技术领域
[0001] 本
发明属于
生物技术领域，具体属于基因工程领域，更具体涉及一种硫酸基转移酶的编码基因及其蛋白质。
背景技术
[0002] 硫
酸化反应在各种外源物和内源物，如药物、
食品添加剂、致癌物、甾体
激素、神经递质的生物转化过程中是一种重要的结合反应。硫酸基转移酶(sulfotransferase，SULT)超家族主要负责催化这一反应。硫酸基转移酶催化3
磷酸腺苷-5磷酸
硫酸盐(PAPS)的硫酰基(SO3-)转移至外源物和内源物，降低其生物活性和增加其排泄率。人的硫酸基转移酶在很多组织器官中表达，是人体内主要的解毒酶，而且与药-药相互作用、激素调节、
肿瘤疾病等有密切关系。因此，研究硫酸基转移酶具有重大意义。
[0003] 1987年首先在大鼠中克隆出SULT2A2，原先认为其是一种衰老标记蛋白，此后相继克隆和鉴定出为硫酸基转移酶基因家族成员。到目前为止，至少发现有9个硫酸基转移酶家族和14个亚家族。同一家族成员至少具有45％的相同
氨基酸序列，同一亚家族至少具有60％的相同氨基酸序列。
[0004] 目前已经鉴定到了14个人来源的硫酸基转移酶(hSULTs)，根据氨基酸序列的一致性被分为4个家族(hSULT1、hSULT2、hSULT4、hSULT6)，除了hSULT1C3a和hSULT6B1外，其余12个hSULTs的结构已经被解析。
[0005] 硫酸基转移酶能够以儿茶酚胺类、类固醇类以及酚类的多种小分子物质为硫基受体，3磷酸腺苷-5磷酸硫酸盐(PAPS)为硫基供体发生转硫基反应。但硫酸基转移酶的底物特异性差别较大，同一家族甚至亚家族内成员的底物特异性可能相差较大。根据全序列的一致性、底物结合位点序列一致性、底物结合位点结构相似性以及催化活性谱等不同依据对硫酸基转移酶进行
聚类分析，可以得到不同的分类结果。研究发现，对硝基
苯酚(PNP)是硫酸基转移酶较通用的受体底物。
[0006] 硫酸基转移酶在很多药物、前致癌物以及内源性化合物的代谢方面起着至关重要的作用，其研究结果必然影响着药物的代谢过程和疗效，关系着人体对前致癌物的解毒能
力，调节着
机体内分泌的平衡。今年来，越来越多的研究涉及到硫酸基转移酶成员的基因多态性，但目前分离鉴定到的新的硫酸基转移酶仍然较少。
发明内容
[0007] 本发明提供了一种硫酸基转移酶的编码基因及其蛋白质，所述基因来源于
角叉菜(Chondrus crispus)，命名为GcrSULT基因，其编码的蛋白质为硫酸基转移酶。
[0008] 一方面，本发明提供了一种硫酸基转移酶的编码基因，所述的硫酸基转移酶的编码基因的编码产物为硫酸基转移酶，所述的硫酸基转移酶的编码基因为GcrSULT基因；所述的GcrSULT基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列。
[0009] 另一个方面，本发明提供了一种硫酸基转移酶，所述的硫酸基转移酶由上述GcrSULT基因所编码；所述的硫酸基转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的序列。
[0010] 再一个方面，本发明还提供了含有上述GcrSULT基因的载体或基因工程细胞。
[0011] 所述的载体可以为原核细胞表达载体或真核细胞表达载体。
[0012] 所述的真核细胞表达载体选自：
酵母表达载体、昆虫细胞表达载体或
哺乳动物细胞表达载体。
[0013] 所述的原核细胞表达载体可以为pMCSG9载体，pGEX表达载体或pET表达载体。
[0014] 所述的pGEX表达载体包括但不限于：pGEX-2T载体、pGEX-2TK载体、pGEX-4T载体、pGEX-3X载体、pGEX-5X载体、pGEX-6P载体、pGEX-KG载体等。
[0015] 所述的pET表达载体包括但不限于：pET-22载体、pET-28载体、pET-30载体、pET-32载体、pET-34载体、pET-40载体或pET-42载体等。
[0016] 所述的基因工程细胞包括但不限于：大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、乳酸菌细胞或毕赤酵母细胞等。
[0017] 本发明的有益效果为：本发明提供的基因及其编码的蛋白质具有硫酸基转移酶的功能；且底物特异性与已知的其他硫酸基转移酶均不完全相同。本发明提供的硫酸基转移酶的基因及其编码的蛋白质为硫酸基转移酶家族的研究提供了优异的基因资源和酶资源。
附图说明
[0018] 图1为
实施例4中的GcrSULT基因转化大肠杆菌BL21表达产物纯化后的聚丙烯酰胺凝胶
电泳图。
[0019] 图2为实施例5中的GcrSULT基因转化大肠杆菌BL21表达蛋白的比色法检测酶活结果图。
[0020] 图3为实施例5中的电喷雾质谱法(ESI-MS)检测GcrSULT蛋白的底物特异性结果图。
具体实施方式
[0021] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明
权利要求的保护范围内。
[0022] 除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
[0023] 实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品
说明书进行。
[0024] 实施例1角叉菜中GcrSULT基因的获取
