本发明涉及通式(I)所示新型法呢基转移酶抑制剂、其可能的盐 类、其制备方法和含有它们的药物组合物。

对法呢基转移酶的抑制作用以及因此而产生的对蛋白质Ras的法呢 基化反应的抑制作用会阻止突变蛋白质Ras将正常细胞转变为癌细胞。

基因Ras的C-末端序列包含图案“CAAX”或“Cys-Aaa1- Aaa2-Xaa”，其中Aaa代表脂族氨基酸，Xaa代表任何一种氨基酸。

众所周知，具有CAAX序列的四肽能够抑制蛋白质Ras的法呢基 化。例如，PCT WO91/16340与EP0461869描述了法呢基转移酶的肽抑 制剂Cys-Aaa1-Aaa2-Xaa，它们特别地是以在约10-6或10-7M浓度下 呈现其抑制活性的肽Cys-Val-Leu-Ser，Cys-Val-Ile-Met与Cys-Val-Val- Met为代表的。

业已发现，作为本发明的主题，通式(I)所示的肽在约10-8或 10-9M的浓度下表现出抑制活性(IC50)。 在通式(I)中， R1代表通式Y-S-A1-所示基团，其中Y代表氢原子，或氨基酸的 其余部分或脂肪酸的残基或烷基或烷氧羰基，A1代表直链或支链C1-4 亚烷基，在基团＞C(X1)(Y1)的α位可视需要而定被下列基团取代： 其中直链或支链烷基或链烷酰基部分含1-6个碳原子， X1和Y1分别代表氢原子或者二者连同与其结合的碳原子共同形成基团 ＞C＝O， R1′代表氢原子或C1-6直链或支链烷基， X代表氧原子或硫原子， R2代表可视具体情况而定被羟基、C1-4烷氧基、巯基、C1-4烷硫基、 C1-4烷基亚磺酰基或C1-4烷基磺酰基取代的C1-6直链或支链烷基、 链烯基或炔基，当R2代表被羟基取代的烷基时，R2可以与α位羧基形 成内酯， R2′代表氢原子或C1-6直链或支链烷基， R代表氢原子或可被下列基团取代的C1-6烷基：C1-4烷氧基、C1-4 烷基硫、C1-4烷基亚磺酰、C1-4烷基磺酰、苯基、苯氧基、苯硫基、 苯基亚磺酰、苯磺酰、C1-4烷基氨基、其中每一个烷基均含1-4个碳 原子的二烷基氨基，或者可被一个或多个选自卤原子和烷基、烷氧基、 烷硫基或链烷酰基的原子或基团取代的苯基，

更具体地， R1代表式Y-S-A1-所示基团，其中Y代表氢原子或赖氨酸或含多 达20个碳原子的脂肪酸的其余部分，A1代表可被氨基取代的亚乙基或 亚丙基， X1和Y1各自代表氢原子或者连同与其相结合的碳原子共同形成基团 ＞C＝O， R1′代表氢原子或甲基， X代表氧原子， R2代表可被羟基、甲氧基、巯基、甲硫基、甲基亚磺酰基或甲基磺酰基 取代的C1-4烷基， R2′代表氢原子或甲基， R代表氢原子或可被烷氧基取代的C1-4烷基，或苯基。

进一步更具体地， R1代表式Y-S-A1-所示基团，其中Y代表氢原子，A1代表 可被氨基取代的亚乙基或亚丙基， X1和Y1分别代表氢原子或连同与其结合的碳原子共同形成基团 ＞C＝O， R1′代表氢原子， X代表氧原子， R2代表可被羟基、甲氧基、巯基或甲硫基取代的甲基、乙基、丙 基或丁基， R2′代表氢原子， R2代表氢原子或C1-4烷基。

作为尤其令人感兴趣的通式I所示化合物，其中R1代表2- 巯基乙基或1-氨基-2-巯基乙基，X1和Y1分别代表氢原子或 连同与其结合的碳原子共同形成基团＞C＝O，R1′代表氢原子， X代表氧原子，R2代表正丁基或2-甲硫基乙基，R2′代表氢原 子，R代表氢原子或甲基。

