序列特异性检测和表型确定
阅读：660发布：2020-05-12
专利汇可以提供序列特异性检测和表型确定专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文公开了使用序列特异性寡核苷酸实现序列特异性 生物 检测和/或表型的材料和方法。还公开了用于以序列特异性方式检测和/或表型分析 微生物 的相关 试剂 盒 、培养物和细胞。，下面是序列特异性检测和表型确定专利的具体信息内容。
1.一种用于确定抗微生物敏感性表型的机制的方法，其包括：
- 提供样品，所述样品包含至少一种对至少一种抗微生物剂不敏感的微生物；
- 使所述样品与所述抗微生物剂接触，其中所述抗微生物剂可以杀死一种或多种微生物、抑制一种或多种微生物的生长或以其它方式损害一种或多种微生物的存活；
- 使所述至少一种微生物与至少一种包含寡核苷酸分子的化合物接触，所述寡核苷酸分子靶向至少一种与对所述抗微生物剂的不敏感表型相关的特异性核酸序列；且- 基于当所述微生物与所述抗微生物剂和所述寡核苷酸分子接触时是否存在与所述微生物相关的可检测的存活指示，确定所述微生物的抗微生物敏感性表型的机制，其中可检测的存活指示的存在表明所述寡核苷酸分子靶向的特异性核酸序列与对所述抗微生物剂的抗微生物敏感性表型的机制无关，且其中可检测的存活指示的不存在表明所述寡核苷酸分子靶向的特异性核酸序列与对所述抗微生物剂的抗微生物敏感性表型的机制相关。
2.权利要求1的方法，其还包括在使得非复制型转导颗粒(NRTP)将报道核酸分子插入微生物且使得报道分子提供可检测的存活指示的条件下，使样品与包含编码报道分子的报道核酸分子的NRTP接触。
3.权利要求2的方法，其中所述报道核酸分子是编码发光分子的基因。
4.权利要求2至3中任一项的方法，其中所述NRTP由细菌细胞包装系统产生，所述细菌细胞包装系统包含：宿主细菌细胞；在所述宿主细菌细胞内的第一核酸构建体，所述第一核酸构建体包含具有非功能性包装起始位点序列的噬菌体基因组，其中所述非功能性包装起始位点序列阻止将所述噬菌体基因组包装至所述NRTP中；和在所述宿主细菌细胞内且与所述第一核酸构建体分开的第二核酸构建体，所述第二核酸构建体包含具有报道基因的所述报道核酸分子和用于促进将报道核酸分子的复制子包装至NRTP中的功能性包装起始位点序列，其中所述第二核酸构建体上的功能性第二包装起始位点序列与所述第一核酸构建体上的噬菌体基因组中的非功能性包装起始位点序列互补。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述化合物选自肽核酸(PNA)、肽-PNA、CRISPR RNA (crRNA)、反义寡核苷酸和双链RNA (dsRNA)。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中至少一种与对所述抗微生物剂的不敏感表型相关的特异性核酸序列选自blaKPC-3基因、blaNDM-1基因、blaSHV-18基因和vanC基因。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述微生物是肠杆菌科、肠球菌属或假丝酵母属。
8.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述抗微生物剂是β-内酰胺或万古霉素。
9.一种用于确定与不敏感表型相关的机制的方法，其包括：
- 提供包含对碳青霉烯不敏感的肠杆菌科的样品；
- 将所述样品与碳青霉烯接触；
- 使所述肠杆菌科与靶向与碳青霉烯抗性相关的基因的寡核苷酸分子接触；和- 基于当所述肠杆菌科与所述碳青霉烯和所述寡核苷酸分子接触时是否存在与所述肠杆菌科相关的可检测的存活指示，确定所述肠杆菌科的碳青霉烯不敏感性的机制，其中可检测的存活指示的存在表明所述寡核苷酸分子靶向的基因与碳青霉烯不敏感性的机制无关，且其中可检测的存活指示的不存在表明所述寡核苷酸分子靶向的基因与碳青霉烯不敏感性的机制相关。
10.权利要求9的方法，其还包括在使得非复制型转导颗粒(NRTP)将报道核酸分子插入肠杆菌科且使得报道分子提供可检测的存活指示的条件下，使样品与包含编码报道分子的报道核酸分子的NRTP接触。
11.权利要求10的方法，其中所述报道核酸分子是编码发光分子的基因。
12.权利要求10至11中任一项的方法，其中所述NRTP由细菌细胞包装系统产生，所述细菌细胞包装系统包含：宿主细菌细胞；在所述宿主细菌细胞内的第一核酸构建体，所述第一核酸构建体包含具有非功能性包装起始位点序列的噬菌体基因组，其中所述非功能性包装起始位点序列阻止将所述噬菌体基因组包装至所述NRTP中；和在所述宿主细菌细胞内且与所述第一核酸构建体分开的第二核酸构建体，所述第二核酸构建体包含具有报道基因的所述报道核酸分子和用于促进将报道核酸分子的复制子包装至NRTP中的功能性包装起始位点序列，其中所述第二核酸构建体上的功能性第二包装起始位点序列与所述第一核酸构建体上的噬菌体基因组中的非功能性包装起始位点序列互补。
13.权利要求9至12中任一项的方法，其中所述寡核苷酸分子选自肽核酸(PNA)、肽-PNA、CRISPR RNA (crRNA)、反义寡核苷酸和双链RNA (dsRNA)。
14.权利要求13的方法，其中所述寡核苷酸分子选自SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5。
15.一种用于在设计用于检测靶生物的测定中减少潜在交叉反应性或干扰性生物的量的方法，其包括：
- 提供包含至少一种生物的样品，所述生物在设计用于检测靶生物的测定中潜在地交叉反应或干扰；
- 使所述交叉反应性或干扰性生物与至少一种包含寡核苷酸分子的化合物接触，所述寡核苷酸分子靶向至少一种与潜在交叉反应性或干扰性生物的存活相关的特异性核酸序列，其中所述特异性核酸序列对于潜在交叉反应性或干扰性生物是独特的；和引起所述潜在交叉反应性或干扰性生物丧失存活。
16.权利要求15的方法，其还包括在使得非复制型转导颗粒(NRTP)将报道核酸分子插入靶生物且使得报道分子提供靶生物的可检测的存活指示的条件下，使样品与包含编码报道分子的报道核酸分子的NRTP接触。
17.权利要求16的方法，其中所述报道核酸分子是编码发光分子的基因。
18.权利要求15至17中任一项的方法，其中所述化合物选自肽核酸(PNA)、肽-PNA、CRISPR RNA (crRNA)、反义寡核苷酸和双链RNA (dsRNA)。
19.权利要求16至18中任一项的方法，其中所述NRTP由细菌细胞包装系统产生，所述细菌细胞包装系统包含：宿主细菌细胞；在所述宿主细菌细胞内的第一核酸构建体，所述第一核酸构建体包含具有非功能性包装起始位点序列的噬菌体基因组，其中所述非功能性包装起始位点序列阻止将所述噬菌体基因组包装至所述NRTP中；和在所述宿主细菌细胞内且与所述第一核酸构建体分开的第二核酸构建体，所述第二核酸构建体包含具有报道基因的所述报道核酸分子和用于促进将报道核酸分子的复制子包装至NRTP中的功能性包装起始位点序列，其中所述第二核酸构建体上的功能性第二包装起始位点序列与所述第一核酸构建体上的噬菌体基因组中的非功能性包装起始位点序列互补。
20.权利要求15至19中任一项的方法，其中所述靶生物是肠杆菌科的。
21.权利要求15至20中任一项的方法，其中至少一种与潜在交叉反应性或干扰性生物的存活相关的特异性核酸序列是murA基因。
序列特异性检测和表型确定
[0001] 发明背景细胞-报道系统可以表现出与非靶生物的交叉反应性和微生物干扰。例如，如果肠杆菌
科（Enterobacteriaceae）报道物用于检测粪便样品中的大肠杆菌（E. coli）；肠杆菌科的其它物种诸如肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）可产生交叉反应信号，导致假阳性结果。此外，可能存在于样品中的其它细菌科的物种，例如铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）、鲍氏不动杆菌（A. baumannii）和嗜麦芽寡养单胞菌（S. maltophilia）可导致微生物干扰，导致假阴性结果。
科（Enterobacteriaceae）报道物用于检测粪便样品中的大肠杆菌（E. coli）；肠杆菌科的其它物种诸如肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）可产生交叉反应信号，导致假阳性结果。此外，可能存在于样品中的其它细菌科的物种，例如铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）、鲍氏不动杆菌（A. baumannii）和嗜麦芽寡养单胞菌（S. maltophilia）可导致微生物干扰，导致假阴性结果。
[0002] 抗微生物敏感性试验(AST)测量微生物对抗微生物剂的反应，并且用于确定微生物是否对抗微生物剂敏感。微生物对抗微生物剂的反应可能是由于各种机制，所有这些机
制都产生相同的反应或表型。例如，在碳青霉烯抗性肠杆菌科(CRE)中，对碳青霉烯抗生素的抗性可能是由于由不同基因和基因变体(包括blaNDM-1、blaKPC、blaIMP、blaVIM、blaCMY等)编码的各种碳青霉烯酶，以及尽管缺乏碳青霉烯酶但导致碳青霉烯不敏感表型的情况(诸如
非碳青霉烯酶β-内酰胺酶超表达)，和导致碳青霉烯摄入细胞减少的突变(例如孔蛋白突
变)。
制都产生相同的反应或表型。例如，在碳青霉烯抗性肠杆菌科(CRE)中，对碳青霉烯抗生素的抗性可能是由于由不同基因和基因变体(包括blaNDM-1、blaKPC、blaIMP、blaVIM、blaCMY等)编码的各种碳青霉烯酶，以及尽管缺乏碳青霉烯酶但导致碳青霉烯不敏感表型的情况(诸如
非碳青霉烯酶β-内酰胺酶超表达)，和导致碳青霉烯摄入细胞减少的突变(例如孔蛋白突
变)。
[0003] AST不能区分赋予共同表型反应的不同抗性机制。当测试肠杆菌科对美罗培南的反应时，例如，如果发现肠杆菌科对美罗培南具有抗性，则不能从该测定中确定该抗性是由于blaNDM-1或blaKPC或其它碳青霉烯抗性机制。
[0004] 已经开发了AST的扩展以提供关于在微生物中赋予抗性表型的机制的有限信息。例如，当使用阿莫西林对肠杆菌科进行AST测试时，如果发现生物对阿莫西林具有抗性，但在克拉维酸(β-内酰胺酶抑制剂)存在的情况下对阿莫西林敏感，则该结果可以表明β-内酰胺酶与阿莫西林抗性表型相关。然而，该技术仅仅告知β-内酰胺酶的作用，而不是特异性β-内酰胺酶的身份。
[0005] 可以采用核酸扩增技术诸如聚合酶链式反应(PCR)来确定可以在生物中赋予抗性表型的特定基因的存在。然而，这些技术无法区分存活和非存活的生物，导致可能的假阳性结果，并且也不能确定检测到的基因是否表达，因此不能测量生物对抗微生物剂的表型反
应，因此通常不能确定抗微生物敏感性。
应，因此通常不能确定抗微生物敏感性。
[0006] 由于这些限制，需要一种确定在生物中赋予表型反应的基本机制的手段。赋予给定表型的具体基本机制的身份可以是用于流行病学分析和其它相关分析的重要信息。
[0007] 发明概述本文公开了用于确定抗微生物敏感性表型的机制的方法，其包括：提供样品，所述样品
包含至少一种对至少一种抗微生物剂不敏感的微生物；使所述样品与所述抗微生物剂接
触，其中所述抗微生物剂可以杀死一种或多种微生物、抑制一种或多种微生物的生长或以
其它方式损害一种或多种微生物的存活；使所述样品与至少一种包含寡核苷酸分子的化合
物接触，所述寡核苷酸分子靶向至少一种与对所述抗微生物剂的不敏感表型相关的特异性
核酸序列，任选地其中所述寡核苷酸分子抑制所述核酸序列；且基于当所述微生物与所述
抗微生物剂和所述寡核苷酸分子接触时是否存在与所述微生物相关的可检测的存活指示，
确定所述微生物的抗微生物敏感性表型的机制，其中可检测的存活指示的存在表明所述寡
核苷酸分子靶向的特异性核酸序列与对所述抗微生物剂的抗微生物敏感性表型的机制无
关，且其中可检测的存活指示的不存在表明所述寡核苷酸分子靶向的特异性核酸序列与对
所述抗微生物剂的抗微生物敏感性表型的机制相关。本文中类似地描述了其它方法、组合
物、系统、培养物、分子和试剂盒。
包含至少一种对至少一种抗微生物剂不敏感的微生物；使所述样品与所述抗微生物剂接
触，其中所述抗微生物剂可以杀死一种或多种微生物、抑制一种或多种微生物的生长或以
其它方式损害一种或多种微生物的存活；使所述样品与至少一种包含寡核苷酸分子的化合
物接触，所述寡核苷酸分子靶向至少一种与对所述抗微生物剂的不敏感表型相关的特异性
核酸序列，任选地其中所述寡核苷酸分子抑制所述核酸序列；且基于当所述微生物与所述
抗微生物剂和所述寡核苷酸分子接触时是否存在与所述微生物相关的可检测的存活指示，
确定所述微生物的抗微生物敏感性表型的机制，其中可检测的存活指示的存在表明所述寡
核苷酸分子靶向的特异性核酸序列与对所述抗微生物剂的抗微生物敏感性表型的机制无
关，且其中可检测的存活指示的不存在表明所述寡核苷酸分子靶向的特异性核酸序列与对
所述抗微生物剂的抗微生物敏感性表型的机制相关。本文中类似地描述了其它方法、组合
物、系统、培养物、分子和试剂盒。
[0008] 本文还公开了用于确定抗微生物敏感性表型的机制的方法，其包括：提供样品，所述样品包含至少一种对至少一种抗微生物剂不敏感的微生物，且其中所述样品进一步包含：抗微生物剂，其中所述抗微生物剂可以杀死一种或多种微生物、抑制一种或多种微生物的生长或以其它方式损害一种或多种微生物的存活；和至少一种包含寡核苷酸分子的化合
物，所述寡核苷酸分子靶向至少一种与对所述抗微生物剂的不敏感表型相关的特异性核酸
序列；且基于当所述微生物与所述抗微生物剂和所述寡核苷酸分子接触时是否存在与所述
微生物相关的可检测的存活指示，确定所述微生物的不敏感表型的机制，其中可检测的存
活指示的存在表明所述寡核苷酸分子靶向的特异性核酸序列与对所述抗微生物剂的不敏
感表型的机制无关，且其中可检测的存活指示的不存在表明所述寡核苷酸分子靶向的特异
性核酸序列与对所述抗微生物剂的不敏感表型的机制相关。
物，所述寡核苷酸分子靶向至少一种与对所述抗微生物剂的不敏感表型相关的特异性核酸
