用于遗传障碍的基因疗法的基因组编辑手段和结合病毒载体的基因疗法
阅读：825发布：2020-06-12
专利汇可以提供用于遗传障碍的基因疗法的基因组编辑手段和结合病毒载体的基因疗法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及重组病毒载体，所述重组病毒载体优选逆转录病毒(RV)载体、慢病毒(LV)载体或腺相关病毒(AAV)载体；其组合物；所述重组病毒载体或其组合物的用途；部件的套装，所述套装包括所述重组病毒载体或其组合物以及催化活性的Cas9或Cpf1蛋白；用于修饰细胞的基因组的方法；以及通过此方法可获得的细胞。，下面是用于遗传障碍的基因疗法的基因组编辑手段和结合病毒载体的基因疗法专利的具体信息内容。
1.一种重组病毒载体，所述重组病毒载体在其基因组中包含：
(i)编码引导RNA(gRNA)的核苷酸序列，所述引导RNA包含适于结合至靶核苷酸序列的间隔区，所述靶核苷酸序列在靶基因的编码序列内、在靶基因的转录的非编码序列内或在靶基因的上游或下游的非转录序列内，所述靶基因参与遗传障碍；以及
(ii)编码在所述遗传障碍中具有治疗效果的蛋白质的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的重组病毒载体，其中，所述载体为逆转录病毒载体或腺相关载体。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的重组病毒载体，其中，所述具有治疗效果的蛋白质为真核蛋白质、优选哺乳动物蛋白质、优选人蛋白质。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组病毒载体，其中，所述具有治疗效果的蛋白质选自于由以下所组成的组：FGFR3、PBGD、SERPINA1、COL4A3、COL4A4、C9、f72、SOD1、TARDBP、FUS、ALS2、ANG、ATXN2、CHCHD10、CHMP2B、DCTN1、ERBB4、FIG4、HNRNPA1、MATR3、NEFH、OPTN、PFN1、PRPH、SETX、SIGMAR1、SMN1、SPG11、SQSTM1、TBK1、TRPM7、TUBA4A、UBQLN2、VAPB、VCP、CTLA4、NFKBIA、RHO、GNAT1、PDE6B、STAT3、PMP22、MPZ、LITAF、EGR2、NEFL、MFN2、KIF1B、RAB7A、LMNA、TRPV4、BSCL2、GARS、HSPB1、MPZ、GDAP1、HSPB8、DNM2、YARS、GJB1、PRPS1、STAT1、NFKB2、NFKB1、IKZF1、TNFRSF13B、ABCC8、KCNJ11、GLUD1、HADH、HNF1A、HNF4A、SLC16A1、UCP2、PTEN、SDHB、SDHD、KLLN、WT1、RHOA、TERC、THAP1、COL7A1、TOR1A、COL3A1、COL1A1、COL1A2、COL7A1、KRT5、KRT15、PLEC1、ITGB4、APC、BRCA1、RB1、FMR1、SLC40A1、ACVRL1、ENG、SMAD4、FH、BRCA1、BRCA2、HOXB13、REEP1、ATL1、SPAST、WASHC5、ANK1、EPB42、SLC4A1、SPTa1、SPTB、HTT、STAT3、LDLR、APOB、PCSK9、SCN4A、CACNA1S、SCN4A、UNC119、PIK3CD、GATA2、IFNGR1、STAT1、STAT1、IRF8、PIK3R1、IFNAR2、BCL11B、TNFRSF13B、IKBKG、TWNK、p53、CHEK2、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM、FBN1、HNF4A、GCK、HNF1A、PDX1、TCF2、NEUROD1、KLF11、CEL、PAX4、INS、BLK、KCNJ11、APPL1、HIVEP2、MEN1、RET、CDKN1B、EXT1、EXT2、SGCE、DMPK、CNBP、NF1、NF2、ELANE、PTCH1、COL1A1、COL1A2、CRTAP、P3H1、STK11、PKD1、PKD2、ATP1A3、RHO、RP1、PRPH2RP9、IMPDH1、PRPF31、PRPF8、CA4、PRPF3、ABCA4、NRL、FSCN2、TOPORS、SNRNP200、SEMA4A、NR2E3、KLHL7、RGR、GUCA1B、BEST1、PRPF6、PRPF4、β-珠蛋白、γ-珠蛋白、δ-珠蛋白、容纳有一个Thr87Gln突变的β-珠蛋白、容纳有三个突变Gly16Asp、Glu22Ala和Thr87Gln的β-珠蛋白、容纳有两个突变Gly16Asp和Glu22Ala的γ-珠蛋白、容纳有一个突变Gly16Asp的δ-珠蛋白、VAPB、ATXN1、ATXN2、ATXN3、NOP56、CACNA1A、SC1、TSC2、VHL和VWF。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组病毒载体，其中，当所述靶基因在患者中表达时，所述靶基因参与所述遗传障碍。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组病毒载体，其中，所述靶基因选自于由以下所组成的组：FGFR3、PBGD、SERPINA1、COL4A3、COL4A4、C9orf72、SOD1、TARDBP、FUS、ALS2、ANG、ATXN2、CHCHD10、CHMP2B、DCTN1、ERBB4、FIG4、HNRNPA1、MATR3、NEFH、OPTN、PFN1、PRPH、SETX、SIGMAR1、SMN1、SPG11、SQSTM1、TBK1、TRPM7、TUBA4A、UBQLN2、VAPB、VCP、CTLA4、NFKBIA、RHO、GNAT1、PDE6B、STAT3、PMP22、MPZ、LITAF、EGR2、NEFL、MFN2、KIF1B、RAB7A、LMNA、TRPV4、BSCL2、GARS、HSPB1、MPZ、GDAP1、HSPB8、DNM2、YARS、GJB1、PRPS1、STAT1、NFKB2、NFKB1、IKZF1、TNFRSF13B、ABCC8、KCNJ11、GLUD1、HADH、HNF1A、HNF4A、SLC16A1、UCP2、PTEN、SDHB、SDHD、KLLN、WT1、RHOA、TERC、THAP1、COL7A1、TOR1A、COL3A1、COL1A1、COL1A2、COL7A1、KRT5、KRT15、PLEC1、ITGB4、APC、BRCA1、RB1、FMR1、SLC40A1、ACVRL1、ENG、SMAD4、FH、BRCA1、BRCA2或HOXB13、REEP1、ATL1、SPAST、WASHC5、ANK1、EPB42、SLC4A1、SPTa1、SPTB、HTT、STAT3、LDLR、APOB、PCSK9、SCN4A、CACNA1S、SCN4A、UNC119、PIK3CD、GATA2、IFNGR1、STAT1、STAT1、IRF8、PIK3R1、IFNAR2、BCL11B、TNFRSF13B、IKBKG、TWNK、TP53、CHEK2、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM、FBN1、HNF4A、GCK、HNF1A、PDX1、TCF2、NEUROD1、KLF11、CEL、PAX4、INS、BLK、KCNJ11、APPL1、HIVEP2、MEN1、RET、CDKN1B、EXT1、EXT2、SGCE、DMPK、CNBP、NF1、NF2、ELANE、PTCH1、COL1A1、COL1A2、CRTAP、P3H1、STK11、PKD1、PKD2、ATP1A3、RHO、RP1、PRPH2RP9、IMPDH1、PRPF31、PRPF8、CA4、PRPF3、ABCA4、NRL、FSCN2、TOPORS、SNRNP200、SEMA4A、NR2E3、KLHL7、RGR、GUCA1B、BEST1、PRPF6、PRPF4、β-珠蛋白、VAPB、ATXN1、ATXN2、ATXN3、NOP56、CACNA1A、SC1、TSC2、VHL、BCL11A和VWF。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的重组病毒载体，其中，所述遗传障碍选自于由以下所组成的组：
优选镰状细胞障碍(SCD)。
8.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1-7所述的重组病毒载体或根据权利要求1-7所述的多个重组病毒载体。
9.一种部件的套装，所述套装包括：
-根据权利要求1-7所述的重组病毒载体或根据权利要求8所述的组合物；以及
-催化活性的Cas9或Cpf1蛋白或者编码催化活性的Cas9或Cpf1蛋白的核苷酸序列。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的重组病毒载体或根据权利要求8所述的组合物或根据权利要求9所述的试剂盒用于将以下导入细胞中的用途：(i)编码引导RNA(gRNA)的核苷酸序列，所述引导RNA包含适于结合至靶核苷酸序列的间隔区，所述靶核苷酸序列在靶基因的编码序列内、在靶基因的转录的非编码序列内或在靶基因的上游或下游的非转录序列内，所述靶基因参与遗传障碍；以及(ii)编码在所述遗传障碍中具有治疗效果的蛋白质的核苷酸序列。
11.一种用于体外或离体修饰细胞的基因组的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使细胞与根据权利要求1-7中任一项所述的重组病毒载体或根据权利要求8所述的组合物接触，以获得经转导的细胞；以及
b)将催化活性的Cas9或Cpf1蛋白或者编码催化活性的Cas9或Cpf1蛋白的核苷酸序列导入所述经转导的细胞中，当导入或表达入所述经转导的细胞中时，所述催化活性的Cas9或Cpf1蛋白破坏所述靶基因的表达和/或功能。
12.一种体外或离体制备遗传学上修饰的细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使细胞与根据权利要求1-7中任一项所述的重组病毒载体或根据权利要求8所述的组合物接触，以获得经转导的细胞；以及
b)将催化活性的Cas9或Cpf1蛋白或者编码催化活性的Cas9或Cpf1蛋白的核苷酸序列导入所述经转导的细胞中，当导入或表达入所述经转导的细胞中时，所述催化活性的Cas9或Cpf1蛋白破坏所述靶基因的表达和/或功能。
13.根据权利要求11-12中任一项所述的方法，其中，所述细胞为真核细胞、优选哺乳动物细胞、优选人细胞。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中，所述细胞为干细胞，优选造血干细胞(HSC)、祖细胞或分化的细胞。
15.通过根据权利要求11-14中任一项所述的方法获得的遗传学上修饰的细胞。
16.用作药物的根据权利要求15所述的遗传学上修饰的细胞。
17.用于选自于由以下所组成的组中的遗传障碍的治疗中的根据权利要求15所述的遗传学上修饰的细胞：
18.根据权利要求17所述的用途的遗传学上修饰细胞，其中，所述遗传障碍为血红蛋白病，优选镰状细胞障碍(SCD)。
用于遗传障碍的基因疗法的基因组编辑手段和结合病毒载体
的基因疗法
背景技术
[0002] 遗传障碍可为遗传性的并且由家族成员传递，或不可遗传的并且在人的有生之年中获得。获得性遗传障碍是指由基因组中的获得性异常引起的病情。这些病情只有当异常在种系中发生时才变成可遗传的。
[0003] 有许多不同类型的遗传障碍：
[0004] -单基因障碍(也称为孟德尔遗传或单基因遗传)：这一类型的遗传性的障碍由单个基因的DNA序列中发生的变化或突变引起。有超过6,000种已知的单基因障碍，其在大约每200个新生儿的1个中发生。一些实例为镰状细胞障碍、免疫缺陷、马凡综合征、亨廷顿氏病和4型遗传性血色素沉着症、先天性高胰岛素血症、遗传性球形红细胞增多症、1型中性粒细胞减少症、Li-Fraumeni综合征。单基因障碍以可识别的模式遗传：常染色体显性、常染色体隐性和X连锁。
[0005] -多因子遗传(也称为复杂遗传或多基因遗传)：这一类型的遗传由环境因子和多个基因中的突变的组合引起。一些常见的慢性疾病为多因子障碍。实例包括心脏病、高血压、阿尔茨海默病、关节炎、糖尿病、癌症和肥胖。
[0006] -染色体异常：染色体是由DNA和蛋白质构成的独特结构，位于每个细胞的细胞核中。因为染色体是遗传物质的载体，染色体数目或结构的异常可导致疾病。例如，唐氏综合征或21三体是当人具有21号染色体的3个拷贝时发生的常见障碍。有许多其它的染色体异常，包括特纳综合征、克氏综合征和猫叫综合征。
[0007] -线粒体遗传：这一类型的遗传障碍由线粒体的非染色体DNA中的突变引起。线粒体是小的圆形或棒状细胞器，其参与细胞呼吸并在动物和植物细胞的细胞质中发现。每个线粒体可含有5-10个DNA的环状片段。线粒体疾病的实例包括称为Leber遗传性视神经萎缩的眼病；称为MERRF(代表伴不整红边纤维的肌阵挛性癫痫)的一类癫痫；以及称为MELAS(代表线粒体脑病、乳酸酸中毒和卒中样发作)的痴呆形式。
[0008] 大多数遗传障碍为单基因障碍。单基因障碍可为显性(常染色体显性)或隐性(常染色体隐性)。
[0009] 如果是常染色体显性，对于将受常染色体显性障碍影响的人而言，将仅需要基因的一个突变拷贝。一般而言，每个受影响的人通常有一位受影响的父母。因此，孩子继承突变基因的几率为50％。常染色体显性病情有时具有降低的外显性，这意味着尽管仅需要一个突变拷贝，并非所有遗传了该突变的个体继续发展出该疾病。此类障碍的实例为亨廷顿氏病、1型神经纤维瘤病、2型神经纤维瘤病、马凡综合征、遗传性非息肉病性结直肠癌、遗传性多发性外生骨疣(高度外显的常染色体显性障碍)、结节性硬化症、血管性血友病和急性间歇性卟啉症。
[0010] 如果是常染色体隐性，对于将受到常染色体隐性障碍影响的人而言，基因的两个拷贝必须突变。受影响的人通常有未受影响的父母，父母各自携带突变基因的单个拷贝。因此，各自携带突变基因的一个拷贝的两个未受影响的人具有25％的风险每次怀孕具有一个受该障碍影响的孩子。此类障碍的实例为镰状细胞病。
[0011] 遗传障碍的治疗已引起新疗法例如基因疗法的发展。基因疗法是指将功能基因(或编码具有治疗效果的蛋白质的核苷酸序列)导入患者的细胞中的治疗形式。这应减轻由改变的基因引起的缺陷或减慢疾病的进展。基因疗法由程序的精确性和直接治疗效果的意图来定义。因此，基因疗法是从其源头修正遗传问题的方法。
[0012] 对于基因疗法，已考虑了两种主要的手段：替换缺陷基因或破坏缺陷基因。在这些手段中，治疗性DNA必须进入细胞，替换/破坏基因，从而表达/破坏蛋白质。因此，主要障碍是基因向受该障碍影响的适当的细胞、组织和器官的递送。
[0013] 已探索了多种递送技术。最初的手段是将治疗性DNA掺入经工程化的病毒中，以将治疗性DNA递送至患者的细胞中。为将治疗性DNA递送入靶细胞中，还探索了用于转染入患者的细胞中的裸DNA手段。
[0014] 最近，使用诸如锌指核酸酶、TALENs或CRISPR的技术的新手段已引起更直接的DNA编辑。这些手段的目的是表达敲除、修改或编辑基因组中的特定基因的核酸酶。这些手段涉及：(i)基于从患者移出细胞、编辑基因并且将经转化的细胞返回患者的离体手段；(ii)基于通过病毒载体或纳米颗粒将核酸酶递送至靶组织中的体内手段。
[0015] 此外，上述手段仅被设计为将治疗性DNA掺入患者的细胞中或编辑患者的细胞中的改变的基因。这些手段未被设计为既将治疗性DNA掺入患者的细胞中且又敲除患者细胞中的改变的基因。该双重功能可特别用于治疗遗传障碍，例如常染色体显性遗传障碍或隐性遗传障碍，其中内源性突变蛋白的表达损害了通过外源性修正的蛋白的表达诱导的有益作用。
[0016] 因此，需要找到新的易于实践的手段，所述手段既用于将治疗性DNA掺入患者的细胞中，又敲除所述患者的细胞中的改变的基因。发明内容
[0017] 此处，发明人提出了用于基因治疗的新的重组病毒载体和过程，该过程对于将治疗性DNA掺入患者的细胞中(即“基因添加”)和敲除所述患者的细胞中的改变的基因(即“基因编辑”)特别有效且易于实践。
[0018] 本发明涉及重组病毒载体，所述重组病毒载体在其基因组中包含：
[0019] (i)编码引导RNA(gRNA)的核苷酸序列，所述引导RNA包含适于结合至靶核苷酸序列的间隔区，所述靶核苷酸序列在靶基因的编码序列内、在靶基因的转录的非编码序列内或在靶基因的上游或下游的非转录序列内，所述靶基因参与遗传障碍；以及
[0020] (ii)编码在所述遗传障碍中具有治疗效果的蛋白质的核苷酸序列。
[0021] 本发明还涉及包含根据本发明所述的重组病毒载体或根据本发明所述的多个重组病毒载体的组合物。
[0022] 本发明还涉及部件的套装，所述套装包括：
[0023] -本发明所述的重组病毒载体或本发明所述的组合物；以及
[0024] -催化活性的Cas9或Cpf1蛋白或者编码催化活性的Cas9或Cpf1蛋白的核苷酸序列。
