技术领域
[0001] 本
发明属于
生物工程领域，具体涉及用于乳酸或柠檬酸发酵生产的非粮碳源及其制备方法。
背景技术
[0002] 乳酸(2-羟基丙酸)和柠檬酸(2-羟基丙烷-1，2，3-三
羧酸)是两种重要的
有机酸，广泛应用于食品、化工和医药工业。工业乳酸虽然部分由化学合成方法得到，但生产成本较高，且污染严重，逐渐被淘汰，目前主要由各种
生物质原料发酵生产而来。由于乳酸和柠檬酸分子主要由碳、氢、
氧三种元素组成，因此这两种有机酸的发酵生产主要消耗的是碳源，而氮源的作用是仅仅维持细胞生长和代谢。传统的工业碳源主要来自
淀粉质的大米、玉米或小麦等粮食原料，利用其所含淀粉发酵生产柠檬酸，或者将淀粉
液化和
糖化后发酵生产乳酸。由于全球粮食生产能
力仍然有限，粮食总体上仍然供不应求，
能源和粮食价格步步攀升，导致工业乳酸和柠檬酸原料成本不断上涨，行业竞争加剧。虽然利用
纤维素质原料生产乳酸和柠檬酸是比较有潜力的发展方向，但
纤维素转化糖等技术尚不成熟，还未大规模应用于工业化生产，淀粉质原料仍然是发酵工业的主要原料。所以，寻找淀粉质的非粮原料以替代或部分替代粮食原料具有重要意义。橡子是一种野生
植物，栎树的果实，形似蚕茧，又称栗茧。橡子果实富含
氨基酸、维生素、
脂肪酸和矿物质，淀粉含量可高达83.24％[1]，因此成为食品和
饲料工业的重要原料，但近年也开始用于发酵生产
燃料乙醇[2，3]。栗是山毛榉科栗属中的乔木或灌木总称，是中国栽培最早的果树之一。板栗果实营养丰富，除大量的
蛋白质、脂肪、氨基酸、维生素和矿物质外，淀粉和糖的含量高达70％，目前主要用作营养和药用食品[4]。黄姜又名盾叶薯蓣或火藤根，是薯蓣属野生草本植物，
块茎含有1.1％～16.5％的皂素，可用作合成甾体
激素药物的重要化工原料；此外还含有35％～40％的淀粉，可以提取出来制成淀粉和
葡萄糖，如用作柠檬酸发酵的原料[5]。据统计，2003年全国黄姜种植面积达150万亩以上，产量达10万吨[6]。由于橡子、板栗中氨基酸和维生素含量较高，是
微生物生长和代谢的营养物质，用作发酵原料提供碳源，不仅淀粉和糖含量较高，还可以减少氮源和生长因子等辅料的用量，制备碳源的同时，分离出的橡子和板栗纤维和蛋白渣作为副产品，可用作食品或饲料添加剂，分离出的皂素可用作化工原料，是综合利用资源的明智之举。非粮原料碳源可以作为粮食原料碳源的季节性替代，在资源丰富的地区甚至可以完全替代粮食原料碳源，但目前尚未发现有利用橡子或板栗等非粮原料制备碳源用于发酵生产乳酸或柠檬酸，以及利用黄姜制备碳源用于发酵生产乳酸的
专利或报道。
发明内容
[0003] 本发明的任务是提供用于乳酸或柠檬酸发酵生产的非粮碳源，另一个任务是提供这种用于乳酸或柠檬酸发酵生产的非粮碳源的制备方法。本发明使用橡子、板栗的果实或黄姜的块茎为原料制备非粮碳源，以替代或部分替代粮食碳源，以避免与人畜争粮，降低乳酸和柠檬酸生产的原料成本。
[0004] 实现本发明的技术方案是：
[0005] 本发明提供的用于乳酸或柠檬酸发酵生产的非粮碳源，是以橡子、板栗的果实或黄姜的块茎为原料制得的用于柠檬酸发酵的碳源：橡子或板栗的糊精混浊液或澄清液；或用于乳酸或柠檬酸发酵的碳源：橡子或板栗的还原糖混浊液或澄清液；或用于乳酸发酵的碳源：黄姜的还原糖混浊液或澄清液。
[0006] 所述的橡子或板栗的糊精混浊液是按以下方法制备的：将干的橡子或板栗的果实用
粉碎机粉碎，过80～200目筛，再按固液比1∶1～1∶10的比例与
水混合，制成
流体；或者将湿的橡子或板栗的果实用磨浆机磨浆，按原材料与水以1∶1～1∶10(w/v)的比例混合，制成流体；将所得流体再过80～200目筛，收集过筛后的
浆液，得到橡子或板栗的淀粉溶液；将橡子或板栗的淀粉溶液调pH至5.0～8.0，升温到所用α-淀粉酶的
