一类新型万古霉素和去甲万古霉素的衍生物,制备方法和用途
阅读：969发布：2021-06-09
专利汇可以提供一类新型万古霉素和去甲万古霉素的衍生物,制备方法和用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及通式(I)的万古霉素或去甲万古霉素的衍 生物 或其可药用盐、 溶剂 化物、立体异构体或前药，其中R1、R2、R3和R4如 说明书 中所定义。，下面是一类新型万古霉素和去甲万古霉素的衍生物,制备方法和用途专利的具体信息内容。
1.通式(I)的万古霉素或去甲万古霉素的衍生物或其可药用 盐、溶剂化物、立体异构体或前药：
其中：
R1是H或-CH2-R5，其中R5是C1-C20饱和或不饱和的烃性质的脂族 基团，例如C1-C20烷基(alkyl)，C2-C20链烯基(alkenyl)，或是 C3-C20饱和或不饱和环脂族基团(cycloaliphatic group)，例如C3-C20 环烷基(cycloalkyl)或C3-C20环烯基(cycloalkenyl)，或是C5- C20杂环基团(heterocycle)(杂环含有选自N、O或S中的一个或多 个杂原子)，或是C6-C30芳基，烷芳基或芳烷基(aryl，alkaryl，aralkyl group)，该芳基、烷芳基或芳烷基可以含有一个或多个芳环或稠环，
上述所有基团是未取代的，或被例如卤素，芳基，OH，氨基等取 代，其碳链任选可以插入选自O、N和S中的一个或多个杂原子(the chains of all group described above may be interupted by one or more hetero atom)；
R2是OH，或-NH-R8，其中其中R8是烷基，链烯基，环烷基，环烯 基，芳烷基，烷芳基和杂环基，这些基团可以是取代或未取代的，其 碳链任选可以插入N、O或S中的一个或多个；
R3是-H或-CN2-NH-R7，其中R7是烷基，链烯基，环烷基，环烯基， 芳烷基，烷芳基和杂环基，这些基团可以是取代或未取代的，其碳链 任选可以插入N、O或S中的一个或多个；
R4是氢或甲基。
2.根据权利要求1的万古霉素或去甲万古霉素的衍生物或其可 药用盐、溶剂化物、立体异构体或前药，其中R1是 -CH2-4-(4-Cl-Ph)-Ph，-CH2-4-(Ph-O)-Ph，-CH2-4-Ph-Ph，-CH2CH2CH2-Ph， -CH2-4-(Butyl-O)-Ph，-CH2-(CH2)9-CH3，-CH2CH2-NH-(CH2)9-CH3， -CH2CH2-S-(CH2)9-CH3，-CH2CH2-NH-CH2-4-(4-Cl-Ph)-Ph，-H， -CH2-(CH2)9-CH3；
R2是OH，-NH(CH2)3N(CH3)2，-N-(D-glucosamine)；
R3是-H，-CH2-NH-CH2-4-Ph-Ph，-CH2-NH(CH2)3N(CH3)2； -CH2-N-(N-CH2-D-glucosamine)；和
R4是-H或-CH3。
3.权利要求1的万古霉素或去甲万古霉素的衍生物的制备方 法，包括以下步骤：
A、将去甲万古霉素或万古霉素：
在三氟乙酸的存在下在升温(例如40-120℃)下反应，获得下式 的葡萄糖残基被除去的化合物NCPC4850(R4是H)或NCPC4851(R4是 CH3)：
其中R4是H或CH3。
4.根据权利要求3的制备方法，进一步包括：
B、NCPC4850或NCPC4851进行氨基的保护获得下式的化合物：
其中Pro是保护基，
上式化合物与醛R5CHO反应，获得以下化合物：
再脱保护，获得下式的化合物：
其中R5如权利要求1所定义，Pro是保护基；
或/和
C、以上步骤A或B的产物：
其中R4如以上所定义，R1为H或-CH2-R5，R5如权利要求1所定义，
与甲醛和胺R7NH2在碱性条件下反应，获得下式的化合物：
其中R7如权利要求1所定义；
或
D、以上步骤A或B的产物：
其中R1为H或-CH2-R5，R5如权利要求1所定义，
与R8NH2反应，形成以下结构式的化合物：
其中R8如以上所定义。
5.权利要求1或2的万古霉素或去甲万古霉素的衍生物或其可 药用盐、溶剂化物、立体异构体或前药在制备抗严重的G+菌感染的药 物中的用途。
6.权利要求1或2的万古霉素或去甲万古霉素的衍生物或其可 药用盐、溶剂化物、立体异构体或前药在制备治疗或/和辅助治疗心内 膜炎、脑膜炎、肺炎、败血症、急慢性骨髓炎、烧伤感染、皮肤或软 组织化脓性感染的药物中的用途。
7.含有药学有效量的权利要求1或2的万古霉素或去甲万古霉 素的衍生物或其可药用盐、溶剂化物、立体异构体或前药的药物组合 物。
发明领域
本发明涉及一类新型万古霉素和去甲万古霉素的衍生物，制备方 法及其在制备抗感染，尤其严重感染的药物中的用途。
背景技术
糖肽抗生素(二丙庚肽)对几乎所有G+性菌具有活性，在临床上 用于严重的G+性菌感染的治疗，代表着对付这类难治性疾病的最后防 线，见Glycopeptide Antibiotics，edited by R.Nagarajan，Marcel Dekker，Inc.New York(1994))。随着80年万古霉素耐药性肠球 菌(VRE)的出现，糖肽耐药性肠球菌不断增多，近期甚至出现了糖肽 耐药基因从肠球菌向其它菌转移的现象，如金黄色葡萄球菌对β-内酰 胺类抗生素及万古霉素耐药株的增加；肠球菌对β-内酰胺类抗生素、 氨基糖甙类抗生素及万古霉素耐药株的增加等等，由于尚缺乏治有效 治疗糖肽耐药菌感染的药物，糖肽耐药性已成为威胁人类生存和健康 的一大难题，见Hospital Infection Control Practices Advisory Committee，Infection Control Hopital Epidemiology， 1995，17，364-369；A.P.Johnson et al.，Clinical Microbiology Rev.，1990，3，280-291；G.M.Eliopoulos，European J.Clinical Microbiol.，Infection Disease，1993，12，409-412；and P. Courvalin，Antimicrob.Agents Chemother，1990，34，2291- 2296)。
从已有的研究发出，肠球菌的糖肽耐药表现型有5种，即VanA， VanB，VanC，VanD和VanE型。为了更有效的控制耐药菌，近年来很 重视糖肽类新药的开发。已经对许多糖肽抗生素衍生物进行了研究， 见美国专利，专利号4,639,433、4,643,987、4,497,802、4,698,327、 5,591,714、5,840,684、5,843,889。其它衍生物在EP 0 802 199； EP 0 801 075；EP 0 667 353；WO 97/28812；WO 97/38702；WO 98/52589； WO 98/52592；J.Amer.Chem.Soc.，1996，118，13107-13108； J.Amer.Chem.Soc.，1997，119，12041-12047；J.Amer.Chem.Soc.， 1994，116，4573-4590中已经公开。由Eli Lilly company开发的 Oritavancin，已经进入了III期临床阶段。尽管如此，仍然需要开发 抗菌谱广，抗菌活性更高，对人体毒副作用更低的糖肽衍生物。
从已有的研究发出，肠球菌的糖肽耐药表现型有5种，即VanA， VanB，VanC，VanD和VanE型。为了更有效的控制耐药菌，近年来很 重视糖肽类新药的开发。已经对许多糖肽抗生素衍生物进行了研究， 见美国专利，专利号4,639,433、4,643,987、4,497,802、4,698,327、 5,591,714、5,840,684、5,843,889。其它衍生物在EP 0 802 199； EP 0 801 075；EP 0 667 353；WO 97/28812；WO 97/38702；WO 98/52589； WO 98/52592；J.Amer.Chem.Soc.，1996，118，13107-13108； J.Amer.Chem.Soc.，1997，119，12041-12047；J.Amer.Chem.Soc.， 1994，116，4573-4590中已经公开。由Eli Lilly company开发的 Oritavancin，已经进入了III期临床阶段。尽管如此，仍然需要开发 抗菌谱广，抗菌活性更高，对人体毒副作用更低的糖肽衍生物。
发明内容
本发明的概述
发明人对万古霉素和去甲万古霉素进行了结构改造，得到了一系 列的衍生物，经过初步MIC试验，证实对耐药葡萄球菌和耐药肠球菌 的作用是去甲万古霉素(万古霉素)的数倍。
因此，本发明的一个目的是提供通式(I)的一系列万古霉素和去 甲万古霉素的衍生物及其可药用盐、溶剂化物、立体异构体或前药：
其中：
R1是H或-CH2-R5，其中R5是C1-C20饱和或不饱和的烃性质的脂族 基团，例如C1-C20烷基(alkyl)，C2-C20链烯基(alkenyl)，或是 C3-C20饱和或不饱和环脂族基团，例如C3-C20环烷基或C3-C20环烯基， 或是C5-C20杂环基团(杂环含有选自N、O或S中的一个或多个杂原子)， 或是C6-C30芳基，烷芳基或芳烷基(aryl，alkaryl，aralkyl group)， 该芳基、烷芳基或芳烷基可以含有一个或多个芳环或稠环，
