一种副猪嗜血杆菌亚单位疫苗及其制备方法
阅读：372发布：2021-06-12
专利汇可以提供一种副猪嗜血杆菌亚单位疫苗及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种用于 预防 猪革拉氏病的亚单位 疫苗 及其制备方法。通过原核表达方法从一株副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，H.parasuis）（菌种保藏号：CGMCC NO.11145，发明 专利 申请 公布号：CN105524857A）克隆表达了具有免疫原性的外膜蛋白Omp16。以该蛋白为 抗原 ，用壳聚糖、 橄榄油 和海藻酸钠为材料包被Omp16蛋白制成了副猪嗜血杆菌亚单位微球疫苗。用该疫苗分别进行注射和口服免疫的小鼠，对H.parasuis血清5型攻击的免疫保护率分别达80%和60%。，下面是一种副猪嗜血杆菌亚单位疫苗及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种副猪嗜血杆菌亚单位疫苗，其特征在于：所述疫苗包含氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示的副猪嗜血杆菌外膜蛋白Omp16抗原以及由橄榄油、壳聚糖和海藻酸钠组成的佐剂；各组分的体积份数为：200 mg/ml的Omp16抗原蛋白8-9份，2% m/v海藻酸钠溶液9-11份，橄榄油28-30份，1% m/v壳聚糖溶液19-21份，Tween80 1-2份，Span80 1-2份，8% m/v CaCl2
90-110份；
该疫苗制备方法，包括以下步骤：
（1）将副猪嗜血杆菌外膜蛋白Omp16，加入到海藻酸钠溶液中，加入Tween80，搅拌混合后再加入橄榄油，以及Span-80，搅拌使其充分乳化；
（2）将上述乳化液缓慢液滴入CaCl2溶液中，搅拌30 分钟，交联固化形成微球；
（3）用乙酸钠缓冲液洗涤固化的微球沉淀；
（4）用10份乙酸钠缓冲液混悬微球，并将其加入的壳聚糖溶液中，搅拌30分钟；
（5）离心分离微球，用乙酸钠缓冲液洗涤；
（6）沉淀冷冻干燥后即得微球疫苗。
2.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌亚单位疫苗，其特征在于：所述疫苗各组分的体积份数为：200 mg/ml的Omp16抗原蛋白8.8份，2% m/v 海藻酸钠溶液10份，橄榄油28.8份，
1% m/v壳聚糖溶液20份，Tween80 1.2份，Span80 1.2份，8% m/v CaCl2 100份。
3.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌亚单位疫苗，其特征在于：该疫苗为微球，粒径
0.1-5 μm，平均粒径2.5±0.5 μm，采用注射或口服方式进行免疫。
4.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌微球疫苗在制备预防副猪嗜血杆菌感染的药物中的应用。
一种副猪嗜血杆菌亚单位疫苗及其制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，H. parasuis）是一种NAD依赖的革兰阴性菌，属于巴斯德杆菌科嗜血杆菌属。作为一种条件致病菌，H. parasuis在猪应急、免疫抑制等条件下，可感染2-8周龄猪，引起以多发性浆膜炎、脑膜炎、关节炎等为特征的猪革拉氏病（Glasser's disease）。该病发病率通常为10%-20%，死亡率可达 50% 以上。猪革拉氏病广泛存在于世界各国猪场，造成了养猪业巨大的经济损失，是影响猪生产的重要细菌性疾病之一。