工作温度30～105℃，按5～20个单位酶/克原料的量加入α-淀粉酶，保温液化20min以上使淀粉转
化成糊精，然后快速升温到80℃以上，保温10min以上灭酶，再冷却至室温，得到橡子或板栗的糊精混浊液。
[0007] 所述的橡子或板栗的糊精澄清液是按以下方法制备的：将上述制得的橡子或板栗的糊精混浊液经过3000～8000rpm离心5～30min或常规过滤处理，得到的上清液或滤过液，即为橡子或板栗的糊精澄清液。
[0008] 所述的橡子或板栗的还原糖混浊液是按以下方法制备的：将前述制得的橡子或板栗的糊精混浊液降温到糖化酶的工作温度40～70℃，调pH至3.5～7.0，按50～200个单位酶/克原料的量加入糖化酶，保温糖化15h以上使糊精转化成还原糖，然后快速升温到80℃以上，保温10min以上灭酶，再冷却至室温，即得到橡子或板栗的还原糖混浊液。
[0009] 所述的橡子或板栗的还原糖澄清液是按以下方法制备的：将上述制得的橡子或板栗的还原糖混浊液经过3000～8000rpm离心5～30min或常规过滤处理，以去掉还原糖混浊液中的纤维和蛋白质等固形物，得到的上清液或滤过液即是橡子或板栗的还原糖澄清液。
[0010] 所述的黄姜的还原糖混浊液是按以下方法制备的：将干的黄姜块茎用粉碎机粉碎，过80～200目筛，再按固液比1∶1～1∶10的比例与水混合，制成流体；或将湿的黄姜的块茎用磨浆机磨浆，按原材料与水以1∶1～1∶10(w/v)的比例混合，制成流体；将所得流体再过80～200目筛，收集过筛后的浆液，得到黄姜的淀粉溶液；将黄姜的淀粉溶液调pH至5.0～8.0，升温到所用α-淀粉酶的工作温度30～105℃，按5～20个单位酶/克原料的量加入α-淀粉酶，保温液化20min以上使淀粉转化成糊精，然后快速升温到
80℃以上，保温10min以上灭酶，再冷却至室温，得到黄姜的糊精混浊液；将黄姜的糊精混浊液降温到糖化酶的工作温度40～70℃，调pH 3.5～7.0，按50～200个单位酶/克原料的量加入糖化酶，保温糖化15h以上使糊精转化成还原糖，然后快速升温到80℃以上，保温10min以上灭酶，再冷却至室温，得到黄姜的还原糖混浊液。
[0011] 所述的黄姜的还原糖澄清液是按以下方法制备的：将上述制得的黄姜的还原糖混浊液经过3000～8000rpm离心5～30min或常规过滤处理，以去掉还原糖混浊液中的纤维和蛋白质等固形物，得到的上清液或滤过液即是黄姜的还原糖澄清液。
[0012] 本发明提供的用于乳酸或柠檬酸发酵生产的非粮碳源的制备方法是：
[0013] 1)粉碎或磨浆：将干的橡子、板栗的果实或黄姜块茎用粉碎机粉碎，过80～200目筛，再按固液比1∶1～1∶10的比例与水混合，制成流体；或将湿的橡子、板栗或黄姜的块茎用磨浆机磨浆，按原材料与水以1∶1～1∶10(w/v)的比例混合，制成流体；将所得流体再过80～200目筛，收集过筛后的浆液；
[0014] 2)液化：将步骤1)橡子、板栗或黄姜筛后的浆液混匀后调pH至5.0～8.0，升温到所用α-淀粉酶的工作温度30～105℃，按5～20个单位酶/克原料的量加入α-淀粉酶，保温液化20min以上使淀粉转化成糊精，然后快速升温到80℃以上，保温10min以上灭酶，再冷却至室温，得到橡子、板栗或黄姜的糊精混浊液，橡子和板栗的糊精混浊液即可用作柠檬酸发酵的非粮碳源；
[0015] 3)糖化：将步骤2)液化后的橡子、板栗或黄姜的糊精降温到糖化酶的工作温度40～70℃，调pH 3.5～7.0，按50～200个单位酶/克原料的量加入糖化酶，保温糖化
15h以上使糊精转化成还原糖，然后快速升温到80℃以上，保温10min以上灭酶，再冷却至室温，得到橡子、板栗或黄姜的还原糖混浊液，其中，橡子和板栗的还原糖混浊液，即可用作乳酸或柠檬酸发酵的非粮碳源，黄姜的还原糖混浊液可用作乳酸发酵的碳源。
