牛蒡苷元在调节PP2A活性中的应用
阅读：1040发布：2020-05-22
专利汇可以提供牛蒡苷元在调节PP2A活性中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种 牛 蒡 苷元 在制备调节PP2A活性的 试剂 中的应用。牛蒡苷元在制备调节PP2A活性试剂的应用中，还可以具有这样的特征：其中，牛蒡苷元的加入量为1～10μm，PP2A的活性在此范围内随着牛蒡苷元的加入量的增加而提高。ATG作为一个能高度结合PP2A且能影响其活性的天然小分子化合物，具有良好的应用前景。，下面是牛蒡苷元在调节PP2A活性中的应用专利的具体信息内容。
牛蒡苷元在调节PP2A活性中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种牛蒡苷元在调节PP2A活性中的应用，属于中医药领域。
背景技术
[0003] PP2A是丝氨酸苏氨酸磷酸化酶，调节真核细胞中大部分的磷酸化酶。在信号转导的级联反应中与其他磷酸化酶和激酶相互作用，构成调节大分子调控下游信号的转导。在糖尿病肾脏疾病(DKD)中P65是导致炎症反应的关键通路。PP2A可以通过去磷酸化P65，来发挥治疗DKD的作用。此外，目前有研究揭示PP2A与原癌基因c-Myc之间有着密切的联系。PP2A调节亚基B56α选择性地与c-Myc的N端结合，引起c-Myc表达水平显著降低。利用shRNA解除B56α与c-Myc的结合，可导致c-Myc过度表达、c-Myc Ser62磷酸化水平的提高及c-Myc功能的增强等现象，依此很容易联想到PP2A在细胞增殖分化调控中担当着某种关键的角色。ATG与PP2A活性之间的关系在之前的研究中并未阐明。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种ATG在调节PP2A活性中的应用，是ATG的一种新应用。
[0005] 本发明采用了如下技术方案：
[0006] 本发明首先提供一种ATG在制备调节PP2A活性的试剂中的应用。
[0007] 进一步，在ATG制备成调节PP2A活性试剂的应用中，还可以具有这样的特征：其中，ATG的加入量为1～10μm，PP2A的活性在此范围内随着牛蒡苷元的加入量的增加而提高。
[0008] 本发明还提供一种提高293T细胞中PP2A活性的方法，其特征在于：包括加入ATG的步骤。
[0009] 进一步，本发明的提高293T细胞中PP2A活性的方法，还可以具有这样的特征：其中，ATG的加入量是1μM～10μM。
[0010] 本发明还提供一种ATG在回收PP2A蛋白中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
[0011] 步骤一，加入100μM～1000μM的ATG刺激细胞。
[0012] 步骤二，提取细胞并粉碎；
[0013] 步骤三，上样并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；
[0014] 步骤四，切下与PP2A分子量相对应部分的凝胶条带，回收蛋白。
[0015] 进一步，本发明的ATG在回收PP2A蛋白中的应用，还可以具有这样的特征：其中，回收蛋白时，将凝胶条带用碾磨棒碾碎，在其中加入小于500μl/块胶的缓冲液，在4摄氏度静置10小时，然后5000-10000rpm离心10min，上清液中即含有PP2A蛋白。
[0016] 发明的有益效果
[0018] 图1是DARTS-western杂交的结果图。
[0019] 图2是不同浓度的ATG刺激后的PP2A活性图。
具体实施方式
[0020] 以下结合具体实施方式详细说明本发明的技术方案。
[0021] 1、ATG刺激293T的质谱分析