上述所有基团是未取代的，或被例如卤素、芳基，OH，氨基等取 代，其碳链任选可以插入选自O、N和S中的一个或多个杂原子(hetero atom)；
R2是OH，或-NH-R8，其中其中R8是烷基，链烯基，环烷基，环烯 基，芳烷基，烷芳基和杂环基，这些基团可以是取代或未取代的，其 碳链任选可以插入N、O或S中的一个或多个；
R3是-H或-CH2-NH-R7，其中R7是烷基，链烯基，环烷基，环烯基， 芳烷基，烷芳基和杂环基，这些基团可以是取代或未取代的，其碳链 任选可以插入N、O或S中的一个或多个；
R4是氢或甲基。
优选的是，R1是-CH2-4-(4-Cl-Ph)-Ph，-CH2-4-(Ph-O)-Ph， -CH2-4-Ph-Ph，-CH2CH2CH2-Ph，-CH2-4-(Butyl-O)-Ph，-CH2-(CH2)9-CH3， -CH2CH2-NH-(CH2)9-CH3，-CH2CH2-S-(CH2)9-CH3，-CH2CH2-NH-CH2-4-(4-Cl-Ph)-Ph， -H，-CH2-(CH2)9-CH3；
R2是OH，-NH(CH2)3N(CH3)2，-N-(D-glucosamine)；
R3是-H，-CH2-NH-CH2-4-Ph-Ph，-CH2-NH(CH2)3N(CH3)2； -CH2-N-(N-CH2-D-glucosamine)；和
R4是-H或-CH3。
本发明的第二个目的是提供上述通式化合物的制备方法，包括以 下步骤：
A、将去甲万古霉素或万古霉素在三氟乙酸的存在下升温(例如 40-120℃)下反应，获得葡萄糖残基被除去的化合物NCPC4850或 NCPC4851：
其中R4是H或CH3。
本发明化合物的制备方法可以进一步包括：
B、NCPC4850或NCPC4851进行氨基的保护获得下式的化合物：
其中Pro是保护基，
上式化合物与醛R5CHO反应，获得以下化合物：
再脱保护，获得下式的化合物：
其中R5如以上所定义，Pro是保护基；
或/和
C、以上步骤A或B的产物：
其中R4如以上所定义，R1为H或-CH2-R5，R5如以上所定义， 与甲醛和胺R7NH2在碱性条件下反应，获得下式的化合物：
其中R7如以上所定义；
或
D、以上步骤A或B的产物：
其中R1为H或-CH2-R5，R5如以上所定义， 与R8NH2反应，形成以下结构式的化合物：
其中R8如以上所定义。
本发明的又一个目的是提供上述化合物在制备抗严重的G+菌感染 的药物，尤其是治疗或/和辅助治疗心内膜炎、脑膜炎、肺炎、败血症、 急慢性骨髓炎、烧伤感染、皮肤或软组织化脓性感染的药物中的用途。
本发明的再一个目的是提供含有有效量的上述本发明化合物的药 物组合物，本发明的药物组合物还可以含有本领域公知的载体，如赋 型剂，稀释剂，香味剂，甜味剂等。
本发明的详细描述
我们将去甲万古霉素(万古霉素)在三氟乙酸存在的条件下，加 热反应后经过一系列后处理，得到了结构单一的化合物，经过高分辨 质谱、NMR等分析技术确定了该化合物的化学结构，NCPC4850 (NCPC4851)。
R＝H，Norvancomycin R＝H，NCPC4850
R＝CH3，Vancomycin R＝CH3，NCPC4851
Molecular Formula ＝C65H73Cl2N9O24 Molecular Formula＝C59H63Cl2N9O19
Formula Weight ＝1435.227 Formula Weight ＝1273.086
Exact Mass Calcd. ＝1433.414557 Da Exact Mass Calcd.＝1271.381732 Da
Exact Mass Obsd. ＝1433.4146 Da Exact Mass Obsd. ＝1271.3617 Da
Norvancomycin NCPC4850
该化合物可能的生成机理是去甲万古霉素分子(结构如上面左) 中的葡萄糖残基(glucose moiety)水解脱去，而另外一个糖(万古糖 残基vancosmine moiety)通过分子内重排(如上面箭头所示)直接连 到去甲万古霉素多肽骨架上。化合物的化学结构已经通过对 NCPC4850的进一步化学反应得到了证实。
去甲万古霉素和NCPC4850的13C NMR(500MHz，D2O，ppm) 数据如下表：
表1 碳原子位置 去甲万古霉素 NCPC4850 碳原子位置 去甲万古霉素 NCPC4850 A-CO 170.4 170.5 D-1’ 56.9 56.9 A-1 139.7 139.9 E-CO 169.4 169.2 A-2 127.3 127.2 E-1 127.3 127.3 A-3 124.0 124.4 E-2 135.7 135.7 A-4 149.9 149.8 E-3 121.7 121.7 A-5 126.1 126.1 E-4 155.0 156.5 A-6 128.7 128.7 E-5 116.2 116.2 A-1’ 71.5 71.6 E-6 125.4 125.5 A-2” 58.8 58.3 E-1’ 53.7 53.8 B-CO 169.1 169.2 Asn-CO 167.3 167.3 B-1 134.7 134.6 Asn-α 51.1 50.9 B-2 107.1 107.0 Asn-β 37.3 37.5 B-3 151.2 151.4 Asn-γ-CO 171.1 170.8 B-4 131.9 131.9 Leu-CO 173.9 174 B-5 152.1 155.1 Leu-α 30.6 61.8 B-6 104.6 104.6 Leu-β 42.6 42.6 B-1’ 54.7 54.9 Leu-γ 23.9 24.1 C-CO 167.5 167.8 Leu-δ 23.2 22.9 C-1 142.5 142.6 Leu-δ 21.6 22.3 C-2 127.3 127.2 Glu-1 101.2 - C-3 126.1 126.2 Glu-2 78.0 - C-4 148.3 148.3 Glu-3 76.7 - C-5 123.3 123.5 Glu-4 70.2 - C-6 126.1 126.2 Glu-5 77.0 - C-1’ 71.1 71.1 Glu-6 61.2 - C-2” 61.8 61.9 Van-1 96.7 100.6 D-CO 172.8 172.7 Van-2 33.3 34.2 D-1 136.5 136.3 Van-3 53.9 54.8 D-2 105.9 105.8 Van-3-CH3 22.3 22.6 D-3 157.1 159.6 Van-4 70.7 70.8 D-4 102.3 102.3 Van-5 63.1 63.2 D-5 156.4 157.2 Van-5-CH3 16.8 16.9 D-6 118.0 118.0
去甲万古霉素和化合物NCPCC4850的高分辨质谱数据如下：
Molecular Formula＝C65H73Cl2N9O24 Molecular Formula＝C59H63Cl2N9O19
Formula Weight ＝1435.227 Formula Weight ＝1273.086
Exact Mass Calcd.＝1433.414557 Da Exact Mass Calcd.＝1271.361732 Da
Exact Mass Obsd.＝1433.4146 Da Exact Mass Obsd. ＝1271.3617 Da
Norvancomycin NCPC4850
通过对化合物NCPC4850(NCPC4851也同)进行下列反应(还原胺基 化)得到如式(1)的衍生物：
Cbz-NCPC4850的合成(氨基的保护)：将NCPC4850(128mg，0.10mmol) 溶解到5ml 1∶1的1，4-二氧六环/水中，加入NaHCO3(17mg，0.20mmol)， 然后在冰浴并剧烈搅拌的情况下逐滴加入Cbz-Cl(17mg，0.11mmol)。反 应液在室温下搅拌1小时后倒入75ml丙酮沉淀。沉淀物用10ml丙酮 分两次洗涤，真空下干燥。
Cbz-NCPC4850-CH2R的合成(胺基化)：将0.10mmol的Cbz- NCPC4850，0.15mmol的醛溶解到5ml的DMF/MeOH(1∶1)。反应液在 65℃下搅拌48小时后加入0.20mmol的NaCNBH3，继续搅拌24小时， 反应液冷却后倒入75ml丙酮沉淀。沉淀物用10ml丙酮分两次洗涤， 真空下干燥。
NCPC4850-CH2R的合成(还原)将0.10mmol的以上沉淀溶解到7ml 的RMF，加入50mg的Pd/C(5％)，在～1atm、室温下氢化3小时， 催化剂过滤除去后将反应液倒入80ml丙酮，沉淀用反相HPLC纯化。 全程收率30-65％。
其中R-CHO的普通醛，例如甲醛，乙醛，丙烯醛，丙醛，戊醛，己醛， 庚醛，苯甲醛，苯乙醛等，即R是烷基，烯基，芳基，芳烷基，烷芳 基等。
式(1)的化合物也可通过以下反应步骤得到：
Boc-NCPC4850的合成(氨基的保护)：将NCPC4850(128mg， 0.10mmol)、(Boc)2O(21.8mg，0.11mmol)以及NaHCO3(17mg，0.20mmol) 溶解到5ml的1，4-二氧六环/水(1∶1)中，反应液在室温下搅拌6小时后 倒入75ml丙酮沉淀。沉淀物用10ml丙酮分两次洗涤，真空下干燥。
