT下以1800×g离心5min。除去SN，将沉淀颗粒在5ml转染缓冲液(200mm Hepes pH 7.0，137mM NaCl，5mMKCl，0.7mM Na2HPO4，6mM葡萄糖，无水(葡萄糖)，通过0.22um无菌过滤)中再悬浮。将细胞再次离心，并将沉淀颗粒在400ul转染缓冲液中再悬浮。将
400ul细胞加入至DNA并转移至比色皿并在冰上培育10min。使用Gene Pulser XcellTM(Biorad)，使用低压规程，指数波衰减：450V，450uF，5-6ms，比色皿：d＝2mm进行电穿孔。立即在冰上精确放置10min。将比色皿中的全部内容物转移至10ml BHIH而无任何选择标志物，并且使细胞在26℃，避光，通气，静态生长20-24h。
对于具有后续克隆选择的多克隆细胞系的选择，加入半浓度的选择标志物并将培养物在26℃培育1-2天，以1:10在10ml BHIH+完全浓度的选择标志物中传代。分配新的株号并且传代数为0。对于所有后续实验，标注转染株的传代数。将细胞进一步在26℃避光生长。如果在7天培养后变为混浊培养物，则将细胞在RT，以1800×g离心沉淀5min，并将沉淀颗粒在含有完全选择标志物浓度的新的BHIH培养基中再悬浮。
对于克隆选择，一旦液体培养物变浑浊，则将细胞在具有适当的100％选择试剂的BHIH平板(含有1.4％的琼脂)上划线。用封口膜将板密封并避光，在26℃倒置培育7-10天。将单个集落(1-2mm大)转移至含有1mlBHIH的24-孔板中，用封口膜密封并在26℃，避光培育约7-
10天。然后，将1ml培养物从24-孔板转移至烧瓶中的10ml BHI中并照旧进一步静态生长。
通过PCR和测序确认靶向的基因组位点的整合。
8.11.2质粒
质粒来源于用于大肠杆菌(E.coli)增殖的pUC57载体主链并且含有氨苄西林选择标志物。表达盒侧接适合于切除的限制性位点。表达盒含有1.)通过同源重组用于位点特异性整合的同源位点，2.)含有剪接前导受体序列的5'未翻译末端重复，3.)作为对于利什曼虫(Leishmania)(硕大利什曼虫(L.major)或者蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae))密码子优化的的ORF的所关心的基因，4.)含有用于多腺苷酸化的3'UTR和用于下游基因的5'UTR的基因间区，所述下游基因例如，5.)抗性标志物，之后是6.)其3'UTR和7.)用于位点特异性重组至基因组的3'同源区。通过基因合成供应商产生质粒并测序。使用以下密码子使用表，对于来自http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝347515上的硕大利什曼虫(L.major)或者http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/上的蜥蜴利什曼虫
(L.tarentolae)，对利什曼虫(Leishmania)进行密码子优化：
GCA：22.791；GCC：29.220；GCG：34.130；GCT：19.986；TGC：13.986；TGT：6.059；GAC：
30.120；GAT：17.499；GAA：15.444；GAG：43.653；TTC：17.287；TTT：12.657；GGA：8.405；GGC：
27.204；GGG：11.971；GGT：14.274；CAC：19.637；CAT：8.559；ATA：3.929；ATC：17.100；ATT：
10.524；AAA：18.838；AAG：26.306；CTA：6.293；CTC：23.191；CTG：32.564；CTT：14.172；TTA：
2.836；TTG：12.837；ATG：23.282；AAC：20.217；AAT：7.912；CCA：13.041；CCC：12.627；CCG：
20.543；CCT：10.758；CAA：9.847；CAG：30.402；AGA：3.857；AGG：6.046；CGA：8.962；CGC：
26.322；CGG：12.218；CGT：12.622；AGC：22.575；AGT：9.528；TCA：10.537；TCC：16.057；TCG：
18.475；TCT：12.894；ACA：14.345；ACC：16.949；ACG：21.677；ACT：9.877；GTA：7.998；GTC：
16.924；GTG：35.086；GTT：10.582；TGG：10.776；TAC：18.379；TAT：5.571；TAA：0.366；TAG：
0.560；TGA：0.719；
手动规划优化序列以避免限制性位点以及重复或均聚物延伸的缺失。表15列出了质粒和描述。
表15质粒
ID 描述
pLMTB 6306 ssu::ClMGAT1；ble标志物(博来霉素抗性)
pLMTB 6307 ssu::BtMGAT1；ble标志物(博来霉素抗性)
pLMTB 6308 ssu::DrMGAT1b；ble标志物(博来霉素抗性)
pLMTB 6309 ssu::GjMGAT1；ble标志物(博来霉素抗性)
8.11.3Gnt候选
表9和表10列出了Gnt和其它Gnt杂交体。
8.11.4使用Rapifluor(RF)标记和MS的N-聚糖谱
(a)样品制备