[0022] 使用293T细胞，用M-PER mammalian protein extraction buffer(78501ThermoFisher)和磷酸酶抑制剂(50mM NaF,10mMβ-glycerophosphate,5mM sodium pyrophosphate,2mM Na3VO4)消化297T细胞。在细胞裂解液中加入10X TNC缓冲液(500mM Tris-HCl pH 8.0,500mM NaCl,100mM CaCl2)并用bradford法(500-0006 Bio-rad)测量蛋白质浓度。在细胞裂解液中加或不加ATG，加ATG时尝试膻300μM，一起放在室温下培养1h。随后在细胞裂解液放入不同浓度的链霉蛋白酶at 1:1000(10165921001,Roche)室温下放置20分钟裂解蛋白质。两组裂解液行质谱检测比较差异，结果见图1。
[0023] 图1：ATG干预后质谱比较结果
[0024]
[0025]
[0026] 分析质谱结果显示，结合最多的2个蛋白是微管蛋白，由于本身细胞内微管蛋白的含量很高，所以我们认为是非特异性的。且由于正常状态下PP2A在细胞中的含量很低，所以我们认为ATG和PP2A的结合率很高。
[0027] 2、ATG与PP2A结合的western blot实验。
[0028] ATG刺激293T细胞。选择链霉蛋白酶最佳浓度为1:1000后，我们选择了不同浓度的ATG刺激293T细胞，来观察ATG与PP2A的结合量能否随着ATG浓度的增高而加大。根据ATG的刺激浓度不同分为3组：DMSO、100μM,300μM、1000μM。加入链霉蛋白酶的浓度为1:1000。故Western Blot一共分5组：空白组(未加链霉蛋白酶)、DMSO(链霉蛋白酶1：1000)、ATG100μM(链霉蛋白酶1：1000)、ATG300μM(链霉蛋白酶1：1000)、ATG1000μM(链霉蛋白酶1：1000)。结果发现在链霉蛋白酶1：1000的条件(链霉蛋白酶可以消化蛋白，但是它消化未与ATG结合的蛋白比消化已经与ATG结合的蛋白多。我们测试了不同浓度的链霉蛋白酶，结果发现1:1000的浓度能够帮助我们很好的发现与ATG结合和不与ATG结合蛋白的差异，这种用来研究小分子化合物的结合蛋白的方法叫DARTS。可以发现随着ATG浓度的增加，PP2A结合也随之增加，结果见图2。
[0029] 图2：DARTS-western blot证实ATG与PP2AB结合，PP2A有3个结构单元，ATG结合的是催化剂单元。这个催化剂单元的蛋白叫PP2AB，基因叫PPP2CB。
[0030] 如果需要提取PP2A蛋白，则不加链霉蛋白酶，采用如下步骤：
[0031] 步骤一，加入100μM～1000μM的ATG刺激细胞。
[0032] 步骤二，提取细胞并粉碎；
[0033] 步骤三，上样并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；
[0034] 步骤四，切下与PP2A分子量相对应部分的凝胶条带，回收蛋白。回收蛋白时，将凝胶条带用碾磨棒碾碎，在其中加入小于500μl/块胶的缓冲液，在4摄氏度静置10小时，然后5000-10000rpm离心10min，上清液中即含有PP2A蛋白。采用此种方法的蛋白回收率是70％。
[0035] 步骤中的细胞可以是293T细胞，也可以是其它种类的细胞。
[0036] 3、ATG对PP2A活性的影响
[0037] 用浓度分别为0、1.0μm、3.3μm、10μm的ATG刺激293T细胞,刺激时间为1小时，利用PP2A活性试剂盒(R&D systems,DYC3309-2)检测PP2A活性，结果发现随着ATG浓度增加，PP2A的活性也随之增加，结果见表1。可见ATG能有效增加PP2A的活性。随着ATG用量的增加，PP2A的活性也随之增加。
[0038] 表1：PP2A活性值
[0039] DMSO 1.0μm 3.3μm 10μm
均数±标准差 0.0176±0.0009 0.0268±0.0004 0.0279±0.0030 0.0484±0.0036P值 0.006 0.044 0.007
均数±标准差 0.0176±0.0009 0.0268±0.0004 0.0279±0.0030 0.0484±0.0036P值 0.006 0.044 0.007
[0040] 注：P值是与DMSO比较。
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