本发明还涉及通式(I)的产物的立体异构形式。由 R1C(X1)(Y1)(NR1′)和R′2CH(NR2′)CO-OH表示的 其余氨基酸优选具有天然氨基酸的构型。

本发明还涉及通式(I)的产物的有机或无机盐。

本发明的新型产物可以通过采用由更具体地于肽化学中使用 的分子链嵌接方法派生的已知方法来制备。

一般地，在通式(I)所示的产物中，X1与Y1连同与其结合 的碳原子共同形成基团＞C＝O并且X代表氧原子，该产物由与通 式(II)所示氨基酸缩合的5-硝基-1，2，3，4-四氢化萘 -1-羧酸得到： 式中R2与R2′如上所述，R′代表可被苯基取代的C1-4烷基， 优选为叔丁基， 上述制备过程在诸如羟基苯并三唑和二环己基碳化二亚胺之类缩 合剂以及诸如三乙胺之类碱存在下在诸如二甲基甲酰胺之类有机 溶剂中进行以便得到通式III所示产物 式中X代表氧原子，R2、R2′与R′如上定义， 该产物优选借助氯化亚锡被还原为通式(IV)所示产物 式中X代表氧原子，R2、R2′与R′如上所述， 通式(V)所示化合物与其缩合 式中R1如上所定义，X1与Y1连同与其结合的碳原子共同形成基 团＞C＝O，条件是R1上的氨基与巯基官能团可以由诸如适用于巯 基官能团的三苯甲基或适用于氨基官能团的叔丁氧羰基之类适宜 的保护基得到保护， 该过程优选在卤代甲酸烷基酯(氯代甲酸异丁酯)和有机碱(N- 甲基吗啉)存在下于惰性有机溶剂(四氢呋喃)中进行以便得到通 式(VI)所示产物： 式中R1、X、X1、Y1、R2、R2′和R′如上定义，其中保护 基借助三氟乙酸在乙二硫醇存在下被氢原子取代，这些保护基为三 苯甲基、叔丁氧羰基或叔丁基，以便得到其中X1与Y1连同与其结 合的碳原子共同形成基团＞C＝O的产物(I)。

一般情况下，其中X1与Y1分别代表氢原子的化合物(I)可 以通过其中R1如上限定的通式(VII)所示醛R1-CHO与化合 物(V)在还原剂如氰基硼氢化钠、硼氢化钠、三乙酸基硼氢化钠 或氢存在下，在催化剂存在下相互作用来获得，条件是R1具有的 氨基与巯基官能团可以由诸如适用于巯基的三苯甲基或适用于氨 基的叔丁氧羰基之类适宜保护基得到保护。一般地，该反应在有机 溶剂例如醇如甲醇中进行，该溶剂可视具体情况而定与另一种有机 溶剂例如醚如四氢呋喃结合使用。特别有利的是在无水介质中进行 操作。

一旦完成胺与醛的缩合过程，便可以通过应用常规技术用氢原 子替代保护基。因此，可以借助三氟乙酸在乙二硫醇存在下用氢原 子代替Boc或三苯甲基或叔丁基保护基。

一般情况下，其中X代表硫原子的通式(I)所示产物可以由 其中X为氧原子的式(III)所示产物通过硫化作用、还原、缩合 或根据情况进行的还原氨化以及上述为了制备其中X代表氧原子 的式(I)所示化合物而进行的去保护步骤来获得。

当通式(I)中的R2与α位的羧基官能团形成内酯时，在碱 性介质中对相应的化合物进行处理可以得到其中R2为被羟基取代 的烷基的化合物(I)。一般地，一旦pH高于7便发生内酯的开 环反应。特别有利的是在无机碱(碳酸钠、氢氧化钾)的存在下于 稀酒精介质如水-甲醇混合物中进行。

其中R代表可被取代的烷基或可如上被取代的苯基的上述化 合物(I)可以通过其中R代表氢原子的化合物(I)在不触及分 子中其余部分的酯化反应的通常条件下进行酯化反应来获得。

