一种治疗心脑血管疾病的中药组合物及其制法和检测方法
阅读：842发布：2020-07-26
专利汇可以提供一种治疗心脑血管疾病的中药组合物及其制法和检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 治疗 心脑 血管 疾病 的中药组合物及其制法和检测方法，它由丹参750g、红花250g作为原料采用先进工艺提取制备，并加入适宜辅料制成注射剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、分散片、口崩片、丸剂、软胶囊剂、滴丸剂或口服液体制剂等剂型；临床用于冠心病、心绞痛、心肌梗塞，瘀血型 肺 心病，缺血性脑病、脑血栓等。，下面是一种治疗心脑血管疾病的中药组合物及其制法和检测方法专利的具体信息内容。
1.一种治疗心脑血管疾病的中药组合物，其特征在于它是由如下重量配比的原料按下述工艺制备而成：丹参750份、红花250份；以上两味，加水煎煮，每次煎煮液滤过，滤液合并浓缩至清膏，加乙醇冷藏，取上清液，回收乙醇并浓缩至清膏，再加乙醇冷藏，取上清液滤过，加活性炭，搅拌，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水搅拌，煮沸，冷藏，滤过，滤液浓缩后冷藏，滤过，滤液浓缩处理后加入药用辅料制成药剂学上允许的各种常用药物剂型。
2.根据权利要求1所述的治疗心脑血管疾病的中药组合物，其特征在于它是由如下重量配比的原料按下述工艺制备而成：丹参750份、红花250份；以上两味，加水煎煮2次，每次1小时，滤过，滤液合并后于65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，加乙醇至含醇量达75～80％，冷藏，取上清液，回收乙醇并65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，再加乙醇至含醇量达80～85％，冷藏，取上清液滤过，加活性炭，搅拌，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水搅拌，煮沸，冷藏，滤过，滤液浓缩后冷藏，滤过，滤液浓缩处理后加入药用辅料制成药剂学上允许的各种常用药物剂型。
3.根据权利要求1或2所述的治疗心脑血管疾病的中药组合物，其特征在于所述的药物剂型是注射剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、分散片、口崩片、丸剂、软胶囊剂、滴丸剂或口服液体制剂。
4.根据权利要求3所述的治疗心脑血管疾病的中药组合物，其特征在于它是注射剂。
5.根据权利要求4所述的治疗心脑血管疾病的中药组合物注射剂，其特征在于：丹参
750g、红花250g；以上两味，加水煎煮2次，每次1小时，滤过，滤液合并65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，加乙醇至含醇量达75～80％，冷藏，取上清液，回收乙醇并65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，再加乙醇至含醇量达80～85％，冷藏，取上清液滤过，加活性炭，搅拌，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加纯化水至1000ml，搅拌，煮沸，冷藏，滤过，滤液浓缩至300ml，冷藏，滤过，滤液用NaOH溶液调节pH值至6.5～7.5，煮沸，加活性炭，搅拌，静置，滤过，滤液经超滤后，加活性炭，煮沸，滤过，滤液加注射用水至1000ml，调pH值至6.5～7.5，滤过，灌封，灭菌，即得。
6.根据权利要求4所述治疗心脑血管疾病的中药组合物的制备方法，其特征在于：丹参750g、红花250g；以上两味，加水煎煮2次，每次1小时，滤过，滤液合并65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，加乙醇至含醇量达75～80％，冷藏，取上清液，回收乙醇并65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，再加乙醇至含醇量达80～85％，冷藏，取上清液滤过，加活性炭，搅拌，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加纯化水，搅拌，煮沸，冷藏，滤过，滤液浓缩，冷藏，滤过，滤液用NaOH溶液调节pH值至6.5～7.5，煮沸，加活性炭，搅拌，静置，滤过，滤液经超滤后，加活性炭，煮沸，滤过，滤液加注射用水，调pH值至6.5～
7.5，滤过，灌封，灭菌，即得。
7.根据权利要求5所述治疗心脑血管疾病的中药注射剂，其特征在于该注射剂的鉴别方法为：取注射液4ml，蒸干，残渣加无水乙醇1ml，使溶解，放置，离心，取上清液，作为供试品溶液；另取红花对照药材1g，加水10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至干，残渣加无水乙醇1ml，使溶解，放置，离心，取上清液，作为对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水＝
6∶2.4∶5为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
8.根据权利要求5所述治疗心脑血管疾病的中药注射剂，其特征在于该注射剂的检查方法为如下方法的一种或几种的组合：
(1)PH值：应为4.5～6.5；
(2)蛋白质：取注射液1ml，加水稀释到5ml，加新配制的30％磺基水杨酸试液1ml，混合，放置5分钟，不得出现混浊；
(3)炽灼残渣：取注射液10ml，依中国药典一部附录IX J法检查应不得过1.5％，单位为g/ml；
(4)溶血试验：取家兔心脏血，置有玻璃珠的容器内，振摇10分钟，除去纤维蛋白原，使成脱纤血，加生理氯化钠溶液，摇匀，离心，倾去上清液，沉淀的红细胞再用生理氯化钠溶液洗涤3～4次，至离心后上清液不显红色为止，将所得红细胞体积用生理氯化钠溶液稀释成
2％的混悬液，即得2％红细胞混悬液，当天使用，用时摇匀；取试管5支，编号，1～3号管分别加入供试品0.3ml及生理盐水2.2ml，4号管加入生理氯化钠溶液2.5ml作阴性对照管，
5号管加入蒸馏水2.5ml作阳性对照管，然后各加入2％红细胞混悬液2.5ml，置恒温箱内，保持36.5±0.5℃的温度，观察3小时，应无溶血现象；
(5)热原：取注射液，依中国药典一部附录XIII A法检查，剂量按家兔体重每1kg注射
2ml，应符合规定；
(6)其他：应符合中国药典一部附录IU及IX S中的有关物质检查法项下有关的各项规定。
9.根据权利要求5所述治疗心脑血管疾病的中药注射剂，其特征在于该注射剂的含量测定方法为如下方法的一种或几种的组合：
(1)丹参素钠和原儿茶醛：照中国药典一部附录VI D的高效液相色谱法测定；色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-1％冰醋酸溶液＝13∶87为流动相，检测波长为280nm，理论板数按丹参素峰计算应不低于5000；对照品溶液的制备：精密称取丹参素钠、原儿茶醛对照品适量，分别加水制成每1ml各含50μg的溶液，即得；供试品溶液的制备：精密量取注射液5ml，置20ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得：
测定法：分别精密吸取对照品与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，注射液每1ml含分子式为C9H9O5Na丹参素钠和分子式为C7H6O3原儿茶醛的总量计，不得少于0.35mg；
(2)总黄酮：对照品溶液的制备，精密称取经120℃干燥至恒重的芦丁对照品20mg，置
