NF-κB(核因子κB)家族由转录因子Rel家族的均和杂二聚体组成。这些 转录因子的主要作用是诱导和协调广谱促炎基因包括细胞因子、趋化因子、 干扰素、MHC蛋白、生长因子和细胞粘附分子的表达(其综述参见Verma 等，Genes Dev.9：2723-35，1995；Siebenlist等，Ann.Rev.Cell.Biol.10： 405-455，1994；Bauerle和Henkel，Ann.Rev.Immunol.，12：141-179，1994； Barnes和Harin，New Engl.J.Med.，336：1066-1071，1997)。
最常见的Rel家族的二聚体复合物由p50 NFκB和p65 RelA组成 (Baeuerle和Baltimore，Cell 53：211-217，1988；Baeuerle和Baltimore，Genes DeV.3：1689-1698，1989)。在静息条件下NF-κB二聚体被抑制蛋白IκB家 族成员保留在细胞质内(Beg等，Genes Dev.，7：2064-2070，1993；Gilmore 和Morin，Trends Genet.9：427-433，1993；Haskil等，Cell 65：1281-1289， 1991)。但是，当细胞被各种细胞因子或其它外界刺激激活后，IκB蛋白就 会在两个关键的丝氨酸残基上被磷酸化(Traenckner等，EMBO J.，14：2876， 1995)，然后靶向于泛素化作用和蛋白体介导的降解(Chen，Z.J.等，Genes and Dev.9：1586-1597，1995；Scherer，D.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：11259-11263，1996；Alkalay，I.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：10599-10603，1995)。然后，所释放的NF-κB可以转位到核中并激活基因 转录(Beg等，Genes Dev.，6：1899-1913，1992)。
已证实有多种外界刺激可以激活NF-κB(Baeuerle，P.A.和Baichwal，V.R.， Adv.Immunol.，65：111-136，1997)。尽管大部分NF-κB活化剂均可以引起IκB 的磷酸化，但证实有多种途径可以导致该关键的事件。受体介导的NF-κB 激活依赖于特异性的受体和衔接子/信号分子(例如，TRADD、RIP、TRAF、 MyD88)以及相关的激酶(IRAK、NIK)之间的相互作用(Song等，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 94：9792-9796，1997；Natoli等，JBC 272：26079-26082，1997)。 环境的刺激例如紫外光和γ-辐射似乎可以通过另一种不太确定的机制刺激 NF-κB。
最近的出版物部分阐明了NF-κB的激活。该研究确定了三种调节特异 性IκB/NF-κB相互作用的关键酶：NF-κB诱导激酶(NIK)(Boldin等，Cell 85：803-815，1996)、IκB激酶-1(IKK-1)(Didonato等，Nature 388：548，1997； Regnier等，Cell 90：3731997)和IκB激酶-2(IKK-2)(Woronicz等，Science 278：866，1997；Zandi等，Cell 91：243，1997)。
NIK似乎代表了由肿瘤坏死因子和白介素-1激发的NF-κB信号级联反 应的常见的介体，并且是IκB磷酸化的有效诱导物。但NIK不能直接磷酸 化IκB。
IKK-1和IKK-2被认为是处于紧邻NIK的下游，并且能够直接磷酸化 所有三种IκB亚型。IKK-1和IKK-2在氨基酸水平上有52％的同源性，但 具有类似的底物特异性；但酶的活性似乎是不同的：IKK-2效力比IKK-1 强数倍。与诱变研究相结合的表达数据表明IKK-1和IKK-2可以通过其C- 末端亮氨酸拉链基序形成均和杂二聚体，更倾向于形成杂二聚体的形式 (Mercurio等，Mol.Cell Biol.，19：1526，1999；Zandi等，Science；281：1360， 1998；Lee等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：9319，1998)。
NIK、IKK-1和IKK-2均是丝氨酸/苏氨酸激酶。最近的数据表明，酪氨 酸激酶在调节NF-κB的激活中也起重要作用。许多研究小组证实，TNF-α 诱导的NF-κB激活可以通过蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)和酪氨酸激酶进行调 节(Amer等，JBC 273：29417-29423，1998；Hu等，JBC 273：33561-33565，1998； Kaekawa等，Biochem.J.337：179-184，1999；Singh等，JBC 271 31049-31054， 1996)。这些酶的作用机制似乎是调节IκB的磷酸化状态。例如，PTP1B和 未确定的酪氨酸激酶似乎可以直接控制IκB-α上的赖氨酸残基(K42)的磷酸 化，而这对邻近的丝氨酸残基作为IKK磷酸化靶点的可能性有关键性的影 响。
许多研究小组证实，IKK-1和IKK-2与其它蛋白包括IKAP(Cohen等， Nature 395：292-296，1998；Rothwarf等，Nature 395：297-300，1998)、MEKK-1、 推定的MAP激酶磷酸酶(Lee等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：9319-9324， 1998)以及NIK和IκB一起构成了“信号传导体(signalosome)”结构的一部分。 现在逐渐有数据表明，虽然IKK-1和IKK-2均与NIK有关，但它们会不同 地被激活，因此可能代表了激活NF-κB的一系列信号的一个重要的集合点。 重要的是，已发现MEKK-1(推定的信号传导体的成分之一以及紫外光、LPS 诱导的信号分子和小GTPases的靶点)可以激活IKK-2但不能激活IKK-1。 类似地，IKK-1的NIK磷酸化会引起IKK-1活性的剧烈增加但对IKK-2仅 有很小的影响(其综述参见Mercurio，F.和Manning，A.M.，Current Opinion in Cell Biology，11：226-232，1999)。
抑制NF-κB的激活有可能在治疗炎性疾病中有广泛的应用。
越来越多的证据表明NF-κB信号传导在癌症和转移的发展中起着重要 的作用。已经在许多肿瘤类型和肿瘤细胞系中提及到c-Rel、NF-κB2或IκBα 的异常表达，现在有数据表明，通过IKK-2的组成型NF-κB信号传导出现 在多种肿瘤细胞系中。这种活性与生长因子信号传导中的各种上游缺陷有 关，如自分泌环的建立、或涉及IKK复合物激活的癌基因产物如Ras、AKT、 Her2的出现。组成型NF-κB活性被认为通过激活抗细胞凋亡基因如 A1/Bfi-1、EX-1、XIAP(这些抗细胞凋亡基因导致抑制细胞死亡途径和促进 细胞生长的细胞周期蛋白D1的转录上调)，从而促进肿瘤生成。其它数据 表明该途径还可能涉及细胞粘着和细胞表面蛋白酶的调节。这提示了NF-κB 活性在转移发展中可能具有另外的作用。证实NF-κB活性涉及肿瘤生成的 证据包括体外抑制肿瘤细胞的生长和修饰形式的IκBα(超阻抑物IκBα)的体 内表达。
除了在许多肿瘤类型中观察到组成型NF-κB信号传导之外，还报道了 NF-κB也响应于某些类型的化学治疗被激活。由对应于化学治疗的IκBα超 阻抑物形式的表达抑制NF-κB激活，证实了异种移植模型中化学治疗的抗 肿瘤作用。因此，还暗示了NF-κB活性参与诱导的化学抗性。
专利申请WO01/58890公开了用作IKK-2抑制剂的一些噻吩甲酰胺衍生 物。现在我们公开了另一组噻吩甲酰胺衍生物，其具有所需的药理活性谱 以及有利的药物代谢动力学特性。