按照Waters应用注释：《Quality control and Automation Freiendly GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan Sample Preparation》来制备样品。简要地，对于纯化的蛋白样品，样品量为10μl，1.5mg/ml(15μg)，或者作为沉淀颗粒，10*8个细胞。添加3％RapiGest，在
100℃保持3min，在RT保持3min，然后加入10μl PNGase F(Sigma，稀释的30μl PNGase+220μl水)并在50℃培育5min。在RT 3min后，加入10μl RFMS(9mg在110μl无水DMF中)并在RT培育
5min。添加360μl ACN，并通过SPE清洗，以3×30μl洗脱来清洗样品，并混合为90μl。在通过满环进样(4×溢出因子)进样10μl之前，用100μl DMF和210μl ACN稀释样品。
(b)柱设置
使用Glycan BEH Amide柱(Waters； 1.7μm,2.1mm×150mm)在Waters Acquity
UPLC系统上进行液相色谱。使用从20％的0.1％甲酸(FA)水溶液(缓冲液A)和80％的0.1％FA乙腈溶液(缓冲液B)起始，3min达到27％的缓冲液A，然后在32分钟内，达到37％的缓冲液A的梯度，以0.5mL/min的流速进行N-聚糖分离。使用UV检测器，在215nm进行检测。
将UPLC直接连接到Waters Q-TOF Synapt HDMS以ESI模式用于质量确定。使用用于锁定质量修正的锁定质量喷雾(lock mass spray)(亮氨酸脑啡肽)，以正离子模式，在m/z
300至3500之间采集质量。
ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide 1.7μm,2.1×150mm；缓冲液：A：50mM AmFor
(H2O)pH 4.5，B：CAN；流速：0.5ml/min；温度：45℃；进样量：10μl(满环进样)；梯度：80-73％B(3’)，73-63％B(32’)(总计55min)，LC方法：ESI_RFMS_mAB_55_FLR；Synapt设置：
20161006_uba284_esi_RFMS)，MS方法：ESI_RFMS_mAB_300_3500_vpos_55；帽电压：3kV；锥电压：80V；源温度：120℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流速：800l/h；锁定质量：亮氨酸脑啡肽，1ng/ul，流速4uL/min；荧光检测：Ex 265/Em 425nm(RapiFluor-MS)(2Hz)。
8.11.5通过全甲基化和MALDI-TOF的粗细胞沉淀颗粒的N-聚糖谱
(a)样品制备
使用氯仿/甲醇(2:1)，使具有10*8个细胞的沉淀颗粒振荡脱脂30min。离心后，使用氯仿-甲醇-水(40:20:3)边振荡边实施第二脱脂步骤30min。离心后，将脱脂细胞颗粒在氮气流下干燥。
通过在200μL含有0.1％ SF(WATERS)和10mM DTT的50mM碳酸氢铵缓冲液中
超声处理3×90sec来提取细胞颗粒的蛋白。将蛋白在56℃变性45分钟，并在室温下通过碘乙酰胺(50mM)避光60分钟来烷基化。然后，将样品在37℃与10μg胰蛋白酶/Lys-C混合物(质谱级(PROMEGA))培育16h以获得消化蛋白。
(b)N-聚糖的糖苷酶消化&全甲基化
在95℃保持5min以使胰蛋白酶/Lys-C失活后，将样品分成两个等份。将一个等份用20个单位的PNGase F(Promega#175715)去糖基化，而用通过200mM乙酸盐缓冲液pH 5调节至pH 5的15μL PNGase A(Roche#10472620)使第二等份去糖基化。通过向消化的蛋白样品中增加0.5％TFA并在37℃培育30分钟，并以15000×g离心10分钟来除去水解性表面活性剂。
将胰蛋白酶肽加载至SEP PACK C18 200mg柱，并收集含有N-聚糖的流经部分。
在Ultra Clean SPE Carbograph(ALLTECH)上纯化N-聚糖。在加载PNGase释放的N-聚糖之前用0.1％TFA平衡SPE并用0.1％TFA清洗。在用3ml 25％的乙腈，0.1％TFA洗脱之后，在全甲基化之前将N-聚糖冻干。使用约25mg的氢氧化钠，500μl DMSO和300μl ICH3，在
40min内，对冻干样品进行全甲基化。在用1ml水使反应淬灭后，将3×500μl的氯仿用于全甲基化聚糖的提取。用相等体积的水清洗氯仿相，然后干燥。将反应产物加载至C18 SepPak
200mg(WATERS)上并在2ml 80％的乙腈中洗脱，并在MALDI-TOF MS分析之前冻干。
(c)N-聚糖的MALDI-TOF分析
在20μl 50:50的甲醇/水中溶解纯化的全甲基化聚糖。将2μl未稀释的和1/2稀释的N-聚糖与2μl 2,5DHB(LaserBiolabs)基质溶液(10mg/ml，50:50的甲醇/水中的溶液)混合。使用Autoflex III质谱仪(Bruker)采集正离子反射MALDI-TOF质谱。通过4000点(shots)积累获得光谱并通过外标(Pepmix4 LaserBiolabs)校准。如下所示，设置加速和反射极电压条件：电压10.3×1954V，80％的激光。
8.11.6用于体外活性测定的亲合标签化异源Gnt的纯化
HA-纯化程序如下所示。首先，对于靶标HA-标签化Gnt酶的胞内表达分析表达异源Gnt的重组细胞培养。收获1×109个细胞并离心(2000×g/5min)以分离细胞沉淀颗粒以用于亲合纯化。将颗粒在含有1％(v/v)Triton的1mL提取缓冲液(25mM Tris pH 7.5，100mM NaCl，