100ml量瓶中，加50％甲醇适量，振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含无水芦丁
0.2mg；标准曲线的制备：精密量取对照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，分别置
10ml量瓶中，各加50％甲醇至5ml，加5％亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液4ml，再加50％甲醇至刻度，摇匀，以相应的溶液为空白，照中国药典分光光度法在500nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；测定法：精密吸取注射液5ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，作为空白对照，另精密量取1ml，置10ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加50％甲醇至5ml”起，依法立即测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中相当于芦丁的重量，计算，即得，注射液每
1ml含分子式为C27H30O16总黄酮以芦丁计，不得少于3.5mg。
一种治疗心脑血管疾病的中药组合物及其制法和检测方法
技术领域
背景技术
[0002] 心脑血管疾病是一种严重威胁人类，特别是50岁以上中老年人健康的常见病，全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，居各种死因首位，目前我国心脑血管疾病患者也已经超过2.7亿人，心脑血管疾病已成为人类死亡病因最高的头号杀手，也是人们健康的“无声凶煞”，因此，心脑血管疾病的防治已成为医学界最为关注的焦点，目前防治手段和治疗药物层出不穷，尤其是毒副作用小、适宜长期服用的中药研发已然成为了国内研究方向的重中之重。近年来，随着治疗心脑血管疾病的中药注射剂的广泛临床使用，使得传统中医药在防治心脑血管方面的优势更为突出，初步克服了中医药疗效缓和、起效速度慢的缺点，成为了国内心脑血管疾病药物新的研究热点。丹红注射液自从2004年投放市场以来，一直受到医患人员的青睐，对于它的继续研究和开发蓬勃发展，与此相关的专利申请也较多。如申请号200510041653.5的专利申请公开了以丹参和红花为原料制备而成的口服药物制剂，将丹参和红花分别进行提取处理，然后再混合制备成各种常用剂型；申请号200410081549.4的申请公开了丹参总酚酸和红花总黄酮为原料制备而成的口服药物制剂，其原料的提取加工是分别提取丹参总酚酸和红花总黄酮后，再继续添加药用辅料制成各种口服剂型；申请号02153312.1的申请公开了丹参与红花分别提取纯化后，各自有效成分合并后继续精制成注射剂。以上这些专利虽然都达到了一定的发明目的，但无一例外都是对丹参和红花分别进行提取处理，造成了制备方法复杂，有效成分损失严重，生产成本较高的缺点，不符合大规模的工业生产，本发明在经过大量基础研究后，对丹参与红花组成的中药组合物的制备工艺进行了改进，取得了显著的进步，不但简化了制备过程，而且大大提高了丹红注射剂的安全性和减少了刺激性。
发明内容
[0003] 本发明的目的在于提供一种中药组合物，具体涉及到一种治疗心脑血管疾病的中药组合物及其制法。
[0004] 本发明的中药组合物原料由丹参750份、红花250份组成，具有活血化瘀，通脉舒络。用于瘀血闭阻所致的胸痹及中风，证见：胸痛，胸闷，心悸，口眼歪斜，言语骞涩，肢体麻木，活动不利等症；冠心病、心绞痛、心肌梗塞，瘀血型肺心病，缺血性脑病、脑血栓等。
[0005] 本发明的技术方案是这样实现的：取丹参750份、红花250份；以上两味，加水煎煮，每次煎煮液滤过，滤液合并浓缩至清膏，加乙醇冷藏，取上清液，回收乙醇并浓缩至清膏，再加乙醇冷藏，取上清液滤过，加活性炭，搅拌，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水搅拌，煮沸，冷藏，滤过，滤液浓缩后冷藏，滤过，滤液浓缩处理后加入药用辅料制成药剂学上允许的各种常用药物剂型。
[0006] 本发明技术方案的具体实现步骤为：取丹参750份、红花250份；以上两味，加水煎煮2次，每次1小时，滤过，滤液合并后于65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，加乙醇至含醇量达75～80％，冷藏，取上清液，回收乙醇并65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，再加乙醇至含醇量达80～85％，冷藏，取上清液滤过，加活性炭，搅拌，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水搅拌，煮沸，冷藏，滤过，滤液浓缩后冷藏，滤过，滤液浓缩处理后加入药用辅料制成药剂学上允许的各种常用药物剂型。
[0007] 本发明的中药组合物的制备辅料可以是药剂学上可接受的任意赋形剂或载体。
[0008] 本发明药物组合物的应用可以是药剂学上可接受的剂型，包括注射剂、丸剂、颗粒剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、片剂、分散片、口崩片、滴丸剂、口服液体制剂等。其中优选为注射剂。
[0009] 注射剂的制备方法优选为丹参750g、红花250g；以上两味，加水煎煮2次，每次1小时，滤过，滤液合并65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，加乙醇至含醇量达75～80％，冷藏，取上清液，回收乙醇并65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，再加乙醇至含醇量达80～85％，冷藏，取上清液滤过，加活性炭，搅拌，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加纯化水，搅拌，煮沸，冷藏，滤过，滤液浓缩，冷藏，滤过，滤液用NaOH溶液调节pH值至6.5～7.5，煮沸，加活性炭，搅拌，静置，滤过，滤液经超滤后，加活性炭，煮沸，滤过，滤液加注射用水，调pH值至6.5～7.5，滤过，灌封，灭菌，即得。
[0010] 本发明是在原有国家药品监督管理局下发给企业的质量标准记载的丹红注射剂的技术基础上进行深入研究的，在大量科学研究的过程中偶然发现了本发明制备工艺的各种关键步骤和参数与原有的工艺比较，生产出来的产品具有意料不到的疗效和安全性，在提高药物治疗作用的同时能够显著改善药液澄明度和降低注射疼痛感。虽然原来丹红注射液质量标准记载有详细的制备工艺，但按照这个工艺生产出来的产品，在临床应用中严重影响了患者的用药依从性，大大阻碍了这个优秀中药品种发挥它在心脑血管疾病治疗领域的巨大作用，经过我们的创造性劳动基本克服了上述的缺点，在此我们以注射剂为代表，采用药效对比实验为指标来充分说明本发明的优越性。
[0011] (1)原质量标准记载工艺：
[0012] 丹参750g、红花250g，以上两味药材，加水煎煮2次，每次1小时，合并水煎液，滤过，澄清冷藏后滤过。滤液加入适量明胶，冷藏，滤过。滤液浓缩至相对密度为1.10～1.20(65℃)，加入乙醇至含量80％以上，冷藏，滤过，调PH值至8～9，冷藏，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水至1000ml，冷藏，滤过，加水至规定量，分装，灭菌，即得。
[0013] (2)本发明制备工艺：
