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纳米轭合物以及纳米轭合物配制品

阅读：203发布：2021-05-24

专利汇可以提供纳米轭合物以及纳米轭合物配制品专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种药物- 聚合物纳米轭合物，该纳米轭合物包括共价键合于聚合物的药物。该纳米轭合物可以包括嵌段共聚物涂层和/或白蛋白涂层。该药物-聚合物纳米轭合物的药物可以是通过由该药物的羟基或硫醇基所形成的醚或硫醚的连接物而连接于聚合物的一种或多种的不同治疗剂。该白蛋白涂层可以基本上或完全地延缓或防止该纳米轭合物在固体形态或在溶液中的聚集。本发明进一步提供了包含多种药物-聚合物纳米轭合物的组合物，以及例如在治疗或诊断应用中使用这些药物-聚合物纳米轭合物的方法。，下面是纳米轭合物以及纳米轭合物配制品专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种药物-聚合物纳米轭合物组合物，包括药物-聚合物纳米轭合物、嵌段共聚物涂层、以及白蛋白涂层；
其中所述药物-聚合物纳米轭合物包括一种或多种药物以及一种或多种聚合物，并且所述药物-聚合物纳米轭合物的所述一种或多种药物是通过醚或硫醚部分单独地共价键合于所述药物-聚合物纳米轭合物的单独聚合物的起始点；
所述药物-聚合物纳米轭合物的所述一种或多种聚合物包括聚酯、聚碳酸酯、多磷酸酯、聚硅氧烷、聚磷腈、多肽、或氨基酸低聚物区段、或它们的组合；
所述嵌段共聚物涂层包含PEG和丙交酯嵌段；并且
所述嵌段共聚物涂层涂覆有一定量的白蛋白，足以有效地至少基本上防止所述药物-聚合物纳米轭合物在与其他药物-聚合物纳米轭合物相接触时发生聚集。
2.如权利要求1所述的组合物，进一步包括一种或多种共价键合于所述药物-聚合物纳米轭合物的表面上或所述嵌段共聚物涂层上的细胞靶向剂。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述合并的药物-聚合物纳米轭合物、嵌段共聚物涂层、以及白蛋白涂层的直径是约2nm至约300nm。
4.如权利要求3所述的组合物，其中所述合并的药物-聚合物纳米轭合物、嵌段共聚物涂层、以及白蛋白涂层的直径是小于约200nm。
5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述合并的药物-聚合物纳米轭合物、嵌段共聚物涂层、以及白蛋白涂层的质量占没有共价键合至聚合物的全部药物的小于
0.5wt.%。
6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述嵌段共聚物涂层包括一种或多种PLA-PEG二嵌段共聚物、一种或多种PLA-PEG-PLA三嵌段共聚物、或它们的组合。
7.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述嵌段共聚物涂层的PEG嵌段的分子量是约400至约40,000。
8.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述嵌段共聚物涂层的丙交酯嵌段的分子量是约1,000至约250,000。
9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述嵌段共聚物涂层的PEG嵌段的分子量是约5,000，并且所述嵌段共聚物涂层的丙交酯嵌段的分子量是约5,000至约50,000。
10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，所述药物-聚合物纳米轭合物在其他药物-聚合物纳米轭合物的存在下当与所述其他药物-聚合物纳米轭合物在水中或在水溶液中接触时在大于24小时内保持不聚集。
11.如权利要求2-10中任一项所述的组合物，其中共价键合至所述药物-聚合物纳米轭合物的表面上的所述细胞靶向剂包括适体。
12.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述嵌段共聚物涂层是通过静电作用而非共价地键合于所述药物-聚合物纳米轭合物的。
13.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中所述药物-聚合物纳米轭合物与所述嵌段共聚物涂层的质量比是约0.1至约10、约0.2至约5、约0.25至约4、约0.3至约3、约0.4至约2、约0.5至约1.5、或约0.75至约1.25。
14.如权利要求1-13中任一项所述的组合物，其中所述白蛋白是哺乳动物血清白蛋白。
15.一种组合物，包含多种如权利要求1-14中任一项所述的纳米轭合物组合物，其中所述纳米轭合物的粒度分布是单峰的。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述药物-聚合物纳米轭合物的分子量分布是小于1.05。
17.如权利要求15或16所述的组合物，其中所述纳米轭合物在暴露于PBS溶液中时在大于30分钟内保持不聚集。
18.一种将药物-聚合物纳米轭合物的药物递送至细胞表面或内部的方法，所述方法包括使细胞与如权利要求1-14中任一项所述的组合物相接触，使得所述药物-聚合物轭合物与所述细胞缔合一段时间足以使所述药物-聚合物纳米轭合物从所述聚合物释放所述药物，由此将所述药物递送至所述细胞的表面或内部。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述细胞是前列腺癌细胞、乳癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞、或结肠癌细胞。
20.如权利要求1所述的组合物，其中所述药物-聚合物纳米轭合物的所述药物中的一种或多种是：阿霉素、帕米膦酸盐、柔红霉素、表柔比星、米托蒽醌、博来霉素A2、博来霉素B2、长春新碱、长春碱、长春瑞宾、长春地辛、鬼臼毒素、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇、多西他赛、伊立替康、托泊特坎、格尔德霉素、阿昔洛韦、去羟肌苷、达芦那韦（TMC-114）、利巴韦林、那他霉素、氟康唑、泊沙康唑、伏立康唑、卡泊芬净、两性霉素B、苯氧乙醇、替拉那韦（TPV）、沙奎那韦（SQV）、利托那韦（RTV）、茚地那韦、奈非那韦（NFV）、氨普那韦（APV）、洛匹那韦（ABT-378）、阿扎那韦（ATV）、长春瑞宾重酒石酸盐、氟维司群、匍枝珊瑚醇、喜树碱、苔藓抑素1、(+)-cylindricine、(+)-乳胞素、铜绿菌素298-A、(+)-福司曲星、garsubellin A/贯叶金丝桃素、(S)-奥昔布宁、埃坡霉素A、齐多夫定（AZT）、拉米夫定（3TC）、恩曲他滨（FTC）、巴美生、香草二乙胺、六氯酚、水杨苯胺、儿茶酚、麝香草酚、喷他佐辛、间苯三酚、丁香酚、氯硝柳胺、特布他林、多巴胺、甲基多巴、去甲肾上腺素、丁香酚、α-萘酚、肾上腺素、去氧肾上腺素、间羟胺、非诺特罗、硫氯酚、α-生育酚、异丙肾上腺素、沙丁胺醇、非诺特罗、硫氯酚、绿原酸和/或其酯、卡托普利、阿莫西林、倍他洛尔、马索罗酚、木黄酮、黄豆苷元、大豆苷、乙酰黄豆黄甙、雌马酚、黄豆黄素、碘超强辣素、SB202190、酪氨酸磷酸化抑制剂SU1498、或它们的组合。
21.一种防聚集的纳米颗粒组合物，包含多个基于聚合物的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包括白蛋白涂层，其中所述白蛋白的量对于减少或防止所述纳米颗粒的聚集是有效的。
22.如权利要求21所述的组合物，其中所述基于聚合物的纳米颗粒在没有所述白蛋白涂层时的平均直径是小于200nm。
23.如权利要求21或22所述的组合物，其中所述基于聚合物的纳米颗粒在不存在所述白蛋白涂层的情况下与水溶液相接触时进行自我稳定。
24.如权利要求21-23中任一项所述的组合物，其中所述白蛋白涂层的质量与所述纳米颗粒的总质量之比是约2:1至约20:1。
25.如权利要求21-24中任一项所述的组合物，其中包含所述白蛋白涂层的所述纳米颗粒在具有50%湿度的空气的存在下在大于12小时内保持不聚集。
26.一种用于减少或消除纳米颗粒聚集的方法，包括：
使在溶剂体系中的纳米颗粒样品与含有白蛋白的水溶液相接触，其中在所述水溶液中所述白蛋白的量是所述纳米颗粒总质量的至少2.5倍；并且
将所述白蛋白涂覆的纳米颗粒冻干，以提供干的不聚集的纳米颗粒。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述基于聚合物的纳米颗粒在没有所述白蛋白涂层时的平均直径是小于200nm；所述纳米颗粒是在不存在所述白蛋白涂层时在与水溶液接触时进行自我稳定的、基于聚合物的纳米颗粒；所述水溶液中的所述白蛋白的质量与所述纳米颗粒总质量之比是约2:1至约20:1；并且包含所述白蛋白涂层的所述纳米颗粒在具有
50%湿度的空气的存在下在大于12小时内保持不聚集。
28.一种组合物，包含在磷酸盐缓冲盐水中、不聚集的PLA-PEG-PLA嵌段聚合物涂覆的药物-聚合物纳米轭合物，其中所述被涂覆的颗粒的平均直径是约20nm至约200nm，并且所述被涂覆的颗粒的粒度分布是单峰的。
29.一种在磷酸盐缓冲盐水中制备纳米颗粒的方法，包括：
将药物-聚合物纳米轭合物和PLA-PEG-PLA嵌段聚合物溶解于有机溶剂，其中所述药物-聚合物纳米轭合物与所述嵌段共聚物涂层的质量比是约0.75至约1.25；并且使所述药物-聚合物纳米轭合物和所述PLA-PEG-PLA嵌段聚合物在至少20倍体积的磷酸盐缓冲盐水中沉淀，以提供涂覆有PLA-PEG-PLA嵌段聚合物的药物-聚合物纳米轭合物，其中所述被涂覆的颗粒在所述磷酸盐缓冲盐水中在长于30分钟内保持不聚集。
30.一种用于减少或消除纳米颗粒聚集的方法，包括：
使多个纳米颗粒与包含聚(乙二醇)嵌段和聚(丙交酯)嵌段的嵌段共聚物相接触以便提供嵌段共聚物涂覆的颗粒；并且
用白蛋白涂覆所述嵌段共聚物涂覆的颗粒，由此减少或消除所述纳米颗粒的纳米颗粒聚集。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述嵌段共聚物是PLA-PEG-PLA嵌段共聚物。
32.如权利要求31或32所述的方法，其中所述纳米颗粒包括如权利要求1-17中任一项所述的药物-聚合物纳米轭合物组合物。

说明书全文

纳米轭合物以及纳米轭合物配制品

[0001] 相关申请

[0002] 本申请按照35U.S.C.§119(e)要求于2009年12月23日提交的美国临时专利申请号61/289,893的优先权，通过引用以其整体结合在此。

[0003] 政府支持

[0004] 本发明是在政府支持下以国家科学基金给予的授权号DMR-0748834-CAREER下进行的。美国政府对本发明享有某些权利。

[0005] 发明背景

[0006] 聚合物纳米颗粒（NP）是具有吸引力的药物运载体。已经研究了不同形式的NP用于递送化学治疗剂来治疗癌症。在这些聚合物NP中，化学治疗剂要么被包胶囊在聚合物基质中要么通过可水解的或酶可降解的连接物共价地共轭至聚合物上。全身给药的NP理想地能够省略网状内皮系统（RES）的辨别、在易漏的肿瘤脉管系统处外渗、穿透并均匀分布在实体肿瘤组织中、被目标癌细胞吸纳、穿过细胞膜和亚细胞膜、并且接着在目标癌细胞的细胞质中以持续的方式释放它们的药物负载物。迫切需要可以成功地克服所有这些全身的、组织的以及细胞的屏障的NP。除了这些平移（translational）的屏障之外，NP还必须能够在临床使用之前被储存长时间。许多NP在溶液中或以冻干的状态聚集。聚集可能毁坏这些组合物的实用性，这是通过使它们不能完成上述目标中的一个或多个。因此，对于可以制备、储存、并全身给药而不聚集的NP存在一种需要。

[0007] 概述

[0008] 已经开发了克服许多平移屏障从而提供临床上有用的药物配制品的纳米轭合物（NC）。在此说明的本发明提供了一种药物-聚合物轭合物，该轭合物包括一种共价结合至聚合物上的药物。该纳米轭合物可以包括一个嵌段共聚物涂层和/或白蛋白涂层。该药物-聚合物纳米轭合物包括一种或多种药物以及一种或多种聚合物，其中该药物-聚合物纳米轭合物的一种或多种药物位于该药物-聚合物轭合物的一种聚合物的起始点处，这些药物中的一种或多种在引发聚合之前包括至少一个羟基或硫醇部分，并且此药物在该药物的羟基或硫醇部分的位置处共价结合至该聚合物上，由此在该药物与聚合物之间形成一个醚或硫醚连接物。

[0009] 该药物-聚合物纳米轭合物的聚合物可以包括衍生自环状酯、环状碳酸酯、环状磷酸酯、环状硅氧烷、环磷腈或环肽或氨基酸的单体。因此，该药物-聚合物纳米轭合物的聚合物中的一种或多种可以包括聚酯、聚碳酸酯、多磷酸酯、聚硅氧烷、聚磷腈、多肽、或氨基酸低聚物。该嵌段共聚物涂层可以包括PEG和/或丙交酯嵌段，并且该嵌段共聚物涂层可以涂覆有白蛋白。用来涂覆该纳米轭合物的白蛋白的量可以是至少基本上防止该药物-聚合物纳米轭合物聚集成其他药物-聚合物纳米轭合物的一个有效量。在多个实施方案中，该白蛋白完全防止了该药物-聚合物纳米轭合物聚集成其他药物-聚合物纳米轭合物，无论在固态下还是在水性介质中。该纳米轭合物可以包括一种或多种共价结合至该药物-聚合物纳米轭合物的表面上或结合至该嵌段共聚物涂层上的细胞靶向剂。这些细胞靶向剂可以选择性地靶向例如癌细胞。

[0010] 本发明还提供了包括多种在此描述的纳米轭合物的一种组合物，其中该纳米轭合物的组合物具有单峰的纳米轭合物粒度分布。该组合物可以是一种干粉组合物、或一种被配制用于静脉注射的、包括例如药学上可接受的稀释剂或载体的组合物。

[0011] 本发明进一步提供了用于将药物-聚合物纳米轭合物递送至细胞表面或内部的方法。该方法可以包括使细胞与在此说明的药物-聚合物纳米轭合物相接触，使得该药物-聚合物轭合物与该细胞缔合一段足以使该药物-聚合物纳米轭合物从聚合物上释放药物的时间，由此将药物递送至细胞的表面或内部。

[0012] 在其他实施方案中，该药物-聚合物轭合物的药物可以换成多种有用的化学物种，例如化学试剂、诊断试剂、造影剂、报道分子、染料、以及类似物，用于制备特定的递送系统。

[0013] 本发明进一步提供了药物-聚合物纳米轭合物用于制造对于治疗哺乳动物如人的疾病有用的药剂的用途。药物-聚合物纳米轭合物的组合物可以用于例如医学治疗或诊断评估中。医学治疗可以是治疗癌症，例如前列腺癌、乳癌、肺癌、胰腺癌、或结肠癌。

[0014] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含多种基于聚合物的纳米颗粒的防聚集的纳米颗粒组合物。此类纳米颗粒包括一个白蛋白涂层，其中白蛋白的量是对于减少或防止纳米颗粒的聚集有效的。

[0015] 这些基于聚合物的纳米颗粒的平均直径可以是小于约200nm、小于100nm、或小于50nm，没有白蛋白涂层。在这些颗粒已经涂覆了白蛋白之后，其平均粒径典型地是小于约
250nm、小于约200nm、或小于约175nm，例如约50nm至约150nm。这些基于聚合物的纳米颗粒可以是在不存在白蛋白涂层的情况下与水性介质相接触时自我稳定的纳米颗粒。白蛋白涂层的质量与纳米颗粒总质量之比可以是约2:1至约20:1、典型地是约3:1至约10:1。这些涂覆有白蛋白的纳米颗粒可以在环境条件下长期保持不聚集，例如在具有50%湿度的空气的存在下在室温（约23°C）下长于约12小时保持不聚集。

[0016] 在又一个实施方案中，本发明提供了一种减小或消除纳米颗粒聚集的方法，该方法包括使一个纳米颗粒样品在溶剂体系中与一种含白蛋白的水溶液相接触，其中该水溶液中白蛋白的量是纳米颗粒总质量的至少2.5倍。然后可以将这些白蛋白涂覆的纳米颗粒冻干，以提供干的不聚集的纳米颗粒。

[0017] 一个另外的实施方案提供了一种组合物，该组合物包括在磷酸盐缓冲盐水中、被不聚集的PLA-PEG-PLA嵌段共聚物涂覆的药物-聚合物纳米轭合物颗粒。这些被涂覆的颗粒的平均直径可以是约20nm至约200nm，其中这些被涂覆的颗粒的粒度分别是单峰的。

[0018] 在一个实施方案中，本发明提供了一种制备磷酸盐缓冲盐水中的纳米颗粒的方法，该方法包括使一种药物-聚合物纳米轭合物与一种PLA-PEG-PLA嵌段聚合物在一种有机溶剂中接触，其中该药物-聚合物纳米轭合物与嵌段聚合物的质量比是约0.75至约1.25。该药物-聚合物纳米轭合物和PLA-PEG-PLA嵌段聚合物可以在一种缓冲剂（例如，至少约20倍体积的磷酸盐缓冲盐水）中沉淀，以提供涂覆有PLA-PEG-PLA嵌段聚合物的药物-聚合物纳米轭合物，其中这些被涂覆的颗粒在该磷酸盐缓冲盐水中在长于30分钟内保持不聚集。

[0019] 在一个进一步的实施方案中，本发明提供了一种减少或消除纳米颗粒聚集的方法，该方法包括使多个纳米颗粒与一种包括聚(乙二醇)和聚(丙交酯)嵌段的嵌段共聚物相接触以便提供嵌段共聚物涂覆的颗粒。这些嵌段共聚物涂覆的颗粒还可以涂覆有白蛋白，由此减少或消除纳米颗粒的纳米颗粒聚集。该嵌段共聚物可以是一种PLA-PEG-PLA嵌段共聚物，并且这些纳米颗粒可以是在此说明的药物-聚合物纳米轭合物组合物。

[0020] 附图简要说明

[0021] 以下附图形成了说明书的一部分并且是被包括来进一步展示本发明的某些实施方案或不同的方面。在一些情况下，通过参考附图结合在此提出的详细说明可以最好地理解本发明的实施方案。本说明和附图可以着重于某个特定的实例或本发明的某个方面，但本领域技术人员将理解的是，该实例或方面的多个部分可以与本发明的其他实例或方面结合使用。根据不同的实施方案：

[0022] 图1(a)通过Ptxl/(BDI)ZnN(TMS)2络合物介导的位置选择性引发和受控的丙交酯（LA）聚合以便提供Ptxl-PLA轭合物。(b)Ptxl-PLANC的配制，是通过i)Ptxl-PLA的纳米沉淀；ii)Ptxl-PLA的纳米沉淀然后用PLA-PEG进行涂覆；iii)Ptxl-PLA和PLA-PEG的共沉淀；以及iv)Ptxl-PLA和PLA-PEG-PLA的共沉淀。NPP=纳米沉淀；CPP=共沉淀。

[0023] 图2(a)游离Ptxl和(b)Ptxl/(BDI)ZnN(TMS)2-介导的LA聚合溶液（LA/Ptxl之比为100）的HPLC光谱。将一个等分部分（30-50μL）的聚合溶液注入一个配备有分析RP-HPLC柱（Curosil-PFP、4.6×250mm、5μ、菲罗门公司（Phenomenex），加利福利亚，托伦斯）的HPLC中。流动相是具有0.1%TFA的乙腈/水（50/50(v/v)）；流速设定在1.0mL/min。