[0003] H. parasuis 血清型众多，现已鉴定15 种，尚有约15-40%无法分型。不同地区流行的优势血清型不尽相同，我国以4型，5型最为流行。不同血清型菌株之间的毒力也存在明显差异。在临床上，抗菌药物和疫苗免疫是防制该病的主要措施。使用抗生素易导致细菌的耐药性，因此疫苗免疫预防依然是最主要措施之一。目前，现有的H. parasuis商品疫苗以全菌灭活苗为主，但H. parasuis培养依赖NAD，培养基中需要添加血清，且生长缓慢，也易污染杂菌，因此传统的全菌疫苗制备方法已不能解决日益增长的疫苗需求。研发具有交叉保护力的新型疫苗已成为当前预防和控制 H. parasuis的迫切需求。亚单位疫苗是指将保护性抗原基因在原核或真核细胞中表达，并以基因产物—蛋白质或多肽制成疫苗，具有安全性高、纯度高、稳定性好，产量高等优势，具有广阔的应用前景，是新型疫苗研发的重要方向之一。目前国内外已报道了大量H. parasuis的亚单位疫苗，如用H. parasuis的脂多糖(LPS)，荚膜多糖（CPS）和外膜蛋白（Omp）等制成的亚单位疫苗，其中，相比于脂多糖和荚膜多糖，H. parasuis的 Omp 具有更强的免疫原性。然而，亚单位疫苗也存在一定的不足，主要是免疫原性比全菌苗弱，因此在亚单位疫苗中往往需要增加佐剂以提高其免疫原性，如氢氧化铝、白油等佐剂。但是这些佐剂存在一定的副作用，如铝佐剂疫苗在肌肉注射时产生肉芽肿，矿物油佐剂不能被代谢，也会在注射部分产生肉芽肿，炎症，发热等副作用。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种副猪嗜血杆菌亚单位疫苗及其制备方法，克服现有技术缺陷，即现有副猪嗜血杆菌亚单位疫苗抗原性较弱，使用传统的亚单位疫苗佐剂如铝佐剂，矿物油佐剂等易产生炎症、肉芽肿等副作用，因此现有的副猪嗜血杆菌疫苗的使用效果不理想等不足。
[0005] 本发明通过以下技术方案实现：
[0006] 申请人从H. parasuis菌LY02株（菌种保藏号：CGMCC NO.11145，发明专利申请公布号：CN105524857A）中用PCR技术扩增得到一种外膜蛋白omp16基因片段，其核苷酸序列如表SEQ ID NO.1所示，序列长度为486bp，该基因编码162个氨基酸，序列如列表SEQ ID NO.2所示。
[0007] 将获得的omp16基因片段纯化，酶切处理后克隆至pET-28a（+），构建了能表达外膜蛋白Omp16的重组质粒pET-hps-omp16。将该质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），在IPTG诱导下获得了由该重组质粒表达的外膜蛋白Omp16。大量表达该外膜蛋白，并将其经镍亲和柱纯化和复性。
[0008] 一种副猪嗜血杆菌亚单位疫苗，所述疫苗包含氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示的副猪嗜血杆菌外膜蛋白Omp16抗原以及由橄榄油、壳聚糖和海藻酸钠组成的佐剂；各组分的体积份数为：200 mg/ml的Omp16抗原蛋白8-9份，2% （m/v）海藻酸钠溶液9-11份，橄榄油28-30份，1%（m/v）壳聚糖溶液19-21份，Tween80 1-2份，Span80 1-2份，8%（m/v）CaCl2 90-110份。
[0009] 优选的，所述疫苗各组分的体积份数为：200 mg/ml的Omp16抗原蛋白8.8份，2% （m/v）海藻酸钠溶液10份，橄榄油28.8份，1%（m/v）壳聚糖溶液20份，Tween80 1.2份，Span80 1.2份，8%（m/v）CaCl2 100份。
[0010] 其制备方法为：
[0011] （1）将200 mg/ml的副猪嗜血杆菌外膜蛋白Omp16，加入到2% m/v海藻酸钠溶液中，加入Tween80，搅拌混合后再加入橄榄油，以及Span-80，搅拌使其充分乳化；
[0012] （2）将上述乳化缓慢液滴入8%（m/v）CaCl2溶液中，搅拌30 分钟，交联固化形成微球；
[0013] （3）用乙酸钠缓冲液洗涤固化的微球沉淀；