1％v/v Triton X-100，无EDTA的蛋白酶抑制剂[Roche]，1mM PMSF)中再悬浮。将再悬浮的细胞在冰上超声处理，从而避免任何种类的过热！以3个步骤，20秒，70％功率输入，7个循环进行超声处理[Bandelin Sonopuls]。在涡旋混合仪上剧烈混合10秒。将破碎细胞的混悬液在4℃，以13000×g离心1h。小心除去上清液(裂解液)并用于纯化。将剩余的固体部份在1×Laemmli中再悬浮并用于SDS-PAGE分析。将裂解液与冷PBS(含有1×蛋白酶抑制剂片)以1:2混合并与100μL抗-HA-磁珠[Thermo Scientific]在RT，600rpm培育30min。使用磁架[Thermo Scientific]在2mL管中收获HA-磁珠并用2mL冰冷的TBS清洗两次。用70μL洗脱缓冲液(2mg/mL HA肽[Thermo Scientific]在TBS中)进行洗脱。在SDS-PAGE上分析洗脱部份，然后进行抗-HA WB并用于体外活性测定。
StrepTactin-纯化程序如下所示：对于靶标Strep-标签化Gnt酶的胞内表达分析表达异源Gnt的重组细胞培养。收获1×109个细胞并离心(2000×g/5min)以分离细胞沉淀颗粒以用于亲合纯化。将颗粒在含有1％(v/v)Triton的1mL提取缓冲液中再悬浮。将再悬浮的细胞在冰上超声处理，从而避免任何种类的过热！以3个步骤，20秒，70％功率输入，7个循环进行超声处理[Bandelin Sonopuls]。在涡旋混合仪上剧烈混合10秒。将破碎细胞的混悬液在
4℃，以13000×g离心1h。小心除去上清液(裂解液)并用于纯化。将剩余的固体部份在1×Laemmli中再悬浮并用于SDS-PAGE分析。将裂解液与冷PBS(含有1×蛋白酶抑制剂片)以1:5混合并与100μLStrepTactin sepharose[VWR]在RT，600rpm培育30min。在PBS中进行5-倍稀释以降低细胞/培养基生物素对StrepTactin纯化效力的干扰影响。通过离心(2000×g/
1min)在2mL管中收集StrepTactin sepharose并用2mL冷TBS清洗两次。用70μL洗脱缓冲液(2.5mM脱硫生物素在1×TBS中)进行洗脱。在SDS-PAGE上分析洗脱部份，然后进行抗Strep WB并用于体外活性测定。
8.11.7体外糖基转移酶活性测定，2-氨基苯甲酰胺(2AB)标记和/或聚糖的清洗和HPLC分离
使用新鲜制备的试剂，以下列顺序加入位于冰上的1.5ml管中来进行HA-纯化的或者链霉亲和素-纯化的GNT的体外活性测定：1.50ng适当的2AB-标记的受体聚糖(例如，2AB-Man3a[Prozymes])或者500ng适当的未标记的受体聚糖(例如，Man3a[Prozymes])；10mM MgCl2；10mM MnCl2；1.2mM激活的糖(例如，UDP-GlcNAc或者UDP-Gal[Sigma Aldrich])。使用TBS缓冲液(pH 8.0，25mM Tris pH 7.5，100mM NaCl)将体积调节至50μl；加入20μL HA-富集的或者链霉亲和素-富集的GNT酶，或者对于相应空白对照，例如，仅洗脱缓冲液，加入水。
此后，将混合物短暂离心，并在RT，600rpm，o/n培育。就未标记的底物而言，在HPLC运行前，用Sep-Pak C18经典柱[Waters]从反应混合物纯化聚糖。根据(Bigge等人,1995)用2-AB标记样品。使用(Merry等人,2002)中所述的纸盘法进行聚糖清洗。在2AB-标记的底物的情况下，在体外测定中，在HPLC运行前进行PTFE清洗。
使用2AB标准品的用于唾液酸转移酶的体外反应(Luley-Goedl等人,2016)包含4μL含有40ng 2AB-G2(底物糖)，20μL HA-富集的蛋白SiaT；24μL 100mM MES pH 6.5(终浓度50mM MES pH 6.5)；1μL TritonX-100溶液(在100mM MES中)至终浓度0.1％(v/v)的TritonX-100和1μL 3.75mMCMP-Neu5Ac(溶于dH2O)储液(终浓度0.75mM)。以400rpm，在37℃进行反应
12h，在4℃冷却并在-20℃冷冻直至PTFE清洗和HPLC分析。使用MabThera作为底物进行进一步的反应。
使用MabThera抗体的用于唾液酸转移酶的体外活性测定使用了50μg(5μL)商品化MabThera(Roche，在制剂缓冲液中)，20μL HA-富集的蛋白SiaT(含有40μg HA肽，在100mM MES中，得自洗脱缓冲液)；22μL100mM MES pH 6.5(终浓度～100mM MES pH 6.5)；1μL TritonX-100溶液(在100mM MES中)至终浓度0.1％(v/v)的TritonX-100。起初，添加1.5mM CMP-Neu5Ac，并在6h后，添加另外1.5mM CMP-Neu5Ac增强剂，从而获得了终浓度3mM的CMP-Neu5Ac。以400rpm，在37℃进行反应12h，在4℃冷却并在-20℃冷冻直至通过PNGaseF的N-聚糖释放和RF-MS标记(根据6.11.4使用Rapifluor(RF)标记和MS的N-聚糖谱)。
根据(Royle等人,2002)，但修改为三溶剂系统，使用GlycoSep-N正相柱，通过HPLC进行