[0024] 图3Ptxl-LA200、Ptxl-LA100和Ptxl-LA50的GPC分析。

[0025] 图4Ptxl-LA100NC在水中（0.025mg/mL）的动态光散射（DLS）分析。

[0026] 图5使用丙酮（●）或DMF（■）作为纳米沉淀的溶剂时txl-LA100NC尺寸对比Ptxl-LA100的浓度。有机溶剂与水的体积比固定在1/40。虚线表示NC尺寸与Ptxl-LA100的2
浓度的线性相关。R 是对应体系的线性相关常数。

[0027] 图6(a)在用mPEG5k（E5）或用PLA-mPEG5k（LE5）涂覆之后Ptxl-LA100NC在PBS（1×）中的稳定性。(b)Ptxl-LA100/LE5NC和未处理的Ptxl-LA100NC的DLS光谱。在PBS溶液中存在颗粒之后4分钟时测定粒度。

[0028] 图7(a)在不同Ptxl-LA100浓度（DMF（或丙酮）/水=1/40(v/v)）下Ptxl-LA100/LE5（wt/wt=1/1）从DMF或丙酮溶液中到水中的共沉淀（CPP）。(b)通过DLS测得的Ptxl-LA100/LE5NC尺寸分布。条件：将DMF中的Ptxl-LA10（0 50μL，12mg/mL）与LE5的DMF溶液（50μL，12mg/mL）进行混合。将混合物滴加到剧烈搅拌的水溶液（4mL）中。通过DLS来分析所得的Ptxl-LA100/LE5NC。

[0029] 图8NC在PBS溶液中的稳定性。使DMF中Ptxl-LA100和LE5的混合物（w/w=1/1，Ptxl-LA100=4mg/mL）在1×PBS中共沉淀（DMF/PBS=1/40(v/v)）。使DMF中Ptxl-LA100和LE5L的混合物（w/w=1/1，Ptxl-LA100=4mg/mL）在1×PBS中共沉淀（DMF/PBS=1/40(v/v)）。使丙酮中Ptxl-LA100和LE5L的混合物（w/w=1/1，Ptxl-LA100=2mg/mL，100μL）在水（4mL）中共沉淀。获得的NC具有88.9nm的直径、以及0.092的多分散性。将所得的NC溶液与BSA的水溶液（500μL，12mg/mL）混合并且将混合物在-50°C冻干16小时。将所得粉末用2mL水进行复水然后添加浓缩的PBS溶液（222μL、10×）。在室温下将该混合物搅拌5分钟并通过DLS进行分析。

[0030] 图9当Ptxl-LA100/LE5L混合物在水中或在PBS中共沉淀时，Ptxl-LA100/LE5L NC尺寸与DMF中的Ptxl-LA100浓度的线性相关。

[0031] 图10(a)由Ptxl-LA100/LE5L的丙酮溶液（w/w=1/1、Ptxl-LA100=2mg/ml、100μL）在水（4mL、丙酮/水=1/40(v/v)）中的共沉淀获得的NC的DLS光谱。获得的NC具有88.9nm的直径、以及0.092的多分散性。(b)然后将所得的NC溶液与BSA的水溶液（500μL，12mg/mL）混合并且将混合物在-50°C冻干16小时。将所得粉末用2mL水进行复水然后添加浓缩的PBS溶液（222μL、10×）。在室温下将该混合物搅拌5分钟并通过DLS进行分析。获得的NC具有105.9nm的直径、以及0.112的多分散性。

[0032] 图11冻干之前和之后适体-Cy5NC的荧光活化细胞分选（FACS分析）；6小时内的LNCaP细胞摄取研究。

[0033] 图12冻干之后适体-Cy5NC以及冻干之后Cy5NC的荧光活化细胞分选（FACS分析）；6小时内的LNCaP细胞摄取研究。

[0034] 图13PLA-Ptxl NC的肿瘤预防/抑制研究。

[0035] 图14PLA-Doxo NC（带有帕米膦酸盐配体）的体内毒性分析；alb/c小鼠组织切片的组织学分析。

[0036] 图15带有PAM的PLA-PEGNC的体内靶向。

[0037] 图16适体-NC的体内靶向。

[0038] 详细说明

[0039] 定义

[0040] 如在此使用的，某些术语在有以下含义。本说明书中使用的所有其他术语和短语具有本领域技术人员会理解的通常含义。此类通常含义可以通过参考技术词典获得，例如Hawley的化学物质精装词典（Hawley’s Condensed Chemical Dictionary）第14版，R.J.Lewis，约翰威立国际出版公司（John Wiley & Sons），纽约2001。

[0041] 本说明书中提及“一个实施方案”、“实施方案”等是指，所说明的实施方案可以包括一个特定的方面、特征、结构、部分或特性，但不是每个实施方案都必须包括这个方面、特征、结构、部分或特性。此外，这样的短语可以但不一定是指在本说明的其他部分中所提及的相同实施方案。此外，当结合一个实施方案来描述一个特定的方面、特征、结构、部分或特性时，本领域技术人员有能力结合无论是否明确说明的其他实施方案来影响或结合此类特定的方面、特征、结构、部分或特性。

[0042] 术语“包括”与“包含”、“含有”或“其特征为”同义，并且是包含性的或开放式的，并且不排除另外的、未叙述的要素或方法步骤。术语“由…组成”排除了在权利要求要素中未指明的任何要素、步骤、或成分。术语“实质上由…组成”不排除没有重大影响该权利要求的基本的以及新颖的特性的材料或步骤。在此处的每种情况下，术语“包括”、“实质上由…组成”或“由…组成”中任何一个都可以用其他两个术语中任一个替代。在此适当地阐述性说明的本发明可以在不存在此处未确切披露的的任何一个或多个要素、一个或多个限制条件的情况下进行实施。

[0043] 术语“和/或”是指这些项目中的任何一个、这些项目的任何组合、或该术语关联的所有项目。短语“一个或多个”是本领域技术人员容易理解的，特别是在其使用背景下阅读时。

[0044] 单数形式“一个/一种（a/an）”和“该”包括复数指示物，除非上下文清楚地另外指明。因此，例如提及“一种纳米轭合物”包括多个这样的纳米轭合物。进一步指出，这些权利要求可以被起草为排除任何任选的要素。这样，这种叙述可以作为引用基础用于诸如“仅仅”、“只是”等等的排他性术语与权利要求要素的引述结合使用、或使用“否定”限制。

[0045] 术语“约”可以指代所指明的值的±5%、±10%、±20%、或±25%变化。例如，在一些实施方案中“约50”百分比可以表示从45%至55%的变化。对于整数范围，术语“约”可以包括大于和/或小于所列举的整数的一个或或两个整数。除非在此另外指明，否则术语“约”旨在包括就单独成分、组合物或实施方案的功能而言相同的、与所列举的范围近似的值，例如重量百分比。

[0046] 如技术人员将理解的，所有数字，包括表示为成分的量、特性如分子量、反应条件等等的那些，是近似值并且应理解为在所有情况下由术语“约”来修饰。这些值可以取决于本领域技术人员利用在此的说明的当前传授内容而寻求获得的所希望的特性而变化。还应理解的是，此类值内在地包含由于其对应的测试测量中发现的标准偏差而必然产生的变化。

[0047] 如本领域技术人员将理解的，出于任何以及所有目的，特别是在提供书面说明的意义上，在此披露的所有范围还涵盖了任何和所有可能的子范围以及子范围的组合、以及构成该范围的单独值，特别是整数值。所列举的一个范围（例如重量百分比）包括该范围内的任何特定的值、整数、小数、或类似物。任何列出的范围可以容易地被认为充分描述了相同的范围并使相同的范围能够被拆分成至少相等的两等分、三等分、四等分、五等分、十等分等等。作为一个非限制性实例，在此讨论的每个范围可以容易地拆分成下部的三分之一、中间的三分之一、和上部的三分之一等等。本领域技术人员也将理解的是，诸如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”、“多于”、“或更多”等等的所有语言包括所列举的数字并且指代如以上讨论的随后可以拆分成子范围的范围。以相同的方式，在此披露的所有比率还包括落在这个较宽比率内的所有子比率。因此，在此对于基团、取代基和范围所列出的特定值仅是为了阐述；它们不排除其他限定值或在对于基团和取代基所限定的范围内的其他值。

[0048] 本领域技术人员还容易认识到，当多个成员以常见方式被组合在一起，例如成为马库西群组，则本发明不仅涵盖了以整体列出的整体群组，而且还涵盖了该群组的每个单独成员以及主群组的所有可能的子群组。另外，出于所有目的，本发明不仅涵盖了主群组，而且还涵盖了缺少一个或多个群组成员的主群组。本发明还设想了明显地排除一个列举的群组中的任何一个或多个成员。

[0049] 术语“烷基”是指一个支链或无支链（直链或线性）饱和烃的单价基团或是指具有一个或多个环的环烷基。除非另外指出，典型的烷基具有1至20个碳原子，例如约1-10个碳原子。短烷基是具有1至6个碳原子的那些，包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基，包括其所有异构体。长烷基是具有约8至约20个碳原子、例如约12至约20个碳原子的那些，以及具有12-20个的那些和具有16-18个碳原子的那些。术语“环烷基”是指具有3至20个碳原子、具有单一环状环或多个稠环的环状烷基。举例而言，环烷基包括单环结构，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环辛基等等，或多环结构，例如金刚烷基等等。除非另外指出，包括环烷基在内的烷基任选地如以下定义的被取代。

[0050] 术语“链烯基”是指具有一个或多个双键的支链或无支链的不饱和烃基的单价基团或者是指具有一个或多个环的环烯基，其中至少一个环包含一个双键。除非另外指出，烷基具有1至20个碳原子，例如约1至约10个碳原子。链烯基可以包含一个或多个双键（C=C），它们可以是共轭的或非共轭的。链烯基可以包括具有1或2个双键的那些，包括ω-链烯基。短链烯基可以是具有2至6个碳原子的那些，包括乙烯（乙烯基）、丙烯、丁烯、戊烯、和己烯的基团，包括其所有异构体。长链烯基包括具有8-20个碳原子的那些，例如具有12-20个碳原子的那些，以及具有12-20个碳原子的那些或具有16-18个碳原子的那些。术语“环烯基”是指具有3至20个碳原子、具有单一环状环或多个稠环的环状链烯基，其中至少一个环包含一个双键（C=C）。举例而言，环烯基包括单环结构（单环状），例如环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环辛烯基、环辛二烯基以及环辛三烯基，以及多环结构。除非另外指出，包括环烷基在内的烷基任选地如以下定义的被取代。

[0051] 术语“炔基”是指具有一个或多个三键的不饱和烃的单基（C=C）。除非另外指出，烷基具有1至20个碳原子，例如包含1-10个碳原子的那些。炔基包括乙炔基、炔丙基等等。短炔基是具有2至6个碳原子的那些，包括其所有异构体。长炔基包括具有8-20个碳原子的那些，例如具有12-20个碳原子的那些，以及具有12-16个碳原子的那些或具有16-18个碳原子的那些。术语“环炔基”是指具有3至20个碳原子、具有单一环状环或多个稠环的环状炔基，其中至少一个环包含一个双键（C=C）。除非另外指出，包括环烷基在内的烷基任选地如以下定义的被取代。

[0052] 术语“芳基”是指包含至少一个芳环的单价基团。该基团在形式上是通过从一个环碳上去除一个H获得的。芳基包含一个或多个环，其中至少一个是芳香族的。芳基的环可以通过单键或连接基团而连接或可以是稠合的。示例性的芳基包括苯基、联苯基和萘基。芳基包括具有6至20个碳原子的那些以及包含6-12个碳原子的那些。除非另外指出，芳基是如在此说明的被任选取代的。术语芳基包括“芳烷基”，芳烷基是指包含至少一个烷基以及至少一个芳基的基团，该芳基可以在烷基上被取代（例如苄基-CH2-C6H5），或者该烷基可以在芳基上被取代（例如甲苯基-C6-H4-CH3）。除非另外指出，芳烷基的烷基或芳基部分可以如在此说明的被取代。

[0053] 当在此披露一个取代基群组时，应理解的是，单独地披露了这个群组以及所有子群组的所有单独成员，包括这些群组成员的任何同分异构体、对映异构体、以及非对映异构体。当在此使用马库西群组或其他群组时，该群组的所有单独成员以及该群组的可能的组合和子组合都旨在被单独地包括在本披露中。在此已经说明了多个特定群组的变量定义。期望的是，这些特定群组的变量定义的所有组合和子组合被单独地包括在本披露中。当在此将一种化合物或组合物描述成未指明该混合物的具体同分异构体、对映异构体、或非对映异构体，例如以化学式或化学名称的形式，则这种描述旨在包括单独或以任何组合形式的该混合物的同分异构体和对映异构体。

[0054] 另外，除非另外指出，在此披露的化合物的所有同位素变体旨在被本披露所涵盖。例如，将会理解的是在此披露的分子中的任何一个或多个氢可以用氘或氚代替。分子的同位素变体普遍地在用于分子的分析和关于分子及其用途的化学和生物研究中作为标准物是有用的。同位素变体，包括带有放射性同位素的那些，还可能在诊断分析和治疗中是有用的。用于制造此类同位素变体的方法是本领域已知的。化合物的具体名称旨在是示例性的，因为已知本领域技术人员可以对相同的化合物不同地命名。

[0055] 在此披露的许多分子包含一个或多个可电离基团[可以从中去除质子（例如-COOH)）或添加质子的基团（例如，胺）或者可以被季铵化的基团（例如胺）]。此类分子的所有可能的离子形式及其盐旨在被单独包括在此处的披露内容中。关于在此这些化合物的盐，本领域普通技术人员可以从多种多样的不同抗衡离子中选择适合制备给定应用的盐的那些。在特定应用中，选择一种用于制备盐的给定阴离子或阳离子可以导致该盐的溶解性增大或减小。

[0056] 本发明提供了聚合物或低聚物的不同轭合物。该聚合物典型地是一种含有多个彼此结合的重复单元的化学物种。聚合物可以包含多于一种的不同重复单元。该重复单元是衍生自一种单体的聚合作用。共聚物确切地是指包含两种或更多种在结构上不同的重复单元的聚合物。聚合物的不同的重复单元可以在该聚合物链中是无序的或者相同的重复单元可以在聚合物中分组为相邻嵌段。当在一种聚合物中存在两种或更多重复单元的相邻嵌段时，该聚合物是嵌段共聚物。如在此使用的，术语聚合物是指包含多于约10个重复单元的化学物种。术语低聚物用来指代具有二至约十个重复单元的化学物种。

[0057] 术语“颗粒”是指具有的尺寸对于通过某种给药方法进行体内递送是有用的、具有任何给定形状的颗粒。这些颗粒可以是微粒、聚集体、球体、或不规则的形状。术语“粒度”在此是与它在本领域中普遍使用的一样进行使用并且是通过本领域技术人员熟知的方法确定的。对于尺寸列举的值是颗粒的平均直径、或不规则形状的颗粒的平均宽度。

[0058] 聚合物的“多分散性”是指一个给定样品中聚合物的分子量的分布。多分散性指数（PDI）是对多分散性的具体衡量，并且是重均分子量除以数均分子量。PDI涉及给定的聚合物样品中单独分子量的分布。PDI可以使用凝胶渗透色谱法（GPC）进行确定。当给定样品中的聚合物链接近均匀的链长度时，PDI接近1。

[0059] 术语“接触”是指触碰、使接触、或带到紧密或密切的附近的一个动作，包括在细胞或分子水平上，例如引起生理反应、化学反应、或物理变化，例如在溶液中、在反应混合物中、体外或体内。

[0060] 术语药物包括药物的“药学上可接受的盐”以及药物前体。在此所用的术语“药物前体”是指在体内通过代谢方式（例如水解）可转化为药物的一种化合物。

[0061] “有效量”是指对于治疗疾病、紊乱、和/或病症、或对引起所列出的效果有效的量。例如，有效量可以是对于减轻所处理的病症或症状的发展或严重程度有效的量。治疗有效量的确定在本领域技术人员的能力之内。术语“有效量”旨在包括一个量的在此说明的一种化合物或组合物、或一个量的在此说明的要素组合，例如对于治疗或预防疾病或紊乱、或对于治疗主体中的疾病或紊乱症状有效的量。因此，“有效量”总体上是指提供所希望的效果的量。

[0062] 因此，术语“治疗有效量”是指一种给定药物在以颗粒形式给予个体时对于至少局部治疗个体所患的紊乱、疾病或病症、或对于至少局部地改善此类紊乱、疾病或病症的症状有效的一个量。如本领域所理解的，一种化合物的治疗有效量将至少部分地取决于给药形式、所采用的任何载体或运载体（例如溶液、乳液等等）、具体的紊乱或病症、以及将该化合物给予它的具体个体（年龄、体重、病症、性别等等）。实现“治疗有效量”所需要的剂量要求随着所采用的具体组合物、给药途径、呈现的病症严重程度以及所治疗的具体受体而变化。基于在标准药理学测试程序中获得的结果，活性化合物的预期的每日剂量可以通过本领域熟练理解的技术来确定。

[0063] 术语“所治疗（treating）”、“要治疗（treat）”和“治疗（treatment）”包括(i)防止疾病、病理学或医学病症出现（例如，预防）；(ii)抑制该疾病、病理学或医学病症或阻止其发展；(iii)缓解该疾病、病理学或医学病症；和/或(iv)逐渐减小与该疾病、病理学或医学病症相关的症状。因此，术语“要治疗”、“治疗”和“所治疗”扩展至预防并且包括要防止、防止、防止了、降低、停止、或扭转所治疗的病症或症状的发展或严重程度。这样，术语“治疗”在适当时包括医学的、治疗的、和/或预防性的给药。

[0064] 术语“要抑制（inhibit）”、“抑制了（inhibiting）”以及“抑制（inhibition）”是指减慢、阻挡、或扭转疾病、感染、病症、或细胞群的生长或发展。与在不存在治疗或接触的情况下出现的生长或发展相比，抑制可以是例如大于约20%、40%、60%、80%、90%、95%、或99%。例如，在此说明的组合物可以用来抑制肿瘤或细胞群的生长。

[0065] 如在此使用的，短语“白蛋白涂层”和“白蛋白的涂层”是指在足以至少基本上防止纳米颗粒与其他类似颗粒聚集的程度上使白蛋白与纳米颗粒相关联时的一组条件。在一些实施方案中，足够的白蛋白分子可以例如通过静电相互作用或类似方式与纳米颗粒接触，而形成围绕该纳米颗粒的保护屏障。在其他实施方案中，在一个纳米颗粒附近存在足够的白蛋白以便对该纳米颗粒和相邻的纳米颗粒提供冻干保护剂（lyoprotectant）特性，例如当纳米颗粒与白蛋白共同配制时，例如白蛋白的量值是对于显著减少或防止聚集有效的。冻干保护剂特性是指白蛋白基本上减少或消除与有效量的白蛋白共同配制的纳米颗粒的聚集的特性，例如当白蛋白在冻干该配制品之前与纳米颗粒共同配制时。

[0066] 短语“对于至少基本上防止聚集”有效的是指减少聚集的特性到了使得未聚集的组合物对于预期用途可能有用的程度。该短语可以包括聚集的完全缺失，例如通过目镜检查、或通过冻干后的粒度与与冻干的颗粒之比（小于三）来确定。

