模块表达序列标签制作方法
专利汇可以提供模块表达序列标签制作方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种模 块 表达序列标签的制作方法。选择蛋白模体 氨 基酸序列设计特异简并引物,分离和定义 生物 样本基因的模块表达序列标签。富集模块表达序列标签制成模块表达序列标签 基因芯片 ,并构建进行全方位检索、查询、 电子 拼接的模块表达序列标签 数据库 。本发明能够为选择克隆与生物学表型密切相关的基因提供丰富的功能信息,以期作为功能基因组学、 疾病 诊断和药物筛选等生物技术领域研究的一种基本技术。，下面是模块表达序列标签制作方法专利的具体信息内容。
1．一种模块表达序列标签的制作方法，其特征在于它的步骤为：
1)收集生物物种多种表型及多种发育阶段样本，提取核酸；
2)分离完成的样本为信使核糖核酸则逆转录合成互补脱氧核糖核酸第一 链；分离完成的样本是脱氧核糖核酸则直接用于模块脱氧核糖核酸片段分离；
3)通过比较生物种类已知的蛋白模体，选择目标生物样本偏爱的蛋白模 体组成序列为蓝本；
4)针对目标生物样本偏爱的氨基酸三联核苷酸密码子设计含保守的蛋白 模体序列的聚合酶链式反应简并引物；
5)按蛋白模体序列信息分类聚合酶链式反应引物，并两两组合为一对聚 合酶链式反应扩增引物对；
6)以所述分离合成完成的互补脱氧核糖核酸样本或脱氧核糖核酸样本为 模板，进行聚合酶链式反应扩增，并在反应体系中掺入放射性同位素进行标记；
7)以脱氧核糖核酸测序胶分离技术对聚合酶链式反应扩增产物进行分离 并放射自显影。利用放射自显影提供的聚合酶链式反应基因表达图谱从脱氧核 糖核酸测序胶中回收特异性扩增的模块脱氧核糖核酸片段，并对每一回收的脱 氧核糖核酸片段进行聚合酶链式反应重扩增和琼脂糖凝胶电泳鉴定；
8)对每一重扩增片段，以已知聚合酶链式反应引物为测序引物进行脱氧 核糖核酸序列分析。所获序列经生物信息学处理后，建立模块表达序列标签库；
9)选择不同的模体引物组合重复5)～8)过程；
10)富集获得的模块氧核糖核酸片段构建模体表达序列标签微阵列形式的 基因芯片；
11)富集所有模块的引物序列、每条模块表达序列标签的脱氧核糖核酸序 列、依模块信息转译的蛋白序列及其功能预报，以建立一个可进行全方位检索、 查询、电子拼接的数据库。
2．按权利要求1所述的一种模块表达序列标签的制作方法，其特征在于： 所说的简并引物长度大于或等于15个碱基。
本发明涉及生物技术，尤其涉及一种模块表达序列标签的制作方法。
生物基因组中可转录表达的序列(即基因)仅占总序列的3～5％，对这部 分序列进行测定，将直接导致新基因的发现，并获取基因组中与产业化关系最 为密切的信息。1992年希克拉(Sikela)和马特休巴拉(Matsubara)针对获得 大量信使核糖核酸(mRNA)序列的迫切要求，提出大规模互补脱氧核糖核酸 (cDNA)测序的研究战略。随后，卡雷格·温特(Craig Venter)创立了表达 序列标签(Expressed Sequence Tag，简称EST)技术，其技术特征是以质粒 构建完成的互补脱氧核糖核酸文库中随机选择互补脱氧核糖核酸克隆，利用质 粒上携带的通用引物对互补脱氧核糖核酸两端进行脱氧核糖核酸(DNA)序列 测定，从而获得两端几百个碱基长度的脱氧核糖核酸序列，并富集这些脱氧核 糖核酸序列数据构建表达序列标签数据库(dbEST)。目前，序列表达标签技 术已被广泛运用于三个方面：克隆基因家族相关基因、基因定位克隆及基因定 位图谱制作。表达序列标签技术大大促进了生物信息学的发展，而表达序列标 签数据库又使得传统基因克隆手段向信息化转化。通过对数据库中相关的序列 表达标签进行分类整合和电子拼接，可以获得部分潜在的全长互补脱氧核糖核 酸序列。但是，表达序列标签技术及其数据库并不都能解析和包含未知基因本 身具有的蛋白序列特征性标志及其所包含的潜在功能作用，同时表达序列标签 制作过程由于随机挑选互补脱氧核糖核酸文库克隆测序，造成了巨大数目的重 复测序。
