黄花蒿二氢黄酮醇氧化酶基因AaDHFO2及其编码蛋白与应用
阅读：450发布：2020-05-17
专利汇可以提供黄花蒿二氢黄酮醇氧化酶基因AaDHFO2及其编码蛋白与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种黄花蒿二氢 黄 酮 醇 氧 化酶 基因AaDHFO2，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码蛋白的 氨 基酸序列如SEQ ID No.2所示。黄花蒿二氢黄酮醇氧化酶AaDHFO2能够催化二氢黄酮醇形成黄酮醇，为体外催化二氢黄酮醇生成黄酮醇，以及黄花蒿体内调控儿黄花蒿组分的组成提供了一种新的可选择途径。此外，本发明通过原核表达制备重组AaDHFO2，克服了直接从黄花蒿中分离该蛋白的困难，降低了成本。，下面是黄花蒿二氢黄酮醇氧化酶基因AaDHFO2及其编码蛋白与应用专利的具体信息内容。
1.一种黄花蒿二氢黄酮醇氧化酶基因AaDHFO2，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述黄花蒿二氢黄酮醇氧化酶基因AaDHFO2编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.含有权利要求1所述基因的载体。
4.权利要求1所述基因在制备转基因黄花蒿或组织中的应用。
5.权利要求3所述载体在制备转基因黄花蒿或组织中的应用。
6.权利要求1所述的黄花蒿二氢黄酮醇氧化酶基因AaDHFO2在催化二氢黄酮醇生成黄酮醇中的应用。
7.权利要求2所述的黄花蒿二氢黄酮醇氧化酶基因AaDHFO2的编码蛋白在催化二氢黄酮醇生成黄酮醇中的应用。
8.权利要求1所述的黄花蒿二氢黄酮醇氧化酶基因AaDHFO2在调控黄花蒿体内二氢黄酮醇与黄酮醇的比例中的应用。
9.权利要求2所述的黄花蒿二氢黄酮醇氧化酶基因AaDHFO2的编码蛋白在调控黄花蒿体内二氢黄酮醇与黄酮醇的比例中的应用。
10.—种体外表达黄花蒿二氢黄酮醇氧化酶AaDHFO2的方法，其特征在于，该方法是利用重组表达载体pET28a(+)-AaDHFO2，将权利要求1所述的基因导入宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，诱导该基因表达。
黄花蒿二氢黄酮醇氧化酶基因AaDHFO2及其编码蛋白与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种黄花蒿二氢黄酮醇氧化酶基因AaDHFO2及其编码蛋白与应用。
背景技术
[0002] 黄酮类化合物(flavonoid)是以黄酮(2-苯基色原酮)为母核而衍生的一类黄色色素，其中包括黄酮的同分异构体及其氢化的还原产物，也即以C6-C3-C6为基本碳架的一系列化合物。黄酮类化合物在植物界分布很广，在植物体内大部分与糖结合成苷类或碳糖基的形式存在，也有以游离形式存在的。天然黄酮类化合物母核上常含有羟基、甲氧基、烃氧基、异戊烯氧基等取代基。由于这些助色团的存在，使该类化合物多显黄色。又由于分子中γ-吡酮环上的氧原子能与强酸成盐而表现为弱碱性，因此曾称为黄碱素类化合物。根据三碳键(C3)结构的氧化程度和B环的连接位置等特点，黄酮类化合物可分为下列几类：黄酮和黄酮醇；二氢黄酮醇(又称二氢黄酮)和二氢黄酮醇醇(又称二氢黄酮醇)；异黄酮；异二氢黄酮醇(又称二氢异黄酮)；查耳酮；二氢查耳酮；橙酮(又称澳咔)；黄烷和黄烷醇；黄烷二醇(3，4)(又称白花色苷元)。黄酮类化合物在植物体中通常与糖结合成苷类，小部分以游离态(苷元)的形式存在。
[0003] 黄酮类化合物在自然界分布非常广泛，一般C3上的羟基与母核上其他位置上的羟基性质不完全相同，所以带有C3-OH的衍生物称为黄酮醇类，例如，黄芩素和黄芩苷(熔点223℃)属于黄酮类，檞皮素(熔点316-318℃)和芦丁(熔点188-190℃)属于黄酮醇类。
[0004] 黄酮类分子中，苯环与苯乙烯基接于同一羰基上，组成了交叉共轭体系，因而能显灰黄到黄色颜色。颜色的深浅与取代基的性质和位置有关，一般认为在C7位或C忨位引入羟基或甲氧基可使化合物颜色加深。黄酮类(配基)一般难溶于水或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂。分子内引入的羟基数目越多，则在水中的溶解度越大。羟基经甲基化后，则增加在有机溶剂中的溶解度；羟基与糖结合成苷后，水溶性相应提高，而在有机溶剂中的溶解度相应减小。黄酮类分子中多为酚性羟基，故显酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶等。