发明公开
本发明提供了式(I)化合物

其中：
R1代表H或CH3；
R2代表H、卤素、氰基、C1-2烷基、三氟甲基或C1-2烷氧基；
n代表整数1、2或3；
m代表整数0、1、2或3；
R3代表H、C2-4烯基或C1-4烷基；所述烷基任选地进一步被CN、C1-4 烷氧基、C1-4烷基-SO2-或一个或多个氟原子取代；
或者R3代表C1-4亚烃基，其通过另外与芳香环Ar或连接 基-CR4R5-(CR4R5)n-键合而形成4-7元氮杂环；
R4和R5独立地代表H或C1-2烷基；或CR4R5一起代表任选并入了选 自O或S的一个杂原子的3-6元碳环；并且各个R4、各个R5和各个CR4R5 独立地选择；
Ar代表苯环或含有1至3个独立地选自O、N和S的杂原子的5或6 元杂芳香环；所述苯环或杂芳香环任选地被一个或多个独立地选自卤素、 氰基、C1-2烷基、三氟甲基、C1-2烷氧基、NR6R7、-CONR6R7、-COOR6、 -NR6COR7、-S(O)pR6、-SO2NR6R7和-NR6SO2R7的取代基所取代；
R6和R7独立地代表H、C2-4烯基或C1-4烷基；所述烷基或烯基任选 地进一步被一个或多个卤素原子取代；
P代表整数0、1或2；
及其可药用盐。
一些式(I)化合物能够以立体异构体的形式存在。应当理解，本发明包括 式(I)化合物的所有几何和光学异构体及其混合物，包括外消旋体。互变异 构体及其混合物也构成了本发明的一个方面。
一个实施方案中，式(I)中的n代表整数1。
另一个实施方案中，式(I)中的R1代表H。
另一个实施方案中，式(I)中的R2代表H。
另一个实施方案中，式(I)中的m代表整数1。
另一个实施方案中，式(I)中各个R4和各个R5代表H。
再一个实施方案中，-CR4R5-(CR4R5)n-与R3相连以及与R3连接的氮原 子一起形成5元氮杂环。
另一个实施方案中，R3是氢或C1-4烷基，或者R3代表C1-4亚烃基， 其通过另外与芳香环Ar或连接基-CR4R5-(CR4R5)n-键合而形成4-7元氮杂 环。
再一个实施方案中，R3是氢或甲基，或者R3代表C1-2亚烃基，其通过 另外与芳香环Ar或连接基-CR4R5-(CR4R5)n-键合而形成5元氮杂环。
再一个实施方案中，R3是氢或甲基，或者当-(CR4R5)m-是亚甲基时，R3 代表亚甲基，其通过另外与芳香环Ar键合从而与其连接的氮、-(CR4R5)m-和Ar形成吡咯烷，或者当n是1时，R3代表亚乙基，其通过另外 与-CR4R5-(CR4R5)n-中的-CR4R5-基键合而形成吡咯烷。
一个实施方案中，R6和R7独立地代表氢或C1-4烷基。
另一个实施方案中，R6和R7独立地代表氢或甲基或乙基。
一个实施方案中，Ar未被取代或被卤素取代。
一个实施方案中，Ar任选地被1、2或3个取代基取代。
另一个实施方案中，Ar任选地被1或2个取代基取代。
再一个实施方案中，Ar任选地被1个取代基取代。
另一个实施方案中，Ar未被取代。
另一个实施方案中，式(I)中的Ar代表任选取代的苯基。
另一个实施方案中，式(I)中的Ar代表任选取代的吡啶基。
一个实施方案中，式(I)中的甲酰胺基(carboxamido)连接在噻吩环的3- 位上。
另一个实施方案中，式(I)中的甲酰胺基连接在噻吩环的2-位上。
一个实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中n和m各自代表整数1； R1和R2各自代表H；各个R4和各个R5代表H；Ar代表任选取代的苯基或 吡啶基；和R3、R6、R7和p如上所定义。
一个实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中n和m各自代表整数1； R1和R2各自代表H；各个R4和各个R5代表H；Ar代表任选取代的苯基或 吡啶基；R3是氢或甲基，或者R3代表C1-2亚烃基，其通过另外与芳香环 Ar或连接基-CR4R5-(CR4R5)n-键合而形成5元氮杂环；R6和R7独立地代表 氢或C1-4烷基且p如上所定义。
一个实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中n和m各自代表整数1； R1和R2各自代表H；各个R4和各个R5代表H；Ar代表任选取代的苯基或 吡啶基；R3是氢或甲基，或者R3代表C1-2亚烃基，其通过另外与芳香环 Ar或连接基-CR4R5-(CR4R5)n-键合而形成5元氮杂环；且当Ar是苯基时， 其上存在1或2个任选的取代基，所述取代基独立地选自卤素和当Ar是吡 啶基时，其是未取代的。
一个实施方案中，本发明涉及式(I)化合物，其中n和m各自代表整数1； R1和R2各自代表H；各个R4和各个R5代表H；Ar代表任选取代的苯基或 吡啶基；R3是氢或甲基，或者R3代表C1-2亚烃基，其通过另外与芳香环 Ar或连接基-CR4R5-(CR4R5)n-键合而形成5元氮杂环；和R6、R7和p如上 所定义。
式(I)化合物及其可药用盐的有利之处在于它们是酶IKK-2的抑制剂。
本发明还提供了一种制备式(I)化合物或其可药用盐、对映体或外消旋体 的方法。
根据本发明，还提供了式(I)化合物或其可药用盐作为药物的用途。
本发明的另一方面提供了式(I)化合物或其可药用盐在制备用于治疗或 预防其中抑制IKK-2活性是有益的疾病或病症的药物中的用途。
本发明更具体地提供了式(I)化合物或其可药用盐在制备用于治疗或预 防炎性疾病的药物中的用途。
根据本发明，还提供了一种治疗或降低其中抑制IKK-2活性是有益的 疾病或病症危险的方法，该方法包括，向患有所述疾病或病症或易患所述 疾病或病症的患者施用治疗有效量的式(I)化合物或其可药用盐。
更具体地讲，本发明还提供了一种给患有或易患所述疾病的患者治疗或 降低炎性疾病发病危险的方法，该方法包括，向所述患有施用治疗有效量 的式(I)化合物或其可药用盐。
本发明的具体化合物包括以下列举的那些：
2-[(氨基羰基)氨基]-5-[2-{2-[{N-(2-氯苄基)-N-甲基}氨基]乙氧基}苯基] 噻吩-3-甲酰胺；
2-[(氨基羰基)氨基]-5-[2-{2-[{N-(4-氯苄基)-N-甲基}氨基]乙氧基}苯基] 噻吩-3-甲酰胺；
2-[(氨基羰基)氨基]-5-[2-{2-(苄基氨基)乙氧基}苯基]噻吩-3-甲酰胺；
2-[(氨基羰基)氨基]-5-[2-{2-[N-苄基-N-甲基氨基]乙氧基}苯基]噻吩-3- 甲酰胺；
2-[(氨基羰基)氨基]-5-[2-{2-(1，3-二氢-2H-异吲哚-2-基)乙氧基}苯基]噻 吩-3-甲酰胺；
2-[(氨基羰基)氨基]-5-[2-{[1-(4-氟苄基)吡咯烷-3-基]氧基}苯基]噻吩-3- 甲酰胺；
2-[(氨基羰基)氨基]-5-[2-{[1-苄基吡咯烷-3-基]氧基}苯基]噻吩-3-甲酰 胺；
2-[(氨基羰基)氨基]-5-[2-{2-[(4-氟苄基)氨基]乙氧基}苯基]噻吩-3-甲酰 胺；
2-[(氨基羰基)氨基]-5-[2-{2-(吡啶-3-基甲基氨基)乙氧基}苯基]噻吩-3- 甲酰胺；
2-[(氨基羰基)氨基]-5-[2-{2-(吡啶-2-基甲基氨基)乙氧基}苯基]噻吩-3- 甲酰胺；
2-[(氨基羰基)氨基]-5-[2-{2-(吡啶-4-基甲基氨基)乙氧基}苯基]噻吩-3- 甲酰胺；
2-[(氨基羰基)氨基]-5-[2-{2-[N-(吡啶-3-基甲基)-N-甲基氨基]乙氧基}苯 基]噻吩-3-甲酰胺；
3-[(氨基羰基)氨基]-5-[2-{2-(1，3-二氢-2H-异吲哚-2-基)乙氧基}苯基]噻 吩-2-甲酰胺；
及其可药用盐。
若无另外说明，术语“C1-4烷基”在本文中是指含有1至4个碳原子的 直链或支链烷基基团。所述基团的例子包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、 正丁基、异丁基和叔丁基。术语“C1-2烷基”可以进行类似的解释。
若无另外说明，术语“C2-4烯基”在本文中是指有至少一个碳碳双键的 具有2至4个碳原子的直链或支链烷基。所述基团的例子包括乙烯基和丙 烯基。