序列；且基于当所述微生物与所述抗微生物剂和所述寡核苷酸分子接触时是否存在与所述
微生物相关的可检测的存活指示，确定所述微生物的不敏感表型的机制，其中可检测的存
活指示的存在表明所述寡核苷酸分子靶向的特异性核酸序列与对所述抗微生物剂的不敏
感表型的机制无关，且其中可检测的存活指示的不存在表明所述寡核苷酸分子靶向的特异
性核酸序列与对所述抗微生物剂的不敏感表型的机制相关。
[0009] 在一些方面，所述化合物是PNA(肽核酸)。在一些方面，所述化合物是肽-PNA。在一些方面，所述肽有助于将所述寡核苷酸分子摄取至微生物中。在一些方面，所述PNA靶向基因的翻译起始区(TIR)。在一些方面，所述肽-PNA靶向β-内酰胺抗性基因或万古霉素抗性基因。在一些方面，所述肽-PNA靶向blaKPC-3基因、blaNDM-1基因、blaSHV-18基因、vanC基因。
[0010] 本文还公开了用于确定参与不敏感表型的机制的方法，其包括：提供包含对碳青霉烯不敏感的肠杆菌科的样品；将所述样品与碳青霉烯接触；使所述样品与靶向与碳青霉
烯抗性相关的基因的寡核苷酸分子接触；和基于当所述肠杆菌科与所述碳青霉烯和所述寡
核苷酸分子接触时是否存在与所述肠杆菌科相关的可检测的存活指示，确定所述肠杆菌科
的碳青霉烯不敏感性的机制，其中可检测的存活指示的存在表明所述寡核苷酸分子靶向的
基因与碳青霉烯不敏感性的机制无关，且其中可检测的存活指示的不存在表明所述寡核苷
酸分子靶向的基因与碳青霉烯不敏感性的机制相关。
烯抗性相关的基因的寡核苷酸分子接触；和基于当所述肠杆菌科与所述碳青霉烯和所述寡
核苷酸分子接触时是否存在与所述肠杆菌科相关的可检测的存活指示，确定所述肠杆菌科
的碳青霉烯不敏感性的机制，其中可检测的存活指示的存在表明所述寡核苷酸分子靶向的
基因与碳青霉烯不敏感性的机制无关，且其中可检测的存活指示的不存在表明所述寡核苷
酸分子靶向的基因与碳青霉烯不敏感性的机制相关。
[0011] 本文还公开了用于确定目标生物的存在的方法，其包括：提供潜在地包含至少一种目标生物的样品；使所述样品与至少一种包含寡核苷酸分子的化合物接触，所述寡核苷
酸分子靶向至少一种与所述生物的存活相关的特异性核酸序列，其中所述特异性核酸序列
对于所述生物是独特的；且基于当所述生物与所述寡核苷酸分子接触时是否存在与所述生
物相关的可检测的存活指示，确定所述生物的存在，其中可检测的存活指示的存在表明所
述目标生物不存在于所述样品中，且其中可检测的存活指示的不存在表明所述目标生物可
存在于所述样品中。
酸分子靶向至少一种与所述生物的存活相关的特异性核酸序列，其中所述特异性核酸序列
对于所述生物是独特的；且基于当所述生物与所述寡核苷酸分子接触时是否存在与所述生
物相关的可检测的存活指示，确定所述生物的存在，其中可检测的存活指示的存在表明所
述目标生物不存在于所述样品中，且其中可检测的存活指示的不存在表明所述目标生物可
存在于所述样品中。
[0012] 本文还公开了用于确定目标生物的存在的方法，其包括：提供潜在地包含至少一种目标生物的样品和至少一种包含寡核苷酸分子的化合物，所述寡核苷酸分子靶向至少一
种与所述生物的存活相关的特异性核酸序列，其中所述特异性核酸序列对于所述生物是独
特的；且基于当所述生物与所述寡核苷酸分子接触时是否存在与所述生物相关的可检测的
存活指示，确定所述生物的存在，其中可检测的存活指示的存在表明所述目标生物不存在
于所述样品中，且其中可检测的存活指示的不存在表明所述目标生物可存在于所述样品
中。
种与所述生物的存活相关的特异性核酸序列，其中所述特异性核酸序列对于所述生物是独
特的；且基于当所述生物与所述寡核苷酸分子接触时是否存在与所述生物相关的可检测的
存活指示，确定所述生物的存在，其中可检测的存活指示的存在表明所述目标生物不存在
于所述样品中，且其中可检测的存活指示的不存在表明所述目标生物可存在于所述样品
中。
[0013] 本文还公开了用于确定目标生物的存在的方法，其包括：提供潜在地包含至少一种目标生物的样品；使所述样品的第一部分与至少一种包含寡核苷酸分子的化合物接触，
所述寡核苷酸分子靶向至少一种与所述生物的存活相关的特异性核酸序列，其中所述特异
性核酸序列对于所述生物是独特的；基于当所述生物与所述寡核苷酸分子接触时是否存在
与所述生物相关的可检测的存活指示，确定所述样品的第一部分中所述生物的存在，其中
可检测的存活指示的存在表明所述目标生物不存在于所述样品中，且其中可检测的存活指
示的不存在表明所述目标生物可存在于所述样品中；且基于是否存在与所述生物相关的可
检测的存活指示，确定不含所述寡核苷酸分子的样品的第二部分中的生物的存在，其中可
检测的存活指示的存在表明所述目标生物可存在于所述样品中，且其中可检测的存活指示
的不存在表明所述目标生物不存在于所述样品中。
所述寡核苷酸分子靶向至少一种与所述生物的存活相关的特异性核酸序列，其中所述特异
性核酸序列对于所述生物是独特的；基于当所述生物与所述寡核苷酸分子接触时是否存在
与所述生物相关的可检测的存活指示，确定所述样品的第一部分中所述生物的存在，其中
可检测的存活指示的存在表明所述目标生物不存在于所述样品中，且其中可检测的存活指
示的不存在表明所述目标生物可存在于所述样品中；且基于是否存在与所述生物相关的可
检测的存活指示，确定不含所述寡核苷酸分子的样品的第二部分中的生物的存在，其中可
检测的存活指示的存在表明所述目标生物可存在于所述样品中，且其中可检测的存活指示
的不存在表明所述目标生物不存在于所述样品中。
[0014] 本文还公开了用于在设计用于检测靶生物的测定中减少潜在交叉反应性或干扰性生物的量的方法，其包括：获得潜在地包含至少一种生物的样品，所述生物在设计用于检测靶生物的测定中潜在地交叉反应或干扰；使所述交叉反应性或干扰性生物与至少一种包
含寡核苷酸分子的化合物接触，所述寡核苷酸分子靶向至少一种与潜在交叉反应性或干扰
性生物的存活相关的特异性核酸序列，其中所述特异性核酸序列对于所述生物是独特的；
且使所述生物丧失存活。在一些方面，至少一种与潜在交叉反应性或干扰性生物的存活相
关的特异性核酸序列是murA基因。
含寡核苷酸分子的化合物接触，所述寡核苷酸分子靶向至少一种与潜在交叉反应性或干扰
性生物的存活相关的特异性核酸序列，其中所述特异性核酸序列对于所述生物是独特的；
且使所述生物丧失存活。在一些方面，至少一种与潜在交叉反应性或干扰性生物的存活相
关的特异性核酸序列是murA基因。
[0015] 本文公开的所有方法的具体方面如下：在一些方面，所述化合物是PNA(肽核酸)。在一些方面，所述化合物是肽-PNA。在一些方
面，所述肽有助于将所述寡核苷酸分子摄取至微生物中。在一些方面，所述PNA靶向基因的翻译起始区(TIR)。在一些方面，所述肽-PNA靶向β-内酰胺抗性基因或万古霉素抗性基因。
在一些方面，所述肽-PNA靶向blaKPC-3基因、blaNDM-1基因、blaSHV-18基因、vanC基因。
面，所述肽有助于将所述寡核苷酸分子摄取至微生物中。在一些方面，所述PNA靶向基因的翻译起始区(TIR)。在一些方面，所述肽-PNA靶向β-内酰胺抗性基因或万古霉素抗性基因。
在一些方面，所述肽-PNA靶向blaKPC-3基因、blaNDM-1基因、blaSHV-18基因、vanC基因。
[0016] 在一些方面，使所述样品与至少一种包含寡核苷酸分子的化合物接触包括向所述微生物中引入包含所述寡核苷酸分子的载体。
[0017] 在一些方面，所述寡核苷酸分子是CRISPR RNA (crRNA)。在一些方面，所述crRNA由微生物内的CRISPR/Cas系统表达。在一些方面，所述crRNA靶向blaNDM-1基因或blaSHV-18基因或转录物。
[0018] 在一些方面，所述寡核苷酸分子是反义寡核苷酸。
[0019] 在一些方面，所述化合物是包含有义链和反义链的双链RNA (dsRNA)，其中所述反义链包含反义分子。在一些方面，所述dsRNA的每条链长度为8至49个核苷酸(例如，长度为
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸)，且任选地其中每条链包含3’ T或TT。在一些方面，所述链中的至少一条包含至少一个化学修饰的核苷酸。在一些方面，所述化学修饰的核苷酸是2’-修饰的核苷酸。在一些方面，所述
2’-修饰的核苷酸是2’-甲基取代的核苷酸或2’-氨基取代的核苷酸。
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸)，且任选地其中每条链包含3’ T或TT。在一些方面，所述链中的至少一条包含至少一个化学修饰的核苷酸。在一些方面，所述化学修饰的核苷酸是2’-修饰的核苷酸。在一些方面，所述
2’-修饰的核苷酸是2’-甲基取代的核苷酸或2’-氨基取代的核苷酸。
[0020] 在一些方面，所述特异性核酸序列是DNA序列或mRNA序列。
[0021] 在一些方面，可检测的存活指示的存在表明所述微生物是存活的。在一些方面，可检测的存活指示的不存在表明所述微生物不是存活的。
[0022] 在一些方面，本文公开的方法还包括使所述样品与包含寡核苷酸分子的第二化合物接触，所述寡核苷酸分子靶向与微生物中对抗微生物剂的抗微生物不敏感性相关的第二
特异性核酸序列。
特异性核酸序列。
[0023] 在一些方面，所述微生物是原核生物或真核生物。
[0024] 在一些方面，可检测的存活指示是微生物的生长、与微生物相关的标记物或与微生物相关的可检测信号。
[0025] 在一些方面，本文公开的方法还包括在使得报道分子进入微生物且提供可检测的存活指示的条件下，使样品与编码报道分子的报道核酸分子接触。在一些方面，所述报道系统是基于脂质体的报道系统、基于噬菌体的报道系统或基于非复制型转导颗粒的报道系
统。
统。
[0026] 在一些方面，所述至少一种微生物包含编码报道分子的报道核酸分子。
[0027] 在一些方面，本文公开的方法还包括在使得非复制型转导颗粒(NRTP)将报道核酸分子插入微生物且使得报道分子提供可检测的存活指示的条件下，使样品与包含编码报道
分子的报道核酸分子的NRTP接触。
分子的报道核酸分子的NRTP接触。
[0028] 在一些方面，所述NRTP由细菌细胞包装系统产生，所述细菌细胞包装系统包含：宿主细菌细胞；在所述宿主细菌细胞内的第一核酸构建体，所述第一核酸构建体包含具有非功能性包装起始位点序列的噬菌体基因组，其中所述非功能性包装起始位点序列阻止将所
述噬菌体基因组包装至所述NRTP中；和在所述宿主细菌细胞内且与所述第一核酸构建体分
开的第二核酸构建体，所述第二核酸构建体包含具有报道基因的所述报道核酸分子和用于
促进将报道核酸分子的复制子包装至NRTP中的功能性包装起始位点序列，其中所述第二核
酸构建体上的功能性第二包装起始位点序列与所述第一核酸构建体上的噬菌体基因组中
的非功能性包装起始位点序列互补。
述噬菌体基因组包装至所述NRTP中；和在所述宿主细菌细胞内且与所述第一核酸构建体分
开的第二核酸构建体，所述第二核酸构建体包含具有报道基因的所述报道核酸分子和用于
促进将报道核酸分子的复制子包装至NRTP中的功能性包装起始位点序列，其中所述第二核
酸构建体上的功能性第二包装起始位点序列与所述第一核酸构建体上的噬菌体基因组中
的非功能性包装起始位点序列互补。
[0029] 在一些方面，所述报道核酸分子是编码发光分子的基因。在一些方面，所述基因是荧光素酶基因。
[0030] 在一些方面，检测可检测的存活指示包括检测是否存在报道分子。在一些方面，检测可检测的存活指示包括检测是否存在由报道分子介导的反应。在其它方面，检测可检测的存活指示包括检测报道分子的构象、活性或其它特征(例如，荧光或结合另一分子或以其它方式与另一分子相互作用的能力)。
[0032] 在一些方面，所述微生物是埃希氏杆菌属(Escherichia)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、李斯特菌属(Listeria)、梭状芽孢杆菌(Clostridium)、链球菌属(Streptococcus)、幽门螺杆菌属(Helicobacter)、立克次体属
(Rickettsia)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、致病杆菌属(Xenorhabdus)、不动杆菌属
(Acinetobacter)、博德特氏菌属(Bordetella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、气单胞菌属
(Aeromonas)、放线杆菌属(Actinobacillus)、巴氏杆菌属(Pasteurella)、弧菌属
(Vibrio)、军团杆菌属(Legionella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、眉藻属(Calothrix)、产甲烷球菌属(Methanococcus)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas)、衣原体属(Chlamydia)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、弯曲杆菌属
(Campylobacter)或耶尔森氏菌属(Yersinia)。
(Rickettsia)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、致病杆菌属(Xenorhabdus)、不动杆菌属
(Acinetobacter)、博德特氏菌属(Bordetella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、气单胞菌属
(Aeromonas)、放线杆菌属(Actinobacillus)、巴氏杆菌属(Pasteurella)、弧菌属
(Vibrio)、军团杆菌属(Legionella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、眉藻属(Calothrix)、产甲烷球菌属(Methanococcus)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas)、衣原体属(Chlamydia)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、弯曲杆菌属