Boc-NCPC4850-CH2R的合成(胺基化)：将0.10mmol的Boc- NCPC4850，0.15mmol的醛溶解到5ml的DMF/MeOH(1∶1)中。反应液 在65℃下搅拌48小时后加入0.20mmol的NaCNBH3，继续搅拌24小 时，反应液冷却后倒入75ml丙酮沉淀。沉淀物用10ml丙酮分两次洗 涤，真空下干燥。
NCPC4850-CH2R的合成(还原)：0.10mmol的以上沉淀悬浮到10ml 氯仿，缓慢滴加2ml TFA。溶液在室温搅拌20分钟后倒入50ml乙醚 沉淀，沉淀用制备型HPLC纯化。全程收率20-60％。
其中R-CHO的普通醛，例如甲醛，乙醛，丙烯醛，丙醛，戊醛，己醛， 庚醛，苯甲醛，苯乙醛等，即R是烷基，烯基，芳基，芳烷基，烷芳 基等。
以上所述的均为一般醛，也可用氨基取代醛进行还原烷基化，氨基取 代醛可用如下方法制备；
将2-氨基乙醛缩二甲醇(1eq.)，以上所述的普通醛RCHO(1.05eq)， 和NaCNBH3(1eq)在CH2Cl2中的溶液在室温下搅拌1-4小时。该反应 用TLC检测。0℃下向反应混合物加入FmocCl(1eq)和DIPEA(2eq)。 室温下继续搅拌1-2小时。真空中除去溶剂，并且通过反相HPLC纯 化残余物得到氨基取代乙缩醛。向上述氨基取代乙缩醛在丙酮中的溶 液内加入6N HCl(1.5eq.)。室温下将反应搅拌5-16小时。真空中除去 溶剂且在高真空下干燥残余物，得到氨基取代醛的粗产物，不需要进 一步纯化即可使用。
也可用硫取代醛进行胺基化，硫取代醛的制备如下：
将溴乙缩醛(1eq.)(如二甲基2-溴乙缩醛(dimethyl 2- bromoacetaldehyde))和碘化钠(1eq.)，在DMF中的溶液在室温下搅 拌0.5小时。向该溶液中加入取代硫醇RSH(R是烷基，烯基，芳基， 烷芳基，芳烷基等)(1.eq)，然后加入碳酸钾(1eq)。在25-80℃ 下将该混合物搅拌4-16小时。随后反应溶解在乙酸乙酯中，用水洗涤 2次且用饱和氯化钠洗涤1次。有机层用MgSO4干燥且真空中除去溶 剂。用反相HPLC纯化，得到相应的硫取代乙缩醛。
在硫取代乙缩醛在丙酮中的溶液中加入6N HCl(1.5eq.)。室温下将反应 搅拌5-16小时。真空中出去溶剂且在高真空下干燥残余物，得到硫取 代醛的粗产物，其通常不需要进一步纯化即可使用。
通过对式(1)的化合物(NCPC481也同)进行胺甲基化可得到如式 (2)的化合物：
将0.10mmol的NCPC4850，1.0mmol的胺R7NH2以及0.12mmol的甲 醛水溶液溶解到10ml的乙腈/水(1∶1)，用1M的NaOH调pH到9.5～ 10，反应液在室温下搅拌6～10小时后，用1M的HCl调pH到4～5， 倒入200ml丙酮沉淀。沉淀用反相HPLC纯化，收率30-85％。 通过对式(2)的羟基与胺的缩合(NCPC4851也同)可得到如式(3) 的化合物：
将0.10mmol的NCPC4850或其还原烷化衍生物、1.0mmol的胺R8NH2 (或胺盐)溶解到5ml的DMSO，用Et3N调pH到8.5～9，反应液搅 拌1小时后加入0.12mmol的PyBOP。反应液在室温继续搅拌3小时。 将150ml乙醚加入到反应混合物中得到油状粘稠物，油状粘稠物用 30ml乙醚分两次震荡洗涤后再用15ml丙酮处理便得到白色或淡黄色 固体。用反相HPLC纯化，收率60-90％。
用本发明的各种化合物对各种耐药菌进行了抗菌活性实验，结 果，本发明的化合物对各种耐药菌的最小抑菌浓度大大优于万古霉素 和去万古霉素，从而证实本发明的化合物可有效用于抗严重的G+菌感 染，尤其用于治疗或/和辅助治疗心内膜炎、脑膜炎、肺炎、败血症、 急慢性骨髓炎、烧伤感染、皮肤或软组织化脓性感染。
本发明的化合物可以制成非肠道给药剂型或经肠道给药剂型，如 口服或静脉注射剂型。本发明的化合物的用量可以参照万古霉素和去 甲万古霉素的现有剂量，例如成人可以为0.8-2.0g/d，可以分2-3次给 药，儿童用量酌减。本发明的化合物可以按常规方法成盐，例如制成 盐酸盐。
实施例
为了进一步阐明本发明，下面给出一系列实施例。需要指出的是， 这些实施例完全是例证性的。给出这些实施例的目的是为了充分明示 本发明的意义和内容，决不对本发明造成任何形式的限制。
在以下实施例中，下列缩写具有以下含义。未定义的缩写具有其 普遍接受的含义，除非另外声明，所有温度为摄氏度。
BOC，Boc ＝叔丁氧基羰基
Cbz-Cl ＝苄氧酰氯
DIPEA ＝二异丙基乙胺
DMF ＝N，N-二甲基甲酰胺
DMSO ＝二甲基亚砜
eq. ＝当量
Et ＝乙基
EtOAc ＝乙酸乙酯
Fmoc ＝9-芴基甲氧基羰基
HPLC ＝高效液相色谱
Me ＝甲基
PyBOP ＝苯并三唑-1-基氧三(吡咯烷子基)膦六氟磷酸盐
TFA ＝三氟乙酸
THF ＝四氢呋喃
TLC，tlc ＝薄层层析
在以下的实施例中，去甲万古霉素盐酸盐由华北制药集团生产， 其它试剂和反应物从Aldrich Chemical Co.购买。
在实施例中，通过上述的一些化学过程合成了一系列NCPC4850 (NCPC4851)的衍生物(见表2化合物编号1～32)。
另外需要指出，实施例所有反应中通过反相HPLC纯化条件：用 DIKMA 10×50mm(5μm)C18柱及TFA缓冲体系通过制备反相高效液相 (HPLC)纯化。用时间为零时10％乙腈/0.1％TFA至时间为15分钟时的 80％乙腈/0.1％TFA的10ml/分钟的线形梯度洗脱。含有产物的流份通过 在254nm处紫外扫描检测。将所需流份冷冻干燥成白色固体。本发明 中所言及的收率均为摩尔收率。
NCPC4850和NCPC4851的衍生物
表2 化合物 编号 R1 R2 R3 R4 1 -CH2-4-(4-Cl-Ph)-Ph -OH -H -H 2 -CH2-4-(Ph-O)-Ph -OH -H -H 3 -CH2-4-Ph-Ph -OH -H -H 4 -CH2CH2CH2-Ph -OH -H -H 5 -CH2-4-(Butyl-O)-Ph -OH -H -H 6 -CH2-(CH2)9-CH3 -OH -H -H 7 -CH2CH2-NH-(CH2)9-CH3 -OH -H -H 8 -CH2CH2-S-(CH2)9-CH3 -OH -H -H 9 -CH2CH2-NH-CH2-4-(4-Cl-Ph)-Ph -OH -H -H 10 -CH2CH2-NH-(CH2)9-CH3 -NH(CH2)3N(CH3)2 -H -H 11 -CH2CH2-NH-(CH2)9-CH3 -N-(D-glucosamine) -H -H 12 -CH2-4-(4-Cl-Ph)-Ph -NH(CH2)3N(CH3)2 -H -H 13 -CH2-4-(4-Cl-Ph)-Ph -N-(D-glucosamine) -H -H 14 -H -OH -CH2-NH-CH2-4-Ph-Ph -H 15 -CH2CH2-NH-(CH2)9-CH3 -OH -CH2-NH(CH2)3N(CH3)2 -H 16 -CH2CH2-NH-(CH2)9-CH3 -OH -CH2-N-(N-CH3-D-glucosamine) -H 17 -CH2-4-(4-Cl-Ph)-Ph -OH -H -CH3 18 -CH2-4-(Ph-O)-Ph -OH -H -CH3 19 -CH2-4-Ph-Ph -OH -H -CH3 20 -CH2CH2CH2-Ph -OH -H -CH3 21 -CH2-4-(Butyl-O)-Ph -OH -H -CH3 22 -CH2-(CH2)9-CH3 -OH -H -CH3 23 -CH2CH2-NH-(CH2)9-CH3 -OH -H -CH3 24 -CH2CH2-S-(CH2)9-CH3 -OH -H -CH3 25 -CH2CH2-NH-CH2-4-(4-Cl-Ph)-Ph -OH -H -CH3 26 -CH2CH2-NH-(CH2)9-CH3 -NH(CH2)3N(CH3)2 -H -CH3 27 -CH2CH2-NH-(CH2)9-CH3 N-(D-glucosamine) -H -CH3 28 -CH2-4-(4-Cl-Ph)-Ph -NH(CH2)3N(CH3)2 -H -CH3 29 -CH2-4-(4-Cl-Ph)-Ph -N-(D-glucosamine) -H -CH3 30 -H -OH -CH2-NH-CH2-4-Ph-Ph -CH3 31 -CH2CH2-NH-(CH2)9-CH3 -OH -CH2-NH(CH2)3N(CH3)2 -CH3 32 -CH2CH2-NH-(CH2)9-CH3 -OH -CH2-N-(N-CH3-D-glucosamine) -CH3
这些化合物的质谱数据如下表所示：