[0014] （4）用10份乙酸钠缓冲液混悬微球，并将其加入1%（m/v）的壳聚糖溶液中，搅拌30分钟；
[0015] （5）离心分离微球，用乙酸钠缓冲液洗涤；
[0016] （6）沉淀冷冻干燥后即得微球疫苗。
[0017] 所述的Tween80为6%（v/v）的Tween80。
[0018] 所述的Span-80为4%（v/v）的Span-80。
[0019] 所述的乙酸钠缓冲液为0.1 mol/乙酸钠缓冲液。
[0020] 用制备的副猪嗜血杆菌亚单位疫苗在小鼠中进行了免疫攻毒试验，结果显示，注射免疫和口服免疫的小鼠对副猪嗜血杆菌LY02的攻毒保护率分别达80%和60%。
[0021] 本发明的优点：
[0022] （1）筛选了副猪嗜血杆菌的一个保守的外膜蛋白作为抗原，该抗原具有较强的免疫原性；
[0023] （2）在佐剂中使用了海藻酸钠、壳聚糖、橄榄油等生物可降解物质，在注射免疫和口服免疫中均保证了安全性，也无副作用产生；
[0024] （3）将亚单位疫苗制备成微球，可采用注射免疫也可采用口服免疫，特别是口服免疫，使用方便，节省了人力和时间。
[0025] 在本发明的实施例中，申请人提供了从H. parasuis菌LY02株（菌种保藏号：CGMCC NO. 11145，发明专利申请公布号：CN105524857A）克隆表达新型外膜蛋白抗原omp16及用该蛋白制备亚单位疫苗的详细过程。附图说明
[0026] 图1 本发明制备的重组抗原蛋白Omp16纯化后的SDS-PAGE电泳图。M．蛋白质分子量标准；1. pET-28a(+)空载体对照菌株；2. 含质粒载体pET-Hps-omp16的表达菌 。
[0027] 图2 副猪嗜血杆菌Omp16蛋白的Western blot鉴定图。
[0028] 图3 本发明制备的微球疫苗在显微镜下观察图。
[0029] 图4本发明所用的载体质粒pET-28a（+）的图谱。
具体实施方式
[0030] 本发明涉及的主要材料与试剂
[0031] 载体pET-28a（+）和大肠杆菌BL21(DE3)购自默克生物技术有限公司；副猪嗜血杆菌LY02株（菌种保藏号：CGMCC NO.11145，发明专利申请公布号：CN105524857A ）由福建省预防兽医学与兽医生物技术重点实验室分离保藏；细菌基因组提取试剂盒、PCR Mix、限制性核酸内切酶EcoRI 和HindIII、T4 DNA连接酶等购自宝生物（大连）生物技术有限公司；PCR产物回收试剂盒、质粒DNA提取试剂盒、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒、低分子量蛋白标准、透析袋、镍琼脂柱（NTA）、壳聚糖、海藻酸钠、橄榄油、SDS-PAGE试剂盒和ELISA反应板等购自上海生工生物工程有限公司。BCA蛋白测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；TSA、TSB和NAD购自OXOID公司；羊抗猪IgG、羊抗小鼠IgG购自博奥森生物技术有限公司(北京)公司。
[0032] 实施例一 H. parasuis omp16基因的克隆及在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达[0033] 1、引物设计与合成 通过对omp16生物信息学分析，设计一对omp16 扩增引物，去除了其信号肽部分，即N端8个氨基酸序列；引物扩增片段长度为162个氨基酸共486bp；omp16-up 5‘-cgggaattcgcgcctgtaggtgaaac -3’（下划线部分为EcoRI酶切位点）， omp16-dn 5’- cccaagcttttagaaacgataggac -3’（下划线部分为HindIII酶切位点）引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0034] 、H. parasuis的复苏和基因组的提取 取冻干保存的 H. parasuis 菌种，划线接种于 TSA固体平板，置37℃，5% CO2 温箱培养过夜。第二天挑取活化好的细菌单克隆接种于 TSB 培养基，37℃摇床振荡培养10 h。用细菌基因组提取试剂盒提取付猪嗜血杆菌基因组DNA。