若无另外说明，术语“C1-4亚烃基”在本文中是指有两个自由价的含有1 至4个碳原子的直链或支链烷基。所述基团的例子包括亚甲基和亚乙基。
若无另外说明，术语“C1-4烷氧基”在本文中是指含有1至4个碳原子 的直链或支链烷氧基。所述基团的例子包括甲氧基、乙氧基和异丙氧基。 术语“C1-2烷氧基”可以进行类似的解释。
若无另外说明，术语“卤素”是指氟、氯、溴和碘。
4-7元氮杂环的例子包括吡咯烷和哌啶。
含有1至3个独立地选自O、N和S的杂原子的5或6元杂芳香环的例 子包括吡啶、嘧啶、呋喃、噻吩、异噁唑、三唑和吡唑。
任选地并入了一个选自O和S的杂原子的3-6元碳环的例子包括环丙 基、环戊基、环己基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基 和哌啶基。
本发明还提供了一种制备式(I)化合物或其可药用盐、对映体或外消旋体 的方法，该方法包括：
(a)将式(II)化合物：

其中R1、R2、R3、R4、R5、Ar、m和n如式(I)中所定义，与异氰酸酯 反应；或
(b)将式(III)化合物

其中R1、R2、R4、R5和n如式(I)中所定义，并且LG代表离去基，与 胺(R3NH(CR4R5)m-Ar)反应，其中R3、R4、R5、Ar和m如式(I)中所定义； 或
(c)将式(IV)化合物

其中R2、R3、R4、R5、m、n和Ar如式(I)中所定义，
与式(V)化合物反应

其中R1如式(I)中所定义且LG代表离去基；或
(d)将式(VI)化合物

其中R2、R3、R4、R5、m、n和Ar如式(I)中所定义，并且LG代表离去 基，
与式(VII)化合物反应

其中R1如式(I)中所定义；
以及在需要时将形成的式(I)化合物或其另一种盐转化成其可药用盐；或 将形成的式(I)化合物转化成另一种式(I)化合物；并且在需要时将形成的式(I) 化合物转化成其光学异构体。
在方法(a)中，适宜的异氰酸酯试剂包括三甲基硅烷基异氰酸酯、三氯 乙酰基异氰酸酯和异氰酸钠。与三甲基硅烷基异氰酸酯反应可以在溶剂例 如二氯甲烷/二甲基甲酰胺中、在适当升高的温度下例如反应混合物的回流 温度下进行。与异氰酸钠的反应可以在适宜的溶剂系统例如含水乙酸中在 室温下进行。与三氯乙酰基异氰酸酯的反应可以在适宜的溶剂系统例如乙 腈中在室温下进行，然后将混合物用氨处理得到通式(I)的化合物。在优选 实施方案中，所述异氰酸酯是三氯乙酰基异氰酸酯。
在方法(b)中，式(III)化合物在合适的反应条件下与胺反应。该反应可以 存在或不存在碱。上述碱可以是无机的或有机的。适宜的离去基包括碘、 溴、氯、磺酸基和三氟甲磺酸基。
在方法(c)和(d)中，式(IV)和(V)化合物或式(VI)和(VII)化合物在过渡金 属如钯或镍的配合物的催化下反应。在式(IV)和(VII)化合物中，在适宜的条 件下，“金属”可以是金属或半金属，例如镁、锌、铜、锡、硅、锆、铝或硼。 适宜的离去基包括碘、溴、氯、三氟甲磺酸基或膦酸基。
本领域技术人员可以理解，在本发明的方法中，在原料试剂或中间体化 合物中的某些官能团例如羟基或氨基可能需要用保护基进行保护。因此， 式(I)化合物的制备可能在适宜的阶段涉及一种或多种保护基的加入和脱 除。
官能团的保护和脱保护详细记载于“Protective Groups in Organic Chemistry”，J.W.F.McOmie编，Plenum Press(1973)和“Protective Groups in Organic Synthesis”，第3版，T.W.Greene&P.G.M.Wuts， Wiley-Interscience(1999)。
本发明包括盐形式、特别是酸加成盐形式的式(I)化合物。适宜的盐包括 与有机酸和无机酸形成的盐。所述的酸加成盐通常是可药用的，但不可药 用的盐可用于制备和纯化所述的化合物。因此，优选的盐包括由盐酸、氢 溴酸、硫酸、磷酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、富 马酸、马来酸、甲磺酸和苯磺酸形成的盐。
式(I)化合物的盐可以通过将游离碱或其盐、对映体或外消旋体与一或多 当量适宜的酸反应形成。反应可以在不能溶解盐的溶剂或介质中进行，或 在可以溶解盐的溶剂例如水、二氧六环、乙醇、四氢呋喃或乙醚或溶剂的 混合物中进行，这些溶剂可以通过真空或冷冻干燥除去。反应还可以是置 换方法或者可以在离子交换树脂上进行。
式(II)化合物可以通过文献[如J.Heterocyclic Chem.，36，333(1999)]中描 述的常规化学方法制备，或通过将式(VIII)化合物与氨反应进行制备：

其中R1、R2、R3、R4、R5、Ar、m和n如式(I)中所定义，LG代表离去 基。适宜的基团LG包括卤素，特别是氯。
其中LG是卤素的式(VIII)化合物可以从相应的式(IX)化合物通过用卤 化试剂例如亚硫酰氯处理进行制备：

其中R1、R2、R3、R4、R5、Ar、m和n如式(I)中所定义。
式(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)和(IX)化合物可以购买到或者可以用本 文中描述的常规化学方法制备。
一些新的中间体化合物构成了本发明的另一方面。
式(I)化合物具有药物活性、特别是IKK-2酶抑制剂治性，可用于在人 或非人类的动物中治疗(治疗性或预防性的)抑制IKK-2酶是有益的病症/疾 病。所述病症/疾病的例子包括炎性疾病或存在炎症成分的疾病。具体的疾 病包括炎性关节炎，包括类风湿性关节炎、骨关节炎、脊椎炎、莱特尔氏 综合征、牛皮癣性关节炎、狼疮和骨吸收疾病；多发性硬化、炎性肠疾病， 包括节段性回肠炎；哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺气肿、鼻炎、重症肌无 力、格雷夫斯氏病、同种异体移植排斥、牛皮癣、皮炎、过敏性疾病、免 疫综合征、恶病质、ARDS、中毒性休克、心衰、心肌梗塞、动脉粥样硬化、 再灌注损伤、AIDS、癌症和特征为胰岛素耐药性的病症例如糖尿病、高血 糖、高胰岛素血症、血脂障碍、肥胖、多囊卵巢疾病、高血压、心血管疾 病和综合征X。
已报道的NF-κB在肿瘤生成和化学抗性中的作用提示通过使用IKK-2 抑制剂如小分子IKK-2抑制剂来抑制该途径可以提供一种新的癌症单一疗 法和/或用IKK-2抑制剂与标准治疗或其它新药剂的联合治疗为化学抗性肿 瘤的治疗和细胞凋亡的协同诱导中提供重要的辅助疗法。
我们对选自哮喘、类风湿性关节炎、牛皮癣、炎性肠疾病包括节段性回 肠炎、多发性硬化、慢性阻塞性肺疾病、骨吸收疾病、骨关节炎、糖尿病/ 血糖控制和癌症的疾病尤为感兴趣。
因此，本发明提供了以上所定义的式(I)化合物或其可药用盐用于治疗。
另一方面，本发明提供了以上所定义的式(I)化合物或其可药用盐在制备 用于治疗的药物中的用途。
另一方面，本发明提供了以上所定义的式(I)化合物或其可药用盐在制备 用于治疗调节IKK-2酶活性有益的疾病或病症的药物中的用途。
在本说明书中，术语“治疗”还包括“预防”，除非有具体的相反指示。术 语“治疗的”和“治疗地”应作相应地解释。
预防是指对患有所述疾病或病症的前期事件或被认为是发病的危险性 增加的人进行特别相关的治疗。有发生某种疾病或病症的危险性的人通常 包括有该疾病或病症的家族史的人或通过基因检测或筛选确定易于发生该 疾病或病症的人。
本发明还提供了治疗IKK-2介导的疾病的方法，该方法包括向患者施 用治疗有效量的以上所定义的式(I)化合物或其可药用盐。
本发明还提供了在患有或易患炎性疾病、特别是哮喘、类风湿性关节炎 或多发性硬化的患者中治疗所述疾病的方法，该方法包括向患者施用治疗 有效量的以上所定义的式(I)化合物或其可药用盐。
对于上述治疗应用，给药剂量会随着所采用的化合物、给药方式、需要 的治疗以及所治疗的病症而改变。
式(I)化合物及其可药用盐可以单独使用，但通常以含有式(I)化合物/盐 (活性成分)以及可药用辅剂、稀释剂或载体的药物组合物的形式给药。根据 给药方式，药物组合物优选含有0.05-99％w(重量百分比)、更优选0.05-80 ％w、仍更优选0.10-70％w、甚至更优选0.10-50％w的活性成分，所有百 分比均以整个组合物重量计。