[0005] 由两蕊苏木芯材中分离出的逮斯替蒙黄酮是一种黄酮醇的内酯衍生物，熔点315℃。由水蓼叶中分离出的水蓼素，是黄酮醇硫酸氢钾的酯类，熔点280℃。由二分子黄酮衍生物聚合(见聚合反应)所成的二聚物称双黄酮类。有的通过C-C键聚合，也有的通过醚氧键缩合(见缩合反应)，聚合的位置也有区别，例如：银杏叶中含有的银杏素(熔点344℃)。
[0006] 绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物，它在植物的生长、发育、开花、结果以及抗菌防病等方面起着重要的作用。黄酮类化合物中有药用价值的化合物很多，如原珍向天果、槐米中的芦丁和陈皮中的陈皮苷，能降低血管的脆性，及改善血管的通透性、降低血脂和胆固醇，用于防治老年高血压和脑溢血。由银杏叶制成的舒血宁片含有黄酮和双黄酮类，用于冠心病、心绞痛的治疗。全合成的乙氧黄酮又名心脉舒通或立可定，有扩张冠状血管、增加冠脉流量的作用。许多黄酮类成分具有止咳、祛痰、平喘、抗菌的活性。护肝，解肝毒、抗真菌、治疗急、慢性肝炎，肝硬化。不少治疗冠心病有效的中成药均含黄酮类化合物，研究发现芦丁、槲皮素、葛根素以及人工合成的立可定等均有明显的扩冠作用；槲皮素、芦丁、金丝桃苷、葛根素、灯盏花素、葛根总黄酮、银杏叶总黄酮对缺血性脑损伤有保护作用；金丝桃苷、水飞蓟素、木犀草素、沙棘总黄酮对心肌缺血性损伤有保护作用；银杏叶总黄酮、葛根素、大豆苷元等对心肌缺氧性损伤有明显保护作用。此外，沙棘总黄酮、苦参总黄酮、甘草黄酮(主要为甘草素和异甘草素)具有抗心律失常作用。木犀草素、黄岑苷、黄岑素等均有一定的抗菌作用；槲皮素、二氢槲皮素、桑色素、山柰酚等具有抗病毒作用；从菊花、獐牙菜中分离得到的黄酮单体对HIV病毒有较强抑制作用，大豆苷元、染料木素、鸡豆黄素A对HIV病毒也有一定抑制作用。
[0007] 黄花蒿(Artemisia annua L.)又名臭蒿，为菊科(Asteraceae)蒿属(Artemisia)植物，黄花蒿叶、花和茎中含有丰富的黄酮类化合物。黄花蒿中含有丰富的黄酮类化合物，研究表明黄花蒿叶黄花蒿具有抑制多种肿瘤细胞的药理功能，其机理可能与黄花蒿叶中黄酮类化合物的抗氧化作用、抑制相关酶的活性、降低肿瘤细胞耐药性、诱导肿瘤细胞凋亡及雌激素样作用等有关。此外，更重要的是，黄花蒿中的黄酮类化合物与青蒿素具有协同作用，促进青蒿素治疗疟疾以及抗癌的效果。由此可见黄花蒿叶黄酮类化合物具有重要的开发前景。然而，目前对黄花蒿黄酮类化合物的生物合成及其调控机理不清楚，尚无相关的关键酶基因克隆的报道。本发明以黄酮类化合物含量差异非常显著的两个黄花蒿为材料，采用消减杂交技术(SSH)，从中获得差异表达基因，在此基础之上通过半定量RT-PCR、生物信息学、过表达、体外酶反应以及基因沉默的方法对候选基因进行功能验证，最终获得了一条黄花蒿二氢黄酮醇氧化酶基因。
发明内容
[0008] 本发明的目的在于提供一种黄花蒿二氢黄酮醇氧化酶基因AaDHFO2，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0009] 本发明的另一目的在于提供上述黄花蒿二氢黄酮醇氧化酶基因AaDHFO2编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0010] 本发明的二氢黄酮醇氧化酶基因AaDHFO2是从黄花蒿(Artemisia annua L.)中克隆得到的一种新的二氢黄酮醇氧化酶基因(现将该基因命名为AaDHFO2)，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该基因全长为1978bp，分析表明，该序列包含一个完整的编码区1008bp，5’非翻译区(UTR)547bp，3'非翻译区388bp和polyA尾巴35bp，编码335个氨基酸组成的蛋白(二氢黄酮醇氧化酶)。由该基因编码的二氢黄酮醇氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。该蛋白的分子量为37.86KDa，等电点为5.32，与黑心菊(Rudbeckia hirta)中的二氢黄酮醇氧化酶(ABN79672.1)序列有86％的一致性(identity)，在196-296位点区域含有一个Fe2OG dioxygenase结构域，在287位残基含有一个2-oxoglutarate结合位点，在221、223和