[0035] 3、omp16基因的PCR扩增与鉴定 以提取的副猪嗜血杆菌基因组DNA为模板，建立PCR反应体系为：2×PCR Mix 10 μl，引物omp16- up (10 μM) 1 μl，引物omp16- dn (10 μM) 1μl，用dd H2O补充至20 μl。PCR反应程序为：95℃ 变性5 min，然后进入“94℃ 变性40 s，56℃ 退火40 s，72℃ 1 min”的循环，共30次；然后72℃ 延伸 5 min；最后 4℃结束反应。取5 μl 反应产物作琼脂糖凝胶分析。
[0036] 、重组质粒pET-Hps-omp16的构建
[0037] 取100 μl 扩增omp16基因的PCR产物，用PCR回收试剂盒将其纯化。将纯化后的Omp16 DNA和载体pET-28a(+)用EcoRI和HindIII进行双酶切，方法如下：分别取2个1.5 ml离心管按表1配制酶切反应：
[0038]
[0039] 将上述载体和目的基因的酶切反应管置37℃孵育2 h。反应结束后分别将酶切产物进行琼脂凝胶电泳和DNA琼脂糖凝胶回收。
[0040] 酶切反应结束后进行连接与转化反应。在1.5 ml离心管中配制连接反应体系：10×T4 DNA连接缓冲液2 μl，已酶切回收的pET-28a(+)（50 ng/ μl，）2 μl，omp16基因DNA（0.2 pM/ μl）1 μl，T4 DNA连接酶（5 U/ μl）1 μl，ddH2O补充至20 μl。将离心管置16℃连接过夜。取10 μl连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布含卡那霉素LB平板。37℃培养12小时候，挑取菌落，进行质粒鉴定。用质粒DNA提取试剂盒提取质粒，并用双酶切法鉴定重组质粒（方法同上），将阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），获得Omp16蛋白表达菌。
[0041] 5、重组蛋白Omp16在大肠杆菌BL21（DE3）的表达与鉴定
[0042] （1）取卡那霉素抗性平板一个表达菌单菌落，接种含卡那霉素的LB菌液，37℃，200 r/m震荡孵育12小时，取1 ml菌液提取质粒DNA。将提取的质粒DNA用PCR方法和双限制性内切酶切鉴定。PCR方法和酶切鉴定的体系和反应条件同步骤3和4。将上述鉴定为阳性的重组质粒送上海生工生物工程有限公司测序鉴定。测序鉴定为阳性的重组质粒，将其宿主细胞BL21(DE3)接种LB液体培养基（含卡那霉素100 μg/ ml），37℃ 200r/m震荡培养至OD600为0.6后添加IPTG至终浓度为1mM，继续震荡培养诱导2-3h。
[0043] （2）SDS-PAGE分析重组蛋白的表达
[0044] 取诱导后的菌液1 ml，12000 r/m离心2 min，取沉淀，用300 μl PBS重悬沉淀后加入100 μl 4×loading buffer。之后，参照《分子克隆实验指南（第三版）》（J.萨姆布鲁克，等著，黄培堂，等译，科学出版社）进行SDS-PAGE电泳分析。
[0045] （3）Western blot鉴定重组蛋白
[0046] 在SDS-PAGE电泳结束后，进行转膜反应。裁取尺寸略小于凝胶的PVDF膜1张及滤纸6张，将PVDF膜在甲醇中浸泡1 min，滤纸浸泡于电转缓冲液中10 min。按照“滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸”的顺序依次排好后，驱除气泡，以12-15V的电压转移50 min。转膜完毕，用1×PBST洗PVDF膜3次（每次5 min），将膜放入5% 脱脂乳中，4℃封闭过夜。倒掉封闭液，用1×PBST洗涤PVDF膜3次（每次5 min）后放入用5%的脱脂乳1：500稀释的H. parasuis感染猪康复血清中，室温孵育2 h。取出PVDF膜到新的平皿中，用1×PBST洗涤3次（每次10 min）后放入5%的脱脂乳1：5000稀释的HRP标记的羊抗猪IgG 抗体中，室温孵育1 h。取出PVDF膜，用l×PBST洗涤3次（每次10 min）后用ECL化学发光显色试剂盒反应，在暗室中压片，然后进行显影、定影。