(Campylobacter)或耶尔森氏菌属(Yersinia)。
[0033] 在一些方面，所述抗微生物剂是β-内酰胺或万古霉素。
[0035] 在一些方面，所述抗微生物剂是氨苄青霉素、氨苄青霉素-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、奥西西林、青霉素、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢洛林、厄他培南、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、庆大霉素、庆大霉素协同剂、链霉素协同剂、妥布霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、克林霉素、粘菌素、达托霉素、多西环素、红霉素、利奈唑胺、呋喃妥因、奎奴普丁-达福普汀、利福平、替加环素、甲氧苄啶-磺胺甲恶唑、磷霉素、头孢西丁、四环素、莫西沙星或特地唑胺。
[0036] 在某些方面，所述微生物是肠杆菌科，且所述抗微生物剂是碳青霉烯。
[0037] 在一些方面，检测可检测的存活指示包括观察微生物的生长，任选地其中使用细胞培养物观察生长。
[0038] 在一些方面，所述化合物还包含脂质体。
[0039] 在一些方面，在使所述样品与所述化合物接触之前，使所述样品与所述抗微生物剂接触。在一些方面，在使所述样品与所述抗微生物剂接触之前，使所述样品与所述化合物接触，或者其中使所述样品与所述化合物和所述试剂同时接触。
[0040] 在一些方面，所述样品、化合物和报道核酸以任何依次顺序或同时彼此接触。
[0041] 本文还公开了用于确定对抗微生物剂不敏感的微生物的不敏感表型的机制的试剂盒，其包含：抗微生物剂，其中所述抗微生物剂可以杀死一种或多种微生物、抑制一种或多种微生物的生长或以其它方式损害一种或多种微生物的存活；包含寡核苷酸分子的化合
物，所述寡核苷酸分子靶向与对所述抗微生物剂的不敏感表型相关的特异性核酸序列；和
说明书，其用于使用所述抗微生物剂和所述寡核苷酸分子来基于当所述微生物与所述抗微
生物剂和所述寡核苷酸分子接触时是否存在与所述微生物相关的可检测的存活指示来确
定所述微生物的不敏感表型的机制，其中可检测的存活指示的存在表明所述寡核苷酸分子
靶向的特异性核酸序列与对所述抗微生物剂的不敏感表型的机制无关，且其中可检测的存
活指示的不存在表明所述寡核苷酸分子靶向的特异性核酸序列与对所述抗微生物剂的不
敏感表型的机制相关。
物，所述寡核苷酸分子靶向与对所述抗微生物剂的不敏感表型相关的特异性核酸序列；和
说明书，其用于使用所述抗微生物剂和所述寡核苷酸分子来基于当所述微生物与所述抗微
生物剂和所述寡核苷酸分子接触时是否存在与所述微生物相关的可检测的存活指示来确
定所述微生物的不敏感表型的机制，其中可检测的存活指示的存在表明所述寡核苷酸分子
靶向的特异性核酸序列与对所述抗微生物剂的不敏感表型的机制无关，且其中可检测的存
活指示的不存在表明所述寡核苷酸分子靶向的特异性核酸序列与对所述抗微生物剂的不
敏感表型的机制相关。
[0042] 本文还公开了用于确定目标生物的存在的试剂盒，其包含：包含寡核苷酸分子的化合物，所述寡核苷酸分子靶向与所述生物的存活相关的特异性核酸序列，其中所述特异
性核酸序列对于所述生物是独特的；和用于使用所述寡核苷酸分子来基于当所述生物与所
述寡核苷酸分子接触时是否存在与所述生物相关的可检测的存活指示来确定所述生物的
存在的说明书，其中可检测的存活指示的存在表明所述目标生物不存在于所述样品中，且
其中可检测的存活指示的不存在表明所述目标生物可存在于所述样品中。
性核酸序列对于所述生物是独特的；和用于使用所述寡核苷酸分子来基于当所述生物与所
述寡核苷酸分子接触时是否存在与所述生物相关的可检测的存活指示来确定所述生物的
存在的说明书，其中可检测的存活指示的存在表明所述目标生物不存在于所述样品中，且
其中可检测的存活指示的不存在表明所述目标生物可存在于所述样品中。
[0043] 本文还公开了对至少一种抗微生物剂不敏感的分离的微生物，其包含：抗微生物剂，其中所述抗微生物剂可以杀死一种或多种微生物、抑制一种或多种微生物的生长或以
其它方式损害一种或多种微生物的存活；至少一种包含寡核苷酸分子的化合物，所述寡核
苷酸分子靶向至少一种与对所述抗微生物剂的不敏感表型相关的特异性核酸序列；和报道
物，任选地其中所述报道物是标记物、可检测信号、编码报道分子的报道核酸分子或包含编码报道分子的报道核酸分子的非复制性转导微粒(NRTP)。
其它方式损害一种或多种微生物的存活；至少一种包含寡核苷酸分子的化合物，所述寡核
苷酸分子靶向至少一种与对所述抗微生物剂的不敏感表型相关的特异性核酸序列；和报道
物，任选地其中所述报道物是标记物、可检测信号、编码报道分子的报道核酸分子或包含编码报道分子的报道核酸分子的非复制性转导微粒(NRTP)。
[0044] 本文还公开了生产本文公开的微生物的方法，其包括：使所述微生物与抗微生物剂接触；使所述微生物与包含寡核苷酸分子的化合物接触；和使所述微生物与报道物接触。
[0045] 本文还公开了体外细胞培养物，其包含对至少一种抗微生物剂不敏感的分离的微生物，且还包含：抗微生物剂，其中所述抗微生物剂可以杀死一种或多种微生物、抑制一种或多种微生物的生长或以其它方式损害一种或多种微生物的存活；至少一种包含寡核苷酸
分子的化合物，所述寡核苷酸分子靶向至少一种与对所述抗微生物剂的不敏感表型相关的
特异性核酸序列；和报道物，任选地其中所述报道物是标记物、可检测信号、编码报道分子的报道核酸分子或包含编码报道分子的报道核酸分子的非复制性转导微粒(NRTP)。
分子的化合物，所述寡核苷酸分子靶向至少一种与对所述抗微生物剂的不敏感表型相关的
特异性核酸序列；和报道物，任选地其中所述报道物是标记物、可检测信号、编码报道分子的报道核酸分子或包含编码报道分子的报道核酸分子的非复制性转导微粒(NRTP)。
[0046] 本文还公开了产生细胞培养物的方法，其包括：使所述培养物与抗微生物剂接触；使所述培养物与包含寡核苷酸分子的化合物接触；和使所述培养物与报道物接触。
[0047] 本文还公开了分离的生物，其包含：至少一种包含寡核苷酸分子的化合物，所述寡核苷酸分子靶向至少一种与所述生物的存活相关的特异性核酸序列，其中所述特异性核酸序列对于所述生物是独特的；和报道物，任选地其中所述报道物是标记物、可检测信号、编码报道分子的报道核酸分子或包含编码报道分子的报道核酸分子的非复制性转导微粒
(NRTP)。
(NRTP)。
[0048] 本文还公开了产生分离的生物的方法，其包括：使所述生物与包含寡核苷酸分子的化合物接触；和使所述生物与报道物接触。
[0049] 本文还公开了体外细胞培养物，其包含生物，并且还包含：至少一种包含寡核苷酸分子的化合物，所述寡核苷酸分子靶向至少一种与所述生物的存活相关的特异性核酸序列，其中所述特异性核酸序列对于所述生物是独特的；和报道物，任选地其中所述报道物是标记物、可检测信号、编码报道分子的报道核酸分子或包含编码报道分子的报道核酸分子
的非复制性转导微粒(NRTP)。
的非复制性转导微粒(NRTP)。
[0050] 本文还公开了产生体外细胞培养物的方法，其包括：使所述培养物与包含寡核苷酸分子的化合物接触；和使所述培养物与报道物接触。
[0051] 本文公开的所有试剂盒和所有分离的微生物的具体方面如下：在一些方面，所述化合物是PNA(肽核酸)。在一些方面，所述化合物是肽-PNA。在一些方
面，所述肽有助于将所述寡核苷酸分子摄取至微生物中。在一些方面，所述PNA靶向基因的翻译起始区(TIR)。在一些方面，所述肽-PNA靶向β-内酰胺抗性基因或万古霉素抗性基因。
在一些方面，所述肽-PNA靶向blaKPC-3基因、blaNDM-1基因、blaSHV-18基因、vanC基因。
面，所述肽有助于将所述寡核苷酸分子摄取至微生物中。在一些方面，所述PNA靶向基因的翻译起始区(TIR)。在一些方面，所述肽-PNA靶向β-内酰胺抗性基因或万古霉素抗性基因。
在一些方面，所述肽-PNA靶向blaKPC-3基因、blaNDM-1基因、blaSHV-18基因、vanC基因。
[0052] 在一些方面，所述寡核苷酸分子是CRISPR RNA (crRNA)。在一些方面，所述crRNA由微生物内的CRISPR/Cas系统表达。在一些方面，所述crRNA靶向blaNDM-1基因或blaSHV-18基因或转录物。
[0053] 在一些方面，所述寡核苷酸分子是反义寡核苷酸。
[0054] 在一些方面，所述化合物是包含有义链和反义链的双链RNA (dsRNA)，其中所述反义链包含反义分子。在一些方面，所述dsRNA的每条链长度为8至49个核苷酸(例如，长度为
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸)，且任选地其中每条链包含3’ T或TT。在一些方面，所述链中的至少一条包含至少一个化学修饰的核苷酸。在一些方面，所述化学修饰的核苷酸是2’-修饰的核苷酸。在一些方面，所述
2’-修饰的核苷酸是2’-甲基取代的核苷酸或2’-氨基取代的核苷酸。
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸)，且任选地其中每条链包含3’ T或TT。在一些方面，所述链中的至少一条包含至少一个化学修饰的核苷酸。在一些方面，所述化学修饰的核苷酸是2’-修饰的核苷酸。在一些方面，所述
2’-修饰的核苷酸是2’-甲基取代的核苷酸或2’-氨基取代的核苷酸。
[0055] 在一些方面，所述特异性核酸序列是DNA序列或mRNA序列。
[0056] 在一些方面，可检测的存活指示的存在表明所述微生物是存活的。在一些方面，可检测的存活指示的不存在表明所述微生物不是存活的。
[0057] 在一些方面，所述微生物是原核生物或真核生物。
[0058] 在一些方面，可检测的存活指示是微生物的生长、与微生物相关的标记物或与微生物相关的可检测信号。
[0059] 在一些方面，所述至少一种微生物包含编码报道分子的报道核酸分子。
[0060] 在一些方面，所述试剂盒还包含非复制型转导颗粒(NRTP)，所述非复制型转导颗粒(NRTP)包含编码报道分子的报道核酸分子。
[0061] 在一些方面，所述NRTP由细菌细胞包装系统产生，所述细菌细胞包装系统包含：宿主细菌细胞；在所述宿主细菌细胞内的第一核酸构建体，所述第一核酸构建体包含具有非功能性包装起始位点序列的噬菌体基因组，其中所述非功能性包装起始位点序列阻止将所
述噬菌体基因组包装至所述NRTP中；和在所述宿主细菌细胞内且与所述第一核酸构建体分
开的第二核酸构建体，所述第二核酸构建体包含具有报道基因的所述报道核酸分子和用于
促进将报道核酸分子的复制子包装至NRTP中的功能性包装起始位点序列，其中所述第二核
酸构建体上的功能性第二包装起始位点序列与所述第一核酸构建体上的噬菌体基因组中
的非功能性包装起始位点序列互补。
述噬菌体基因组包装至所述NRTP中；和在所述宿主细菌细胞内且与所述第一核酸构建体分
开的第二核酸构建体，所述第二核酸构建体包含具有报道基因的所述报道核酸分子和用于
促进将报道核酸分子的复制子包装至NRTP中的功能性包装起始位点序列，其中所述第二核
酸构建体上的功能性第二包装起始位点序列与所述第一核酸构建体上的噬菌体基因组中
的非功能性包装起始位点序列互补。
[0062] 在一些方面，所述报道核酸分子是编码发光分子的基因。在一些方面，所述基因是荧光素酶基因。
[0063] 在一些方面，检测可检测的存活指示包括检测是否存在报道分子。在一些方面，检测可检测的存活指示包括检测是否存在由报道分子介导的反应。在其它方面，检测可检测的存活指示包括检测报道分子的构象、活性或其它特征(例如，荧光或结合另一分子或以其它方式与另一分子相互作用的能力)。
[0064] 在一些方面，所述微生物是肠杆菌科、肠球菌属或假丝酵母属。
[0065] 在一些方面，所述微生物是埃希氏杆菌属(Escherichia)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、李斯特菌属(Listeria)、梭状芽孢杆菌(Clostridium)、链球菌属(Streptococcus)、幽门螺杆菌属(Helicobacter)、立克次体属
(Rickettsia)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、致病杆菌属(Xenorhabdus)、不动杆菌属
(Acinetobacter)、博德特氏菌属(Bordetella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、气单胞菌属
(Aeromonas)、放线杆菌属(Actinobacillus)、巴氏杆菌属(Pasteurella)、弧菌属
(Vibrio)、军团杆菌属(Legionella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、眉藻属(Calothrix)、产甲烷球菌属(Methanococcus)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas)、衣原体属(Chlamydia)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、弯曲杆菌属
(Campylobacter)或耶尔森氏菌属(Yersinia)。
(Rickettsia)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、致病杆菌属(Xenorhabdus)、不动杆菌属
(Acinetobacter)、博德特氏菌属(Bordetella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、气单胞菌属