277位残基各含有一个Fe2+结合位点。为便于表述，将该二氢黄酮醇氧化酶命名为AaDHFO2。
277位残基各含有一个Fe2+结合位点。为便于表述，将该二氢黄酮醇氧化酶命名为AaDHFO2。
[0011] 应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。因而，本发明二氢黄酮醇氧化酶基因还包括由SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到编码AaDHFO2的核苷酸序列。
[0012] 此外，应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的二氢黄酮醇氧化酶的氨基酸序列(SEQ ID No.2)，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第120位的Q替换为V。因此，本发明二氢黄酮醇氧化酶还包括SEQ ID No.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有与AaDHFO2同等活性的由AaDHFO2衍生得到的蛋白质。
[0013] 本发明的又一目的是提供含有二氢黄酮醇氧化酶基因AaDHFO2的载体：重组表达载体pET28a(+)-AaDHFO2和基因沉默载体pHellsgate8-AaDHFO2。
[0014] 将本发明的AaDHFO2基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体或抑制本发明基因表达的基因沉默载体，进一步将该重组表达载体或者基因沉默载体导入适当的宿主细胞中，获得表达本发明AaDHFO2的基因工程菌，或者转基因黄花蒿或组织。
[0015] 在本发明实施例中，根据AaDHFO2编码区序列设计包含酶切位点的引物，通过RT-PCR的方法先克隆到T-easy载体上，测序正确后将AaDHFO2克隆到原核表达载体pET28的多克隆位点，转化大肠杆菌BL21(DE3)，进行诱导表达，优化条件，获得具有活性的二氢黄酮醇氧化酶。实验表明，AaDHFO2能够催化二氢黄酮醇形成黄酮醇。
[0016] 在本发明实施例中，根据AaDHFO2全长序列设计引物，扩增AaDHFO2全长序列中的300bp-600bp的基因片段，通过BP反应连接到pDONR221构建中间载体，测序正确后将中间载体与pHellsgate 8通过LR反应获得AaDHFO2基因沉默载体pHellsgate8-AaDHFO2，转化农杆菌农杆菌LBA4404，浸染黄花蒿叶片等外植体，获得转基因黄花蒿或组织，其体内AaDHFO2表达水平得以改变，从而调控二氢黄酮醇与黄酮醇的比例。
[0017] 本发明首次提供了一种二氢黄酮醇氧化酶基因AaDHFO2序列，其编码蛋白能够催化二氢黄酮醇形成黄酮醇，为体外催化二氢黄酮醇生成黄酮醇，以及黄花蒿体内调控儿黄花蒿组分的组成(二氢黄酮醇与黄酮醇的比例)提供了一种新的可选择途径。此外，本发明通过原核表达制备重组AaDHFO2，克服了直接从黄花蒿中分离该蛋白的困难，降低了成本。附图说明
[0018] 图1是半定量RT-PCR分析黄酮含量高和低的黄花蒿叶中AaDHFO2基因表达水平电泳图。
[0019] 其中，H：黄酮含量高的黄花蒿叶；L：黄酮含量低的黄花蒿叶。
[0020] 图2是PCR产物凝胶电泳图。
[0021] 其中，A：5’-RACE；B：3’-RACE；M：Marker。
[0022] 图3是AaDHFO2重组蛋白分离纯化SDS-PAGE电泳图。
[0023] 其中，M：Protein Marker；CK：BL21未诱导上清；1-5依次为上样原液、上样流出液、Wash Buffer洗脱液0-8BV、Elute Buffer洗脱液0-4.5BV、蛋白浓缩液。
[0024] 图4是HPLC分析AaDHFO2蛋白酶反应产物。
[0025] 其中，A为对照，反应体系中加入失活的AaDHFO2；B为AaDHFO2催化二氢山奈酚的产物图；①为二氢山奈酚；②为山奈酚。
具体实施方式
[0027] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0028] 实施例1 AaDHFO2基因片段的获得