[0025] 本发明还涉及本发明所述的重组病毒载体或本发明所述的组合物用于将如下导入细胞中的用途：(i)编码引导RNA(gRNA)的核苷酸序列，所述引导RNA包含适于结合至靶核苷酸序列的间隔区，所述靶核苷酸序列在靶基因的编码序列内、在靶基因的转录的非编码序列内或在靶基因的上游或下游的非转录序列内，所述靶基因参与遗传障碍；以及(ii)编码在所述遗传障碍中具有治疗效果的蛋白质的核苷酸序列。
[0026] 本发明还涉及用于体外、离体或体内修饰细胞的基因组的方法，所述方法包括以下步骤：
[0027] a)使细胞与本发明所述的重组病毒载体或本发明所述的组合物接触，以获得经转导的细胞；以及
[0028] b)将催化活性的Cas9或Cpf1蛋白或者编码催化活性的Cas9或Cpf1蛋白的核苷酸序列导入所述经转导的细胞中，当导入或表达入所述经转导的细胞中时，所述催化活性的Cas9或Cpf1蛋白破坏所述靶基因的表达和/或功能。
[0029] 本发明还涉及用于体外、离体或体内制备遗传学上修饰的细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
[0030] a)使细胞与本发明所述的重组病毒载体或本发明所述的组合物接触，以获得经转导的细胞；以及
[0031] b)将催化活性的Cas9或Cpf1蛋白或者编码催化活性的Cas9或Cpf1蛋白的核苷酸序列导入所述经转导的细胞中，当导入或表达入所述经转导的细胞中时，所述催化活性的Cas9或Cpf1蛋白破坏所述靶基因的表达和/或功能。
[0032] 本发明还涉及通过本发明的方法可获得的细胞。
具体实施方式
[0033] 重组载体
[0034] 本发明涉及重组病毒载体，所述重组病毒载体在其基因组中包含：
[0035] (i)编码引导RNA(gRNA)的核苷酸序列，所述引导RNA包含适于结合至靶核苷酸序列的间隔区，所述靶核苷酸序列在靶基因的编码序列内、在靶基因的转录的非编码序列内或在靶基因的上游或下游的非转录序列内，所述靶基因参与遗传障碍；
[0036] (ii)编码在所述遗传障碍中具有治疗效果的蛋白质的核苷酸序列。
[0037] 当转导入细胞(经转导的细胞)中时，根据本发明所述的重组病毒载体提供具有治疗效果的蛋白质以及gRNA向所述经转导的细胞和/或经转导的细胞的分化后代中的表达。
[0038] 通常将病毒用作用于将核苷酸序列转移至细胞的递送系统或载体。转移可体外、离体或体内发生。当以此方式使用时，这些病毒通常被称为“病毒载体”。在本发明的优选实施方式中，病毒载体为逆转录病毒(RV)载体或腺相关病毒(AAV)载体。根据本发明所述的逆转录病毒载体为含有逆转录病毒来源的病毒基因组、缺乏自我更新能力、并且具有将核苷酸序列导入细胞中的能力的病毒颗粒。根据本发明所述的AAV载体为含有AAV来源的基因组、缺乏自我更新能力并且具有将核苷酸序列导入细胞中的能力的病毒颗粒。
[0039] “重组体”与其在本领域中的用法一致地用于指包含不会作为单个序列的一部分一起自然出现的部分或已相对于自然出现的序列重新排列的部分的核苷酸序列。重组核苷酸序列(或转基因)通过涉及人为干预的过程产生和/或由人为干预(例如通过复制、扩增、转录等的一个或多个循环)产生的核酸生成。重组病毒是包含重组核苷酸序列的病毒。重组细胞是在其基因组中包含重组核苷酸序列的细胞。因此，根据本发明所述的“重组病毒载体”(例如“重组逆转录病毒载体”或“重组AAV载体”)是指在其基因组中包含重组核苷酸序列(或转基因)的病毒载体。
[0040] 因此，如本文所使用的重组病毒“基因组”除被置于适当的调节序列控制下以用于其表达的所谓的重组核苷酸序列外，还包含原始病毒的序列，所述序列为所述基因组的非编码区，并且对于提供用于DNA或RNA合成和加工的识别信号是必需的(小的病毒基因组)。例如，对于重组慢病毒载体，这些序列是对于包装、逆转录和转录而言所必需的顺式作用序列，此外，对于本发明的特定目的，它们含有有利于细胞中的核输入并因此有利于在所述细胞中的转基因转移效率的功能序列，该元件被描述为DNA分叉(Flap)元件。
[0041] 重组病毒载体可基于能够将遗传信息递送至真核细胞、特别是哺乳动物细胞、特别是人细胞的任何合适的病毒。在一些实施方式中，对于体内手段，细胞为干细胞、祖细胞或分化的细胞。在一些实施方式中，对于离体和体外手段，细胞为干细胞(例如人干细胞)、祖细胞或分化的细胞(例如T淋巴细胞)。
[0042] 在一些实施方式中，本发明的病毒载体为逆转录病毒载体或腺相关载体。
[0043] 例如，逆转录病毒载体可为α-逆转录病毒载体、γ-逆转录病毒载体、慢病毒载体或spuma-逆转录病毒载体，优选慢病毒载体。此类载体已广泛用于基因疗法治疗以及其它基因递送应用中。在优选的实施方式中，逆转录病毒载体为慢病毒载体。在一些实施方式中，慢病毒载体为“慢病毒整合载体”。
[0044] 如本文所使用的术语“慢病毒载体”是指来源于复合逆转录病毒例如人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒载体。在本发明中，可使用来源于任何株和亚型的慢病毒载体。慢病毒载体可基于人或灵长类慢病毒例如HIV，或非人慢病毒例如猫免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒和马传染性贫血病毒(EIAV)。在优选的实施方式中，慢病毒载体为基于HIV的载体，尤其是基于HIV-1的载体。
[0045] “AAV载体”意为来源于腺相关病毒血清型的病毒载体，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV6等。AAV载体可具有一个或多个全部或部分缺失的AAV野生型基因，优选rep和/或cap基因，但保留功能性侧翼ITR序列。功能性ITR序列对于AAV病毒粒子的拯救、复制和包装而言是必需的。因此，本文将AAV载体限定为至少包含需要处于顺式以用于病毒的复制和包装的那些序列(例如功能性ITR)。只要序列提供功能性拯救、复制和包装，ITR不必为野生型核苷酸序列，并且可例如通过核苷酸的插入、缺失或取代而被改变。使用已知技术构建AAV载体，以至少提供处于转录方向上的操作性地连接的组件、包含转录起始区的控制元件、感兴趣的DNA以及转录终止区。选择控制元件以在哺乳动物细胞中起作用。将含有操作性地连接的组件的所得构建体与功能性AAV ITR序列结合(5'和Y)。“腺相关病毒反向末端重复”或“AAVITRs”意为在AAV基因组的每个末端发现的本领域公认的区域，它们一起作为DNA复制的起点以及作为病毒的包装信号顺式起作用。AAV ITR与AAV rep编码区域一起提供两个侧翼ITR之间插入的核苷酸序列的有效切除和拯救，以及其向哺乳动物细胞基因组中的整合。AAV ITR区域的核苷酸序列是已知的。AAV-2序列参见例如Kotin，
1994；Berns，KI，Fundamental Virology，第2版(B.N.Fields和D.M.Knipe，eds.)中的“Parvoviridae and their Replication”。本文使用的“AAV ITR”不一定包含野生型核苷酸序列，但可例如通过核苷酸的插入、缺失或取代而被改变。此外，AAV ITR可来源于数种AAV血清型(包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV6等)中的任一种。此外，只要AAV载体中的位于所选择的核苷酸序列的侧翼的5'ITR和3'ITR按预期发挥作用(例如，当AAV Rep基因产物存在于细胞中时，允许异源性序列整合至受体细胞基因组中，并且允许从宿主细胞基因组或载体切除和拯救感兴趣的序列)，它们并不必需是相同的或来源于相同的AAV血清型或分离物。此外，AAV ITR可来源于数种AAV血清型(包括但不限于AAV-1、AAV-
2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV6等)中的任一种。此外，只要AAV载体中的位于所选择的核苷酸序列的侧翼的5'ITR和3'ITR按预期发挥作用(例如，当AAV Rep基因产物存在于细胞中时，允许DNA分子整合至受体细胞基因组中，并且允许从宿主细胞基因组或载体切除和拯救感兴趣的序列)，它们不一定是相同的或来源于相同的AAV血清型或分离物。所选择的核苷酸序列操作性地连接至控制元件，所述控制元件指导所述核苷酸序列在受试者体内的转录或表达。此类控制元件可包含通常与所选择的基因相关的控制序列。替代地，可采用异源控制序列。有用的异源控制序列通常包括来源于编码哺乳动物基因或病毒基因的序列的那些序列。实例包括但不限于磷酸甘油酸激酶(PKG)启动子、SV40早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)、单纯疱疹病毒(HSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子例如CMV立即早期启动子区域(CMVIE)、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、合成启动子、杂合启动子等。此外，也可在本文中使用来源于非病毒基因例如人βAS3珠蛋白基因或HTT的序列。此类启动子序列可在商业上购自例如Stratagene(San Diego，CA)。为本发明的目的，异源启动子和其它控制元件例如CNS特异性和诱导型启动子、增强子等均将特别有用。
1994；Berns，KI，Fundamental Virology，第2版(B.N.Fields和D.M.Knipe，eds.)中的“Parvoviridae and their Replication”。本文使用的“AAV ITR”不一定包含野生型核苷酸序列，但可例如通过核苷酸的插入、缺失或取代而被改变。此外，AAV ITR可来源于数种AAV血清型(包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV6等)中的任一种。此外，只要AAV载体中的位于所选择的核苷酸序列的侧翼的5'ITR和3'ITR按预期发挥作用(例如，当AAV Rep基因产物存在于细胞中时，允许异源性序列整合至受体细胞基因组中，并且允许从宿主细胞基因组或载体切除和拯救感兴趣的序列)，它们并不必需是相同的或来源于相同的AAV血清型或分离物。此外，AAV ITR可来源于数种AAV血清型(包括但不限于AAV-1、AAV-
2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV6等)中的任一种。此外，只要AAV载体中的位于所选择的核苷酸序列的侧翼的5'ITR和3'ITR按预期发挥作用(例如，当AAV Rep基因产物存在于细胞中时，允许DNA分子整合至受体细胞基因组中，并且允许从宿主细胞基因组或载体切除和拯救感兴趣的序列)，它们不一定是相同的或来源于相同的AAV血清型或分离物。所选择的核苷酸序列操作性地连接至控制元件，所述控制元件指导所述核苷酸序列在受试者体内的转录或表达。此类控制元件可包含通常与所选择的基因相关的控制序列。替代地，可采用异源控制序列。有用的异源控制序列通常包括来源于编码哺乳动物基因或病毒基因的序列的那些序列。实例包括但不限于磷酸甘油酸激酶(PKG)启动子、SV40早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)、单纯疱疹病毒(HSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子例如CMV立即早期启动子区域(CMVIE)、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、合成启动子、杂合启动子等。此外，也可在本文中使用来源于非病毒基因例如人βAS3珠蛋白基因或HTT的序列。此类启动子序列可在商业上购自例如Stratagene(San Diego，CA)。为本发明的目的，异源启动子和其它控制元件例如CNS特异性和诱导型启动子、增强子等均将特别有用。
[0046] 在本发明的重组病毒载体中，重组核苷酸序列编码具有治疗效果的蛋白质以及包含适于结合至靶核苷酸序列的间隔区(即gRNA间隔区)的gRNA。术语“具有治疗效果的蛋白质”意为向患者(特别是患有遗传障碍的患者)提供被判断为期望和有益的效果的蛋白质。在本发明中具有治疗效果的蛋白质的实例可为由于遗传障碍而变得功能失调的蛋白质。因此，在一个实施方式中，术语“具有治疗效果的蛋白质”是指不产生遗传障碍并且有效地向患者(特别是患有遗传障碍的患者)提供治疗益处的蛋白质。具有治疗效果的蛋白质可为适合待治疗的患有遗传障碍的患者的野生型(WT)蛋白质，或其可为适合待治疗的患者的WT蛋白质的突变形式(即WT蛋白质的变体)。与“适合患者的野生型蛋白质”相比，具有治疗效果的蛋白质还可为具有相似或改善的特征的蛋白质。
[0047] 在具体的实施方式中，预期的患者为哺乳动物，优选人(无论年龄和性别)。特别地，患者患有遗传障碍，所述遗传障碍在下面公开。
[0048] 在一些实施方式中，具有治疗效果的蛋白质为真核蛋白质，优选哺乳动物蛋白质，优选人蛋白质。
[0049] 根据本发明，靶基因参与遗传障碍。换句话说，当在受试者中表达相应的蛋白质(靶蛋白质)时，靶基因参与遗传障碍。在一个实施方式中，靶基因引起遗传障碍，例如当在患者中该蛋白质被改变时，具有治疗效果的蛋白质参与遗传障碍。因此，靶蛋白质为具有治疗效果的蛋白质的改变的型式。在另一实施方式中，靶基因为基因疾病的基因修饰因子，但不是引起基因疾病的基因。
[0050] 术语“蛋白质被改变”或“改变的蛋白质”意为蛋白质的表达水平或活性的变化(增加或减少)、或蛋白质的结构构象或相互作用性质的变化。改变的蛋白质可导致遗传障碍。
[0051] 在一些实施方式中，遗传障碍选自于由以下所组成的组：
[0052]
[0053]
[0054]
[0055]
[0056] 在一些实施方式中，具有治疗效果的蛋白质为：
[0057]
[0058]
[0059]
[0060]
[0061] β样珠蛋白基因的正式符号为：HBB(β珠蛋白基因)、HBD(δ珠蛋白基因)、HBG1和HBG2(γ珠蛋白基因)、HBA1和HBA2(α珠蛋白基因)。在本说明书中，独立地使用希腊符号(例如α、β、γ和δ)和相应的名称(例如alpha、beta、gamma和delta)。此外，在本说明书中，β样珠蛋白基因/mRNA/蛋白质独立地以斜体使用或不以斜体使用(例如HBB基因或HBB基因；HBB mRNA和HBB mRNA以及HBB蛋白质或HBB蛋白质)。
[0062] 术语“γ-珠蛋白靶基因”意为HBG1、HBG2或HBG1和HGB2两者。
[0063] 根据本发明，gRNA包含适于结合至靶核苷酸序列的间隔区(在本说明书中，所述间隔区也称为“CRISPR间隔区”或“gRNA间隔区”)。术语“靶核苷酸序列”意为细胞的基因组的任何内源性核酸序列，例如基因，或者基因内或与基因相邻的非编码序列，其中期望通过靶向的非同源末端连接(NHEJ)或MMEJ(微同源介导的末端连接)修饰，特别是破坏(例如敲除)所述基因(也称为“靶基因”)的表达和/或功能。靶核苷酸序列可存在于染色体中。在一些实施方式中，靶核苷酸序列在靶基因的编码序列内或在靶基因的转录的非编码序列(例如前导序列、尾随序列或内含子)内。根据本发明，当靶基因在患者中表达时，已知所述靶基因参与镰状细胞病(SCD)。
[0064] 通常，将编码gRNA的核苷酸序列设计为编码可通过在靶基因编码序列中插入移码突变来破坏靶基因的表达和/或功能的gRNA。因此，将编码gRNA的核苷酸序列设计为编码可破坏靶蛋白质的功能和/或表达的gRNA。当所述gRNA分别通过CRISPR/Cas9系统或CRISPR/Cpf1系统在经转导的细胞中与Cas9或Cpf1形成复合物时，发生此类破坏(见下文)。
[0065] 因此，根据本发明，重组病毒载体提供具有治疗效果的蛋白质和gRNA向通过所述重组病毒载体转导的细胞(也称为“经转导的细胞”)中的表达。因此，经转导的细胞表达可通过与Cas9或Cpf1形成复合物而破坏经转导的细胞中的靶蛋白质的功能和/或表达的gRNA。根据本发明，靶基因上游或下游的非转录序列可为调节靶基因表达的区域，例如启动子或增强子。在一些实施方式中，当靶基因在患者中表达时，所述靶基因参与遗传障碍。
[0066] 术语“破坏靶蛋白质的功能”或“靶蛋白质被破坏”或“被破坏的靶蛋白质”意为靶蛋白质的表达水平和/或活性的降低。因此，术语“破坏靶基因的功能”或“靶基因被破坏”或“被破坏的靶基因”意为靶基因的表达水平和/或功能的降低。
[0067] 术语“破坏”包括“敲除”。在具体的实施方式中，gRNA敲除靶基因的表达和/或功能，并且因此gRNA敲除靶蛋白质的表达和/或活性。
[0068] 在一些实施方式中，靶基因选自于由以下所组成的组：
[0069]
[0070]
[0071]
[0072]
[0073] 在优选的实施方式中，重组病毒载体进一步包含以下的元件1、2、3、4和5，或以下的元件1、2、3、4、5和6：
[0074] 1)编码具有治疗效果的蛋白质的表达盒；
[0075] 2)自灭活(SIN)LTR构造；
[0076] 3)包装信号；
[0077] 4)Rev应答元件(RRE)，以增强未剪接的重组病毒载体RNA的核输出；
[0078] 5)中央多聚嘌呤区(cPPT)，以增强重组病毒载体基因组的核输入；以及[0079] 6)转录后调节元件(PRE)，以增强重组病毒载体基因组稳定性并且改善重组病毒载体效价(例如WPRE)。