(Aeromonas)、放线杆菌属(Actinobacillus)、巴氏杆菌属(Pasteurella)、弧菌属
(Vibrio)、军团杆菌属(Legionella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、眉藻属(Calothrix)、产甲烷球菌属(Methanococcus)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas)、衣原体属(Chlamydia)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、弯曲杆菌属
(Campylobacter)或耶尔森氏菌属(Yersinia)。
[0066] 在一些方面，所述抗微生物剂是β-内酰胺或万古霉素。
[0067] 在一些方面，所述抗微生物剂属于以下组群或类别：青霉素类、头孢菌素、碳青霉烯、氨基糖苷类、氟喹诺酮、林可酰胺、多粘菌素、四环素、大环内酯、噁唑烷酮、链阳菌素类、利福霉素或糖肽。
[0068] 在一些方面，所述抗微生物剂是氨苄青霉素、氨苄青霉素-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、奥西西林、青霉素、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢洛林、厄他培南、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、庆大霉素、庆大霉素协同剂、链霉素协同剂、妥布霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、克林霉素、粘菌素、达托霉素、多西环素、红霉素、利奈唑胺、呋喃妥因、奎奴普丁-达福普汀、利福平、替加环素、甲氧苄啶-磺胺甲恶唑、磷霉素、头孢西丁、四环素、莫西沙星或特地唑胺。
[0069] 在某些方面，所述微生物是肠杆菌科，且所述抗微生物剂是碳青霉烯。
[0070] 在一些方面，检测可检测的存活指示包括观察微生物的生长，任选地其中使用细胞培养物观察生长。
[0071] 在一些方面，所述化合物还包含脂质体。
[0072] 本文还公开了用于抑制与肠杆菌科中的碳青霉烯不敏感性相关的基因的表达的肽核酸(PNA)分子，所述PNA分子包含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3的核苷酸序列。
[0073] 本文还公开了用于抑制与肠球菌属中的万古霉素不敏感性相关的基因的表达的PNA分子，所述PNA分子包含SEQ ID NO: 6的核苷酸序列。
[0074] 本文还公开了用于抑制假丝酵母中的内部转录间隔区的表达的反义分子，所述反义分子包含SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 9的核苷酸序列。
[0076] 图2显示大肠杆菌特异性肽-PNA对肺炎克雷伯菌的生长的影响。
[0078] 图4描述大肠杆菌1289011、1289012、1289014和1289018的典型的美罗培南/肽-PNA盘扩散结果的实例。
[0079] 图5描述肽PNA细胞报道物AST测定的结果的实例，其中+表明报道物测定产生阳性结果，并且-表明报道物测定产生阴性结果。
[0080] 图6描述CRISPR Cas9细胞报道物AST测定的结果的实例，其中+表明报道物测定产生阳性结果，并且-表明报道物测定产生阴性结果。
[0081] 图7描述VRE细胞-报道物测定的结果的实例，其中+表明报道物测定产生阳性结果，并且-表明报道物测定产生阴性结果。
[0082] 图8包括可以用于产生靶向每种物种的2’-OMe修饰的反义寡核苷酸(AON)的ITS2序列的列表。
[0083] 图9描述用于假丝酵母属鉴定的AON的组合的测定设置。
[0085] 如本文中所使用，“报道核酸分子”是指包含DNA或RNA分子的核苷酸序列。报道核酸分子可以是天然存在的或者人工或合成分子。在一些实施方案中，报道核酸分子对于宿主细胞是外源的，并且可以作为外源核酸分子诸如质粒或载体的部分引入宿主细胞内。在
其它实施方案中，报道核酸分子包含编码报道分子(例如报道酶、蛋白)的报道基因。在一些实施方案中，报道核酸分子被称为“报道构建体”或“核酸报道构建体”。
其它实施方案中，报道核酸分子包含编码报道分子(例如报道酶、蛋白)的报道基因。在一些实施方案中，报道核酸分子被称为“报道构建体”或“核酸报道构建体”。
[0086] “报道分子”或“报道物”是指对生物赋予可检测或可选择表型的分子(例如核酸衍生的或氨基酸衍生的)。可检测表型可以是例如比色的、荧光的或发光的。报道分子可以由如下表达：编码介导发光反应的酶(luxA、luxB、luxAB、luc、ruc、nluc)的报道基因、编码介导比色反应的酶(lacZ、HRP)的基因、编码荧光蛋白(GFP、eGFP、YFP、RFP、CFP、BFP、mCherry、近红外荧光蛋白)的基因、编码亲和肽(His-标签、3X-FLAG)的核酸分子、以及编码可检测标记物(ampC、tet(M)、CAT、erm)的基因。报道分子可以用作将核酸分子或外源序列(质粒)成功摄入细胞内的标记物。报道分子还可以用于指示靶基因、靶核酸分子、靶细胞内分子或细胞的存在。所述报道分子也可以用于指示细胞的存活。可选地，报道分子可以是核酸，诸如适体或核酶。
[0087] 在一些方面，报道核酸分子与启动子可操作地连接。在其它方面，启动子可以被选择或设计为基于启动子在特定细胞(例如特定物种)而不是其它细胞中的活性，促成报道系统的反应性和交叉反应性。在某些方面，报道核酸分子包含复制起点。在其它方面，当基于复制起点在特定细胞(例如特定物种)而不是其它细胞中的活性，报道核酸分子在靶细胞内
的复制促成报道信号产生或是报道信号产生所需的时，复制起点的选择可以类似地促成报
道系统的反应性和交叉反应性。在一些实施方案中，报道核酸分子形成能够在病毒复制期
间(例如，作为多联DNA)包装到子代病毒内的复制子。在其它方面，所述报道核酸分子包括影响报道基因的转录或翻译的因子(例如，特异性核糖体结合位点、密码子使用)，其可以类似地有助于报道系统的反应性和交叉反应性。
的复制促成报道信号产生或是报道信号产生所需的时，复制起点的选择可以类似地促成报
道系统的反应性和交叉反应性。在一些实施方案中，报道核酸分子形成能够在病毒复制期
间(例如，作为多联DNA)包装到子代病毒内的复制子。在其它方面，所述报道核酸分子包括影响报道基因的转录或翻译的因子(例如，特异性核糖体结合位点、密码子使用)，其可以类似地有助于报道系统的反应性和交叉反应性。
[0088] 如本文中所使用，术语“转录物”是指由DNA或RNA模板序列或基因转录的核苷酸序列(DNA或RNA)的长度。转录物可以是由RNA模板转录的cDNA序列或由DNA模板转录的mRNA序列。转录物可以是蛋白编码或非编码的。转录物还可以由经工程改造的核酸构建体进行转
录。
录。
[0089] 如本文中所使用，“靶转录物”是指DNA序列或mRNA的核苷酸序列的一部分，所述DNA序列或mRNA由靶细胞天然形成，包括在靶基因的转录期间形成的那种和其为初级转录
产物的RNA加工产物的mRNA。靶转录物还可以被称为细胞转录物或天然存在的转录物。
产物的RNA加工产物的mRNA。靶转录物还可以被称为细胞转录物或天然存在的转录物。
[0090] 当指核酸分子或外源序列(例如质粒、载体、构建体)时，“引入细胞内”意指促进摄取或吸收到细胞内，如本领域技术人员所理解。核酸构建体或转录物的吸收或摄取可以通过无辅助扩散或活性细胞过程，或者通过辅助试剂或装置包括经由细菌噬菌体、病毒、转导颗粒、脂质体、聚合物、病毒样颗粒和弹射手段的使用来发生。该术语的含义并不限于体外细胞；核酸分子还可以被“引入细胞内”，其中细胞是活生物的部分。在这样的情况下，引入细胞内将包括对生物的递送。例如，对于体内递送，核酸分子、构建体或载体可以注射到组织部位内或全身施用。体外引入细胞内包括本领域已知的方法，诸如转化、电穿孔、转导和脂转染。进一步的方法在本文中描述或是本领域已知的。
[0091] “抗微生物敏感性表型的机制”是指与赋予生物对抗微生物剂的抗性或敏感性的一种或多种机制(例如，一种或多种基因、mRNA和/或蛋白)。
[0092] 如本文中所使用，术语“分子”是指任何化合物，包括但不限于小分子、肽、蛋白、糖、核苷酸、核酸、脂质等，并且这种化合物可以是天然的或合成的。
[0093] “寡核苷酸分子”是指包括结合特异性靶核酸序列的核酸的分子。寡核苷酸分子包括单链分子、双链分子、反义分子、双链RNA、PNA、CRISPR RNA、DNAi等。通常，寡核苷酸分子特异性结合靶核酸序列(例如，DNA或RNA)。寡核苷酸分子与特异性核酸序列的结合通常将导致核酸序列的抑制，例如经由降低核酸序列的表达。寡核苷酸分子与特异性核酸序列的
结合可导致核酸序列的阻断或破坏。
结合可导致核酸序列的阻断或破坏。
[0094] “反义分子”是指通过特异性结合DNA或RNA来抑制基因表达而表现出反义活性的分子。反义分子通常包括与其靶DNA或RNA具有互补序列的核酸低聚物。反义分子的实例包
括反义寡核苷酸(DNA或RNA)、肽核酸(PNA)和吗啉代磷酰二胺(PMO)寡聚体。
括反义寡核苷酸(DNA或RNA)、肽核酸(PNA)和吗啉代磷酰二胺(PMO)寡聚体。
[0095] “抗微生物剂”是指可以杀死一种或多种微生物、抑制一种或多种微生物的生长、或以其它方式损坏一种或多种微生物的存存活的化合物。抗微生物剂包括抗生素、抗真菌剂、抗原生动物剂、抗病毒剂和其它化合物。
[0096] “可检测的存活指示”是指与细胞相关的指示剂，其可以被观察到且证实细胞是更多还是更少存活或者它的存活例如相对于对照细胞是否受影响，其中对照细胞可以是在不同时间点时的相同细胞或分开的细胞。例子包括一种或多种信号、一种或多种报道物、一种或多种标记物、其生长或缺乏、光(例如由萤光素酶发出的光)或其缺乏等。
[0097] 基于病毒的报道物或基于噬菌体的报道物可以分别指这样的病毒或噬菌体，其经修饰，使得报道基因已插入其基因组中。
[0098] “转导颗粒”是指能够将非病毒核酸分子递送到细胞内的病毒。病毒可以是细菌噬菌体、腺病毒等。转导颗粒报道物可以与病毒或基于噬菌体的报道物同义。
[0099] “非复制型转导颗粒”(NRTP)是指能够将非病毒核酸分子递送到细胞内的病毒，但不将其自身复制病毒基因组包装成转导颗粒。病毒可以是细菌噬菌体、腺病毒等。NRTP及其制备方法详细描述于2014年3月13日提交的PCT/US2014/026536中。
[0100] “质粒”是小DNA分子，其与细胞内的染色体DNA物理分开且可以不依赖于染色体DNA而复制。最通常作为小环状双链DNA分子在细菌中发现，质粒有时存在于古细菌和真核
生物中。质粒被视为复制子，能够在合适宿主内自主复制。
生物中。质粒被视为复制子，能够在合适宿主内自主复制。
[0101] “载体”是包括可以用作媒介物以将遗传材料携带到细胞内的核酸的分子，它可在其中整合、复制和/或表达。
[0102] “病毒”是仅在其它生物的活细胞内复制的小传染剂。病毒颗粒(称为病毒粒子)包括两个或三个部分：i)由携带遗传信息的DNA或RNA分子制成的遗传材料；ii)保护该核酸的蛋白外壳；以及在一些情况下，iii)围绕蛋白外壳的脂质包膜。当涉及感染细菌的病毒时，术语“病毒”、“噬菌体(phage)”和“噬菌体(bacteriophage)”在说明书中可互换使用。
[0103] “特异性结合”是指两个分子优先于结合环境中的其它分子结合彼此的能力。通常，“特异性结合”区分反应中的偶然结合至少两倍，更通常至少10倍，通常至少100倍或更-7
多。通常，如通过解离常数定量的特异性结合反应的亲和力或亲合力为约10 M或更强(例
如约10-8 M、10-9 M或甚至更强)。
多。通常，如通过解离常数定量的特异性结合反应的亲和力或亲合力为约10 M或更强(例
如约10-8 M、10-9 M或甚至更强)。
[0105] 术语“原位”是指在与活生物分开生长例如在组织培养中生长的活细胞中发生的过程。
[0106] 术语“体内”是指在活生物中发生的过程。
[0108] 术语“微生物”意指来自古细菌域(Archaea)、细菌域(Bacteria)和真核生物域(Eucarya)的原核生物和真核生物微生物物种，后者包括酵母和丝状真菌、原生动物、藻类或更高等的原生生物。术语“微生物细胞”和“微生物(microbe)”可与术语微生物
(microorganism)互换使用。
(microorganism)互换使用。
[0109] 术语“标记物(marker或markers)”包含但不限于脂质、脂蛋白、蛋白、细胞因子、趋化因子、生长因子、肽、核酸、基因和寡核苷酸，连同其相关复合物、代谢产物、突变、变体、多态性、修饰、片段、亚基、降解产物、元素以及其它分析物或样品衍生测量。标记物还可以包括突变蛋白、突变核酸、拷贝数变化和/或转录物变体。
[0110] 术语“样品”可以包括通过手段包括静脉穿刺、排泄、射精、按摩、活组织检查、针抽吸、灌洗样品、刮擦、手术切口、擦拭或干预或本领域已知的其它方法，取自环境或受试者的单一细胞或多个细胞或细胞的片段或者体液等分试样。
[0111] 术语“受试者”涵盖细胞、组织或生物、人或非人，无论是在体内、离体还是体外、男性还是女性。
[0112] “G”、“C”、“A”和“U”各自通常分别代表含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶作为碱基的核苷酸。“T”和“dT”在本文中可互换使用，并且指其中核碱基是胸腺嘧啶例如脱氧胸腺嘧啶的脱氧核糖核苷酸。然而，应理解术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”或“脱氧核糖核苷酸”还可以指如下文进一步详述的经修饰的核苷酸，或替代替换部分。技术人员熟知鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以被其它部分替换，而基本上不改变包含具有这样的替换部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对性质。例如且不限于，包含肌苷作为其碱基的核苷酸可