[0029] 取红茎黄花蒿(HJ2013020)与绿茎黄花蒿(NJ201007)嫩叶，分别提取总RNA，用Qiagen公司的Free DNase Set试剂盒消化总RNA中DNA，防止基因组DNA污染。取0.5μL消化DNA的RNA样品，用Thermo Scientific公司Nanodrop 2000c型分光光度计，测定样品RNA浓度、OD260/OD280值。取1μL RNA，经1％Agarose gel电泳进行检测，测定RNA样品的完整性及纯度。将完整性及纯度符合要求的RNA稀释成200ng/μL，待用。分别取约2μL(2μg)红茎黄花蒿与绿茎黄花蒿poly(A)RNA，各加入cDNA systhesis Primer(10mmol/L)1μL，加入无菌水至总体积5μL，混匀后，短暂离心，在PCR仪中，70℃温育2min，冰上冷却2min，短暂离心。加入2μL 5×第一链缓冲液、1μL dNTP Mix(各10mmol/L)、1μL去核酸酶水及1μL AMV反转录酶(20U/μL)，混匀后短暂离心，置于PCR仪中42℃反应1.5h。冰上终止反应。在第一链合成管中加入预先冰上冷却的下列成分：48.4μL去核酸酶水、16.0μL 5×第二链合成缓冲液、1.6μL dNTP Mix(10mmol/L)及4.0μL 20×第二链酶混合物，终体积为80μL，混匀并短暂离心。于PCR仪中16℃反应2h。加入2μL(6U)T4DNA多聚酶，小心混匀，16℃反应30min。加入4μL 20×EDTA/glycogen混合物以终止第二链合成。然后用酚:氯仿:异戊醇(体积比25:24:1)抽提一次，氯仿：异戊醇(体积比24:1)重复抽提一次。加入40μL 4mol/L NH4OAc和300μL 95％乙醇沉淀DNA，再用1mL 70％的乙醇洗两次，然后空气干燥10min，重悬于50μL H2O中，-20℃保存。取上述cDNA 43.5μL，加入10×RsaⅠ缓冲液5.0μL和RsaⅠ(10U/μL)1.5μL，混匀并短暂离心，PCR仪上37℃反应1.5h。加入2.5μL 20×EDTA/glycogen以终止反应。然后用酚:氯仿:异戊醇(体积比25:24:1)抽提一次，氯仿:异戊醇(体积比24:1)重复抽提一次。加入25μL
4mol/L NH4OAc和187.5μL 95％乙醇沉淀DNA，80％乙醇洗涤沉淀，空气干燥沉淀5-10min，用5.5μL去核酸酶水溶解沉淀，-20℃保存备用。这些纯化产物即可用作Driver，用来扣除Tester cDNA中非差异表达基因。取5μL去核酸酶水稀释RsaⅠ消化的cDNA1μL，对于初花和盛花各重复取2μL连接不同的接头(Adaptor 1和Adaptor 2R)。在0.2mL离心管中依次加入1.5μL driver cDNA，1.5μL Tester cDNA和1μL杂交缓冲液，进行第一轮杂交，98℃，变性
1.5min，68℃杂交8h。第一轮杂交结束后，混合两份杂交液(Tester的接头不同)，再加入新变性driver cDNA和1μL杂交缓冲液，68℃反应12h。第二轮杂交后，产物加入200μL稀释缓冲液，吹打混匀。于PCR仪中68℃加热7min，-20℃保存。取消减杂交产物1μL为模板，依次加入
2.5μL 10×PCR反应缓冲液、dNTPs(10mmol/L)0.5μL、1μL PCR primer 1(10mmol/L)、0.5μL
50×Advantage cDNA Polymerase Mix，用去核酸酶水补足至25μL。混匀后短暂离心，在PCR仪中75℃，5min补平末端，94℃预变性5min，30个反应循环(94℃30s，66℃30s，72℃
1.5min)。反应结束后，2.0％琼脂糖凝胶分析，取3μL PCR产物，加27μL去核酸酶水稀释，混合均匀后，取1μL为模板，进行第二轮PCR反应。在含有1μL模板的离心管中，加入2.5μL 10×PCR反应缓冲液、0.5μL dNTPs(10mmol/L)、1μL Nested primer 1(10mmol/L)、1μL Nested primer 2(10mmol/L)、0.5μL 50×Advantage cDNA Polymerase Mix，用去核酸酶水补足至
25μL。混匀并短暂离心，PCR反应条件为：15个循环(94℃30s，68℃30s，72℃1.5min)。产物经