表3 化合物编号 MW(free base) Observed MH+ Oberved MH2+ 1 1473.8 1474.9 739.0 2 1455.3 1456.7 729.9 3 1439.3 1440.3 721.7 4 1391.3 1392.9 697.45 5 1435.3 1436.5 719.8 6 1427.4 1428.4 715.7 7 1456.4 1458.0 730.1 8 1473.5 1474.8 738.7 9 1516.8 1518.2 760.6 10 1540.6 1541.6 772.3 11 1617.6 1618.9 811.0 12 1601.0 1602.5 802.8 13 1678.0 1679.1 841.0 14 1502.8 1504.0 753.5 15 1541.6 1543.0 772.5 16 1618.6 1620.2 811.3 17 1487.8 1489.0 746.1 18 1469.3 1470.7 736.9 19 1453.3 1454.3 728.7 20 1405.3 1407.1 704.6 21 1449.3 1451.0 727.0 22 1441.4 1442.5 722.8 23 1470.4 1471.4 737.2 24 1487.5 1489.0 746.1 25 1530.8 1531.9 767.5 26 1554.6 1556.1 779.6 27 1631.6 1632.5 817.8 28 1615.0 1616.2 809.7 29 1692.0 1693.9 848.5 30 1516.8 1518.1 760.6 31 1555.6 1556.8 779.9 32 1632.6 1633.5 818.3
实施例：
实施例1
NCPC4850和NCPC4851的化学合成
R＝H，Norvancomycin R＝H，NCPC4850
R＝CH3，Vancomycin R＝CH3，NCPC4851
将5.0克去甲万古霉素盐酸盐溶解到20ml三氟乙酸(TFA)，于 50℃下搅拌反应2小时。反应液真空浓缩后溶于20ml丙酮，倒入200ml 氯仿沉淀。沉淀物用20ml氯仿分两次洗涤后在真空下干燥。粗品用反 相HPLC纯化得化合物NCPC4850纯品500mg(产率10％)。如果用万 古霉素盐酸盐为原料，通过相同的实验过程，则可得到化合物 NCPC4851。
实施例2
化合物1的合成
Cbz-NCPC4850的合成：将NCPC4850(128mg，0.10mmol)溶解到5ml 的1，4-二氧六环/水(1∶1)中，加入NaHCO3(17mg，0.20mmol)，然 后在冰浴并剧烈搅拌的情况下逐滴加入Cbz-Cl(17mg，0.11mmol)。 反应液在室温下搅拌1小时后倒入75ml丙酮沉淀。沉淀无用10ml丙 酮分两次洗涤，真空下干燥。
Cbz-NCPC4850-4-Chlorophenylbenzyl的合成：将0.10mmol的 Cbz-NCPC4850，0.15mmol的4-氯联苯甲醛溶解到5ml的DMF/MeOH(1∶1)。反应液在65℃下搅拌48小时后加入0.20mmol的NaCNBH3， 继续搅拌24小时，反应液冷却后倒入75ml丙酮沉淀。沉淀用10ml丙 酮分两次洗涤，真空下干燥。
化合物1的合成：将0.10mmol的以上沉淀物溶解到7ml的DMF，加入 50mg的Pd/C(5％)，在～1atm、室温下氢化3小时，催化剂过滤除去 后将反应液倒入80ml丙酮沉淀，沉淀物用反相HPLC纯化。全程收率 50％。
实施例3
化合物2的合成
Boc-NCPC4850的合成：将NCPC4850(128mg，0.10mmol)、(Boc)2O(21.8mg，0.11mmol)、NaCO3(17mg，0.20mmol)溶解到5ml的1，4- 二氧六环/水(1∶1)中，反应液在室温下搅拌6小时后倒入75ml丙酮 沉淀。沉淀用10ml丙酮分两次洗涤，真空下干燥。
Boc-NCPC4850-4-phenyoxylbenzyl的合成：将0.10mmol的Boc- NCPC4850，0.15mmol的4-苯氧基苯甲醛溶解到5ml的DMF/MeOH(1∶1)。反应液在65℃下搅拌48小时后加入0.20mmol的NaCNBH3， 继续搅拌24小时，反应液冷却后倒入75ml丙酮沉淀。沉淀用10ml丙 酮分两次洗涤，真空下干燥。
化合物2的合成：将0.10mmol的以上沉淀悬浮到10ml氯仿，缓慢滴 加2ml TFA。溶液在室温搅拌20分钟后倒入50ml乙醚沉淀，沉淀用 反相HPLC纯化。全程收率42％。
实施例4
化合物3的合成
与化合物1的制备相同，只是用4-Ph-Ph-CHO代替4-氯联苯甲 醛。
实施例5
化合物4的合成
与化合物1的制备相同，只是用Ph-CH2CH2-CHO代替4-氯联苯甲 醛。
实施例6
化合物5的合成
与化合物1的制备相同，只是用4-(Butyl-O)-Ph-CHO代替4-氯 联苯甲醛。
实施例7
化合物6的合成
与化合物1的制备相同，只是用CH3-(CH2)9-CHO代替4-氯联苯甲 醛。
实施例8
化合物7的合成
与化合物1的制备相同，只是用CH3-(CH2)9-NH-CH2CHO代替4-氯 联苯甲醛。
实施例9
化合物8的合成
与化合物1的制备相同，只是用CH3-(CH2)9-S-CH2CHO代替4-氯联 苯甲醛。
实施例10
化合物9的合成
与化合物1的制备相同，只是用4-(4-Cl-Ph)-Ph-CH2-NH-CH2CHO代替4-氯联苯甲醛。
实施例11
化合物10的合成
将0.1mmol的化合物7、1.0mmol的H2N-(CH2)3N(CH3)2溶解到5ml 的DMSO，用DIPEA调pH到8.5～9，反应液搅拌1小时后加入0.12mmol 的PyBOP。反应液在室温继续搅拌3小时。将150ml乙醚加入到反应 混合物中得到油状粘稠物，油状粘稠物用30ml乙醚分两次震荡洗涤后 再用15ml丙酮处理便得到白色固体。用反相HPLC纯化。收率65％。
实施例12
化合物11的合成
同实施例11，只是用H2N-(D-glucosamine)代替 H2N-(CH2)3N(CH3)2。
实施例13
化合物12的合成
将0.1mmol的化合物1、1.0mmol的H2N-(CH2)3N(CH3)2溶解到5ml 的DMSO，用DIPEA调pH到8.5～9，反应液搅拌1小时后加入0.12mmol 的PyBOP。反应液在室温继续搅拌3小时。将150ml乙醚加入到反应 混合物中得到油状粘稠物，油状粘稠物用30ml乙醚分两次震荡洗涤后 再用15ml丙酮处理便得到白色固体。用反相HPLC纯化。收率70％。
实施例14
化合物13的合成
同实施例13，只是用H2N-(D-glucosamine)代替 H2N-(CH2)3N(CH3)2。
实施例15
化合物14的合成
将0.10mmol的NCPC4850，1.0mmol的4-苯基苄胺以及0.12mmol 的甲醛水溶液溶解到10ml 1∶1的乙腈/水，用1M的NaOH调pH到9.5～ 10，反应液在室温下搅拌8小时，用1M的HCl调pH到4～5后倒入 120ml丙酮沉淀。沉淀物用反相HPLC纯化。收率65％。
实施例16
化合物15的合成
将0.10mmol的化合物7，1.0mmol的H2N-(CH2)3N(CH3)2以及 0.12mmol的甲醛水溶液溶解到10ml 1∶1的乙腈/水，用1M的NaOH调 pH到9.5～10，反应液在室温下搅拌8小时，用1M的HCl调pH到4～ 5后倒入120ml丙酮沉淀。沉淀物用反相HPLC纯化。收率50％。
实施例17
化合物16的合成
与实施例16类似，只是用(N-CH3-D-glucosamine)NH2代替 H2N-(CH2)3N(CH3)2。
实施例18
化合物17的合成
将5.0克万古霉素盐酸盐溶解到20ml TFA，于50℃下搅拌反应2 小时。反应液真空浓缩后溶于20ml丙酮，倒入200ml氯仿沉淀。沉淀 用20ml氯仿分两次洗涤后真空干燥。粗品用反相HPLC纯化得化合物 NCPC4851纯品350mg。
化合物17的合成：将0.10mmol的NCPC4851，0.15mmol的4-氯联 苯甲醛溶解到5ml的DMF/MeOH(1∶1)。反应液在65℃下搅拌48小时 后加入0.20mmol的NaCNBH3，再搅拌24小时，反应液冷却后倒入75ml 丙酮沉淀。沉淀用10ml丙酮分两次洗涤，真空下干燥。粗品用反相HPLC 纯化。
实施例19-33
化合物18-31的合成
化合物18-31的合成分别与化合物2-16的合成相同，只是用 NCPC4851代替NCPC4850。
实施例34
将2ml注射用水和0.6g的本发明化合物按常规方法制成注射剂。
抗菌活性的研究
抗菌活性的测定
最小抑菌浓度(MIC)的测定
由微生物12、13、14、15河北医科大学第二医院提供，微生物1、 2、3、4、7、8、9、10、11由河北省人民医院提供，微生物5、6、16、 17由美国CHIRON公司提供，微生物18、19由国家生物制品检定所提 供。基于对替考拉宁的敏感性，万古霉素耐药肠球菌的表型为Van A 或Van B。
在NCCLS准则下在微量稀释液体培养法(microdilution broth procedure)中测定最小抑菌浓度(MIC)。通常，将化合物连续稀释 在96孔微量滴定平板中的Mueller-Hinton培养液内。基于在600nm 的吸光度，稀释过夜培养的菌株，各孔中的最终浓度是5×105cfu/mL。 将平板重新置于35℃的培养箱。次日(或在肠球菌菌株的情况中是24 小时后)，通过目测的平板测定MIC。在初始筛选中常规试验的菌株包 括甲氧苯青霉素敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧苯青霉素的 金黄色葡萄球菌(MRSA)、甲氧苯青霉素敏感的表皮葡萄球菌(MSSE)、 耐甲氧苯青霉素的表皮葡萄球菌(MRSE)、万古霉素敏感的屎肠球菌 (VSE Fm)、万古霉素敏感的粪肠球菌(VSE Fs)、耐万古霉素也耐 提考拉宁的屎肠球菌(VRE Fm Van A)、耐万古霉素但对提考拉宁敏 感的屎肠球菌(VRE Fm Van B)、耐万古霉素也耐提考拉宁的粪肠球 菌(VRE Fs Van A)、耐万古霉素但对的考拉宁敏感的粪肠球菌(VRE Fs Van B)。