以与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸碱基配对。因此，含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸在核苷酸序列中可以由含有例如肌苷的核苷酸替换。包含这样的替换部分的序列
是本发明的实施方案。
以与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸碱基配对。因此，含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸在核苷酸序列中可以由含有例如肌苷的核苷酸替换。包含这样的替换部分的序列
是本发明的实施方案。
[0113] 如本文中所使用，当用于描述与第二核苷酸序列相关的第一核苷酸序列时，术语“互补的”是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包含第二核苷
酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交且形成双链体结构的能力，如技术人员应理解。互补序
列还描述为彼此结合且特征在于结合亲和力。
酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交且形成双链体结构的能力，如技术人员应理解。互补序
列还描述为彼此结合且特征在于结合亲和力。
[0114] 例如，当两个序列在严格杂交条件下杂交(例如退火)时，第一核苷酸序列可描述为与第二核苷酸序列互补。杂交条件包括用于退火和/或洗涤步骤的温度、离子强度、pH和有机溶剂浓度。术语严格杂交条件指这样的条件，在其下第一核苷酸序列优先与其靶序列
例如第二核苷酸序列杂交，并且与其它序列杂交至更少程度或完全不杂交。严格杂交条件
是序列依赖性的，并且在不同环境参数下不同。通常，严格杂交条件选择为比在限定离子强度和pH下核苷酸序列的热解链温度(Tm)低约5℃。Tm是在其下50%的第一核苷酸序列与完美
匹配的靶序列杂交的温度(在限定离子强度和pH下)。关于核酸杂交的广泛指导在例如
Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--
Hybridization with Nucleic Acid Probes part I，第2章，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,” Elsevier，
N.Y.(“Tijssen”)中找到。可应用其它条件诸如如生物内可能遇到的生理学相关条件。技术人员将能够根据杂交核苷酸的最终应用，确定对于两个序列的互补性测试最适当的条件
组。
例如第二核苷酸序列杂交，并且与其它序列杂交至更少程度或完全不杂交。严格杂交条件
是序列依赖性的，并且在不同环境参数下不同。通常，严格杂交条件选择为比在限定离子强度和pH下核苷酸序列的热解链温度(Tm)低约5℃。Tm是在其下50%的第一核苷酸序列与完美
匹配的靶序列杂交的温度(在限定离子强度和pH下)。关于核酸杂交的广泛指导在例如
Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--
Hybridization with Nucleic Acid Probes part I，第2章，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,” Elsevier，
N.Y.(“Tijssen”)中找到。可应用其它条件诸如如生物内可能遇到的生理学相关条件。技术人员将能够根据杂交核苷酸的最终应用，确定对于两个序列的互补性测试最适当的条件
组。
[0115] 这包括在第一和第二核苷酸序列的整个长度上包含第一核苷酸序列寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸的碱基配对。这样的序列在本文中
可以被称为就彼此而言“完全互补”。然而，当第一序列在本文中被称为就第二序列而言“基本上互补”时，两个序列可以是完全互补的，或它们可以在杂交后形成一个或多个，但一般不超过4、3或2个错配碱基对，同时保留在与其最终应用最相关的条件下杂交的能力。然而，当两个寡核苷酸设计为在杂交后形成一个或多个单链突出端时，就互补性测定而言这样的
突出端不应视为错配。例如，包含长度21个核苷酸的一种寡核苷酸和长度23个核苷酸的另
一种寡核苷酸的dsRNA，其中更长的寡核苷酸包含与较短寡核苷酸完全互补的21个核苷酸
的序列，对于本文描述的目的仍可被称为“完全互补的”。
可以被称为就彼此而言“完全互补”。然而，当第一序列在本文中被称为就第二序列而言“基本上互补”时，两个序列可以是完全互补的，或它们可以在杂交后形成一个或多个，但一般不超过4、3或2个错配碱基对，同时保留在与其最终应用最相关的条件下杂交的能力。然而，当两个寡核苷酸设计为在杂交后形成一个或多个单链突出端时，就互补性测定而言这样的
突出端不应视为错配。例如，包含长度21个核苷酸的一种寡核苷酸和长度23个核苷酸的另
一种寡核苷酸的dsRNA，其中更长的寡核苷酸包含与较短寡核苷酸完全互补的21个核苷酸
的序列，对于本文描述的目的仍可被称为“完全互补的”。
[0116] 如本文中所使用，“互补”序列还可以包括非沃森克里克碱基对和/或由非天然和经修饰的核苷酸形成的碱基对，或者完全由非沃森克里克碱基对和/或由非天然和经修饰
的核苷酸形成的碱基对形成，到就其杂交能力而言的上述需求得到满足的程度。这样的非
沃森克里克碱基对包括但不限于G:U摆动或Hoogstein碱基配对。
的核苷酸形成的碱基对形成，到就其杂交能力而言的上述需求得到满足的程度。这样的非
沃森克里克碱基对包括但不限于G:U摆动或Hoogstein碱基配对。
[0117] 术语“互补的”、“完全互补的”和“基本上互补的”在本文中可以就dsRNA的两条链之间，或在dsRNA的反义链和靶序列之间，在单链RNA序列或单链DNA序列的互补链之间的碱基匹配而言使用，如由其使用的上下文将理解。
[0118] 如本文中所使用，“双链体结构”包含两个反向平行和基本上互补的核酸序列。核酸构建体中、两个转录物之间、转录物内的两个区域之间、或转录物和靶序列之间的互补序列可以形成“双链体结构”。一般而言，每条链的大多数核苷酸是核糖核苷酸，但如本文详细描述，每条链或两条链还可以包括至少一个非核糖核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸和/或经修饰的核苷酸。形成双链体结构的两条链可以是一个较大的RNA分子的不同部分，或它们可以是分开的RNA分子。当两条链是一个较大分子的部分且因此通过形成双链体结构的一条链的3'末端和分别的另一条链的5'末端之间的不间断核苷酸链连接时，连接的RNA链被称为
“发夹环”。当两条链通过除形成双链体结构的一条链的3'末端和分别另一条链的5'末端之间的不间断核苷酸链连接以外的方式共价连接时，连接结构被称为“接头”。RNA链可以具有相同或不同数目的核苷酸。碱基对的最大数目是双链体的最短链中的核苷酸数目减去双链
体中存在的任何突出端。通常，双链体结构是长为15至30或25至30，或18至25，或19至24，或
19至21，或19、20或21个碱基对。在一个实施方案中，双链体长为19个碱基对。在另一个实施方案中，双链体长为21个碱基对。当两种不同的siRNA组合使用时，双链体长度可以相同或可以不同。
“发夹环”。当两条链通过除形成双链体结构的一条链的3'末端和分别另一条链的5'末端之间的不间断核苷酸链连接以外的方式共价连接时，连接结构被称为“接头”。RNA链可以具有相同或不同数目的核苷酸。碱基对的最大数目是双链体的最短链中的核苷酸数目减去双链
体中存在的任何突出端。通常，双链体结构是长为15至30或25至30，或18至25，或19至24，或
19至21，或19、20或21个碱基对。在一个实施方案中，双链体长为19个碱基对。在另一个实施方案中，双链体长为21个碱基对。当两种不同的siRNA组合使用时，双链体长度可以相同或可以不同。
[0119] 如本文中所使用，术语“互补性区域”是指与序列例如靶序列基本上互补的反义链上的区域（如本文所定义）。当互补性区域与靶序列并非完全互补时，错配在末端区域中最耐受，并且如果存在的话，一般在一个或多个末端区域中，例如在5'和/或3'末端的6、5、4、3或2个核苷酸内。
[0120] 在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“同一性”百分比指当就最大对应性进行比较时，具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列，如使用下文描述的序列比较算法之一(例如BLASTP和BLASTN或技术人员可获得的其它
算法)或通过目视检查所测量。取决于应用，术语“同一性”可存在于待比较的序列的区域上，例如功能结构域上，或可选地，存在于待比较的两个序列的全长上。
算法)或通过目视检查所测量。取决于应用，术语“同一性”可存在于待比较的序列的区域上，例如功能结构域上，或可选地，存在于待比较的两个序列的全长上。
[0121] 对于序列比较，通常一个序列充当测试序列与之比较的参考序列。当使用序列比较算法时，测试和参考序列输入到计算机内，需要时，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。序列比较算法随后基于指定的程序参数，计算关于测试序列相对于参考序列的
序列同一性百分比。关于比较的最佳序列比对可以例如通过如下进行：Smith & Waterman，Adv. Appl. Math. 2:482(1981)的局部同源性算法，Needleman & Wunsch，J. Mol. Biol.
48:443(1970)的同源性比对算法，Pearson & Lipman，Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:
2444(1988)的相似性搜索方法，这些算法的计算机化实现(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或目视检查(一般参见Ausubel等人，下文)。
序列同一性百分比。关于比较的最佳序列比对可以例如通过如下进行：Smith & Waterman，Adv. Appl. Math. 2:482(1981)的局部同源性算法，Needleman & Wunsch，J. Mol. Biol.
48:443(1970)的同源性比对算法，Pearson & Lipman，Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:
2444(1988)的相似性搜索方法，这些算法的计算机化实现(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或目视检查(一般参见Ausubel等人，下文)。
[0122] 适合于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一个例子是BLAST算法，其在Altschul等人，J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)中描述。用于执行BLAST分析的软件
通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)
(www.ncbi.nlm.nih.gov/)可公开获得。
通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)
(www.ncbi.nlm.nih.gov/)可公开获得。
[0123] 术语“足够量”意指足以产生所需效应的量，例如足以产生来自细胞的可检测信号的量。
[0125] 必须指出如说明书和所附权利要求中所使用，单数形式“一个/种”和“所述”包括复数参考，除非上下文另有明确说明。
[0126] NRTP和报道物测定非复制型转导颗粒(NRTP)和生产NRTP的方法描述于WO 2014/160418和US 2015/
0104787中。在一些实施方案中，使用基于破坏/互补的方法在细菌细胞包装系统中产生
NRTP。该非复制型转导颗粒包装系统基于将突变、沉默突变、插入或缺失引入病毒/噬菌体的基因组的组分，所述组分可被病毒/噬菌体包装机器识别为在病毒/噬菌体产生期间起始
基因组包装的元件。这样的元件的实例包括pac-型噬菌体的pac-位点序列和cos-型噬菌体
的cos-位点序列。
0104787中。在一些实施方案中，使用基于破坏/互补的方法在细菌细胞包装系统中产生
NRTP。该非复制型转导颗粒包装系统基于将突变、沉默突变、插入或缺失引入病毒/噬菌体的基因组的组分，所述组分可被病毒/噬菌体包装机器识别为在病毒/噬菌体产生期间起始
基因组包装的元件。这样的元件的实例包括pac-型噬菌体的pac-位点序列和cos-型噬菌体
的cos-位点序列。
[0127] 因为这些包装起始位点通常存在于病毒/噬菌体产生所必需的基因编码区内，所以引入突变、沉默突变、插入或缺失，使得pac-位点不再被病毒/噬菌体包装机器识别为包装起始位点。同时，在沉默突变的情况下，所述突变不破坏编码该位点的基因。通过使包装位点序列无功能，突变的病毒能够经历裂解周期，但不能将其基因组DNA包装入其包装单
元。
元。
[0128] 可将外源报道核酸分子(诸如质粒DNA)引入宿主细菌细胞，所述宿主细菌细胞已经被具有无功能的包装起始位点序列的病毒/噬菌体基因组溶原化。外源报道核酸分子可
包括天然功能包装起始位点序列，并且在其中破坏编码包装起始位点序列的基因的情况
下，外源报道核酸分子还包括相应的天然功能基因。可将外源报道核酸分子引入宿主细菌
细胞并在细胞中复制。当突变的病毒/噬菌体经历裂解周期时，表达的病毒/噬菌体包装机
器将具有功能包装起始位点序列的外源报道核酸分子包装入病毒包装单元。病毒/噬菌体
基因组未被包装入包装单元，因为其包装起始位点序列已经被破坏。