[0014] 丹参750g、红花250g，以上两味，加水煎煮2次，每次1小时，滤过，滤液合并浓缩至相对密度为1.20～1.30(65℃)的清膏，加乙醇至含醇量达75～80％，冷藏，取上清液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.20～1.30(65℃)的清膏，加乙醇至含醇量达80～85％，冷藏，上清液滤过，加活性炭，搅拌，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加纯化水至配制量，搅拌，煮沸，冷藏，滤过，滤液浓缩至约配制量的1/3，冷藏，滤过，滤液用NaOH溶液调节pH值至6.5～7.5，煮沸，加活性炭，搅拌，静置，滤过，滤液经超滤后，加活性炭，煮沸，滤过，滤液加注射用水至1000ml，调pH值至6.5～7.5，滤过，灌封，灭菌，即得。
[0015] 两种工艺制备的产品按照以下检测方法进行检测：
[0016] ①鉴别方法：取注射液4ml，蒸干，残渣加无水乙醇1ml，使溶解，放置，离心，取上清液，作为供试品溶液；另取红花对照药材1g，加水10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至干，残渣加无水乙醇1ml，使溶解，放置，离心，取上清液，作为对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水＝6∶2.4∶5为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
[0017] ②检查方法：PH值应为4.5～6.5；取注射液1ml，加水稀释到5ml，加新配制的30％磺基水杨酸试液1ml，混合，放置5分钟，不得出现混浊(蛋白质检查项)；取注射液
10ml，依中国药典一部附录IX J法检查应不得过1.5％，单位为g/ml(炽灼残渣项)；溶血试验：取家兔心脏血，置有玻璃珠的容器内，振摇10分钟，除去纤维蛋白原，使成脱纤血，加生理氯化钠溶液，摇匀，离心，倾去上清液，沉淀的红细胞再用生理氯化钠溶液洗涤3～
4次，至离心后上清液不显红色为止，将所得红细胞体积用生理氯化钠溶液稀释成2％的混悬液，即得2％红细胞混悬液，当天使用，用时摇匀；取试管5支，编号，1～3号管分别加入供试品0.3ml及生理盐水2.2ml，4号管加入生理氯化钠溶液2.5ml作阴性对照管，5号管加入蒸馏水2.5ml作阳性对照管，然后各加入2％红细胞混悬液2.5ml，置恒温箱内，保持36.5±0.5℃的温度，观察3小时，应无溶血现象；热原：取注射液，依中国药典一部附录XIII A法检查，剂量按家兔体重每1kg注射2ml，应符合规定；其他：应符合中国药典一部附录IU及IX S中的有关物质检查法项下有关的各项规定。
10ml，依中国药典一部附录IX J法检查应不得过1.5％，单位为g/ml(炽灼残渣项)；溶血试验：取家兔心脏血，置有玻璃珠的容器内，振摇10分钟，除去纤维蛋白原，使成脱纤血，加生理氯化钠溶液，摇匀，离心，倾去上清液，沉淀的红细胞再用生理氯化钠溶液洗涤3～
4次，至离心后上清液不显红色为止，将所得红细胞体积用生理氯化钠溶液稀释成2％的混悬液，即得2％红细胞混悬液，当天使用，用时摇匀；取试管5支，编号，1～3号管分别加入供试品0.3ml及生理盐水2.2ml，4号管加入生理氯化钠溶液2.5ml作阴性对照管，5号管加入蒸馏水2.5ml作阳性对照管，然后各加入2％红细胞混悬液2.5ml，置恒温箱内，保持36.5±0.5℃的温度，观察3小时，应无溶血现象；热原：取注射液，依中国药典一部附录XIII A法检查，剂量按家兔体重每1kg注射2ml，应符合规定；其他：应符合中国药典一部附录IU及IX S中的有关物质检查法项下有关的各项规定。
[0018] ③含量测定方法：丹参素钠和原儿茶醛：照中国药典一部附录VID的高效液相色谱法测定；色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-1％冰醋酸溶液＝13∶87为流动相，检测波长为280nm，理论板数按丹参素峰计算应不低于5000；对照品溶液的制备：精密称取丹参素钠、原儿茶醛对照品适量，分别加水制成每1ml各含50μg的溶液，即得；供试品溶液的制备：精密量取注射液5ml，置20ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得：测定法：分别精密吸取对照品与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，注射液每1ml含分子式为C9H9O5Na丹参素钠和分子式为C7H603原儿茶醛的总量计，不得少于0.35mg；总黄酮：对照品溶液的制备：精密称取经120℃干燥至恒重的芦丁对照品
20mg，置100ml量瓶中，加50％甲醇适量，振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含无水芦丁0.2mg；标准曲线的制备：精密量取对照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，分别置10ml量瓶中，各加50％甲醇至5ml，加5％亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液4ml，再加50％甲醇至刻度，摇匀，以相应的溶液为空白，照中国药典分光光度法在500nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；测定法：精密吸取注射液5ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取lml，置10ml量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，作为空白对照，另精密量取1ml，置10ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加50％甲醇至5ml”起，依法立即测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中相当于芦丁的重量，计算，即得，注射液每1ml含分子式为C27H30O16总黄酮以芦丁计，不得少于3.5mg。
20mg，置100ml量瓶中，加50％甲醇适量，振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含无水芦丁0.2mg；标准曲线的制备：精密量取对照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，分别置10ml量瓶中，各加50％甲醇至5ml，加5％亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液4ml，再加50％甲醇至刻度，摇匀，以相应的溶液为空白，照中国药典分光光度法在500nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；测定法：精密吸取注射液5ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取lml，置10ml量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，作为空白对照，另精密量取1ml，置10ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加50％甲醇至5ml”起，依法立即测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中相当于芦丁的重量，计算，即得，注射液每1ml含分子式为C27H30O16总黄酮以芦丁计，不得少于3.5mg。
[0019] 为了充分比较两种工艺生产的品种差别，我们按照企业的内控标准将两种工艺生产的药液进行检验，具体检验结果见下表。
[0020]