[0067] 术语“单峰的”是指一种粒度分布，其中一个颗粒集合（例如，纳米轭合物、粉末、粒料、珠粒、晶体等等）在粒度分布曲线上具有单一的清晰可辨的最大值（例如，其中重量百分比或强度是在纵坐标或Y轴上，并且粒度是在横坐标或X轴上）。双峰粒度分布是指在粒度分别曲线上具有两个清晰可辨的最大值的颗粒集合，并且多峰粒度分布是指在粒度分别曲线上具有三个或更多清晰可辨的最大值的颗粒集合。粒度分布可以表示一个无聚集体的颗粒集合的粒度分布。一个颗粒群组的多分散性可以使用DLS分析来确定。当给定样品中的颗粒接近均匀的直径时，多分散性接近0。

[0068] 药物-聚合物轭合物

[0069] 本发明至少部分地是基于以下发现：与药物和/或其他可以作为开环聚合的引发剂起作用的化学物种轭合的聚合物和低聚物可以在单步骤的聚合合成中容易地制备。在该合成中，该化学物种引发剂可以与一种或多种环状单体以及任选地一种开环聚合催化剂进行组合。在一个实施方案中，可以使用轭合至PLA上的紫杉醇来制备纳米轭合物制剂。如此形成的聚合物和低聚物轭合物对于制备颗粒是有用的，包括微颗粒和纳米颗粒，这些颗粒具有的粒度对于在体内或体外递送化学物种是有用的。在一些实施方案中，可以使用纳米沉淀方法来形成包含有在此说明的轭合物的纳米颗粒（纳米轭合物）。纳米颗粒纳米轭合物可以用PEG或活化的PEG衍生物进行处理以便将纳米颗粒的表面聚乙二醇化。在其他实施方案中，可以用一种含PEG的嵌段共聚物处理纳米轭合物以便通过该嵌段共聚物与纳米轭合物表面的静电相互作用而涂覆纳米轭合物。

[0070] 在此说明的聚合物和低聚物轭合物可以与通过一种化学物种、特别是药物与一种预形成的聚合物的轭合作用所形成的轭合物区分开。在此说明的轭合物可以展现出远低于所预形成聚合物的聚合物平均分子量。在此说明的轭合物还可以展现出远低于所预形成聚合物的多分散性。例如，在此说明的聚合物轭合物可以展现出1.5或更小、1.3或更小、和/或1.2或更小的多分散性。总体上，通过在此说明的方法形成的轭合物在聚合物长度上比通过化学物种与预形成聚合物的轭合作用形成的那些更均匀。

[0071] 由在此说明的聚合物或低聚物轭合物的纳米沉淀形成的纳米轭合物（NC）与纳米胶囊（NE）就药物负载、药物包胶囊、药物释放、颗粒分布、以及便于制造而言是可区分的。NE典型地展现出低到中的药物负载（1-5wt.%），这是不可能预先确定的并且可以从一批到另一批发生变化。NC展现出了具有高得多的批次到批次一致性的预定药物负载水平。NE展示出了不可控制的包胶囊效率（范围是10%-80%），这是从批次到批次、并且从系统到系统改变的并且典型地不可用于将亲水药物包胶囊。NC展现出了约100%的包胶囊效率，具有极小的或者没有批次到批次以及系统到系统的变化，并且它们可以用亲水性以及疏水性药物二者形成。

[0072] NE典型地展现出显著的突然释放，在前24小时释放了40%-80%。NC展现出极小或没有药物的突然释放并且提供了可调节的并且可控制的药物释放。NE通常展现出多峰的颗粒分布。NC展现出单峰的颗粒分布。NE的制造涉及多组分的多步骤方法，该方法难以扩大并且对于长期储存可能是有害的。此外，难以从NE中去除未包胶囊的药物，并且去除要求使用困难的过滤方法进行灭菌。相比之下，NC的制造涉及单组分的系统，该系统可直接扩大，并且当适当储存时，药物释放是最小的或不存在，从而增大了储存寿命。由于基本上没有要去除的游离药物或药物聚集体，该方法的实施是更有效且更便宜的。

[0073] 在聚合过程中，对于聚合引发起作用的一种化学物种（例如，包括羟基部分或硫醇部分的药物）变成共价结合至一个或多个生长的低聚物或聚合物链上。该聚合反应可以是一种开环聚合反应，具有的特征是活性聚合。各种引发剂可以是具有一个或多个羟基基团或硫醇基团的药物或其他化学物种，可以在存在催化剂的情况下起作用来引发聚合。该开环聚合可以采用不同的环状单体，包括环状酯、环状碳酸酯、以及环状硅氧烷和环状的含磷单体。

[0074] 该聚合反应可以通过丙交酯和/或乙交酯与一种是药物并且具有一个或多个羟基或硫醇基团的化学物种的聚合反应来举例说明。已经开发了大量醇-金属氧化物（RO-M）用于丙交酯与其他相关环状单体的受控的活性聚合、通过RO的定量的、末端的轭合而通过一个酯键成为聚丙交酯。所得的聚丙交酯中RO的量可以通过调节丙交酯/ROH之比（例如单体与引发剂的摩尔比）而精确地控制。该ROH可以是含有一个或多个羟基的药物或其他化学物种，这些羟基将轭合至在开环聚合后形成的聚合物上。多种有机催化剂，例如TBD（1,5,7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯）可以与含羟基或硫醇的引发剂（例如待轭合的药物或其他物种）一起使用以便形成在此说明的轭合物。在所得聚合物（或低聚物）中该药物或其他物种的量可以通过控制单体-引发剂之比来进行控制。可以采用在存在感兴趣的药物时有效地起作用的任何适当的催化剂。

[0075] 已证明可以使用在此说明的聚合方法（例如，使用紫杉醇（Ptxl）和一种来活化Ptxl的Mg(II)络合物((BDI)MgN(TMS)2）将含羟基的化学治疗剂定量掺入聚丙交酯中。还可以使用Zn(II)络合物。从该颗粒中的药物释放速率可以通过药物-聚丙交酯酯键的断裂而进行调制，这比包胶囊的未共价结合的药物从颗粒中的扩散是远远更可控的。药物的释放动力学可以通过调节药物负载和颗粒尺寸来控制。由于可以控制聚合反应以给出定量的产率，则药物负载进而可以简单地通过调节单体/药物（或其他物种）的摩尔比（单体与引发剂之比）来精确控制。这些方法通过控制药物-聚合物组合物而精确控制药物负载的能力显著增强了纳米颗粒产物的临床转译以及监管批准纳米颗粒用于临床用途的可能性。另外，用在此说明的纳米颗粒已经证明了空前的高药物负载（高达约40%）。

[0076] 纳米颗粒的配制和使用

[0077] 通过不同的方法由在此说明的聚合物和/或低聚物轭合物可以形成不同种类的纳米颗粒（NP）。在一个特定实施方案中，在将该轭合物的溶液加入该轭合物在其中不可溶的一个溶液中时，可以采用纳米沉淀（NPP）。采用轭合物来形成纳米颗粒的沉淀步骤与使用其他材料相比得到了简化，因为仅涉及一种类型的材料，该轭合物。游离药物在聚合物中、甚至是二元系统中的沉淀和包胶囊相比之下是非常复杂的。在相分离过程中对药物和聚合物的整合控制通常很差，尤其是在这两种要素具有不同的化学和物理特性时。在纳米胶囊中始终观察到高双相性颗粒分布，这部分地是由于药物或聚合物根据相似相溶原理的自我聚集。在此说明的方法可以提供具有单峰颗粒分布的颗粒。

[0078] 以上对药物-聚合物或药物-低聚物轭合物所说明的益处在形成与任何可以作为聚合引发剂起作用并且希望在体内以微粒形式递送的化学物种的轭合物的过程中也可以观察到。此外，以上对于纳米颗粒递送组合物的制备所说明的具体益处在该聚合物或低聚物轭合物被用来制造对于体内递送有用的任何尺寸的颗粒时也可以观察到。

[0079] 这些纳米沉淀技术可以包括将药物-聚合物轭合物溶解在一种水混溶性溶剂（例如THF或DMF）中并且加入过量的水中。有机溶剂向水中的扩散有助于形成例如小于100nm尺寸的纳米聚集体。本领域已知的用于由聚合物或低聚物材料来制备纳米颗粒的许多方法中的任何一种都可以用于在此说明的轭合物。

[0080] 在一个方面，本发明涉及一种纳米轭合技术，该技术整合了药物引致的环状酯（或碳酸酯）聚合以及纳米沉淀来制备具有预定药物荷载、接近100%的包胶囊效率、最小化的颗粒不均匀性、以及显著减小的突然释放作用的含药物的纳米颗粒。在用于癌症化疗的应用中、特别是使用在此类治疗中有用的纳米颗粒时，微粒配制品可以展现出改进的功效和减小的毒性。

[0081] 在一个实施方案中，本发明涉及用于癌症治疗的聚合物纳米颗粒。在这个方面，该药物-聚合物或药物-低聚物轭合物可以包括一种抗癌剂或化学治疗剂。对于癌症治疗有用的纳米颗粒可以包含带有两种或更多种不同抗癌剂的轭合物混合物。微粒配制品（例如含有在此说明的NP和NC的那些）可以通过任何已知的适合颗粒尺寸、以及适合为了的治疗、诊断或其他试剂的方法来给予受试者。

[0082] 药物-聚合物轭合物可以在制备用于该药物的体内递送的药剂过程中使用。该药物可以是例如一种抗癌剂。更特别地，这些纳米轭合物可以在用于治疗癌症的药剂的制造过程中使用。在特别的实施方案中，所制造的药剂是处于颗粒的形式，例如纳米颗粒，用于以任何适当的剂量形式给药。在特别的实施方案中，该药剂进一步包括一种药学上可接受的载体或稀释剂，例如一种适合于静脉给药的载体或稀释剂。

[0083] 术语药物在此广义地用来包括任何可以对需要治疗效果的个体提供此效果的化学物种。轭合物可以用适当的药物或其他用于通过纳米颗粒递送的化学物种来形成。至少一种药物或其他化学物种必须具有至少一种可以在催化剂存在下起作用而引发开环聚合的官能团。该官能团应该能够与该催化剂相互作用而形成对于聚合而言活性的物种。例如羟基和硫醇基团是适合的开环聚合引发剂。羟基和硫醇基团可以是伯、仲、或叔官能团。如本领域所理解的，伯、仲和叔羟基以及硫醇基团具有不同的立体环境并且可以展现出不同的相对反应性。

[0084] 在此处对化学基团的说明中，所用的术语旨在具有它们最宽的、本领域认可的含义。具有至少一种对于引发开环聚合有作用的官能团的化学物种可以与两种或更多种可以通过开环聚合进行聚合的环状单体以及一种适当的开环聚合催化剂在一种适当的溶剂中、在多种条件下进行组合，并且持续足以形成所希望的低聚物或共聚物的时间。一种给定的化学物种对聚合引发起作用的能力可以在采用此处说明的或本领域熟知的材料和方法所进行的测试聚合反应中容易地进行评估而无需过度的实验。这些方法在下面的实例中进行进一步说明。

[0085] 在药物-轭合物以及纳米轭合物颗粒的制备中有用的、含羟基的药物包括：阿霉素、帕米膦酸盐、柔红霉素、表柔比星、米托蒽醌、博来霉素A2、博来霉素B2、长春新碱、长春碱、长春瑞宾、长春地辛、鬼臼毒素、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇、多西他赛、伊立替康、托泊特坎、格尔德霉素、阿昔洛韦、去羟肌苷、达芦那韦（darunavir）（TMC-114）、利巴韦林、那他霉素、大扶康、泊沙康唑、伏立康唑、卡泊芬净、两性霉素B、以及苯氧乙醇。可以在此处说明的纳米轭合物中使用并且具有羟基的另外的药物尤其包括：替拉那韦（TPV）、沙奎那韦（SQV）、利托那韦（RTV）、茚地那韦、奈非那韦（NFV）、氨普那韦（APV）、洛匹那韦（ABT-378）、阿扎那韦（ATV）、长春瑞宾酒石酸氢盐、氟维司群、匍枝珊瑚醇（sarcodictyin）、喜树碱、苔藓抑素1、(+)-cylindricine、(+)-乳胞素、铜绿菌素298-A、(+)-福司曲星、garsubellin A/贯叶金丝桃素、(S)-奥昔布宁、埃坡霉素A、齐多夫定（AZT）、拉米夫定（3TC）、阿巴卡韦（ABC）、以及恩曲他滨（FTC）。另外的有用药物包括具有酚羟基的那些，尤其包括：巴美生、香草二乙胺、六氯酚、水杨苯胺、儿茶酚、麝香草酚、喷他佐辛、间苯三酚、丁香酚、氯硝柳胺、特布他林、多巴胺、甲基多巴、去甲肾上腺素、丁香酚、α-萘酚、多元苯酚、肾上腺素、去氧肾上腺素、间羟胺、非诺特罗、硫氯酚、α-生育酚、异丙肾上腺素、沙丁胺醇、非诺特罗、硫氯酚、绿原酸和/或其酯、卡托普利、阿莫西林、倍他洛尔、马索罗酚、木黄酮、黄豆苷元、大豆苷、乙酰黄豆黄甙、雌马酚、黄豆黄素、碘超强辣素、SB202190、以及酪氨酸磷酸化抑制剂SU1498。

[0086] 聚合物的形成

[0087] 对于有待轭合至聚合物上的一种给定的化学物种，可能必须采用不同催化剂来进行试验性聚合。一些化学物种与有机金属催化剂更相容，而其他可能与有机催化剂更相容。例如，这些化学物种即使包含适当的官能团，仍可能不起作用（或可能具有有限的作用）来用某些金属基催化剂引发聚合，因为这些化学物种可能使这些催化剂失活。确切地，PLA与米托蒽醌用(BDI)MgN(TMS)2进行轭合不能进行，潜在地是因为米托蒽醌使该Mg催化剂失活。

[0088] 在此说明的环状单体的任何一种，包括AB2型环状单体，可以用来与此类可以对聚合引发起作用的化学物种形成聚合物或低聚物轭合物。可以通过开环聚合而聚合的任何环状单体或其混合物可以用来形成药物-轭合物和颗粒，特别是纳米颗粒。特别地，可以通过活化的-OH或金属氧化物基团而聚合的环状单体可以用来形成该药物-轭合物和颗粒。有用的环状单体可以包括环酯和环状碳酸酯。环酯包括内酯、环状二酯、以及环状酯-酰胺，例如环状缩肽。

[0089] 环酯可以包括具有化学式A的化合物：

[0090]

[0091] 其中m+n是1-20；X是O或NH，x是0或1用于表明该酯或酰胺基团的存在，并且Y1和Y2表示该环的一个或多个碳原子被非氢取代基的任选取代。每个Y1和Y2彼此独立地可以是不干扰如在此说明的聚合反应的取代基并且可以是例如氢、卤素、-COOR、-NRR′、-SR、-OR，其中每个R和R'彼此独立地是氢、烷基（例如(C1-C10)烷基）、胍基、咪唑基团、链烯基（例如(C1-C10)链烯基）、炔基（例如(C1-C10)炔基）、芳基（如苯基和萘基）、(芳基)烷基（例如苄基或苯乙基）、或-N3。每个Y1或Y2也可以是氨基酸或具有1-5个氨基酸的短肽。每个Y1或Y2也可以包括以上列出的、被本领域认可的保护基保护的基团。
烷基、链烯基、炔基和芳基任选地被一个或多个卤素（例如-F、-Cl、-Br、和或-I）、-N3、-COOR"、-NR"R"'、-SR"、-OR"取代，其中R"和R'''各自独立地是氢或未取代的烷基、链烯基、炔基或芳基。在一个特定实施方案中，Y1和Y2之一或二者可以是羟基烷基。在特别的实施方案中，每个Y1和Y2是氢或具有1至6个碳原子的烷基，例如甲基。

[0092] 环状碳酸酯可以包括聚合化学式B的化合物

[0093]

[0094] 其中p是1-20，并且Y1和Y2表示该环的一个或多个碳原子被非氢取代基取代，并且其中Y1和Y2是如以上定义的。在特别的实施方案中，每个Y1和Y2是氢或具有1至6个碳原子的烷基，例如甲基。在一个特定实施方案中，Y1和Y2之一或二者可以是羟基烷基。

[0095] 环酯包括但不限于：内酯，例如β-丁内酯（n=2）、δ-戊内酯（n=4）、ε-己内酯（n=5）、α-甲基-β-丙内酯、β-甲基-β-丙内酯、ω-五癸内酯、ω-十二内酯、或任何丙交酯或乙交酯，包括其所有立体异构体，例如SS-丙交酯、RR-丙交酯、RS-丙交酯，取代的丙交酯或具有化学式C的乙交酯：

[0096]

[0097] 带有6或7元环结构的环状缩酚酞(半酯和半酰胺)，除其他之外分别包括化学式D1-D3：

[0098]

[0099] 通过活化的-OH或金属氧化物基团可聚合的其他环状单体包括含磷的环酯，包括具有化学式E的环状磷酸酯和膦酸酯：

[0100]

[0101] 其中q是1至20，Y3是如以上对Y1和Y2所定义的，并且R3是Y3（膦酸酯）或-OY3（磷酸酯）。

[0102] 环状亚膦酸酯可以包括具有化学式F的化合物：

[0103]

[0104] 其中变量是如以上定义的。含硅的环状单体可以包括具有化学式G的化合物：

[0105]

[0106] 其中，每个R独立地是氢或任选取代的烷基。在以上环状单体的特别的实施方案中，每个Y1-3是氢或具有1-6个碳原子的烷基。在以上环状单体的特别的实施方案中，所有Y1-3是氢或所有Y1-3是具有1-6个碳原子的烷基，例如所有Y1-3可以是甲基。在以上环状单体的特别的实施方案中，每个R是氢或具有1-6个碳原子的烷基。在以上环状单体的特别的实施方案中，所有R's是氢或所有R's是具有1-6个碳原子的烷基，例如所有R's可以是甲基。

[0107] 在特别的实施方案中，AB2型环状可聚合单体单独地或与其他环酯或环状碳酸酯组合使用。AB2型环酯单体包括具有化学式H的那些：

[0108]

[0109] 其中z是1至6并且Y1是如以上定义的。在特别的实施方案中，Y1可以是氢或具有1-6个碳原子的烷基。

[0110] 形成在此说明的药物-聚合物纳米轭合物的聚合反应可以在不同的反应条件（温度、溶剂、浓度）下进行，如本领域所理解的。这些条件一部分被选择来保持有待轭合的化学物种如该药物的活性。该聚合反应可以在任何适当的溶剂或溶剂混合物中进行。在一个特定实施方案中，该溶剂可以是无水的、水混溶性溶剂。该聚合反应可以在与用于随后的颗粒制备中的溶剂相同或不同的溶剂中进行。对于该聚合反应有用的溶剂尤其包括THF、丙酮、二氯甲烷、氯仿、二甲基甲酰胺、DMSO、乙腈、或它们的混合物。

[0111] 在此说明的纳米颗粒可以成功地将药物分子或其他化学物种携带到所希望的体内位置，例如哺乳动物的肿瘤部位。然后该药物可以进入肿瘤的癌细胞中。无适当涂层或改性的全身给药的纳米颗粒通常在循环中被快速清除并且主要位于肝和脾中。严重的肝和脾截留不仅大大减小了纳米颗粒接近目标组织，例如肿瘤组织，而且还造成肝和脾损伤。清除率典型地是由于库弗细胞和脾脏巨噬细胞的清除作用。无适当表面特征的纳米颗粒可能在几分钟至几十分钟中通过这种被动的并且位点特异性的机制清除。此外，纳米颗粒的表面特征和尺寸对血液调理（调理素像纤连蛋白的沉积过程）有重要作用，这个过程可以触发免疫响应并且加速巨噬细胞将纳米颗粒从血液中清除。当纳米颗粒的表面特征受到良好控制，例如通过在此说明的的准备方法时，调理素至纳米颗粒表面的结合可以实质性地减少。