2.0％琼脂糖凝胶分析，-20℃保存。消减杂交的二次PCR产物经Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)纯化后，重悬于50μL去核酸酶水中，电泳估算DNA浓度及片段大小，取适量纯化后的的PCR产物按1:1.5的比例与载体连接，室温孵育1h，取50μL JM109高效感受态细胞，加入到2μL连接产物中，小心混匀，冰浴20min，精确42℃水浴中热击45s，迅速移到冰浴中冷却，每管加入950μL SOC培养基，37℃振荡培养(150rpm)1.5h。将每个转化培养基100μL涂到两个LB/氨苄/IPTG/X-gal平板上，将平板于37℃过夜培养。用无菌牙签随机挑取重组单克隆接种在200μL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇菌过夜。将纯化的质粒DNA送上海生物工程技术有限公司测序。产生的序列去除载体序列后，将所得到的EST通过BLASTx软件与GenBank unigene库中的序列进行同源比对分析。根据提交序列长度、得分高低、配准百分比，判定EST是否是己知功能基因。判定标准参照水稻、拟南芥的EST研究比对标准，即一致性大于40％。分析结果表明，有一个差异基因片段与拟南芥(Arabidopsis thaliana)二氢黄酮醇氧化酶基因有90％的相似性。结果表明，该基因为黄花蒿二氢黄酮醇氧化酶基因，故将该基因命名为AaDHFO2，其序列如SEQ ID No.1所示，通过半定量RT-PCR进一步分析，结果表明，AaDHFO2的在黄酮含量高的黄花蒿叶中的表达量明显高于含量低的黄花蒿叶，见图1。
4mol/L NH4OAc和187.5μL 95％乙醇沉淀DNA，80％乙醇洗涤沉淀，空气干燥沉淀5-10min，用5.5μL去核酸酶水溶解沉淀，-20℃保存备用。这些纯化产物即可用作Driver，用来扣除Tester cDNA中非差异表达基因。取5μL去核酸酶水稀释RsaⅠ消化的cDNA1μL，对于初花和盛花各重复取2μL连接不同的接头(Adaptor 1和Adaptor 2R)。在0.2mL离心管中依次加入1.5μL driver cDNA，1.5μL Tester cDNA和1μL杂交缓冲液，进行第一轮杂交，98℃，变性
1.5min，68℃杂交8h。第一轮杂交结束后，混合两份杂交液(Tester的接头不同)，再加入新变性driver cDNA和1μL杂交缓冲液，68℃反应12h。第二轮杂交后，产物加入200μL稀释缓冲液，吹打混匀。于PCR仪中68℃加热7min，-20℃保存。取消减杂交产物1μL为模板，依次加入
2.5μL 10×PCR反应缓冲液、dNTPs(10mmol/L)0.5μL、1μL PCR primer 1(10mmol/L)、0.5μL
50×Advantage cDNA Polymerase Mix，用去核酸酶水补足至25μL。混匀后短暂离心，在PCR仪中75℃，5min补平末端，94℃预变性5min，30个反应循环(94℃30s，66℃30s，72℃
1.5min)。反应结束后，2.0％琼脂糖凝胶分析，取3μL PCR产物，加27μL去核酸酶水稀释，混合均匀后，取1μL为模板，进行第二轮PCR反应。在含有1μL模板的离心管中，加入2.5μL 10×PCR反应缓冲液、0.5μL dNTPs(10mmol/L)、1μL Nested primer 1(10mmol/L)、1μL Nested primer 2(10mmol/L)、0.5μL 50×Advantage cDNA Polymerase Mix，用去核酸酶水补足至
25μL。混匀并短暂离心，PCR反应条件为：15个循环(94℃30s，68℃30s，72℃1.5min)。产物经
2.0％琼脂糖凝胶分析，-20℃保存。消减杂交的二次PCR产物经Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)纯化后，重悬于50μL去核酸酶水中，电泳估算DNA浓度及片段大小，取适量纯化后的的PCR产物按1:1.5的比例与载体连接，室温孵育1h，取50μL JM109高效感受态细胞，加入到2μL连接产物中，小心混匀，冰浴20min，精确42℃水浴中热击45s，迅速移到冰浴中冷却，每管加入950μL SOC培养基，37℃振荡培养(150rpm)1.5h。将每个转化培养基100μL涂到两个LB/氨苄/IPTG/X-gal平板上，将平板于37℃过夜培养。