[0080] 如上所述，在各种实施方式中，本文所述的重组病毒载体包含编码具有治疗效果的蛋白质的表达盒，其在组织特异性或普遍存在的转录控制元件(例如启动子或增强子)的控制下能够确保疾病靶细胞中的治疗性蛋白质的表达。例如，表达盒编码β样珠蛋白基因(即γ-珠蛋白、β-珠蛋白、δ-珠蛋白)。例如，表达盒编码人γ-珠蛋白基因，例如，表达盒包含在转录控制元件(例如人β-珠蛋白基因启动子，例如-265bp/+50bp)的控制下的约1.95kb重组人γ-β-珠蛋白基因(即γ-珠蛋白外显子和β-珠蛋白内含子，其中β-珠蛋白内含子2具有600bp的RsaI至SspI缺失)以及2.7kb复合人β-珠蛋白基因座控制区(例如HS2-1203bp、HS3-1213bp和/或HS4-954bp)。
[0081] 但是，β样珠蛋白基因(γ珠蛋白、β珠蛋白、δ珠蛋白)盒是说明性的，而无需是限制性的。使用本文所述的已知的盒，本领域技术人员将可获得许多变化。此类变化包括例如用以进一步增强非镰状化特性的对β-珠蛋白的进一步的和/或替代的突变(例如通过Levasseur(2003)Blood 102：4312-4319描述的PAS3盒)、转录控制元件中的改变(例如启动子和/或增强子例如HS4)、内含子大小/结构的变化等。在优选的实施方式中，盒缺少HS4(即重组病毒载体缺少HAS)。发明人示出，HS4的缺失增加了重组病毒载体效价，并且因此提高了重组病毒载体的效率和效力；并且HS4的缺失不影响重组病毒载体的治疗潜力。
[0082] 自灭活(SIN)LTR构造
[0083] 为进一步提高安全性，在各种实施方式中，本文所述的重组慢病毒载体包含非TAT依赖性的自灭活(SIN)构造。因此，在各种实施方式中，可期望在本文所述的LV中采用相对于野生型LTR具有降低的启动子活性的LTR区。可提供有效地“自灭活”(SIN)的构建体，其提供生物安全性特征。SIN载体是其中的经转导的细胞中的全长重组病毒载体RNA的产生极大减少或完全消除的载体。此特征使出现复制型重组体(RCR)的风险最小化。此外，它降低了位于重组病毒载体整合位点附近的细胞编码序列异常表达的风险。SIN构造在本领域中是熟知的。
[0084] 包装信号
[0085] 在各种实施方式中，本文所述的重组病毒载体进一步包含包装信号。“包装信号”、“包装序列”或“psi序列”是足以指导将核酸(其序列包含包装信号)包装至逆转录病毒颗粒中的任何核酸序列。该术语包括天然存在的包装序列以及它们的经工程化的变体。包括慢病毒在内的许多不同的逆转录病毒的包装信号在本领域中是已知的。在具体的实施方式中，包装序列为天然存在的包装序列。
[0086] Rev应答元件(RRE)
[0087] 在某些实施方式中，本文所述的重组病毒载体包含Rev应答元件(RRE)以增强未剪接的RNA的核输出。RRE是本领域技术人员熟知的。
[0088] 刺激表达的转录后调节元件(PRE)
[0089] 在某些实施方式中，本文所述的重组病毒载体可包含多种转录后调节元件(PRE)中的任一种，所述转录后调节元件在转录物内的存在增加了异源核酸(例如γ-β-珠蛋白基因)在蛋白质水平上的表达。PRE可在某些实施方式中特别有用，尤其是那些参与具有效率低下的启动子的病毒构建体的PRE。
[0090] 一类PRE是置于表达盒内的内含子，其可刺激基因表达。但是，在慢病毒的生命周期事件过程中内含子可被剪接掉。因此，如果将内含子用作PRE，它们通常以与重组病毒载体基因组转录物相反的朝向放置。PRE对于本领域技术人员是熟知的。
[0091] 本发明还涉及包含本发明的重组病毒载体或本发明的多个重组病毒载体的组合物。可将本发明的重组病毒载体或多个重组病毒载体纯化以成为实质上纯的。术语“实质上纯的”意为重组病毒载体除所述重组病毒载体外实质上不含可复制的病毒。可使用已知的纯化和分离方法例如过滤、离心和柱纯化来实现纯化。如果必要，本发明的重组病毒载体或多个重组病毒载体可通过将它们与期望的药学上可接受的载体或溶媒适当组合来作为组合物制备。术语“药学上可接受的载体”是指可添加至本发明的重组病毒载体或多个重组病毒载体中，并且不会显著抑制重组病毒载体介导的基因转移的物质。具体地，重组病毒载体或多个重组病毒载体可与例如无菌水、生理盐水、培养基、血清和磷酸盐缓冲盐水(PBS)适当组合。重组病毒载体或多个重组病毒载体也可与稳定剂、生物杀灭剂等组合。含有本发明的重组病毒载体或多个重组病毒载体的组合物可用作试剂或药物。例如，本发明的组合物可用作用于将基因转移至细胞中、优选用于细胞(特别是干细胞，更特别是人干细胞)的转导的试剂。
[0092] 本发明还涉及部件的套装，所述套装包括：
[0093] -本发明所述的重组病毒载体或本发明所述的组合物；以及
[0094] -催化活性的Cas9或Cpf1蛋白或者编码催化活性的Cas9或Cpf1蛋白的核苷酸序列。
[0095] 根据本发明，gRNA/Cas9或gRNA/Cpf1复合物诱导靶核苷酸序列被破坏和/或通过称为“CRISPR/Cas9系统”或“CRISPR/Cpf1系统”的系统添加新的核苷酸序列。CRISPR意为成簇的规律间隔的短回文重复序列。
[0096] CRISPR/Cas系统为原核免疫系统，其赋予对诸如质粒和噬菌体内存在的外源遗传元件的抗性，并且提供获得性免疫的形式。CRISPR相关蛋白(Cas，例如Cas9)使用CRISPR间隔区来识别并切割目标核苷酸序列。通过将包含适于结合至靶核苷酸序列的间隔区的gRNA和Cas9递送至细胞中，可在期望的位置切割细胞基因组，诱导去除靶核苷酸序列和/或添加新的核苷酸序列(Mandal等，Cell Stem Cell，2014，15(5)：643-52)。术语“Cas9”包括Cas9变体，例如saCas9、spCAS9、esp-CAS9或spCas9-HF1。
[0097] 在本发明的具体的实施方式中，所述靶核苷酸序列在靶基因的编码序列内，在靶基因的转录的非编码序列内或在靶基因的上游或下游的非转录序列内。因此，gRNA/Cas9或gRNA/Cpf1复合物可破坏(例如可敲除)靶基因的表达和/或功能。
[0098] 在一些实施方式中，当所述靶基因在患者中表达时，所述靶基因参与遗传障碍。在一些实施方式中，靶基因可选自于由以下所组成的组：
[0099]
[0100]
[0101]
[0102]
[0103] 众所周知，在利用CRISPR/Cas9系统用于基因组编辑时，CRISPR/Cas9系统可包括Cas9、CRISPR RNA(crRNA)和/或反式激活crRNA(tracrRNA)：
[0104] -crRNA包含结合至靶核苷酸序列的RNA，所述RNA伴随tracrRNA(通常处于发夹环形式)；
[0105] -tracrRNA和crRNA形成活性复合物，称为引导RNA(gRNA)。由于真核系统缺少加工crRNA所需的一些蛋白质，创建了合成的构建体gRNA以将用于Cas9靶向的RNA基本片段组合为单个RNA。通常，将gRNA用RNA聚合酶III型启动子U6(启动子U6)进行表达；
[0106] -Cas9是核酸酶蛋白，其活性形式能够修饰DNA。由于Cas9的DNA位点识别功能，存在具有不同功能(即单链切刻、双链断裂、DNA结合)的许多变体。在本发明的优选实施方式中，Cas9具有双链断裂功能。术语“Cas9”包括Cas9变体。在变体中，我们可列出但不限于spCAS9、esp-CAS9、spCas9-HF1。
[0107] 通常通过同源重组或非同源末端连接(NHEJ)的不同机制修复由Cas9或Cpf1引起的核酸切割。NHEJ是有瑕疵的修复过程，其通常引起切割位点处的核苷酸序列(即靶核苷酸序列)的改变。通过非同源末端连接(NHEJ)进行的修复通常引起小的插入或缺失，并且可用于特定的基因敲除的创建。
[0108] 在本发明的一方面，CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统修饰真核细胞，优选真核干细胞，例如人干细胞。因此，在本发明的一方面，CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统旨在诱导经转导的真核细胞中的靶核苷酸序列的敲除，并因此破坏经转导的真核细胞中的靶基因(例如诱导所述靶基因的敲除)，并因此破坏(例如抑制)经转导的真核细胞和/或经转导的真核细胞的分化的后代中的靶蛋白的表达和/或活性。
[0109] 本发明还涉及本发明所述的重组病毒载体或本发明所述的组合物用于向细胞中导入如下的用途：(i)编码引导RNA(gRNA)的核苷酸序列，所述引导RNA包含适于结合至靶核苷酸序列的间隔区，所述靶核苷酸序列在靶基因的编码序列内、在靶基因的转录的非编码序列内或在靶基因的上游或下游的非转录序列内，所述靶基因参与遗传障碍；以及(ii)编码在所述遗传障碍中具有治疗效果的蛋白质的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述用途为体外、离体或体内的。
[0110] 本发明还涉及用于体外、离体或体内修饰细胞的基因组的方法，所述方法包括以下步骤：
[0111] a)使细胞与本发明所述的重组病毒载体或本发明所述的组合物接触，以获得经转导的细胞；以及
[0112] b)将催化活性的Cas9或Cpf1蛋白或者编码催化活性的Cas9或Cpf1蛋白的核苷酸序列导入所述经转导的细胞中，当导入或表达入所述经转导的细胞中时，所述催化活性的Cas9或Cpf1蛋白破坏所述靶基因的表达和/或功能。
[0113] 本发明还涉及用于体外、离体或体内制备遗传学上修饰的细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
[0114] a)使细胞与本发明所述的重组病毒载体或本发明所述的组合物接触，以获得经转导的细胞；以及
[0115] b)将催化活性的Cas9或Cpf1蛋白或者编码催化活性的Cas9或Cpf1蛋白的核苷酸序列导入所述经转导的细胞中，当导入或表达入所述经转导的细胞中时，所述催化活性的Cas9或Cpf1蛋白破坏所述靶基因的表达和/或功能。
[0116] 根据本发明，术语“转导”意为通过重组病毒载体将外源核苷酸序列导入细胞的基因组中的过程。根据本发明，由本发明的重组病毒载体转导的细胞(也称为“经转导的细胞”)编码(即在其基因组中包含)以下核苷酸序列，该核苷酸序列编码具有治疗效果的蛋白质以及编码包含适于结合至靶核苷酸序列的间隔区的gRNA。因此，根据优选的实施方式，经转导的细胞表达具有治疗效果的蛋白质和包含适于结合至靶核苷酸序列的间隔区的gRNA。
[0117] 本发明的方法涉及将催化活性的Cas9或Cpf1蛋白(以下称为“Cas9”或“Cpf1”)或者编码Cas9或Cpf1的核苷酸序列(优选编码Cas9或Cpf1的RNA)导入经转导的细胞中。以下段落仅涉及“Cas9”，但是，“Cas9”可被替换为“Cpf1”。
[0118] 根据本发明，可将Cas9针对其将被导入的有机体进行优化。因此，例如在以下中阐述了来源于酿脓链球菌或嗜热链球菌(S.Thermophilus)的为了在人中使用而进行密码子优化的Cas9多核苷酸序列：Cong等，Science，2013，339(6121)：819-23；Mali等，Science，2013，339(61210)：823-6；Kleinstiver等，Nature，2015，523(7561)：481-5；Hou等，Proc Natl Acad Sci USA，2013，110(39)：11644-9；Ran等，Nature，2015，520(7546)：186-191。
[0119] 可将Cas9作为蛋白质直接导入经转导的细胞中，或可作为编码Cas9的核苷酸序列(例如编码Cas9的DNA或RNA，优选编码Cas9的RNA)的导入的结果而在细胞中原位合成(或表达)。
[0120] 可在细胞外产生Cas9或编码Cas9的核苷酸序列，然后将其导入。
[0121] 用于将核苷酸序列导入细胞中的方法是本领域已知的，并且作为非限制性实例包括：稳定转导方法，其中，将核苷酸序列整合至细胞的基因组中(重组病毒载体介导的方法)；或瞬时转染方法，其中，不将核苷酸序列整合至细胞的基因组中(重组病毒载体介导的方法、脂质体、显微注射、电穿孔、粒子轰击等)。鉴于所述核苷酸序列在细胞中表达，其可被包含在载体中，更特别地可被包含在质粒或病毒载体中。在优选的实施方式中，用于将编码Cas9的核苷酸序列导入细胞中的方法为瞬时转染方法。
[0122] 在具体的实施方式中，编码Cas9的核苷酸序列是编码Cas9的DNA。在该实施方式中，瞬时转染是特别有利的，因为编码Cas9的DNA序列不被整合至细胞的基因组中，并且因此Cas9在有限的时间段内瞬时产生。在瞬时产生后，鉴于细胞在其基因组中不包含编码Cas9的核苷酸序列，细胞不再产生Cas9。当该细胞随后用作离体治疗中的药物时，这是特别有利的。此外，在不存在Cas9核酸酶的情况下，快速gRNA降解将避免干扰素反应和细胞凋亡，从而改善安全问题。
[0123] 在另一具体的实施方式中，编码Cas9的核苷酸序列是编码Cas9的RNA。RNA还具有不被整合至细胞基因组中的优势。例如，通过电穿孔或脂质体导入编码Cas9的RNA。
[0124] 用于将蛋白质导入细胞中的方法是本领域已知的，并且作为非限制性实例包括脂质体、显微注射、电穿孔或粒子轰击的使用。例如，通过电穿孔或脂质体将Cas9导入细胞中。
[0125] 在具体的实施方式中，将Cas9作为蛋白质导入细胞中。在该实施方式中，Cas9具有不被整合至细胞的基因组中并被迅速降解的优点。例如，通过电穿孔或纳米颗粒导入Cas9。
[0126] 根据本发明，Cas9可在经转导的HSPC中与gRNA形成复合物。所述Cas9/gRNA复合物可结合至靶核苷酸序列，并且可因此破坏靶基因的表达或功能。在优选的实施方式中，Cas9/gRNA复合物诱导靶基因的表达或功能的敲除。在具体的实施方式中，本发明的方法是特别有利的，因为在靶基因的破坏后唯一能够存活的细胞是在它们的基因组中包含编码具有治疗效果的蛋白质的核苷酸序列以及表达所述具有治疗效果的蛋白质的核苷酸序列的那些细胞。在这一具体的实施方式中，细胞需要具有治疗效果的蛋白质，以在靶基因的破坏后存活。
[0127] 在特定的实施方式中，细胞为真核细胞，优选哺乳动物细胞，优选人细胞。在一些实施方式中，对于体内途径，细胞为干细胞、祖细胞或分化的细胞。在一些实施方式中，对于离体和体外途径，细胞为干细胞(例如人干细胞)、祖细胞或分化的细胞(例如T淋巴细胞)。
[0128] 本发明还涉及通过根据本发明所述的方法可获得的遗传学上修饰的细胞，以及用作药物的所述遗传学上修饰的细胞。
[0129] 在一个实施方式中，本发明涉及用于障碍的治疗中的通过根据本发明所述的方法可获得的遗传学上修饰的细胞，所述障碍特别是需要显性等位基因的改变(例如破坏)的常染色体显性障碍、或其中内源性突变蛋白的表达损害由外源性修正的蛋白的表达诱导的有益效应的隐性遗传障碍(例如镰状细胞病)。
[0130] 在另一实施方式中，本发明涉及用于常染色体显性血液障碍、特别是需要显性等位基因的改变(例如破坏)的常染色体显性血液障碍的治疗中的通过根据本发明所述的方法可获得的遗传学上修饰的细胞。在一些实施方式中，常染色体显性血液障碍选自于由以下所组成的组：原发性免疫缺陷、1型中性粒细胞减少症、高IgE复发性感染综合征、遗传性球形红细胞增多症。在一些实施方式中，原发性免疫缺陷选自于由以下所组成的组：13型免疫缺陷、14型免疫缺陷、21型免疫缺陷、27B型免疫缺陷、31A型免疫缺陷、31C型免疫缺陷、32A型免疫缺陷、36型免疫缺陷、45型免疫缺陷、49型免疫缺陷和2型免疫球蛋白A(IgA)缺乏症。
[0131] 在另一实施方式中，本发明涉及用于血红蛋白病、特别是镰状细胞病或障碍(SCD)的治疗中的可通过根据本发明所述的方法获得的遗传学上修饰的细胞。
[0132] 在一个实施方式中，细胞为人干细胞(例如人HSC)或分化的细胞(例如T淋巴细胞)，可使用本领域技术人员熟知的方法从人(例如人患者)中移出并进行如上所述的修饰。然后将遗传学上修饰的细胞重新导入相同或不同的人中，优选相同的人。人干细胞可从骨髓、外周血或脐带血获得。特别优选的，人干细胞为CD34+细胞。
[0133] 因此，本发明还涉及治疗患者中的遗传障碍的方法，所述方法包括以下步骤：
[0134] a)从患者获得细胞；
[0135] b)使细胞与本发明所述的重组病毒载体或本发明所述的组合物接触以获得经转导的细胞；
[0136] c)将催化活性的Cas9或Cpf1蛋白质或者编码催化活性的Cas9或Cpf1蛋白质的核苷酸序列导入经转导的细胞中，以获得遗传学上修饰的细胞，当被导入经转导的细胞中或在经转导的细胞中表达时，所述催化活性的Cas9或Cpf1蛋白质破坏靶基因的表达和/或功能；
[0137] d)向患者给予遗传学上修饰的细胞。
[0138] 在一些实施方式中，给予可为移植或接种，特别是在骨髓中的移植或接种。
[0139] 根据本发明，当具有治疗效果的蛋白质为靶蛋白质的功能型式(例如野生型型式)时，本领域技术人员将容易地调整核苷酸序列(例如编码具有治疗效果的蛋白质的核苷酸序列和/或编码gRNA的核苷酸序列)的设计，以避免gRNA靶向编码具有治疗作用的蛋白质的核苷酸序列(即密码子设计)。例如，重组病毒载体包含编码β-珠蛋白的核苷酸序列(例如由Levasseur等，Blood，2003，102(13)：4312-9描述的PAS3β-珠蛋白盒)以及编码靶向镰状β-珠蛋白的gRNA的核苷酸序列。在此情况下，为避免编码β-珠蛋白的核苷酸序列(即β-珠蛋白转基因)的不必要的破坏，将修饰编码β-珠蛋白的核苷酸序列(在转基因序列中导入沉默突变)，以便其不会被gRNA识别(见图14)。为此目的，技术人员通常使用同义密码子(编码相同的氨基酸)，允许核苷酸序列的改变和相同的β-珠蛋白的产生。通常，将从β-珠蛋白基因和α-珠蛋白基因中最常用的密码子中选择同义密码子。附图说明