化合物的体外活性MIC(μg/ml) 微生 物编 号 微生物 万古 霉素 去甲万 古霉素 NCPC 4850 NCPC48 51 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 金黄色葡萄球菌134 2 2 ＜0.25 ＜0.25 ≤0.125 0.25 0.25 0.25 ≤0.125 ≤0.125 ≤0.125 0.125 0.125 2 金黄色葡萄球菌143 1 2 ＜0.25 0.5 ≤0.125 0.125 0.125 0.25 ≤0.125 0.125 0.125 0.25 0.25 3 金黄色葡萄球菌68 1 2 ＜0.25 ＜0.25 ≤0.125 0.125 0.25 0.125 0.25 ≤0.125 ≤0.125 0.125 0.125 4 金黄色葡萄球菌83 2 2 0.5 0.5 ≤0.125 0.25 0.25 0.25 ≤0.125 ≤0.125 0.125 ≤ 0.125 ≤0.125 5 金黄色葡萄球菌 Stau Mu50-HIP5406 2 2 0.78 0.78 0.25 0.5 0.5 0.5 0.25 0.5 0.25 0.5 0.5 6 金黄色葡萄球菌 Stau HIP5827 8 8 3.13 3.13 0.5 0.5 0.5 1 0.5 0.5 0.5 1 1 7 表皮葡萄球菌24 2 1 - - ≤0.125 0.125 0.125 0.125 0.125 ≤0.125 ≤0.125 0.125 ≤0.125 8 表皮葡萄球菌25 2 2 0.5 0.5 ≤0.125 0.125 0.125 0.25 0.125 0.25 0.125 0.25 0.25 9 表皮萄萄球菌26 4 2 - - ≤0.125 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 ≤0.125 0.25 0.25 10 表皮葡萄球菌3 4 2 - - ≤0.125 0.25 0.25 0.25 ≤0.125 ≤0.125 0.125 0.125 ≤0.125 11 表皮葡萄球菌10 1 1 0.5 0.5 ≤0.125 0.25 0.25 0.25 ≤0.125 ≤0.125 ≤0.125 ≤ 0.125 0.125 12 肠球菌9 2 2 0.5 0.5 ≤0.125 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.125 0.25 0.25 13 肠球菌16 4 4 1 1 ≤0.125 0.25 0.25 0.25 0.125 0.125 ≤0.125 0.125 0.125 14 肠球菌22 2 2 0.5 0.5 ≤0.125 0.25 0.25 0.25 0.125 0.125 0.125 ≤ 0.125 0.125 15 肠球菌24 2 2 0.5 0.5 ≤0.125 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 ≤0.125 0.25 0.25 16 肠球菌Enfa_29212 ＞64 - ＞50 ＞50 0.5 0.5 0.5 1 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 17 肠球菌Enfa_t29882 ＞64 - ＞50 ＞50 0.125 0.5 0.5 0.5 0.125 0.125 0.25 1 0.5 18 ATCC 29213 2 2 0.5 0.5 ≤0.125 0.25 0.25 0.25 0.125 0.125 ≤0.125 0.25 0.25 19 ATCC 29213 2 2 0.5 1 ≤0.125 0.25 0.25 0.25 0.125 0.125 0.125 0.25 0.125
发明人对万古霉素和去甲万古霉素进行了结构改造，得到了一系 列的衍生物，经过初步MIC试验，证实对耐药葡萄球菌和耐药肠球菌 的作用是去甲万古霉素(万古霉素)的数倍。
因此，本发明的一个目的是提供通式(I)的一系列万古霉素和去 甲万古霉素的衍生物及其可药用盐、溶剂化物、立体异构体或前药：
其中：
R1是H或-CH2-R5，其中R5是C1-C20饱和或不饱和的烃性质的脂族 基团，例如C1-C20烷基(alkyl)，C2-C20链烯基(alkenyl)，或是 C3-C20饱和或不饱和环脂族基团，例如C3-C20环烷基或C3-C20环烯基， 或是C5-C20杂环基团(杂环含有选自N、O或S中的一个或多个杂原子)， 或是C6-C30芳基，烷芳基或芳烷基(aryl，alkaryl，aralkyl group)， 该芳基、烷芳基或芳烷基可以含有一个或多个芳环或稠环，
上述所有基团是未取代的，或被例如卤素、芳基，OH，氨基等取 代，其碳链任选可以插入选自O、N和S中的一个或多个杂原子(hetero atom)；
R2是OH，或-NH-R8，其中其中R8是烷基，链烯基，环烷基，环烯 基，芳烷基，烷芳基和杂环基，这些基团可以是取代或未取代的，其 碳链任选可以插入N、O或S中的一个或多个；
R3是-H或-CH2-NH-R7，其中R7是烷基，链烯基，环烷基，环烯基， 芳烷基，烷芳基和杂环基，这些基团可以是取代或未取代的，其碳链 任选可以插入N、O或S中的一个或多个；
R4是氢或甲基。
优选的是，R1是-CH2-4-(4-Cl-Ph)-Ph，-CH2-4-(Ph-O)-Ph， -CH2-4-Ph-Ph，-CH2CH2CH2-Ph，-CH2-4-(Butyl-O)-Ph，-CH2-(CH2)9-CH3， -CH2CH2-NH-(CH2)9-CH3，-CH2CH2-S-(CH2)9-CH3，-CH2CH2-NH-CH2-4-(4-Cl-Ph)-Ph， -H，-CH2-(CH2)9-CH3；
R2是OH，-NH(CH2)3N(CH3)2，-N-(D-glucosamine)；
R3是-H，-CH2-NH-CH2-4-Ph-Ph，-CH2-NH(CH2)3N(CH3)2； -CH2-N-(N-CH2-D-glucosamine)；和
R4是-H或-CH3。
本发明的第二个目的是提供上述通式化合物的制备方法，包括以 下步骤：
A、将去甲万古霉素或万古霉素在三氟乙酸的存在下升温(例如 40-120℃)下反应，获得葡萄糖残基被除去的化合物NCPC4850或 NCPC4851：
其中R4是H或CH3。
本发明化合物的制备方法可以进一步包括：
B、NCPC4850或NCPC4851进行氨基的保护获得下式的化合物：
其中Pro是保护基，
上式化合物与醛R5CHO反应，获得以下化合物：
再脱保护，获得下式的化合物：
其中R5如以上所定义，Pro是保护基；
或/和
C、以上步骤A或B的产物：
其中R4如以上所定义，R1为H或-CH2-R5，R5如以上所定义， 与甲醛和胺R7NH2在碱性条件下反应，获得下式的化合物：
其中R7如以上所定义；
或
D、以上步骤A或B的产物：
其中R1为H或-CH2-R5，R5如以上所定义， 与R8NH2反应，形成以下结构式的化合物：
其中R8如以上所定义。
本发明的又一个目的是提供上述化合物在制备抗严重的G+菌感染 的药物，尤其是治疗或/和辅助治疗心内膜炎、脑膜炎、肺炎、败血症、 急慢性骨髓炎、烧伤感染、皮肤或软组织化脓性感染的药物中的用途。
本发明的再一个目的是提供含有有效量的上述本发明化合物的药 物组合物，本发明的药物组合物还可以含有本领域公知的载体，如赋 型剂，稀释剂，香味剂，甜味剂等。
本发明的详细描述
我们将去甲万古霉素(万古霉素)在三氟乙酸存在的条件下，加 热反应后经过一系列后处理，得到了结构单一的化合物，经过高分辨 质谱、NMR等分析技术确定了该化合物的化学结构，NCPC4850 (NCPC4851)。
R＝H，Norvancomycin R＝H，NCPC4850
R＝CH3，Vancomycin R＝CH3，NCPC4851
Molecular Formula ＝C65H73Cl2N9O24 Molecular Formula＝C59H63Cl2N9O19
Formula Weight ＝1435.227 Formula Weight ＝1273.086
Exact Mass Calcd. ＝1433.414557 Da Exact Mass Calcd.＝1271.381732 Da
Exact Mass Obsd. ＝1433.4146 Da Exact Mass Obsd. ＝1271.3617 Da
Norvancomycin NCPC4850
该化合物可能的生成机理是去甲万古霉素分子(结构如上面左) 中的葡萄糖残基(glucose moiety)水解脱去，而另外一个糖(万古糖 残基vancosmine moiety)通过分子内重排(如上面箭头所示)直接连 到去甲万古霉素多肽骨架上。化合物的化学结构已经通过对 NCPC4850的进一步化学反应得到了证实。
去甲万古霉素和NCPC4850的13C NMR(500MHz，D2O，ppm) 数据如下表：