用无菌牙签随机挑取重组单克隆接种在200μL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇菌过夜。将纯化的质粒DNA送上海生物工程技术有限公司测序。产生的序列去除载体序列后，将所得到的EST通过BLASTx软件与GenBank unigene库中的序列进行同源比对分析。根据提交序列长度、得分高低、配准百分比，判定EST是否是己知功能基因。判定标准参照水稻、拟南芥的EST研究比对标准，即一致性大于40％。分析结果表明，有一个差异基因片段与拟南芥(Arabidopsis thaliana)二氢黄酮醇氧化酶基因有90％的相似性。结果表明，该基因为黄花蒿二氢黄酮醇氧化酶基因，故将该基因命名为AaDHFO2，其序列如SEQ ID No.1所示，通过半定量RT-PCR进一步分析，结果表明，AaDHFO2的在黄酮含量高的黄花蒿叶中的表达量明显高于含量低的黄花蒿叶，见图1。
[0030] 实施例2 AaDHFO2基因全长cDNA序列的克隆
[0031] 根据已获得保守区片断的序列设计5'-RACE引物( DHFO5):5’-AGCTCAGGGCATGGACATGGTGGGTAGT-3'(SEQ ID No.3)；3'-RACE引物(DHFO3)：5’-TTGGGTTGTTGTCAAAAGGTCTTGGACTG-3'(SEQ ID No.4)。引物DHFO5和UPM的产物在1160bp左右有一条亮带(见图2)，而引物DHFO3和UPM的产物在1300bp左右有一条亮带(见图2)。将PCR产物回收、连接后转化，在得到的大量克隆中，选取阳性克隆进行测序。通过测序并于保守区序列拼接，去掉重叠部分，得到脱氧核糖核苷酸序列全长为1978bp，分析表明，该序列包含一个完整的编码区1008bp，5’非翻译区(UTR)547bp，3'非翻译区388bp和polyA尾巴35bp，编码335个氨基酸组成的蛋白(二氢黄酮醇氧化酶)。由该基因编码的二氢黄酮醇氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。该蛋白的分子量为37.86KDa，等电点为5.32。为便于表述，将该二氢黄酮醇氧化酶命名为AaDHFO2。
[0032] 通过blast软件在线比较分析，发现AaDHFO2编码的氨基酸序列与其它物种的二氢黄酮醇氧化酶具有较高的一致性，尤其与黑心菊(Rudbeckia hirta)、三花龙胆(Gentiana triflora)、洋桔梗(Eustoma grandiflorum)、烟草(Nicotiana tabacum])和马铃薯(Solanum tuberosum)的二氢黄酮醇3-羟化相似性分别为86％、74％、73％、74％和73％。
[0033] 实施例3二氢黄酮醇氧化酶基因AaDHFO2的异源表达
[0034] 一、携带黄花蒿二氢黄酮醇氧化酶基因AaDHFO2的重组表达载体的构建[0035] 以黄花蒿cDNA为模板，根据序列SEQ ID No.1设计引物，PCR扩增黄花蒿二氢黄酮醇氧化酶基因编码区的脱氧核糖核苷酸序列。引物两端分别引入EcoRI和Xho I酶切位点，引物序列如下：
[0036] 上游：5'-CCGGAATTCATGGAGGTGGAAAGAGTTCAAGA-3'(SEQ ID No.5)，引入EcoRI酶切位点，下游：5'-CCGCTCGAGTCACTGTGGAAGCTTATTTAGCTTG-3'(SEQ ID No.6)，引入Xho I酶切位点；
[0037] 对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带纯化回收，将回收的DNA片段连接到pGEM-T easy载体上，转化大肠杆菌(Esherichia coli)DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选，提取阳性克隆质粒测序，得到含有NdeI和SacI酶切位点及编码黄花蒿二氢黄酮醇氧化酶的脱氧核糖核苷酸序列的质粒pGEMT-AaDHFO2。
[0038] 将质粒pGEMT-AaDHFO2和质粒pET28a(+)先在30℃条件下分别用EcoRI和Xho I酶双酶切4h，酶切产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，回收，用T4DNA连接酶16℃连接过夜。连接产物转化DH5a感受态细胞，挑取Kan抗性平板上长出的单克隆，提取质粒，进行PCR鉴定和酶切图谱鉴定，结果重组表达载体构建成功。将获得的重组表达载体命名为pET28a(+)-AaDHFO2。
