黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MdUGT75B1基因及其编码蛋白和应用
阅读：501发布：2020-05-16
专利汇可以提供黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MdUGT75B1基因及其编码蛋白和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 黄 酮 醇 3‑O‑半乳糖基转移酶MdUGT75B1基因，该基因从苹果 果皮 中分离获得，其核苷酸序列如SEQ:NO.1所示，其编码蛋白的 氨 基酸序列如SEQ:NO.2所示。本发明首次克隆并验证了苹果黄酮醇3‑O‑半乳糖苷合成相关的MdUGT75B1基因的功能。通过构建重组质粒，实现了MdUGT75B1基因在大肠杆菌中的重组表达，并得到纯化的重组蛋白。在体外，重组蛋白可以高效地将槲皮素转 化成 槲皮素3‑O‑半乳糖苷。本发明可用于 植物 黄酮醇糖苷的 生物 合成调控，应用于植物黄酮醇含量和组分改良的基因工程中，并为实现黄酮醇糖苷类物质商品化生产提供了代谢工程 基础 。，下面是黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MdUGT75B1基因及其编码蛋白和应用专利的具体信息内容。
黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MdUGT75B1基因及其编码蛋白和
应用
技术领域
背景技术
[0002] 苹果(Malus×domestica)系蔷薇科李属果树，是世界五大栽培果树之一，因果实的甘甜风味及其保健功效而受广大消费者喜爱。黄酮醇是苹果果实中富含的一类重要的黄酮类化合物，具有消炎，抗肿瘤，抗氧化，保护神经系统，预防心血管疾病和糖尿病等医药学活性，且在植物生长发育和抵抗逆境等方面具有重要作用。
[0003] 黄酮醇通常以糖苷的形式存在于植物细胞的液泡中，苹果中的黄酮醇主要为槲皮素及其糖苷，包括槲皮素3-O-半乳糖苷、槲皮素3-O-芸香糖苷和槲皮素3-O-鼠李糖苷等。糖基化主要发生在细胞质中，在糖基转移酶的催化下，将糖基从活化的供体分子转移到受体分子上，是一种广泛存在的化合物修饰方式，也是许多次生代谢产物合成反应的最后一步。糖基化可以改变黄酮醇化合物的亲水性，增加其溶解度和化学稳定性，影响其生物活性，有助于其在细胞内和生物体内的储存和转运等。
[0004] 糖基转移酶(glycosyltransferase,GT,E.C.2.4.x.y)是负责催化生物体内糖基化反应的酶类，它们将活性糖基从活化的糖基供体转移到糖基受体，形成糖苷键。其中的GT1家族，由于其C末端含有1个由44个氨基酸组成的保守序列，该保守序列被认为是糖基化过程中与UDP-糖的结合的区域，所以被称为PSPG-box，据此将GT1单独归类为一个尿苷二磷酸糖基依赖的转移酶超家族(UGTs)，其成员主要以UDP-葡萄糖，UDP-半乳糖，UDP-鼠李糖和UDP-葡糖醛酸为糖基供体。
[0005] 由于糖苷化产物具有潜在的药用价值以及对植物生命活动调节的重要性，现在已受到人们的广泛关注。因此鉴别出苹果黄酮醇糖苷生物合成相关的糖基转移酶，对于阐明苹果黄酮醇糖苷生物合成途径有重要意义，也可用于其他植物基于基因工程技术的黄酮醇组分改良，对提高食物中的黄酮醇含量，增加食物的保健功能，具有重要的应用价值。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一种黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MdUGT75B1基因，其核苷酸序列如SEQ:NO.1所示的，该基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ:NO.2所示。
[0007] 本发明提供的一种黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MdUGT75B1基因，是从苹果果皮中分离获得，为一种尿苷二磷酸半乳糖依赖的黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MdUGT75B1基因。
[0008] 本发明的另一个目的是提供所述黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MdUGT75B1基因及其编码蛋白在合成黄酮醇3-O-半乳糖苷中的应用。将上述黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MdUGT75B1基因连接到pET-32a(+)载体的多克隆位点中构建获得重组质粒，命名为pET-32a(+)-MdUGT75B1。在大肠杆菌中表达pET-32a(+)-MdUGT75B1，得到MdUGT75B1重组蛋白，可将黄酮醇转化成黄酮醇3-O-半乳糖苷。