本发明还提供了含有以上所定义的式(I)化合物或其可药用盐以及可药 用辅剂、稀释剂或载体的药物组合物。
本发明还提供了制备本发明的药物组合物的方法，该方法包括，将以上 所定义的式(I)化合物或其可药用盐与可药用辅剂、稀释剂或载体混合。
可将药物组合物以溶液、混悬液、七氟烷烃气雾剂和干粉制剂的形式局 部给药(例如向肺和/或气管或皮肤给药)；或进行全身性给药，例如，以片 剂、胶囊、糖浆、散剂或颗粒剂的形式口服给药，或以溶液或混悬液的形 式通过胃肠外给药，或通过皮下给药或以栓剂的形式通过直肠给药或经皮 给药。选择和制备适宜药物制剂的常规方法记载于例如“Pharmaceuticals- The Science of Dosage Form Designs”，M.E.Aulton，Churchill Livingstone， 1988。
本发明的一方面中，所述组合物可适于通过吸入和吹入给药。例如，所 述组合物可以适于吸入的形式给药，例如为微细粉末或液体气雾剂如由主 要是含水溶液或混悬液形成的气雾剂，或者以适于吹入给药的形式给药， 例如为微细粉末。
可以理解，由吸入或吹入传送比那些易于获得药物的下述全身吸收向所 需部位也即肺的粘膜上皮提供了较高浓度的药物。因此可以使用较小的剂 量局部地传送药物到受控的特定细胞。因而，减少了药物的任何不利全身 性副作用，并且可以更加快捷地实现治疗的有益效果。
上述给药可以使用压缩气体以从容器中排出药物，例如可使用的气雾剂 包含在压力下由气体推进剂承载的微细液体或固体颗粒。该气雾剂含有溶 解、悬浮或乳化于液体载体和推进剂的混合物中的药物。可使用的常规推 进剂例如为烃或其它合适的气体或其混合物。可采用常规计量剂量的气雾 剂和呼吸激活传递装置(MDIs)。另外，药物可使用常规喷雾器给药，该喷 雾器产生含有呈小液滴的药物的基本上均匀大小的细液体颗粒，该液滴能 渗入病人的呼吸道。另外，可使用具有或没有润滑剂、载体或推进剂的含 药物的粉末组合物。例如，化合物和适宜基料如乳糖或淀粉的粉末混合物 可制成单位剂量形式，其可以在吸入器的帮助下给药。
但是，某些病人会在肺部内产生大量的粘液，并且上述病人起初不能由 吸入法治疗。在这种情况下，优选通过注射或口服传送本发明的药物组合 物。
本发明的组合物可使用本领域公知的常规药物赋形剂由常规方法制得。 因此，用于口服应用的组合物可以例如含有一种或多种着色剂、甜味剂、 调味剂和/或防腐剂。
通过以下实施例说明本发明：
DCM              二氯甲烷；
DMF              N，N-二甲基甲酰胺；
THF              四氢呋喃；
除非另有说明，使用无水硫酸镁干燥有机溶液。
除非另有说明，阳离子交换柱使用氨/甲醇混合物洗脱。
实施例1
2-[(氨基羰基)氨基]-5-[2-{2-[{N-(2-氯苄基)-N-甲基}氨基]乙氧基}苯基]- 噻吩-3-甲酰胺
a)在氩气氛下，将N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]-N-(2-氯苄基)甲胺(1.75g)在 THF(15ml)中搅拌。将该溶液冷却到-78℃并滴加入正丁基锂(3.4ml，1.6M的 己烷溶液)。将反应混合物于-78℃下搅拌30分钟，加入硼酸三异丙酯(1.88 g)。在室温下搅拌搅拌混合物1小时，然后减压蒸发溶剂。将残余物溶解于 二甲氧基乙烷(25ml)，然后加入饱和碳酸氢钠水溶液(12ml)，以及2-[(氨基 羰基)氨基]-5-溴噻吩-3-甲酰胺(0.35g)。将混合物用氩气净化回流搅拌5分 钟并加入Pd(PPh3)4(0.1g)。然后在氩气氛下在搅拌回流混合物2小时，冷却 并减压蒸发二甲氧基乙烷。用水(10ml)和DCM(30ml)搅拌残余物30分钟并 过滤。用水、DCM和甲醇洗涤固体，得到浅褐色固体状的标题化合物(0.204 g)。
MS(ES)459(M+H)+.
1H NMR(DMSO-D6)2.25(s，3H)，2.9(t，2H)，3.65(s，2H)，4.0(t，2H)，6.8(s， 2H)，6.95(t，1H)，7.1(d，1H)，7.1-7.25(m，4H)，7.3(m，1H)，7.45(m，1H)，7.6(m， 2H)，7.7(s，1H)，10.9(s，1H)。
b)N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]-N-(2-氯苄基)甲胺
在DMF(45ml)中将N-2-氯苄基甲胺(3.0g)、1-溴-2-(2-氯乙氧基)苯(4.0 g)、碘化钾(0.165g)和碳酸钾(7.0g)于115℃下搅拌加热18小时。冷却混合 物，滤除固体，蒸发DMF溶液，将其再次溶解于乙酸乙酯中，硅胶吸附并 蒸干，经色谱乙酸乙酯-异己烷混合物洗脱得到油状产物(1.7g)。
MS(ES)354(M+H)+.
1H NMR(CDCl3)2.4(s，3H)，3.0(t，2H)，3.75(s，2H)，4.2(t，2H)，6.7-6.9(m， 2H)，7.15-7.3(m，3H)，7.3(d，1H)，7.5-7.6(m，2H)。
实施例2
2-[(氨基羰基)氨基]-5-[2-{2-[{N-(4-氯苄基)-N-甲基}氨基]乙氧基}苯基] 噻吩-3-甲酰胺
a)按照与实施例1(a)类似的方式由N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]-N-(4-氯苄 基)甲胺制备标题化合物。冷却后，蒸发掉溶剂，将残余物用DCM和水搅 拌。将DCM层进行硅胶色谱，用甲醇-DCM混合物洗脱，将相关的级分蒸 发至胶状，用乙醚研制得到固体状的标题化合物。
MS(ES)459(M+H)+.
1H NMR(DMSO-D6)2.2(s，3H)，2.9(t，2H)，3.55(s，2H)，4.2(t，2H)，6.8(bs， 2H)，6.9(t，1H)，7.05(d，1H)，7.2(m，2H)，7.3(s，4H)，7.5-7.7(m，2H)，7.75(s，1H)。
b)N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]-N-(2-氯苄基)甲胺
按照与实施例1(b)类似的方式由2-(2-溴苯氧基)乙基氯和N-甲基-4-氯苄 基胺制备，并用硅胶色谱纯化，DCM洗脱，得到油状标题化合物。
1H NMR(CDCl3)2.35(s，3H)，2.9(t，2H)，3.6(s，2H)，4.1(t，2H)，6.8-6.9(m， 2H)，7.2-7.3(m，4H)，7.5(d，2H)。
实施例3
2-[(氨基羰基)氨基]-5-[2-{2-(苄基氨基)乙氧基}苯基]噻吩-3-甲酰胺
a)将N-[2-(2-{3-(氨基羰基)-2-[(氨基羰基)氨基]噻吩-5-基}苯氧基)乙 基]-N-苯基氨基甲酸叔丁基酯(0.16g)溶于DCM(3ml)中；加入茴香硫醚(0.5 g)和三氟乙酸(1ml)。搅拌混合物30分钟，然后加入水(5ml)并用DCM萃取 该混合物。将DCM萃取物加入SCX阳离子交换柱并用30％甲醇-DCM洗脱以 除去茴香硫醚，然后用氨的甲醇溶液-DCM混合物洗脱。蒸发掉溶剂，用甲 醇重结晶残余物，得到白色固体的标题化合物(0.04g)。
MS(ES)411(M+H)+.
1H NMR(DMSO-D6)2.9(t，2H)，3.8(s，2H)，4.1(t，2H)，6.9(s，2H)，7.0(t， 1H)，7.05(d，1H)，7.15-7.35(m，8H)，7.6(d，1H)，7.65(s，1H)，7.8(s，1H)，10.9(s， 1H)。
b)N-[2-(2-{3-(氨基羰基)-2-[(氨基羰基)氨基]噻吩-5-基}苯氧基)乙 基]-N-苯基氨基甲酸叔丁基酯
除了DCM层用DCM-甲醇混合物洗脱由硅胶色谱处理两次之外，按照与 实施例1(a)类似的方式由N-苄基-N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]氨基甲酸叔丁基酯 制备，得到树脂状固体的标题化合物。
MS(ES)511(M+H)+.