本发明的目的是提供一种加快定向克隆特异性基因的速度的模块表达序列 标签制作方法。
为了达到上述目的本发明采取下列措施：
基于蛋白模块分类的表达序列标签的制作方法，它的步骤为：
1)收集生物物种多种表型及多种发育阶段样本，提取核酸；
2)分离完成的样本为信使核糖核酸则逆转录合成互补脱氧核糖核酸第一 链；分离完成的样本是脱氧核糖核酸则直接用于模块脱氧核糖核酸片段分离；
3)通过比较生物种类已知的蛋白模体，选择目标生物样本偏爱的蛋白模 体组成序列为蓝本；
4)针对目标生物样本偏爱的氨基酸三联核苷酸密码子设计含保守的蛋白 模体序列的聚合酶链式反应简并引物；
5)按蛋白模体序列信息分类聚合酶链式反应引物，并两两组合为一对聚 合酶链式反应扩增引物对；
6)以所述分离合成完成的互补脱氧核糖核酸样本或脱氧核糖核酸样本为 模板，进行聚合酶链式反应扩增，并在反应体系中掺入放射性同位素进行标记；
7)以脱氧核糖核酸测序胶分离技术对聚合酶链式反应扩增产物进行分离 并放射自显影。利用放射自显影提供的聚合酶链式反应基因表达图谱从脱氧核 糖核酸测序胶中回收特异性扩增的模块脱氧核糖核酸片段，并对每一回收的脱 氧核糖核酸片段进行聚合酶链式反应重扩增和琼脂糖凝胶电泳鉴定；
8)对每一重扩增片段，以已知聚合酶链式反应引物为测序引物进行脱氧 核糖核酸序列分析。所获序列经生物信息学处理后，建立模块表达序列标签库；
9)选择不同的模体引物组合重复5)～8)过程；
10)富集获得的模块氧核糖核酸片段构建模体表达序列标签微阵列形式的 基因芯片；
11)富集所有模块的引物序列、每条模块表达序列标签的脱氧核糖核酸序 列、依模块信息转译的蛋白序列及其功能预报，以建立一个可进行全方位检索、 查询、电子拼接的数据库。
本发明的优点：
1)模块表达序列标签能给予较明确的蛋白序列生物信息，并且这种信息 是以模块形式给出，这对利用模块表达序列标签克隆新的未知基因提供强有力 的信息指导，从而加快定向克隆特异性基因的速度。这一点是现有表达序列标 签系统不能完全做到的。
2)模块表达序列标签能支持利用表达序列标签进行基因图制作，加快序 列标签位点(STS)的制作过程和新基因的染色体定位。
3)模块表达序列标签的富集可以最大限度地利用公开的表达序列标签数 据库信息，通过电子拼接技术直接获取潜在的互补脱氧核糖核酸全长，大大缩 短克隆新的全长互补脱氧核糖核酸的周期并可减少克隆的成本，加快类似于水 稻这样一种生物信息积累较薄弱的模式生物的基因克隆进度。
4)模块表达序列标签以微阵列硬件形式提供的生物芯片可以为克隆差异 基因提供“索引”，并且模体表达序列标签给予“索引”一个较为详尽的模块 功能描述，这为选择克隆与生物学表型密切相关的基因提供潜在的针对性强的 功能分析。
5)由于模块表达序列标签的建立是靠以双蛋白模体设计的简并引物两两 配对为基础，用测序胶以不同组合结合不同长度来分离每一条模块表达序列标 签，所以避免了序列表达标签制作过程中由于随机挑选互补脱氧核糖核酸文库 克隆而造成的巨大数目的重复测序，极大地降低了获取每一条模块表达序列标 签的所需费用。
6)通过模块表达序列标签还可进行新基因的遗传进化关系分析。
附图是模块表达序列标签方法原理图。
所说的简并引物长度大于或等于15个碱基。
通过对基因序列、蛋白序列及其模块结构数据进行分析，结果表明：生命 体基因组所含的基因数量虽然十分巨大，在人类中达到105个，但是基因编码 蛋白质的高度保守的构件块或称“模块”(Module)的数量是有限的，估计在103 个左右。这表明通过数量有限的蛋白编码区段的倍增、重排和整合，可以产生 大量含有多个模块的复合蛋白序列，从而构成庞大而复杂的编码序列。这种倍 增可以是成串的或分散的倍增，也可是对应于折叠蛋白功能域的结构模块的倍 增，同时，倍增方式的改变会导致基因产物特异性的变化，即识别特征的改变 或功能的变更。模块由单个或多个模体(Motif)组成，所谓的模体是蛋白质家 族中的最小序列单位，是蛋白质区段排列对比中高度相似的区域，因此，模体 的识别对蛋白质功能或结构的预测非常重要。