[0009] 本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MdUGT75B1基因及其编码蛋白和应用，首次克隆并验证了苹果黄酮醇3-O-半乳糖苷生物合成相关糖基转移酶MdUGT75B1基因的功能，在体外，MdUGT75B1重组蛋白可以高效地将槲皮素转化成槲皮素3-O-半乳糖苷。本发明还提供了含有MdUGT75B1基因的重组质粒，为通过生物工程方法大量合成黄酮醇3-O-半乳糖苷，本发明提供了一种能大量合成黄酮醇3-O-半乳糖苷的途径，进一步开展黄酮醇糖苷生物合成调控研究奠定基础。附图说明
[0010] 图1：光照处理实验中苹果果皮中槲皮素3-O-半乳糖苷含量检测和MdUGT75B1基因表达分析。
[0011] 图2：MdUGT75B1氨基酸序列比对结果；CsUGT78A15(KP682361)，F3GT(AAD55985)，VVGT6(AB499075)。
[0012] 图3：MdUGT75B1重组蛋白SDS-Page凝胶图。
[0013] 图4：重组蛋白MdUGT75B1对槲皮素体外酶活分析HPLC图谱。
[0014] 图5：黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶的催化流程图与化学结构式；以槲皮素为糖受体，UDP-半乳糖为糖供体，经MdUGT75B1催化生成槲皮素3-O-半乳糖苷。
具体实施方式
[0015] 下面对本发明的实施例和附图作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0016] 实施例1：
[0017] 一、材料
[0018] 1、苹果品种：红富士(Malus pumila Mill)，以果实为材料，开展了蓝光(BL)加UV-B处理。设置三个生物学重复，每个重复4个果实，取果实样品外果皮1mm厚的皮层组织，迅速用液氮冻透，然后放至-80℃冰箱中保存。
[0019] 2、pET-32a(+)载体：购于长沙优宝生物科技有限公司。
[0020] 3、大肠杆菌BL21(DE3)PlysS表达宿主菌株：购于上海普洛麦格生物产品有限公司。
[0022] 5、UDP-半乳糖溶液(10mg/mL)：称取10mg UDP-半乳糖，融于超纯水，定容至1mL，-20℃保存。
[0023] 6、氨苄青霉素母液(Amp+，500mM)：称取9.3mg氨苄青霉素钠Amp，溶于50mL灭菌超纯水，过滤除菌，分装小管，-20℃保存。
[0024] 7、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷IPTG(500mM)：称取5.95g IPTG，溶于灭菌超纯水，定容至50mL，过滤除菌，分装小管，-20℃保存。
[0025] 8、蛋白纯化试剂盒：Clontech HisTALON试剂盒，购于Takara宝生物工程有限公司。
[0026] 9、Tris-HCl缓冲液(pH 7.5，100mM)：称取1.1214g Tris加水至90mL搅拌溶解均匀，加HCl调pH至7.5，补水定容至100mL。
[0027] 二、MdUGT75B1的基因表达和黄酮醇糖苷含量的检测
[0029] 2、以苹果MdActin为内参基因，序列如SEQ:NO.3所示，引物为SEQ:NO.4和SEQ:NO.5，MdUGT75B1基因的引物为SEQ:NO.6和SEQ:NO.7，进行实时定量PCR分析其基因表达。反应体系包括10μL Ssofast EvaGreen Supermix(Bio-Rad)，上下游引物(10μM)各1μL，2μL cDNA，6μL H2O。反应程序为：95℃反应3min；95℃反应10s，60℃反应30s，循环45次；95℃反应10s；溶解曲线65℃to 95℃，每5s上升0.5℃；结束。所用仪器为Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪，每次检测都包括以H2O作反应模版的阴性对照。
[0030] 3、苹果黄酮醇糖苷的含量检测，所有样品用磨样罐磨成粉末，称取0.1g样品粉末加入1mL 50％甲醇水溶液中，超声30min，然后11000rpm离心15min，吸取上清液至新管中用于HPLC检测。HPLC检测体系为：流动相：A：水(0.1％甲酸)，B：乙腈：水(0.1％甲酸)＝1：1；进样体积：10μl；流速：1mL/min；HPLC程序如下：0-45min，23％-50％B；45-50min，50％-100％B；50-55min，100％B；55-56min，100％-23％B；56-60min，23％B。
[0031] 结果显示蓝光加UV-B处理可以显著诱导MdUGT75B1基因的表达以及槲皮素3-O-半乳糖苷的积累(图1)。在苹果果皮中，MdUGT75B1基因的表达和槲皮素3-O-半乳糖苷的积累呈正相关关系。
[0032] 三、MdUGT75B1基因的克隆