1H NMR(DMSO-D6)1.35(s，9H)，3.6(t，2H)，4.2(t，2H)，4.5(s，2H)，6.5(bs 2H)，6.9-7.4(m，10H)，7.5(d，1H)，7.6(s，1H)，10.9(s，1H)。
c)N-苄基-N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]氨基甲酸叔丁基酯
用5分钟将焦碳酸二叔丁酯(0.96g)的DCM(4ml)溶液加入搅拌的N- 苄基-N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]胺(1.3g)的DCM(16ml)溶液中，并搅拌该混合 物1.5小时，然后浓缩至6ml，用异己烷(12ml)稀释。将溶液进行硅胶色谱， 用异己烷-DCM混合物洗脱，得到无色油状的标题化合物(0.9g)。
MS(ES)350(M+H-56)+.
1H NMR(DMSO-D6，100℃)1.4(s，9H)，3.5(t，2H)，4.15(t，2H)，4.55(s， 2H)，6.9(t，1H)，7.1(d，1H)，7.2-7.35(m，6H)，7.55(d，1H)。
d)N-苄基-N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]胺
根据实施例1(b)的方法由苄基胺和1-溴-2-(2-氯乙氧基)苯制备。经硅胶 色谱DCM-氨的甲醇液处理后所得的物质搅拌于DCM中，过滤除去固体。蒸 发母液得到油状的标题化合物。
1H NMR(DMSO-D6)2.9(t，2H)，3.2-3.3(bs，1H)，3.8(s，2H)，4.1(t，2H)， 6.9(t，1H)，7.1(d，1H)，7.2-7.35(m，6H)，7.55(d，1H)。
实施例4
2-[(氨基羰基)氨基]-5-[2-{2-[N-苄基-N-甲基氨基]乙氧基}苯基]噻吩-3- 甲酰胺
a)除了在蒸发掉二甲氧乙烷后，用DCM(100ml)萃取含水残余物之外， 按照与实施例1(a)类似的方式由N-苄基-N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]甲胺制备标 题化合物。然后，DCM萃取液用5％乙酸水溶液萃取，用10N氢氧化钾溶 液调节乙酸萃取液至pH 8，过滤收集所得沉淀，用水洗涤，甲醇(5ml)中消 化，得到固体的标题化合物。
MS 425(M+H)+.
1H NMR(DMSO-D6)2.2(s，3H)，2.9(t，2H)，3.55(s，2H)，4.25(t，2H)，6.8(s， 2H)，7.0(t，1H)，7.1(d，1H)，7.2-7.3(m，7H)，7.6(d，2H)，7.8(s，1H)，11.0(s，1H)。
b)N-苄基-N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]甲胺
除了在65℃下搅拌混合物16小时之外，按照与实施例1(b)类似的方式 由1-溴-2-(2-氯乙氧基)苯和N-甲基苄基胺制备。
MS(ES)320(M+H)+.
1H NMR(CDCl3)2.4(s，3H)，2.9(t，2H)，3.7(s，2H)，4.1(t，2H)，6.7-6.9(m， 2H)，7.15-7.4(m，6H)，7.5(d，1H)。
实施例5
2-[(氨基羰基)氨基]-5-[2-{2-(1，3-二氢-2H-异吲哚-2-基)乙氧基}苯基]噻 吩-3-甲酰胺
a)除了得到的粗固体溶于DCM中并用5％乙酸水溶液萃取之外，按照 与实施例1(a)类似的方式由2-[2-(2-溴苯氧基)乙基]异二氢吲哚制备标题化 合物；该乙酸萃取液用碳酸氢钠溶液调节至pH9，过滤收集所得沉淀。
MS(ES)423.2(M+H)+.
1H NMR(DMSO-D6)3.2(t，2H)，3.9(s，4H)，4.2(t，2H)，6.8(bs，2H)，7.0(t， 1H)，7.1-7.3(m，7H)，7.5-7.7(m，2H)，7.75(s，1H)。
b)2-[2-(2-溴苯氧基)乙基]异二氢吲哚
除了在100℃下搅拌混合物16小时和产物用硅胶色谱纯化利用乙酸乙 酯-异己烷混合物洗脱之外，按照与实施例1(b)类似的方式制备。
MS(ES)318(M+H)+.
1H NMR(CDCl3)3.2(t，2H)，4.1(s，4H)，4.2(t，2H)，6.8(t，1H)，6.9(d，1H)， 7.2(s，4H)，7.3(t，1H)，7.5(d，1H)。
实施例6
2-[(氨基羰基)氨基]-5-[2-{[1-(4-氟苄基)吡咯烷-3-基]氧基}苯基]噻吩-3- 甲酰胺
a)除了浓缩的反应混合物在DCM和饱和碳酸钠之间进行分配之外，按 照与实施例1(a)类似的方式由3-(2-溴苯氧基)-1-(4-氟苄基)吡咯烷制备标题 化合物。(盐水)洗涤溶剂层，干燥并蒸发，留下油状物，由阳离子交换色谱 纯化。
MS(ES)455(M+H)+.
1H NMR(DMSO-D6)2.0(m，1H)，2.3(m，1H)，2.55(m，2H)，2.75(m，2H)， 3.0(m，1H)，3.7(m，2H)，5.0(m，1H)，6.8(b r，2H)，6.95(m，2H)，7.1(m，2H)，7.2(br， 1H)，7.3(m，2H)，7.6(m，2H)，7.8(s，1H)，10.95(s，1H)。
b)3-(2-溴苯氧基)-1-(4-氟苄基)吡咯烷
将氢化钠(0.144g，60％的油分散体)分次加入搅拌的2-溴苯酚(0.52g)的 二甲基乙酰胺(10ml)溶液中。搅拌15分钟后，分次加入1-(4-氟苄基)吡咯 烷-3-基甲磺酸酯(3.7mmol)的二甲基乙酰胺(10ml)溶液，并在75℃下搅拌所 得反应混合物18小时。蒸干溶剂，残余物溶解于乙酸乙酯/水中。溶剂相洗 涤(盐水)两次，干燥并蒸发，留下油状物，由阳离子交换色谱纯化，得到标 题化合物(0.6g)。
MS(ES)350(M+H)+.
1H NMR(DMSO-D6)1.6(m，1H)，2.05(m，1H)，2.3(m，1H)，2.7(m，2H)， 3.1(m，1H)，3.6(s，2H)，4.8(m，1H)，6.8(m，2H)，7.0(m，2H)，7.2(m，3H)，7.55(dd， 1H)。
c)1-(4-氟苄基)吡咯烷-3-基甲磺酸酯
将1-(4-氟苄基)吡咯烷-3-醇(0.72g)和三乙胺(0.62ml)的甲苯(50ml)溶液 冷却到0℃，搅拌下滴加甲磺酰氯(0.34ml)。将混合物升温至室温并再搅拌 4小时。过滤反应混合物，蒸发滤液，得到油状物，立即使用。
d)1-(4-氟苄基)吡咯烷-3-醇
在室温下搅拌3-吡咯烷醇(1.74g)和4-氟苄基溴(4.9g)的丙酮溶液24小 时。蒸发溶剂之后，残余物用30％w/v氢氧化钾溶液处理并用乙酸乙酯萃 取两次。合并溶剂相，用盐水洗涤并干燥。蒸发溶剂得到油状物，用阳离 子交换色谱纯化，得到标题化合物(0.72g)。
MS(ES)196(M+H)+.
1H NMR(CDCl3)1.75(m，1H)，2.2(m，2H)，2.3(m，2H)，2.5(m，1H)，2.6(m， 1H)，2.8(m，1H)，3.6(s，2H)，4.35(m，1H)，7.0(m，1H)，7.25(m，2H)。
实施例7
2-[(氨基羰基)氨基]-5-[2-{[1-苄基吡咯烷-3-基]氧基}苯基]噻吩-3-甲酰 胺
a)按照与实施例6(a)类似的方式由1-苄基-3-(2-溴苯氧基)吡咯烷制备标 题化合物。
MS(ES)437(M+H)+.
1H NMR(DMSO-D6)2.0(m，1H)，2.2(m，1H)，2.5(m，1H)，2.7(m，2H)， 3.0(m，1H)，3.6(m，2H)，5.0(m，1H)，6.8(br，2H)，6.95(m，2H)，7.2(m，3H)，7.3(m， 5H)，7.7(s，1H)，7.8(m，1H)，10.91(s，1H)。
b)1-苄基-3-(2-溴苯氧基)吡咯烷
按照与实施例6(b)类似的方式由1-苄基吡咯烷-3-基甲磺酸酯和2-溴苯酚 制备标题化合物，并用阳离子交换色谱纯化。
MS(ES)334(M+H)+.
1H NMR(DMSO-D6)2.0(m，1H)，2.3(m，1H)，2.7(m，3H)，3.15(m，1H)， 3.7(s，2H)，4.8(m，1H)，6.8(m，2H)，7.25(m，6H)，7.5(m，1H)。
c)1-苄基吡咯烷-3-基甲磺酸酯
按照与实施例6(c)类似的方式由1-苄基吡咯烷-3-醇制备标题化合物。
MS(ES)256(M+H)+.