[0016] 将上述步骤2)制备的橡子、板栗或黄姜的糊精混浊液可经过3000～8000rpm离心5～30min或常规过滤处理，以去掉橡子、板栗或黄姜的纤维和蛋白质等固形物，得到的上清液或滤过液，主要是橡子、板栗或黄姜的糊精澄清液，其中，橡子和板栗的糊精澄清液即可用作柠檬酸发酵的非粮碳源；
[0017] 将上述步骤3)制备的橡子、板栗或黄姜的还原糖混浊液可经过3000～8000rpm离心5～30min或常规过滤处理，以去掉还原糖混浊液中的纤维和蛋白质等固形物，得到的上清液或滤过液主要是橡子、板栗或黄姜的还原糖澄清液，其中，橡子和板栗的还原糖澄清液，即可用作乳酸或柠檬酸发酵的非粮碳源，黄姜的还原糖澄清液可用作乳酸发酵的非粮碳源。
[0018] 本发明提供的非粮碳源适用于乳酸或柠檬酸的发酵生产，也适合于用作其它微生物作菌种发酵生产其它物质的非粮碳源。
[0019] 采用本发明提供的方法制备非粮碳源，并用制备好的非粮碳源和粮食碳源发酵生产柠檬酸和乳酸，两种碳源发酵效果相似或者非粮碳源更好，具体结果见
实施例。采用本发明提供的方法制备非粮碳源，获得的还原糖得率，以及利用本发明制备的非粮碳源发酵生产柠檬酸和乳酸(实施例)，也均取得与
现有技术相似或更好的效果(参考文献)，其结果如下表所示。
[0020]
[0021] 因此，与现有粮食原料的碳源相比，本发明提供的非粮碳源具有如下优势：橡子、板栗和黄姜等非粮原料来源丰富，价格低廉，制备成非粮碳源，可以部分甚至完全替代供应紧张、价格上涨的粮食碳源，避免与人畜争粮，使工业生产原料供应得到保证，与传统的大米、玉米和小麦等粮食原料来源碳源相比，不仅可提供高效的碳源，还可提供一定量的氮源和生长因子，在达到利用现有碳源发酵乳酸和柠檬酸相似甚至更好生产能力的同时，非粮碳源成本大大降低。同时，在制备非粮碳源的同时，还可生产橡子和板栗的纤维和蛋白，制备黄姜皂素等副产物，用于食品、饲料或化工工业，是资源综合利用、节能增效的好方法。
[0022] 总之，本发明制备非粮碳源的原料来源广泛，价格低廉，制备方法简便，非粮碳源用于乳酸和柠檬酸发酵，能达到与现今常用的玉米、大米和小麦等粮食碳源相似甚至更好的效果，是粮食碳源的优良替代碳源，具有很好的工业生产应用价值。
具体实施方式
[0023] 一、测量方法
[0024] (1)乳酸和柠檬酸的定量测定方法：采用高效液相色谱法(HPLC)[7]。
[0025] ① 仪 器：安 捷 伦 1200色 谱 仪 (Agilent Co.，America)，离 子 交 换 柱AminexHPX-87H(300x 7.8mm，Bio-Rad，Hercules，Calif.)。
[0026] ②流动相：0.01mol/L H2SO4，流速0.5mL/min。
[0027] ③柱温和
波长：测量波长210nm，测量柱温35℃。
[0028] (2)还原糖的定量测定方法：采用3，5-二硝基水杨酸法(DNS法)[11]。
[0029] 二、实施例
[0030] 实施例1：
[0031] (1)非粮碳源制备实施例
[0032] 1)粉碎：将去壳的干橡子果100g粉碎，然后过80目筛，收集过筛后的橡子粉，按橡子粉与水1∶2(w/v)的比例加200mL水混匀，调和成浆液，得到橡子淀粉溶液；
[0033] 2)液化：将步骤1)制备的橡子淀粉溶液用1mo/L的
盐酸调pH为6.0，升温到所用α-淀粉酶的工作温度92℃，按5个单位/克原料的量加入α-淀粉酶500单位(α-淀粉酶由无
锡赛德生物工程有限公司出产)，保温20min，使橡子中的淀粉转化成糊精，得到橡子糊精混浊液，即可作为柠檬酸发酵生产的非粮碳源；
[0034] 3)糖化：将步骤2)制备的橡子糊精混浊液降温到糖化酶的工作温度60℃，用1mo/L的盐酸调pH为4.0，按50个单位/克原料的量加入糖化酶5000单位(糖化酶由无锡赛德生物工程有限公司出产)，保温糖化20h，使橡子糊精转化成还原糖，然后快速升温到100℃，保温10min灭酶，然后冷却至室温，得到橡子还原糖混浊液，即可作为乳酸发酵生产的非粮碳源，本例还原糖得率为72.2％。