其中R代表氢原子的化合物(I)还可以通过化合物(VI) 发生皂化反应随后在上述条件下置换R1携带的保护基而获得。

可以按照T.NAKAYAMA等人在Chem.Pharm.Bull.32，3968 (1984)中描述的方法制备与7-硝基-1，2，3，4-四氢化萘 基-1-羧酸混合在一起的5-硝基-1，2，3，4-四氢化萘 基-1-羧酸。

可以按照诸如色谱分离之类的常规方法提纯化合物(I)。

下列实施例描述本发明化合物的制备方法。

实施例1

按照T.NAKAYAMA等人的Chem.Pharm.Bull.32，3968(1984) 所述方法制备5-硝基-1，2，3，4-四氢化萘基-1(R， S)-羧酸。

在由1.23g 5-硝基-1，2，3，4-四氢化萘基-1(R， S)-羧酸与25cm3氯仿和7.5cm3二甲基甲酰胺形成的溶液中，加 入1.24g(L)-蛋氨酸甲酯盐酸盐、0.84g 1-羟基苯并三唑、 0.9cm3三乙胺和1.28g二环己基碳化二亚胺。在约20℃下将反应 混合物搅拌2天，随后用烧结玻璃过滤，用50cm3氯仿洗涤，先2 次用50cm3 10％(P/V)碳酸氢钠水溶液、随后1次用50cm3 10 ％柠檬酸水溶液、1次用蒸馏水、最后用饱和氯化钠水溶液洗涤有 机溶液。用MgSO4干燥有机相，过滤，减压浓缩至干。得到3.68g N-(5-硝基-1，2，3，4-四氢化萘基-1(R，S)- 羰基)-(L)-蛋氨酸甲酯油状物，其特征如下所示： -质子核磁共振谱(300MHz；(CD3)2SO d6；δ

ppm；co偶合常J Hz)：1，55-2.10(mt，6H：CH2CH2 2和CH2

3)；2，07(s，3H：SCH3)；2，56(mt，1H：CH en1)；4，45(mt，1H：CHCOO)；

7，35-7，55和7，77(2mts，2H和1H：H6和H7和H8)；

8，63和8，69(2d，J＝8，5，1H：CONH).

向由3.68gN-(5-硝基-1，2，3，4-四氢化萘基-1 (R，S)-羰基〕-(L)-蛋氨酸甲酯与100cm3乙醇组成的 溶液中加入6.32g氯化亚锡(II)二水合物。在约70℃将反应混 合物搅拌30分钟，将其冷却至约20℃。用100cm3乙酸乙酯稀释 后，将反应混合物倾至冰上，通过加入5％碳酸氢钠水溶液将pH 值调至7-8。在配有C盐的烧结玻璃上过滤所得到的混合物。通 过倾析分离有机相，用150cm3乙酸乙酯萃取水相2次。合并有机 相，用MgSO4干燥，过滤并减压浓缩至干。因此得到2.49g油状N -(5-氨基-1，2，3，4-四氢化萘基-1(R，S)-羰 基〕-(L)-蛋氨酸甲酯，其特征在于：

-质子核磁共振谱(300MHz；(CD3)2SO d6；δ ppm；偶合常数J Hz)：1，50-2，10(mt，6H：CH2CH2 2和CH32)；2，10(s，3H：SCH3)；2，39和2，53(2mts，2H CH2S和CH2 4)； 3，66(mt，1H：CH 1)；3，69(s，3H：CHCOO)；4，75(s宽，2H：NH2)；6，30- 6，60和6，82(2mts，2H和1H：H6和H7和H8)；8，48(d， J＝9，1H：CONH).

向由1.24gN-(5-氨基-1，2，3，4-四氢化萘基- 1(R，S)-羰基)-(L)-蛋氨酸甲酯与60cm3甲醇组成的 溶液中加入3.73g S-三苯甲基-N-叔丁氧羰基半胱氨醛 (cysteinal)、0.48cm3浓乙酸、分子筛(3埃)和0.52g氰基硼 氢化钠。在约20℃将反应混合物搅拌2天，随后用配有C盐的烧 结玻璃过滤。用甲醇洗涤烧结玻璃。减压浓缩滤液至干，将残余物 溶于150cm3乙酸乙酯并且用100cm3 10％(p/v)NaHCO3水溶 液、100cm3 10％(p/v)柠檬酸水溶液、100cm3蒸馏水、再用 100cm3 10％(p/v)NaHCO3水溶液、最后用100cm3NaCl饱和水 溶液洗涤。用MgSO4干燥有机相，过滤并在减压下浓缩至干。得 到5.62g米色奶油夹心烤蛋白状N-〔5-(2(R)-叔丁氧羰 基氨基-3-三苯基甲巯基丙氨基)-1，2，3，4-四氢化萘 基-1(R，S)-羰基〕-(L)-蛋氨酸甲酯，其特征如下