[0021] 从上表可以看出，本发明工艺与原工艺比较，药液性状变得更加澄明，不溶性微粒大大减少，丹参素钠、原儿茶醛和总黄酮等有效成分的总量明显升高，这些数据说明了本发明工艺的改进取得了显著的进步。为了更充分说明本发明的创造性，我们还将两种工艺生产的产品进行如下药效对比实验：
[0022] 实验1丹红注射液对大鼠肾静脉血栓的影响试验
[0023] 1.试验材料
[0024] 1.1供试品：
[0025] 丹红注射液(本发明工艺)，规格：每支10ml，批号：090901，由菏泽步长制药有限公司提供，遮光，阴凉处密封保存。
[0026] 1.2对照品：
[0027] 丹红注射液(原工艺)，规格：每支10ml，批号：090832，由菏泽步长制药有限公司提供，遮光，阴凉处密封保存。
[0028] 1.3试剂：
[0030] 1.4实验动物：
[0031] Wistar大鼠40只，普通级，体重200-250g，雄性，由山东鲁抗医药股份有限公司提供，许可证号：SCXK(鲁)20050017，由山东省科学技术厅签发，2009年08月购入。
[0032] 1.5主要仪器设备：
[0033] AY220型电子分析天平，岛津有限公司生产；C2000型血凝仪：由北京东方普利生科贸有限公司提供；TDL-5台式低速大容量离心机：由江苏金坛市医疗仪器厂提供。
[0034] 2.试验方法与观察指标
[0035] 2.1动物分组：
[0036] 取健康雄性大鼠40只，按体重随机分为4组，分空白对照组、模型组、丹红注射液(本发明工艺)组、丹红注射液(原工艺)组，每组10只。
[0037] 2.2给药剂量选择及依据：
[0038] 丹红注射液原工艺组：丹红注射液对照临床临床用法：成人每日8ml。按成人70kg和200g大鼠等效剂量折算系数法可得大鼠用药剂量为：8ml×0.018×5＝0.72ml/kg，故本试验设丹红注射液原工艺组剂量为1ml/kg。
[0039] 丹红注射液本发明工艺组：丹红注射液临床临床用法：成人每日8ml。按成人70kg和200g大鼠等效剂量折算系数法可得大鼠用药剂量为：8ml×0.018×5＝0.72ml/kg，，故本试验设丹红注射液本发明工艺组剂量为1ml/kg。
[0040] 2.3药物配制：
[0041] 各剂量均用50％葡萄糖注射液稀释后缓慢注射，丹红注射液本发明工艺组溶液：取丹红注射液5ml+50％葡萄糖注射液稀释至50ml；丹红注射液原工艺组溶液：取丹红注射液对照品5ml+50％葡萄糖注射液稀释至50ml。
[0042] 2.4试验过程：
[0043] 大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉，仰卧固定，开腹，分离后腔静脉至左肾静脉一段约2cm，先用线结扎左肾静脉10min，然后，再用线结扎后腔静脉至左肾静脉段2h。2h后，解除结扎，关闭腹腔，缝合伤口。从尾静脉或股静脉给予不同剂量的供试品。连续给药3天后，测药后5h出血时间、解剖大鼠取血及静脉血栓。
[0044] 2.4.1
[0045] 在给药前及药后5h，测定出血时间。用锋利的刀片横切大鼠尾部5mm，每30s用滤纸吸去，直至出血停止，计算出血时间。各剂量组及对照组大鼠出血时间与对照比较进行统计学处理，时间以均数±标准差 表示，各药物组与空白对照组进行组间、给药组之间进行T检验，以判断药物的效果。
[0046] 2.4.2
[0047] 药后6h，重新打开腹腔，从后腔静脉上段取血，测定活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)及凝血酶时间(TT)。各剂量组及对照组大鼠各指标与对照比较进行统计学处理，以均数±标准差 表示，各药物组与空白对照组进行组间、给药组之间进行T检验，以判断药物的效果。
[0048] 2.4.3
[0049] 取血同时，在结扎下方2em处夹闭管腔，取出瘀血段血管，剖开管腔，取出血栓，放在滤纸上，吸干血液，用微量电子天平称取血栓湿重(mg)，然后将血栓之培养皿中在室温下放置24h，称取血栓干重(mg)。各剂量组及对照组大鼠血栓重量与对照比较进行统计学处理，重量以均数±标准差 表示，各药物组与空白对照组进行组间、给药组之间进行T检验，以判断药物的效果。
[0050] 2.4.5数据统计及结果判定：
[0051] 每组动物的各项指标以均数±标准差 表示。供试品各剂量组与模型对照组的各项指标进行t检验统计差异性。如p＜0.05则该剂量组与对照组比较有显著性差异，该剂量对指标有影响；如p＞0.05则没有显著性差异，该剂量对指标无影响。
[0052] 3试验结果
[0053] 3.1对大鼠出血时间的影响：
[0054] 丹红注射液本发明工艺组中可明显延长大鼠的药后出血时间，与模型对照组比较有极显著性差异(P＜0.001或P＜0.01)，与丹红注射液原工艺组比较亦有显著性差异(P＜0.05)，药后变化值与模型组比较亦有极显著性差异(P＜0.001)。结果见表2：
[0055] 表2丹红注射液对大鼠出血时间的影响
[0056] [0057] 出血时间(s)
[0058] 组别
[0059] 药前 药后5h 变化值[0060] [0061] 空白对照组 477.0±226.9 495.0±211.8 18.0±75.1[0062] 模型组 462.9±129.6 476.0±121.6 13.1±54.8***# ***#
[0063] 丹红注射液本发明工艺组 447.0±147.3 957.0±270.4 510.0±117.5** ***
[0064] 丹红注射液原工艺组 459.0±148.4 783.0±139.6 324.0±134.8[0065] 与模型组比较，***P＜0.001，**P＜0.01；与原工艺组比较，#P＜0.05。
[0066] 3.2对凝血指标的影响：
[0067] 丹红注射液各组均可明显延长凝血酶时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)，与模型对照组比较有极显著性差异(P＜0.01、P＜0.001或P＜0.05)；本发明工艺组以上指标与原工艺组比较亦有显著性差异(P＜0.05)。结果见表3：
[0068] 表3丹红注射液对凝血指标的影响
[0069]
[0070] 与模型组比较，***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05；与原工艺组比较，#P＜0.05。
[0071] 3.3对血栓形成的影响：
[0072] 丹红注射液各组可明显降低结扎后血栓的重量，与模型对照组比较有显著性差异(P＜0.05)；丹红本发明工艺组与原工艺组比较在血栓湿重上有显著性差异(P＜0.05)。结果见表4。
[0073] 表4丹红注射液对血栓形成的影响
[0074]
[0075] 血栓重量(mg)
[0076] 组别
[0077] 湿重 干重
[0078]
[0079] 空白对照组 --- ---
[0080] 模型组 21.5±4.4 5.0±1.1
[0081] 丹红注射液本发明工艺组 16.1±3.8*# 3.7±0.7*
[0082] 丹红注射液原工艺组 18.1±6.1 4.2±0.9
[0083] 与模型组比较，*P＜0.05；与原工艺组比较，#P＜0.05。
[0084] 4试验结论
[0085] 本试验观察了两种工艺制备的丹红注射液经静脉注射后对大鼠肾静脉血栓有无作用，并将两种工艺制备的产品进行比较。结果显示：丹红注射液本发明工艺组在延长大鼠的药后出血时间、延长凝血酶时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、降低结扎后血栓的湿重等方面均比原工艺组有显著性改善，提示，本发明工艺改进取得良好的效果。
[0086] 试验2丹红注射液对家兔血小板各指标影响的影响试验
[0087] 1试验材料
[0088] 1.1供试品：与试验1相同。
[0089] 1.2试剂：与试验1相同