实施例8
2-[(氨基羰基)氨基]-5-[2-{2-[(4-氟苄基)氨基]乙氧基}苯基]噻吩-3-甲酰 胺
a)标题化合物的制备过程如下：在室温下，用10％三氟乙酸水溶液处 理N-[2-(2-{3-(氨基羰基)-2-[(氨基羰基)氨基]噻吩-5-基}苯氧基)乙基]-N-[4- 氟苄基]氨基甲酸叔丁基酯2小时，然后用阳离子交换色谱纯化。
MS(ES)429(M+H)+.
1H NMR(DMSO-D6)2.9(m，2H)，3.8(s，2H)，4.15(m，2H)，6.85(br，2H)， 6.95(m，1H)，7.05(m，3H)，7.2(m，2H)，7.35(m，2H)，7.6(m，2H)，7.75(s，1H)， 10.92(s，1H)。
b)N-[2-(2-{3-(氨基羰基)-2-[(氨基羰基)氨基]噻吩-5-基}苯氧基)乙 基]-N-[4-氟苄基]氨基甲酸叔丁基酯
除了浓缩的反应混合物在DCM和饱和碳酸钠之间进行分配之外，按照 与实施例1(a)类似的方式由N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]-N-[4-氟苄基]氨基甲酸 叔丁基酯制备标题化合物。(盐水)洗涤溶剂层，干燥并蒸发，留下油状物。 经硅胶色谱用DCM/甲醇混合物洗脱得到纯净的产物。
MS(ES)529(M+H)+.
1H NMR(DMSO-D6)1.35(s，9H)，3.6(m，2H)，4.1(m，2H)，4.4(m，2H)， 6.8(m，2H)，7.1(m，2H)，7.25(m，3H)，7.6(m，6H)，10.98(s，1H)。
c)N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]-N-[4-氟苄基]氨基甲酸叔丁基酯
用5分钟将焦碳酸二叔丁酯(1.86g)的DCM(5ml)溶液加入搅拌的 N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]-N-[4-氟苄基]胺(2.5g)的DCM(20ml)溶液中，并在 室温下搅拌该混合物4小时。用DCM稀释反应，然后用水洗涤。干燥后， 蒸发溶剂得到油状物(2.9g)。
MS(ES)424(M+H)+.
d)N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]-N-[4-氟苄基]胺
按照与实施例1(b)类似的方式由1-溴-2-(2-氯乙氧基)苯和4-氟苄基胺制 备标题化合物。
MS(ES)324(M+H)+.
实施例9
2-[(氨基羰基)氨基]-5-[2-{2-(吡啶-3-基甲基氨基)乙氧基}苯基]噻吩-3- 甲酰胺
a)按照与实施例8(a)类似的方式由N-[2-(2-{3-(氨基羰基)-2-[(氨基羰基) 氨基]噻吩-5-基}苯氧基)乙基]-N-[吡啶-3-基甲基]氨基甲酸叔丁基酯制备标 题化合物。用阳离子交换色谱进行纯化。
MS(ES)412(M+H)+.
1H NMR(DMSO-D6)3.3(m，2H)，4.2(m，2H)，4.3(m，2H)，6.9(br，2H)， 7.1-7.3(m，5H)，7.7(m，2H)，7.8(s，1H)，7.9(m，1H)，8.5(m，1H)，8.6(s，1H)， 10.95(s，1H)。
b)N-[2-(2-{3-(氨基羰基)-2-[(氨基羰基)氨基]噻吩-5-基}苯氧基)乙 基]-N-[吡啶-3-基甲基]氨基甲酸叔丁基酯
按照与实施例1(a)类似的方式由N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]-N-[吡啶-3-基甲 基]氨基甲酸叔丁基酯制备标题化合物。用阳离子交换色谱进行纯化。
MS(ES)512(M+H)+.
c)N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]-N-[吡啶-3-基甲基]氨基甲酸叔丁基酯
按照与实施例8(c)类似的方式由N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]-N-[吡啶-3-基 甲基]胺制备标题化合物。用阳离子交换色谱进行纯化。
MS(ES)407(M+H)+.
1H NMR(DMSO-D6)1.5(s，9H)，3.6(m，2H)，4.2(m，2H)，4.8(s，2H)，6.8(m， 2H)，7.2(m，2H)，7.55(m，1H)，7.6(m，1H)，8.5(m，1H)，8.6(s，1H)。
d)N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]-N-[吡啶-3-基甲基]胺
按照与实施例8(d)类似的方式由1-溴-2-(2-氯乙氧基)苯和(吡啶-3-基甲 基)胺制备标题化合物。
MS(ES)307(M+H)+.
1H NMR(DMSO-D6)3.1(m，2H)，4.05(s，2H)，4.2(m，2H)，6.8(m，2H)， 7.2(m，3H)，7.55(m，1H)，7.6(m，1H)，8.55(m，1H)。
实施例10
2-[(氨基羰基)氨基]-5-[2-{2-(吡啶-2-基甲基氨基)乙氧基}苯基]噻吩-3- 甲酰胺
a)按照与实施例8(a)类似的方式由N-[2-(2-{3-(氨基羰基)-2-[(氨基羰基) 氨基]噻吩-5-基}苯氧基)乙基]-N-[吡啶-2-基甲基]氨基甲酸叔丁基酯制备标 题化合物。用阳离子交换色谱进行纯化。
MS(ES)412(M+H)+.
1H NMR(DMSO-D6)3.4(m，2H)，4.4(m，4H)，6.9(br，2H)，7.1-7.3(m，6H)， 7.7(m，2H)，7.8(s，1H)，7.9(m，1H)，8.5(m，1H)，8.6(m，1H)，10.95(s，1H)。
b)N-[2-(2-{3-(氨基羰基)-2-[(氨基羰基)氨基]噻吩-5-基}苯氧基)乙 基]-N-[吡啶-2-基甲基]氨基甲酸叔丁基酯
按照与实施例1(a)类似的方式由N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]-N-[吡啶-2-基甲 基]氨基甲酸叔丁基酯制备标题化合物。用阳离子交换色谱进行纯化。
MS(ES)512(M+H)+.
c)N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]-N-[吡啶-2-基甲基]氨基甲酸叔丁基酯
按照与实施例8(c)类似的方式由N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]-N-[吡啶-2-基甲 基]胺制备标题化合物。用阳离子交换色谱进行纯化。
MS(ES)407(M+H)+.
1H NMR(DMSO-D6)1.5(s，9H)，3.8(m，2H)，4.2(m，2H)，4.8(s，2H)，6.8(m， 3H)，7.2(m，2H)，7.5(m，1H)，7.6(m，1H)，8.5(m，1H)。
d)N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]-N-[吡啶-2-基甲基]胺
按照与实施例8(d)类似的方式由1-溴-2-(2-氯乙氧基)苯和(吡啶-2-基甲 基)胺制备标题化合物。
MS(ES)307(M+H)+.
1H NMR(DMSO-D6)3.1(m，2H)，4.05(s，2H)，4.2(m，2H)，6.8(m，2H)， 7.2(m，3H)，7.55(m，1H)，7.6(m，1H)，8.55(m，1H)。
实施例11
2-[(氨基羰基)氨基]-5-[2-{2-(吡啶-4-基甲基氨基)乙氧基}苯基]噻吩-3- 甲酰胺
a)按照与实施例8(a)类似的方式由N-[2-(2-{3-(氨基羰基)-2-[(氨基羰基) 氨基]噻吩-5-基}苯氧基)乙基]-N-[吡啶-4-基甲基]氨基甲酸叔丁基酯制备标 题化合物。用阳离子交换色谱进行纯化。
MS(ES)412(M+H)+.
1H NMR(DMSO-D6)3.45(m，2H)，4.3(m，2H)，4.4(m，2H)，6.9(br，2H)， 7.2(m，1H)，7.3(m，1H)，7.4(m，2H)，7.6(m，2H)，7.7(m，1H)，7.8(s，1H)，7.9(m， 1H)，8.5(m，1H)，8.6(m，1H)，9.4(m，1H)，11.0(s，1H)。
b)N-[2-(2-{3-(氨基羰基)-2-[(氨基羰基)氨基]噻吩-5-基}苯氧基)乙 基]-N-[吡啶-4-基甲基]氨基甲酸叔丁基酯
按照与实施例1(a)类似的方式由N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]-N-[吡啶-4-基甲 基]氨基甲酸叔丁基酯制备标题化合物。用阳离子交换色谱进行纯化。
MS(ES)512(M+H)+.
c)N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]-N-[吡啶-4-基甲基]氨基甲酸叔丁基酯
按照与实施例8(c)类似的方式由N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]-N-[吡啶-4-基 甲基]胺制备标题化合物。用阳离子交换色谱进行纯化。
MS(ES)407(M+H)+.