我们利用蛋白模块这一基本的蛋 白质分类特征标志以及模式生物体中越来越多的蛋白模块编码信息的富集，建 立模块表达序列标签库。其技术方法是选择一对基于蛋白模体设计的简并引 物，以聚合酶链式反应(PCR)扩增和测序胶分离来定义每一基因特异的表达 标签，并对每一分离的特异扩增片段进行序列测定。当选择足够数目的蛋白模 体简并引物并两两组合扩增后，可以获得覆盖大部分基因群体的模块表达序列 标签(见附图)。利用模块表达序列标签技术所获得的全部或部分互补脱氧核 糖核酸片段采用微阵列(Microarray)或称生物芯片(Biochip)或基因芯片 (Genechip)形式制成模块表达序列标签基因芯片，同时富集所有模块的引物 序列、每条模块表达序列标签的脱氧核糖核酸序列、依模块信息转译的蛋白序 列及其可能的功能预报，建立一个可进行全方位检索、查询、电子拼接的数据 库。
实施例一：水稻模块表达序列标签的制作方法与步骤
1)收集水稻多种品系及多种发育阶段样本，提取信使核糖核酸；
2)逆转录合成互补脱氧核糖核酸第一链；
3)通过比较生物种类已知的蛋白模体，选择水稻偏爱的蛋白模体组成序 列为蓝本；
4)针对水稻偏爱的氨基酸三联核苷酸密码子设计含保守的蛋白模体序列 的聚合酶链式反应简并引物；
5)按蛋白模体序列信息分类聚合酶链式反应引物，并两两组合为一对聚 合酸链式反应扩增引物对；
6)以所述分离合成完成的互补脱氧核糖核酸样本为模板，进行聚合酶链 式反应扩增，并在反应体系中掺入放射性同位素进行标记；
7)以脱氧核糖核酸测序胶分离技术对聚合酶链式反应扩增产物进行分离 并放射自显影。利用放射自显影提供的聚合酶链式反应基因表达图谱从脱氧核 糖核酸测序胶中回收特异性扩增的模块脱氧核糖核酸片段，并对每一回收的脱 氧核糖核酸片段进行聚合酶链式反应重扩增和琼脂糖凝胶电泳鉴定；
8)对每一重扩增片段，以已知聚合酶链反应引物为测序引物进行脱氧核 糖核酸序列分析。所获序列经生物信息学处理后，建立模块表达序列标签库；
9)选择不同的模体引物组合重复5)～8)过程；
10)富集获得的模块氧核糖核酸片段构建模体表达序列标签微阵列形式的 水稻基因芯片；
11)富集所有模块的引物序列、每条模块表达序列标签的脱氧核糖核酸序 列、依模块信息转译的蛋白序列及其功能预报，以建立一个可进行全方位检索、 查询、电子拼接的数据库。
实施二：耐药细菌模块表达序列标签的制作方法与步骤
1)大通量收集耐药细菌样本，小规模抽提质粒脱氧核糖核酸；
2)合并不同来源的质粒脱氧核糖核酸并过柱纯化；
3)通过比较生物种类已知的蛋白模体，选择细菌偏爱的蛋白模体组成序 列为蓝本；
4)针对细菌偏爱的氨基酸三联核苷酸密码子设计含保守的蛋白模体序列 的聚合酶链式反应简并引物；
5)按蛋白模体序列信息分类聚合酶链式反应引物，并两两组合为一对聚 合酶链式反应扩增引物对；
6)以所述分离合成完成的互补脱氧核糖核酸样本为模板，进行聚合酶链 式反应扩增，并在反应体系中掺入放射性同位素进行标记；
7)以脱氧核糖核酸测序胶分离技术对聚合酶链式反应扩增产物进行分离 并放射自显影。利用放射自显影提供的聚合酶链式反应基因表达图谱从脱氧核 糖核酸测序胶中回收特异性扩增的模块脱氧核糖核酸片段，并对每一回收的脱 氧核糖核酸片段进行聚合酶链式反应重扩增和琼脂糖凝胶电泳鉴定；
8)对每一重扩增片段，以已知聚合酶链式反应引物为测序引物进行脱氧 核糖核酸序列分析。所获序列经生物信息学处理后，建立模块表达序列标签库；
9)选择不同的模体引物组合重复5)～8)过程；
10)富集获得的模块氧核糖核酸片段构建模体表达序列标签微阵列形式的 耐药细菌质粒基因芯片；
11)富集所有模块的引物序列、每条模块表达序列标签的脱氧核糖核酸序 列、依模块信息转译的蛋白序列及其功能预报，以建立一个可进行全方位检索、 查询、电子拼接的数据库。
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