表1 碳原子位置 去甲万古霉素 NCPC4850 碳原子位置 去甲万古霉素 NCPC4850 A-CO 170.4 170.5 D-1’ 56.9 56.9 A-1 139.7 139.9 E-CO 169.4 169.2 A-2 127.3 127.2 E-1 127.3 127.3 A-3 124.0 124.4 E-2 135.7 135.7 A-4 149.9 149.8 E-3 121.7 121.7 A-5 126.1 126.1 E-4 155.0 156.5 A-6 128.7 128.7 E-5 116.2 116.2 A-1’ 71.5 71.6 E-6 125.4 125.5 A-2” 58.8 58.3 E-1’ 53.7 53.8 B-CO 169.1 169.2 Asn-CO 167.3 167.3 B-1 134.7 134.6 Asn-α 51.1 50.9 B-2 107.1 107.0 Asn-β 37.3 37.5 B-3 151.2 151.4 Asn-γ-CO 171.1 170.8 B-4 131.9 131.9 Leu-CO 173.9 174 B-5 152.1 155.1 Leu-α 30.6 61.8 B-6 104.6 104.6 Leu-β 42.6 42.6 B-1’ 54.7 54.9 Leu-γ 23.9 24.1 C-CO 167.5 167.8 Leu-δ 23.2 22.9 C-1 142.5 142.6 Leu-δ 21.6 22.3 C-2 127.3 127.2 Glu-1 101.2 - C-3 126.1 126.2 Glu-2 78.0 - C-4 148.3 148.3 Glu-3 76.7 - C-5 123.3 123.5 Glu-4 70.2 - C-6 126.1 126.2 Glu-5 77.0 - C-1’ 71.1 71.1 Glu-6 61.2 - C-2” 61.8 61.9 Van-1 96.7 100.6 D-CO 172.8 172.7 Van-2 33.3 34.2 D-1 136.5 136.3 Van-3 53.9 54.8 D-2 105.9 105.8 Van-3-CH3 22.3 22.6 D-3 157.1 159.6 Van-4 70.7 70.8 D-4 102.3 102.3 Van-5 63.1 63.2 D-5 156.4 157.2 Van-5-CH3 16.8 16.9 D-6 118.0 118.0
去甲万古霉素和化合物NCPCC4850的高分辨质谱数据如下：
Molecular Formula＝C65H73Cl2N9O24 Molecular Formula＝C59H63Cl2N9O19
Formula Weight ＝1435.227 Formula Weight ＝1273.086
Exact Mass Calcd.＝1433.414557 Da Exact Mass Calcd.＝1271.361732 Da
Exact Mass Obsd.＝1433.4146 Da Exact Mass Obsd. ＝1271.3617 Da
Norvancomycin NCPC4850
通过对化合物NCPC4850(NCPC4851也同)进行下列反应(还原胺基 化)得到如式(1)的衍生物：
Cbz-NCPC4850的合成(氨基的保护)：将NCPC4850(128mg，0.10mmol) 溶解到5ml 1∶1的1，4-二氧六环/水中，加入NaHCO3(17mg，0.20mmol)， 然后在冰浴并剧烈搅拌的情况下逐滴加入Cbz-Cl(17mg，0.11mmol)。反 应液在室温下搅拌1小时后倒入75ml丙酮沉淀。沉淀物用10ml丙酮 分两次洗涤，真空下干燥。
Cbz-NCPC4850-CH2R的合成(胺基化)：将0.10mmol的Cbz- NCPC4850，0.15mmol的醛溶解到5ml的DMF/MeOH(1∶1)。反应液在 65℃下搅拌48小时后加入0.20mmol的NaCNBH3，继续搅拌24小时， 反应液冷却后倒入75ml丙酮沉淀。沉淀物用10ml丙酮分两次洗涤， 真空下干燥。
NCPC4850-CH2R的合成(还原)将0.10mmol的以上沉淀溶解到7ml 的RMF，加入50mg的Pd/C(5％)，在～1atm、室温下氢化3小时， 催化剂过滤除去后将反应液倒入80ml丙酮，沉淀用反相HPLC纯化。 全程收率30-65％。
其中R-CHO的普通醛，例如甲醛，乙醛，丙烯醛，丙醛，戊醛，己醛， 庚醛，苯甲醛，苯乙醛等，即R是烷基，烯基，芳基，芳烷基，烷芳 基等。
式(1)的化合物也可通过以下反应步骤得到：
Boc-NCPC4850的合成(氨基的保护)：将NCPC4850(128mg， 0.10mmol)、(Boc)2O(21.8mg，0.11mmol)以及NaHCO3(17mg，0.20mmol) 溶解到5ml的1，4-二氧六环/水(1∶1)中，反应液在室温下搅拌6小时后 倒入75ml丙酮沉淀。沉淀物用10ml丙酮分两次洗涤，真空下干燥。
Boc-NCPC4850-CH2R的合成(胺基化)：将0.10mmol的Boc- NCPC4850，0.15mmol的醛溶解到5ml的DMF/MeOH(1∶1)中。反应液 在65℃下搅拌48小时后加入0.20mmol的NaCNBH3，继续搅拌24小 时，反应液冷却后倒入75ml丙酮沉淀。沉淀物用10ml丙酮分两次洗 涤，真空下干燥。
NCPC4850-CH2R的合成(还原)：0.10mmol的以上沉淀悬浮到10ml 氯仿，缓慢滴加2ml TFA。溶液在室温搅拌20分钟后倒入50ml乙醚 沉淀，沉淀用制备型HPLC纯化。全程收率20-60％。
其中R-CHO的普通醛，例如甲醛，乙醛，丙烯醛，丙醛，戊醛，己醛， 庚醛，苯甲醛，苯乙醛等，即R是烷基，烯基，芳基，芳烷基，烷芳 基等。
以上所述的均为一般醛，也可用氨基取代醛进行还原烷基化，氨基取 代醛可用如下方法制备；
将2-氨基乙醛缩二甲醇(1eq.)，以上所述的普通醛RCHO(1.05eq)， 和NaCNBH3(1eq)在CH2Cl2中的溶液在室温下搅拌1-4小时。该反应 用TLC检测。0℃下向反应混合物加入FmocCl(1eq)和DIPEA(2eq)。 室温下继续搅拌1-2小时。真空中除去溶剂，并且通过反相HPLC纯 化残余物得到氨基取代乙缩醛。向上述氨基取代乙缩醛在丙酮中的溶 液内加入6N HCl(1.5eq.)。室温下将反应搅拌5-16小时。真空中除去 溶剂且在高真空下干燥残余物，得到氨基取代醛的粗产物，不需要进 一步纯化即可使用。
也可用硫取代醛进行胺基化，硫取代醛的制备如下：
将溴乙缩醛(1eq.)(如二甲基2-溴乙缩醛(dimethyl 2- bromoacetaldehyde))和碘化钠(1eq.)，在DMF中的溶液在室温下搅 拌0.5小时。向该溶液中加入取代硫醇RSH(R是烷基，烯基，芳基， 烷芳基，芳烷基等)(1.eq)，然后加入碳酸钾(1eq)。在25-80℃ 下将该混合物搅拌4-16小时。随后反应溶解在乙酸乙酯中，用水洗涤 2次且用饱和氯化钠洗涤1次。有机层用MgSO4干燥且真空中除去溶 剂。用反相HPLC纯化，得到相应的硫取代乙缩醛。
在硫取代乙缩醛在丙酮中的溶液中加入6N HCl(1.5eq.)。室温下将反应 搅拌5-16小时。真空中出去溶剂且在高真空下干燥残余物，得到硫取 代醛的粗产物，其通常不需要进一步纯化即可使用。
通过对式(1)的化合物(NCPC481也同)进行胺甲基化可得到如式 (2)的化合物：
将0.10mmol的NCPC4850，1.0mmol的胺R7NH2以及0.12mmol的甲 醛水溶液溶解到10ml的乙腈/水(1∶1)，用1M的NaOH调pH到9.5～ 10，反应液在室温下搅拌6～10小时后，用1M的HCl调pH到4～5， 倒入200ml丙酮沉淀。沉淀用反相HPLC纯化，收率30-85％。 通过对式(2)的羟基与胺的缩合(NCPC4851也同)可得到如式(3) 的化合物：
将0.10mmol的NCPC4850或其还原烷化衍生物、1.0mmol的胺R8NH2 (或胺盐)溶解到5ml的DMSO，用Et3N调pH到8.5～9，反应液搅 拌1小时后加入0.12mmol的PyBOP。反应液在室温继续搅拌3小时。 将150ml乙醚加入到反应混合物中得到油状粘稠物，油状粘稠物用 30ml乙醚分两次震荡洗涤后再用15ml丙酮处理便得到白色或淡黄色 固体。用反相HPLC纯化，收率60-90％。
用本发明的各种化合物对各种耐药菌进行了抗菌活性实验，结 果，本发明的化合物对各种耐药菌的最小抑菌浓度大大优于万古霉素 和去万古霉素，从而证实本发明的化合物可有效用于抗严重的G+菌感 染，尤其用于治疗或/和辅助治疗心内膜炎、脑膜炎、肺炎、败血症、 急慢性骨髓炎、烧伤感染、皮肤或软组织化脓性感染。
本发明的化合物可以制成非肠道给药剂型或经肠道给药剂型，如 口服或静脉注射剂型。本发明的化合物的用量可以参照万古霉素和去 甲万古霉素的现有剂量，例如成人可以为0.8-2.0g/d，可以分2-3次给 药，儿童用量酌减。本发明的化合物可以按常规方法成盐，例如制成 盐酸盐。
实施例
为了进一步阐明本发明，下面给出一系列实施例。需要指出的是， 这些实施例完全是例证性的。给出这些实施例的目的是为了充分明示 本发明的意义和内容，决不对本发明造成任何形式的限制。