2-AB标记的聚糖的分离。溶剂A是10mM甲酸铵(pH 4.4)在80％乙腈中的溶液。溶剂B是30mM甲酸铵(pH 4.4)在40％乙腈中的溶液。溶剂C是0.5％的甲酸。柱温为30℃，并且通过荧光(λex＝330nm，λem＝420nm)检测2-AB标记的聚糖。梯度条件为以0.4ml/min的流速，在160min内，从100％A至100％B的线性梯度，然后2min内，100％B至100％C，流速提高至1ml/min。用
100％C清洗柱5min，在2min内返回100％A并以100％A，1ml/min的流速运行15min，然后流速恢复至0.4ml/min，5min。样品在水中进样。
8.11.8rhEPO从非工程化和糖工程化细胞系的表达和纯化
对于两种株，将2×200ml培养在26℃，在BHIH中以140rpm振荡生长72h。收获培养物并以2000×g离心45min。收获SN用于硫酸铵沉淀。简要地，在4℃，以11000×g离心1h之前，在RT通过(NH4)2SO4(40％W/V)使SN沉淀45min。除去SN并再悬浮，将剩余的棕色/黑色颗粒在
50ml 1×PBSpH 7.4中溶解。在4℃，使用5L PBS透析2h，并对5L透析o/n。将50ml透析样品加载至6ml StrepTactin柱。用20CV 1×PBS pH 7.4，0.5ml/min进行清洗。以1ml部份，使用
10CV 2.5mM脱硫生物素在1×PBS中的溶液洗脱蛋白。混合部分，并在-20℃，用加入混合的
4.5ml洗脱部分的冷丙酮(-20℃)沉淀o/n。将样品以8000g离心2h，并将沉淀颗粒溶于500ul ddH2O。
8.11.9N-糖基化位点占据和位点特异性糖基化的确定
(a)rhEPO的肽质量指纹图谱
将 SF用于提高蛋白在50mM碳酸氢铵中的酶促消化。通过Vivaspin 500PES
(5kDa)和4次离心(15000×g；10min，4℃)在50mM碳酸氢铵缓冲液，pH 8中制备对应于250μL的每个样品的180μg蛋白。最终蛋白浓度为约3mg/ml。
根据 SF规程(WATERS)，将蛋白在0.1％ SF中变性，通过DTT(5mM)
在60℃还原45分钟并通过碘乙酰胺(15mM)在室温下避光烷基化45分钟。将样品在37℃与
6.4μg胰蛋白酶/Lys-C混合物(质谱级(PROMEGA V507A#201254))培育16小时以获得消化蛋白。通过向消化的蛋白样品中加入0.5％TFA并在37℃培育30分钟，并以15000g离心10分钟来除去水解性表面活性剂。在0.1％TFA在水中的溶液中，在SEP Pack C18,200mg(Waters)上纯化所有胰蛋白酶肽。将洗脱体积(2mL 70％的乙腈，0.1％TFA)通过冻干完全干燥。
(b)糖肽富集方法
将肽溶解在40μL超纯水中，并根据 糖肽富集试剂盒规程72103-3
(Novagen)，将30μl用于糖肽富集。
将30μL样品加入至150μL ZIC Glycocapture树脂并收集含有未结合的肽的流经部分。
用225μL ZIC洗脱缓冲液洗脱糖肽。在真空离心干燥仪(speed vac.)中使流经部分和洗脱样品完全蒸发。将糖肽在15μL MilliQ水中再悬浮。在Zip Tips MILLIPORE C18上纯化以改善信噪比之后，将糖肽在50％甲醇中的溶液在maldi板上干燥并添加1μl CHCA
(LaserBiolabs)基质溶液(7mg/mL，在50％的乙腈中)。
(c)富集部分的去糖基化
将5μL混悬的糖肽调节至50mM乙酸钠缓冲液，并加入1μL PNGase F(Promega V483A#
226517)和1μL PNGase A(Sigma#01000353)以在37℃，16小时期间内去糖基化。在Zip Tips MILLIPORE C18(SOP P17/2)上制备后，将去糖基化的肽与CHCA(1:1)(LaserBiolabs)基质溶液(7mg/mL，在50:50乙腈/水，0.1％TFA中)混合。
制备流经部分并用CHCA(1:1)(LaserBiolabs)基质溶液(7mg/mL，在50:50乙腈/水，
0.1％TFA中)分析。
(d)MALDI-TOF MS分析
通过MALDI-TOF MS质谱，以正离子反射模式和线性模式分析流经部分中的肽、去糖基化的糖肽和占据的糖肽。在MALDI-TOF/TOF Autoflex III(Bruker Daltonics)上采集线性模型MALDI质谱。采集条件为：14.3×2904V，激光49％，6000个点(shots)。在MALDI-TOF/TOF AutoflexIII(Bruker Daltonics)(SOP 44/1)上采集正离子反射MALDI质谱。使用RP850-
3500 Bruker法的采集条件为40×2160V；激光97％，5000个点。
8.11.10用于蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)分泌蛋白的鉴定的肽谱
将St10569细胞在26℃，在400ml BHIH中振荡培养(140rpm)2d至OD为3.4。通过以2000×g离心收获上清液并在-80℃储存直至使用。将SN在4℃融化o/n，在RT与蛋白酶抑制剂混合物片(Roche，无EDTA)保持4h。
实施硫酸铵(NH4)2SO4沉淀以沉淀分泌蛋白。简要地，将40g(NH4)2SO4逐步加入SN(起始百分比浓度为10％)。添加160g后，样品混浊并进行最后一步40g。将样品在RT搅拌培育