质子核磁共振谱(300MHz；(CD3)2SO d6

加数滴CD3COOD d4；δppm；T＝393K；偶合常数

J Hz)：1，38(s，9H：C(CH3)3)；1，50-2，05(mt，6H：CH2CH2 2和 CH2 3)；2，06(s，3H：SCH3)；2，05-2，45和2，53(2 mts，4H和2H： 2CH2S和CH2 4)；2，85-3，05(mt，2H：NH2)；3，63(mt，1H：CH 1)；3，63和 3，67(2 s，3H：COOCH3)；3，71(mt，1H：CHN)；4，43(mt，1H：CHCOO)；6，30- 6，56和6，90(2 mts，2H和1H：H6和H7和H8)；7，15-7，35 (mt，15H：芳香)；8，36和8，39(2d残余，J＝10，1H：CONH).

向由5.45g N-〔5-(2(R)-叔丁氧羰基氨基-3-三苯甲 巯基丙酰氨基)-1，2，3，4-四氢化萘基-1(R，S)- 羰基〕-(L)-蛋氨酸甲酯与10cm3乙二硫醇组成的混合物于约 20℃加入110cm3三氟乙酸。在约20℃搅拌2小时，随后减压浓缩。 用25cm3乙醚研磨残余物3次，随后进行减压干燥。用高性能液相 色谱(相C18)提纯残余物，用含0.1％三氟乙酸的乙腈/水混合 物洗脱。得到0.4g粉状N-〔5-(2(R)-氨基-3-巯基丙氨 基)-1，2，3，4-四氢化萘基-1(R，S)-羰基〕-(L) -蛋氨基甲酯的三氟乙酸盐，其特征如下：

质子核磁共振谱：(300MHz；(CD3)2SO d6

加数滴CD3COOD d4；T＝393°K；δppm；偶合常数

J Hz)：1，55-2，10(mt，6H：CH2CH2 2和CH2 3)；2，04(s，3H： SCH3)；2，30-2，65和2，80(2mts，4H和2H：2CH2S和CH2 4)； 3，30和3，35-3，50(dd，J＝14和8和mt，1H NCH2)；3，43(mt， 1H：CHN)；3，63(mt，1 H：CH en 1)，3，63(s，3H：COOCH3)；4，42(mt，1H： CHCOO)；6，40-6，60和6，95(2mts，2H和1H：H6和H7和H 8)；8，35和8，38(2d残余，J＝8，1H：CONH).

元素分析：C20H31N3O3S2，1，25CF3CO2H

计算值％：C＝47，7；H＝5，70；N＝7，4；S＝11，9

实测值：47，8；537；7，1；10，6

实施例2

向1.98g N-〔5-(2(R)-叔丁氧羰基氨基-3-三苯甲巯 基丙氨基)-1，2，3，4-四氢化萘基-1(R，S)-羰基〕 -(L)-蛋氨酸甲酯于8.4cm3蒸馏水和30cm3四氢呋喃中形成的溶 液中加入0.17g一水合氢氧化锂(LiOH，H2O)。于约20℃搅拌 20小时，减压浓缩。将残余物溶于蒸馏水中并且通过添加10％ (p/v)柠檬酸水溶液将pH值调至3。用100cm3乙酸乙酯萃取水 相3次。合并有机相，用NaCl饱和水溶液洗涤，用MgSO4干燥， 过滤和减压浓缩至干。得到1.92g烤蛋白状N-〔5-(2(R)-叔 丁氧羰基氨基-3-三苯甲巯基丙氨基)-1，2，3，4-四氢 化萘基-1(R，S)-羰基〕-(L)-蛋氨酸。