[0047] 6、重组蛋白Omp16的大量表达、纯化与复性
[0048] 将Western blot鉴定为表达重组Omp16蛋白阳性的宿主菌BL21(DE3)，诱导表达500 ml菌液。诱导结束后，4℃，5000 r/m离心10 min收集菌体。加入原菌体1/10的裂解缓冲液充分悬浮。冰浴条件下，用超声波破碎细胞（条件为：功率300 W，工作3秒，间歇10秒，共
200次）。12000 r/m离心10 min，弃上清，沉淀加入5 ml PBS洗涤1次。12000 r/m离心20 min。加入6 ml 8M尿素裂解液，4℃静置过夜。12000 r/m离心20 min，取上清。将溶解的包涵体蛋白溶液用NTA柱进行纯化，方法参照试剂盒说明书。将纯化的重组蛋白Omp16放入透析袋，分别在含6M尿素、4M尿素、2M尿素和不含尿素的PBS中，置4℃冰箱，各透析2h进行复性。
复性后，用BCA试剂盒测定已复性的重组Omp16蛋白浓度。方法参照试剂盒说明书。
200次）。12000 r/m离心10 min，弃上清，沉淀加入5 ml PBS洗涤1次。12000 r/m离心20 min。加入6 ml 8M尿素裂解液，4℃静置过夜。12000 r/m离心20 min，取上清。将溶解的包涵体蛋白溶液用NTA柱进行纯化，方法参照试剂盒说明书。将纯化的重组蛋白Omp16放入透析袋，分别在含6M尿素、4M尿素、2M尿素和不含尿素的PBS中，置4℃冰箱，各透析2h进行复性。
复性后，用BCA试剂盒测定已复性的重组Omp16蛋白浓度。方法参照试剂盒说明书。
[0049] 实施例二 副猪嗜血杆菌Omp16亚单位微球疫苗的制备
[0050] 1、乳化-离子交联法制备微球疫苗。将纯化、复性后的Omp16重组蛋白溶解于8.8 ml pH8.0的PBS中配制成浓度为200 mg/ml溶液后，与10 ml的2%海藻酸钠溶液混合，加入1.2 ml Tween 80，充分搅拌混合。在混合液中加入橄榄油28.8 ml， Span-80 1.2 ml，1500 r/min搅拌20 min，充分乳化；将乳化液滴加入100 ml 8% CaCl2溶液中，1200 r/min搅拌30 min，交联固化；将固化的微球悬液转移至离心管中，1500g离心10 min，弃去上层液体，微球沉淀用10ml 0.1 mol/L乙酸钠缓冲液（pH4.5）洗涤3次，用相同缓冲液混悬；取微球混悬液5 ml至烧杯中，加入至20 ml、1%（m/v）的壳聚糖溶液（含0.1mol/L NaAc，pH5.0），继续搅拌10 min；1200g离心10 min分离微球，用缓冲液洗涤3次，沉淀经冷冻干燥后即得微球疫苗。
[0051] 2、微球的表观形态观察与粒径测定。将制备的微球涂布于载玻片上，用倒置显微镜观察微球的外观形态，并测量 20 个微球的直径。结果显示微球的直径在（0.1-5） μm之间，平均直径为(2.5±0.5)μm。
[0052] 3、亚单位疫苗微球的包封率测定。先采用BCA试剂盒测定包被前溶液的蛋白量，包被结束后，取1.0 ml微球悬液，12000g离心15 min，用BCA试剂盒测定上清中的蛋白量，计算包封率［包封率=（溶液的蛋白量-上清中的蛋白量）／溶液中的蛋白量×100%］。结果显示本发明制备的微球疫苗包封率为85.3%。
[0053] 实施例三 副猪嗜血杆菌亚单位疫苗的效力试验
[0054] 1、小鼠免疫试验。取50只8-10周龄清洁级昆明小鼠（购自福建医科大学动物实验中心），分成5组，每组10只。各组免疫程序如表2。注射免疫的各组共免疫两次，间隔14天；口服灌胃组免疫3次，每次间隔14天。