[0033] 1、以反转录产物cDNA为模板，用SEQ:NO.8和SEQ:NO.9所示引物进行PCR扩增，PCR反应体系为50μL，成分分别为：2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTP Mix(10mM each)1μL，DNA polymerse(1U/μL)1μL，上下游引物(10μM)各2μL，cDNA 1μL，H2O 18μL。PCR程序为：95℃预变性3min，35个循环的95℃15s，58℃15s和72℃1min 40s，72℃5min，4℃hold。
[0034] 2、将PCR扩增产物连接到T载体，转化大肠杆菌DH5α，进行菌落PCR验证，获得阳性菌落进行测序。
[0035] 四、MdUGT75B1基因序列及编码蛋白分析
[0036] 测序结果返还之后Blast比对发现核苷酸序列与数据库中一致，获得的MdUGT75B1基因序列如SEQ：NO.1所示含有1425个核苷酸，编码474个氨基酸的蛋白，如SEQ：NO.2所示。利用MdUGT75B1氨基酸序列与已发表具有黄酮醇3-OH半乳糖基催化功能的糖基转移酶比对，结果如图2所示。
[0037] 五、MdUGT75B1基因的原核表达
[0038] 1、设计带有表达载体pET-32a(+)载体的多克隆酶切位点的特异引物，其引物序列如SEQ:NO.10和SEQ:NO.11所示。
[0039] 2、以测序正确返还T载体为模板，用SEQ:NO.10和SEQ:NO.11所示引物进行PCR扩增，PCR反应体系为50μL，成分分别为：2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTP Mix(10mM each)1μL，DNA polymerse(1U/μL)1μL，上下游引物(10μM)各2μL，cDNA 1μL，H2O 18μL。PCR程序为：95℃预变性3min，35个循环的95℃15s，58℃15s和72℃1min 40s，72℃5min，4℃hold。
[0040] 3、将PCR扩增产物连接到用Xho I和BamH I双酶切过的pET-32a(+)载体，获得pET-32a(+)-MdUGT75B1重组质粒。
[0041] 4、将pET-32a(+)-MdUGT75B1重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)PlysS表达宿主菌中，经菌落PCR验证，挑取阳性菌落接种到500mL LB液体培养基，37℃摇菌，直至OD600约为0.8，获得转基因工程菌。
[0042] 5、在上述转基因的工程菌中加入IPTG至终浓度为1mM，16℃诱导24h，收集菌体，500mL收集1管，加入20mL 1×PBS缓冲液，充分悬浮菌体，-80℃放置48h以上，将菌体置于30℃水浴锅解冻后，超声破碎20min，10000rpm离心30min，收集上清液即为粗蛋白。用Clontech HisTALON试剂盒进一步纯化目的蛋白。利用SDS-PAGE方法检测蛋白表达和纯化效果，结果如图3所示。
[0043] 图3中可看出，pET-32a(+)-MdUGT75B1重组质粒转化到表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)PlysS，经IPTG诱导后，有重组蛋白的表达，上清蛋白经Clontech HisTALON试剂盒纯化后得到较纯的重组蛋白，且重组蛋白条带大小与预测的一致，加上重组标签后在75kDa左右有明显的重组蛋白条带。纯化的蛋白可用于进一步的酶学分析。
[0044] 六、MdUGT75B1重组蛋白的酶学活性检测分析
[0045] 对于黄酮醇底物的酶活检测，是在在100μL，100mM pH 7.5的Tris-HCl缓冲液包含5mM UDP-半乳糖作为糖基供体，200uM槲皮素作为糖基受体，5μg纯化后的重组蛋白和0.1％的DTT。
[0046] 所有酶反应体系在30℃反映30min后停止反应，反应均以空载蛋白作为对照，获得酶反应产物。酶反应产物经产物标准品结合HPLC进行检测鉴定，所述HPLC检测条件如下：Waters 2695-2996DAD检测器，ODS C18柱(4.6×250mm)色谱柱。以含0.1％甲酸水溶液(溶液A)和含0.1％甲酸的100％乙腈(溶液B)为流动相，洗脱梯度为：0-45min，23％-50％B；45-
50min，50％-100％B；50-55min，100％B；55-56min，100％-23％B；56-60min，23％B。检测波长为280nm-520nm，柱温为25℃，流速为1mL/min，进样体积为10μL。
50min，50％-100％B；50-55min，100％B；55-56min，100％-23％B；56-60min，23％B。检测波长为280nm-520nm，柱温为25℃，流速为1mL/min，进样体积为10μL。
[0047] 结果如图4所示，可以看出MdUGT75B1重组蛋白以UDP-半乳糖作为糖供体，可选择性地催化槲皮素3-OH上的糖基化，生成槲皮素3-O-半乳糖苷，与标准品一致，催化流程如图5所示，说明MdUGT75B1重组蛋白具有黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶活性。
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