[0090] 1.3实验动物：新西兰兔18只，体重2.3-2.5kg，雌雄各半，由山东鲁抗医药股份有限公司提供，许可证号：SCXK(鲁)20050017，由山东省科学技术厅签发，2009年8月购入。
[0091] 1.4主要仪器设备：HEMAVET-950型全自动血球计数仪：由Drew Scientitic公司提供；C2000型血凝仪：由北京东方普利生科贸有限公司提供；PLS-F5型流体样品处理器：由北京东方普利生科贸有限公司提供；TDL-5台式低速大容量离心机：由江苏金坛市医疗仪器厂提供。
[0092] 2试验方法
[0093] 2.1动物分组：
[0094] 取家兔18只，随即分为3组：空白对照组、丹红注射液本发明工艺组、丹红注射液原工艺组，每组动物6只，雌雄各3只。
[0095] 2.2给药剂量选择及依据：
[0096] 供试品临床临床用法：成人每日20ml。按成人70kg和1.5kg家兔等效剂量折算系数法可得家兔用药剂量为：20ml×0.07÷1.5＝0.93ml/kg，故本试验可设丹红注射液本发明工艺组剂量为2ml/kg。同理，设丹红注射液原工艺组剂量为2ml/kg。
[0097] 2.3药物配制：各剂量均用5％葡萄糖注射液稀释后缓慢注射，本发明工艺组与原工艺组溶液：取丹红注射液72ml+5％葡萄糖注射液稀释至180ml。
[0098] 3试验过程：
[0099] 分别于药前及静脉给药30min后，静脉取血5ml。其中1ml全血经25μl 5％EDTAK2抗凝用于测定血小板数；1ml全血经3.8％柠檬酸三钠抗凝后离心取血清用于血凝指标测定；3ml全血离心后用于血小板凝集率的测定。用药前采取血样设为自身对照组，用药后采取的血样为药物吸收后观察组。
[0100] 3.1血小板凝集率的测定：
[0101] 1)富含血小板血浆(PRP)制备：将抗凝血的标本用离心机500r/min，离心5min，小心吸取上层富含血小板的血浆。PRP应无溶血，外观微混。
[0102] 2)贫血小板血浆(PPP)的制备：将吸取PRP的血再次离心，3000r/min，离心10min，小心吸取上层无血小板的血浆备用。血浆应清亮透明。
[0103] 将所得样品按照仪器操作步骤依次置于血小板凝集仪中测试。
[0104] 3.2凝血酶时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)的测定：
[0105] 将3.8％柠檬酸三钠抗凝后的全血经3000r/min，离心10min后，取血清使用血凝仪测试各项血凝指标。
[0106] 3.3黏附率的测定：
[0107] 将15％EDTAK2抗凝后的全血使用全自动血球计数仪测试血小板数此为黏附前值，经流体样品处理器旋转后再次测得的血小板数为黏附后值。
[0108] 4数据统计及结果判定
[0109] 每组动物的各项指标以均数±标准差 表示。供试品各组与空白对照组的各项指标进行t检验统计差异性。如P＜0.05则该组与对照组比较有显著性差异，该剂量组对指标有影响；如P＞0.05则没有显著性差异，该剂量组对指标无影响。
[0110] 5试验结果
[0111] 5.1丹红注射液各组仅有降低血小板聚集率的趋势，且与对照组比较无显著性差异(P＞0.05)，变化值与空白对照组比较无差异(P＞0.05)，但本发明工艺组与原工艺组比较具有更好的效果。结果见表5：
[0112] 表5丹红注射液对家兔血小板凝集率的影响
[0113]
[0114] P＞0.05，各剂量组与对照组比较。
[0115] 5.2丹红注射液各组均可明显延长APTT、PT、TT，与空白对照组比较有显著性差异(P＜0.05)；各药物组自身治疗前后比较，本发明工艺组延长APTT的作用强于原工艺组(P＜0.05)，延长PT与TT的作用比原工艺组更显著(P＜0.01)，结果见表6、7、8：
[0116] 表6丹红注射液对活化部分凝血活酶时间的影响
[0117]
[0118] 与自身药前比较，***P＜0.001，*P＜0.05；与空白对照组比较，#P＜0.05；与原工艺组比较，&P＜0.05。
[0119] 表7丹红注射液对凝血酶原时间的影响
[0120]
[0121] 与自身药前比较，***P＜0.001；与空白对照组比较，###P＜0.001；与原工艺组比较，&&P＜0.01。
[0122] 表8丹红注射液对凝血酶时间的影响
[0123]
[0124] 与自身药前比较，***P＜0.001，**P＜0.01；###P＜0.001，与空白对照组比较，###P＜0.001，#P＜0.05；与原工艺组比较，&&P＜0.01。
[0125] 5.3丹红注射液给药组均可明显降低药后血小板的黏附率，与空白对照组比较有极显著性差异(P＜0.001或P＜0.05)，本发明工艺组与原工艺组比较，药后血小板黏附率降低更为显著(P＜0.01)，结果见表9：
[0126] 表9丹红注射液对血小板黏附率的影响
[0127]
[0128] 与自身药前比较，*P＜0.05；与空白对照组比较，###P＜0.001，#P＜0.05；与原工艺组比较，&&P＜0.01。
[0129] 5.4试验结论
[0130] 本试验观察了丹红注射液经静脉注射后对家兔血凝指标有无影响，并将本发明工艺制备的产品与原工艺制备的产品进行比较。结果显示：丹红注射液在2ml/kg剂量下可显著延长APTT、PT、TT及降低药后血小板的黏附率，且本发明工艺生产的丹红注射液具有更显著的作用。
[0131] 试验3丹红注射液对沙土鼠局部脑缺血模型的影响试验
[0132] 1试验材料
[0133] 1.1供试品：与试验1相同。
[0134] 1.2试剂：红四氮唑(TTC)，规格：10g，批号：20090413，天津市科密欧化学试剂开发中心生产；磷酸氢二钾，规格：500g，批号：200810106，天津市广成化学试剂有限公司生产；乙醚，分析纯，规格：500ml，批号：20071012；50％葡萄糖注射液，规格：20ml/10g，批号：0708071，天津药业集团新郑股份有限公司生产。
[0135] 1.3实验动物：沙土鼠，40只，60-90g，雄性，由浙江省试验动物中心提供。许可证号：SCXK(浙)2003-0001。2008年10月购入。
[0136] 1.4主要仪器设备：AY220型电子分析天平，岛津有限公司生产；YB502型电子天平，上海海康电子仪器厂生产
[0137] 2试验方法
[0138] 2.1动物分组：取健康沙土鼠40只，随机分为4组：伪手术组、模型组、丹红注射液原工艺组、丹红注射液本发明工艺组，每组10只。
[0139] 2.2药剂量选择及依据：丹红注射液原工艺组：丹红注射液，临床用药一次4ml，每日1-2次，按成人70kg和沙土鼠200g等效剂量折算系数法可得沙土鼠用药剂量为：8ml×0.018×5＝0.72ml/kg，故本试验设剂量为0.4ml/kg。同理丹红注射液本发明工艺组剂量为0.4ml/kg。
[0140] 2.3药物配制：丹红注射液原工艺组与本发明工艺组：取丹红注射液0.4ml+50％葡萄糖注射液稀释至10ml。
[0141] 3试验过程：
[0142] 将动物用乙醚麻醉，将沙土鼠仰卧固定，沿颈正中作约2cm长皮肤切口，分离出右侧颈总动脉并穿缝线2根，作双结扎，两结扎之间剪断，缝合皮肤，手术完毕后立即给予相应的药物溶液10ml/kg，伪手术组和模型组给予等容积的50％葡萄糖注射液。12h后对其神经症状进行评分，24h后将动物断头取脑，置于冰冷的生理盐水(0-4℃)，10min后，去嗅球、小脑及低位脑干后，沿冠状切5片，将其置于5ml溶液中(内含1.5ml2％TTC及0.1mmol/LK2HPO4)，37℃下避光温孵30min(染色)，取出放入10％福尔马林溶液中避光保存。正常脑组织呈玫瑰红色，缺血区呈白色。根据由重量求面积法，求出梗塞范围(重量表示)，并对脑梗死边缘区进行病理组织学检查。神经症状评分标准如下：
[0143] 0分：正常，无神经功能缺损；
[0144] 1分：左侧前爪不能完全伸展，轻度神经功能缺损；
[0145] 2分：行走时，大鼠向左侧(瘫痪侧)转圈，中度神经功能缺损；