40min。在4℃，以11000×g离心30min。将沉淀颗粒在20ml 1×结合缓冲液(1×TBS+1mM CaCl2+1mM MnCl2)(“1stSN)”中再悬浮。在4℃，以4000×g离心15min，颗粒仅有蛋白而无BHIH残留。观察到小的黑色颗粒，将其在10ml 1×结合缓冲液(1×TBS+1mM CaCl2+1mM MnCl2)中再悬浮。在4℃，以12-14K MWCO，使SN和再悬浮的颗粒在1×TBS中透析o/n以除去(NH4)2SO4。用新配制的1×TBS更换缓冲液，并在4℃，以12-14K MWCO再透析2.5h。将0.7ml ConA柱制备(1.4ml浆料)为珠与样品的比为1:50。将1mM CaCl2+1mM MnCl2加入至第二SN的样品中并用1×结合缓冲液填充至35ml以用于“再悬浮颗粒”样品。将ConA浆料加入至样品并在RT旋转4h。对于所有以下步骤，在RT，以1000×g离心5min。收集流经部分(FT)并取
100ul进行SDS PAGE。用2CV结合缓冲液清洗浆料4×，并收集清洗部分。用6CV洗脱蛋白，其中1CV(700ul)，将前两次洗脱部分在洗脱缓冲液(Vectorlab)中培育10min。
使用以下程序进行肽谱绘制。将5μl样品与40μl缓冲液(10mM Tris/2mM CaCl2，pH
8.2)和5μl胰蛋白酶(100ng/μl，在10mM HCl中)混合，并在60℃，微波处理30min。。将样品干燥，溶于20μl 0.1％的甲酸，用0.1％FA 1:2稀释并转移至LC/MS/MS的自动进样瓶中。进样1μl用于测量。
使用Mascot(swiss prot and uniref(所有物种))，以下fasta文件的数据库，在搜索程序中进行数据库搜索。
TriTrypDB-26_LmajorFriedlin_AnnotatedProteins.fastaTriTrypDB-26_
LtarentolaeParrotTarII_AnnotatedProteins.fasta
另外，对含有已知的利什曼虫(Leishmania)和锥虫属(Trypanosoma)的蛋白质组的常规数据库进行搜索：
Uniprot：布氏锥虫(Trypanosoma brucei brucei)(株927/4GUTat10.1)；克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)；克氏锥虫(Trypanosoma cruzi marinkellei)；活动锥虫
(Trypanosoma vivax)(株Y486)；克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)Dm28c；让氏锥虫(Trypanosoma rangeli)SC58；刚果锥虫(Trypanosoma congolense)(株IL3000)；克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)(株CL Brener)；冈比亚布氏锥虫(Trypanosoma brucei gambiense)(株MHOM/CI/86/DAL972)；婴儿利什曼虫(Leishmania infantum)；硕大利什曼虫
(Leishmania major)；巴西利什曼虫(Leishmania braziliensis)；墨西哥利什曼虫(Leishmania mexicana)(株MHOM/GT/2001/U1103)；杜氏利什曼虫(Leishmania donovani)(株BPK282A1)。
TriTrypDB(http://tritrypdb.org/tritrypdb/)：硕大利什曼虫(Leishmaniamajor friedlin)；蜥蜴利什曼虫(Leishmania tarentolae)Parrot Tar II；布氏锥虫
(Trypanosoma brucei)Lister 427；克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)Dm28c。
总蛋白：155'504
以Scaffold汇总搜索结果(如果存在，隐藏胰蛋白酶、角蛋白、其它常见污染物和诱饵匹配数(decoy hits))。
8.11.11用于鉴别信号肽的N末端测序
对于通过EDMAN降解的信号肽的N末端测序，使用SEC 10/300Superdex GL进一步纯化Con A富集的分泌蛋白。为此，将24ml CV ConA洗脱部分混合并使用3K MWCO Amicon过滤器在1×PBS pH 7.4中浓缩至500ul。用0.5ml/min流速加载SEC柱，并以0.5ml体积收集等份。
观察到在极低mAU所观察到的几个峰并混合。以可以分离不同的峰/蛋白的方式进行混合。
使用Amicon 3K MWCO实施超速离心以浓缩样品体积。将样品加载至SDS PAGE并在PDVF膜上印迹，用丽春红染色并切割蛋白条带并进行EDMAN测序。
8.11.12通过不同信号肽的rhEPO表达和分泌的评价
将重组细胞系St 11376和St11377分别在26℃，以140rpm，以1：40在5×400ml BHIH中生长3天(72h)。在以2000×g离心沉降40min后收获上清液。如下所示，将对应于15OD的上清液用于三氯乙酸(TCA)沉淀：将上清液在冰上冷却，将100％TCA加入至最终浓度10％，并在冰上培育15-30min，在4℃，以11000×g离心30min，用1mL冰冷的丙酮清洗，在4℃，以11000×g离心30min。将沉淀颗粒在1×Laemmli(30μL)中再悬浮并加入至5μL 1M TrisHCl(pH