[0140] 图1：编码β-样珠蛋白基因的重组慢病毒载体的构建。
[0141] 图2：使用CRISPR-Cas9系统对造血细胞中的基因组编辑效率的评价。
[0142] 图3：用于β-珠蛋白基因失活的gRNA的构建和筛选：靶向HBB基因的gRNA的设计。
[0143] 图4：靶向β-珠蛋白基因的gRNA的选择：新型gRNA的设计。
[0144] 图5：K562和HUDEP-2红系细胞系中的gRNA A、gRNA B、gRNA D和gRNA E的切割效率。
[0145] 图6：HUDEP-2中的β-珠蛋白表达的下调。
[0146] 图7：HSPC中的所选择的gRNA(B、D和E)的切割效率。
[0147] 图8：HSPC来源的红系细胞中的β-珠蛋白表达的下调。
[0148] 图9：gRNA介导的靶位点的破坏的优化。
[0149] 图10：根据本发明所述的重组慢病毒载体的构建。
[0150] 图11：用根据本发明所述的重组慢病毒载体转导HSPC，并将Cas9导入经转导的细胞中。
[0151] 图12：患者SCD HSPC的体外遗传修饰。
[0152] 图13：患者SCD HSC的体内遗传修饰。
[0153] 图14：编码根据本发明所述的具有治疗效果的珠蛋白变体的核苷酸序列。gRNA D靶位点加了下划线。以灰色/绿色突出显示了βAS3(经修饰以避免被gRNA D靶向)和βAS1(T87Q，经修饰以避免被gRNA D靶向)转基因中的核苷酸变化。
[0154] 图15：对来源于对照和遗传学上修饰的HUDEP-2细胞系的成熟的成红细胞(分化的第9天)中的珠蛋白mRNA表达的评估。UT：来源于非转导和非转染的HUDEP-2细胞的成熟的成红细胞：“正常”水平的β珠蛋白、δ珠蛋白和γ珠蛋白(阴性对照)；VCN：“载体拷贝数”；未转染：来源于非转染的HUDEP-2细胞的成熟的成红细胞；GFP+(Cas9质粒)：在用GFP-Cas9质粒转染时通过FACS选择的来源于表达Cas9-GFP融合蛋白的HUDEP-2细胞的成熟的成红细胞。Cas9蛋白：来源于不使用基于选择的策略而用Cas9-GFP蛋白转染的HUDEP-2细胞的成熟的成红细胞；当转导时，用选自以下的表达β-珠蛋白AS3mod转基因和gRNA的慢病毒载体处理细胞：编码经优化的gRNA D的“D”慢病毒载体；编码靶向荧光素酶基因(该基因在人类基因组中不存在)的经优化的gRNA的“luc”慢病毒载体(阴性对照)；编码靶向BCL11A基因的内含子红系特异性增强子的经优化的gRNA的“BCL11A”慢病毒载体；编码被设计以复制在HBG1和HBG2基因的启动子内的13bp小HPFH缺失的gRNA的“13bpdel”慢病毒载体；β：内源性β-珠蛋白mRNA；β-AS3：AS3β-珠蛋白转基因mRNA；Aγ+Gγ：γ-珠蛋白mRNA；δ：δ珠蛋白mRNA。
[0155] 图16：来源于对照和遗传学上修饰的HUDEP-2细胞系的成熟的成红细胞(分化的第9天)中的单个珠蛋白链的反相HPLC谱图。(A)来源于WT(野生型)HUDEP-2UT细胞的成熟的成红细胞：表达“正常”水平的β珠蛋白、δ珠蛋白和γ珠蛋白的未转导且未转染的细胞(阴性对照)；(B)来源于用LV.GLOBE.AS3mod-β-globin.gRNA D(编码AS3修饰的β-珠蛋白以及经优化的gRNA D的慢病毒GLOBE载体)转导但未用Cas9-GFP质粒转染的HUDEP-2细胞的成熟的成红细胞：表达AS3修饰的β-珠蛋白转基因和内源性β-珠蛋白链(无内源性HBB基因的修饰)的细胞；(C)来源于用LV.GLOBE.AS3mod-β-globin.gRNA D(编码AS3修饰的β-珠蛋白以及经优化的gRNA D的慢病毒GLOBE载体)转导并且用GFP-Cas9质粒转染的HUDEP-2细胞的成熟的成红细胞：表达AS3修饰的β-珠蛋白转基因但不表达内源性β-珠蛋白链(因内源性HBB基因的外显子1中的高的基因组编辑率)的细胞。
[0156] 图17：用编码β-珠蛋白AS3mod和靶向BCL11A基因的内含子红系特异性增强子的gRNA的慢病毒载体转导、伴随Cas9-GFP质粒转染(“+”)或无Cas9-GFP质粒转染(“-”)的HUDEP-2细胞中的BCL11A mRNA表达的评估(分化过程中的时间点分析)。
[0157] 图18：来源于对照和遗传学上修饰的HUDEP-2细胞系的成熟的成红细胞(分化的第9天)中的单个珠蛋白链的反相HPLC分析。UT：来源于非转导和非转染的HUDEP-2细胞的成熟的成红细胞：“正常”水平的β珠蛋白、δ珠蛋白和γ珠蛋白(阴性对照)；VCN：“载体拷贝数”；
未转染：来源于非转染的HUDEP-2细胞的成熟的成红细胞；GFP+(Cas9质粒)：在用GFP-Cas9质粒转染时通过FACS选择的来源于表达Cas9-GFP融合蛋白的HUDEP-2细胞的成熟的成红细胞。Cas9蛋白：来源于不使用基于选择的策略而用Cas9-GFP蛋白转染的HUDEP-2细胞的成熟的成红细胞；当转导时，用选自以下的表达AS3modβ-珠蛋白转基因和gRNA的慢病毒载体处理细胞：编码经优化的gRNA D的“D”慢病毒载体；编码靶向荧光素酶基因的经优化的gRNA的“luc”慢病毒载体(阴性对照)；编码靶向BCL11A基因的内含子红系特异性增强子的经优化的gRNA的“BCL11A”慢病毒载体；编码被设计以复制在HBG1和HBG2基因的启动子内的13bp小HPFH缺失的gRNA的“13bpdel”慢病毒载体；β：内源性β-珠蛋白链；β-AS3：AS3β-珠蛋白链；Aγ+Gγ：γ-珠蛋白链；δ：δ珠蛋白链。
未转染：来源于非转染的HUDEP-2细胞的成熟的成红细胞；GFP+(Cas9质粒)：在用GFP-Cas9质粒转染时通过FACS选择的来源于表达Cas9-GFP融合蛋白的HUDEP-2细胞的成熟的成红细胞。Cas9蛋白：来源于不使用基于选择的策略而用Cas9-GFP蛋白转染的HUDEP-2细胞的成熟的成红细胞；当转导时，用选自以下的表达AS3modβ-珠蛋白转基因和gRNA的慢病毒载体处理细胞：编码经优化的gRNA D的“D”慢病毒载体；编码靶向荧光素酶基因的经优化的gRNA的“luc”慢病毒载体(阴性对照)；编码靶向BCL11A基因的内含子红系特异性增强子的经优化的gRNA的“BCL11A”慢病毒载体；编码被设计以复制在HBG1和HBG2基因的启动子内的13bp小HPFH缺失的gRNA的“13bpdel”慢病毒载体；β：内源性β-珠蛋白链；β-AS3：AS3β-珠蛋白链；Aγ+Gγ：γ-珠蛋白链；δ：δ珠蛋白链。
[0158] 图19：来源于对照和遗传学上修饰的HUDEP-2细胞系的成熟的成红细胞(分化的第9天)中的血红蛋白四聚体的阳离子交换HPLC谱图。(A)WT(野生型)HUDEP-2UT细胞：来源于非转导和非转染的HUDEP-2细胞的成熟的成红细胞：“正常”水平的珠蛋白HbA(含有内源性β-珠蛋白链的血红蛋白四聚体)、HbA2(含有内源性δ-珠蛋白链的血红蛋白四聚体)和HbF(含有内源性γ-珠蛋白链的血红蛋白四聚体)(阴性对照)；(B)来源于用LV.GLOBE.AS3mod-β-globin.gRNA D(编码AS3修饰的β-珠蛋白以及经优化的gRNA D的慢病毒GLOBE载体)转导但未用Cas9-GFP质粒转染的HUDEP-2细胞的成熟的成红细胞：细胞表达含有AS3修饰的β-珠蛋白转基因的Hb四聚体(HbAS3)以及含有内源性β-珠蛋白链的HbA(无内源性HBB基因的修饰)；(C)来源于用LV.GLOBE.AS3mod-β-globin.gRNA D(编码AS3修饰的β-珠蛋白和经优化的gRNA D的慢病毒GLOBE载体)转导并且用GFP-Cas9质粒转染的HUDEP-2细胞的成熟的成红细胞：细胞表达HbAS3但不表达HbA(因内源性HBB基因的外显子1中的高的基因组编辑率)。
(D)来源于用LV.GLOBE.AS3mod-β-globin.gRNA 13bp-del(编码AS3修饰的β-珠蛋白以及编码被设计以复制在HBG1和HBG2基因的启动子内的13bp小HPFH缺失的gRNA的经优化的gRNA“13bpdel”的慢病毒GLOBE载体)转导并且用GFP-Cas9质粒转染的HUDEP-2细胞的成熟的成红细胞：在HBG1和HBG2基因的启动子的基因组编辑时，细胞表达HbAS3、HbA和高水平的HbF。
HbA：α2β2四聚体；HbAS3：α2β-AS32四聚体；HbA2：α2δ2四聚体；HbF：α2γ2四聚体。
(D)来源于用LV.GLOBE.AS3mod-β-globin.gRNA 13bp-del(编码AS3修饰的β-珠蛋白以及编码被设计以复制在HBG1和HBG2基因的启动子内的13bp小HPFH缺失的gRNA的经优化的gRNA“13bpdel”的慢病毒GLOBE载体)转导并且用GFP-Cas9质粒转染的HUDEP-2细胞的成熟的成红细胞：在HBG1和HBG2基因的启动子的基因组编辑时，细胞表达HbAS3、HbA和高水平的HbF。
HbA：α2β2四聚体；HbAS3：α2β-AS32四聚体；HbA2：α2δ2四聚体；HbF：α2γ2四聚体。
[0159] 图20：通过如图19所示的HPLC对来自对照和遗传学上修饰的HUDEP-2细胞系的成熟的成红细胞(分化的第9天)中的血红蛋白四聚体的定量。UT：来源于非转导和非转染的HUDEP-2细胞的成熟的成红细胞：“正常”水平的珠蛋白HbA、HbA2和HbF(阴性对照)；VCN：“载体拷贝数”；未转染：来源于未用GFP-Cas9质粒或Cas9-GFP蛋白转染的HUDEP-2细胞的成熟的成红细胞；GFP+(Cas9质粒)：来源于在用GFP-Cas9转染时通过FACS选择的表达Cas9-GFP融合蛋白的HUDEP-2细胞的成熟的成红细胞。Cas9蛋白：来源于不使用基于选择的策略而用Cas9-GFP蛋白转染的HUDEP-2细胞的成熟的成红细胞；当转导时，用选自以下的表达β-珠蛋白AS3mod转基因和gRNA的慢病毒载体处理细胞：编码经优化的gRNA D的“D”慢病毒载体；编码靶向荧光素酶基因的经优化的gRNA的“luc”慢病毒载体(阴性对照)；编码靶向BCL11A基因的内含子红系特异性增强子的经优化的gRNA的“BCL11A”慢病毒载体；编码被设计以复制在HBG1和HBG2基因的启动子内的13bp小HPFH缺失的gRNA的“13bpdel”慢病毒载体。HbA：α2β2四聚体；HbAS3：α2β-AS32四聚体；HbA2：α2δ2四聚体；HbF：α2γ2四聚体。
[0160] 图21：来源于对照和遗传学上修饰的HUDEP-2细胞(分化的第9天)的成熟的成红细胞中的HbF表达(针对高GPA(血型糖蛋白A)高群体的流式细胞术分析)。
[0161] 实施例
[0162] 实施例1：编码β样珠蛋白基因的重组慢病毒载体的构建
[0163] 已使用GLOBE慢病毒载体产生了能够以高水平表达β样珠蛋白基因的重组慢病毒载体(Miccio等，Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(30)：10547-52，Roselli等，EMBO Mol Med，2010，2(8)：315-28)。GLOBE慢病毒载体以其前病毒形式包含在HIV U3区域(δ)缺失400bp的LTR、rev应答元件(RRE)、剪接供体(SD)和剪接受体(SA)位点、人β-珠蛋白基因(外显子和内含子)、β-珠蛋白启动子(βp)以及来自β-珠蛋白LCR的DNase I超敏感位点HS2和HS3(图1A和图1B)。图1C中详述了重组慢病毒载体的构建。抗镰状化转基因(例如βAS3(未修饰的)，SEQ ID NO：2；图1B)被包含在GLOBE慢病毒载体中(图1C)。通过定点诱变将人β-珠蛋白基因的外显子替换为不同的抗镰状化转基因的外显子(例如选自SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：8)。
[0164] 实施例2：使用CRISPR-Cas9系统对造血细胞中的基因组编辑效率的评价[0165] 用以下转染了100万个K562造血细胞：
[0166] (i)4μg的表达Cas9-GFP的质粒(pMJ920，Addgene质粒#42234)以及0.8μg的表达无关的gRNA的质粒(MLM3636，Addgene质粒#43860)，
[0167] (ii)20μg的用假尿苷和5-甲基胞苷修饰以减少免疫刺激的Cas9mRNA(Trilink，#L-6125)以及15μg的化学修饰的gRNA(MD gRNA，2'O-甲基的无关的gRNA，抗一般的碱基水解，Trilink)；或
[0168] (iii)在人U6启动子控制下表达Cas9(Addgene，#52962)和无关的gRNA的慢病毒载体(图2A)。
[0169] 上述gRNA为无关的gRNA，即与β-珠蛋白基因或γ-珠蛋白基因不相关的gRNA结合区。实际上，gRNA靶向β-珠蛋白基因座中的γ-δ基因间区域(例如SEQ ID NO：48)。
[0170] 使用Nucleofector I(Lonza)、AMAXA细胞系Nucleofector试剂盒V(Lonza，VCA-1003)以及T16程序以100μl体积转染K562细胞。
[0171] 转染后，将K562细胞维持在RPMI 1640培养基(Lonza)中，所述培养基包含2mM谷氨酰胺并且补充有10％胎牛血清(FBS，BioWhittaker，Lonza)、HEPES(20mM，LifeTechnologies)、丙酮酸钠(1mM，LifeTechnologies)以及青霉素和链霉素(每种100U/ml，LifeTechnologies)。
[0172] 转染1周后，使用PURE LINK Genomic DNA Mini试剂盒(LifeTechnologies)按照制造商的说明提取DNA。涵盖gRNA靶位点的基因组区域通过PCR扩增，并使之经受Sanger测序。使用TIDE(通过分解追踪插入/缺失；Brinkman等，Nucleic Acids Res，2014，42(22)：e168)评价的基因组编辑效率(插入缺失％，小的插入和缺失的频率)高于全部递送系统的
50％(图2B)。
50％(图2B)。
[0173] 这些结果显示出，用于gRNA和Cas9的DNA、RNA和慢病毒(LV)递送系统的使用在K562造血细胞中产生良好的编辑效率。
[0174] 实施例3：用于β-珠蛋白基因失活的gRNA的构建和筛选
[0175] 1.靶向β-珠蛋白基因的gRNA的选择
[0176] 为减少镰状β-珠蛋白基因(即βS-珠蛋白基因)的表达，我们选择了4种公开可得的靶向β-珠蛋白基因的外显子1的gRNA(Cradick等，Nucleic Acids Res，2013，41(20)：9584-92；Liang等，Protein Cell，2015，6(5)：363-72)(编码gRNA间隔区的序列A、B、D和E，图3，分别为SEQ ID NO：23-SEQ ID NO：26)。
[0177] 使用COSMID(具有错配、插入和缺失的CRISPR脱靶位点；https://crispr.bme.gatech.edu/；Cradick等，MolTher Nucleic Acids，2014，3(12)：e214)的生物信息学预测显示出少量的经预测的脱靶，它们均容纳有与δ-珠蛋白靶序列的≥2个错配(图
3)。
3)。
[0178] 重要的是，HBG1/2基因(编码γ-珠蛋白)未被包含在潜在的脱靶的列表中，所选择的gRNA展示出与γ-珠蛋白基因的序列的低的相似性。在4个gRNA间隔区中，仅gRNA间隔区E展示出与δ-珠蛋白基因的外显子1的序列少于3个错配。脱靶活性的生物信息学预测表明该基因为gRNA E的潜在脱靶基因。
[0179] 将编码gRNA的序列A、B、D和E克隆在MLM3636质粒(MLM3636，Addgene质粒#43860)中，生成以下质粒：
[0180] -编码gRNA A的MLM3636 gRNA A
[0181] -编码gRNA B的MLM3636 gRNA B
[0182] -编码gRNA D的MLM3636 gRNA D
[0183] -编码gRNA E的MLM3636 gRNA E
[0184] 为生成携带编码gRNA的序列A、B、D和E的MLM3636质粒，应用以下方案：
[0185] a.将gRNA寡核苷酸退火
[0186] 寡核苷酸序列：
[0187]
[0188]
[0189] (*)粗体：编码gRNA间隔区的核苷酸序列
[0190] 10×退火缓冲液的制备：[pH 8的400μl 1M Tris HCl、200μl 1M MgCl2、100μl 5M NaCl、20μl 0.5M EDTA pH8、280μl DEPC水]。用于gRNA寡核苷酸退火的MIX 1的制备：[1μl 100μM gRNA寡核苷酸FOR、1μl 100μM gRNA寡核苷酸REV、5μl 10×退火缓冲液、43μl DEPC水]。用以下的梯度退火温度在PCR仪器中进行退火反应：60分钟内从95℃至4℃，因此退火温度每分钟降低-1.5℃。