[0146] 3分：行走时，大鼠身体向左侧(瘫痪侧)倾倒。重度神经功能缺损；
[0147] 4分：不能自发行走，有意识丧失。
[0148] 5分：死亡。
[0149] 4数据统计及结果判定：结果见下表10：
[0150] 表10丹红注射液对造模后沙土鼠的影响
[0151]
[0152] 与模型组比较，**P＜0.01，*P＜0.05；与原工艺组比较，#P＜0.05。
[0153] 每组动物的各项指标以均数±标准差 表示。丹红注射液各组与空白对照组、模型对照组的各项指标进行t检验统计差异性。如p＜0.05则该剂量组与对照组比较有显著性差异，该剂量对指标有影响；如p＞0.05则没有显著性差异，该剂量对指标无影响。
[0154] 5试验结果
[0155] 丹红注射液0.4ml/kg减少造模后沙土鼠局部脑缺血的范围并可缓解由于造模致使沙土鼠的行为障碍；可明显降低模型大鼠大脑梗塞面积和梗塞率，明显减轻模型大鼠的神经症状，与模型对照组比较有显著性差异(P＜0.05)；抑制神经元变性坏死和神经细胞水肿等病理组织学的改变，丹红注射液本发明工艺组与原工艺组比较具有更明显改善作用。
[0156] 梗塞边缘区进行病理学检查结果如下：
[0157] 正常对照组：大脑皮质结构清晰，表层分布着各种神经元及星形细胞，深层可见大量的神经胶质细胞，镜下未见神经细胞变性、坏死及血管增生。
[0158] 模型对照：大部分神经元变性、坏死，细胞间隙增大，镜下可见一大的液化性坏死灶，呈灰白色，灶内细胞结构消失。
[0159] 丹红注射液本发明工艺组：神经元轻度变性，神经周围间隙增大不明显，血管周围水肿较轻。
[0160] 丹红注射液原工艺组：神经元变性、坏死，镜下可见小的液化性坏死灶，呈灰白色，灶内细胞结构消失。
[0161] 6试验结论
[0162] 本试验观察了丹红注射液经静脉注射后对沙土鼠局部脑缺血模型有无影响，并将两种工艺制备的产品进行比较。结果显示：丹红注射液可减少造模后沙土鼠局部脑缺血的范围并可缓解由于造模致使沙土鼠的行为障碍，且本发明工艺组与原工艺组比较具有显著性差异，疗效更为良好。
[0163] 另外，为了验证丹红注射液改进工艺的安全性，我们也进行了一系列的动物局部毒性和全身过敏性实验研究，现总结如下：
[0164] 1.血管刺激性试验：采用家兔同体左右侧自身对比法给药，3只家兔分别编号为1-3号，每只家兔左耳给予丹红注射液溶液静脉注射给药，右耳给予5％葡萄糖注射液作对照。给药剂量为3.7ml原液(50.3mg)/kg，给药体积为13ml/kg，给药速度180ml/h，每天给药1次，连续7天。采用以下观察指标：(1)给药前和给药后，对动物和注射部位进行肉眼观察，观察血管是否清晰，有无血管扩张、收缩，血管内是否淤血，血管周围组织有无水肿等；
(2)末次给药后48h，肉眼观察3只家兔耳缘静脉，将家兔敲击头部处死。分别于注射部位近心端1.5cm至3cm处剪取含有血管的耳缘组织，其它部位有肉眼可见变化一并剪取。动物尸体冰柜中暂存，集中处理；(3)病理检查：动物标本取材→10％甲醛溶液固定→固定标本取材→动物标本脱水→脱水标本包埋→组织切片→摊片、捞片及烤片→苏木素—伊红染色→组织切片显微镜检查，观察有无血栓形成、内皮损伤及其他组织病理变化；(4)给药前和动物处死前各称重一次。
(2)末次给药后48h，肉眼观察3只家兔耳缘静脉，将家兔敲击头部处死。分别于注射部位近心端1.5cm至3cm处剪取含有血管的耳缘组织，其它部位有肉眼可见变化一并剪取。动物尸体冰柜中暂存，集中处理；(3)病理检查：动物标本取材→10％甲醛溶液固定→固定标本取材→动物标本脱水→脱水标本包埋→组织切片→摊片、捞片及烤片→苏木素—伊红染色→组织切片显微镜检查，观察有无血栓形成、内皮损伤及其他组织病理变化；(4)给药前和动物处死前各称重一次。
[0165] 观察结果：(1)给药前和给药后，肉眼观察注射部位：原工艺组产品自第二次给药后开始3只家兔左右耳注射部位出现红肿现象，停药48h后红肿现象稍减轻，但未完全恢复正常。组织切片检查可见：对照侧兔耳缘静脉结构清晰，内皮结构完整，管壁无炎细胞细胞附着，管周未见水肿，未见炎细胞浸润。给药侧兔耳静脉结构部分清晰，内皮结构部分完整，血管内皮细胞稍见肿胀、有轻微坏死现象，血管壁有少量炎性细胞附着，血管无明显扩张，血管周围组织有少量炎细胞浸润，血管周围有渗出；(2)给药前和给药后，肉眼观察注射部位：本发明工艺组产品自第二次给药后开始3只家兔左右耳注射部位出现红肿现象，停药48h后红肿现象减轻，但未完全恢复正常。组织切片检查可见：对照侧兔耳缘静脉结构清晰，内皮结构完整，管壁无炎细胞细胞附着，管周未见水肿，未见炎细胞浸润。给药侧兔耳静脉结构清晰，内皮结构完整，血管内皮细胞未见肿胀、坏死现象，血管壁无炎性细胞附着，血管无明显扩张，血管周围组织无炎细胞浸润，血管周围无渗出。
[0166] 结果表明：原工艺制备产品对新西兰兔耳缘静脉有轻微刺激作用，本发明工艺制备产品对新西兰兔耳缘静脉无明显刺激作用。
[0167] 2.肌肉刺激性试验：采用家兔同体左右侧自身对比法给药，6只家兔分别编号为1-6号，每只家兔左侧股四头肌给予丹红注射液溶液，右侧股四头肌给予0.9％氯化钠，给药剂量为1.36mg/1ml/次，一日1次，连续7天。采用以下观察指标：(1)给药前和给药后，对动物和注射部位进行肉眼观察；(2)末次给药后48h，肉眼观察6只家兔股四头肌，取编号为1-4号家兔，空气栓塞处死，解剖取出股四头肌，纵向切开，肉眼观察注射局部毒性反应，按表11换算相应的反应级，然后算出4块股四头肌反应级的平均值和反应级数之和。
[0168] 表11新西兰兔肌肉刺激试验评分表
[0169]反应级 刺激反应
0 无明显变化
1 轻度充血，直径在0.5cm以下
2 中度充血，直径在1cm左右
3 肌肉红肿、发紫、光泽消失，可见坏死点
4 肌肉红肿、发紫、光泽消失、坏死范围直径达0.5cm左右
5 出现广泛性坏死
0 无明显变化
1 轻度充血，直径在0.5cm以下
2 中度充血，直径在1cm左右
3 肌肉红肿、发紫、光泽消失，可见坏死点
4 肌肉红肿、发紫、光泽消失、坏死范围直径达0.5cm左右
5 出现广泛性坏死
[0170] 如各股四头肌反应级的最高与最低之差大于2时，应另取4只新西兰兔重新试验。如在初试或重试的4只新西兰兔4块股四头肌反应级之和小于10，则认为供试品的肌肉刺激试验符合规定，否则为不符合规定，对肌肉有刺激；(3)病理检查：动物标本取材→10％甲醛溶液固定→固定标本取材→动物标本脱水→脱水标本包埋→组织切片→摊片、捞片及烤片→苏木素—伊红染色→组织切片显微镜检查，观察股四头肌病理变化；(4)如1-4号家兔病理组织检查未见明显肌肉刺激，则留下的2只家兔(5-6号)即可处死，仅保存肌肉组织。如1-4号家兔病理组织检查有肌肉刺激，则留下的2只家兔(5-6号)根据受试物的特点和刺激性反应情况，继续观察14-21d。处死家兔后剪取肌肉组织，用10％甲醛固定，常规组织切片，观察刺激性反应的可逆程度。动物尸体置冰柜中暂存，集中处理；(5)给药前和动物处死前各称重一次。
[0171] 观察结果：(1)原工艺组产品在给药前和给药后，肉眼观察注射部位肌肉有红肿现象。末次注射后48小处死家兔，肉眼观察给药侧股四头肌有红肿现象，给药测和对照侧4块股四头肌反应级数之和为6，平均反应级数为1.5(见表12)。病理切片检查可见对照侧：肌纤维成长圆柱状或圆形(横切面)，胞质内可见密集纵向排列的肌原纤维，每个细胞有多个细胞核，位于肌膜下，视野内未见肌纤维的破坏，视野内未见炎性细胞浸润；给药侧：