在以下实施例中，下列缩写具有以下含义。未定义的缩写具有其 普遍接受的含义，除非另外声明，所有温度为摄氏度。
BOC，Boc ＝叔丁氧基羰基
Cbz-Cl ＝苄氧酰氯
DIPEA ＝二异丙基乙胺
DMF ＝N，N-二甲基甲酰胺
DMSO ＝二甲基亚砜
eq. ＝当量
Et ＝乙基
EtOAc ＝乙酸乙酯
Fmoc ＝9-芴基甲氧基羰基
HPLC ＝高效液相色谱
Me ＝甲基
PyBOP ＝苯并三唑-1-基氧三(吡咯烷子基)膦六氟磷酸盐
TFA ＝三氟乙酸
THF ＝四氢呋喃
TLC，tlc ＝薄层层析
在以下的实施例中，去甲万古霉素盐酸盐由华北制药集团生产， 其它试剂和反应物从Aldrich Chemical Co.购买。
在实施例中，通过上述的一些化学过程合成了一系列NCPC4850 (NCPC4851)的衍生物(见表2化合物编号1～32)。
另外需要指出，实施例所有反应中通过反相HPLC纯化条件：用 DIKMA 10×50mm(5μm)C18柱及TFA缓冲体系通过制备反相高效液相 (HPLC)纯化。用时间为零时10％乙腈/0.1％TFA至时间为15分钟时的 80％乙腈/0.1％TFA的10ml/分钟的线形梯度洗脱。含有产物的流份通过 在254nm处紫外扫描检测。将所需流份冷冻干燥成白色固体。本发明 中所言及的收率均为摩尔收率。
NCPC4850和NCPC4851的衍生物
表2 化合物 编号 R1 R2 R3 R4 1 -CH2-4-(4-Cl-Ph)-Ph -OH -H -H 2 -CH2-4-(Ph-O)-Ph -OH -H -H 3 -CH2-4-Ph-Ph -OH -H -H 4 -CH2CH2CH2-Ph -OH -H -H 5 -CH2-4-(Butyl-O)-Ph -OH -H -H 6 -CH2-(CH2)9-CH3 -OH -H -H 7 -CH2CH2-NH-(CH2)9-CH3 -OH -H -H 8 -CH2CH2-S-(CH2)9-CH3 -OH -H -H 9 -CH2CH2-NH-CH2-4-(4-Cl-Ph)-Ph -OH -H -H 10 -CH2CH2-NH-(CH2)9-CH3 -NH(CH2)3N(CH3)2 -H -H 11 -CH2CH2-NH-(CH2)9-CH3 -N-(D-glucosamine) -H -H 12 -CH2-4-(4-Cl-Ph)-Ph -NH(CH2)3N(CH3)2 -H -H 13 -CH2-4-(4-Cl-Ph)-Ph -N-(D-glucosamine) -H -H 14 -H -OH -CH2-NH-CH2-4-Ph-Ph -H 15 -CH2CH2-NH-(CH2)9-CH3 -OH -CH2-NH(CH2)3N(CH3)2 -H 16 -CH2CH2-NH-(CH2)9-CH3 -OH -CH2-N-(N-CH3-D-glucosamine) -H 17 -CH2-4-(4-Cl-Ph)-Ph -OH -H -CH3 18 -CH2-4-(Ph-O)-Ph -OH -H -CH3 19 -CH2-4-Ph-Ph -OH -H -CH3 20 -CH2CH2CH2-Ph -OH -H -CH3 21 -CH2-4-(Butyl-O)-Ph -OH -H -CH3 22 -CH2-(CH2)9-CH3 -OH -H -CH3 23 -CH2CH2-NH-(CH2)9-CH3 -OH -H -CH3 24 -CH2CH2-S-(CH2)9-CH3 -OH -H -CH3 25 -CH2CH2-NH-CH2-4-(4-Cl-Ph)-Ph -OH -H -CH3 26 -CH2CH2-NH-(CH2)9-CH3 -NH(CH2)3N(CH3)2 -H -CH3 27 -CH2CH2-NH-(CH2)9-CH3 N-(D-glucosamine) -H -CH3 28 -CH2-4-(4-Cl-Ph)-Ph -NH(CH2)3N(CH3)2 -H -CH3 29 -CH2-4-(4-Cl-Ph)-Ph -N-(D-glucosamine) -H -CH3 30 -H -OH -CH2-NH-CH2-4-Ph-Ph -CH3 31 -CH2CH2-NH-(CH2)9-CH3 -OH -CH2-NH(CH2)3N(CH3)2 -CH3 32 -CH2CH2-NH-(CH2)9-CH3 -OH -CH2-N-(N-CH3-D-glucosamine) -CH3
这些化合物的质谱数据如下表所示：
表3 化合物编号 MW(free base) Observed MH+ Oberved MH2+ 1 1473.8 1474.9 739.0 2 1455.3 1456.7 729.9 3 1439.3 1440.3 721.7 4 1391.3 1392.9 697.45 5 1435.3 1436.5 719.8 6 1427.4 1428.4 715.7 7 1456.4 1458.0 730.1 8 1473.5 1474.8 738.7 9 1516.8 1518.2 760.6 10 1540.6 1541.6 772.3 11 1617.6 1618.9 811.0 12 1601.0 1602.5 802.8 13 1678.0 1679.1 841.0 14 1502.8 1504.0 753.5 15 1541.6 1543.0 772.5 16 1618.6 1620.2 811.3 17 1487.8 1489.0 746.1 18 1469.3 1470.7 736.9 19 1453.3 1454.3 728.7 20 1405.3 1407.1 704.6 21 1449.3 1451.0 727.0 22 1441.4 1442.5 722.8 23 1470.4 1471.4 737.2 24 1487.5 1489.0 746.1 25 1530.8 1531.9 767.5 26 1554.6 1556.1 779.6 27 1631.6 1632.5 817.8 28 1615.0 1616.2 809.7 29 1692.0 1693.9 848.5 30 1516.8 1518.1 760.6 31 1555.6 1556.8 779.9 32 1632.6 1633.5 818.3
实施例：
实施例1
NCPC4850和NCPC4851的化学合成
R＝H，Norvancomycin R＝H，NCPC4850
R＝CH3，Vancomycin R＝CH3，NCPC4851
将5.0克去甲万古霉素盐酸盐溶解到20ml三氟乙酸(TFA)，于 50℃下搅拌反应2小时。反应液真空浓缩后溶于20ml丙酮，倒入200ml 氯仿沉淀。沉淀物用20ml氯仿分两次洗涤后在真空下干燥。粗品用反 相HPLC纯化得化合物NCPC4850纯品500mg(产率10％)。如果用万 古霉素盐酸盐为原料，通过相同的实验过程，则可得到化合物 NCPC4851。
实施例2
化合物1的合成
Cbz-NCPC4850的合成：将NCPC4850(128mg，0.10mmol)溶解到5ml 的1，4-二氧六环/水(1∶1)中，加入NaHCO3(17mg，0.20mmol)，然 后在冰浴并剧烈搅拌的情况下逐滴加入Cbz-Cl(17mg，0.11mmol)。 反应液在室温下搅拌1小时后倒入75ml丙酮沉淀。沉淀无用10ml丙 酮分两次洗涤，真空下干燥。
Cbz-NCPC4850-4-Chlorophenylbenzyl的合成：将0.10mmol的 Cbz-NCPC4850，0.15mmol的4-氯联苯甲醛溶解到5ml的DMF/MeOH(1∶1)。反应液在65℃下搅拌48小时后加入0.20mmol的NaCNBH3， 继续搅拌24小时，反应液冷却后倒入75ml丙酮沉淀。沉淀用10ml丙 酮分两次洗涤，真空下干燥。
化合物1的合成：将0.10mmol的以上沉淀物溶解到7ml的DMF，加入 50mg的Pd/C(5％)，在～1atm、室温下氢化3小时，催化剂过滤除去 后将反应液倒入80ml丙酮沉淀，沉淀物用反相HPLC纯化。全程收率 50％。
实施例3
化合物2的合成
Boc-NCPC4850的合成：将NCPC4850(128mg，0.10mmol)、(Boc)2O(21.8mg，0.11mmol)、NaCO3(17mg，0.20mmol)溶解到5ml的1，4- 二氧六环/水(1∶1)中，反应液在室温下搅拌6小时后倒入75ml丙酮 沉淀。沉淀用10ml丙酮分两次洗涤，真空下干燥。
Boc-NCPC4850-4-phenyoxylbenzyl的合成：将0.10mmol的Boc- NCPC4850，0.15mmol的4-苯氧基苯甲醛溶解到5ml的DMF/MeOH(1∶1)。反应液在65℃下搅拌48小时后加入0.20mmol的NaCNBH3， 继续搅拌24小时，反应液冷却后倒入75ml丙酮沉淀。沉淀用10ml丙 酮分两次洗涤，真空下干燥。
化合物2的合成：将0.10mmol的以上沉淀悬浮到10ml氯仿，缓慢滴 加2ml TFA。溶液在室温搅拌20分钟后倒入50ml乙醚沉淀，沉淀用 反相HPLC纯化。全程收率42％。
实施例4
化合物3的合成
与化合物1的制备相同，只是用4-Ph-Ph-CHO代替4-氯联苯甲 醛。
实施例5
化合物4的合成
与化合物1的制备相同，只是用Ph-CH2CH2-CHO代替4-氯联苯甲 醛。
实施例6
化合物5的合成
与化合物1的制备相同，只是用4-(Butyl-O)-Ph-CHO代替4-氯 联苯甲醛。