[0112] 纳米颗粒表面通过静电（非共价）相互作用的聚乙二醇化可以减小蛋白的结合。该PEG层形成了一个亲水层，该亲水层可以实质性降低血液的蛋白结合并且减少肝和脾的吸收。聚乙二醇化创造了隐形式（stealth-like）结构，该结构类似于致病微生物所发展的策略，以便省略免疫检测。因此可以实现对调理作用的抑制并且可以用来增强在循环中对纳米颗粒的被动截留并且避免纳米颗粒在与血液接触时陷入巨噬细胞中。操纵纳米颗粒表面的这种简单策略可以具有显著的影响，因为通过这种聚乙二醇化技术可以将纳米颗粒的循环半寿期从几分钟延长至几小时至几十小时。

[0113] 纳米颗粒是可以显著影响生物学分布和体内功效的另一个重要参数。纳米颗粒尺寸可以剧烈影响清除率。具有高于200nm的尺寸的大颗粒与较小纳米颗粒相比更有可能诱导巨噬细胞的免疫响应并且激活库弗细胞的吸收。肝中的窦内皮的窗孔（fenestrae）尺寸可以大到150nm。当颗粒尺寸超过细胞狭缝的一半时（200-250nm），内皮细胞狭缝处的脾脏过滤可以占主导。因此，纳米颗粒在用于抗癌药物的递送中时其尺寸通常控制在150nm或更低以便延长循环。

[0114] 纳米颗粒的尺寸也不应太小，否则颗粒将非常快地滤过肾（尺寸<10nm），这是具有40kDa或更低分子量的聚合物-药物轭合物的典型问题。非常小的颗粒（1-20nm）还可以减慢从脉管系统向间质间隙中的外渗、并且进一步通过淋巴管而累积在淋巴结中。使用开创术，具有小于20nm的尺寸的纳米颗粒可以容易地从脉管系统中逸出到毛细血管中。因此，对于某些用途，纳米颗粒应该足够大而能防止从循环中不希望的泄漏，但应该足够小而能将免疫响应最小化。

[0115] 用于抗癌剂递送的纳米颗粒典型地是在20nm至150nm的范围内。为了改进抗癌剂的递送，应该着重注意隐身技术的发展以提供用于在异漏的肿瘤脉管系统处获得长循环NP的增大的外渗的装置。肿瘤的脉管系统是高度异质的。取决于具体的位置，肿瘤组织可以是脉管坏死的或极度血管化的，使得足够的营养和氧可以输送到肿瘤组织而支持其快速生长。肿瘤血管也是非常异质的并且与正常血管相比具有若干异常情况。总体上，肿瘤血管比它们的正常对应物是更易漏的、并且显示是具有范围在380与780nm之间的特征性孔截止尺寸。这些孔成为了NP离开循环系统并且进入肿瘤间质间隙中的路径。因此，具有150nm或更低尺寸的NP可以自由扩散穿过这些易漏的脉管孔，而具有大于400nm尺寸的颗粒较不可能外渗到肿瘤组织中。由于肿瘤组织中不发达的淋巴排泄系统，从肿瘤脉管系统的易漏孔中外渗的纳米颗粒不能容易地被去除。因此持续的循环导致纳米颗粒随时间的逐步累积。这种效应就是在癌症药物递送中众所周知的高通透和滞留（ERP）效应被动靶向机理。

[0116] 在此说明的聚合物和低聚物轭合物可以通过反应来化学改性以便引入所希望的官能端基。感兴趣的用于药物递送的官能端基除其他之外包括羟基、硫醇、胺、叠氮化物、炔、烯、酮、酚、卤化物、咪唑、胍鎓、羧酸酯或磷酸酯基团。这些官能团可以在此处的聚合物或低聚物的末端使用熟知的化学方法引入。可以使用官能团来进一步将本发明的聚合物或低聚物轭合物与其他化学物种轭合，例如其他聚合物、其他低聚物、碳水化合物类、肽、蛋白、抗体、核酸、适体，和/或来进一步为使用在此说明的轭合物所制备的纳米颗粒的表面改性提供位点。

[0117] 这些纳米轭合物可以是多层颗粒，其中对在此说明的颗粒进行处理以便涂覆该纳米颗粒或以其他方式在其上提供一个另外的聚合物层（例如药物-聚合物纳米轭合物）。该另外的聚合物在实践中可以与该聚合物轭合物的聚合物相同或不同。颗粒可以包含两种或更多种轭合的化学物种，例如两种或更多种在给定应用中相容的不同药物。颗粒可以包含不同的层或部分，在其中该化学物种或药物的浓度是不同的。例如一个外层与内层相比可以包含更高或更低浓度的一种给定化学物种（例如药物）。例如，外层可以包含PEG而内层包含一种不同聚合物的轭合物。例如，第一内层可以包含第一药物的聚合物或低聚物轭合物，而另一个外层包含第二药物的聚合物或低聚物轭合物。该另外的外层可以在添加该嵌段共聚物涂层之前或之后添加，并且可以在添加该另外的外层之后添加一个另外的嵌段共聚物涂层。

[0118] 纳米颗粒可以具有核/壳结构或具有多层结构，其中核或壳中的至少一个或多层中的一个层是由该药物（或其他化学物种）-聚合物/低聚物轭合物形成的一个层。例如，纳米颗粒的核可以由一种聚合物/低聚物轭合物通过以上对于形成纳米颗粒而说明的方法来形成。此后可以向该核纳米颗粒添加一个壳以便产生具有增大的粒度的核/壳纳米颗粒。更确切地说，可以形成这样的核/壳纳米颗粒，具有一个由第一聚合物/低聚物轭合物形成的核以及由聚合物例如亲水聚合物或两亲聚合物形成的壳。在特别的实施方案中，该聚合物可以是一种两亲嵌段共聚物。在特别的实施方案中，该聚合物是为PEG聚合物的聚合物或者包括PEG嵌段的聚合物（作为聚合物本身或该聚合物的一个嵌段）。

[0119] 替代地，核/壳纳米颗粒可以由第一聚合物/低聚物轭合物（形成核）以及第二聚合物/低聚物轭合物（形成壳）形成。注意，在一些实施方案中，该第一或第二聚合物偶联物99m
之一可以具有轭合至该聚合物或低聚物上的标记物或报道分子（例如 Tc或类似物）。在特别的实施方案中，该第一和/或第二聚合物/低聚物轭合物可以选自具有官能团的紫杉烷、蒽环类抗生素、或Shh拮抗剂的轭合物，该官能团可以对于如在此说明的聚合引发起作用，是例如羟基或硫醇基团。在更特别的实施方案中，该第一和/或第二聚合物/低聚物轭合物可以是Ptxl、Dtxl、Doxo、环巴胺、喜树碱、或它们的组合。

[0120] 纳米颗粒可以是包含三个或更多不同的层的多层纳米颗粒，其中至少一个层是由聚合物/低聚物轭合物形成的，包括药物或气体化学物种如标签或报道分子的那些。纳米颗粒包括具有三个、四个或五个层的那些。纳米颗粒包括所有层均是由在此说明的聚合物/低聚物轭合物形成的那些。这些纳米颗粒可以包括以下这些：其中的至少一个层是由聚合物/低聚物轭合物形成并且至少一个另外的层是由聚合物（非轭合的聚合物）如亲水的、疏水的或两亲性的聚合物形成。在特别的实施方案中，纳米颗粒可以包括以下这些：其中的至少一个层是由聚合物/低聚物轭合物形成并且至少一个另外的层是由包含PEG的两亲聚合物例如LE5或LE5L形成。

[0121] 包含PEG的聚合物除其他之外包括：包含PEG的两亲共聚物，例如聚(丙交酯)-PEG(PLA-PEG)、具有PLA和PEG区段的两亲共聚物、和/或聚(乙交酯-共聚-丙交酯)-b-甲氧基化的PEG（PLGA-mPEG）、具有PLGA和PEG区段的两亲共聚物。在这样的共聚物中，PEG的范围可以该共聚物的例如从10%至90%、从20%至50%、从60%至80%、从50%至75%、从70%至99%或从1%至50%。

[0122] 在此处的方法和材料中使用的聚合物和低聚物典型地是生物适合性的且生物可降解的（取决于所希望的应用）。它们典型地在使用中展现出极小的毒性或没有不希望的毒性。

[0123] 在此说明的颗粒可以进行表面改性以便优先靶向至某些细胞类型。颗粒的优先靶向可以例如通过靶向配体到颗粒表面上的共价或非共价附接而实现。

[0124] 在此说明的轭合物典型地是具有至少一个羟基或一个硫醇基团的化学物种与通过开环聚合形成的低聚物或聚合物之间形成。该化学物种典型地包含至少一种在反应条件下作为聚合引发剂起作用的官能团。该羟基最普遍地是附接至碳上的伯（1'）、仲（2'）或叔（3'）羟基、或附接至芳环的碳上的羟基，概括地在此描述为“酚羟基”酚羟基是直接附接到芳环的碳上的那些。

[0125] 术语羟基和氢氧基在此可互换使用。羟基不包括-COOH基团（羧酸基团）的OH部分，该基团中的氢是酸性的。酚羟基的氢比醇的更酸性、但不及羧酸基团的酸性。如在此使用的术语羟基也不是指键合至N、P或S原子上的-OH部分。如本领域所理解的，伯羟基是键合至一个还键合了两个氢的碳原子上的羟基（例如-CH2-OH）。仲羟基是键合至一个键合了一个氢原子的碳原子上的羟基（例如-CH(M)-OH，其中M是一个除H外的原子或基团；在许多情况下M是含碳基团）。叔羟基是键合至一个未键合氢的碳原子上的羟基；典型地键合至该羟基上的碳键合到三个其他碳原子上。硫醇基团最普遍地可以是附接至碳上的伯（1'）、仲（2'）或叔（3'）硫醇基团，其中术语伯、仲和叔是如对于羟基所定义的来使用的。

[0126] 正如本领域技术人员容易理解的，当一种药物通过羟基或硫醇基团共价键合至一种聚合物上时，该羟基或硫醇部分的末端羟基被一个到聚合物上的键所置换，由此产生醚或硫醚连接。

[0127] 在此说明的颗粒配制品可以用来治疗不同的疾病、紊乱或病症。治疗方法可以包括将治疗有效量的药物（例如，在药物-聚合物纳米轭合物中）给予需要治疗的个体。

[0128] 此处的微粒配制品可以例如处于干粉的形式，干粉可以在适当时再水合。这些微粒配制品可以处于单位剂型，例如胶囊、悬浮体、干粉以及类似物。以这样的形式，该配制品可以细分为含适当量的该活性成分的单位剂量。单位剂型可以是包装好的组合物，例如包装好的粉末、小瓶、安瓿、预装注射器或含液体的囊剂。该单位剂型可以是例如胶囊，或者他可以是处于包装形式的适当数目的任何此类组合物。

[0129] 所用的剂量可以在宽界限内变化并且如本领域所理解的可以在每种具体情况下根据单独的要求进行调整。在此处的方法中可以采用任何适当的给药形式。可以将该颗粒以口服剂型、由静脉内、向腹膜内、皮下地、或肌内地给药，全都使用制药领域的普通技术人员熟知的剂型。还可以将组合物以鼻内形式通过主要使用鼻内运载体来给药。对于鼻内的或支气管内的吸入或隔离，可以将组合物配制成水性或部分水性的溶液，然后可以将该溶液以气溶胶的形式来使用。

[0130] 本发明提供了治疗哺乳动物如人类的紊乱、疾病、病症和症状的方法，是通过对需要治疗或预防的个体给于治疗有效量的一种在此说明的微粒配制品，给于需要它的哺乳动物。治疗结果可以部分或完全减轻、抑制、防止、改善和/或缓解该紊乱、病症或其一种或多种症状。给药包括本领域已知的对于给定类型的疾病或紊乱有效的给药形式、并且旨在涵盖以任何适当剂型的给药。需要治疗或预防的个体包括已经被诊断为患有给定的紊乱或病症的那些，以及例如由于某些症状的显现而被怀疑患有此类紊乱或病症的那些。

[0131] 纳米颗粒和纳米轭合物的发展

[0132] 在之前二十年对于纳米颗粒（NP）的理化特性的控制以及这些特性与NP的体内生物学分布和抗癌功效的相关性已经积累了大量信息。虽然NP对于药物递送应用的理想的理化特性尚未完全阐明，但关于NP的重要参数，如对于其体内应用很关键的粒度、药物负载、负载效率、以及释放动力学已经达成了普遍的一致。NP的尺寸典型地应该小于200nm、具有窄的多分散性，以给出令人满意的体内生物学分布。对于NP的体内应用可以利用高的药物负载、定量的负载效率以及受控的释放特征曲线。

[0133] 在配制用于生物技术和药物递送应用的颗粒的过程中已经使用了聚丙交酯（PLA），一种生物相容的且生物可降解的材料。NP典型地是通过PLA与药物的纳米沉淀制备的。然而，这种常规方法趋向于给出具有不同的、仍有待解决的配制挑战的NP。例如，PLA/药物NP典型地在水溶液中显示出“突然的”药物释放特征。典型地，多达80%-90%的包胶囊药物在前几小时至几十小时的过程中被快速释放。快速的药物释放，也称为剂量倾释，可以造成严重的全身毒性。

[0134] 此外，常规NP中的药物负载可以非常低，典型地对于大多数NP是在1%-5%的范围内（Tong和Cheng,Angew.Chem.,Int.Ed.[德国应用化学国际版]2008;47:4830-4834)）。递送运载体的药物负载可能是临床中对其利用的一种重要的衡量。在较低药物负载下，需要更大量的递送运载体。由于动物有限的体重和血容量，给药体积通常是固定的。例如，经静脉内给予20-30克体重的老鼠的溶液的体积应该控制在100至200μL左右。在100-μL溶液中具有1%药物负载的NP以50mg/kg的剂量对20g体重的老鼠的静脉给药要求浓缩的、
1g/mL NP溶液的配制品。在惯例中，不可能配制出如此浓缩的溶液并将其静脉注射。此外，还缺乏一般的策略来在PLA/药物NP中实现定量的药物包胶囊。取决于所使用的药物的量、药物的疏水性和亲水性、以及药物与聚合物的相容性，包胶囊效率在10%至90%的范围内急剧变化。未包胶囊的药物可以自我聚集并且可能难以从NP中去除。这些制剂挑战显著影响了PLA NP递送运载体对于癌症治疗的可工作性和临床转译（clinical translation）。

[0135] 很好地确立了用于制备具有精确受控的分子量和窄的多分散性的聚酯、多肽和基于烃的合成聚合物的受控聚合方法论，并且已经针对用作药物递送运载体对这些物质进行了评估。然而，在药物递送运载体的配制中直接使用的受控聚合是罕见的。已经开发了允许通过丙交酯（LA）的药物引发的受控开环聚合而将药物分子掺入PLA中的新方法并且在此进行说明（图1a）。紫杉醇（Ptxl）和其他含羟基的治疗性分子的定量掺入已经通过聚合催化剂如在此说明的Zn催化剂所促成的酯键被掺入PLA中。

[0136] 当使用大块的螯合化合物时，Zn-催化剂可以通过Ptxl的最小空间位阻的2’-OH（或类似的含羟基试剂）来调整引发和聚合。这种技术得到了具有精确受控的组成和分子量的轭合物。在单体/引发剂（LA/Ptxl）之比为10时，Ptxl-PLA轭合物以及衍生自该轭合物的NP的药物负载可以高达40%，具有接近100%的负载效率。Ptxl能以受控的方式、在具有可忽略的陡变的情况下从这些Ptxl-PLA轭合物NP中释放，将后者称为纳米轭合物（NC），以便将其于通过包胶囊方法制备的PLA/药物NP区分开。

[0137] 在此说明了对Ptxl-PLANC的配制以及通过将癌特异性靶向适体配体轭合至NC表面上而开发癌靶向NC所作的综合性研究。已证明Ptxl-PLA NC可以与PLA-PEG-PLA（一种两亲三嵌段共聚物）直接在PBS中共沉淀，而形成具有200nm或更小尺寸的NC。这些含PEG的NC能够在PBS中长期保持不聚集。还已发现，白蛋白（在血液中的丰富蛋白）可以防止冻干过程中的NC聚集。作为新的冻干保护剂，白蛋白的表现超过了许多熟知的、基于糖的冻干保护剂，例如海藻糖和蔗糖。在白蛋白的存在下冻干的NC可以在PBS中复水。以这种方式处理的NC于是保持不聚集。这些技术允许以空前的简易性来配制并处理临床适用的NC。因此这些技术可以广泛应用于配制其他进行药物递送和药物靶向的聚合物NP。

[0138] 特别的实施方案

[0139] 在此说明了可以用作药物递送运载体的新型纳米轭合物（NC）。例如，开发了一种新的、药物引发的LA聚合方法以允许将药物受控地掺入PLA的末端。在一个实施方案中，Ptxl可以通过其2'-OH基团而区域选择性地轭合至PLA上（图1a）。所得的Ptxl-PLA轭合物具有良好受控的MW以及窄的多分散性。

[0140] 使Ptxl-PLA具有受控特性的能力形成了对聚合物NP的临床转译很关键的配制参数进行进一步研究的基础。已证明Ptxl-PLA可以与PLA-PEG-PLA（一种两亲三嵌段共聚物）直接在PBS溶液中共沉淀，而形成在水溶液例如盐溶液中可以保持不聚集的NC。还已发现，白蛋白是优异的冻干保护剂，它成功地提供了NC的固体配制品，该配制品可以复水而没有NP聚集，其中所得的颗粒具有小于220nm或小于约200nm的直径。NC的有效靶向能力可以通过适体至颗粒表面的直接轭合而容易地实现。

[0141] 通过结合在此说明的现有技术的冻干保护技术，已证明，含有轭合的核酸靶向配体的聚合物NC能大量以固体形式制造。固体形式的NC可以复水成良好分散的NC而没有或只有可忽略的颗粒聚集、具有良好维持的靶向能力。在此说明的配制策略和冻干保护技术可以用于其他用于基础科学以及临床应用的聚合物纳米药剂的受控制备。

[0142] 因此，在一个实施方案中，紫杉醇-聚丙交酯（Ptxl-PLA）轭合物纳米颗粒，称为纳米轭合物（NC），可以通过丙交酯（LA）的由Ptxl/(BDI)ZnN(TMS)2-介导的受控聚合、然后进行纳米沉淀来制备。BDI是对2-((2,6-二异丙基苯基)-酰氨基)-4-((2,6-二异丙基苯基)-亚氨基)-2-戊烯的缩写。Ptxl-PLA的纳米沉淀得到了具有单峰颗粒分布以及小的多分散性的、小于100nm的NC。Ptxl-PLANC的尺寸可以通过使用适当的水混溶性溶剂并且通过控制纳米沉淀过程中Ptxl-PLA的浓度来精确地控制。

[0143] PLA-PEG-PLA（PLA=14kDa；PEG=5kDa）与Ptxl-PLA的混合物在PBS中的共沉淀得到了在PBS中长期保持不聚集的NC。为了开发NC的固体配制品，对一系列冻干保护剂进行评估以便辨识出在冻干过程中有效减小或消除NC聚集的制剂。发现白蛋白对于制备固体形式的NC是优异的冻干保护剂，从而允许冻干的NC容易地分散在PBS中而没有可检出的聚集。制备了适体-NC生物轭合物并以细胞特异性的方式有效地靶向至前列腺特异性膜抗原上，如在下面的实例中说明的。