[0035] (2)非粮碳源应用实施例A：利用两种碳源发酵生产柠檬酸
[0036] 1)菌种：黑曲霉(Aspergillus niger HG 09)。
[0037] 2)发酵培养基：①碳源：同时采用非粮碳源和粮食碳源做平行实验，以比较两种碳源的发酵效果，a.非粮碳源：将非粮碳源制备实施例步骤2)制备的橡子糊精混浊液调整初糖浓度为100g/L；b.粮食碳源：以玉米为原料，按非粮碳源制备实施例提供的方法制备玉米糊精混浊液，调整初糖浓度为100g/L；②氮源及其它辅料：添加
硫酸铵7g/L、
磷酸二氢
钾1g/L、
硫酸镁1g/L、碳酸
钙80g/L；③灭菌：250mL三
角瓶装培养基100mL，120℃、0.1MPa灭菌15min，作为发酵培养基。
[0038] 3)培养条件：接种量106个孢子/mL，发酵温度37℃，摇床转速300rpm，培养时间68h。
[0039] 4)发酵结果：发酵完成后，定量检测发酵液中的柠檬酸和还原糖，结果如下表：
[0040]
[0041] (3)非粮碳源应用实施例B：利用两种碳源发酵生产乳酸
[0042] 1)菌种：德氏乳酸杆菌(Lactobacillus delbrueckii HG 07)。
[0043] 2)发酵培养基：①碳源：同时采用非粮碳源和粮食碳源做平行实验，以比较两种碳源的发酵效果，a.非粮碳源：将非粮碳源制备实施例步骤3)制备的橡子还原糖混浊液调整初糖浓度为100g/L；b.粮食碳源：以玉米为原料，按非粮碳源制备实施例提供的方法制备玉米还原糖混浊液，调整初糖浓度为100g/L；②氮源及其它辅料：添加玉米浆30g/L，
酵母粉15g/L，
牛肉膏10g/L，碳酸钙60g/L；③灭菌：250mL三角瓶装培养基100mL，120℃、0.1MPa灭菌15min，作为发酵培养基。
[0044] 3)培养条件：接种量8％，发酵温度45℃，摇床转速150rpm，培养时间48h。
[0045] 4)发酵结果：发酵完成后，定量检测发酵液中的乳酸和还原糖，结果如下表：
[0046]
[0047] 实施例2：
[0048] (1)非粮碳源制备实施例
[0049] 1)磨浆：将去壳的湿板栗果1000g磨浆，按板栗与水1∶1(w/v)的比例加1000mL水混匀，调和成浆液，然后过100目筛，得到板栗淀粉溶液；
[0050] 2)液化：将步骤1)制备的板栗淀粉溶液用1mo/L的盐酸调pH 6.5，升温到所用α-淀粉酶的工作温度92℃，按10个单位/克原料的量加入α-淀粉酶10000单位，保温35min，使板栗中的淀粉转化成糊精，得到板栗糊精混浊液，即可作为柠檬酸发酵生产的非粮碳源；
[0051] 3)糖化：将步骤2)制备的板栗糊精混浊液降温到糖化酶的工作温度60℃，用1mo/L的盐酸调pH 4.2，按100个单位/克原料的量加入糖化酶100000单位，保温糖化30h，使板栗糊精转化成还原糖，然后快速升温到100℃，保温15min灭酶，然后冷却至室温，得到板栗还原糖混浊液；
[0052] 4)澄清：将步骤3)制备的板栗还原糖混浊液于7000rpm离心10min，收集离心后的上清液，得到板栗还原糖澄清液，即可作为乳酸发酵生产的非粮碳源，本例还原糖得率71.3％。
[0053] (2)非粮碳源应用实施例A：利用两种碳源发酵生产柠檬酸
[0054] 1)菌种：黑曲霉(Aspergillus nigerHG 09)。
[0055] 2)发酵培养基：①碳源：同时采用非粮碳源和粮食碳源做平行实验，以比较两种碳源的发酵效果，a.非粮碳源：将非粮碳源制备实施例步骤2)制备的橡子糊精混浊液调整初糖浓度为150g/L；b.粮食碳源：以大米为原料，按非粮碳源制备实施例提供的方法制备大米糊精混浊液，调整初糖浓度为150g/L；②氮源及其它辅料：添加尿素9g/L、磷酸二氢钾1.4g/L、硫酸镁2.3g/L、碳酸钙120g/L；③灭菌：250mL三角瓶装培养基100mL，120℃、0.1MPa灭菌15min，作为发酵培养基。