实施例7
化合物6的合成
与化合物1的制备相同，只是用CH3-(CH2)9-CHO代替4-氯联苯甲 醛。
实施例8
化合物7的合成
与化合物1的制备相同，只是用CH3-(CH2)9-NH-CH2CHO代替4-氯 联苯甲醛。
实施例9
化合物8的合成
与化合物1的制备相同，只是用CH3-(CH2)9-S-CH2CHO代替4-氯联 苯甲醛。
实施例10
化合物9的合成
与化合物1的制备相同，只是用4-(4-Cl-Ph)-Ph-CH2-NH-CH2CHO代替4-氯联苯甲醛。
实施例11
化合物10的合成
将0.1mmol的化合物7、1.0mmol的H2N-(CH2)3N(CH3)2溶解到5ml 的DMSO，用DIPEA调pH到8.5～9，反应液搅拌1小时后加入0.12mmol 的PyBOP。反应液在室温继续搅拌3小时。将150ml乙醚加入到反应 混合物中得到油状粘稠物，油状粘稠物用30ml乙醚分两次震荡洗涤后 再用15ml丙酮处理便得到白色固体。用反相HPLC纯化。收率65％。
实施例12
化合物11的合成
同实施例11，只是用H2N-(D-glucosamine)代替 H2N-(CH2)3N(CH3)2。
实施例13
化合物12的合成
将0.1mmol的化合物1、1.0mmol的H2N-(CH2)3N(CH3)2溶解到5ml 的DMSO，用DIPEA调pH到8.5～9，反应液搅拌1小时后加入0.12mmol 的PyBOP。反应液在室温继续搅拌3小时。将150ml乙醚加入到反应 混合物中得到油状粘稠物，油状粘稠物用30ml乙醚分两次震荡洗涤后 再用15ml丙酮处理便得到白色固体。用反相HPLC纯化。收率70％。
实施例14
化合物13的合成
同实施例13，只是用H2N-(D-glucosamine)代替 H2N-(CH2)3N(CH3)2。
实施例15
化合物14的合成
将0.10mmol的NCPC4850，1.0mmol的4-苯基苄胺以及0.12mmol 的甲醛水溶液溶解到10ml 1∶1的乙腈/水，用1M的NaOH调pH到9.5～ 10，反应液在室温下搅拌8小时，用1M的HCl调pH到4～5后倒入 120ml丙酮沉淀。沉淀物用反相HPLC纯化。收率65％。
实施例16
化合物15的合成
将0.10mmol的化合物7，1.0mmol的H2N-(CH2)3N(CH3)2以及 0.12mmol的甲醛水溶液溶解到10ml 1∶1的乙腈/水，用1M的NaOH调 pH到9.5～10，反应液在室温下搅拌8小时，用1M的HCl调pH到4～ 5后倒入120ml丙酮沉淀。沉淀物用反相HPLC纯化。收率50％。
实施例17
化合物16的合成
与实施例16类似，只是用(N-CH3-D-glucosamine)NH2代替 H2N-(CH2)3N(CH3)2。
实施例18
化合物17的合成
将5.0克万古霉素盐酸盐溶解到20ml TFA，于50℃下搅拌反应2 小时。反应液真空浓缩后溶于20ml丙酮，倒入200ml氯仿沉淀。沉淀 用20ml氯仿分两次洗涤后真空干燥。粗品用反相HPLC纯化得化合物 NCPC4851纯品350mg。
化合物17的合成：将0.10mmol的NCPC4851，0.15mmol的4-氯联 苯甲醛溶解到5ml的DMF/MeOH(1∶1)。反应液在65℃下搅拌48小时 后加入0.20mmol的NaCNBH3，再搅拌24小时，反应液冷却后倒入75ml 丙酮沉淀。沉淀用10ml丙酮分两次洗涤，真空下干燥。粗品用反相HPLC 纯化。
实施例19-33
化合物18-31的合成
化合物18-31的合成分别与化合物2-16的合成相同，只是用 NCPC4851代替NCPC4850。
实施例34
将2ml注射用水和0.6g的本发明化合物按常规方法制成注射剂。
抗菌活性的研究
抗菌活性的测定
最小抑菌浓度(MIC)的测定
由微生物12、13、14、15河北医科大学第二医院提供，微生物1、 2、3、4、7、8、9、10、11由河北省人民医院提供，微生物5、6、16、 17由美国CHIRON公司提供，微生物18、19由国家生物制品检定所提 供。基于对替考拉宁的敏感性，万古霉素耐药肠球菌的表型为Van A 或Van B。
在NCCLS准则下在微量稀释液体培养法(microdilution broth procedure)中测定最小抑菌浓度(MIC)。通常，将化合物连续稀释 在96孔微量滴定平板中的Mueller-Hinton培养液内。基于在600nm 的吸光度，稀释过夜培养的菌株，各孔中的最终浓度是5×105cfu/mL。 将平板重新置于35℃的培养箱。次日(或在肠球菌菌株的情况中是24 小时后)，通过目测的平板测定MIC。在初始筛选中常规试验的菌株包 括甲氧苯青霉素敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧苯青霉素的 金黄色葡萄球菌(MRSA)、甲氧苯青霉素敏感的表皮葡萄球菌(MSSE)、 耐甲氧苯青霉素的表皮葡萄球菌(MRSE)、万古霉素敏感的屎肠球菌 (VSE Fm)、万古霉素敏感的粪肠球菌(VSE Fs)、耐万古霉素也耐 提考拉宁的屎肠球菌(VRE Fm Van A)、耐万古霉素但对提考拉宁敏 感的屎肠球菌(VRE Fm Van B)、耐万古霉素也耐提考拉宁的粪肠球 菌(VRE Fs Van A)、耐万古霉素但对的考拉宁敏感的粪肠球菌(VRE Fs Van B)。
化合物的体外活性MIC(μg/ml) 微生 物编 号 微生物 万古 霉素 去甲万 古霉素 NCPC 4850 NCPC48 51 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 金黄色葡萄球菌134 2 2 ＜0.25 ＜0.25 ≤0.125 0.25 0.25 0.25 ≤0.125 ≤0.125 ≤0.125 0.125 0.125 2 金黄色葡萄球菌143 1 2 ＜0.25 0.5 ≤0.125 0.125 0.125 0.25 ≤0.125 0.125 0.125 0.25 0.25 3 金黄色葡萄球菌68 1 2 ＜0.25 ＜0.25 ≤0.125 0.125 0.25 0.125 0.25 ≤0.125 ≤0.125 0.125 0.125 4 金黄色葡萄球菌83 2 2 0.5 0.5 ≤0.125 0.25 0.25 0.25 ≤0.125 ≤0.125 0.125 ≤ 0.125 ≤0.125 5 金黄色葡萄球菌 Stau Mu50-HIP5406 2 2 0.78 0.78 0.25 0.5 0.5 0.5 0.25 0.5 0.25 0.5 0.5 6 金黄色葡萄球菌 Stau HIP5827 8 8 3.13 3.13 0.5 0.5 0.5 1 0.5 0.5 0.5 1 1 7 表皮葡萄球菌24 2 1 - - ≤0.125 0.125 0.125 0.125 0.125 ≤0.125 ≤0.125 0.125 ≤0.125 8 表皮葡萄球菌25 2 2 0.5 0.5 ≤0.125 0.125 0.125 0.25 0.125 0.25 0.125 0.25 0.25 9 表皮萄萄球菌26 4 2 - - ≤0.125 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 ≤0.125 0.25 0.25 10 表皮葡萄球菌3 4 2 - - ≤0.125 0.25 0.25 0.25 ≤0.125 ≤0.125 0.125 0.125 ≤0.125 11 表皮葡萄球菌10 1 1 0.5 0.5 ≤0.125 0.25 0.25 0.25 ≤0.125 ≤0.125 ≤0.125 ≤ 0.125 0.125 12 肠球菌9 2 2 0.5 0.5 ≤0.125 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.125 0.25 0.25 13 肠球菌16 4 4 1 1 ≤0.125 0.25 0.25 0.25 0.125 0.125 ≤0.125 0.125 0.125 14 肠球菌22 2 2 0.5 0.5 ≤0.125 0.25 0.25 0.25 0.125 0.125 0.125 ≤ 0.125 0.125 15 肠球菌24 2 2 0.5 0.5 ≤0.125 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 ≤0.125 0.25 0.25 16 肠球菌Enfa_29212 ＞64 - ＞50 ＞50 0.5 0.5 0.5 1 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 17 肠球菌Enfa_t29882 ＞64 - ＞50 ＞50 0.125 0.5 0.5 0.5 0.125 0.125 0.25 1 0.5 18 ATCC 29213 2 2 0.5 0.5 ≤0.125 0.25 0.25 0.25 0.125 0.125 ≤0.125 0.25 0.25 19 ATCC 29213 2 2 0.5 1 ≤0.125 0.25 0.25 0.25 0.125 0.125 0.125 0.25 0.125
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