[0039] 二、重组表达载体转化宿主、阳性克隆鉴定
[0040] 将步骤一中构建的重组表达载体pET28a(+)-AaDHFO2转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取Kan抗性平板上长出的单菌落进行PCR鉴定。以AaDHFO2基因重组表达载体的单克隆菌落为模板，用M13F和M13R引物进行PCR检测。菌落PCR产物的电泳结果可知单克隆菌落含有目的基因片段，可用于蛋白的诱导表达实验。
[0041] 三、AaDHFO2基因的原核表达
[0042] 将步骤二中鉴定正确的克隆培养过夜，再将细菌100倍稀释于含Kan(50mg/L)的LB培养基中培养，待菌液生长至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG(终浓度为0.1mmol/L)进行诱导培养，30℃诱导6h。取诱导过的菌液250ml离心10min，离心收集菌体(4000rpm，10min，4℃)，用50mL Binding buffer(20mM Tris-HCl、500mM NaCl和10mM imidazole，pH 7.9)洗涤菌体2遍后，重悬于30mL 1×binding buffer中，进行超声波破碎以释放蛋白，然后高速冷冻低温离心(12000xg，30min，4℃)除去不溶部分。取稍许上清和沉淀样品100℃煮沸，离心后(12000xg，20min，4℃)，将上清部分上样到镍柱HisTrap HT column(1mL，GE Healthcare)上，待滤液全部过滤完后，用wash buffer(20mM Tris-HCl,pH 7.9,500mM NaCl,50mM imidazole)冲洗两次，每次3mL。然后用2.5ml elution buffer(20mM Tris-HCl,pH 7.9,500mM NaCl,250mM imidazole)洗脱。用Vivaspin(20mL，10kD)浓缩至2.5mL，经PD-10脱盐柱(GE Healthcare)脱盐后，溶解于含10％甘油的Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 8.0)，采用Bradford方法测定蛋白浓度后(Bradford et al.,1976)，分装保存于-80℃备用。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测重组蛋白，结果见图3，表达蛋白的分子量约为38Kda。
[0043] 四、AaDHFO2酶促反应及其产物检测
[0044] 采用Tris-HCl缓冲液(80mM Tris-HCl，0.5mM DTT,1mM抗坏血酸钠,pH7.0)进行AaDHFO2的100μL酶促反应，底物为二氢山奈酚，反应1h。反应后用乙酸乙酯进行萃取，蒸干后用甲醇溶解，然后利用HPLC进行分析，分析条件为：色谱柱为Ecosil C18(4.6 I.D.×150mm,5μm)，流动相0.2％磷酸水(A)和乙腈(B)，流速1.0mL/min，柱温30℃，波长280nm(检测二氢山奈酚)、365nm(检测山奈酚)、330nm(二氢山奈酚和山奈酚都有吸收)，流动相组成：
0-52min，8％-85％B；52-55min，85％-8％B；55-60min，8％-8％B。分析结果表明(如图4)，AaDHFO2可将二氢山奈酚转变为山奈酚。
0-52min，8％-85％B；52-55min，85％-8％B；55-60min，8％-8％B。分析结果表明(如图4)，AaDHFO2可将二氢山奈酚转变为山奈酚。
[0045] 实施例4抑制二氢黄酮醇氧化酶基因AaDHFO2的表达
[0046] 一、二氢黄酮醇氧化酶基因沉默载体构建