向0.5g N-〔5-(2(R)-叔丁氧羰基氨基-3-三苯甲巯 基丙氨基)-1，2，3，4-四氢化-萘基1(R，S)-羰 基〕-(L)-蛋氨酸与2.5cm3三乙基硅烷的混合物中于约20℃ 加8cm3三氟乙酸。在约20℃搅拌2小时，减压浓缩。用25cm3 乙醚研磨残余物3次，减压干燥。用高性能液相色谱(相C18)提 纯残余物，用含0.1％三氟乙酸的乙腈-水混合物洗提。得到0.094g 粉状N-〔5-(2(R)-氨基-3-巯基丙氨基)-1，2，3， 4-四氢化萘基-1(R，S)-羰基〕-(L)-蛋氨酸三氟乙 酸盐，其特征在于：

-质子核磁共振谱：(300MHz；(CD3)2SO d6；δ

ppm；偶合常数J Hz)：1，55-2，10(mt，6H：CH2CH2 2和CH2

3)；2，06(s，3H：SCH3)；2，30-2，65和2，75-2，30(2mts，4H和2H：

2CH2S和CH2 4)；3，30和3，35-3，50(dd，J＝14和8和mt，1H

：NCH2)；3，43(mt，1H：CHN)；3，66(mt，1H：CH en 1)；4，37(mt，1H：

CHCOO)；6，40-6，60和6，95(2mts，2H和1H：H6和H7和H

8)；7，95(s宽3H：NH3+)；8，33和8，35(2d，J＝9，1H：CONH).

元素分析：C19H29N3O3S2，1，33 CF3CO2H

计算值％：C＝46，2；H＝5，42；N＝7，46；S＝11，38；F＝13，46

实测值：45，8；5，5；7，47；11，25；13，2

可以在下列试验中证明蛋白质Ras的法呢基转移酶和法呢基 化作用的抑制活性。

法呢基转移酶的活性是通过被转移的(3H)法呢基的数量由 蛋白质p21 H-Ras上的(3H)焦磷酸法呢酯〔(3H)FPP〕 来确定。最终体积为60μl的标准反应混合物的组成如下：三羟 甲基氨基甲烷-HCl50mM，MgCl2 5mM，二硫苏糖醇5mM， 辛基-β-D-吡喃葡糖苷0.2％，p21 H-ras 200皮摩尔， (3H)FPP(61000dpm/皮摩尔)4.5皮摩尔。

通过添加约5ng由THP1细胞培养物提纯得到的人体法呢基 转移酶来引发反应。在有96个1cm3孔的微量滴定平皿(Titer Plate，Beckman)上于37℃培养20分钟后，通过添加0.4cm30.1 ％处于甲醇之中的0℃SDS来终止反应。随后加入0.4cm330％处 于甲醇之中的三氯乙酸(TCA)。将平皿放置于冰中1小时。用 过滤装置(Combi Cell Harvester，Skatron)在玻璃纤维膜 (FiltermatPharmacia)上回收沉淀物并用6％处于蒸馏水中的 三氯乙酸进行清洗。用微波炉干燥这些膜，随后用通过在热空气中 熔融形成的闪烁体(MeltilexPharmacia)进行浸渍，最后在β -Plate(LKB)计数器中计数(cpm)。每一试验重复3次。

活性单元被定义为在20分钟内在p21 H-Ras上有1皮摩尔 (3H)FPP被转移。

通过将在有或无抑制剂存在的条件下进行的试验经过空白扣 除之后进行对比得到抑制百分比，IC50为由9种不同浓度采用 Enzfitter或Grafit软件得到的抑制效果测量值。

可以下列方式确定细胞活性：

细胞系为THAC系(被活性Ha-Ras转染的细胞CCL39， K.Sennuen等人，EMBOJ.，7(1)161-168(1988))。这 些细胞在含DMEM介质、5％胎牛血清，1％G418的直径为 6cm的培替培养皿中被接种。