[0191] b.MLM3636质粒的消化
[0192] 孵育消化混合反应物：[xμl(2.5μg)的MLM3636质粒(Addgene质粒#43860)、5μl BSMB I酶(50U)、5μl酶缓冲液10×，(50-x)μl DEPC水]在55℃下过夜。用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)从低熔点琼脂糖(0.8％)凝胶中纯化经线性化的MLM3636质粒(大小：2265bp)。
[0193] c.在MLM3636质粒内插入gRNA
[0194] 将连接混合物[xμl(10ng)线性化的MLM3636质粒、1.1μl退火的编码gRNA的序列(以1:10稀释)、5μl 2×连接酶缓冲液、1μl连接酶(QUICK LIGASE NEB-Biolabs-M22OO)、(10-x)μl DEPC水]在室温下孵育15分钟。
[0195] d.细菌的转化和质粒的扩增
[0196] 按照制造商的说明，用5μl连接产物转化化学感受态大肠杆菌(One Shot TOP10化学感受态大肠杆菌-Invitrogen-C4040)，并在LB AGAR+100μg/ml氨苄青霉素中涂板在37℃下过夜。
[0197] 从LB AGAR平板中挑取经转化的大肠杆菌的单菌落，然后在3ml LB培养基+100μg/ml氨苄青霉素(接种培养物)中在37℃下过夜生长。对于大量制备的培养物，在250ml LB培养基+100μg/ml氨苄青霉素中使0.5ml接种培养物生长。
[0198] e.质粒DNA的纯化
[0199] 应用制造商的说明，使用PureLink HiPure质粒DNA纯化试剂盒(Invitrogen-K2100)从经转化的大肠杆菌的250ml的大量制备的培养物中分离质粒DNA。
[0200] 2.靶向β-珠蛋白基因的gRNA的选择：新型gRNA的设计
[0201] 使用CRISPOR工具(http://crispor.tefor.net/)设计新型编码gRNA间隔区的序列(F、G、H、I、J、K、L、M、N和O分别为SEQ ID NO：27-SEQ ID NO：36)。使用人GRCh37/hg19基因组组装体选择靶区域(例如HBB基因的外显子1或外显子2)的基因组DNA序列(图4A)，并从UCSC基因组浏览器(https://genome-euro.ucsc.edu/index.html)下载(图4B)。将靶区域的基因组DNA序列上传至http://crispor.tefor.net/，并基于“智人-人-UCSC，2009年2月(GRCh37/hg19)+SNPs”基因组设计与特定PAM(例如NGG-酿脓链球菌或NGA-酿脓链球菌突变体VQR)相关的gRNA(图4C)。从所得的gRNA的列表中，我们选择了具有最高的(i)特异性评分(cfdSpecScore≥85)、(ii)预测效率(ChariEffScore≥38)以及(iii)框外评分(≥60)并且在δ-珠蛋白和γ-珠蛋白基因中无错配≤2的脱靶的gRNA(图4D)。
[0202] 3.K562和HUDEP-2红系细胞系中的gRNA A、gRNA B、gRNA D和gRNA E的切割效率[0203] 已知胎儿K562和成人HUDEP-2红系细胞在它们的基因组中天然包含β-珠蛋白基因。因此，我们测试了这些细胞系中靶向β-珠蛋白基因的gRNA。
[0204] 使用Nucleofector I(Lonza)以100μl体积用4μg的表达Cas9-GFP的质粒(pMJ920，Addgene质粒#42234)以及0.8μg的含有各gRNA的质粒(MLM3636gRNA A、MLM3636gRNA B、MLM3636gRNA D和MLM3636gRNA E)转染一百万个细胞。用4μg的表达Cas9-GFP的质粒(pMJ920，Addgene质粒#42234)处理对照细胞。对于K562和HUDEP-2(T16和L-29程序)，我们使用AMAXA细胞系Nucleofector试剂盒V(VCA-1003)。转染后，将K562维持在RPMI 1640培养基(Lonza)中，所述培养基包含2mM谷氨酰胺并且补充有10％胎牛血清(FBS，BioWhittaker，Lonza)、HEPES(20mM，LifeTechnologies)、丙酮酸钠(1mM，LifeTechnologies)以及青霉素和链霉素(每种100U/m1，LifeTechnologies)，并且如Canver等，Nature，2015，527(7577)：192-7中所述来维持HUDEP-2。转染1周后，使用PURE LINK Genomic DNA Mini试剂盒(LifeTechnologies)按照制造商的说明提取DNA。
[0205] 通过PCR扩增涵盖gRNA靶位点的胎儿K562和成人HUDEP-2红系细胞的基因组区域。使用引物HBBex1 F(5′-CAGCATCAGGAGTGGACAGA-3′，SEQ ID NO：9)和HBBex1 R(5′-AGTCAGGGCAGAGCCATCTA-3′，SEQ ID NO：10)进行PCR。我们进行了Sanger测序和TIDE分析以评价插入缺失和移码突变的频率。在经转染的K562和HUDEP-2细胞中，所有经筛选的gRNA(即A、B、D、E)能够在>35％的基因座处切割(图5A)。用gRNA D转染的细胞产生最高的移码突变频率，这引起外显子1中的终止密码子的生成(图5B)。这些结果显示出gRNA A、gRNA B、gRNA D和gRNA E对在胎儿K562和成人HUDEP-2红细胞中生成β-珠蛋白基因的移码突变(引起外显子1中的终止密码子的生成)而言特别有效。
[0206] 4.HUDEP-2中的β-珠蛋白表达的下调
[0207] 评价了表达高水平β-珠蛋白链的HUDEP2细胞中的β-珠蛋白敲减的效率(Kurita等，PLoS One，2013，8(3)：e59890)。如上所述，用4μg的表达Cas9-GFP的质粒(pMJ920，Addgene质粒#42234)和0.8μg的含有各gRNA的质粒(MLM3636gRNA A、MLM3636gRNA B、MLM3636gRNA C和MLM3636gRNA D)转染HUDEP-2细胞(实施例3)。用4μg的表达Cas9-GFP的质粒(pMJ920，Addgene质粒#42234)处理对照细胞。1周后，使用RNeasy micro试剂盒(QIAGEN)按照制造商的说明提取总RNA。使用用于RT-PCR的SuperScript第一链合成系统(Invitrogen)用寡核苷酸(dT)引物对成熟的转录物进行逆转录。使用SYBR green(Applied Biosystems)进行qRT-PCR。使用引物HBB F(5′-GCAAGGTGAACGTGGATGAAGT-3′，SEQ ID NO：
11)和HBB R(5′-TAACAGCATCAGGAGTGGACAGA-3′，SEQ ID NO：12)来扩增β-珠蛋白转录物。使用引物HBA1 F(5′-CGGTCAACTTCAAGCTCCTAA-3′，SEQ ID NO：13)和HBA1 R(5′-ACAGAAGCCAGGAACTTGTC-3′，SEQ ID NO：14)来扩增α-珠蛋白转录物。将β-珠蛋白表达结果归一化至α-珠蛋白。平行地，在裂解缓冲液[PBS 1×、50mM TriS-HCl PH 7.4-7.5、150mM NaCl、0.5％DOC、0.1％SDS、2mM EDTA、1％Triton、蛋白酶抑制剂7×(不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物，Roche)以及磷酸酶抑制剂10×(PhosphoSTOP，Roche)]中提取总蛋白，使之经受3轮超声(3个循环，每个循环10个脉冲、振幅0.7、0.5s振荡)以及3个冷冻/解冻循环(每个
3分钟)。将裂解液在4℃下以12,000×g离心12分钟，并将上清液用于免疫印迹分析。我们使用Bradford蛋白测定试剂盒以牛血清白蛋白(BSA)作为参比标准来测量蛋白质含量。在上样缓冲液(30％甘油、5％SDS、9.25％二硫苏糖醇、1ul溴酚蓝、Tris-HCl 0.5M，pH 6.8)中煮沸5分钟后，使用15％丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳分离含有20μg-50μg蛋白的样品。在4℃或室温(RT)下，在250mA下进行转移2小时。将PDVF膜进行干燥，然后在5％牛奶中的0.1％TBS-Tween封闭溶液(Tris-缓冲盐水+Tween 20；TBS-T；Sigma Aldrich)中在4℃下孵育过夜，并在室温下用TBS-Tween 5％牛奶溶液中稀释的一抗染色1-2小时。一抗对β-珠蛋白(稀释度1∶200；血红蛋白β(37-8)，sc-21757，Santa Cruz Biotechnology)和α-珠蛋白(稀释度1∶
200；血红蛋白α(D-16)，sc-31110，Santa Cruz Biotechnology)而言是特异性的。在TBS-Tween中清洗3次(每次10分钟)后，使用HRP缀合的抗小鼠抗体(1∶5,000；Thermo Scientific)和HRP缀合的抗山羊抗体(1∶5,000；Thermo Scientific)在TBS-T 5％牛奶溶液中于室温下示出抗体染色1小时。印迹用ECL系统(Immobilon Western，Millipore)显影，并曝光至X射线胶片(曝光时间根据信号的强度而不同)。用剥离缓冲液(Thermo Scientific)将膜剥离15秒。通过使用ImageJ软件和/或Gel Pro软件将对应于β-珠蛋白的条带进行定量，并将获得的值(以像素计)归一化至α-珠蛋白条带的值。qRT-PCR(图6)和免疫印迹(图6)分析均显示用靶向HBB基因的Cas9+gRNA处理的细胞中的β-珠蛋白表达减少，这在允许最高频率的移码突变的gRNA存在的情况下电穿孔的细胞中更明显(gRNA D和gRNA E)。
11)和HBB R(5′-TAACAGCATCAGGAGTGGACAGA-3′，SEQ ID NO：12)来扩增β-珠蛋白转录物。使用引物HBA1 F(5′-CGGTCAACTTCAAGCTCCTAA-3′，SEQ ID NO：13)和HBA1 R(5′-ACAGAAGCCAGGAACTTGTC-3′，SEQ ID NO：14)来扩增α-珠蛋白转录物。将β-珠蛋白表达结果归一化至α-珠蛋白。平行地，在裂解缓冲液[PBS 1×、50mM TriS-HCl PH 7.4-7.5、150mM NaCl、0.5％DOC、0.1％SDS、2mM EDTA、1％Triton、蛋白酶抑制剂7×(不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物，Roche)以及磷酸酶抑制剂10×(PhosphoSTOP，Roche)]中提取总蛋白，使之经受3轮超声(3个循环，每个循环10个脉冲、振幅0.7、0.5s振荡)以及3个冷冻/解冻循环(每个
3分钟)。将裂解液在4℃下以12,000×g离心12分钟，并将上清液用于免疫印迹分析。我们使用Bradford蛋白测定试剂盒以牛血清白蛋白(BSA)作为参比标准来测量蛋白质含量。在上样缓冲液(30％甘油、5％SDS、9.25％二硫苏糖醇、1ul溴酚蓝、Tris-HCl 0.5M，pH 6.8)中煮沸5分钟后，使用15％丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳分离含有20μg-50μg蛋白的样品。在4℃或室温(RT)下，在250mA下进行转移2小时。将PDVF膜进行干燥，然后在5％牛奶中的0.1％TBS-Tween封闭溶液(Tris-缓冲盐水+Tween 20；TBS-T；Sigma Aldrich)中在4℃下孵育过夜，并在室温下用TBS-Tween 5％牛奶溶液中稀释的一抗染色1-2小时。一抗对β-珠蛋白(稀释度1∶200；血红蛋白β(37-8)，sc-21757，Santa Cruz Biotechnology)和α-珠蛋白(稀释度1∶
200；血红蛋白α(D-16)，sc-31110，Santa Cruz Biotechnology)而言是特异性的。在TBS-Tween中清洗3次(每次10分钟)后，使用HRP缀合的抗小鼠抗体(1∶5,000；Thermo Scientific)和HRP缀合的抗山羊抗体(1∶5,000；Thermo Scientific)在TBS-T 5％牛奶溶液中于室温下示出抗体染色1小时。印迹用ECL系统(Immobilon Western，Millipore)显影，并曝光至X射线胶片(曝光时间根据信号的强度而不同)。用剥离缓冲液(Thermo Scientific)将膜剥离15秒。通过使用ImageJ软件和/或Gel Pro软件将对应于β-珠蛋白的条带进行定量，并将获得的值(以像素计)归一化至α-珠蛋白条带的值。qRT-PCR(图6)和免疫印迹(图6)分析均显示用靶向HBB基因的Cas9+gRNA处理的细胞中的β-珠蛋白表达减少，这在允许最高频率的移码突变的gRNA存在的情况下电穿孔的细胞中更明显(gRNA D和gRNA E)。
[0208] 这些结果显示，gRNA A、gRNA B、gRNA D和gRNA E对破坏HUDEP-2细胞中β-珠蛋白的表达特别有效。
[0209] 5.HSPC中的所选择的gRNA的切割效率
[0210] 5.1用gRNA B、gRNA D和gRNA E转染原代HSPC：编辑效率
[0211] 在来自健康供体的成人HSPC中测试了允许最高频率的移码突变的gRNA(B、D和E)。将HSPC在以下的扩增培养基中培养：含有2mM谷氨酰胺、青霉素和链霉素(每种100U/ml，Gibco，LifeTechnologies)、Flt3-配体(300ng/ml，Peprotech)、SCF(300ng/ml，Peprotech)、TPO(100ng/ml，Peprotech)和IL3(60ng/ml，Peprotech)的StemSpan SFEM培养基(StemCell Technologies)。解冻后48小时，使用Nucleofector I(Lonza)以100μl体积用
4μg的表达Cas9-GFP的质粒(pMJ920，Addgene质粒#42234)以及1.6μl的含有各gRNA的质粒(MLM3636 gRNA B、MLM3636 gRNA C和MLM3636 gRNA D)转染一百万个细胞。用4μg的表达Cas9-GFP的质粒(pMJ920，Addgene质粒#42234)处理对照细胞。对于HSPC(U-08程序)，我们使用AMAXA人CD34细胞Nucleofector试剂盒(VPA-1003)。转染后，将HSPC维持在补充有Z-VAD-FMK(120μM，InvivoGen)和StemRegenin 1(750μM，Stem Cell Technologies)的相同培养基中。在转染后第5天，如上文针对K562和HUDEP-2细胞所述的，提取DNA以评价编辑效率(实施例3)。gRNA B的基因组编辑效率较高(图7A)，但是与gRNA D和gRNA E相比，gRNA B生成的移码突变率较低(图7B)。总体而言，gRNA B和gRNA D允许HSPC中的最高绝对频率的移码突变(图7C)。但是，选择gRNA D用于以下实验，因其以较低的频率生成了非移码突变(图
7B)，并且不具有β-样珠蛋白基因中的预测的脱靶。
4μg的表达Cas9-GFP的质粒(pMJ920，Addgene质粒#42234)以及1.6μl的含有各gRNA的质粒(MLM3636 gRNA B、MLM3636 gRNA C和MLM3636 gRNA D)转染一百万个细胞。用4μg的表达Cas9-GFP的质粒(pMJ920，Addgene质粒#42234)处理对照细胞。对于HSPC(U-08程序)，我们使用AMAXA人CD34细胞Nucleofector试剂盒(VPA-1003)。转染后，将HSPC维持在补充有Z-VAD-FMK(120μM，InvivoGen)和StemRegenin 1(750μM，Stem Cell Technologies)的相同培养基中。在转染后第5天，如上文针对K562和HUDEP-2细胞所述的，提取DNA以评价编辑效率(实施例3)。gRNA B的基因组编辑效率较高(图7A)，但是与gRNA D和gRNA E相比，gRNA B生成的移码突变率较低(图7B)。总体而言，gRNA B和gRNA D允许HSPC中的最高绝对频率的移码突变(图7C)。但是，选择gRNA D用于以下实验，因其以较低的频率生成了非移码突变(图
7B)，并且不具有β-样珠蛋白基因中的预测的脱靶。
[0212] 这些结果显示，gRNA B、gRNA D和gRNA E对于在HSPC中生成β-珠蛋白基因的移码突变特别有效。
[0213] 5.2原代HSPC细胞的转染：脱靶分析
[0214] 为评价原代HSPC中的脱靶活性，将编码所选择的gRNA的质粒与表达Cas9-GFP的质粒一起单独地递送至脐带血来源的CD34+HSPC。方案与5.1略有不同。使用Nucleofector I(Lonza)、AMAXA人CD34细胞Nucleofector试剂盒(VPA-1003)和U08程序用4μg的表达Cas9-GFP的质粒和3.2μg的含有各gRNA的载体转染细胞。电穿孔后18小时通过流式细胞术分析验证转染效率(30％-50％的表达GFP+Cas9的细胞)。