包括天然功能包装起始位点序列，并且在其中破坏编码包装起始位点序列的基因的情况
下，外源报道核酸分子还包括相应的天然功能基因。可将外源报道核酸分子引入宿主细菌
细胞并在细胞中复制。当突变的病毒/噬菌体经历裂解周期时，表达的病毒/噬菌体包装机
器将具有功能包装起始位点序列的外源报道核酸分子包装入病毒包装单元。病毒/噬菌体
基因组未被包装入包装单元，因为其包装起始位点序列已经被破坏。
[0129] 因此，本发明考虑使用细菌细胞包装系统用于将报道核酸分子包装入NRTP以引入细胞中，所述细菌细胞包装系统包含：宿主细菌细胞；在所述宿主细菌细胞内的第一核酸构建体，所述第一核酸构建体包含具有非功能性包装起始位点序列的噬菌体基因组，其中所
述非功能性包装起始位点序列阻止将所述噬菌体基因组包装至所述NRTP中；和在所述宿主
细菌细胞内且与所述第一核酸构建体分开的第二核酸构建体，所述第二核酸构建体包含具
有报道基因的所述报道核酸分子和用于促进将报道核酸分子的复制子包装至NRTP中的功
能性包装起始位点序列，其中所述第二核酸构建体上的功能性第二包装起始位点序列与所
述第一核酸构建体上的噬菌体基因组中的非功能性包装起始位点序列互补。
述非功能性包装起始位点序列阻止将所述噬菌体基因组包装至所述NRTP中；和在所述宿主
细菌细胞内且与所述第一核酸构建体分开的第二核酸构建体，所述第二核酸构建体包含具
有报道基因的所述报道核酸分子和用于促进将报道核酸分子的复制子包装至NRTP中的功
能性包装起始位点序列，其中所述第二核酸构建体上的功能性第二包装起始位点序列与所
述第一核酸构建体上的噬菌体基因组中的非功能性包装起始位点序列互补。
[0130] 在一些实施方案中，构建体(包括NRTP)包含包括报道基因的报道核酸分子。报道基因可以编码报道分子，并且报道分子可以是可检测或可选择标记物。在某些实施方案中，报道基因编码报道分子，当在细胞表达时，所述报道分子产生可检测信号。
[0131] 在某些实施方案中，报道分子可以是荧光报道分子，诸如但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、增强型GFP、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、红色荧光蛋白(RFP)或mCherry以及近红外荧光蛋白。
[0132] 在其它实施方案中，报道分子可以是介导发光反应的酶(luxA、luxB、luxAB、luc、ruc、nluc等)。报道分子可以包括细菌萤光素酶、真核萤光素酶、适合于比色检测的酶(lacZ、HRP)、适合于免疫检测的蛋白诸如亲和肽(His-标签、3X-FLAG)、充当适体或展示酶活性的核酸(核酶)、或选择性标记物诸如抗生素抗性基因(ampC、tet(M)、CAT、erm)。本领域已知的其它报道分子可以用于产生信号，以检测靶核酸或细胞。
[0133] 在其它方面，报道分子包含核酸分子。在一些方面，报道分子是具有特异性结合活性的适体或其展示酶活性(例如适体酶、DNA核酶、核酶)。
[0134] 本文公开了用于检测活细胞内的细胞内酶的系统，其采用可被靶细胞内酶去笼罩（un-caged）的被笼罩（caged)的底物分子。
[0135] 细胞报道核酸分子的递送可以通过各种方式完成，所述各种方式包括电穿孔、化学、生物弹射和玻璃珠转化、转导、转染、载体、缀合，包括但不限于经由核酸递送媒介物递送，包括细菌噬菌体、病毒、原生质球、脂质体、病毒样颗粒、脂质-DNA复合物、脂复合物、聚合物-DNA复合物、聚合复合物等。
[0136] 寡核苷酸分子和抗微生物敏感性机制确定本文公开了用于确定生物的身份和为生物赋予抗微生物抗性或敏感性的机制的方法。
这些方法包括通过抑制与生物的存活和/或产生可选择和/或可检测的标记物/信号的能力
相关的生物的特定功能来抑制由细胞-报道系统中生物的特定菌株和物种产生的信号、存
活和/或生长。
这些方法包括通过抑制与生物的存活和/或产生可选择和/或可检测的标记物/信号的能力
相关的生物的特定功能来抑制由细胞-报道系统中生物的特定菌株和物种产生的信号、存
活和/或生长。
[0137] 在一些实施方案中，通过靶向非靶生物中的DNA或RNA来实现由生物的特定菌株和物种产生的信号、存活和/或生长的抑制。可以使用寡核苷酸调节(其中通过设计来靶向菌
株和物种特异性分子)来实现不是报道物测定的靶标的生物中的核酸分子的靶向，其目的
为抑制这些非靶生物的信号、存活和/或生长。在这个意义上，使用可以通过互补序列与靶核酸杂交的分子实现“靶向”。
株和物种特异性分子)来实现不是报道物测定的靶标的生物中的核酸分子的靶向，其目的
为抑制这些非靶生物的信号、存活和/或生长。在这个意义上，使用可以通过互补序列与靶核酸杂交的分子实现“靶向”。
[0138] 本文公开的示例性靶标是本申请中描述的非限制性实例，并且可以扩展到这些实施例之外，以包括寡核苷酸分子可以结合的任何序列靶标，包括基因、转录物、非编码RNA等。
[0139] 寡核苷酸分子可用于通过在单次测定中并入靶向不同序列的多个寡核苷酸分子来靶向单个序列或多个序列。因此，测定可以靶向单个基因、不同基因或单个基因的不同变体。
[0140] 寡核苷酸分子可以是任何类型的，包括但不限于核酸寡核苷酸、寡核苷酸类似物、寡核苷酸模拟物、DNA小沟结合聚酰胺、PNA、LNA、硫代磷酸酯、2'-甲氧基-、2'-甲氧基乙氧基-、吗啉代、磷酰胺等。
[0141] 可以经由外源性添加分子或其原位表达来完成寡核苷酸分子的递送。通过分子与肽的缀合或通过其它方式(包括但不限于经由脂质体的递送等)促进外源递送。由设计用于
在靶生物内表达寡核苷酸的核酸介导的原位表达可以经由将核酸递送至靶生物中的任何
方式来完成，所述方式包括电穿孔、化学、生物弹射和玻璃珠转化、转导、转染、缀合，包括但不限于经由核酸递送媒介物的递送，所述核酸递送媒介物包括噬菌体、病毒、原生质球、脂质体、病毒样颗粒、脂质-DNA复合物、脂质复合物、聚合物-DNA复合物、聚合复合物等。
在靶生物内表达寡核苷酸的核酸介导的原位表达可以经由将核酸递送至靶生物中的任何
方式来完成，所述方式包括电穿孔、化学、生物弹射和玻璃珠转化、转导、转染、缀合，包括但不限于经由核酸递送媒介物的递送，所述核酸递送媒介物包括噬菌体、病毒、原生质球、脂质体、病毒样颗粒、脂质-DNA复合物、脂质复合物、聚合物-DNA复合物、聚合复合物等。
[0142] 细胞报道核酸分子的递送可以通过各种方式来完成，所述方式包括电穿孔、化学、生物弹射和玻璃珠转化、转导、转染、缀合，包括但不限于经由核酸递送媒介物的递送，所述核酸递送媒介物包括噬菌体、病毒、原生质球、脂质体、病毒样颗粒、脂质-DNA复合物、脂质复合物、聚合物-DNA复合物、聚合复合物等。
[0143] 反义RNA调节在自然界中经由反义RNA结合另一RNA分子的过程而发生(1)。反义寡核苷酸、肽核酸(PNA)(2)和吗啉代磷酰二胺(PMO)寡聚体已被设计为结合细胞内核酸靶标。
例如，已经使用PNA来以与天然反义RNA调节类似的方式调节细胞中的基因表达(3-5)。反义分子可以是任何类型的，包括但不限于寡核苷酸、寡核苷酸类似物、寡核苷酸模拟物、DNA小沟结合聚酰胺、PNA、LNA、硫代磷酸酯、2'-甲氧基-、2'-甲氧基乙氧基-、吗啉代、磷酰胺等。
反义分子的递送可以通过分子与肽的缀合或通过其它方式促进，所述方式包括但不限于经
由脂质体的递送，与肽的缀合，经由设计用于转录反义分子的DNA递送媒介物的递送等。肽-PNA是与肽缀合的PNA。肽-PNA已经用于靶向细菌中的RNA分子，其中肽被设计为促进分子摄入细菌(6)。
例如，已经使用PNA来以与天然反义RNA调节类似的方式调节细胞中的基因表达(3-5)。反义分子可以是任何类型的，包括但不限于寡核苷酸、寡核苷酸类似物、寡核苷酸模拟物、DNA小沟结合聚酰胺、PNA、LNA、硫代磷酸酯、2'-甲氧基-、2'-甲氧基乙氧基-、吗啉代、磷酰胺等。
反义分子的递送可以通过分子与肽的缀合或通过其它方式促进，所述方式包括但不限于经
由脂质体的递送，与肽的缀合，经由设计用于转录反义分子的DNA递送媒介物的递送等。肽-PNA是与肽缀合的PNA。肽-PNA已经用于靶向细菌中的RNA分子，其中肽被设计为促进分子摄入细菌(6)。
[0144] 可以设计反义分子以靶向细菌的特定菌株和物种(7)。通过分析目标细菌的基因组，可以鉴定一组反义分子靶标，其以靶向对于细菌的一种物种、而不是另一种物种特异性的方式靶向必需基因。以这种方式，可以调谐反义分子以抑制细菌的单独物种。
[0145] 寡核苷酸和寡聚体可以经由促进摄入细胞中的各种机制(包括脂质体和与肽的缀合)来递送至细胞中。肽-PNA是与肽缀合的PNA。肽-PNA已经用于靶向细菌中的RNA分子，使得所述肽被设计为促进分子摄入细菌(Good, L.和P.E. Nielsen, WO2002/0279467)。
[0146] 可以设计反义分子以靶向细菌的特定菌株和物种(Mondhe, M., 等人, Species-Selective Killing of Bacteria by Antimicrobial Peptide-PNAs. PLoS ONE, 2014.
9(2): p. e89082)。通过分析目标细菌的基因组，可以鉴定一组反义分子靶标，其以靶向对于细菌的一种物种、而不是另一种物种特异性的方式靶向必需基因。以这种方式，可以调谐反义分子以抑制细菌的特定单独物种。
9(2): p. e89082)。通过分析目标细菌的基因组，可以鉴定一组反义分子靶标，其以靶向对于细菌的一种物种、而不是另一种物种特异性的方式靶向必需基因。以这种方式，可以调谐反义分子以抑制细菌的特定单独物种。
[0147] 在一个实施方案中，设计系统以击倒（knock down）靶表型的表达，诸如抗微生物抗性机制的表达。可以设计寡核苷酸分子以靶向抗性基因的转录物，使得通常对抗微生物化合物具有抗性的微生物在暴露于靶向寡核苷酸后对所述化合物变得敏感。
[0148] 除了采用外源性寡核苷酸之外，靶向寡核苷酸可以从递送至靶生物的DNA在体内产生。在该实施方案中，设计DNA以转录设计用于靶向目标转录物的反义RNA分子。
[0149] 在另一个实施方案中，可以采用RNA干扰(RNAi)；这是一种过程，其中双链RNA片段(dsRNA，也称为小干扰RNAs (siRNAs))触发催化性介导的基因沉默，最典型地通过靶向RNA-诱导的沉默复合物(RISC)与mRNA结合并使之降解。将dsRNA分子的一条链退火至mRNA
或DNA，可通过细胞中的核糖核酸酶、或通过反义化合物本身的靶RNA切割，而导致双链体
RNA、杂合RNA/DNA双链体或双链体RNA类似前体tRNA的快速降解。
或DNA，可通过细胞中的核糖核酸酶、或通过反义化合物本身的靶RNA切割，而导致双链体
RNA、杂合RNA/DNA双链体或双链体RNA类似前体tRNA的快速降解。
[0150] RNAi途径存在于许多真核生物中，并且由酶Dicer起始，该酶Dicer将长双链RNA (dsRNA)分子切割为 20个核苷酸的短双链片段，其称为siRNAs。每个siRNA被松开为两条单~
链RNAs (ssRNA)，称为过客链(passenger strand)和引导链(guide strand)。过客链被降
解，而引导链被并入RNA-诱导的沉默复合物(RISC)。在转录后基因沉默中，引导链与信使
RNA分子中的互补序列碱基配对，并且由称为Argonaute的蛋白(RISC复合物的催化组件)诱
导切割。
链RNAs (ssRNA)，称为过客链(passenger strand)和引导链(guide strand)。过客链被降
解，而引导链被并入RNA-诱导的沉默复合物(RISC)。在转录后基因沉默中，引导链与信使
RNA分子中的互补序列碱基配对，并且由称为Argonaute的蛋白(RISC复合物的催化组件)诱
导切割。
[0151] 寡核苷酸和靶转录物之间的相互作用可以依赖于两个转录物中都存在的环之间(例如，“接吻复合物(kissing complex)”)、或环和单链(ss)区之间的碱基配对。在一些情况下，接吻复合物形成足以介导所需的相互作用的效应，而在另一些情况下，初步接触的蔓延将导致相互作用，产生所需效应。
[0152] 采用靶向寡核苷酸的体内产生的另一个实施方案基于在细菌中作为针对外源DNA的防御发现的聚集的、定期间隔的短回文重复(CRISPR)/CRISPR-相关(Cas)系统(8)。可以
设计CRISPR/Cas系统以通过并入转录并加工成CRISPR RNA (crRNA)的靶序列来靶向目标
DNA序列。该系统还表达反式激活小RNA (tracrRNA)，并且由Cas9、tracrRNA和crRNA形成的复合物使得Cas9核酸内切酶能够在由crRNA靶向的靶DNA序列中形成双链断裂。在该实施方
案中，可以在有义或反义方向设计crRNA寡核苷酸，该系统靶向DNA，而不是靶向转录物，因此被设计为靶向在染色体中或附加型编码的生物特异性DNA序列或抗生素抗性基因。
设计CRISPR/Cas系统以通过并入转录并加工成CRISPR RNA (crRNA)的靶序列来靶向目标
DNA序列。该系统还表达反式激活小RNA (tracrRNA)，并且由Cas9、tracrRNA和crRNA形成的复合物使得Cas9核酸内切酶能够在由crRNA靶向的靶DNA序列中形成双链断裂。在该实施方
案中，可以在有义或反义方向设计crRNA寡核苷酸，该系统靶向DNA，而不是靶向转录物，因此被设计为靶向在染色体中或附加型编码的生物特异性DNA序列或抗生素抗性基因。
[0153] 为了开发针对抗微生物感染的治疗剂的目的，本领域中已经采用了与上述类似的技术(9-10)。如本文进一步描述，这些技术用于实现细菌检测系统的目的和确定与抗微生
物抗性或敏感性表型相关的特定机制。
物抗性或敏感性表型相关的特定机制。
[0154] 通过设计寡核苷酸分子以靶向抗性基因的特定DNA或RNA序列，可以确定与表型相关的特异性机制。例如，如果当存在寡核苷酸分子时微生物被确定为对所讨论的抗微生物
具有抗性且对相同的抗微生物剂敏感，则对微生物进行AST，则该结果表明，设计寡核苷酸分子以靶向的特异性抗微生物基因与抗微生物抗性表型相关。
实施例