1H NMR(DMSO-D6)1.5(s，9H)，3.6-3.8(m，2H)，4.2(m，2H)，4.8(s，2H)， 6.8(m，3H)，7.2(m，2H)，7.6(m，2H)，8.55(m，1H)。
d)N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]-N-[吡啶-4-基甲基]胺
按照与实施例8(d)类似的方式由1-溴-2-(2-氯乙氧基)苯和(吡啶-4-基甲 基)胺制备标题化合物。
MS(ES)307(M+H)+.
实施例12
2-[(氨基羰基)氨基]-5-[2-{2-[N-(吡啶-3-基甲基)-N-甲基氨基]乙氧基}苯 基]噻吩-3-甲酰胺
a)除了浓缩的反应混合物在DCM和饱和碳酸钠之间进行分配之外，按 照与实施例1(a)类似的方式由N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]-N-甲基-N-(吡啶-3-基 甲基)胺制备标题化合物。(盐水)洗涤溶剂层，干燥并蒸发，得到油状物。 经阳离子交换色谱得到纯化的产物。
MS(ES)426(M+H)+.
1H NMR(DMSO-D6)2.2(s，3H)，2.95(m，2H)，3.7(s，2H)，4.25(m，2H)， 6.8(br，2H)，7.0(m，1H)，7.05(m，1H)，7.2(m，1H)，7.25(m，1H)，7.6(m，2H)， 7.7(m，2H)，7.8(s，1H)，8.4(m，2H)，10.95(s，1H)。
b)N-[2-(2-溴苯氧基)乙基]-N-甲基-N-(吡啶-3-基甲基)胺
按照与实施例1(b)类似的方式由1-溴-2-(2-氯乙氧基)苯和3-(甲基氨基 甲基)吡啶制备标题化合物。
MS(ES)321(M+H)+.
1H NMR(DMSO-D6)2.4(s，3H)，2.95(m，2H)，3.7(s，2H)，4.2(m，2H)，6.8(m， 2H)，7.2(m，2H)，7.55(m，1H)，7.7(m，1H)，8.5(m，1H)，8.55(m，1H)。
实施例13
3-[(氨基羰基)氨基]-5-[2-{2-(1，3-二氢-2H-异吲哚-2-基)乙氧基}苯基]噻 吩-2-甲酰胺
a)2-溴噻吩-4-羧酸
根据J.Am.Chem.Soc.，1954，76，2445中记载的方法制备。
MS(ES)205(M-H)-.
1H NMR(DMSO-D6)7.45(s，1H)，8.22(s，1H)，12.94(bs，1H)。
b)2-溴-4-(N-叔丁基氧羰基)氨基噻吩
将2-溴噻吩-4-羧酸(3g)溶解于干燥的温热叔丁醇(24ml)中。加入三乙胺 (2.02ml)以及二苯基磷酰叠氮化物(3.12ml)。缓慢加热溶液至回流并持续回 流加热过夜。然后冷却反应混合物，倒入水(150ml)中，用乙酸乙酯萃取(3× 100ml)。合并萃取物，干燥、过滤并蒸发。粗产物用柱色谱纯化，5％乙酸 乙酯的己烷溶液洗脱，得到白色固体(1.69g)。
MS(ES)276(M-H)-.
1H NMR(DMSO-D6)1.44(s，9H)，7.03(s，1H)，7.51(s，1H)，9.65(s，1H)。
c)5-溴-3-[(叔丁基氧羰基)氨基]噻吩-2-羧酸
在氩气氛下，将2-溴-4-(N-叔丁基氧羰基)氨基噻吩(1.68g)在干燥 THF(45ml)中搅拌，并将溶液冷却到-78℃。滴加二异丙基氨基锂(7.55ml，2M 溶液)并持续搅拌3.5小时。加入粉状CO2(过量)并在升温至室温之前在搅拌 混合物10分钟。加入水(50ml)，真空去除THF并且水相用乙酸乙酯(3×40ml) 萃取。合并萃取液，用1M HCl溶液(50ml)、水(50ml)和盐水(50ml)洗涤。干 燥、过滤并蒸干溶剂。残余物用DCM研制，过滤收集产物，为浅黄色固体 (1.57g)。
MS(ES)320(M-H)-.
1H NMR(DMSO-D6)9.38(s，1H)，7.79(s，1H)，1.42(s，9H)。
d)5-溴-3-(叔丁基氧羰基)氨基噻吩-2-甲酰胺
在乙腈(80ml)中搅拌5-溴-3-[(叔丁基氧羰基)氨基]噻吩-2-羧酸(0.80g)。 加入羟基苯并三唑(1.41g)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (2.62g)，在室温下持续搅拌10分钟。加入浓氨水溶液(8ml)并回流加入反 应混合物1小时。蒸发除去乙腈。加入水(100ml)并超声研制混合物。然后 过滤收集所得白色固体，用水洗涤并真空干燥(0.763g)。
MS(ES)319(M-H)-.
1H NMR(DMSO-D6)1.45(s，9H)，7.63(brs，2H)，7.78(s，1H)，10.40(s，1H)。
e)3-氨基-5-溴噻吩-2-甲酰胺
在DCM(30ml)中搅拌5-溴-3-(叔丁基氧羰基)氨基噻吩-2-甲酰胺(0.76 g)。加入三氟乙酸(5ml)，室温下搅拌溶液1小时，倒入饱和碳酸氢钠溶液 (200ml)中并用DCM(3×100ml)萃取。合并萃取液，用盐水洗涤、干燥、过 滤并蒸干得到黄色固体(0.511g)。
MS(ES)221(M+H)+.
1H NMR(DMSO-D6)6.50(bs，2H)，6.69(s，1H)，6.87(bs，2H)。
f)3-[(氨基羰基)氨基-5-溴噻吩-2-甲酰胺
在无水THF(10ml)中搅拌3-氨基-5-溴噻吩-2-甲酰胺(0.25g)，冷却到0 ℃，并滴加三氯乙酰基异氰酸酯(0.148ml)。让混合物升温至室温，搅拌1.5 小时并加入2M氨的甲醇溶液(16ml)。1.5小时之后，蒸干溶剂，用乙醚研 制残余物，真空干燥，得到黄色固体的标题化合物0.26g)。
MS(ES)264(M+H)+.
1H NMR(DMSO-D6)6.63(bs，2H)，7.41(bs，2H)，7.97(s，1H)，10.02(s，1H)。
g)3-[(氨基羰基)氨基]-5-[2-{2-(1，3-二氢-2H-异吲哚-2-基)乙氧基}苯基] 噻吩-2-甲酰胺
按照与实施例1(a)类似的方式由2-[2-(2-溴苯氧基)乙基]异二氢吲哚和 3-[(氨基羰基)氨基-5-溴噻吩-2-甲酰胺制备标题化合物。经硅胶色谱用DCM/ 甲醇混合物洗脱得到纯化的产物。
MS(ES)423(M+H)+.