[0215] 从转染后4天提取的基因组DNA扩增并含有HBB外显子1的基因组区域的TIDE(通过分解追踪插入缺失)分析(Brinkman EK等，2014)显示出，gRNA D和gRNA E分别展示了约35％和约25％的切割效率，这两种gRNA的移码突变频率为90％-95％(未显示)。相反，与gRNA D和gRNA E(未显示)相比，gRNA B展示出约60％的编辑效率，具有较低的移码突变频率。含有HBD外显子1的基因组区域的TIDE分析显示出，在用gRNA D处理的样品中不存在插入缺失，而在用gRNA E处理时，约3％HBD等位基因被编辑(“脱靶”)(图7D)。可通过gRNA E序列与HBD外显子1中的对应的脱靶之间的低的错配数(2)来解释此结果(图3)，而观察到gRNA D的较高的错配数(4；图3)，这可能降低HBD基因中的脱靶活性的或然性。
[0216] 6.在来源于HSPC的红系细胞中的β-珠蛋白表达的下调
[0217] 如上所述，通过来源于健康供体的成人HSPC中的质粒转染(质粒pMJ920 Cas9-GFP和MLM3636 gRNA D)递送Cas9和gRNA D(实施例5)。在质粒pMJ920存在下，将对照细胞电穿孔。转染后2天通过FACS对GFP阳性HSPC进行分选，1天后，如先前所述(Sankaran，Science，2008，322(5909)：1839-42)，HSPC在液体培养物中向红系分化。11天后，从成熟的红系细胞中提取RNA以评价β-珠蛋白表达水平。使用RNeasy micro试剂盒(QIAGEN)按照制造商的说明提取总RNA。使用用于RT-PCR的SuperScript第一链合成系统(Invitrogen)用寡核苷酸(dT)引物对成熟的转录物进行逆转录。使用SYBR green(Applied Biosystems)进行qRT-PCR。使用引物HBB F(5′-GCAAGGTGAACGTGGATGAAGT-3′，SEQ ID NO：11)和HBB R(5′-TAACAGCATCAGGAGTGGACAGA-3′，SEQ ID NO：12)来扩增β-珠蛋白转录物。使用引物HBA1 F(5′-CGGTCAACTTCAAGCTCCTAA-3′，SEQ ID NO：13)和HBA1 R(5′-ACAGAAGCCAGGAACTTGTC-
3′，SEQ ID NO：14)来扩增α-珠蛋白转录物。将β-珠蛋白表达结果归一化至α-珠蛋白。平行地，使用NexeraX2 SIL-30AC色谱仪(Shimadzu)和LC Solution软件对珠蛋白链进行反相HPLC(RP-HPLC)分析。使用250×4.6mm、3.6μm Aeris Widepore柱(Phenomenex)通过HPLC分离来自体外分化的成熟的成红细胞的珠蛋白链。用溶液A(水/乙腈/三氟乙酸，95∶5∶0.1)和溶液B(水/乙腈/三氟乙酸，5∶95∶0.1)的梯度混合物洗脱样品。在220nm处测量吸光度。qRT-PCR和RP-HPLC分析均显示用质粒MLM3636 gRNA D电穿孔的成熟的成红细胞中的β-珠蛋白表达的显著下调(图8)。
3′，SEQ ID NO：14)来扩增α-珠蛋白转录物。将β-珠蛋白表达结果归一化至α-珠蛋白。平行地，使用NexeraX2 SIL-30AC色谱仪(Shimadzu)和LC Solution软件对珠蛋白链进行反相HPLC(RP-HPLC)分析。使用250×4.6mm、3.6μm Aeris Widepore柱(Phenomenex)通过HPLC分离来自体外分化的成熟的成红细胞的珠蛋白链。用溶液A(水/乙腈/三氟乙酸，95∶5∶0.1)和溶液B(水/乙腈/三氟乙酸，5∶95∶0.1)的梯度混合物洗脱样品。在220nm处测量吸光度。qRT-PCR和RP-HPLC分析均显示用质粒MLM3636 gRNA D电穿孔的成熟的成红细胞中的β-珠蛋白表达的显著下调(图8)。
[0218] 这些结果显示，gRNA D对于破坏HSPC来源的成红细胞中的β-珠蛋白的表达特别有效。
[0219] 实施例4：gRNA活性的优化
[0220] 由Cong等，Science，2013，339(6121)：819-23开发的原始gRNA支架最近由Dang等，Genome Biol，2015，16：280进行优化，以提高敲除效率。
[0221] 将编码gRNA间隔区的序列B、D和E(分别为SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26)克隆在Dang p.hU6 gRNA质粒(Addgene#53188)中，生成以下质粒：
[0222] -编码gRNA B的Dang p.hU6 gRNA B
[0223] -编码gRNA D的Dang p.hU6 gRNA D
[0224] -编码gRNA E的Dang p.hU6 gRNA E
[0225] 为生成携带gRNA B、gRNA D和gRNA E的Dang p.hU6质粒(Addgene#53188)，应用以下方案：
[0226] a.将gRNA寡核苷酸退火
[0227] 寡核苷酸序列：
[0228]
[0229] (*)粗体：编码gRNA间隔区的核苷酸序列
[0230] 用于gRNA寡核苷酸退火的MIX 1的制备：[8μl 10μM gRNA寡核苷酸FOR-Opt、8μl 10μM gRNA寡核苷酸REV-Opt、2μl 10×NEB连接酶缓冲液(Biolabs-M22OO)，2μl DEPC水]。
按照以下PCR程序在PCR仪器中进行退火反应：96℃300秒、85℃20秒、75℃20秒、65℃20秒、
55℃20秒、45℃20秒、35℃20秒、25℃20秒。
按照以下PCR程序在PCR仪器中进行退火反应：96℃300秒、85℃20秒、75℃20秒、65℃20秒、
55℃20秒、45℃20秒、35℃20秒、25℃20秒。
[0231] b.Dang p.hU6质粒的消化
[0232] 将消化混合物反应液[xμl(20μg)Dang p.hU6质粒(Addgene#53188)、10μl BbsI酶(100U)、10μl酶缓冲液10×、(100-x)μl DEPC水]在37℃下孵育过夜。用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)从低熔点琼脂糖(0.8％)凝胶中纯化线性化的Dang p.hU6质粒(大小：3515bp)。
[0233] c.在Dang p.hU6质粒内插入gRNA
[0234] 将连接混合物[xμl(50ng)线性化的MA128.hU6质粒、1μl退火的gRNA寡核苷酸，1μl 10×连接酶缓冲液、1μl连接酶(QUICK LIGASE NEB-M22OO)、(10-x)μl DEPC水]在室温下孵育15分钟。
[0235] d.细菌的转化和质粒的扩增
[0236] 按照制造商的说明，用5μl连接产物转化化学感受态大肠杆菌(One Shot TOP10化学感受态大肠杆菌-Invitrogen-C4040)，并在LB AGAR+100μg/ml氨苄青霉素中涂板于37℃下过夜。
[0237] 从LB AGAR平板中挑取经转化的大肠杆菌的单个菌落，并在3ml LB培养基+100μg/ml氨苄青霉素(接种培养物)中在37℃下使之过夜生长。对于大量制备的培养物，在250ml LB培养基+100μg/ml氨苄青霉素中使0.5ml接种培养物生长。
[0238] e.质粒DNA的纯化
[0239] 应用制造商的说明，使用PureLink HiPure质粒DNA纯化试剂盒(Invitrogen-K2100)从经转化的大肠杆菌的250ml的大量制备培养物中分离质粒DNA。
[0240] 使用Nucleofector I(Lonza)以100μl体积用4μg的表达Cas9-GFP的质粒(pMJ920，Addgene质粒#42234)以及0.8μg的含有各gRNA的质粒(MLM3636 gRNA B、MLM3636 gRNA C和MLM3636 gRNA D、Dang p.hU6 gRNA B、Dang p.hU6 gRNA C和Dang p.hU6 gRNA D)转染一百万个K562细胞。用4μg的表达Cas9-GFP的质粒(pMJ920，Addgene质粒#42234)处理对照细胞。对于K562细胞(T16程序)，我们使用了AMAXA细胞系Nucleofector试剂盒V(VCA-1003)。转染后，将K562维持在RPMI 1640培养基(Lonza)中，所述培养基包含2mM谷氨酰胺并补充有
10％的胎牛血清(FBS，BioWhittaker，Lonza)、HEPES(20mM，LifeTechnologies)、丙酮酸钠(1mM，LifeTechnologies)以及青霉素和链霉素(每种100U/ml，LifeTechnologies)。转染1周后，使用PURE LINK Genomic DNA Mini试剂盒(LifeTechnologies)按照制造商的说明提取DNA。与相应的具有原始结构的gRNA(MLM3636 gRNA B、MLM3636gRNA C和MLM3636 gRNA D；Cong等，Science，2013，339(6121)：819-23)相比，所有的具有经优化的结构的gRNA(Dang p.hU6 gRNA B、Dang p.hU6 gRNA C和Dang p.hU6 gRNA D；Dang等，Genome Biol，2015，16：
280)显示出更高的插入缺失效率(图9A)以及HBB基因中的移码突变频率(图9B)。
10％的胎牛血清(FBS，BioWhittaker，Lonza)、HEPES(20mM，LifeTechnologies)、丙酮酸钠(1mM，LifeTechnologies)以及青霉素和链霉素(每种100U/ml，LifeTechnologies)。转染1周后，使用PURE LINK Genomic DNA Mini试剂盒(LifeTechnologies)按照制造商的说明提取DNA。与相应的具有原始结构的gRNA(MLM3636 gRNA B、MLM3636gRNA C和MLM3636 gRNA D；Cong等，Science，2013，339(6121)：819-23)相比，所有的具有经优化的结构的gRNA(Dang p.hU6 gRNA B、Dang p.hU6 gRNA C和Dang p.hU6 gRNA D；Dang等，Genome Biol，2015，16：
280)显示出更高的插入缺失效率(图9A)以及HBB基因中的移码突变频率(图9B)。
[0241] 这些结果显示出靶向β-珠蛋白基因的gRNA中的支架的修饰(参见实施例3)可进一步增加它们的基因破坏的频率。
[0242] 实施例5：根据本发明所述的重组病毒载体(即慢病毒载体)的构建
[0243] LV.GLOBE.βAS3-globin.gRNA D-OPTIMIZED慢病毒构建体(图10A，例如SEQ ID NO：47)携带：(1)抗镰状化基因(图10B，例如经修饰的βAS3 SEQ ID NO：8)容纳有通过定点诱变插入的沉默突变(在图10B中用带下划线的字母表示)，以损害gRNA结合至转基因以及外显子1和外显子2中的3个抗镰状化突变[Gly16Asp(G16D)、Glu22Ala(E22A)和Thr87Gln(T87Q)](图10A)；(2)gRNA，所述gRNA显示出(i)高效率的β-珠蛋白基因的破坏；(ii)高的移码突变率；(iii)在人U6启动子的控制下的低的脱靶活性(例如β样珠蛋白基因中无脱靶)(图10A)，例如gRNA D(图10B)。
[0244] 在图10C、图10D、图10E和图10F中，(A)通过定点诱变将限制位点SalI插入LV.GLOBE.βAS3-globin质粒的HS3和δU3元件之间(图10C；SEQ ID NO：45)，以生成LV.GLOBE.βAS3-globin(SalI)质粒(SEQ ID NO：46)。(B)合成了包含侧接着SalI限制性位点的编码gRNA的序列(例如gRNA D)和hU6启动子的DNA片段(称为“gRNA表达盒”；图10E)。(C)将LV.GLOBE.βAS3-globin(SalI)质粒(SEQ ID NO：46)在37℃下消化过夜[消化混合物反应液：xμl(20μg)LV.GLOBE.βAS3-globin(SalI)质粒(SEQ ID NO：46)、10μl SalI酶(100U)、10μl酶缓冲液10×、(100-x)μl DEPC水]。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)通过低熔点琼脂糖(0.8％)凝胶纯化线性化的LV.GLOBE.βAS3-globin-globin(SalI)质粒(大小：10195bp)。平行地，将gRNA表达盒在37℃下消化过夜[消化混合物反应液：xμl(20μg)gRNA表达盒、10μl SalI酶(100U)、10μl酶缓冲液10×、(100-x)μl DEPC-水]。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)通过低熔点琼脂糖(1.5％)凝胶纯化线性化的gRNA表达盒(大小：
383bp)。(D)通过将连接混合物[xμl(50ng)线性化的gRNA表达盒、yμl(50ng)线性化的LV.GLOBE.βAS3-globin-globin(SalI)质粒、1μl 10×连接酶缓冲液、1μl连接酶(QUICK LIGASE NEB-M22OO)、(10-x-y)μl DEPC水)]在室温下孵育15分钟来将gRNA表达盒插入LV.GLOBE.βAS3-globin-globin(SalI)质粒内。按照制造商的说明，用5μl连接产物转化化学感受态大肠杆菌细菌(One Shot TOP10化学感受态大肠杆菌-Invitrogen-C4040)，并在LB AGAR+100μg/ml氨苄青霉素中涂板于32℃下过夜。从LB AGAR平板中挑取经转化的大肠杆菌的单个菌落，并在50ml LB培养基+100μg/ml氨苄青霉素中(小量制备的培养物)使之在
32℃下生长过夜。使用PureLink HiPure质粒DNA纯化试剂盒(Invitrogen-K2100)，应用制造商的说明从经转化的大肠杆菌的10ml的小量制备的培养物中分离质粒DNA。将通过Sanger测序分析质粒DNA，以验证与βAS3-globin表达盒相比，gRNA表达盒以相反朝向插入。
使来源于含有符合这些标准的质粒的菌落的小量制备的培养物(10ml)在250ml LB培养基+
100μg/ml氨苄青霉素中在32℃下过夜生长。使用PureLink HiPure质粒DNA纯化试剂盒(Invitrogen-K2100)，应用制造商的说明从经转化的大肠杆菌的250ml的大量制备的培养物中分离质粒DNA。使用经分离的质粒DNA(LV.GLOBE.βAS3-globin.gRNA D-OPTIMIZED；图
10F，SEQ ID NO：47)作为用于重组慢病毒载体生产的骨架。
383bp)。(D)通过将连接混合物[xμl(50ng)线性化的gRNA表达盒、yμl(50ng)线性化的LV.GLOBE.βAS3-globin-globin(SalI)质粒、1μl 10×连接酶缓冲液、1μl连接酶(QUICK LIGASE NEB-M22OO)、(10-x-y)μl DEPC水)]在室温下孵育15分钟来将gRNA表达盒插入LV.GLOBE.βAS3-globin-globin(SalI)质粒内。按照制造商的说明，用5μl连接产物转化化学感受态大肠杆菌细菌(One Shot TOP10化学感受态大肠杆菌-Invitrogen-C4040)，并在LB AGAR+100μg/ml氨苄青霉素中涂板于32℃下过夜。从LB AGAR平板中挑取经转化的大肠杆菌的单个菌落，并在50ml LB培养基+100μg/ml氨苄青霉素中(小量制备的培养物)使之在
32℃下生长过夜。使用PureLink HiPure质粒DNA纯化试剂盒(Invitrogen-K2100)，应用制造商的说明从经转化的大肠杆菌的10ml的小量制备的培养物中分离质粒DNA。将通过Sanger测序分析质粒DNA，以验证与βAS3-globin表达盒相比，gRNA表达盒以相反朝向插入。
使来源于含有符合这些标准的质粒的菌落的小量制备的培养物(10ml)在250ml LB培养基+
100μg/ml氨苄青霉素中在32℃下过夜生长。使用PureLink HiPure质粒DNA纯化试剂盒(Invitrogen-K2100)，应用制造商的说明从经转化的大肠杆菌的250ml的大量制备的培养物中分离质粒DNA。使用经分离的质粒DNA(LV.GLOBE.βAS3-globin.gRNA D-OPTIMIZED；图
10F，SEQ ID NO：47)作为用于重组慢病毒载体生产的骨架。
[0245] 实施例6：用根据本发明的重组慢病毒载体转导HSPC并将Cas9导入经转导的细胞中
[0246] (A)在经典的基因疗法手段中，表达抗镰状化基因的慢病毒载体(例如LV.GLOBE.β-globin和LV.AS3(Romero等，JCI，2016))不会强力降低SCD HSPC的红系后代中的镰状β-珠蛋白的表达，并且仅允许10％-30％的成熟的红细胞的修正(图11A)。