具有抗性且对相同的抗微生物剂敏感，则对微生物进行AST，则该结果表明，设计寡核苷酸分子以靶向的特异性抗微生物基因与抗微生物抗性表型相关。
实施例
[0155] 实施例1：从大肠杆菌消除肠杆菌科报道物的信号。
[0156] 在本实施例中，将肠杆菌科报道系统与靶向大肠杆菌的肽-PNA结合使用。不使用肽-PNA的情况下，肠杆菌科报道系统从肠杆菌科(包括肺炎克雷伯菌和大肠杆菌两者)产生
可检测的信号。当添加肽-PNA时，肠杆菌科报道系统产生来自肠杆菌科(排除大肠杆菌)的
信号。该系统可以在有和没有寡核苷酸的情况下一起使用，并且可以通过观察信号在没有
肽-PNA的情况下存在且在有肽-PNA的情况下不存在来确定靶生物的存在。可选地，在可含
有大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的样品中，在寡核苷酸存在的情况下运行测定允许确定样品中
是否存在肺炎克雷伯菌。在本实施例中，仅含有肺炎克雷伯菌的样品将产生信号，无论大肠杆菌是否也存在于样品中，而仅含有大肠杆菌的样品将不产生信号。以这种方式，肽-PNA可用于实现物种特异性细菌检测。
可检测的信号。当添加肽-PNA时，肠杆菌科报道系统产生来自肠杆菌科(排除大肠杆菌)的
信号。该系统可以在有和没有寡核苷酸的情况下一起使用，并且可以通过观察信号在没有
肽-PNA的情况下存在且在有肽-PNA的情况下不存在来确定靶生物的存在。可选地，在可含
有大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的样品中，在寡核苷酸存在的情况下运行测定允许确定样品中
是否存在肺炎克雷伯菌。在本实施例中，仅含有肺炎克雷伯菌的样品将产生信号，无论大肠杆菌是否也存在于样品中，而仅含有大肠杆菌的样品将不产生信号。以这种方式，肽-PNA可用于实现物种特异性细菌检测。
[0157] 根据(7)设计肽-PNA以靶向大肠杆菌的必需基因。简而言之，分析大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的基因组，以鉴定存在于目标物种中的必需基因同源物。从该分析编译每个基因
的翻译起始区域(TIR)的列表，即基因组中TIRs的二十个碱基对(相对于起始密码子的-10
到+10个碱基)。将来自基因同源物的20个碱基对TIR进行比对，并确定物种之间的碱基对错配数。使用靶向TIR内的区域的9-12 bp的反义序列来设计PNA。测定PNA/DNA双链体的预测
热稳定性，并使用大于2个碱基对错配的截止值进行靶物种内的PNA的可能结合位点的基因
组分析。
的翻译起始区域(TIR)的列表，即基因组中TIRs的二十个碱基对(相对于起始密码子的-10
到+10个碱基)。将来自基因同源物的20个碱基对TIR进行比对，并确定物种之间的碱基对错配数。使用靶向TIR内的区域的9-12 bp的反义序列来设计PNA。测定PNA/DNA双链体的预测
热稳定性，并使用大于2个碱基对错配的截止值进行靶物种内的PNA的可能结合位点的基因
组分析。
[0158] 从该分析可以针对基因同源物鉴定每个PNA的潜在结合位点，例如其中一个PNA结合一个物种、但非另一个物种的同源物，反之亦然。靶向murA基因的大肠杆菌特异性PNA被鉴定为SEQ ID NO 1中所示的序列。因此预期靶向该序列的肽-PNA结合大肠杆菌murA，但不结合肺炎克雷伯菌murA。
[0159] 根据(11)，将PNA与肽KFFKFFKFFK (SEQ ID NO 10)缀合，因为已经证明该肽有助于PNA渗透至细菌细胞中。因此，大肠杆菌murA靶向肽-PNA的序列如下：KFFKFFKFFK-eg-
ccatttagtt (murA PNA)，其中eg是衍生自[2-[2-(Fmoc-氨基)乙氧基]乙氧基]乙酸的乙二
醇接头。
ccatttagtt (murA PNA)，其中eg是衍生自[2-[2-(Fmoc-氨基)乙氧基]乙氧基]乙酸的乙二
醇接头。
[0160] murA PNA对大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的生长的影响：检查murA PNA对大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的生长的影响。当大肠杆菌和肺炎克雷伯氏
菌在murA PNA存在的情况下培养时，大肠杆菌的生长受损，而肺炎克雷伯菌的生长则不受
损。
菌在murA PNA存在的情况下培养时，大肠杆菌的生长受损，而肺炎克雷伯菌的生长则不受
损。
[0161] 大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的分离株在LB中在37℃下生长过夜，并且第二天以1:100稀释至新鲜LB中来亚培养，并生长至600 nm (OD600)为0.2的光密度。将约104 CFU的每种细菌菌株的菌株的接种物添加至各自含有50μL LB或含有最终浓度为4.5μM的murA PNA
的LB的微板的单独孔中。经8小时的时段测量OD600读数以评估PNA处理和PNA未处理的细胞
的生长。
的LB的微板的单独孔中。经8小时的时段测量OD600读数以评估PNA处理和PNA未处理的细胞
的生长。
[0162] 图1描述了大肠杆菌的生长实验的结果。在PNA存在的情况下，大肠杆菌的生长受损。图2描述了肺炎克雷伯菌的生长实验的结果。在PNA存在的情况下，肺炎克雷伯菌的生长未受损。结果表明，murA PNA特异性抑制大肠杆菌的生长，而不抑制肺炎克雷伯菌的生长。
[0163] 当测试大肠杆菌和肺炎克雷伯菌时murA PNA对肠杆菌科报道物的发光的影响：大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的分离株在LB中在37℃下生长过夜，并且第二天以1:100稀
释至新鲜LB中来亚培养，并生长至0.2的OD600。将约104 CFU的每种细菌物种的各菌株的接种物添加至各自含有50μL LB或含有最终浓度为4.5μM的murA PNA的LB的微板的单独孔中。
所有孔随后都接受100μL肠杆菌科发光报道物非复制型转导颗粒（如PCT/US2014/026536，实施例1中所述），并且样品在30℃下温育2小时。在温育期之后，使用Molecular Devices SpectraMax L微孔板发光计测定平板的发光，其中当取发光读数时将十三醛溶液注入每个
孔。
释至新鲜LB中来亚培养，并生长至0.2的OD600。将约104 CFU的每种细菌物种的各菌株的接种物添加至各自含有50μL LB或含有最终浓度为4.5μM的murA PNA的LB的微板的单独孔中。
所有孔随后都接受100μL肠杆菌科发光报道物非复制型转导颗粒（如PCT/US2014/026536，实施例1中所述），并且样品在30℃下温育2小时。在温育期之后，使用Molecular Devices SpectraMax L微孔板发光计测定平板的发光，其中当取发光读数时将十三醛溶液注入每个
孔。
[0164] 图3描述了大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的发光实验的结果。在PNA存在的情况下，大肠杆菌产生的发光信号受损，而肺炎克雷伯菌产生的发光信号则不受损。结果表明，murA PNA特异性抑制大肠杆菌的信号产生，并且不抑制肺炎克雷伯菌的信号产生，表明使用肠杆菌科报道系统和大肠杆菌特异性肽-PNA区分大肠杆菌与肺炎克雷伯菌的能力。
[0165] 实施例2：经由使用肽-PNA的AST抗微生物盘扩散测试法来测定与CRE表型相关的特异性碳青霉烯酶。
[0166] 在本实施例中，通过对CRE菌株添加肽-PNA来进行AST抗微生物盘扩散测试，以确定与CRE表型相关的特异性机制。不使用肽-PNA的情况下，CRE表现出碳青霉烯抗性结果。当添加设计用于靶向特异性碳青霉烯酶基因的肽-PNA并且AST结果变为碳青霉烯敏感(CSE)
表型时，这表明肽-PNA靶向的碳青霉烯酶基因是与CRE表型相关的机制。以这种方式，可以使用肽-PNA来确定与细菌的抗微生物抗性表型相关的特异性机制。
表型时，这表明肽-PNA靶向的碳青霉烯酶基因是与CRE表型相关的机制。以这种方式，可以使用肽-PNA来确定与细菌的抗微生物抗性表型相关的特异性机制。
[0167] 设计肽-PNA以靶向大肠杆菌的blaKPC-3和blaNDM-1转录物。简而言之，分析大肠杆菌1289012和大肠杆菌1289014中靶基因的基因序列(分别表达blaKPC-3和blaNDM-1基因的大肠杆菌的两个临床分离株)，以鉴定每种基因的TIR的序列(表1，SEQ ID NO 11和12)。使用靶向TIR内的区域的9-12 bp的反义序列来设计潜在PNA。可以从该分析鉴定用于靶向blaKPC-3 (SEQ ID NO 2)和blaNDM-1 (SEQ ID NO 3)基因的PNA的潜在结合位点。
[0168] 根据(11)，将PNA与肽KFFKFFKFFK缀合，因为已经证明该肽有助于PNA渗透至细菌细胞中。
[0169] AST测试盘扩散测试：盘扩散测试根据CLSI-M02 (12)进行，且根据M100-S22 (13)解释。简而言之，为了测试
每种细菌对美罗培南的敏感性，以0.5 McFarland标准使用浸入细胞培养物悬浮液中的无
菌棉拭子接种Mueller-Hinton琼脂(MHA)平板，使得覆盖MHA的整个表面。将10μg美罗培南盘施加至接种平板的表面，并将平板在35℃下在环境空气中温育16-18小时。如果美罗培南盘周围的抑制区域的直径≥23mm，则确定细菌菌株对美罗培南敏感，并且如果区域直径≤
19mm，则确定细菌菌株对美罗培南有抗性。
每种细菌对美罗培南的敏感性，以0.5 McFarland标准使用浸入细胞培养物悬浮液中的无
菌棉拭子接种Mueller-Hinton琼脂(MHA)平板，使得覆盖MHA的整个表面。将10μg美罗培南盘施加至接种平板的表面，并将平板在35℃下在环境空气中温育16-18小时。如果美罗培南盘周围的抑制区域的直径≥23mm，则确定细菌菌株对美罗培南敏感，并且如果区域直径≤
19mm，则确定细菌菌株对美罗培南有抗性。
[0170] 经由盘扩散测试大肠杆菌1289012、1289014、对照大肠杆菌1289018(其为CSE且不表达碳青霉烯酶)和大肠杆菌1289011(为CRE且表达VIM碳青霉烯酶的对照菌株)的美罗培
南抗性。图4的第二行描述了大肠杆菌菌株的典型美罗培南盘扩散结果，其中1289011、
1289012和1289014是CRE，且1289018是CSE。
南抗性。图4的第二行描述了大肠杆菌菌株的典型美罗培南盘扩散结果，其中1289011、
1289012和1289014是CRE，且1289018是CSE。
[0171] 为了确定与美罗培南抗性表型相关的特异性机制，用10μg美罗培南盘(包括blaKPC-3-和blaNDM-1-肽-PNA)进行盘扩散测试。如果肽-PNA抑制与大肠杆菌菌株中的美罗培南抗性相关的特异性碳青霉烯酶，则当暴露于仅含有美罗培南的盘时，观察到的区域直径
相比于菌株的区域直径将降低。
相比于菌株的区域直径将降低。
[0172] 图4描述了大肠杆菌1289011、1289012、1289014和1289018的典型的美罗培南/肽-PNA盘扩散结果。在该图中，401描述了含有MHA和在琼脂的表面上生长的细菌菌苔的培养皿的俯视图，402描述了已经放置在401表面上的盘，且403表示由于盘402的内容物导致细菌
的菌苔的区域直径。
的菌苔的区域直径。
[0173] 图中的顶行证明单独的肽-PNA不对大肠杆菌菌株具有抑制作用。第3行证明，1289011是CRE，因为区域直径≥23mm，并且与CRE表型相关的机制不是blaKPC-3，因为在
blaKPC-3肽-PNA存在的情况下，区域直径相比于单独的美罗培南的区域直径不减小，1289012是CRE，其中blaKPC-3是与CRE表型相关的机制，因为区域直径减小，并且1289014是CRE，并且与CRE表型相关的机制不是blaKPC-3，因为区域直径不减少。第4行证明，1289011是CRE，因为区域直径≥23mm，并且与CRE表型相关的机制不是blaNDM-1，因为在blaNDM-1肽-PNA存在的情况下，区域直径相比于单独的美罗培南的区域直径不减小，1289012是CRE，并且与CRE表型相关的机制不是blaNDM-1，因为区域直径不减小，并且1289014是CRE，其中blaNDM-1是与CRE表型相关的机制，因为区域直径减小。
blaKPC-3肽-PNA存在的情况下，区域直径相比于单独的美罗培南的区域直径不减小，1289012是CRE，其中blaKPC-3是与CRE表型相关的机制，因为区域直径减小，并且1289014是CRE，并且与CRE表型相关的机制不是blaKPC-3，因为区域直径不减少。第4行证明，1289011是CRE，因为区域直径≥23mm，并且与CRE表型相关的机制不是blaNDM-1，因为在blaNDM-1肽-PNA存在的情况下，区域直径相比于单独的美罗培南的区域直径不减小，1289012是CRE，并且与CRE表型相关的机制不是blaNDM-1，因为区域直径不减小，并且1289014是CRE，其中blaNDM-1是与CRE表型相关的机制，因为区域直径减小。
[0174] 从这些结果可以确定，大肠杆菌的各菌株的与碳青霉烯抗性相关的基础机制对于1289012是blaKPC-3，对于1289014是blaNDM-1，且1289011中既不是blaKPC-3，也不是blaNDM-1。
[0175] 实施例3：经由使用肽-PNA的AST细胞-报道物测试来测定与CRE表型相关的特异性碳青霉烯酶。
[0176] 在本实施例中，将实施例2中描述的AST技术扩展至基于细胞-报道物测定的AST测试。使用如PCT/US2014/026536、实施例1中所述的肠杆菌科细胞报道物，并且如下运行测
定。简而言之，制备大肠杆菌1289011、1289012、1289014和1289018的培养物，并将其用于接种含有50μL LB与50μL接种物的微孔板的孔，使得每孔接受104 CFU的每种细菌菌株。一组孔不含额外添加剂，另一组孔含有5 μg/mL美罗培南，另一组孔含有5 μg/mL美罗培南和