[0055]
[0056] 最后一次免疫14天后，采集小鼠眼眶静脉血，分离血清，-20℃保存备用。
[0057] 血清特异性抗体检测。使用本发明纯化、复性的Omp16蛋白，包被ELISA板，建立检测H. parasuis抗体的间接ELISA方法。用包被液（0.05 mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6）稀释Omp16蛋白后加入ELISA板（200 ng/50μl/孔），在4℃下孵育过夜。弃去包被液，用PBST缓冲液洗涤3次。每孔加入50 μl 0.5%的BSA，于37℃封闭1 h，然后用PBST缓冲液洗涤3次。将上述采集的小鼠血清用PBS稀释300倍后，取100 μl加入ELISA反应孔，同时设立阳性对照和阴性对照。37℃反应30 min。用PBST洗涤3次，加入1:10000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG，37℃反应1h。PBST洗涤3次后，每孔加入50 μl TMB溶液进行显色反应20 min，加入50 μl H2SO4（1.25 mol/L）终止反应后，将ELISA板放入酶标仪测定OD450值。抗体水平检测结果见表3。结果显示，注射组及口服免疫组小鼠血清抗H. parasuis 的S/N值即抗体水平显著高于佐剂组和PBS对照组（p<0.05），且注射组抗体水平高于口服组。
[0058]
[0059] 小鼠攻毒保护试验
[0060] （1）攻毒菌LD50的测定。选取龙岩分离株副猪嗜血杆菌LY02株（血清5型，菌种保藏号：CGMCC NO.11145，发明专利申请公布号：CN105524857A）作为攻毒菌株。攻毒前，先采用寇氏法测定LY02株半数致死量（LD50）（袁安文，等. 副猪嗜血杆菌培养基筛选与小鼠半数致死量测定. 上海畜牧兽医通讯，2011，02:8-9.），方法如下：首先进行预实验：选取与实验小鼠同批次的约18g清洁级昆明小鼠若干只，测得100%小鼠死亡的最小攻毒剂量和死亡率为0的最大耐受剂量分别作为正式试验的最高剂量（Dm）和最低剂量（Dn）分别为2.34×109 9
CFU和1.71×10 CFU。正式试验：取昆明小鼠60只，随机分6组，每组10只。根据预实验结果，用无菌PBS将LY02菌液稀释为不同梯度浓度的菌液，腹腔接种小鼠，每只小鼠接种200 μl。
攻毒后，连续观察2周，计录小鼠死亡情况。根据寇氏公式计算获得该菌株的LD50为2.0×
109 CFU。
CFU和1.71×10 CFU。正式试验：取昆明小鼠60只，随机分6组，每组10只。根据预实验结果，用无菌PBS将LY02菌液稀释为不同梯度浓度的菌液，腹腔接种小鼠，每只小鼠接种200 μl。
攻毒后，连续观察2周，计录小鼠死亡情况。根据寇氏公式计算获得该菌株的LD50为2.0×
109 CFU。
[0061] （2）攻毒试验。最后一次免疫结束后15天，进行攻毒试验。每只小鼠腹腔注射0.2 ml菌含量为2×LD50（即4.0×109 CFU）的H. parasuis LY02菌液。观察10天，统计各组小鼠的死亡情况。结果（表4）显示，注射免疫组和口服免疫组的免疫保护率分别为80%和60%，而PBS对照组1和PBS对照组2全部死亡，佐剂对照组1和佐剂对照组2保护率仅为20%和10%。
[0062]
[0063] 实施例四 副猪嗜血杆菌亚单位疫苗的安全性试验
[0064] 取20只约18g健康昆明小鼠，分成2组，每组10只，用制备的H. parasuis 亚单位微球疫苗分别进行注射和口服免疫。注射组按500 μg/只作皮下注射，口服组采用灌胃方式，每只灌胃1 mg。免疫后观察10天。结果显示，两组小鼠均无异常反应，其精神状态和健康状况良好。各组小鼠注射部位均无肉芽肿、炎症等异常反应。
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