[0144] 纳米轭合物的制备

[0145] 可以制备有用的颗粒，例如通过已知的方法由含有在此说明的药物-聚合物纳米轭合物的溶液。这些药物-聚合物纳米轭合物可以在该聚合物或低聚物的聚合过程中形成，其中该药物被用作形成该聚合物和/或低聚物的单体的聚合引发剂。更特别地，该药物轭合物可以通过环状单体在适当的开环聚合催化剂以及抑制剂（该药物）的存在下的开环聚合而形成。

[0146] 这些颗粒对于药物递送是有用的。这些药物-聚合物纳米轭合物的尺寸总体上是范围从约2nm至约500微米。在其他更特别的实施方案，这些药物-聚合物纳米轭合物被用于制造含有该药物并且尺寸范围总体上是从约500nm至约100微米的微颗粒。在其他实施方案，这些药物-聚合物或药物-低聚物轭合物被用于制造含有该药物并且尺寸范围总体上是从约55nm至约600nm的纳米颗粒。在其他实施方案，这些药物-聚合物或药物-低聚物轭合物被用于制造含有该药物并且尺寸范围总体上是从约2nm至约100nm的颗粒。在其他实施方案，这些药物-聚合物或药物-低聚物轭合物被用于制造含有该药物并且尺寸范围总体上是从约200nm至约800nm的颗粒。在其他实施方案，这些药物-聚合物或药物-低聚物轭合物被用于制造含有该药物并且尺寸范围总体上是从约1微米至约500微米的颗粒。

[0147] 在一个特定实施方案中，本发明的方法可以用来制造在20-60nm尺寸范围内的纳米颗粒。此类纳米颗粒可以如下制造，例如通过已知的微颗粒化（micellation）方法由如在此说明的聚合物或低聚物轭合物、然后与含PEG的嵌段聚合物（例如LE5或LE5L）进一步反应。

[0148] 在另一个特定实施方案中，本发明的方法可以用来制造在1-20nm尺寸范围内并且对递送至细胞特别有用的纳米颗粒。此类纳米颗粒可以通过使用环状AB2型单体或此类单体与以上说明的其他环酯和碳酸酯单体的混合物来形成。AB2型单体可以聚合而形成轭合至选定的药物分子上的超支化的或树枝状结构。通过AB2型单体的聚合直接形成的颗粒可以用于药物递送。替代地，可以使这些颗粒经受如在此讨论的表面处理。

[0149] 这些药物-聚合物纳米轭合物可以包括任何小分子药物（例如，非肽的、非糖的并且不是基于核酸的药物的小分子药物）。该药物可以包含至少一个可以对该开环聚合反应的引发起作用的官能团，例如羟基或硫醇基团。该药物可以包含但不需要包含多个这样的聚合引发基团，例如多个羟基或硫醇基团。在优选的实施方案中，该药物仅包含此类聚合基团中的一种。该羟基可以是伯、仲、或叔羟基。同样地，该硫醇基团可以是伯、仲、或叔硫醇基团。该羟基也可以是酚羟基。在特别的实施方案中，该药物包含一个或多个非酚羟基。在特别的实施方案中，该药物包含一个或多个为伯或仲羟基的非酚羟基。在特别的实施方案中，该药物包含单个非酚羟基。在特别的实施方案中，该药物包含单个伯或仲羟基。可以用于此处的聚合物、组合物和方法中的示例性药物在上面进行了说明。

[0150] 在特别的实施方案中，该药物是亲水的并且在相关实施方案，该药物是水溶性的（例如展现出的水中溶解度是在mg/mL的范围内）。在其他特别的实施方案中，该药物是疏水的并且在相关实施方案，该药物不是水溶性的或者展现出低的水中溶解度（例如，展示出的水中溶解度是在微克/mL或更小的范围内）。

[0151] 在特别的实施方案中，轭合物至该聚合物或低聚物上的药物是一种为抗癌剂或对于化学治疗有用的药物。在特别的实施方案中，该药物是紫杉烷。在其他特别的实施方案中，该药物是蒽环类抗生素家族中的一种抗癌剂。在其他实施方案中，该药物是蛋白酶抑制剂。在其他特别的实施方案中，该药物是逆转录酶的一种抑制剂。在其他特别的实施方案中，该药物是逆一种抗病毒剂。在其他特别的实施方案中，该药物是逆一种抗真菌剂。在其他特别的实施方案中，该药物是一种酚类药物，即，具有一个或多个酚羟基。在其他特别的实施方案中，该药物是一种硫醇药物，即，具有一个或多个硫醇基。

[0152] 在此说明的这些纳米轭合物、组合物和方法对于是肽、蛋白、糖和/或核酸（DNA或RNA）的药物的递送也是有用的。在各自的情况下，该药物典型地包含至少一个可以在该开环聚合反应中用作引发剂的官能团，例如在至少一个羟基或一个硫醇基团。

[0153] 在此说明的这些纳米轭合物、组合物和方法可以更广泛地用于任何分子或其他化学物种（包括合成的、或天然存在的分子以及有机或无机物种），例如，包含至少一个可以在该开环聚合反应中用作引发剂的官能团（例如，羟基或硫醇基）的那些，以及人们希望使用微粒递送系统如微颗粒或纳米颗粒来在体内给药或递送的那些。该纳米轭合物可以包括任何此类有用的化学物种，包括而不限于用于诊断方法的试剂、营养素或维生素（在某些实施方案中也可以视为药物）、或报道分子（例如，放射性标记的或荧光标记的分子）。有待轭合至该聚合物或低聚物上的化学物种可以是亲水的、疏水的、水溶性的或水不溶的。该化学物种可以包含多个羟基或硫醇基，它们可以是伯、仲或叔羟基并且可以是酚羟基。在特别的实施方案中，这些羟基是伯或仲羟基。在特别的实施方案中，这些羟基是酚羟基。在特别的实施方案中，这些硫醇基是伯或仲硫醇基。在特别的实施方案中，该化学物种是除糖类外的化学物种。在特别的实施方案中，该化学物种是除碳水化合物外的化学物种。

[0154] 在特别的实施方案中，颗粒，例如纳米颗粒，可以展现出20%或更多、30%或更多、40%或更多、或50%或更多的药物负载（或更普遍地，选定化学物种的负载）。

[0155] 在特别的实施方案中，颗粒，例如纳米颗粒，可以展现出对于有效的体内递送有用的长循环寿命。当这些颗粒采用此处说明的方法或者采用本领域已知的方法进行表面改性时，尤其是这种情况。在特别的实施方案中，这些颗粒可以展现出在盐溶液中的溶解度。可以将形成轭合物的方法与用于形成颗粒的任何已知方法进行结合，包括纳米沉淀、微颗粒化、乳化、以及双乳化方法。

[0156] 纳米轭合物总体上可以是带有希望以微粒递送系统进行递送的任何化学物种的那些。例如，该药物可以是例如一种抗癌剂或化学治疗药。在特别的实施方案中，这些轭合物是轭合物中的聚合物平均具有100个或更少的单体单元的那些。在其他实施方案中，这些轭合物是轭合物中的聚合物平均具有75、50或25个单体单元的那些。在特别的实施方案中，这些轭合物是轭聚合物具有的平均分子量为5000或更小、2500或更小、1500或更小、或1000或更小的那些。在特别的实施方案，该轭合物的化学物种可以轭合或键合至仅一种聚合物或低聚物上。在特别的实施方案中，该轭合物是轭合或键合至仅一种聚合物或低聚物上并且在该化学物种的仅一个位点处。

[0157] 在特别的实施方案中，本发明提供了至亲水性化学物种如亲水性药物上的聚合物或低聚物轭合物。在其他特别的实施方案中，一种疏水性化学物种如疏水性药物被轭合至该聚合物上。

[0158] 本发明进一步提供了颗粒，包括微颗粒和纳米颗粒，这些颗粒包括对于选定化学物种（例如一种或多种药物，例如一种或多种抗癌剂或化学治疗剂）的体内递送有用的聚合物轭合物或低聚物轭合物。在特别的实施方案中，这些颗粒，包括微颗粒和纳米颗粒，是通过本领域已知的任何手段进行表面改性过的，例如用一种或多种抗体，用一种或多种核酸分子例如适体，用一种或多种肽或蛋白例如酶，用一种或多种聚合物或低聚物例如两亲聚合物，如含有PEG的两亲共聚物。本领域已知的颗粒的表面改性可以有助于颗粒靶向至某些组织、可以促进颗粒进入细胞内或者可以增强该颗粒的稳定性。例如，由聚酯、聚碳酸酯或其混合物形成的纳米颗粒可以涂覆有亲水性聚合物如PEG或含PEG的两亲聚合物，以增强该纳米颗粒的循环寿命。

[0159] 在另外的实施方案中，本发明提供了具有核/壳结构或具有多层结构的颗粒，其中核或壳中的至少一个或多层中的一个层是由该药物（或其他化学物种）-聚合物/低聚物轭合物形成的一个层。纳米颗粒可以具有核/壳结构，其中核或壳是由在此说明的聚合物/低聚物轭合物形成的。还可以形成这样纳米颗粒，具有一个由第一聚合物/低聚物轭合物形成的核以及由(1)聚合物例如亲水聚合物或两亲聚合物或者(2)第二聚合物/低聚物轭合物形成的壳。在特别的实施方案中，该第一和第二聚合物/低聚物轭合物可以选自具有官能团的紫衫烷、蒽环类抗生素、或Shh拮抗物的轭合物，该官能团可以对于如在此说明的聚合引发起作用，是例如羟基或硫醇基团。在更特别的实施方案中，该第一和第二聚合物/低聚物轭合物可以是选自Ptxl、Dtxl、Doxo、环巴胺、或喜树碱的那些。可以制备含有三个或更多不同的层的多层纳米颗粒，其中至少一个层是由一种聚合物/低聚物轭合物形成的。纳米颗粒包括具有三个、四个或五个层的那些。

[0160] 纳米颗粒包括所有层均是由在此说明的聚合物/低聚物轭合物形成的那些。纳米颗粒可以包括以下这些：其中的至少一个层是由聚合物/低聚物轭合物形成并且至少一个另外的层是由聚合物（非轭合的聚合物）如亲水的、疏水的或两亲性的聚合物形成。在特别的实施方案中，纳米颗粒可以包括以下这些：其中的至少一个层是由在此说明的聚合物/低聚物轭合物形成并且至少一个另外的层是由包括PEG的两亲聚合物形成。

[0161] 本发明进一步提供了用于进行此处的聚合反应从而形成具有一种含至少一个羟基的选定化学物种的聚合物或低聚物轭合物的套件。这些套件包括一个或多个容器，这些容器进而包括一种或多种环状单体的和/或一种或多种开环聚合催化剂、并且任选地包括用于进行该聚合反应的指示、用于制造颗粒的指示、用于颗粒的表面改性的一种或多种试剂或指示、用于进行聚合或制造颗粒的一种或多种溶剂、一种或多种控制引发剂、用于进行该反应或形成颗粒或进行表面改性的另外的接收座（receptacle）。在特别的实施方案中，套件可以包括对于制造具有不同低聚物或聚合物的轭合物有用的多种不同的环状单体。在一些实施方案中，套件可以进一步包含用于形成轭合物的一种或多种不同的具有至少一个羟基的化学物种。

[0162] 在综合以下详细说明、实例和附图之后本发明的另外的实施方案将是清楚的。其他关于纳米轭合物的有用信息可以在美国专利公开号2008/0248126（Cheng等人）中找到，将其通过引用以其全部内容结合在此。

[0163] 纳米轭合物以及纳米轭合物组合物

[0164] 如以上说明的，本发明提供了一种药物-聚合物纳米轭合物，该轭合物包括一种共价结合至聚合物上的药物、一个嵌段共聚物涂层、以及一个白蛋白涂层；

[0165] 其中该药物-聚合物纳米轭合物包括一种或多种药物以及一种或多种聚合物，该药物-聚合物纳米轭合物的一种或多种药物位于该药物-聚合物轭合物的一种聚合物的起始点处，这些药物中的一种或多种包括至少一个羟基或硫醇部分，并且此药物在该药物的羟基或硫醇部分的位置处共价结合至该聚合物上；

[0166] 该药物-聚合物纳米轭合物的聚合物可以包括衍生自环状酯、环状碳酸酯、环状磷酸酯、环状硅氧烷、环磷腈或环肽或氨基酸的单体；

[0167] 该嵌段共聚物涂层包含PEG和丙交酯嵌段；

[0168] 该嵌段共聚物涂层涂覆有一个量的白蛋白，该量对于至少基本上防止该药物-聚合物纳米轭合物聚集成其他药物-聚合物纳米轭合物是有效的。

[0169] 该纳米轭合物还可以包括一种或多种共价结合至该药物-聚合物纳米轭合物的表面上或结合至该嵌段共聚物涂层上的细胞靶向剂。因此纳米轭合物可以如本领域已知的进行表面改性以便改善它们作为药物递送运载体的有用性。组合后的药物-聚合物纳米轭合物、嵌段共聚物涂层、以及白蛋白涂层的直径可以是约2nm至约300nm、或约20nm至约200nm。因此组合后的药物-聚合物纳米轭合物、嵌段共聚物涂层、以及白蛋白涂层的直径可以小于约300nm、小于约250nm、小于约200nm、或小于约150nm。组合后的药物-聚合物纳米轭合物、嵌段共聚物涂层、以及白蛋白涂层的质量可以是小于没有共价键合至聚合物上的全部药物的2wt.%、小于全部药物的1.5wt.%、小于全部药物的1wt.%、小于全部药物的
0.5wt.%、或小于全部药物的0.25wt.%。

[0170] 该嵌段共聚物涂层可以是一种或多种PLA-PEG二嵌段共聚物、一种或多种PLA-PEG-PLA三嵌段共聚物、或它们的组合。该嵌段共聚物涂层的PEG嵌段的分子量是约400至约40,000。该嵌段共聚物涂层的丙交酯嵌段的分子量是约1,000至约250,000。例如，该嵌段共聚物涂层的PEG嵌段可以是约5,000，并且该嵌段共聚物涂层的丙交酯嵌段可以是约5,000至约50,000。该聚合物的端基可以是羟基、硫醇、胺、叠氮化物、炔、烯、酮、酚、卤化物、咪唑、胍鎓、羧酸酯或磷酸酯基团。

[0171] 该药物-聚合物纳米轭合物在其他药物-聚合物纳米轭合物的存在下当与该其他药物-聚合物纳米轭合物在水中或在水溶液接触时可以在大于24小时内保持不聚集。该细胞靶向剂可以是一种适体。

[0172] 该嵌段共聚物涂层可以通过静电相互作用而非共价地键合至该药物-聚合物纳米轭合物上，和/或一个嵌段共聚物涂层可以共价地键合至该药物-聚合物纳米轭合物组合物的一个层上。该药物-聚合物纳米轭合物与该嵌段共聚物涂层的质量比可以是例如约0.5至约1.5、或约0.75至约1.25。该白蛋白涂层的白蛋白可以是哺乳动物血清白蛋白，例如牛血清白蛋白或人血清白蛋白。

[0173] 本发明还提供了包括多种在此描述的纳米轭合物的一种组合物，其中该纳米轭合物的组合物具有单峰的纳米轭合物粒度分布。该药物-聚合物纳米轭合物的分子量分布可以是例如小于1.1、小于1.07、小于1.06、小于1.05、小于1.04、小于1.03、或小于1.02。这些纳米轭合物例如在暴露于PBS中大于30分钟时可以保持不聚集。

[0174] 本发明进一步提供了用于将药物-聚合物纳米轭合物递送至细胞表面或内部的方法。该递送可以包括使细胞与在此说明的药物-聚合物纳米轭合物相接触，使得该药物-聚合物轭合物与该细胞缔合一段足以使该药物-聚合物纳米轭合物从聚合物上释放药物的时间，由此将药物递送至细胞的表面或内部。该细胞可以是前列腺癌细胞、乳癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞、或结肠癌细胞。

[0175] 环状单体与药物引发剂的摩尔比可以是例如约5,000:1至2:1。该药物可以是含羟基的小有机分子、大分子、或肽、糖类或核酸。

[0176] 该药物-聚合物纳米轭合物的药物中的一种或多种可以是例如：阿霉素、柔红霉素、表柔比星、米托蒽醌、博来霉素A2、博来霉素B2、长春新碱、长春碱、长春瑞宾、长春地辛、鬼臼毒素、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇、多西他赛、伊立替康、托泊特坎、格尔德霉素、阿昔洛韦、去羟肌苷、达芦那韦（darunavir）（TMC-114）、利巴韦林、那他霉素、氟康唑、泊沙康唑、伏立康唑、卡泊芬净、两性霉素B、苯氧乙醇、替拉那韦（TPV）、沙奎那韦（SQV）、利托那韦（RTV）、茚地那韦、奈非那韦（NFV）、氨普那韦（APV）、洛匹那韦（ABT-378）、阿扎那韦（ATV）、长春瑞宾重酒石酸盐、氟维司群、匍枝珊瑚醇（sarcodictyin）、喜树碱、苔藓抑素1、(+)-cylindricine、(+)-乳胞素、铜绿菌素298-A、(+)-福司曲星、garsubellin A/贯叶金丝桃素、(S)-奥昔布宁、埃坡霉素A、齐多夫定（AZT）、拉米夫定（3TC）、恩曲他滨（FTC）、巴美生、香草二乙胺、六氯酚、水杨苯胺、儿茶酚、麝香草酚、喷他佐辛、间苯三酚、丁香酚、氯硝柳胺、特布他林、多巴胺、甲基多巴、去甲肾上腺素、α-萘酚、肾上腺素、去氧肾上腺素、间羟胺、非诺特罗、硫氯酚、α-生育酚、异丙肾上腺素、沙丁胺醇、绿原酸和/或其酯、卡托普利、阿莫西林、倍他洛尔、马索罗酚、木黄酮、黄豆苷元、大豆苷、乙酰黄豆黄甙、雌马酚、黄豆黄素、碘超强辣素、SB202190、酪氨酸磷酸化抑制剂SU1498、或它们的组合。该纳米轭合物可以是分层的，使得这些颗粒具有药物浓度梯度。例如，这些颗粒可以具有一种多层结构，该多层结构在不同的层中具有不同的药物浓度或不同类型的药物。至少一个层的颗粒是由该药物-聚合物纳米轭合物形成的。

[0177] 因此本发明还提供了一种共价的药物-低聚物或药物-聚合物轭合物，该轭合物是通过使一种或多种环状单体在一种药物以及一种开环聚合催化剂的存在下进行聚合而制备的，该单体是选自下组，该组由以下各项组成：环酯、环状碳酸酯、环状磷酸酯、环状硅氧烷、环肽或氨基酸衍生物、或环磷腈，该药物的结构包括一个或多个羟基，其中该包含一个或多个羟基的药物是该聚合反应的引发剂。该药物-低聚物或药物-聚合物轭合物可以是分层的或者如在此说明的进行了改性。

[0178] 该聚合物可以包括5000或更少的该开环单体的重复单元。该聚合物还可以包括500或更少的该开环单体的重复单元。该聚合物进一步可以包括50或更少的该开环单体的重复单元。该聚合物还可以包括20或更少的该开环单体的重复单元。该聚合物（例如低聚物）替代地可以包括10或更少的该开环单体的重复单元。