[0247] (B)用表达γ-β杂合珠蛋白和gRNA的慢病毒载体(例如LV.GLOBE.γ-β-globin.gRNA)转导SCD HSPC，并瞬时递送Cas9。这一手段允许抗镰状化转基因的表达以及镰状β-珠蛋白水平的同步降低，这将引起修正的红细胞的频率的增加。重要的是，将仅在经转导的SCD细胞中观察到Cas9介导的镰状β-珠蛋白基因的破坏，其中镰状β-珠蛋白的敲除被抗镰状化基因的表达所补偿，因此避免了β样链的缺失(其导致α链沉淀的风险，从而导致细胞死亡和贫血，如同在β地中海贫血中观察到的)(图11B)。
[0248] 实施例7：患者SCD HSPC的体外遗传修饰
[0249] 用表达抗镰状化基因以及靶向以下的gRNA的慢病毒载体转导SCD CD34+HSPC，并且瞬时递送(DNA递送、RNA递送、蛋白质递送或慢病毒递送)Cas9：β-珠蛋白基因(例如LV.GLOBE.βAS3-globin.gRNAD-OPTIMIZED，SEQ ID NO：47或LV.GLOBE-AS3modified.gRNAD，SEQ ID NO：94)或内含子红系特异性BCL11A增强子(例如LV.GLOBE-AS3modified.gRNA-BCL11A增强子，SEQ ID NO：75)或γ珠蛋白启动子(例如LV.GLOBE-AS3modified.gRNA-13bp-del，SEQ ID NO：76)。
[0250] 将来自SCD患者的流动的外周血或骨髓的HSPC在RetroNectin(20μg/ml，Takara Shuzo Co.)包被的平板中在以下的扩增培养基中培养(预活化步骤)：含有2mM谷氨酰胺、青霉素和链霉素(每种100U/ml，Gibco，LifeTechnologies)、Flt3-配体(300ng/ml，Peprotech)、SCF(300ng/ml，Peprotech)、TPO(100ng/ml，Peprotech)和IL3(60ng/ml，Peprotech)的StemSpan SFEM培养基(StemCell Technologies)。解冻后24小时(第1天)，在扩增培养基+蛋白硫酸盐(4μg/ml)中用LV.GLOBE.βAS3-globin.gRNAD-OPTIMIZED(SEQ ID NO：47)(MOI 20-100)转导200,000个细胞并在RetroNectin(20μg/ml，Takara Shuzo Co.)包被的96孔平板中涂板。用LV.GLOBEβAS3-globin(SalI)(SEQ ID NO：46)(MOI 20-100)或LV.GLOBE.gRNAD(MOI 20-100)(携带无βAS3珠蛋白转基因的gRNA表达盒的LV.GLOBE载体)转导对照细胞。转导后24小时(第2天)更换培养基，并使用Nucleofector 4D(Lonza)以100μl体积用20μg的经假尿苷和5-甲基胞苷修饰以减少免疫刺激的Cas9 mRNA(Trilink，#L-6 6
6125)转染1×10 -3×10 个细胞。替代地，使用Nucleofector 4D(Lonza)以20μl体积用
30pmol-180pmol的Cas9转染1×105-3×105个细胞。对于HSPC(CA137程序)，我们使用AMAXA人CD34细胞Nucleofector试剂盒(VPA-1003)。转染后，将HSPC维持在补充有Z-VAD-FMK(120μM，InvivoGen)和StemRegenin 1(750μM，Stem Cell Technologies)的相同培养基中。次日(第3天)，经处理的HSPC可使用三相液体红系培养体系(Giarratana等，Blood，2011，118(19)：5071-9)在体外向红系分化或在含有支持红系和骨髓造血祖细胞生长的细胞因子的半固体培养基上涂板(克隆祖细胞测定；培养基GFH4435，Stem Cell Technologies)。在液体培养和克隆祖细胞测定的第13天，如上文针对K562和HUDEP-2细胞(实施例3)所述的，收集样品用于DNA提取以评价编辑效率，并且通过PCR随后分别经由通过分解追踪插入/缺失(Brinkman EK，Chen T，Amendola M和van Steensel B.Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.Nucleic acids
research.2014；42(22)：e168；也称为TIDE分析，如实施例3中所述)和qPCR(使用特异性地识别慢病毒载体的引物；Miccio等，Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(30)：10547-52)评价经转导的细胞在批量(红系)和克隆培养物中的频率。
6125)转染1×10 -3×10 个细胞。替代地，使用Nucleofector 4D(Lonza)以20μl体积用
30pmol-180pmol的Cas9转染1×105-3×105个细胞。对于HSPC(CA137程序)，我们使用AMAXA人CD34细胞Nucleofector试剂盒(VPA-1003)。转染后，将HSPC维持在补充有Z-VAD-FMK(120μM，InvivoGen)和StemRegenin 1(750μM，Stem Cell Technologies)的相同培养基中。次日(第3天)，经处理的HSPC可使用三相液体红系培养体系(Giarratana等，Blood，2011，118(19)：5071-9)在体外向红系分化或在含有支持红系和骨髓造血祖细胞生长的细胞因子的半固体培养基上涂板(克隆祖细胞测定；培养基GFH4435，Stem Cell Technologies)。在液体培养和克隆祖细胞测定的第13天，如上文针对K562和HUDEP-2细胞(实施例3)所述的，收集样品用于DNA提取以评价编辑效率，并且通过PCR随后分别经由通过分解追踪插入/缺失(Brinkman EK，Chen T，Amendola M和van Steensel B.Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.Nucleic acids
research.2014；42(22)：e168；也称为TIDE分析，如实施例3中所述)和qPCR(使用特异性地识别慢病毒载体的引物；Miccio等，Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(30)：10547-52)评价经转导的细胞在批量(红系)和克隆培养物中的频率。
[0251] 使用通过测序实现的DSB的全基因组无偏鉴定(也称为GUIDE-seq；Tsai等，Nat Biotechnol，2015，33(2)：187-97)进行双链断裂的全基因组分析，以检测并量化HSPC及它们的分化的后代(从在克隆祖细胞测定的第13天收集的样品中提取的DNA)中的脱靶切割位点。分析SCD HSPC中的LV整合位点，以评价表达珠蛋白的LV载体的潜在的遗传毒性风险。如前所述(Romano等，Sci Rep，2016，6：24724)，整合位点通过连接介导的PCR进行扩增、测序并定位至人类基因组。通过qRT-PCR评价液体培养物分化第13天、第16天、第18天和第21天时收集的样品中的抗镰状化珠蛋白和BS珠蛋白的表达。使用RNeasy micro试剂盒(QIAGEN)按照制造商的说明提取总RNA。使用用于RT-PCR的SuperScript第一链合成系统(Invitrogen)用寡核苷酸(dT)引物对成熟的转录物进行逆转录。使用SYBR green(Applied Biosystems)进行qRT-PCR。使用引物HBB F(5′-GCAAGGTGAACGTGGATGAAGT-3′，SEQ ID NO：
11)和HBB R(5′-TAACAGCATCAGGAGTGGACAGA-3′，SEQ ID NO：12)来扩增β-珠蛋白转录物，并且使用引物HBB-AS3 F(5′-AAGGGCACCTTTGCCCAG-3′，SEQ ID NO：21)和HBB-AS3 R(5′-GCCACCACTTTCTGATAGGCAG-3′，SEQ ID NO：22)来扩增βAS3珠蛋白转录物。使用引物HBA1 F(5′-CGGTCAACTTCAAGCTCCTAA-3′，SEQ ID NO：13)和HBA1 R(5′-ACAGAAGCCAGGAACTTGTC-
3′，SEQ ID NO：14)来扩增α-珠蛋白转录物。将β-珠蛋白表达结果归一化至α-珠蛋白。平行地，在体外分化至完全成熟的无核红细胞的遗传学上修饰的HSPC(液体培养物分化的第21天)中进行了反相HPLC(RP-HPLC)分析(如以上的实施例6中所述)。通过评价镰状化的逆转和SCD细胞的增加的粘附性和刚性(参与血管闭塞事件的病理学发生的特征)的修正，在无核红细胞(液体培养物分化的第21天)中评估功能RBC特性的恢复(Picot等，Am J Hematol，
2015，90(4)：339-45)。将细胞暴露于氧剥夺的气氛(0％O2)，在无核红细胞(液体培养物分化的第21天)中评价镰状化动力学。通过视频显微镜实时监控镰状化的时程1小时，使用AxioObserver Z1显微镜(Zeiss)和40倍物镜每5分钟捕获图像。
11)和HBB R(5′-TAACAGCATCAGGAGTGGACAGA-3′，SEQ ID NO：12)来扩增β-珠蛋白转录物，并且使用引物HBB-AS3 F(5′-AAGGGCACCTTTGCCCAG-3′，SEQ ID NO：21)和HBB-AS3 R(5′-GCCACCACTTTCTGATAGGCAG-3′，SEQ ID NO：22)来扩增βAS3珠蛋白转录物。使用引物HBA1 F(5′-CGGTCAACTTCAAGCTCCTAA-3′，SEQ ID NO：13)和HBA1 R(5′-ACAGAAGCCAGGAACTTGTC-
3′，SEQ ID NO：14)来扩增α-珠蛋白转录物。将β-珠蛋白表达结果归一化至α-珠蛋白。平行地，在体外分化至完全成熟的无核红细胞的遗传学上修饰的HSPC(液体培养物分化的第21天)中进行了反相HPLC(RP-HPLC)分析(如以上的实施例6中所述)。通过评价镰状化的逆转和SCD细胞的增加的粘附性和刚性(参与血管闭塞事件的病理学发生的特征)的修正，在无核红细胞(液体培养物分化的第21天)中评估功能RBC特性的恢复(Picot等，Am J Hematol，
2015，90(4)：339-45)。将细胞暴露于氧剥夺的气氛(0％O2)，在无核红细胞(液体培养物分化的第21天)中评价镰状化动力学。通过视频显微镜实时监控镰状化的时程1小时，使用AxioObserver Z1显微镜(Zeiss)和40倍物镜每5分钟捕获图像。
[0252] 此过程如图12所示。
[0253] 当使用本发明的任何慢病毒载体时，将此方法加以必要的修改而应用。
[0254] 实施例8：患者SCD HSC的体内遗传修饰
[0255] 在体内小鼠实验中评估了遗传学上修饰的患者SCD HSC的植入能力以及治疗手段在来源于植入的SCD HSC的红细胞中的功效。经修饰的HSC的体内频率和治疗策略的功效必须与在HSPC中体外测量的相同参数相似，以排除归因于我们的治疗的任何HSC损伤。
[0256] 将来源于SCD患者的流动的外周血或骨髓的HSPC在RetroNectin(20μg/ml，Takara Shuzo Co.)包被的平板中在以下的扩增培养基中培养(预活化步骤)：含有2mM谷氨酰胺、青霉素和链霉素(每种100U/ml，Gibco，LifeTechnologies)、Flt3-配体(300ng/ml，Peprotech)、SCF(300ng/ml，Peprotech)、TPO(100ng/ml，Peprotech)和IL3(60ng/ml，Peprotech)的StemSpan SFEM培养基(StemCell Technologies)。解冻后24小时(第1天)，在扩增培养基+蛋白硫酸盐(4μg/ml)中用表达抗镰状化基因以及靶向以下的gRNA的慢病毒载体转导1×106-2×106个细胞，并将其在RetroNectin(20μg/ml，Takara Shuzo Co.)包被的96孔平板中涂板：β-珠蛋白基因(例如LV.GLOBE.βAS3-globin.gRNAD-OPTIMIZED，SEQ ID NO：47或LV.GLOBE-AS3modified.gRNAD，SEQ ID NO：94)、或内含子红系特异性BCL11A增强子(LV.GLOBE-AS3修饰的gRNA-BCL11A增强子，SEQ ID NO：75)、或γ-珠蛋白启动子(LV.GLOBE-AS3modified.gRNA-13bp-del，SEQ ID NO：76)(MOI 20-100)。用LV.GLOBE.γ-β-globin(SalI)(MOI 20-100)和LV.GLOBE.gRNAD(MOI 20-100，无βAS3珠蛋白转基因的携带gRNA表达盒的LV.GLOBE载体)转导对照细胞。转导后24小时(第2天)更换培养基，并使用Nucleofector 4D(Lonza)以100μl体积用20μg的经假尿苷和5-甲基胞苷修饰以减少免疫刺激的Cas9 mRNA(Trilink，#L-6125)转染1×106-3×106个细胞。替代地，使用Nucleofector
5 5
4D(Lonza)以20μl体积用30pmol-180pmol的Cas9转染1×10 -3×10 个细胞。对于HSPC(CA137程序)，我们使用AMAXA人CD34细胞Nucleofector试剂盒(VPA-1003)。转染后，将HSPC维持在补充有Z-VAD-FMK(120μM，InvivoGen)和StemRegenin 1(750μM，Stem Cell Technologies)的相同培养基中。次日(第3天)，向9-10周龄的部分地骨髓清除
(myeloablated)的免疫缺陷型NSG(NOD SCID GAMMA；NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠中静脉内注射细胞(每只小鼠0.5×106-1×106个细胞)。16周后，对小鼠实施安乐死，并使用抗人CD45抗体相比于抗鼠CD45抗体通过流式细胞术对骨髓、胸腺和脾分析人细胞的植入。植入的人细胞的百分比如下定义：huCD45+％/(huCD45+％+muCD45+％)。通过用于人CD34、人CD45、人CD19、人CD33、人CD71、人CD36和人CD235a的细胞特异性染色对存在的不同的造血细胞类型进行分析。如上文的实施例7所述，在经纯化的HSPC以及淋巴和髓系后代中确定转导效率和基因组编辑效率。
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4D(Lonza)以20μl体积用30pmol-180pmol的Cas9转染1×10 -3×10 个细胞。对于HSPC(CA137程序)，我们使用AMAXA人CD34细胞Nucleofector试剂盒(VPA-1003)。转染后，将HSPC维持在补充有Z-VAD-FMK(120μM，InvivoGen)和StemRegenin 1(750μM，Stem Cell Technologies)的相同培养基中。次日(第3天)，向9-10周龄的部分地骨髓清除
(myeloablated)的免疫缺陷型NSG(NOD SCID GAMMA；NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠中静脉内注射细胞(每只小鼠0.5×106-1×106个细胞)。16周后，对小鼠实施安乐死，并使用抗人CD45抗体相比于抗鼠CD45抗体通过流式细胞术对骨髓、胸腺和脾分析人细胞的植入。植入的人细胞的百分比如下定义：huCD45+％/(huCD45+％+muCD45+％)。通过用于人CD34、人CD45、人CD19、人CD33、人CD71、人CD36和人CD235a的细胞特异性染色对存在的不同的造血细胞类型进行分析。如上文的实施例7所述，在经纯化的HSPC以及淋巴和髓系后代中确定转导效率和基因组编辑效率。
[0257] 使用免疫磁性分离(人CD34微珠试剂盒；Miltenyi Biotech)从植入小鼠的骨髓中分离出人CD34+HSPC。hCD34阳性部分在三相液体红系培养体系中培养(Giarratana等，Blood，2011，118(19)：5071-9)或在含有支持红系和髓系造血祖细胞生长的细胞因子的半固体培养基中涂板(克隆祖细胞测定；培养基GFH4435，Stem Cell Technologies)。鉴于在NSG小鼠中在体内获得的低数量的红系细胞，如上所述(实施例7)，在经修饰的SCID-再植细胞的红系后代中离体评估抗镰状化转基因的表达、镰状β-珠蛋白表达的下调和SCD表型的功能性修正。
[0258] 此过程如图13所示。
[0259] 实施例9：转基因表达、基因组编辑效率以及(i)β-珠蛋白下调(gRNA D)或(ii)γ-珠蛋白重新活化(gRNA-13bp-del和gRNA-BCL11A增强子)的评价
[0260] 方案
[0261] 所使用的慢病毒载体
[0262] LV.GLOBE-AS3modified(LV.GLOBE.βAS3-globin质粒，SEQ ID NO：45)：仅容纳有通过将沉默突变插入gRNA-D靶向的外显子1的序列中而修饰的β-AS3转基因(AS3修饰的转基因)、不表达gRNAD的慢病毒载体。