8.0)以调节pH(颜色指示由黄变为蓝)。将含有分泌的Strep-标签化rhEPO的TCA沉淀的上清液用于WB和考马斯亮蓝分析。加载15OD SN TCA并在200V，使用MOPS运行缓冲液在10％Bis-Tris凝胶上运行60min。对于抗Strep免疫印迹和考马斯亮蓝染色，将2ug uDarpinLL用作加TM
样对照。以20-25V，用iblot (Invitrogen)P0进行印迹，随后在10％奶粉中封闭膜。以1:
1000，在30℃，使用多克隆抗Strep-标签II抗体(兔，Abcam ab76949)进行检测1h，随后以1:
1000，在30℃，使用第二抗体山羊抗兔HRP(Biorad，170-6515)检测1h。将TMB用于显色检测。
通过染色o/n和ddH2O脱色o/n进行考马斯亮蓝染色。
8.11.13高尔基体定位蛋白的CTS区的生物信息学预测和杂交体设计
用于TM和信号肽预测的方法为：1)http://phobius.sbc.su.se/Phobius( 2004)，A Combined Transmembrane Topology and Signal Peptide PredictionMethod)；2)基于HMM的信号肽和跨膜拓扑结构预测(声称比TMHMM和SignalP的假阳性率更低)和3)SignalP。
对4类蛋白训练HMM：具有/不具有信号肽的跨膜蛋白，具有/不具有信号肽的非跨膜蛋白。
8.11.14用于亚细胞分离的亲合标签化异源Gnt的纯化
收获表达HA-或Strep-标签化GNT酶的细胞(1×109，对应于50OD)并离心(4000×g/
10min)以将SN与细胞颗粒分离。如下所示，将上清液(对应于5或10OD)用于TCA沉淀：将上清液在冰上冷却，将100％TCA加入至最终浓度10％，并在冰上培育15-30min，在4℃，以11000×g离心30min，用1mL冰冷的丙酮清洗，在4℃，以11000×g离心30min。将沉淀颗粒在1×Laemmli(～30μL)中再悬浮并加入至5μL 1M TrisHCl(pH 8.0)以调节pH(颜色指示由黄变为蓝)。将TCA沉淀的上清液用于WB分析。将颗粒在使用或不使用1％(v/v)TritonX-100的
1mL提取缓冲液(ExB，125mM Tris pH 7.5，100mM NaCl，无EDTA的蛋白酶抑制剂[Roche]，
1mM PMSF)中再悬浮。将再悬浮的细胞在冰上超声处理[Bandelin Sonopuls]以避免任何种类的过热。以3个步骤，10秒，70％功率输入，7个循环进行超声处理，并在涡旋混合仪上剧烈混合10秒。将破碎的细胞悬液在4℃，以13000×g旋转1h。小心除去上清液(裂解液)并将其用作免疫印迹分析的直接载样(具有1×Laemmli)。使用细胞均质机(cell douncer)[Sigma Aldrich]，使剩余的颗粒(+/-TritonX)分别在补充有1％(v/v)TritonX-100的500μL ExB中溶解以用于更好的均质化。此后，将细胞悬液在4℃，以13000×g离心1h。将可溶性部分用作WB分析的直接载样(具有1×Laemmli)(称为“不溶性部分”)。任选地，将残留的颗粒(称为细胞碎片)在1×Laemmli中再悬浮并用于WB分析。在使用适当检测抗体的WB之后，在SDS-PAGE上分析所有部份。可以基于不同部份(例如，上清液、裂解液+/-TritonX、细胞碎片)中WB条带的存在和强度来解释Gnt的膜结合。
SDS PAGE的条件如下所示：将样品在1×Laemmli加样染料中加热至95℃，10min；使用MOPS缓冲液，在200V，对10％Bis-Tris凝胶运行60min。以20-25V，用iblotTM(Invitrogen)P0进行印迹，随后在10％奶粉中封闭膜。在30℃，以1:1000使用多克隆抗Strep-标签II抗体(兔，Abcam ab76949)或者以1:1000使用兔抗HA标签化抗体(Sigma,H6908)进行检测1h，随后以1:1000或者1:2000，在30℃，使用第二抗体山羊抗兔IgG HRP(Biorad，170-6515)检测
1h。将TMB用于显色检测。
8.12蜥蜴利什曼虫(L.tarentolae)中抗-CD20“利妥昔单抗”的表达、纯化和分析(a)表达
将5×1000ml的St12427(p13，p5026)培养物在26℃，在BHIH中以140rpm振荡培养72h。
收获培养物并以2000×g离心15min。将4片蛋白酶抑制剂混合物(Roche)和EDTA(1mM最终浓度)加入至5000ml培养基SN。在用Vivaflow 200(50000Da)浓缩之前，将5000ml培养基SN通过0.22um过滤器过滤。使用100ml BSA(2g/L)封闭Vivaflow，封闭后，用1L ddH2O清洗膜。将SN浓缩5倍至1000ml，vivaflow的流速为600ml/min。
(b)纯化
在4℃，用蠕动泵将培养基SN连续离线加载过夜至10ml蛋白A柱。将柱连接至NGC系统并用8CV 1×PBS pH 7.4清洗。使用0.15M甘氨酸pH 2.5进行洗脱，并通过添加150ul 1M Tris pH 8.5直接中和。用0.7g(NH4)2SO4调节含有利妥昔单抗的混合部分(10ml)并以1ml/min的流速加载至1ml HIC(PhenylSepharose GE)，用缓冲液A 20mM Tris，1M(NH4)2SO4 pH 7.0和缓冲液B 20mM Tris pH 7.0梯度洗脱。收集1000ul部份并通过考马斯亮蓝染色的SDS PAGE和免疫印迹分析。
(c)分析