[0025] 根据角叉菜(Chondrus crispus)全基因组序列信息，得到1个硫酸基转移酶基因，命名为GcrSULT基因，其中所述的GcrSULT基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列。对GcrSULT基因进行全序列合成(委托上海旭冠生物科技发展有限公司进行合成)，同时在两端引入EcoRI和NotI酶切位点及相应保护
碱基，得到GcrSULT基因。GcrSULT基因的CDS序列全长为981bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码326个氨基酸，以ATG为起始密码子，TAA为终止密码子。
[0026] 实施例2GcrSULT基因的克隆表达
[0027] 将实施例1得到的GcrSULT基因
片段连接至pMCSG9载体(购自淼灵生物公司)的EcoRI和NotI位点之间，获得pMCSG9-GcrSULT重组载体；将获得的pMCSG9-GcrSULT重组载体转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞(购自Takara公司)中，并涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养平板上，37℃培养过夜；将阳性克隆接种至含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌液OD600为0.6时，加入终浓度为0.2mM IPTG，在16℃、160rpm的诱导条件下，经20h诱导目的蛋白的表达。
[0028] 实施例3pMCSG9-GcrSULT蛋白的分离纯化
[0029] 收集实施例2诱导表达得到的菌液，共收集3L菌液，离心后收集菌体加入裂解液，裂解液为20mM Tris-HCl，500mM NaCl，10mM咪唑，pH 7.5溶液；在
冰上对菌体进行超声
破碎，12000rpm，10min离心取上清，将上清液用5ml Ni2+纯化，100mM咪唑洗脱。洗脱样品
透析至20mM Tris-HCl，500mM NaCl并用TEV酶切过夜，之后流过三次Ni2+柱除去MBP标签，最后透析至200mM NaCl，pH 7.5缓冲液。得到纯化后的蛋白，该重组蛋白为GcrSULT基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，命名为GcrSULT蛋白，功能为硫酸基转移酶。
[0030] 实施例4重组蛋白的鉴定
[0031] 对实施例3获得的GcrSULT蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳图如图1所示，GcrSULT蛋白的分子量大小符合预期值36.7kDa。
[0032] 实施例5GcrSULT蛋白的功能验证
[0033] (1)比色法检测酶活
[0034] 对硝基苯酚(PNP)在400nm处有可见光吸收峰，当反应体系中的PNP被消耗后，溶液的A400值会降低，因此可以用比色法检测GcrSULT蛋白以PNP作底物的活性。反应体系200μl包含：50mM
磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，PAPS 500μM，200μM PNP，4.6μM 153。37℃反应2h，每分钟测A400。结果如图2所示。由图2的结果可知，反应体系的△A400值随时间而降低，证明GcrSULT蛋白能够以PNP为底物进行催化反应。
[0035] (2)质谱法检测底物特异性
[0036] 电喷雾质谱法(ESI-MS)检测GcrSULT蛋白的底物特异性。
[0037] 选择分属于儿茶酚胺类、类固醇、酚类以及糖类四个不同类别的13种含有羟基的物质作为硫基受体底物，3磷酸腺苷-5磷酸硫酸盐(PAPS)为硫基供体底物进行反应。
[0038] 100μl反应体系：含有250μM PAPS，100μM受体底物，4μM酶溶液(20μl，透析至10mM NH4OAc)，10mM NH4OAc(pH 7.0)作为缓冲液。各不同底物组设置灭活酶样品作为阴性对照。37℃反应2h，100℃加热10min终止反应，离心后取上清，ESI-MS负离子模式检测反应产物。
检测到目标产物的6组的质谱图如图3所示。
[0039] (3)GcrSULT蛋白与hSULTs底物特异性比较
[0040] 将GcrSULT蛋白与部分人来源的硫酸基转移酶(hSULTs)的受体底物特异性1进行比较(√表示能够作为受体底物)，结果如下表所示：
[0041]
[0042] GcrSULT的受体底物有雌二醇，雌酚
酮，1-
萘酚，4-乙基苯酚，4-硝基苯酚，
白藜芦醇，由上述受体底物的共同特征为具有单酚羟基，而临位和间位存在双酚羟基的物质不能作为GcrSULT的底物，推测可能是第二个酚羟基阻碍了底物与酶催化中心的结合。GcrSULT与上述8个hSULTs的受体底物特异性均不完全相同，可知GcrSULT具有特殊的底物结合机制。
[0043] 上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的
专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。