[0263] LV.GLOBE-AS3modified.gRNAD(LV.GLOBE-AS3modified.gRNAD，SEQ ID NO：94)：表达AS3修饰的转基因以及经优化的gRNA D的慢病毒载体。
[0264] LV.GLOBE-AS3modified.gRNA-luciferase(SEQ ID NO：93)：表达AS3修饰的转基因以及靶向荧光素酶基因(该基因在人基因组中不存在)的经优化的gRNA的慢病毒载体。
[0265] LV.GLOBE-AS3modified.gRNA-BCL11A增强子(SEQ ID NO：75)：表达AS3修饰的转基因以及靶向BCL11A基因的内含子红系特异性增强子的经优化的BCL11A gRNA(5′-CACAGGCTCCAGGAAGGGTT-3′-SEQ ID NO：74)的慢病毒载体。为了通过TIDE评价BCL11A gRNA的编辑效率，使用以下引物：
[0266] -BCL11A-TIDE正向：5′-TGGACAGCCCGACAGATGAA-3′-SEQ ID NO：77)
[0267] -BCL11A-TIDE反向：5′-AAAAGCGATACAGGGCTGGC-3′-SEQ ID NO：78)
[0268] LV.GLOBE-AS3modified.gRNA-13bp-del(SEQ ID NO：76)：表达AS3修饰的转基因以及被设计以复制在HBG1和HBG2基因的启动子内的13bp小HPFH缺失的经优化的13bp-del gRNA(SEQ ID NO：71)的慢病毒载体。为了通过TIDE评价13bp-del gRNA的编辑效率，使用以下引物：
[0269] -13bp-del-TIDE正向：5′-AAAAACGGCTGACAAAAGAAGTCCTGGTAT-3′(SEQ ID NO：79)[0270] -13bp-del-TIDE反向：5′-ATAACCTCAGACGTTCCAGAAGCGAGTGTG-3′(SEQ ID NO：80)[0271] HUDEP-2细胞的转导
[0272] 用LVs以MOI50转导HUDEP-2 WT细胞：LV.GLOBE-AS3modified.gRNAD(D，SEQ ID NO：94)、LV.GLOBE-AS3modified.gRNA-BCL11A增强子(BCL11A，SEQ ID NO：75)和LV.GLOBE-AS3modified.gRNA-13bp-del(13bpdel，SEQ ID NO：76)。使用未转导的(UT)样品或用LV(LV.GLOBE-AS3modified(AS3，SEQ ID NO：45)和LV.GLOBE-AS3modified.gRNA-luciferase(Luc))转导的细胞作为对照。
[0273] 转导后10天，用4μg GFP-Cas9质粒(pMJ920，Addgene质粒#42234)转染经转导的细胞。18小时后，通过FACS分选经质粒转染的Cas9-GFP+细胞(29％-45％，未显示)。
[0274] 平行地，通过使用Nucleofector 4D(CA-137程序)，使用10μg(60pmol)的Cas9-GFP蛋白对经LVs(LV.GLOBE-AS3modified.gRNAD)转导的样品进行电穿孔，实现约90％的表达GFP+Cas9的细胞(未显示)。
[0275] 然后在成熟的成红细胞中对以下进行了区分：经分选的质粒转染的以及未经分选的Cas9蛋白转染的D样品，以及用作对照的非转导且非转染的细胞(UT)以及转导但非转染的样品。
[0276] mRNA定量
[0277] 图15中展现了成熟的成红细胞(分化的第9天)中的珠蛋白mRNA表达。
[0278] 通过qRT-PCR在分化的第9天收集的样品中评价珠蛋白表达。使用RNeasy micro试剂盒(QIAGEN)按照制造商的说明提取总RNA。使用用于RT-PCR的SuperScript第一链合成系统(Invitrogen)用寡核苷酸(dT)引物对成熟的转录物进行逆转录。使用SYBR green(Applied Biosystems)进行qRT-PCR。
[0279] 使用引物HBG1+HBG2正向：5′-CCTGTCCTCTGCCTCTGCC-3′(SEQ ID NO：81)以及HBG1+HBG2反向：5′-GGATTGCCAAAACGGTCAC-3′(SEQ ID NO：82)来扩增γ-珠蛋白转录物。使用引物HBB-AS3正向：5′-AAGGGCACCTTTGCCCAG-3′(SEQ ID NO：21)和HBB-AS3反向：5′-GCCACCACTTTCTGATAGGCAG-3′(SEQ ID NO：22)来专门扩增βAS3珠蛋白转录物。使用引物HBB正向：5′-AAGGGCACCTTTGCCACA-3′(SEQ ID NO：81)和HBB反向：5′-gccaccactttctgataggcag-3′(SEQ ID NO：82)来扩增内源性β-珠蛋白转录物。使用引物HBD正向：5′-CAAGGGCACTTTTTCTCAG-3′(SEQ ID NO：85)和HBD反向：5′-AATTCCTTGCCAAAGTTGC-
3′(SEQ ID NO：86)来扩增δ-珠蛋白转录物。使用引物HBA1 F(5′-CGGTCAACTTCAAGCTCCTAA-
3′，SEQ ID NO：13)和HBA1 R(5′-ACAGAAGCCAGGAACTTGTC-3′，SEQ ID NO：14)来扩增α-珠蛋白转录物。将内源性β-珠蛋白、AS3 β-珠蛋白、γ-珠蛋白和δ-珠蛋白的结果归一化至α-珠蛋白。
3′(SEQ ID NO：86)来扩增δ-珠蛋白转录物。使用引物HBA1 F(5′-CGGTCAACTTCAAGCTCCTAA-
3′，SEQ ID NO：13)和HBA1 R(5′-ACAGAAGCCAGGAACTTGTC-3′，SEQ ID NO：14)来扩增α-珠蛋白转录物。将内源性β-珠蛋白、AS3 β-珠蛋白、γ-珠蛋白和δ-珠蛋白的结果归一化至α-珠蛋白。
[0280] 通过伴随着Cas9-GFP质粒转染或无Cas9-GFP质粒转染的用LV.GLOBE-AS3modified.gRNA-BCL11A增强子转导的样品中的qRT-PCR(如上所述)、随后的基于流式细胞术的GFP+细胞的选择，来评价未分化的(第0天)HUDEP WT细胞和处于不同的分化天数(第
5天、第7天和第9天)的分化的成红细胞中的BCL11A mRNA的表达。通过使用qRT-PCR用以下引物进行总的BCL11A mRNA亚型和BCL11A亚型XL(主要参与γ-珠蛋白表达的调节)的时程分析：
5天、第7天和第9天)的分化的成红细胞中的BCL11A mRNA的表达。通过使用qRT-PCR用以下引物进行总的BCL11A mRNA亚型和BCL11A亚型XL(主要参与γ-珠蛋白表达的调节)的时程分析：
[0281] -BCL11A正向：5′-AACCCCAGCACTTAAGCAAA-3′(SEQ ID NO：87)
[0282] -BCL11A反向：5′-GGAGGTCATGATCCCCTTCT-3′(SEQ ID NO：88)
[0283] -BCL11AXL正向：5′-ATGCGAGCTGTGCAACTATG-3′(SEQ ID NO：89)
[0284] -BCL11AXL反向：5′-GTAAACGTCCTTCCCCACCT-3′(SEQ ID NO：90)
[0285] -GAPDH正向：5′-CTTCATTGACCTCAACTACATGGTTT-3′(SEQ ID NO：91)
[0286] -GAPDH反向：5′-TGGGATTTCCATTGATGACAAG-3′(SEQ ID NO：92)
[0287] 珠蛋白链和血红蛋白四聚体的HPLC分析
[0288] 图16展现了使用反相HPLC在来源于对照或遗传学上修饰的HUDEP细胞(分化的第9天)的成熟的成红细胞中获得的珠蛋白链谱图。图18示出了归一化至α-珠蛋白水平的β样珠蛋白的蛋白质水平的定量。
[0289] 简而言之，使用NexeraX2 SIL-30AC色谱仪(Shimadzu)和LC Solution软件对珠蛋白链进行反相HPLC(RP-HPLC)分析。使用250×4.6mm、3.6μm Aeris Widepore柱(Phenomenex)通过HPLC分离来自体外分化的成熟的成红细胞的珠蛋白链。用溶液A(水/乙腈/三氟乙酸，95:5:0.1)和溶液B(水/乙腈/三氟乙酸，5:95:0.1)的梯度混合物洗脱样品。在220nm下测量吸光度。
[0290] 图19展现了使用阳离子交换HPLC在来源于未修饰或遗传学上修饰的HUDEP细胞(分化的第9天)的成熟的成红细胞中获得的血红蛋白谱图。以占血红蛋白四聚体总量的百分比报告各血红蛋白四聚体(HbA、HbAS3、HbF和HbA2)的定量结果，并且如图20所示。
[0291] 使用NexeraX2 SIL-30AC色谱仪(Shimadzu)和LC Solution软件，通过阳离子交换HPLC进行血红蛋白四聚体的分析。使用2阳离子交换柱(PolyCAT A，PolyLC，Columbia，MD)分离来自成熟的成红细胞的血红蛋白四聚体。用溶液A(20mM bis Tris，2mM KCN，pH＝6.5)和溶液B(20mM bis Tris，2mM KCN，250mM NaCl，pH＝6.8)的梯度混合物洗脱样品。在415nm下测量吸光度。
[0292] 结果：
[0293] A)珠蛋白(图15)和BCL11A mRNA表达(图17)
[0294] 1)未转染的细胞(未转染)
[0295] AS3mod(图中未示出)：与其它样品相比，与较高的VCN相关的较高的β-AS3的表达水平。
[0296] “Luc”转导的细胞：与对照(UT)相比相似的内源性HBB mRNA的表达水平，以及由于较低的VCN，与AS3mod相比较低的AS3β-珠蛋白mRNA转基因的表达(图15)。
[0297] “D”转导的细胞：由于不存在Cas9递送，无内源性β-珠蛋白基因(即HBB)的失活。与对照(UT和“luc”)相比相似的内源性HBB mRNA的表达水平。“D”还以与具有相似的VCN的对照(“luc”)相比相似的水平表达AS3β-珠蛋白mRNA转基因(图15)。
[0298] “BCL11A”和“13bp del”转导的细胞：由于不靶向HBB的gRNA的表达，无内源性β-珠蛋白基因(即HBB)的失活。与对照(UT和“luc”)相比BCL11A和13bp del样品中的相似的内源性HBB mRNA的表达水平。与具有相似VCN的对照(“luc”)相比BCL11A和13bp del样品两者的相似的AS3β-珠蛋白mRNA转基因的表达水平(图15)。
[0299] 注意，在非转染的BCL11A样品中，BCL11A/BCL11AXL mRNA表达水平随时间增加，在分化的第5天和第7天达到峰值(在图17中用作对照)。
[0300] 2)用GFP-Cas9质粒(GFP+(Cas9质粒))或Cas9-GFP蛋白(Cas9蛋白)转染的细胞[0301] AS3mod和Luc转导的细胞：由于LV载体(AS3mod)中不存在gRNA或存在靶向荧光素酶基因(Luc)的gRNA，无内源性HBB基因的外显子1以及γ-珠蛋白启动子或BCL11A基因的内含子增强子中的基因组编辑。与用相同LV转导但未用Cas9-GFP质粒“转染”的样品相比相似的内源性β-珠蛋白链、AS3β-珠蛋白链、γ-珠蛋白链和δ-珠蛋白链的表达水平。
[0302] “D”转导的细胞：由于gRNA D对内源性HBB基因的靶向以及Cas9的质粒或蛋白质递送，与D“未转染的”样品和对照样品相比内源性β-珠蛋白基因表达的下调。β-AS3转基因和γ-珠蛋白链(Aγ+Gγ)的表达趋于增加，这可能是HBB下调的结果。
[0303] “BCL11A”和“13bp del”转导的细胞：由于作为gRNA表达和Cas9的质粒递送的结果的红系特异性BCL11A增强子的破坏(BCL11A样品)或γ-珠蛋白启动子中的13bp区域的缺失(13bp del样品)，与“BCL11A”和“13bp del”未转染的样品和对照相比，观察到γ-珠蛋白链(Aγ+Gγ)表达的上调。实际上，用Cas9进行的处理强力地下调来源于Cas9-GFP+BCL11A样品的成熟的成红细胞中的BCL11A(包括XL亚型)的表达，表明靶向BCL11A增强子的gRNA在降低红系细胞中的BCL11A的表达中有效，并且从而暗示了γ-珠蛋白基因表达的失调(参见例如图15或以下的蛋白质表达水平)。13bp del样品显示出降低的内源性β-珠蛋白基因表达。与用相同的LV转导但未用Cas9-GFP质粒“转染”的样品相比相似的β-AS3-珠蛋白链和δ-珠蛋白链的表达水平。
[0304] B)蛋白表达
[0305] HPLC分析显示出，当与LV.AS3-β-globin.gRNAD转导但非转染的细胞(图16子图B、图18和图20)相比时，来源于用LV.AS3-β-globin.gRNAD转导并且用Cas9-GFP质粒或Cas9蛋白转染的HUDEP-2细胞的成熟的成红细胞(图16子图C、图18和图20)中的内源性β-珠蛋白表达(“β”)以及HbA四聚体(图18和图20)的显著下调以及外源性β-AS3-珠蛋白和HbAS3四聚体(图18和图20)的增加的数量。
[0306] 特别地，如同通过与对照样品中相似的α/非α比说明的，来源于用LV.AS3-β-globin.gRNA-D转导并且用Cas9-GFP质粒或Cas9蛋白转染的HUDEP-2细胞的成熟的成红细胞显示出通过外源性β-AS3-珠蛋白和HbAS3四聚体的表达补偿的内源性β-珠蛋白链的表达(“β”)和HbA四聚体的几乎完全敲减(图18和图20)。HBB靶位点处的基因组编辑及其导致的内源性β-珠蛋白链/HbA的减少以及β-珠蛋白AS3/HbAS3的增加为VCN依赖性的(未显示)，但即使在低VCN(VCN＝3)下也是显著的。
[0307] 与对照样品相比，在来源于用LV.AS3-β-globin.gRNA-BCL11A增强子或LV.AS3-β-globin.gRNA-13bpdel转导并用Cas9-GFP质粒转染的HUDEP-2细胞的成熟的成红细胞中，γ-珠蛋白表达和HbF水平显著增加(图18和图20)，并且HbF表达模式接近全细胞型的，分别在来源于表达Cas9的BCL11A和13bpdel HUDEP-2的成熟的成红细胞中达到61％和74％的F+(HbF+)细胞(图21)。
[0308] 结论：
[0309] 在mRNA和蛋白质水平上的转基因表达(图18和图20)是相关的，并且不受gRNA表达和Cas9递送的削弱。转基因表达在mRNA(图15)和蛋白质(图18和图20)水平上均与VCN相关。
[0310] 在Cas9-GFP+D样品中，内源性β-珠蛋白基因在mRNA水平上的敲减(图15)引起内源性β-珠蛋白蛋白表达的完全敲减(图16和图18)和HbA四聚体的不存在(图19和图20)。因此，在这些细胞中观察到大多数的抗镰状化四聚体(HbAS3)。
[0311] 在所有样品之间，α-珠蛋白和非α-珠蛋白的表达之间的比(α/非α比)相似。抗镰状化珠蛋白表达的同时增加(图15-图16)、主要是AS3-β-珠蛋白(与未转染的D样品相比+60％；图16和图19)补偿了所观察到的稳健的内源性β-珠蛋白下调。因此，未观察到α-珠蛋白链和其它珠蛋白链合成之间的平衡的改变(图18-图19)，从而避免了在此治疗策略的情况下可能被视为风险的α-珠蛋白沉淀的生成(图19-图20)。
[0312] “D”样品中的Cas9蛋白质介导的基因组编辑引起了内源性HbA四聚体(16％)和抗镰状化四聚体(HbAS3、HbF和HbA2；84％)之间的临床相关的转换(图19-图20)。
[0313] 与未转染的13bpdel和BCL11A样品相比，在来源于Cas9-GFP+13bpdel和BCL11A样品的成熟的成红细胞中，观察到γ珠蛋白在mRNA(图15)和蛋白质(对于13bpdel和BCL11A分别约5倍和约10倍的增加(图18))水平上的表达均稳健增加。与匹配的非转染的对照相比，在13bpdel和BCL11A样品中均观察到抗镰状化四聚体的产生增加(在13bpdel和BCL11A中分别为+9％和+22％(图19-图20))，这主要与增强的HbF四聚体的生成相关。在13bpdel样品中，这最终产生约50％的HbA和约50％的HbAS3+HbF，这看起来像健康杂合SCD携带者的情况。
[0314] 图20示出了HbA、HbA2、HbF和HbAS3四聚体的相对量。具有高于50％的抗镰状化Hb水平的个体被认为是健康的(即HbAS3+HbF+HbA2)，这是来源于用D或13bpdel转导并用Cas9转染的HUDEP-2细胞的成红细胞的情况。
[0315] 所有这些结果一起显示了通过发明人在以下方面建立的整合系统的有效性：
[0316] -当使用gRNA D时，使参与SCD病理生理学的突变的β-珠蛋白基因失活；以及[0317] -表达HbAS3，并且当使用gRNA BCL11A或gRNA 13bpdel而非gRNAD时，增加了γ-珠蛋白链的表达，引起足以修正镰状细胞病并避免α-珠蛋白沉淀的量的抗镰状化血红蛋白四聚体的产生。
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