[0179] 因此本发明提供了一种包含核/壳结构或多层结构的纳米颗粒。该核或壳中的至少一个或这些层中的一个层可以是如在此说明的纳米轭合物。在一些实施方案中，这些单体可以是例如丙交酯、乙交酯或它们的组合。

[0180] 本发明还进一步提供了一种制备用于化学物种的体内递送的颗粒的方法，该化学物种例如具有至少一个羟基或硫醇基，该方法可以包括(a)在具有至少一个羟基作为聚合引发剂以及一种聚合催化剂的存在下在无水的水混溶性溶剂中进行一种或多种环状单体的开环聚合，以便形成一种共价的药物-低聚物或药物-聚合物轭合物，该单体是选自：环酯、环状碳酸酯、环状磷酸酯、环状硅氧烷、环肽或氨基酸衍生物、或环磷腈、或它们的组合；并且(b)形成包含该药物-低聚物或药物-聚合物轭合物、尺寸范围是从2微米至100微米的颗粒。

[0181] 本发明另外提供了一种共价的低聚物或聚合物轭合物，该轭合物是通过使一种或多种环状单体在一种化学物种以及一种开环聚合催化剂的存在下进行聚合而制备的，该单体是选自下组，该组由以下各项组成：环酯、环状碳酸酯、环状磷酸酯、环状硅氧烷、环肽或氨基酸衍生物、或环磷腈，该化学物种的结构包括一个或多个羟基，其中该包含一个或多个羟基的药物是该聚合反应的引发剂。在任何实施方案中，该化学物种可以是例如一种诊断剂、肽、糖类、碳水化合物、无机物种、造影剂、维生素、营养素、核酸、RNA分子、siRNA或分子。

[0182] 药物制剂

[0183] 在此说明的纳米轭合物可以用于制备治疗性的药物组合物。这些纳米轭合物能以盐或溶剂化物的形式加入该组合物中。例如，当纳米轭合物足够碱性或酸性而能形成稳定的无毒酸或碱盐的情况下，这些纳米轭合物作为盐的给药可能是适合的。药学上可接受的盐的实例是与酸形成的有机酸加成盐，这些酸形成了生理学上可接受的阴离子，例如甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐、以及α-甘油磷酸盐。还可以形成适合的无机盐，包括盐酸盐、卤化物、硫酸盐、硝酸盐、重碳酸盐、以及碳酸盐。

[0184] 药学上可接受的盐可以使用本领域熟知的标准程序获得，例如通过使一种足够碱性的化合物如胺与一种适合的酸进行反应而提供一种生理学上可接受的离子化合物。通过类似方法也可以制备羧酸的碱金属（例如钠、钾或锂）或碱土金属（例如钙）盐。

[0185] 在此说明的纳米轭合物可以配制为药用组合物并且以多种形式给予哺乳动物主体，如人类患者。这些形式可以针对选定的给药途径来专门适配，给药途径是例如口服或肠胃外给药、通过静脉内、肌内、局部或皮下的途径。

[0186] 在此说明的纳米轭合物可以与药学上可接受的运载体如惰性稀释剂或可同化的可食用载体相结合地进行全身给药。对于口服给药，可以将化合物包封在硬或软壳的胶囊内、压缩成片剂、或直接掺入患者饮食的食物中。还可以将纳米轭合物与一种或多种赋形剂进行组合并且以可吸收的片剂、含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮体、糖浆剂、薄片等等的形式来使用。此类组合物和制品典型地包含至少0.1%的活性化合物。这些组合物和制品的百分比可以变化并且适宜地可以是给定的单位剂型的重量的从约2%至约60%。在此类治疗上有用的组合物中活性剂的量是使得可以获得有效的剂量水平。

[0187] 这些片剂、锭剂、丸剂、胶囊等等还可以包含以下一种或多种：粘合剂，例如黄芪胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等等；以及润滑剂，例如硬脂酸镁。可以加入甜味剂，例如蔗糖、果糖、乳醇或阿司帕坦；或调味剂，例如薄荷或冬青油、或樱桃调味剂。当单位剂型是胶囊时，它除了以上类似的物质外还可以包含液体载体，例如植物油或聚乙二醇。不同的其他物质可以作为涂层存在或者以其他方式改变固体单位剂型的实体形式。例如，片剂、丸剂、或胶囊可以涂覆有明胶、蜡、虫胶或糖等等。糖浆剂或酏剂可以包含这些纳米轭合物、作为甜味剂的蔗糖或果糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和丙酯，染料和甜味剂如草莓或橘子香精。在制备任何单位剂型中使用的任何物质在所采用的量下都应该是药学上可接受的并且是基本上无毒的。此外，这些纳米轭合物可以掺入持续释放的制品和装置中。

[0188] 这些纳米轭合物可以静脉内或向腹膜内通过输注或注射来给药。纳米轭合物或其盐的溶液可以在水中制备、任选地与一种无毒表面活性剂进行混合。分散体可以在甘油、液体聚乙二醇、三乙酸甘油酯、或它们的混合物中、或在一种药学上可接受的油中制备。在通常的储存和使用条件下，制品可以包含一种防腐剂以防止微生物的生长。

[0189] 适合于注射或输注的药物剂型可以包括无菌水溶液、分散体、或无菌粉末，它们包含的活性成分是针对无菌可注射或可输注的溶液或分散体的临时制品进行适配的、任选地包胶囊在脂质体中。最终剂型应该在制造和储存条件下是无菌的、流体的并且稳定的。液体载体或运载体可以是一种溶剂或液体分散体介质，包含例如水、乙醇或多元醇（例如，乙二醇、丙二醇、液体聚乙二醇等等）、植物油、无毒甘油酯、以及它们的合适混合物。可以维持适当的流动性，例如通过形成脂质体、通过在分散体的情况下维持所要求的粒度、或者通过使用表面活性剂。对微生物活动的防止可以通过不同的抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等等来进行。在许多情况下，优选的是包括等渗剂，例如糖类（例如葡萄糖、甘露醇或类似物）、缓冲剂、或氯化钠。可注射的组合物的长时间吸收可以通过延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和/或明胶来获得。

[0190] 无菌的可注射溶液可以通过将纳米轭合物以所要求的量掺入具有以上列举的各中其他成分的适当溶剂中来制备、如所要求的话接着进行过滤灭菌。在用于制备无菌的可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法可以包括真空干燥和冷冻干燥技术，这产生了这些活性成分加上在之前过滤灭菌的溶液中存在的任何另外的所希望成分的一种粉末。

[0191] 对于局部给药，纳米轭合物能以纯形式与一种液体组合使用。然而，普遍希望的是将该纳米轭合物作为组合物或配制品来给予皮肤，例如与皮肤病学上可接受的载体（可以是固体或液体）组合。

[0192] 有用的固体载体包括细分的固体，如滑石、粘土、微晶纤维素、硅石、氧化铝等等。有用的液体载体包括水、二甲亚砜（DMSO）、醇、二醇、或水-醇/二醇共混物，其中将一种纳米轭合物以有效的水平、任选地借助无毒表面活性剂进行溶解或分散。可以加入辅助剂如香料和另外的抗微生物剂以便对于给定的用途来优化其特性。所得的液体组合物可以从吸收垫中应用、用来加固绷带和其他敷料、或使用泵型或气溶胶喷雾器来喷雾到受影响的表面上。

[0193] 也可以将增稠剂例如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性的矿物与液体载体一起使用以形成可铺开的糊剂、凝胶、软膏、皂、等等，用于直接涂抹到使用者的皮肤上。

[0194] 用于将活性剂递送到皮肤上的皮肤病学组合物的实例是本领域已知的，例如参见Jacquet等人（美国专利号4,608,392）、Geria（美国专利号4,992,478）、Smith等人（美国专利号4,559,157）、以及Wortzman（美国专利号4,820,508）。此类皮肤病学组合物可以与在此说明的组合物组合使用。

[0195] 在此说明的纳米轭合物的有用剂量可以通过将其在动物模型中的体外活性与体内活性进行比较来确定。用于将小鼠和其他动物中的有效剂量外推到人类的方法是本领域已知的，例如参见美国专利号4,938,949。用于治疗中所要求的纳米轭合物或其活性盐或衍生物的量不仅随着所选择的具体化合物或盐而改变并且还随着给药途径、所治疗的病症性质、患者的年龄和状况改变，并且最终是由护理大夫或临床医师来决定。

[0196] 这些纳米轭合物可以适宜地以单位剂型来给药，例如每单位剂型包含5至2 2 2
1000mg/m、适宜地10至750mg/m、更适宜地50至500mg/m 的纳米轭合物。所希望的剂量可以按单次剂量呈现或者作为分开的剂量以适当的间隔来给药，例如按照每日两次、三次、四次或更多次子剂量。子剂量本身可以进一步划分成例如多次不连续的宽松间隔开的给药。

[0197] 在此说明的纳米轭合物可以是有效的抗肿瘤剂并且与纳米胶囊的配制品相比具有更高的疗效和/或减小的毒性。本发明提供了治疗哺乳动物的癌症的治疗方法，该治疗方法涉及对患有癌症的哺乳动物给药有效量的一种在此说明的纳米轭合物或组合物。哺乳动物包括灵长类、人类、啮齿类、犬齿类、猫科、牛族、羊族、马科、猪、山羊科、牛族等等动物。癌症是指任何不同类型的恶性新生物，例如前列腺癌、结肠癌、乳癌、黑色素瘤和白血病，并且总体上特征为不希望的细胞增生，例如不受调节的生长、缺乏分化、局部组织侵入、以及新陈代谢。

[0198] 本发明的纳米轭合物治疗癌症的能力可以通过使用本领域熟知的测定方法来确定。例如，治疗方案的设计、毒性评估、数据分析、肿瘤细胞杀死率的量化、以及使用可移植肿瘤筛查的生物学意义是已知的。

[0199] 以下实例旨在展示以上发明并且不应解释为缩小了其范围。本领域技术人员将容易认识的是，实例部分表明了可以实施本发明的许多其他方式。应当理解的是，可以做出大量的变更和修改而仍位于本发明的范围之内。

[0200] 实例

[0201] 实例1.适体涂覆的纳米轭合物

[0202] 材料、方法以及概述的试验细节。从梯希爱美国公司（TCI America，俄勒冈州波特兰）购买D,L-丙交酯（LA）、在甲苯中重结晶三次并在使用之前在手套箱中储存在-30°C。按照所公开的程序（J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志]2001;123:3229-3238）制备了β-二亚胺（BDI）配体和对应的金属络合物(BDI)ZnN(TMS)2并且在手套箱中在-30°C储存。通过使溶剂穿过氧化铝柱将无水溶剂纯化并通过用分子筛储存来保持无水。从LC实验室公司（LC Laboratories，马萨诸塞州沃本）购买紫杉醇（Ptxl）、并在使用之前在手套箱中储存在-30°C。其他化学物典型地是从西格玛奥德里奇公司（Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯）被按收到时原样使用。

[0203] 在凝胶渗透色谱仪（GPC）上测定PLA的分子量（MW），该色谱仪配备有等度泵（型号1100，安捷伦科技有限公司，加利福尼亚州圣克拉拉）、DAWN HELEOS 18角度激光散射检测器或Optilab rEX折光率检测器（怀雅特技术公司（Wyatt Technology），加利福尼亚州圣克拉拉）。HELEOS检测器的波长设定在658nm。将用于分离PLA或Ptxl-PLA轭合物的多个尺寸排阻柱（Phenogel柱和 5μm,300×7.8mm，菲罗门公司（Phenomenex），加利福尼亚州托伦斯）串联连接到GPC上。使用THF（HPLC等级）作为GPC的移动相。在System Gold系统（贝克曼库尔特公司（Beckman Coulter），加利福尼亚州富勒顿）上进行HPLC分析，该系统配备有一个126P溶剂模块、一个System Gold 128UV检测器、以及一个分析性五氟苯基柱（Curosil-PFP，250×4.6mm,5μ，菲罗门公司，加利福尼亚州托伦斯）。Ptxl分析的UV波长设定在227nm。在Varian UI500NB系统上（500MHz）进行NMR研究。在ZetaPALS动态光散射（DLS）检测器（15mW 激光器，入射束=676nm，布鲁克海文仪器公司（Brookhaven Instruments），纽约州霍尔茨维尔）上测定PLA NC的尺寸和多分散性。在台式冻干机（Freezone 2.5，飞世尔科技公司（Fisher Scientifc），宾夕法尼亚州匹兹堡）上进行NC的冻干。

[0204] Ptxl-LA100的制备和表征。在手套箱中，将Ptxl（8.5mg，0.01mmol）溶解在无水THF（2mL）中。加入(BDI)ZnN(TMS)2（6.4mg，0.01mmol）并允许其与Ptxl反应15-20分钟。将THF（1.2mL）中的LA（144.0mg，1.0mmol）滴加到Ptxl和(BDI)ZnN(TMS)2的剧烈搅拌的混合物中。使用FT-IR监控该聚合反应接着LA单体在1772cm-1的内酯谱带消失，或者使用1H-NMR通过监控LA单体在5.2-5.0ppm附近的次甲基(CH-)峰。在完成聚合之后，使用HPLC分析该聚合溶液的一个等分部分，以定量任何未反应的Ptxl从而确定Ptxl在Ptxl-PLA轭合物中的掺入效率。将所得的以LA/Ptxl之比为100（Ptxl-LA100）而制备的Ptxl-PLA轭合物用乙醚（10mL）进行沉淀、用醚和甲醇洗涤以去除BDI配体、在真空下干1
燥并通过GPC和 H NMR进行表征。通过TLC确认BDI从Ptxl-PLA中完全去除。

[0205] 通过纳米沉淀制备Ptxl-LA100NC的概述的程序。将DMF（或另一种水混溶性溶剂，例如丙酮）中的Ptxl-LA100轭合物（50μL，10mg/mL）滴加至纳米纯的水溶液（2mL）中。将所得NC在纳米沉淀之后通过DLS分析、通过超滤进行收集（5分钟，3000×g,10,000NMWL的Ultracel膜，密里博公司（Millipore），马萨诸塞州比尔里卡）、用水洗涤以去除DMF（或其他有机溶剂）、并然后通过SEM进行分析。

[0206] PLA-PEG多嵌段共聚物的合成。按照以上关于制备Ptxl-LA100所说明的程序，使用(BDI)ZnN(TMS)2作为催化剂和PEG作为引发剂来制备PLA-PEG嵌段聚合物。为了制备PLA-PEG二嵌段共聚物和PLA-PEG-PLA三嵌段共聚物（分别是LE5和LE5L，表1），在(BDI)ZnN(TMS)2的存在下使用mPEG5k-OH和HO-PEG5k-OH作为对应的引发剂。

[0207] 表1.PEG和PEG-PLA共聚物*

[0208]

[0209] *Mn=数均分子量；PDI=多分散性指数。化学物的缩写：mPEG5k-OH=单甲氧基聚(乙二醇)，分子量为5kDa；PLA=聚丙交酯；PLGA=聚(丙交酯-共聚-乙交酯)（LA/GA=50/50摩尔比）。

[0210] 概述的程序在手套箱中，将无水二氯甲烷（DCM、300μL）中的mPEG5k-OH（50mg、0.01mmol）与(BDI)ZnN(TMS)2的DCM溶液（6.5mg、0.01mmol、50μL）进行混合。将混合物搅拌15分钟。将LA的DCM溶液（144mg，1mmol，2.88mL）加入剧烈搅拌的PEG5k-OH/(BDI)ZnN(TMS)2溶液中。将该混合物在室温（约23°C）下搅拌16小时。以FT-IR通过监控-1
1772cm 处的丙交酯谱带来确定LA的转化率。将所得共聚物LE5用乙醚（10mL）沉淀、用醚和甲醇/乙酸（100/1(v/v)，10mL）洗涤以去除BDI配体、并在真空下干燥。通过NMR、HPLC和TLC确认BDI被完全去除。在该有机溶剂蒸发后，将所得产物（LE5）溶解在THF（10mg/mL）中并通过GPC分析。与LE5类似地制备LE5L并进行表征。LE5和LE5L二者的MW和分子量分布（MWD）在表1中列出。

[0211] 通过相继沉淀得到的Ptxl-LA100/LE5的形成和表征。将Ptxl-LA100轭合物（50μl，2mg/mL）的DMF溶液滴加到纳米纯的水溶液（2mL）中以给出Ptxl-LA100NC。将在DMF中的
4
LE5（Mn=1.9×10g/mol，2mg/mL,100μL）或mPEG5（k E5，2mg/mL，100μL）滴加到Ptxl-LA100NC中。将一个浓缩的PBS溶液（10×，228μL）加入该纳米沉淀溶液中使得最终的盐浓度等于
1×PBS。通过DLS测量NC尺寸。为了确定PBS溶液中NC的稳定性，通过DLS对粒度进行
30分钟测试（follow）。

[0212] 通过共沉淀（CPP）得到的Ptxl-LA100/LE5NC的形成和表征。将Ptxl-LA100轭合物（12mg/mL，50μL）的DMF溶液与LE5的DMF溶液（12mg/mL，50μL）进行混合。然后将混合物滴加到剧烈搅拌的水溶液（4mL）中。通过DLS对所得NC进行分析。

[0213] 通过共沉淀得到的Ptxl-LA100/LE5L的形成和表征。将Ptxl-LA10（0 8mg/mL，50μL）的DMF溶液与丙酮中的LE5（8mg/mL，50μL）进行混合。然后将混合物滴加到剧烈搅拌的水或PBS溶液（4mL）中。通过DLS对所得NC进行分析。通过DLS对PBS溶液中NC的稳定性进行10-30分钟测试。

[0214] PLGA-mPEG NP在冻干保护剂存在下的冻干。将PLGA-mPEG的丙酮溶液（5mg/mL，100μL）滴加到含NC的剧烈搅拌的水溶液（4mL）中以制造PLGA-mPEG NP。将一种冻干保护剂以选定的冻干保护剂/NC质量比（从2变化至20）加入剧烈搅拌的NC溶液中。然后将该溶液冻干、用2mL水复水并搅拌5分钟。通过DLS对所得NC的尺寸进行分析。

[0215] Ptxl-LA100/LE5LNC在白蛋白存在下的冻干。将Ptxl-LA100的丙酮溶液（4mg/mL，50μL）与LE5L的丙酮溶液（4mg/mL，50μL）进行混合。将混合物滴加到剧烈搅拌的水溶液（4mL）中。将所得NC溶液在通风橱中搅拌6小时以蒸发丙酮，然后通过DLS对所得NC溶液进行分析。将牛血清白蛋白（BSA）的水溶液（12mg/mL，500μL）加入该NC溶液中。将该混合物在室温（约-50°C）下冻干16小时。将所得白色粉末用纳米纯水（2mL）并然后添加浓缩的PBS溶液（10×，222μL）进行复水。将该溶液在室温下搅拌5分钟。通过DLS对所得NC溶液进行分析。

[0216] 适体与Cy5-LA50/PLA-PEG-COOH NC的轭合。按照所报道的程序（Tong和Cheng,J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志]2009;131:4744-4754）制备了Cy5-LA50。将Cy5-LA50/PLA-PEG-COOH NC（w/w=1/1，1mL，1mg/mL，在无DNase RNase的水中）用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）（400mM，200μL）和N-羟基丁二酰亚胺（NHS）（100mM,200μL）的水溶液在室温下孵育15分钟。使所得的NHS活化的NC与5'-NH2改性的A10PSMA适体（1μg/μL，在无DNase RNase的水中，50μL）进行反应。将所得的NC-适体生物轭合物用超纯水（15mL）通过超滤来洗涤（5min,1000×g,带有10,000NMWL的Ultracel膜,密里博公司（Millipore），马萨诸塞州比尔里卡）。使该适体改性的NC重新悬浮（1mg/TMmL，在无DNase RNase的水中）并通过荧光激活细胞分选术（FACS，BD FACScan 流式细胞测定器）和荧光显微术（Leica SP2激光扫描共焦显微镜）进行分析。