6
[0056] 3)培养条件：接种量10 个孢子/mL，发酵温度37℃，摇床转速300rpm，培养时间70h。
[0057] 4)发酵结果：发酵完成后，定量检测发酵液中的柠檬酸和还原糖，结果如下表：
[0058]
[0059] (3)非粮碳源应用实施例B：利用两种碳源发酵生产乳酸
[0060] 1)菌种：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus HG 08)。
[0061] 2)发酵培养基：①碳源：同时采用非粮碳源和粮食碳源做平行实验，以比较两种碳源的发酵效果，a.非粮碳源：将制备好的板栗还原糖澄清液调整初糖浓度为150g/L；b.粮食碳源：以大米为原料，按本实施例提供的方法制备大米还原糖澄清液，调整初糖浓度为150g/L；②氮源及其它辅料：添加玉米浆40g/L，酵母粉20g/L，牛肉膏15g/L，碳酸钙
80g/L；③灭菌：250mL三角瓶装培养基100mL，120℃、0.1MPa灭菌15min，作为发酵培养基。
[0062] 3)培养条件：接种量8％，发酵温度42℃，摇床转速150rpm，培养时间52h。
[0063] 4)发酵结果：发酵完成后，定量检测发酵液中的乳酸和还原糖，结果如下表：
[0064]
[0065] 实施例3：
[0066] (1)非粮碳源制备实施例
[0067] 1)磨浆：将洗净的湿黄姜块茎1000g磨浆，按板栗与水1∶5(w/v)的比例加5000mL水混匀，调和成浆液，然后过200目筛，得到黄姜淀粉溶液；
[0068] 2)液化：将步骤1)制备的黄姜淀粉溶液用1mo/L的盐酸调pH 6.5，升温到所用α-淀粉酶的工作温度90℃，按10个单位/克原料的量加入α-淀粉酶10000单位，保温40min，使黄姜中的淀粉转化成糊精，得到黄姜糊精混浊液；
[0069] 3)糖化：将步骤2)制备的黄姜糊精混浊液降温到糖化酶的工作温度60℃，用1mo/L的盐酸调pH 4.5，按100个单位/克原料的量加入糖化酶100000单位，保温糖化30h，使黄姜糊精转化成还原糖，然后快速升温到100℃，保温15min灭酶，然后冷却至室温，得到黄姜还原糖混浊液；
[0070] 4)澄清：将步骤3)制备的黄姜还原糖混浊液于7000rpm离心10min，收集离心后的上清液，得到黄姜还原糖澄清液，作为乳酸发酵的非粮碳源，本例还原糖得率40.5％。
[0071] (2)非粮碳源应用实施例B：利用两种碳源发酵生产乳酸
[0072] 1)菌种：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus HG 08)。
[0073] 2)发酵培养基：①碳源：同时采用非粮碳源和粮食碳源做平行实验，以比较两种碳源的发酵效果，a.非粮碳源：将制备好的黄姜还原糖澄清液调整初糖浓度为150g/L；b.粮食碳源：以小麦为原料，按本实施例提供的方法制备小麦还原糖澄清液，调整初糖浓度150g/L；②氮源及其它辅料：添加玉米浆40g/L，酵母粉20g/L，牛肉膏15g/L；③灭菌：5L
发酵罐装培养基3L，120℃、0.1MPa灭菌15min，作为发酵培养基；④中和剂：25％的
氨水。
[0074] 3)培养条件：接种量8％，发酵温度42℃，发酵罐搅拌转速150rpm，培养时间52h。
[0075] 4)发酵结果：发酵完成后，定量检测发酵液中的乳酸和还原糖，结果如下表：
[0076]
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