SDS PAGE和毛细管凝胶电泳：在还原或非还原条件下，对于考马斯亮蓝染色使用10ug，对于WB使用2.5ug，在4-12％凝胶上分离，使用MOPS缓冲液，进行SDS PAGE 55min。使用10ug蛋白样品，通过考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE确定蛋白纯度并与BSA标准曲线相比较。通过ImageQuant定量杂质。根据规程，使用Agilent Protein 230试剂盒(5067-1518)进行毛细管凝胶电泳(CGE)。
分析型SEC：MAbPac SEC-1(4×300mm)是针对单克隆抗体(mAbs)的分离和鉴定所设计的尺寸排阻色谱(SEC)柱，并根据生产商的建议使用(温度：30℃；洗脱剂：PBS 50mM NaPO4，
300mM NaCl pH 6.8；洗脱：等度，30min；流速：0.2mL/min；检测：215nm；进样V：5uL，对应于
5ug蛋白)。
8.12.2单克隆抗体样品的N-聚糖谱
(a)N-聚糖的糖苷酶消化&全甲基化：
将IgG(200μg/40μl)在200μl 50mM磷酸盐缓冲液pH 7.5中混悬，并在0.5％十二烷基硫酸钠(SDS Sigma L4509)和1％β巯基乙醇中，在90℃变性10min。在最终反应体积484μl中添加22μl NP40之后，通过使用15个单位的PNGase F(PROMEGA#226517ref V483A)，在37℃，在磷酸盐缓冲液pH 7.5中酶促消化15小时使蛋白去糖基化。通过电泳控制去糖基化。在10min期间，将6.5μl去糖基化前后的样品在70℃加热10min，并加载至 MES缓冲液
(Invitrogen NP0002)+抗氧化剂中的 Novex Bis-Tris 4-12％凝胶，1.0MM，
12w(Invitrogen)上。在恒定200V，运行时间35min。在1H期间，用Simply BlueSafestain(Invitrogen)对凝胶染色并在水中脱色。
在Hypercarb Hypersep 200mg(Thermo Fisher)上纯化N-聚糖。在加载PNGase释放的N-聚糖之前用0.1％TFA平衡SPE并用0.1％TFA清洗。在用3ml 25％的乙腈，0.1％TFA洗脱之后，在全甲基化之前将N-聚糖冻干。使用约25mg的氢氧化钠，500μl DMSO和300μl ICH3，在
40min内，对冻干样品进行全甲基化。在用1ml水使反应淬灭后，将3×500μl的氯仿用于全甲基化聚糖的提取。用相等体积的水清洗氯仿相，然后干燥。将反应产物加载至C18 SepPak
200mg(WATERS)上并在2ml 80％的乙腈中洗脱，并在MALDI-TOF MS分析之前冻干。
8.12.3N-聚糖的MALDI-TOF分析：
在20μl 50:50的甲醇/水中溶解纯化的全甲基化聚糖。用1μl CHCA(LaserBiolabs)基质溶液(7mg/ml，50:50的乙腈/水中的溶液)对2μl未稀释的和1/2稀释的N-聚糖点样。使用Autoflex III质谱仪(Bruker)采集正离子反射MALDI-TOF质谱。通过4000点(shots)积累获得光谱并通过外标(Pepmix4 LaserBiolabs)校准。如下所示，设置加速和反射极电压条件：
电压14.7×2008V，80％的激光。
+
使用EXPAZY GlycoMod工具进行对应于单同位素质量[M+Na]的N-聚糖结构解析。计算N-聚糖的相对强度(％)以建立每个光谱的N-聚糖谱。对此，确定了去同位素的N-聚糖峰强度之和并设置为100％。然后，相对于该值确定了每个聚糖的相对强度(％)。
8.12.4FACS
将Raji细胞用于抗CD20抗体测试。存在5个不同的预期浓度，使用10微克/ml作为流式细胞术的期待最优浓度(表16)。染色序列：-FcR封闭、-IgG1封闭、-第一抗体、-第二抗体抗IgG1 APC。在设门后，每个样品代表10000-13000个细胞的分析。对照IgG1抗体也提供了一定的信号。原因可以是不充分的封闭和通过Fc-受体的结合，或者通过其特异性的结合-对照抗体的特异性未知，尽管它常用于此目的。封闭对照显示FcR自身封闭实际导致了低背景信号，通过使用未标记的抗人-IgG1的第二封闭步骤再次逆转(未显示)。
使用通过以150×g(790rpm，Hettich Rotixa RP转子4210)旋转5min，从培养瓶中收集的Raji细胞的抗CD20抗体的分析，完全除去上清液，并且细胞是以每80μl清洗缓冲液中107个细胞，在清洗缓冲液(DPBS w/o Ca++/Mg++，加入至2％胎牛血清，在4℃储存；DPBS w/o Ca++/Mg++，Corning 21-031-CMR，批号21031494R)中再悬浮的细胞，加入20μl FcR封闭试剂。在4℃，避光培育10min。通过以下方法进行清洗：添加1.4ml D-PBS/107个细胞，将细胞以250×g(1750rpm，Eppendorf 5415C)旋转5min，完全除去上清液。
将细胞在80μl DPBS/107个细胞中再悬浮，加入20μl纯的抗-人-IgG1(＝20μg/ml)，在冰箱中避光培育10min，通过添加1.4ml清洗缓冲液/107个细胞清洗，将细胞以250×g旋转
5min，完全除去上清液。将细胞在20μl清洗缓冲液/2×106个细胞中再悬浮，根据以下样品时间表加入第一抗体，在冰箱中避光培育10min，通过添加0.7ml清洗缓冲液/107个细胞清洗，将细胞以250×g旋转5min，完全除去上清液。将细胞在20μl清洗缓冲液/2×106个细胞中再悬浮，根据以下样品时间表加入2μl第二抗体抗-人-IgG1-APC，在冰箱中避光培育