肌纤维呈长圆柱或圆形，胞质内可见肌原纤维，胞核位于肌膜下，间质稍有充血、出血现象，间隙稍有增宽，间质稍见水肿现象，镜下见炎性细胞浸润，少量肌纤维坏死现象；(2)本发明工艺产品给药前和给药后，肉眼观察注射部位肌肉无肉眼可见病变。末次注射后48小处死家兔，肉眼观察：给药侧和对照侧股四头肌均未见明显变化，给药测和对照侧4块股四头肌反应级数之和均为0，平均反应级数为0(见表13)。病理切片检查可见对照侧：肌纤维成长圆柱状或圆形(横切面)，胞质内可见密集纵向排列的肌原纤维，每个细胞有多个细胞核，位于肌膜下，视野内未见肌纤维的破坏，视野内未见炎性细胞浸润；给药侧：肌纤维呈长圆柱或圆形，胞质内可见肌原纤维，胞核位于肌膜下，间质未见充血、出血现象，间隙未增宽，间质未见水肿现象，镜下未见炎性细胞浸润，未见肌纤维坏死现象。
肌纤维呈长圆柱或圆形，胞质内可见肌原纤维，胞核位于肌膜下，间质稍有充血、出血现象，间隙稍有增宽，间质稍见水肿现象，镜下见炎性细胞浸润，少量肌纤维坏死现象；(2)本发明工艺产品给药前和给药后，肉眼观察注射部位肌肉无肉眼可见病变。末次注射后48小处死家兔，肉眼观察：给药侧和对照侧股四头肌均未见明显变化，给药测和对照侧4块股四头肌反应级数之和均为0，平均反应级数为0(见表13)。病理切片检查可见对照侧：肌纤维成长圆柱状或圆形(横切面)，胞质内可见密集纵向排列的肌原纤维，每个细胞有多个细胞核，位于肌膜下，视野内未见肌纤维的破坏，视野内未见炎性细胞浸润；给药侧：肌纤维呈长圆柱或圆形，胞质内可见肌原纤维，胞核位于肌膜下，间质未见充血、出血现象，间隙未增宽，间质未见水肿现象，镜下未见炎性细胞浸润，未见肌纤维坏死现象。
[0172] 表12原工艺组产品家兔肌肉刺激试验肉眼观察表
[0173]
[0174] 表13本发明工艺组产品家兔肌肉刺激试验肉眼观察表
[0175]
[0176] 结果表明：本发明工艺制备产品对新西兰兔股四头肌无明显刺激作用；原工艺制备产品对新西兰兔股四头肌有轻微刺激作用。
[0177] 3.溶血性试验：两种工艺产品处理办法相同，均采用家兔体外红细胞溶血试验方法，具体步骤如下：(1)新西兰兔心脏取血10ml，置烧杯中用竹签搅拌去除纤维蛋白，然后分别取4ml移入2支50ml刻度离心管中，各加入0.9％氯化钠注射液40ml，混匀后离心15min(1500r/m)，去除上清液，再加入0.9％氯化钠注射液40ml混匀离心，洗涤两次，至上清液无色透明。将所得红细胞用0.9％氯化钠注射液稀释成2％(V/V)的混悬液备用；(2)静脉注射液配制：供试品1支+50％葡萄糖注射液50ml；静脉滴注液配制：供试品1支+5％葡萄糖注射液25ml；(3)取试管7支，按表14分别加入2％红细胞混悬液、0.9％氯化钠注射液、灭菌注射用水及丹红注射液溶液，第6管为阴性对照管，第7管为阳性对照管；
[0178] 表14体外溶血试验加样表
[0179]
[0180] 观察指标：将各管轻轻摇匀，在37℃水浴中保温3h，按表15所列标准观察各管加入供试品后15min、30min、45min、1h、2h、3h的溶血情况；
[0181] 表15红细胞溶血、凝集判断标准
[0182] [0183] A无溶血：红细胞下沉，上层液体无色澄明
[0184] B部分溶血：管底有少量红细胞残留，上层液体澄明红色或棕色
[0185] C全部溶血：管底无细胞残留，溶液呈澄明红色
[0186] D红细胞真凝聚：溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，振摇后不分散
[0187] E红细胞假凝聚：溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，振摇后均匀分散[0188] [0189] 当阴性对照管(6号管)无溶血和凝聚发生，阳性对照管(7号管)有溶血发生时，若供试品管中的溶液在3小时内不发生溶血和凝聚，则供试品可以注射使用；若供试品管中的溶液在3小时内发生溶血和(或)凝聚，则供试品不宜注射使用。
[0190] 观察结果：原工艺组与本发明工艺组产品试验结果完全一致，为了减少描述篇幅，省去原工艺组数据，仅详细描述本发明工艺组结果。
[0191] 阳性对照管(7号管)加入灭菌注射用水混匀后即刻出现溶血现象；1-5号管加入受试物后观察到的情形与6号管基本一致：15min时红细胞开始下沉，极少量上层液体分出，分层的上层液体淡黄色澄明；30min、45min、1h时红细胞继续下沉，上层液体逐渐更多的分出，上层液体淡黄色澄明；2h时更多的上层液体分出，淡黄色澄明，更多的红细胞沉于管底；3h时上层液体淡黄色澄明，大量红细胞沉于管底，经振摇后可见红细胞均匀散开，证明无红细胞凝聚。(见表16)
[0192] 表16本发明工艺组溶血试验结果
[0193]
[0194] 表中：-无溶血+全溶血，阴性对照为0.9％氯化钠注射液；阳性对照为灭菌注射用水
[0195] 结果表明：本发明工艺与原工艺组制备的产品在0.23mg/ml、0.39mg/ml对新西兰兔红细胞均无明显的体外溶血及致凝集作用。
[0196] 4.主动全身过敏试验：采用豚鼠隔日腹腔注射丹红注射液，高、低剂量分别为13.6mg(1ml原液)/只和6.8mg(0.5ml原液)/只，给药体积为1ml/只，共三次致敏；于末次致敏后第10天，进行激发，高、低剂量分别为27.2mg(2ml原液)/只、13.6mg(1ml原液)/只，给药容积为2ml/只，激发30分钟后将动物用戊巴比妥钠麻醉处死，剪下背部皮肤，进行蓝斑的测定，并提供照片；测量皮肤内层的斑点大小，直径大于5mm者判断为阳性。不规则斑点的直径为长径与短径之和的平均值。
[0197] 试验结果：本发明工艺组产品和0.9％氯化钠注射液激发后，大鼠皮肤未见任何蓝斑，试验结果均为阴性；原工艺组产品在抗血清比例(1∶2)、(1∶4)情况下，出现蓝斑；而1％牛血清白蛋白动物组(阳性对照组)均出现明显蓝斑，实验结果均为阳性，见表17。
[0198] 表17丹红注射液大鼠被动皮肤过敏试验结果(n＝6)
[0199]
[0200] 结果表明：在本试验条件下，本发明工艺制备的丹红注射液静脉注射对受试豚鼠无主动全身致敏作用；原工艺组制备的丹红注射液静脉注射对受试豚鼠有轻微全身致敏作用。
[0201] 通过以上药理毒理实验，本发明的工艺改进取得了巨大成功，为将来临床广泛应用及疾病治疗打下坚实基础。
具体实施方式
[0202] 实施例1
[0203] 取丹参750g、红花250g；以上两味，加水煎煮2次，每次1小时，滤过，滤液合并后于65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，加乙醇至含醇量达75～80％，冷藏，取上清液，回收乙醇并65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，再加乙醇至含醇量达80～85％，冷藏，取上清液滤过，加活性炭，搅拌，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水搅拌，煮沸，冷藏，滤过，滤液浓缩后冷藏，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.34(60℃热测)的浸膏，减压干燥粉碎成粉，加入适量淀粉、羧甲基纤维素钠、甜菊甙，混匀过80目筛，加适量水制粒，60℃减压干燥，整粒，分装，制成1000g颗粒剂。
[0204] 实施例2
[0205] 取丹参750g、红花250g；以上两味，加水煎煮2次，每次1小时，滤过，滤液合并后于65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，加乙醇至含醇量达75～80％，冷藏，取上清液，回收乙醇并65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，再加乙醇至含醇量达80～85％，冷藏，取上清液滤过，加活性炭，搅拌，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水搅拌，煮沸，冷藏，滤过，滤液浓缩后冷藏，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.34(60℃热测)的浸膏，减压干燥粉碎成粉，经制粒后装入胶囊，制成1000g硬胶囊剂。