blaKPC-3-肽-PNA，另一组孔含有5 μg/mL美罗培南和blaNDM-1-肽-PNA，且另外两组孔分别仅含有blaKPC-3或blaNDM-1肽-PNA。所有孔也接受100μL的肠杆菌科报道物。然后将样品在30℃下温育2小时，然后如实施例1中所述测定样品的发光。
定。简而言之，制备大肠杆菌1289011、1289012、1289014和1289018的培养物，并将其用于接种含有50μL LB与50μL接种物的微孔板的孔，使得每孔接受104 CFU的每种细菌菌株。一组孔不含额外添加剂，另一组孔含有5 μg/mL美罗培南，另一组孔含有5 μg/mL美罗培南和
blaKPC-3-肽-PNA，另一组孔含有5 μg/mL美罗培南和blaNDM-1-肽-PNA，且另外两组孔分别仅含有blaKPC-3或blaNDM-1肽-PNA。所有孔也接受100μL的肠杆菌科报道物。然后将样品在30℃下温育2小时，然后如实施例1中所述测定样品的发光。
[0177] 图5描述了细胞-报道物AST测定的结果，其中+表明报道物测定产生阳性结果，并且-表明报道物测定产生阴性结果。
[0178] 第1列表明肠杆菌科报道分子为所有大肠杆菌菌株提供阳性信号。第5列证明肽-PNA不抑制任何大肠杆菌菌株中的阳性结果。第2列表明，除了1289018以外的所有大肠杆菌菌株都是CRE，因为除了1289018以外的所有大肠杆菌菌株在美罗培南存在的情况下都继续
提供阳性信号。第3列证明1289011和1289014是CRE，并且与CRE表型相关的机制不是
blaKPC-3，因为在美罗培南和blaKPC-3肽-PNA存在的情况下，其继续产生阳性信号，而1289012是CRE，其中blaKPC-3是与CRE表型相关的机制，因为在美罗培南和blaKPC-3肽-PNA存在的情况下，其不再产生阳性信号。第4列证明1289011和1289012是CRE，并且与CRE表型相关的机制不是blaNDM-1，因为在美罗培南和blaNDM-1肽-PNA存在的情况下，其继续产生阳性信号，而
1289014是CRE，其中blaNDM-1是与CRE表型相关的机制，因为在美罗培南和blaNDM-1肽-PNA存在的情况下，其不再产生阳性信号。
提供阳性信号。第3列证明1289011和1289014是CRE，并且与CRE表型相关的机制不是
blaKPC-3，因为在美罗培南和blaKPC-3肽-PNA存在的情况下，其继续产生阳性信号，而1289012是CRE，其中blaKPC-3是与CRE表型相关的机制，因为在美罗培南和blaKPC-3肽-PNA存在的情况下，其不再产生阳性信号。第4列证明1289011和1289012是CRE，并且与CRE表型相关的机制不是blaNDM-1，因为在美罗培南和blaNDM-1肽-PNA存在的情况下，其继续产生阳性信号，而
1289014是CRE，其中blaNDM-1是与CRE表型相关的机制，因为在美罗培南和blaNDM-1肽-PNA存在的情况下，其不再产生阳性信号。
[0179] 从这些结果可以确定，大肠杆菌的各菌株中与碳青霉烯抗性相关的机制对于1289012是blaKPC-3，对于1289014是blaNDM-1，且1289011中既不是blaKPC-3，也不是blaNDM-1。
[0180] 实施例4：经由使用CRISPR/Cas9的AST细胞-报道物测试来测定与不敏感表型相关的特异性β-内酰胺酶。
[0181] 在本实施例中，使用设计用于靶向质粒编码的β-内酰胺酶基因的CRISPR/Cas9系统来修饰实施例3中所述的AST技术以测定与CRE表型相关的特异性β-内酰胺酶。
[0182] 用报道质粒设计如PCT/US2014/026536、实施例中所述的肠杆菌科细胞报道分子，所述报道质粒也携带具有CRISPR基因座的单引导[14] CRISPR/Cas9系统，所述CRISPR基因
座携带靶向blaNDM-1和blaSHV-18基因((表1，SEQ ID NO 11和13)，分别为碳青霉烯抗性和延长的β-内酰胺抗性基因)的序列。报道质粒pGWP10001被修饰为包括cas9基因，PL(tetO-1)启动子的控制下的tracrRNA和CRISPR克隆位点，并且CRISPR基因座被设计为靶向blaNDM-1 (SEQ ID NO 4)和blaSHV-18 (SEQ ID NO 5)基因，并且将各自克隆至pGWP10001/CRISPR/Cas9载体中以产生同时靶向blaNDM-1和blaSHV-18基因的报道质粒。
座携带靶向blaNDM-1和blaSHV-18基因((表1，SEQ ID NO 11和13)，分别为碳青霉烯抗性和延长的β-内酰胺抗性基因)的序列。报道质粒pGWP10001被修饰为包括cas9基因，PL(tetO-1)启动子的控制下的tracrRNA和CRISPR克隆位点，并且CRISPR基因座被设计为靶向blaNDM-1 (SEQ ID NO 4)和blaSHV-18 (SEQ ID NO 5)基因，并且将各自克隆至pGWP10001/CRISPR/Cas9载体中以产生同时靶向blaNDM-1和blaSHV-18基因的报道质粒。
[0183] 使用载体来产生携带每种质粒的非复制型转导颗粒，并且这些用于报道系统中以确定负责β-内酰胺不敏感性的机制。简而言之，制备大肠杆菌1289018 (blaNDM-1，blaSHV-18-阴性)、1289023 (blaNDM-1-阳性)、1289027 (blaSHV-阳性)和1289011 (blaVIM-阳性)的培养物，并将其用于接种含有50μL LB与50μL接种物的微孔板的孔，使得每孔接受104 CFU的每种细菌菌株。向这些孔中添加100μL以下物质：一组孔含有5 μg/mL美罗培南和blaNDM-1-靶向NRTP，另一组孔含有5 μg/mL美罗培南和blaSHV-18-NRTP，另一组孔含有5 μg/mL头孢他啶和blaNDM-1-靶向NRTP，且另一组孔含有5 μg/mL头孢他啶和blaSHV-18-NRTP。然后将样品在30℃下温育2小时，然后如实施例1中所述测定样品的发光。
[0184] 图6描述了细胞-报道物AST测定的结果，其中+表明报道物测定产生阳性结果，并且-表明报道物测定产生阴性结果。
[0185] 第1行表明菌株1289018被美罗培南和头孢他啶抑制，而不考虑哪个NRTP被包括在测定中，因此可能既不携带blaNDM-1，也不携带blaSHV-18。第2行表明，当存在blaNDM-1-靶向NRTP时，菌株1289023仅被β-内酰胺类抑制，因此可能携带blaNDM-1基因。第3行表明菌株
1289027在美罗培南存在下被抑制，并且只有在存在blaSHV-18-靶向NRTP使才在头孢他啶存在的情况下被抑制，因此可能携带blaSHV-18基因。第4行表明菌株1289011不被任何β-内酰胺类抑制，而不考虑测定中包括的NRTP，因此可能携带仅由blaNDM-1介导的碳青霉烯抗性机制。
1289027在美罗培南存在下被抑制，并且只有在存在blaSHV-18-靶向NRTP使才在头孢他啶存在的情况下被抑制，因此可能携带blaSHV-18基因。第4行表明菌株1289011不被任何β-内酰胺类抑制，而不考虑测定中包括的NRTP，因此可能携带仅由blaNDM-1介导的碳青霉烯抗性机制。
[0186] 从这些结果可以确定菌株1289023中与β-内酰胺抗性表型相关的机制是blaNDM-1，并且在菌株1289027中是blaSHV-18。
[0187] 实施例5：万古霉素抗性的肠球菌测定。
[0188] 在另一个实施方案中，可以开发用于检测万古霉素抗性肠球菌(VRE)的测定法。
[0189] VRE由肠球菌属组成，所述肠球菌属已经经由抗性基因(包括vanA和vanB基因)获得万古霉素抗性。肠球菌属携带其它万古霉素抗性基因且表达其它万古霉素抗性表型(包
括由包括vanC-1、vanC-2和vanC-3的基因编码的VanC表型)，然而，这些生物不被认为是
VRE。
括由包括vanC-1、vanC-2和vanC-3的基因编码的VanC表型)，然而，这些生物不被认为是
VRE。
[0190] 在本实施例中，肠球菌细胞报道物与靶向vanC-2基因表达的万古霉素和反义分子组合使用。该测定允许检测VRE和区分万古霉素敏感性肠球菌(VSE)和表达vanC-2基因而非
vanA或vanB基因的肠球菌。设计肠球菌报道物以引起肠球菌属产生可检测信号。设计肽-
PNA以靶向vanC-2转录物。分析铅黄肠球菌1279015(表达vanC-2基因(表1，SEQ ID NO 14)
的临床分离株)中的靶基因的基因序列，以鉴定该基因的TIR的序列。使用靶向TIR内的区域的9-12 bp的反义序列来设计潜在PNA。可以从该分析鉴定用于靶向vanC-2基因(SEQ ID NO
6)的PNA的潜在结合位点。
vanA或vanB基因的肠球菌。设计肠球菌报道物以引起肠球菌属产生可检测信号。设计肽-
PNA以靶向vanC-2转录物。分析铅黄肠球菌1279015(表达vanC-2基因(表1，SEQ ID NO 14)
的临床分离株)中的靶基因的基因序列，以鉴定该基因的TIR的序列。使用靶向TIR内的区域的9-12 bp的反义序列来设计潜在PNA。可以从该分析鉴定用于靶向vanC-2基因(SEQ ID NO
6)的PNA的潜在结合位点。
[0191] 简而言之，制备VSE粪肠球菌1259012、vanA-阳性VRE粪肠球菌1259016、VSE屎肠球菌1269011、vanB-阳性VRE屎肠球菌1269014和vanC-2-阳性万古霉素不敏感性铅黄肠球菌1279015的培养物，并将其用于接种含有50μL LB与50μL接种物的微孔板的孔，使得每孔接受104 CFU的每种细菌菌株。一组孔不含额外添加剂，另一组孔含有5 μg/mL万古霉素，且另一组孔含有5 μg/mL万古霉素和vanC-2-肽-PNA。所有孔也接受100μL的肠球菌报道物。然后将样品在37 °C下温育2小时，然后如实施例1中所述测定样品的发光。
[0192] 图7描述了细胞-报道物测定的结果，其中+表明报道物测定产生阳性结果，并且-表明报道物测定产生阴性结果。
[0193] 第1列表明肠球菌报道分子为所有肠球菌属种提供阳性信号。第4列证明肽-PNA不抑制任何菌株中的阳性结果。第2列表明所有表达van基因的菌株继续提供阳性信号，而不
携带van基因的菌株则不提供。第3列表明只有表达vanA或vanB基因的菌株才持续提供阳性
信号。
携带van基因的菌株则不提供。第3列表明只有表达vanA或vanB基因的菌株才持续提供阳性
信号。
[0194] 因此，这些结果证明，这样将肠球菌报道物以及万古霉素和靶向vanC-2基因表达的反义分子组合的测定法可用于检测VRE。
[0195] 实施例6：假丝酵母报道物测定。
[0196] 在另一个实施方案中，可以开发用于鉴定假丝酵母的真菌学测定。
[0197] 应用设计用于使酵母细胞产生可检测或可选择标记的酵母报道系统以及靶向物种特异性序列的反义分子。当将该系统应用于含有靶物种的样品时，反义分子引起靶细胞
的信号、存活和/或生长的抑制。
的信号、存活和/或生长的抑制。
[0198] 报道质粒基于大肠杆菌/酵母载体pLG5，其包括在GAL1启动子的控制下的融合的哈维氏弧菌（V. harveyi）细菌荧光素酶(15,16)。设计物种特异性反义分子以靶向酵母中的内部转录间隔区(ITS)区域内的序列。ITS由位于转录物上的核糖体RNA(rRNA)序列之间
的非功能性RNA的区段组成，在rRNA成熟过程中从所述转录物切除ITS。假丝酵母属中的内
部转录间隔区2(ITS2)表现出可用于鉴定不同种类的假丝酵母的序列特异性(17)，并且通
过反义分子破坏rRNA成熟表现出杀真菌作用(18)。图8包括用于产生靶向每种物种的2’-
OMe修饰的反义寡核苷酸(AON)的ITS2序列的列表。
的非功能性RNA的区段组成，在rRNA成熟过程中从所述转录物切除ITS。假丝酵母属中的内
部转录间隔区2(ITS2)表现出可用于鉴定不同种类的假丝酵母的序列特异性(17)，并且通
过反义分子破坏rRNA成熟表现出杀真菌作用(18)。图8包括用于产生靶向每种物种的2’-
OMe修饰的反义寡核苷酸(AON)的ITS2序列的列表。
[0199] 通过在每种物种的TS2序列之间进行序列比对来设计用于靶向每种物种的反义序列。选择基于比对数据对每种物种是独特的9-12bp的序列，并且对于来自潜在交叉反应生
物的文库的基因组数据间的同源性分析这些序列候选物。可以从该分析序列选择对于每种
靶物种是独特的。
物的文库的基因组数据间的同源性分析这些序列候选物。可以从该分析序列选择对于每种
靶物种是独特的。
[0200] 基于该分析，对于白色假丝酵母（Candida albicans）、热带假丝酵母（Candida tropicalis）和近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）设计AON序列(分别为SEQ ID NO 7、8和9)。
[0201] 简而言之，经由完整的细胞转化，用报道质粒和AON转化白色假丝酵母5120012、热带假丝酵母5160014和近平滑假丝酵母5150013 (16)。将样品温育24小时的时段，并如实施例1中所述测定发光(19)。
[0202] 图9描述了用于假丝酵母属鉴定的AON的组合的测定设置。显示细胞-报道物测定的结果，其中+表明报道物测定产生阳性结果，并且-表明报道物测定产生阴性结果。
[0203] 第1列表明报道物为测定中测试的所有生物提供阳性信号。第2-5列表明，当测定中包括靶向特定物种的AON时，含有那些物种的样品则在测定中产生阴性结果，而含有靶向该物种的AON不存在于测定中的物种的样品导致阳性结果。
[0204] 因此，这些结果证明，这样将酵母报道物以及靶向物种特异性ITS2衍生序列的反义寡核苷酸分子组合的测定法可用于检测假丝酵母的特定物种。
[0205] 尽管本发明已就优选实施方案和各种替代实施方案而言进行具体显示且描述，但相关领域技术人员应理解可以在其中作出形式和细节中的各种变化，而不背离本发明的精
神和范围。
神和范围。
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