培养24小时之后，改变培养介质(采用或不采用血清)，将 所研究的化合物在有或无DTT存在条件下以二甲基甲酰胺 (DMF)溶液的形式加入其中(DMF的最终浓度为0.5％， 0.1mMDTT)。于37℃培养24小时后，在1cm3裂解缓冲液(三 羟甲基氨基甲烷HCl20mM，三硝基甲苯X1141％，MgCl25mM，DTT7mM，NaCl150mM，pH＝7.4)中裂解细胞。在10 分钟内以4000转/分的转速通过离心分离澄清裂解物。用三硝基甲 苯(Triton)X114进行萃取能够将法尼基化蛋白Ras与非法尼基 化蛋白Ras相互分离〔C.BORDIER，J.Biol.Chem.256(4)，1604 -1607(1981)〕。憎水性更强的法尼基化蛋白Ras存在于去污 剂相中，而非法尼基化蛋白Ras存在于水相中。在用于在14％聚 丙烯酰胺凝胶上进行电泳和沉积的变性缓冲剂中通过于95℃加热 将样品变性。当着色剂到达凝胶下部时，凝胶的蛋白质在PVDF隔 膜上被转移。借助蛋白质印迹法提取蛋白质Ras：用特异性的抗 Ras(pan-Ras Ab3，Oncogene Science)单克隆抗体随后用125I 标记蛋白质A培养膜。经过自动射线照相术，识别分割谱带并用γ 计数器计数。与法尼基化Ras和非法尼基化Ras对应的谱带的放射 活性可以确定对蛋白质Ras的法尼基化作用的抑制百分数。

结果如表1所示。

表1 化合物    抑制活性IC50nM对细胞(THAC)的抑制作用(％) 实施例1   15                   ＞10(10μM) 实施例2   405                    50(50μM)

新型化合物I呈无毒性和药物可接受的盐的形式。这些无毒盐 包括与无机酸(盐酸、硫酸、氢溴酸、磷酸、硝酸)或与有机酸(乙 酸、三氟乙酸、丙酸、琥珀酸、马来酸、羟基马来酸、苯甲酸、富 马酸、甲磺酸或草酸)或与无机碱(氢氧化钾、氢氧化锂、碳酸钠、 石灰)或有机碱(叔胺如三乙胺、哌啶、苄胺)根据化合物I中R1 和R的性质形成的盐。

本发明还涉及含有至少一种与一种或多种惰性或生理活性且 药物可接受稀释剂或助剂缔合的化合物I的药物组合物形式。

这些组合物可以口服、非肠胃或直肠方式给药。

口服组合物包括片剂、丸剂、粉剂或粒剂。其中本发明活性化 合物与一种或多种惰性稀释剂如蔗糖、乳糖或淀粉混合。其中还可 以含有除了稀释剂以外的其它物质如润滑剂例如硬脂酸镁。

作为口服液体组合物，可以选用药物可接受的乳液、溶液、悬 液液、糖浆、含有惰性稀释剂如水或石蜡油的酏剂。其中还可以含 有除了稀释剂以外的其它物质例如润湿剂、甜味剂或芳香剂。

用于非肠胃给药的本发明组合物可以是含水或非水无菌溶 液、悬浮液或乳液。作为溶剂或赋形剂，可以采用丙二醇、聚乙二 醇、植物油、尤其是橄榄油或可注射有机酯如油酸乙酯。其中还可 以含有助剂，尤其是润湿剂、乳化剂和分散剂、可以采用多种方法 例如借助细菌过滤器向组合物中加入杀菌剂或通过加热来进行灭 菌步骤。这些组合物还可被制成在使用时能够被溶于无菌水中或其 他可注射无菌介质中的无菌固体组合物。

适用于直肠给药的组合物为除了活性化合物以外还含有赋形 剂如可可油的栓剂。

本发明组合物特别适用于治疗人体不同器官的癌症。

人体治疗剂量取决于所期望的疗效、疗程和治疗客体的自身因 素。

一般地，人体腹膜内给药剂量包括在0.1-20mg/kg/天。

下列实施例描述本发明组合物。

实施例

将实施例1得到的化合物200mg溶于100cm3生理盐水之中。 将所形成的溶液以无菌方式分配于10cm3安瓿瓶中。

以一次性注射或灌注的方式施用这些安瓿给药。