10min，通过添加0.7ml清洗缓冲液/107个细胞清洗，将细胞以250×g旋转5min，完全除去上清液。将细胞在300μl清洗缓冲液中再悬浮，在冰上保持直至通过流式细胞术分析。如下所示，使用试剂：FcR封闭试剂，Miltenyi 130-059-901，批号5170330778；纯的抗-人-IgG1(100μg，在1ml中)，Miltenyi 130-093-197，批号5170426031；抗-人-IgG1-APC，Miltenyi
130-099-126，批号5170426074。
表16用于FACS的样品制剂
点-印迹：
使用DotBlot管吸印仪(manifold)将5-1000ng CD20-GST(Proteintech,#ag17309)在NC-膜上印迹，并用10％奶粉/PBST在4℃封闭o/n。切下泳道并在RT，与5ug/ml利妥昔单抗_LMTB 2ug/ml AntiGoEL、2ug/ml AntiMBP、1:2000抗-His一起在1％奶粉的
PBST溶液中培育2h。用PBST清洗泳道(3×5min)，并在RT，与抗人-IgG-HRP(1:2000)或者抗小鼠在1％奶粉的PBST溶液中培育1h。用PBST清洗泳道(3×5min)，并使用TMB使印迹显像。
利妥昔单抗EDMAN降解、IP-MS和肽谱：
如下所示进行样品制备和分析：
还原、烷基化：在8M脲，50mM TEAB缓冲液中增溶溶解，通过5mMTCEP还原并在RT培育20分钟。使用10mM IAA烷基化，并在RT，避光培育20分钟。
去糖基化：在烷基化之后，通过添加PNGase F酶缓冲液1:10稀释抗体样品。对于25μg抗体，加入0.5μl PNGase F。将样品在37℃进一步培育1h。
SDS-PAGE：将烷基化和去糖基化的抗体样品溶解在 缓冲液中。将5μg样品等
份加载至SDS-PAGE凝胶。在凝胶运行(150V，max.400mA，75min)后，将凝胶在50％乙醇，10％乙酸中培育30min，然后用考马斯亮蓝对凝胶染色。
胶内酶促切割：通过分别在100mM TEAB或者50mM TEAB，60％ACN中膨胀/收缩3次，将从SDS-PAGE凝胶切下的凝胶制备用于酶促切割。将每个步骤在RT下进行30min。在最后一次收缩步骤之后，将凝胶切片在打开的eppys中干燥15min。通过添加3倍体积的酶溶液(酶/蛋白比为1:40)起始蛋白水解。蛋白水解过夜。在质谱之前，用0.5％(终浓度)的甲酸使所得的肽酸化。
完整质量确定：在用0.5％ACN，0.5％FA稀释至约1pmol/μl(1:50)并将5μl应用于通过LC-系统的质谱仪后，将去糖基化和还原的抗体用于其子链的完整质量确定。通过Thermo Scientific Orbitrap XL质谱仪的LTQ和FT检测器进行检测。使用Znova算法进行电荷反卷积。
高分辨率MS：将Agilent 1100nanoLC系统与Orbitrap XL质谱仪偶联。在酸化后，将来自蛋白水解的样品应用于nanoLC-ESI MS/MS。在使用0.5％ACN/0.5％FA溶液在富集柱(Zorbax SB C18，0.3mm×5mm,Agilent)上对肽捕集和脱盐5min之后，使用5％至40％ACN的ACN/0.1％FA梯度在Zorbax 300SB C18,75μm×150mm柱(Agilent)上分离肽。根据生产商对于nanoLC-ESI-MSMS分析的仪器设置，以FT-模式自动采集MS总览光谱。也以FT-模式进行肽碎片化(CID)和检测。
数据库搜索：将通过高分辨质谱所采集的数据组用于对客户提供的常规序列数据库进行数据库搜索。根据预期蛋白修饰和本研究中所使用的MS仪器来设置搜索参数。相对于给定酶的特异性，通过PEAKS(Bioinformatics solutions)软件完成序列组装。
6.13基因组测序和注释
(a)测序和序列修正
在12PacBio RS2 SMRT cells(v3.0 P6/C4化学，根据生产商的说明书进行文库制备并且尺寸选择为8-9kbp)和Illumina HiSeq(2×150bp双端测序；根据生产商的说明书，TruSeq文库制备为400-600bp片段)上对St10569基因组DNA测序。所得原始数据包括6M PacBio读序，其平均读序长度为6549bp，和14M Illumina读序。
使用HGAP[https://github.com/PacificBiosciences/Bioinformatics-Training/wiki/HGAP-in-SMRT-Analysis]将PacBio原始读序组装成重叠群，并且使用两轮Arrow[https://github.com/PacificBiosciences/GenomicConsensus]修正错误。将Abacas2(Assefa等人,2009)用于沿基于杜氏利什曼虫(Leishmania donovani)的参考基因组(Dumetz等人,2017)拼接所得重叠群(最小重叠1000bp，最小同一性15％)。基于大于1kb的PacBio精修读序(polished reads)，将PBjelly(English等人,2012)用于尝试封闭剩余的缺口。基于Illumina数据，进行5轮Pilon精修(Walker等人,2014)以修正所得染色体拼接中剩余的测序错误。
(b)注释
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