[0206] 实施例3
[0207] 取丹参750g、红花250g；以上两味，加水煎煮2次，每次1小时，滤过，滤液合并后于65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，加乙醇至含醇量达75～80％，冷藏，取上清液，回收乙醇并65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，再加乙醇至含醇量达80～85％，冷藏，取上清液滤过，加活性炭，搅拌，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水搅拌，煮沸，冷藏，滤过，滤液浓缩后冷藏，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.34(60℃热测)的浸膏，减压干燥粉碎成粉，将明胶、水及甘油(1∶1∶0.3-0.45)融胶后保温待用，药粉加适量植物油(大豆油或色拉油)搅匀，胶体磨研磨成均匀粘稠的糊状物，减压除气，压制，制成
1000g软胶囊剂。
1000g软胶囊剂。
[0208] 实施例4
[0209] 取丹参750g、红花250g；以上两味，加水煎煮2次，每次1小时，滤过，滤液合并后于65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，加乙醇至含醇量达75～80％，冷藏，取上清液，回收乙醇并65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，再加乙醇至含醇量达80～85％，冷藏，取上清液滤过，加活性炭，搅拌，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水搅拌，煮沸，冷藏，滤过，滤液浓缩后冷藏，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.34(60℃热测)的浸膏，减压干燥粉碎成粉，加入适量淀粉、微粉硅胶及硬脂酸镁，制粒，压制成片，包衣，制成1000g片剂。
[0210] 实施例5
[0211] 取丹参750g、红花250g；以上两味，加水煎煮2次，每次1小时，滤过，滤液合并后于65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，加乙醇至含醇量达75～80％，冷藏，取上清液，回收乙醇并65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，再加乙醇至含醇量达80～85％，冷藏，取上清液滤过，加活性炭，搅拌，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水搅拌，煮沸，冷藏，滤过，滤液浓缩后冷藏，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.34(60℃热测)的浸膏，减压干燥粉碎成粉，加入到4倍量3∶1的熔融聚乙二醇4000-聚乙二醇6000中，搅拌均匀，转移至滴丸机，滴制成丸，除去表面的二甲基硅油，包装，制成1000g滴丸剂。
[0212] 实施例6
[0213] 取丹参750g、红花250g；以上两味，加水煎煮2次，每次1小时，滤过，滤液合并后于65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，加乙醇至含醇量达75～80％，冷藏，取上清液，回收乙醇并65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，再加乙醇至含醇量达80～85％，冷藏，取上清液滤过，加活性炭，搅拌，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水搅拌，煮沸，冷藏，滤过，滤液浓缩后冷藏，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.34(60℃热测)的浸膏，另取2.5g苯甲酸钠、80g蔗糖加水150ml，煮沸，加入浸膏中，搅匀，加水至1000ml，搅匀，滤过，灌装，灭菌，加水至1000ml，即得口服液。
[0214] 实施例7
[0215] 丹参750g、红花250g；以上两味，加水煎煮2次，每次1小时，滤过，滤液合并65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，加乙醇至含醇量达75～80％，冷藏，取上清液，回收乙醇并65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，再加乙醇至含醇量达80～85％，冷藏，取上清液滤过，加活性炭，搅拌，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加纯化水至1000ml，搅拌，煮沸，冷藏，滤过，滤液浓缩至300ml，冷藏，滤过，滤液用NaOH溶液调节pH值至6.5～7.5，煮沸，加活性炭，搅拌，静置，滤过，滤液经超滤后，加活性炭，煮沸，滤过，滤液加甘露醇煮沸溶解后，加注射用水至1000ml，调pH值至6.5～7.5，滤过，在-40～-50℃下预冻2～3小时，然后冷冻干燥，在抽真空前，凝结器应先降温至-50～-60℃，在第一阶段，真空度维持在0.1mmHg柱左右，升华温度-20～-30℃，干燥6～8小时，当看到制品中无水晶存在时，即以除去90％以上水份时，然后进入第二阶段干燥，此时将干燥箱中搁板的温度升至30℃左右并保持恒定，继续干燥5～6小时左右，制成冻干粉即得。
[0216] 实施例8
[0217] 取丹参750g、红花250g；以上两味，加水煎煮2次，每次1小时，滤过，滤液合并后于65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，加乙醇至含醇量达75～80％，冷藏，取上清液，回收乙醇并65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，再加乙醇至含醇量达80～85％，冷藏，取上清液滤过，加活性炭，搅拌，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水搅拌，煮沸，冷藏，滤过，滤液浓缩后冷藏，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.34(60℃热测)的浸膏，减压干燥粉碎成粉，加入微晶纤维素和半量的羧甲基淀粉钠充分混合均匀，用乙醇为黏合剂，制成20目湿颗粒；于50-60℃热风干燥，干颗粒水分控制为3％-8％；加入微粉硅胶、硬脂酸镁和另外的一半羧甲基淀粉钠，混匀后用20目筛整粒；压片后制成分散片。
[0218] 实施例9
[0219] 取丹参750g、红花250g；以上两味，加水煎煮2次，每次1小时，滤过，滤液合并后于65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，加乙醇至含醇量达75～80％，冷藏，取上清液，回收乙醇并65℃浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，再加乙醇至含醇量达80～85％，冷藏，取上清液滤过，加活性炭，搅拌，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水搅拌，煮沸，冷藏，滤过，滤液浓缩后冷藏，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.34(60℃热测)的浸膏，减压干燥粉碎成粉，加入乳糖、微晶纤维素、阿斯巴甜及交联聚乙烯吡咯烷酮混合均匀，用
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