[0217] 荧光显微镜对Cy5-LA50/PLA-PEG-COOH NC-适体生物轭合物的细胞吸收的分析。使LNCaP和PC3细胞分别在RPMI介质1640和F-12介质（美国标准培养收集所）中的腔式载玻片中生长，用100单位/mL的水性青霉素G、100μg/mL的链霉素、以及10%FBS以能在
2
24内获得70%的合生的浓度（即，40,000细胞/cm）进行增补。在实验当天，将介质用含有Cy5-LA50/PLA-PEG-COOH（w/w=1/1,50μg）NC或Cy5-LA50/PLA-PEG-COOH NC-适体（NC-适体，50μg，5wt%的适体）的Opti-MEM介质（200μL）替换。将细胞和NC共同孵育2-6小时，此后将细胞用PBS（3×200μL）洗涤、用4%的甲醛固定、用Alexa-Flour 488 Phalloidin（英杰公司（Invitrogen），美国加利福尼亚州）复染色、安装在Leica SP2激光扫描共焦显微镜上并然后以40×的放大倍率进行分析。沿着z轴以0.8-μm的间隔收集图像并使用所提供的软件进行重构。

[0218] FACS对Cy5-LA50/PLA-PEG-COOH NC-适体生物轭合物的细胞吸收的分析。使LNCaP和PC3细胞分别在RPMI介质1640和F-12介质（美国标准培养收集所）中的24孔的板中生长，用100单位/mL的水性青霉素G、100μg/mL的链霉素、以及10%链霉素以能在24内获得2
70%的合生的浓度（即，40,000细胞/cm）进行增补。在实验当天，将细胞用预加温的PBS洗涤并用预加温的酚红还原的OptiMEM介质中孵育30分钟，然后添加Cy5-LA50/PLA-PEG-COOH（50μg）NC或Cy5-LA50/PLA-PEG-COOH NC-适体（50μg，5wt%的适体）。将细胞在37°C孵育4小时、用PBS（每孔2×500μL）洗涤并随后用带有EDTA的0.25%胰蛋白酶处理10分钟。将细胞转移到15-mL的falcon离心管中并以1200rpm离心5分钟、接着使用移液管去除胰蛋白溶液。在用PBS（2×500μL/孔）洗涤细胞后，在室温下将它们用4%的甲醛固定
10分钟、用PBS（1×500μL）洗涤并通过FACS进行分析。

[0219] 结果与讨论

[0220] Ptxl-LA100纳米轭合物的合成。为了确保在是室温下使用Ptxl作为引发剂时LA的快速且完全的聚合，使用了Coates及其同伴对于LA的聚合所开发的活
性催化剂(BDI)ZnN(TMS)2（图1a）（Chamberlain等人,J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志]2001;123:3229-3238）。我们实验室如之前一样进行了Ptxl的位置选择性引发接着是LA的受控聚合（Tong和Cheng,Angew.Chem.,Int.Ed.[德国应用化学国际
版]2008;47:4830-4834）。在将Ptxl与1当量的(BDI)ZnN(TMS)2混合之后，通过Ptxl的
2’-OH原位形成的(BDI)Zn-Ptxl醇盐（图1a）在室温下在数小时内引发并完成了LA的聚合，其中几乎定量的Ptxl并入了所得的PLA中（轨迹ii，图2）。

[0221] 通过Ptxl/(BDI)ZnN(TMS)2-介导的LA聚合溶液（LA/Ptxl之比为100）制备了4 4
Ptxl-LA100。得到的Ptxl-LA100的Mn为1.27×10g/mol，这与预期的Mn（1.52×10g/mol）非常相符。Ptxl-LA100还具有非常窄的分子量分布（MWD，Mw/Mn=1.03）(图3)，这与之前对于与Ptxl的受控LA聚合的(BDI)ZnN(TMS)2-介导的位置选择性引发的观察结果一致。分别以50和200的LA/Ptxl之比制备的Ptxl-LA50和Ptxl-LA200（Ptxl-PLA轭合物）也使用相同的方法进行了分析，得出具有预期的Mn和非常窄的MWD。这三种聚合物的GPC显示了单峰分子量分布图像（图3）。

[0222] Ptxl-PLA轭合物的合成是直接的。使用这种药物引发的聚合方法可以容易地制备具有良好受控的组成（Ptxl确切地通过其2’-OH基团连接到PLA链上）以及良好受控的MW的克规模的Ptxl-PLA轭合物并且将其用于制备NC。因此Ptxl-LA100是用于开发纳米颗粒药物递送系统的临床转译配方的一种适当候选物。

[0223] 通过纳米沉淀（NPP）形成Ptxl-LA100纳米轭合物。纳米沉淀（NPP）可以用于制备具有包埋在疏水聚合物基质中的治疗剂的NP。这种方法允许快速获得大量NP。典型地，将疏水聚合物与药物的混合物溶解在水混溶性有机溶剂（例如DMF或丙酮）中并然后滴加到剧烈搅拌的水溶液（V水/V溶剂=10至40）中。该有机溶剂到水中的瞬时扩散导致了聚合物/药物NP的形成。

[0224] Ptxl-LA100的NPP得到了具有单峰粒度分布以及小的多分散性的、小于100nm的Ptxl-LA100NC（图4）。在使用具有不同MW的Ptxl-PLA轭合物进行的数百的NPP实验中，基于DLS分析，很少看到具有多于一个粒度分布的NC。通过SEM分析已经确认了由Ptxl-PLA轭合物的NPP得到的窄的、单峰粒度分布的NC。NC的单峰粒度分别与典型地对于通过Ptxl与疏水聚合物的共沉淀（CPP）制备的NP（例如，PLA或PLGA（聚(丙交酯-共聚-乙交酯)））所观察到的单峰粒度分布有所不同（Cheng等人,Biomaterials[生物材料]2007;28:869-876）。由于NP的单峰分布一部分是由于未包胶囊的药物分子的聚集，因此Ptxl-LA100NC的所观察到的单峰粒度分布图像和非常低的多分散性可以归因于Ptxl-PLA轭合物的单分子结构。

[0225] NPP过程中Ptxl-LA100NC尺寸的控制（途径i，图1b）。粒度是NP的一个重要参数，并且尺寸对生物学分布、清除动力学、以及体内功效具有显著影响。关于生物学分布，希望的NP尺寸的上限典型地在200nm左右。具有200nm或更大直径的颗粒与其更小的对等物相比更有可能引发免疫响应并且被库弗细胞吸收，从而导致颗粒从循环中的快速清除。150nm或更小的颗粒可以通过脉管内皮的开窗术逸出并且从循环中被去除，而小于10和30nm的颗粒分别容易通过肾或淋巴结被清除。虽然在NP全身给药时何种NP尺寸会导致最有利的生物学分布和最高的体内疗效仍不完全清除，但NP直接应典型地低于约200nm。

[0226] 之前的研究揭示出，具有小于200nm的直径的NP可以在实体瘤中通过高通透和滞留效应（ERP）而被动地聚集，这是广泛用于改进NP在肿瘤组织中的滞留的一种机制。然而，具有低于200nm尺寸的NP在其体内生物学分布、肿瘤靶向效率、肿瘤渗透和抗癌效率方面仍可以在不同尺寸范围内大不相同。在此说明了具有不同尺寸范围的NC用于协助评估NC的生物学分布和抗癌功效与NC尺寸的相互关系。这样的信息随后可以用于体内靶向性癌症治疗。在此还说明了允许容易地配制具有精确受控的尺寸的NP的方法。使用Ptxl-LA100作为PLA-药物轭合物进行了一系列研究，以评估溶剂、Ptxl-LA100的浓度和表面活性剂会如何影响NC的尺寸。还进行了研究以确定如何可以制备出在PBS溶液中长时间不聚集或只有可忽略的聚集的NC以便促进其体内应用。

[0227] 首先研究了溶剂对Ptxl-LA100在水作为非溶剂时的NPP的影响。该有机溶剂与水的可混和性可以显著影响给定的溶剂/水系统中的NP尺寸。如图5中所示，Ptxl-LA100NC的尺寸和所用的这两种有机溶剂的水可混和性是非常相关的。在所有其他配制参数保持恒定时，水可混和性的增加导致了平均NC尺寸的降低。

[0228] 以DMF为溶剂（一种更加水混溶性的溶剂）而制备的Ptxl-LA100NC产生了更小的颗粒。这可能是由于在这种DMF/水NPP系统中向水中更有效的溶解扩散和聚合物分散。以丙酮（一种不及DMF水混溶性的溶剂）制备的Ptxl-LA100NC典型地比以DMF为溶剂在对应浓度下制备的NC大出了20-30nm（图5）。丙酮由于其低沸点而可以通过蒸发来容易地去除。相比之下，DMF典型地要求通过超滤然后过度洗涤来去除。因此，在丙酮/水系统中通过NPP进行NC配制是更容易的，这更适合于NC的大规模制备。

[0229] 然后研究了在NPP过程中Ptxl-LA100浓度对NC尺寸的影响。当在Ptxl-LA100的NPP过程中以固定的溶剂:水之比来改变聚合物浓度时（图5），观察到了NC尺寸与Ptxl-LA100浓度的线性相关性。当DMF中聚合物浓度从1mg/mL增加至10mg/mL时，NC的尺寸从90.9nm增大至195.3nm。以丙酮为溶剂对于Ptxl-LA100的NPP也观察到了类似的相关性（图5）。在DMF/水和丙酮/水NPP系统二者中，NC的多分散性在所有浓度下都保持非常低，对于从DMF/水和丙酮/水系统的NC分别是范围为0.061-0.128和0.081-0.168。由于NPP过程中NC尺寸与Ptxl-PLA轭合物浓度的线性相关性，可以简单地通过调节沉淀浓度来获得范围从80至250nm的任何所希望的尺寸的NC。

[0230] 通过Ptxl-LA100和LE5的相继沉淀来形成NC（途径ii，图1b）。专门对于体内药物递送应用设计了NC。希望的是具有延长的循环从而将其疗效最大化的NC。为了实现在循环中延长的滞留而被网状内皮系统的辨认减少，NC的尺寸和表面特性二者都必须进行良好控制。无适当表面改性的全身给药的NP通常在循环中被快速清除并且主要位于肝和脾中。严重的肝和脾滞留大大减小了NP接近肿瘤组织，而且还可能造成肝和脾损伤。清除率典型地是由于库弗细胞和脾脏巨噬细胞的清除作用。NP表面特性对血液调理具有关键的作用，血液调理是涉及被吞噬系统辨识的蛋白调理素的沉积，由此加速NP从血液中的清除。当对NP表面特征进行适当控制时，可以实质性减小NP的调理作用。用PEG对NP表面的改性，称为“PEG化”，可以减少蛋白结合。因此调理作用的抑制通过PEG化是可实现的并且可以用于将NP的循环半寿期从几分钟增加至几小时或几十小时。

[0231] Ptxl-LAn NC具有负的表面ζ电位并且在水中由于表面电荷排斥而保持不聚集。然而，在PBS中出现了NC的聚集，推测是由于盐引致的对排斥力的屏蔽（图6a）。因此对PEG化策略进行适配以便产生在盐溶液中聚集减少或消除了的NC。PEG化的NC还可以具有减小的蛋白结合以便用于体内应用。

[0232] PEG典型地共价轭合至NP的表面上。为了最小化在轭合化学中涉及的努力，开发了一种用PEG涂覆NC的直接沉积方法。使用mPEG与(BDI)ZnN(TMS)2的混合物通过LA的开环聚合来合成PLA-mPEG5k（LE5，表1），一种具有14kDa的PLA嵌段和5kDa的mPEG区段的两亲嵌段共聚物。将LE5滴加到Ptxl-LA100NC水性溶液中得到了Ptxl-LA100的快速涂覆，这是通过LE5的PLA区段以及疏水性NC表面的疏水作用。处理之后，Ptxl-LA100NC的尺寸从101.6nm增加至112.7nm。所得NC在PBS中至少30分钟保持不聚集（图6a）。

[0233] 为了证明PLA嵌段对非共价表面PEG化的重要性，我们将mPEG5k（E5，表1）加入NC溶液中然后添加PBS。没有疏水的PLA嵌段，E5不应该与NC形成稳定的相互作用。正如所预期的，在添加PBS后Ptxl-LA100/E5NC几乎立即形成了大的聚集体，是按照与PBS中的母体NC非常相似的聚集图案（图6a）。此外，通过DLS对LE5涂覆的Ptxl-LA100NC在处理前后的分析显示出，颗粒保持了它们的单峰分布图案（图6b）。DLS实验表明，LE5有利地沉淀在Ptxl-LA100NC的表面上而不是自我组装而形成微粒。所得的PEG涂覆的NC形成了一种核-壳型纳米结构，其中疏水聚合物-药物轭合物位于核内而LE5位于壳上，这是通过TEM研究所确认的。

[0234] 通过Ptxl-LA100和LE5的混合物的共沉淀来形成NC（途径iii，图1b）。Ptxl-LA100/LE5核-壳型纳米结构的形成可以按两个步骤进行：Ptxl-LA100的NPP而形成NC核、然后以LE5涂覆而形成PEG壳。以这样的分步方式制备盐稳定的NC是难以处理的，尤其是对于大规模的制备NC。希望的是在一个步骤中配制盐稳定的Ptxl-LAn NC。因此，研究了通过Ptxl-LA100与LE5的混合物的共沉淀（CPP）来配制盐稳定的NC。

[0235] 将Ptxl-LA100在DMF中与LE5以1:1的质量比混合，这是贯穿以下实验所使用的固定比率。然后使该混合物在纳米纯水中沉淀（VDMF/V水=1/40）。观察到了随着聚合物浓度的增加，粒度的线性增加（图7a），遵循与之前对于图5讨论的Ptxl-LA100的NPP相似的趋势。当Ptxl-LA100浓度从2mg/mL增加至10mg/mL时，NC的尺寸逐步从61.4nm增大至121.0nm。当使用丙酮为溶剂时，观察到了NC尺寸与Ptxl-LA100浓度的类似的线性相关性。当Ptxl-LA100浓度从2mg/mL增加至10mg/mL时，NC的尺寸从79.2增大至145.9nm。后一种情况下获得的NC（Ptxl-LA100/LE5从丙酮到水的CPP）比以DMF为溶剂在对应浓度下制备的NC粗略地大出20-25nm，类似于图5中说明的溶剂效应。

[0236] 在DMF/水和丙酮/水系统二者中制备的NC均显示了窄分散的、单峰的粒度分布，如通过NPP在丙酮中以6mg/mL的浓度制备的Ptxl-LA100/LE5NC所例证的（图7b）。然后评估NC在PBS中的稳定性。在使Ptxl-LA100和LE5（Ptxl-LA100=4mg/mL）在水溶液中的混合DMF溶液（VDMF/V水=1/40）沉淀后，然后将PBS添加所得的NC溶液中，基于DLS分析，这些颗粒长时间保持不聚集。

[0237] 通过Ptxl-LA100和LE5L的混合物的共沉淀来形成NC（途径iv，图1b）。为了进一步简化NC的配制，确定了是否有可能在PBS溶液中直接配制稳定的NC。当使Ptxl-LA100与LE5的混合物在PBS中直接共沉淀时，所得的NC在PBS中不稳定并且快速形成大的聚集体（图8）。粒度在6分钟内从83nm增加至197nm。有趣的是，当将LE5L（表1），这是一种以PEG为B嵌段（MW=5kDa）并且PLA为A嵌段（MW=14kDa）的ABA型三嵌段共聚物与Ptxl-LA100以1:1的质量比在DMF中混合并随后在PBS中沉淀，发现所得Ptxl-LA100/LE5LNC在PBS中出乎意料地稳定并且长时间保持不聚集（图8）。

[0238] 为了比较对NC配制的非溶剂效应，在PBS和水二者中以不同浓度进行了Ptxl-LA100/LE5L的CPP。当使用水作为非溶剂时，在混合物浓度从2mg/mL增加至10mg/mL时，Ptxl-LA100/LE5L NC的尺寸逐步从66.8nm增大至125.5nm。Ptxl-LA100与LE5L的混合物在水中或向PBS中的CPP显示出了Ptxl-LA100浓度与NC尺寸的线性相关性（图9），这与之前报道的Ptxl-LA100在水中的NPP相类似（图5）。当以PBS为非溶剂进行CPP时，NC的尺寸与一水为非溶剂制备的NP所得的那些相比典型地大出20-40nm并且与Ptxl-LA100浓度遵循一种线性趋势。当混合物中Ptxl-LA100浓度从2mg/mL增加至10mg/mL时，NC的尺寸从99.0增大至156.5nm（图9）。在不同浓度下制备的NC全都在PBS中长期保持不聚集。

[0239] 三嵌段LE5L和二嵌段LE5以不同的方式自我组装。LE5形成星状微粒，而LE5L由于其ABA型的两亲结构，趋向于形成花状微粒（图1b）。花状微粒中的疏水聚合物趋向于与星状微粒相比具有更强的相互作用，这可能有助于形成具有稳定涂覆的PEG壳并且在PBS溶液中的稳定性增强了的Ptxl-LA100/LE5LNC。

[0240] Ptxl-PLA NC的冻干和储存。用于体外或体内实验室研究的在PBS中保持不聚集的小规模NP的配制是较容易控制的。然而，为了有助于其临床转译，NP必须以良好受控的特性大量制备，这些特性需要在其临床使用之前的制造、储存和传输过程中保持不变。在Ptxl-PLA中，由于Ptxl是通过酯键共价轭合至PLA上，该酯键在暴露于水中时发生水解，因此在上述过程中在水性溶液中处理NC是不希望的。NC典型地必须以固体形式配制以便它们被临床使用。

[0241] 基于PLA的NP在冻干过程中易于聚集。如所预期的，当具有小于100nm的尺寸的Ptxl-LA100/LE5或Ptxl-LA100/LE5L NC被冻干、复水并通过DLS进行分析时，观察到微米尺寸的、不可分散的聚集体。具有微米尺寸的聚集体的聚合物NP通过尾静脉注射的给药导致老鼠立即死亡。

[0242] 已经有许多研究使用了冻干保护剂来在冻干过程中物理地分离NP以免聚集。单糖或二糖，如蔗糖、右旋糖、麦芽糖、山梨糖醇、葡萄糖，被频繁地用作冻干保护剂，因为它们具有生物相容性和低成本（Musumeci等人,J.Nanosci.Nanotechnol.[纳米科技]2006;6:3118-3125）。在我们实验室进行了关于使用蔗糖作为冻干保护剂来冻干PLGA-mPEG5k NP的研究（Biomaterials[生物材料],2007;28:869-876）。虽然在冻干过程中PLGA-mPEG5k NP的聚集减少了，但是仍观察到形成了显著量的、大的、不分散的聚集体。
因此使用基于PLGA-mPEG5k的NP屏蔽了大量的冻干保护剂。比较这些冻干保护剂与蔗糖的防止NP聚集的能力（表2）。