1H NMR(DMSO-D6)3.2(m，2H)，3.95(s，4H)，4.3(m，2H)，6.5(br，2H)，7.0(s， 1H)，7.2(m，5H)，7.3(m，2H)，7.6(m，2H)，8.4(s，1H)，10.0(s，1H)。
化合物的药理学和药动学评估
IKK-2滤膜激酶试验
用滤膜激酶试验测试化合物对IKK-2的抑制作用。将试验化合物在二 甲亚砜(DMSO)中溶解达到10mM。然后将化合物以1比40在激酶缓冲液 (50mM Tris，pH 7.4，含有0.1mM EGTA、0.1mM原钒酸钠和0.1％β-巯基 乙醇)中稀释。用2.5％DMSO的激酶缓冲液溶液对该溶液进行1比3的系 列稀释。将20μl化合物稀释液一式两份地加入到96孔板的孔中。向对照 孔中加20μl 2.5％DMSO的激酶缓冲液溶液代替化合物(0％抑制)。向本底孔 中加20μl 0.5M EDTA代替化合物(100％抑制)
将10μl的乙酸镁、未标记的ATP和33P-标记的ATP的混合物加入各孔 中达到最终浓度为10mM乙酸镁、1μM ATP和0.1μCi33P ATP。将20μl 的IKK-2(0.15μg/孔)、1-53 GST-IκB(0.5μg/孔)和牛血清蛋白(BSA)(8.5ug/ 孔)的混合物加入各孔中引发反应。最终的反应体积为50μl。
将激酶反应液于21℃孵育80分钟，然后通过加等体积(50μl)的20％三 氯乙酸(TCA)沉淀出蛋白终止反应。使沉淀形成10分钟然后过滤到GF/C单 滤膜96孔板上。将各滤膜用约1ml 2％TCA洗涤两次。将滤板于30-40℃ 干燥60分钟，向各孔中加入20μl闪烁剂，然后将平板密封并在Packard Topcount微板闪烁计数器上对放射性进行计数。
在进行上述测试时，实施例1和13化合物的IC50值小于10μM，这表示 它们正如期望地显示出有用的治疗活性。
IKK-1滤膜激酶试验
用滤膜激酶试验测试化合物对IKK-1的抑制作用，评估化合物的选择 性。试验条件与IKK-2滤膜激酶试验相同，所不同的是向各孔中加入 IKK-1(0.25μg/孔)和1-53 GST IκB(9μg/孔)的混合物以引发反应。
对LPS-诱导的PBMC产生TNFα的抑制作用
通过测定对由细菌脂多糖(LPS)刺激的人外周血单核细胞(PBMC)产生 肿瘤坏死因子α(TNFα)的抑制来评估试验化合物对细胞中核因子κB(NFκB) 激活的影响。
从健康的自愿者收集人血(250ml)，用肝素抗凝。将血液的等分液(25ml) 放置在50ml聚丙烯离心管中的20ml LymPhoprep(Nycomed)上。将离心管以 2,500rpm离心30分钟(Sorval RT600B)。用细头的巴斯德吸管收集含有 PBMCs的浑浊层，转移到8个干净的聚丙烯离心管中(每管约10ml)，并用 磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释至50ml。将这些离心管以2,000rpm离心8分钟。 向各细胞沉积物中加入PBS(10ml)，然后温和地将细胞重新悬浮。将细胞收 集在4个离心管中，向各管中加入PBS使体积达到50ml，然后将离心管以 1,400rpm离心8分钟。将细胞沉积物再次重新悬浮在10ml PBS中，收集在 2个离心管中，用PBS使体积达到50ml，然后将离心管以900rpm离心10 分钟。
将最终的细胞沉积物温和地重新悬浮在10ml组织培养液(含有1％热灭 活的人血清、L-谷氨酰胺和青霉素及链霉素的RPMI)中，合并在一个试管中， 并用RPMI培养液使体积达到30ml。进行细胞计数并将细胞悬浮液稀释至 2.6×106细胞/ml。
将试验化合物溶于DMSO达到10mM，然后以1比250用RPMI培养 液稀释(40μM)。然后将化合物用0.4％DMSO的RPMI培养液溶液以1比3 进行系列稀释。将试验化合物稀释液的等分液(50μl)转移到96孔平板中。对 照孔中含有0.4％DMSO的RPMI溶液而不含化合物。
将细胞悬浮液的等分液(100μl)加入各孔中，并将平板于37℃孵育30分 钟。向各孔中加入50μl 40μg/ml的LPS(Sigma，L-4130)以刺激细胞产生 TNFα，并将平板于37℃孵育过夜。阴性对照孔加入RPMI培养液(50μl)而 不是LPS。最终的孵育体积为200μl。
将平板于1,200rpm离心4分钟，然后取出上清液测定TNFα浓度。用 WST-1试剂(Boehringer Mannheim，1044807)测定剩余的细胞沉积物的活力。 将100μl含有10μl WST-1试剂的RPMI培养液加入各孔中，并将平板孵育 0.5-3小时。然后用96孔板分光光度计测定在450nm的吸光度。
用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定上清液(新收集的或于-20℃保存的) 中的TNFα。通过将96孔板的各孔用绵羊抗人TNFα单克隆抗体(100μl 1μg/ml在包被缓冲液中稀释的抗体；0.5M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6， 含有0.2g/l叠氨化钠)包被制备ELISA平板并于4℃孵育过夜。空白孔未包 被。将各孔用0.1％BSA在含有0.05％Tween的PBS(PBS/Tween)中的溶液 洗涤一次，然后和1％BSA一起在包被缓冲液(200μl)中室温孵育1小时。 然后将各孔用0.1％BSA的PBS/Tween溶液洗涤3次。
将PBMC孵育的上清液样品用1％BSA的PBS/Tween溶液以1比3进 行稀释。将这些稀释液的100μl等分液加入ELISA平板中。其它的孔含有 100μl TNFα标准物(10、3.3、1.1、0.37、0.12、0.04、0.014和0ng/ml)。将 ELISA平板室温孵育2小时然后将各孔用0.1％BSA的PBS/Tween溶液洗涤 3次。向各孔中加入兔抗人TNFα抗体(100μl2.5μg/ml的溶液)然后将平板室 温孵育1.5小时。然后将各孔用0.1％BSA的PBS/Tween溶液洗涤3次。向 各孔中加入山羊抗兔IgG辣根过氧化物酶结合物(ICN，674371；100μl的1 比10,000稀释液)并将平板于室温下孵育1.5小时。将各孔用0.1％BSA的 PBS/Tween溶液洗涤3次。
过氧化物酶底物通过将1mg TMB片(Sigma，T-5525)溶于100μl DMSO(100μ1)然后将其和36μl UHPO(BDH，30559；1g的片剂溶于25ml蒸 馏水)一起加入10ml 0.1M柠檬酸盐/乙酸盐缓冲液(pH6)中进行制备。向各孔 中加入100μl底物然后将平板在黑暗中室温孵育30分钟。通过向各孔中加 入25μl 2M硫酸终止反应。在96孔平极分光光度计中测定在450nm的吸 光度。
使用CACO-2细胞单层评估化合物渗透性和流出能力
Caco-2细胞是来自人结肠癌细胞的细胞系。Caco-2细胞保留了人肠道 的许多特性，包括紧密连接和传递蛋白(例如PgP转运体)，并且主要用于评 估口服给药后化合物被吸收的能力。在该测试方案中，顶部到基底方向(A -B方向)和基底到顶部方向(B-A方向)的传输被确定用来评估试验化合物 的渗透性和流出能力。
在24孔板(Beckton-Dickinson，UK)各孔内的1μm滤膜上以100,000个细 胞/孔的密度接种细胞，并生长直到在跨过各孔形成完整的细胞单层(14天)。
在各孔中使用经Trans-Epithelial Resistance(TEER)测试评估准备好使用 单层完整性的时机。如果，可以TEERs是接受的，则将试验化合物一式两 份地加入到加入pH7.4缓冲液中，使其在24孔板各个孔的上室(顶部；A) 或下室(基底；B)中的浓度为10μM，结果重复测定每个化合物由A-B方向 和B-A方向经过单层的渗透性。出于对照目的，将四个参照化合物放在试 验化合物一起孵育(低、中和高渗透性以及一种已知的流出底物)。
混合之后，供给室的等分液立即取出进行分析(T0)。然后在37℃孵育平 板120分钟，之后再从供给室取出等分液(用于评估试验持续期间的回收率)， 这时从接受室中取出类似的等分液(T120样品)。
所有的样品操作均在Tecan Genesis RS200机器人上进行。
所有的样品均用LC-电喷雾MS(正型和负型)，并且峰面积用于定量各 个试验化合物。
由所获得的数据计算各个化合物由A-B方向或B-A方向跨过单层的 转移速率(Papp)。由Papp(A-B)数据，潜在的人吸收率被分为低(Papp＜＝0.5× 106.cm2.秒-1)、不完全(Papp＞0.5＜＝2.9×106.cm2.秒-1)或高(Papp＞2.9×106.cm2. 秒-1)，而由Papp(B-A)/Papp(A-B)比值，评估试验化合物的流出能力，当比 值≥5被定为高，比值＜5被定为低。
结果   化合物   IKK-2抑制   (μM)                Caco-2测试   Papp   (cm2.秒-1×10-6)   Papp(B-A)   /Papp(A-B)比值   实施例4   0.04   13.4   0.83   实施例5   0.15   14.3   0.66   实施例7   0.04   15.7   1.07   实施例13   1.43   23.6   1.26   实施例82   WO 01/58890   0.26   0.1-0.4   64-472   2-[(氨基羰基)氨基]-5-(2-[{1-甲基吡咯   烷-3-基}氧基]苯基)-3-噻吩甲酰胺   0.01   2.19   8.14   2-[(氨基羰基)氨基]-5-(2-{[1-(2-甲氧乙   基)吡咯烷-3-基]氧基]苯基)-3-噻吩甲   酰胺   0.03   1.86   5.88