[0243] 表2在不同冻干保护剂存在下冻干的PLGA-mPEGNP的表征以及通过水的复水a[0244]a 3

[0245] 使用PLGA-mPEG5k（Mn=19.4×10g/mol）来研究冻干保护剂的效率。初始的PLGA-mPEG NP具有62.7nm的直径，是通过PLGA-mPEG至水中的NPP配制的。完成NPP之后，在冻干之前已选定的冻干保护剂/NP质量比来添加对应的冻干保护剂。b

[0246] SDS=十二烷基硫酸钠；BSA=牛血清白蛋白。c

[0247] Wc/WNP=冻干保护剂化学物与NP的质量比。d

[0248] PDI=多分散性；STD=标准偏差。e

[0249] Distr.No.=粒度分布的数目；N.D.=没有确定。f

[0250] SL/SO=冻干后的NP尺寸与冻干前的NP尺寸之比。g

[0251] Aggr.=可见的大附聚体；Y=观察到聚集体；N=没有观察到聚集体。

[0252] 通过PLGA-mPEG5k的纳米沉淀（表1）如之前说明的来制备PLGA-mPEG5k NP（Biomaterials (生物材料),2007;28:869-876）。标准的基于糖的冻干保护剂，如蔗糖、山梨糖醇、麦芽糖、右旋糖、和甘露糖能够在某种程度上减少NP聚集，当NP与这些冻干保护剂一起冻干时（表2）。发现高的冻干保护剂化学物/NP之质量比（Wc/WNP）就减少NP聚集而言是更有效的。然而，即使在高达10的Wc/WNP比下，在所有基于糖的系统中都观察到了显著的NP聚集。

[0253] 这些NP在冻干之后的DLS分析显示了单峰的粒度分布。一些大的、不可分散的聚集体从溶液中沉淀出来并且甚至是肉眼可见的。其他糖，例如半乳糖，根本不能防止NP聚集，即使在冻干保护剂/NC质量比为10时。还将氨基酸（例如甘氨酸）和表面活性剂（例如SDS）作为冻干保护剂进行了评估并且发现，它们不能在冻干过程中防止NP聚集（表2）。

[0254] 由于所测试的小分子均不能有效防止冻干过程中的NP聚集，因此评估了大分子以便潜在地提供NP冻干过程中更好的冻干保护。将牛血清白蛋白（BSA）作为NP的冻干保护剂进行了评估。在BSA/NP质量比为2时，NP尺寸增大了8.2倍，从冻干前的62nm增大至冻干后的512nm。观察到了两个粒度分布。在BSA/NP质量比增加至6和10时，冻干后的NP的尺寸相应地变为176nm和114nm。这粗略地对应于冻干前的NP的2.8倍和1.8倍。使用白蛋白允许获得具有小于200nm直径的、完全分散的冻干后NP而绝对没有沉淀物。复水的NP显示了单峰的粒度分布，如通过DLS确定的。

[0255] 然后对于白蛋白稳定化Ptxl-LA100/LE5L NC进行评估。首先通过如之前对图9说明的共沉淀来制备Ptxl-LA100/LE5L NC。所得NC的粒度和多分散性分别是88.9nm和0.092，如通过DLS确定的（图10(a)）。在以15的BSA/NC质量比冻干然后用1×PBS复水之后，NC尺寸轻微增加至105.9nm（图10(b)）但在DLS分析过程中在至少10分钟内保持不聚集。通过DLS分析，确认了单峰的粒度分布。NC的多分散性保持低至0.112。将这个实验重复多次，获得了一致的且高度可重现的结构，并且在每次重复的实验中都没有NC聚集。由于白蛋白的生物相容性，这种基于白蛋白的冻干保护策略可以广泛用于药物递送或其他转移应用的固体配制品中。

[0256] 用于前列腺癌靶向的Ptxl-PLA NC。适体是特异性地结合至目标配体上的单链DNA或RNA。在此使用的适体是选自通过组合过程而具有无规则序列的核酸库，称为指数富集配体系统进化（SELEX）。当用于癌靶向时，适体能够以极高的亲和力和特异性结合至目标抗原上，是以一种类似于抗体介导的癌靶向的方式。适体典型地是非免疫原性的并且展示出对pH、温度和溶剂显著的稳定性。适体的合成是一个化学过程并且因此显示出可忽略的批次到批次的不一致性。适体的这些罕见特性与典型地对温度和pH变化不稳定的抗体形成强烈对比，是免疫原性的并且具有显著的批次到批次变化性。

[0257] 将在所有嘧啶上具有2'-氟改性的核糖和3'-反向脱氧胸苷帽的A10适体通过SELEX进行鉴定并用来靶向细胞外的前列腺特异性膜抗原（PSMA）。该A10适体结合至PSMA阳性的LNCaP前列腺癌细胞上但不结合至PSMA阴性的PC3前列腺癌细胞上。PLGA-A10适体生物轭合物也能够在体外和体内靶向LNCaP细胞。

[0258] 使用Cy5（具有羟基的荧光染料）来引发LA聚合以制备Cy5-PLA并随后将Cy5-PLANC用于体外癌靶向的研究（Tong和Cheng,J.Am.Chem.Soc.[美国化学会
志]2009;131:4744-4754）。使胺封端的A10适体在EDC和NHS才存在下通过羧酸-胺偶联反应而轭合至PLA-PEG-COOH/Cy5-PLANC（粒度132.8nm，多分散性为0.031）上，以给出适体/PLA-PEG-COOH/Cy5-PLA NC（适体-Cy5 NC）。在通过离心纯化适体-Cy5 NC并用PBS洗涤NP之后，发现A10适体轭合之后适体-Cy5NC的尺寸轻微增大至157.1nm，多分散性为
0.144。

[0259] 然后将新鲜制备的适体-Cy5 NC用于LNCaP（PSMA+）和PC-3(PSMA-)细胞，并且通过荧光激活细胞分选（FACS）流式细胞仪来评估它们的结合和内化。用适体-Cy5 NC孵育4小时后的LNCaP细胞（PSMA+）的平均荧光强度是376.7（FACS Cy5通道上的任意强度单位），相比之下对于PS3细胞（PSMA-）是72.4并且在未处理的LNCaP细胞中是16.4。适体-Cy5 NC处理的LNCaP细胞的荧光强度与在相同条件下处理过的PC-3细胞相比高出5.2倍，表明适体-Cy5 NC与PSMA+LNCaP细胞的结合增强并且潜在地改进了NC内化。

[0260] 然后进行了适体-Cy5 NC内化进入LNCaP细胞的动力学研究。用适体-Cy5 NC处理了2小时的LNCaP细胞揭示了136.2的平均荧光强度，相比之下未处理的细胞是16.4。当用适体-Cy5 NC将LNCaP细胞处理6小时，平均荧光强度增大至779.8，表明多了5.7倍的NC被内化到细胞中。这些观察结果是使用共焦显微学通过摄取成像研究进行确认的。当NC涂覆适体时，Cy5 NC到LNCaP细胞内的摄取得到显著增强。用LNCaP细胞将适体-Cy5 NC孵育更长时间得到了显著增加的NC内化。由于PC3不表达PSMA蛋白，因此在适体-Cy5 NC与无适体的Cy5NC之间就其细胞结合和内化能力而言基本上没有差异。用NC将PC3细胞孵育更长时间得到了略微增加的NC摄取。适体-Cy5 NC与PC3细胞的结合比对LNCaP细胞的结合显著更弱。这些体外研究证明，与适体靶向配体轭合的NC可以用于前列腺癌靶向。

[0261] 因此，当使用白蛋白作为冻干保护剂时可以将NC配制成固体形式。适体-Cy5 NC也可以制成固体形式并然后复水以给出具有类似尺寸和靶向能力的NC。在BSA/适体-Cy5 NC质量比为10时，冻干并复水后的适体-Cy5 NC的尺寸为212.6nm（多分散性为0.386），相比之下冻干前的NC为157.1nm（多分散性为0.144）。DLS分析表明，冻干并复水后的适体-Cy5 NC维持了单峰的尺寸分布。然后将复水的适体-Cy5 NC用于细胞结合研究并通过FACS进行分析。发现其靶向能力在冻干过程中得到很好的保持。

[0262] 实例2.白蛋白冻干保护

[0263] 如以上在实例1中说明的，可以使用白蛋白作为冻干保护剂来消除冻干的纳米颗粒的聚集，例如不同的基于聚合物的纳米颗粒，包括药物-聚合物纳米轭合物在内。在此说明的白蛋白冻干保护剂方法可以扩展至各种胶体系统，除了纳米轭合物组合物之外。对于许多亚微米的颗粒，长期储存中的不稳定性可能限制其否则将宽广的临床应用。为了解决不稳定性问题，将这些颗粒与白蛋白共同配制，例如在实例1中说明的。该白蛋白可以是哺乳动物血清白蛋白，例如牛血清白蛋白或人血清白蛋白。

[0264] 可以使用白蛋白冻干以提供不聚集的固体形式制品的、基于聚合物的颗粒的实例包括生物可降解聚合物，例如聚丙交酯、聚乙二醇、以及他们的共聚物聚(丙交酯共聚乙交酯)；聚己酸内酯；聚丙烯酸酯；聚酐；聚(邻酯)；聚(氨基酯)；多肽；以及多糖；连同不可生物降解的聚合物，例如聚丙烯酸化物、聚(氯乙烯-共聚-乙酸酯)、聚苯乙烯、以及它们的共聚物。白蛋白冻干保护方法还可以扩展至交联的聚合物网络，例如用于支架、缝合、或组织移植的那些，它们包括上述聚合物或其共聚物中的一种或多种。胶体的无机微粒系统也可以使用白蛋白进行冻干保护。适合的胶体系统的实例可以包括碳纳米管、单层石墨、量子点、氧化铁、硅石微粒、金属有机框架、金纳米颗粒、银纳米颗粒、铂纳米颗粒、不同的金属氧化物纳米颗粒、以及它们的混合物。这些白蛋白冻干方法可以进一步扩展至有机-无机混杂的胶体系统。常规的脂质体递送运载体和对应的脂质体与纳米颗粒的混合物也可以使用白蛋白进行冻干保护。

[0265] 实例3.冷冻干燥后体外适体靶向能力的确认

[0266] 如以上说明的，已经证明当使用白蛋白作为冻干保护剂时NC可以配制成固体的不聚集的配制品。申请人然后测试了适体-Cy5 NC是否可以制成固体形式并然后复水以给出具有类似尺寸和靶向能力的NC。

[0267] 在BSA/适体-Cy5 NC质量比为10:1时，冻干并复水后的适体-Cy5 NC的尺寸为212.6nm（DLS多分散性为0.386），相比之下冻干前的NC为157.1nm直径（多分散性为0.144）。DLS分析表明，冻干并复水后的适体-Cy5 NC维持了单峰的尺寸分布。然后将复水的适体-Cy5 NC用于细胞结合研究并通过FACS进行分析；发现相比于无适体的颗粒在冷冻干燥之后（图12），在冻干过程中它们的靶向能力得到很好的保持（图11）。这些结果证明，如在此说明的配制的NC可以进行临床转译并且适合于治疗人的癌症。

[0268] 实例4使用PLA-Ptxl NC的肿瘤预防/抑制研究

[0269] 为了在模仿当手术切缘接近肿瘤时可能存在的显微疾病的体内模型中评估紫杉醇负载的纳米颗粒抑制肺癌出现的能力，在快速生长的皮下肿瘤模型中对Ptxl-PLA NC进行评估。确切地说，评估了与单独的Ptxl（在临床配制品中）以及不含任何药物的对照物相比Ptxl-PLA NC防止在C57Bl/6雌鼠中快速生长的LLC肿瘤形成的能力。在这些实验中，将1,000,000LLC肿瘤细胞加Ptxl-LA25/PLGA-mPEG纳米颗粒（含总剂量5或50mg/kg的并入的Ptxl）经皮下注射到老鼠的肋腹中。其他组接收单独的1,000,000LLC细胞或与Ptxl混合并以1:1克列莫佛EL/乙醇增容的LLC细胞的注射，如临床上使用的5mg/kg剂量。

[0270] 25天时，在LLC细胞与单独的介质或单独的紫杉醇共同注射的位置注意到了大的肿瘤。相比之下，接收LLC细胞加紫杉醇负载的纳米颗粒的部位显示肿瘤或肿瘤负担的发病率实质性减小。30天时，在将LLC细胞与5mg/kg的Ptxl-LA25N共同注射的部位注意到了生长的肿瘤；而对于被共同注射了50mg/kg的Ptxl-LA25NC的组，肿瘤尺寸保持不变（图13），因此证明NC的抑制能力。接收了除Ptxl负载的NC（50mg/kg）外所有其他治疗方案的动物快速形成大肿瘤这一观察结果表明，NC对于Ptxl和在此说明的其他药物是一种有效的药物运载体。

[0271] 实例5.PLA-Doxo NC毒性的体内评估

[0272] 进行balb/c小鼠组织切片的组织学分析（图14）。对小鼠喂服（静脉内）阿霉素（“Doxo”）（8mg/kg）、PLA-PEG-PAM/Doxo-LA25（8和16mg/kg）、盐水、和空白NP。来自小鼠的肾的组织切片显示，阿霉素（8mg/kg）对肾有严重毒性，而具有16mg/kg阿霉素当量的NC没有显示任何对肾组织的毒性。这些结果证明，如在此说明的配制的NC可以进行临床转译并且与以非轭合的形式给药的药物相比是较无毒的。

[0273] 实例6适体-PLA-NC的体内肿瘤靶向

[0274] 选择帕米膦酸盐（PAM），这是一种众所周知的二膦酸盐药物，作为靶向配体来进行骨肿癌的化学治疗。将PAM用EDC/NHS通过轭合反应而轭合至PLA-PEG-COOH上。将所得的PLA-PEG-PAM 通过透析进行纯化。将Doxo-LA25与PLGA-mPEG/PLA-PEG-PAM在DMF中混合并进行纳米沉淀以制备平均直径为126nm的NP。

[0275] 为了验证Doxo-LA25/PLA-PEG-PAM NP对骨肿瘤治疗的潜力，在balb/c小鼠的组织学研究中评估了NP对组织的毒性。在通过苏木精和曙红染色之后，在用8mg/kg Doxo治疗的组中发现了肾组织损伤；而在接收带有相同或两倍的Doxo当量剂量（8和16mg/kg）的NP的组以及对照物中没有发现肾组织毒性。此外，PLA-PEG-PAM NP本身并没有在组织学组织分析中展示出体内毒性（图14）。该研究证明，Doxo-LA25/PLA-PEG-PAM可以进一步用于骨癌治疗的临床前研究。通过将PLA-PEG-PAM NP（50mL盐水溶液，3mg/mLNP）输注给狗（n=5）也确认了体内组织毒性，并且甚至在输注之后的数天也没有观察到严重或异常的症状。

[0276] 注意到PAM可以标记有99mTc益用于实时体内成像，从而有助于对靶向过程的监控。在开发诊断性放射性药物中将放射性核素锝-99m的最佳衰变特征用于靶向分子中的99m
潜力是最优先考虑的。 Tc-标记的放射性药物因其同位素的理想的特性以及从商业发生
99m
柱（generator column）的宽广可得性而优于其他同位素。 Tc发射89%丰度的140keVγ射线，这对于用商业γ相机成像是理想的。

[0277] 将PLA-PEG-PAM NP在盐水和还原剂SnCl2中用钠99mTcO4原位标记并快速用于狗的体内骨肿瘤靶向研究。在狗的一条腿中生长骨肿瘤并通过X射线分析进行确认。在γ99m
相机图片中观察到了带有 Tc标记的PLA-PEG-PAM NP的累积，并且其量值随时间增大，甚至在注射后仅2小时（图15）。对狗的全身生物学分布分析显示，在输注后2小时NP没有在肝和肾中累积，表明带有PAM的NP可以在体内快速靶向至骨肿瘤。注意到了30小时之后
99m
在膀胱部位的强度也增大了，从而表明了 Tc试剂在长时间之后可能与NP分离。

[0278] 图15展示了用于狗的骨肿瘤的、以99mTc标记的PLA-PEG-PAM NP的体内成像：X射99m 99m
线和 Tc放射性γ成像，一侧被植入了肿瘤的狗的(a)前视图和(b)侧视图。 Tc放射性图片的强度（黑色）面积表示NP的累积。(c)注射后1小时（上）和2小时（下）在骨肿瘤中NP累积的动力学研究。(d)注射后5分钟时NP在狗中的全身生物学分布（俯视图）。部位编号：1：侧面隐静脉（NP输注部位）；2：尾部大静脉；3：膀胱；4：左肾；5：右肾；6：肝；7：
心脏。

[0279] 图16进一步展示了适体-NC的体内肿瘤靶向。该肿瘤模型是对犬有害的内皮肿瘤线SB-HAS的移植（用于PSMA适体靶向），肿瘤新血管系统的模型。将五百万细胞注入NOD-SCID小鼠的肋腹并允许小鼠生长约4个月。在肿瘤生长到约10mm x 10mm之后，通过PLA-PEG-NIR/PLA-PEG-适体（NIR：近红外花青染料）的静脉内注射来治疗小鼠。四个小鼠接受这治疗并显示出适体颗粒的肿瘤累积的清楚证据（图16）。初步的生物学分布分析显示对肿瘤的%ID/g（ID：注射剂量）为7.83%（比之前的LNCaP前列腺癌模型更高）；脾和肝分别是40.10和18.28。这些结果证明，如在此说明的配制的NC可以进行临床转译并且具有在已知治疗的基础上显著改进的特性。

[0280] 实例7.药物剂型

[0281] 以下配方展示了可以用于在此说明的组合物（此后称为“组合物X”）的治疗或预防性给药的代表性药物剂型：

[0282]

[0283]

[0284]

[0285]

[0286] 这些配制品可以通过制药领域熟知的常规技术制备。将会了解的是以上药物组合物可以根据熟知的制药技术进行改变以便适应不同的量和类型的活性成分“组合物X”。气溶胶配制品(iii)可以与一种标准的、计量的气溶胶分配器结合使用。另外，这些具体的成分和比例是用于展示的目的。根据感兴趣的剂型的希望特性，成分可以换成适当的等效物并且可以改变比例。

[0287] 本领域普通技术人员将了解的是，除这些明确例示的之外的起始物料，例如环状单体、药物和具有至少一个羟基的其他物种、生物材料、试剂例如开环聚合催化剂、合成方法、纯化方法、分析方法、测定方法、以及生物方法也可以用于实施本发明而无需采取过度的实验。任何这样的物料和方法的所有本领域已知的功能等效物都旨在包括在本发明之内。已经采用的术语和表述是作为描述而非限制的术语使用的，并且无意使得在此类术语和表述的使用中排除所示出和描述的这些特征或其部分的任何等效物，而是应认识到在要求保护的本发明的范围内有可能进行不同的变更。因此，应当理解的是，尽管已经通过优选的实施方案和任选的特征明确披露了本发明，但本领域技术人员可以寻求在此披露的这些概念的变更和改变，并且此类变更和改变应被认为是位于如通过所附权利要求而限定的本发明的范围之内。

[0288] 虽然以上关于所披露的实施方案和实例描述了具体的实施方案，但这些实施方案和实例仅是展示性的并且不限制本发明的范围。可以根据本领域的普通技术来进行改变和变更，而不背离本发明如在以下权利要求书中限定的较宽方面。

[0289] 所有的公开文件、专利和专利文件都通过引用结合在此，就好像单独地通过引用结合在此一样。已经关于不同的具体的和优选的实施方案以及技术对本发明进行了说明。然而，应当理解的是，可以做出许多变更和修改而仍位于本发明的精神和范围之内。

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