[0047] 取0.5mL的离心管1支，依次加入5μL 10×PCR Buffer、3μL 25mmol/L MgC12、0.4μL 25mmol/L dNTP mix、1μL 10μmol/L上游引物AADHFO2RNAiF、1μL 10μmol/L下游引物AADHFO2RNAiR、1μL 2U/μL Taq酶、2μL实施例1得到的cDNA，加双蒸水至总体积20μL。采用如下程序进行PCR：95℃4min，94℃1.5min，62℃退火1min，72℃2min，35个循环，72℃延伸10min。PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，PCR产物加150μL TE pH8.0缓冲液与于50μL的attB-PCR产物，再加入100μL 30％PEG 8000/30mM MgCl2溶液，充分混匀，室温下
10,000×g离心15min，去除上清液，加入50μL TE pH 8.0缓冲液，得attB-PCR纯化产物。取
1.5mL离心管，于室温下依次加入1μL attB-PCR纯化产物，0.5μL pDONR221，2.5μL TE pH
8.0缓冲液。从-80℃冰箱中取出BP Clonase II enzyme mix，迅速放置冰上约2min，短暂涡旋2次，每次2s，加1μL of BP Clonase II enzyme mix于反应液中，混匀，短暂离心，25℃下孵育1h，加入1μL Proteinase K于反应液中，短暂离心，37℃孵育10min终止反应。反应产物转化DH5α，以M13F和M13R引物进行PCR鉴定，鉴定克隆为阳性克隆，选阳性克隆提取质粒，得到中间载体。在1.5mL离心管中，室温下分别加入1μL中间载体，0.5μL pHellsgate 8，2.5μL TE pH 8.0缓冲液。从-80℃冰箱中取出LR Clonase II enzyme mix，迅速放置冰上约2min，短暂涡旋2次，每次2s，加1μL of LR Clonase II enzyme mix于反应液中，混匀，短暂离心，
25℃下孵育1h，加入1μL Proteinase K于反应液中，短暂离心，37℃孵育10min终止反应。反应产物转化DH5α，以Agri 51、Agri 56、PDKFP和Agri 69两对引物进行PCR鉴定阳性克隆，结果表明，AaDHFO2基因沉默载体pHellsgate8-AaDHFO2构建成功。
10,000×g离心15min，去除上清液，加入50μL TE pH 8.0缓冲液，得attB-PCR纯化产物。取
1.5mL离心管，于室温下依次加入1μL attB-PCR纯化产物，0.5μL pDONR221，2.5μL TE pH
8.0缓冲液。从-80℃冰箱中取出BP Clonase II enzyme mix，迅速放置冰上约2min，短暂涡旋2次，每次2s，加1μL of BP Clonase II enzyme mix于反应液中，混匀，短暂离心，25℃下孵育1h，加入1μL Proteinase K于反应液中，短暂离心，37℃孵育10min终止反应。反应产物转化DH5α，以M13F和M13R引物进行PCR鉴定，鉴定克隆为阳性克隆，选阳性克隆提取质粒，得到中间载体。在1.5mL离心管中，室温下分别加入1μL中间载体，0.5μL pHellsgate 8，2.5μL TE pH 8.0缓冲液。从-80℃冰箱中取出LR Clonase II enzyme mix，迅速放置冰上约2min，短暂涡旋2次，每次2s，加1μL of LR Clonase II enzyme mix于反应液中，混匀，短暂离心，
25℃下孵育1h，加入1μL Proteinase K于反应液中，短暂离心，37℃孵育10min终止反应。反应产物转化DH5α，以Agri 51、Agri 56、PDKFP和Agri 69两对引物进行PCR鉴定阳性克隆，结果表明，AaDHFO2基因沉默载体pHellsgate8-AaDHFO2构建成功。
[0048] 二、基因沉默载体转化宿主、阳性克隆鉴定
[0049] 将步骤一中构建的基因沉默载体pHellsgate8-AaDHFO2转化农杆菌LBA4404感受态细胞，挑取Spe抗性平板上长出的单菌落进行PCR鉴定。菌落PCR产物的电泳结果表明，单克隆菌落含有目的基因片段。
[0050] 三、转愈伤组织及分子鉴定与生化分析
[0051] 挑取阳性单菌落接种于LB附加100mg/L Spe和50mg/L Rif的培养基中，于28℃、240r/min摇床上过夜培养至OD600为0.5左右，然后于5000r/min离心6min，其沉淀用MS液体培养基重新悬浮，加入100uM As，28℃继续振荡培养3个小时后，用作侵染液。取无菌黄花蒿叶为外植体，用上述工程菌侵染液浸泡外植体，间歇摇动使外植体与菌液充分接触，侵染时间分别为16min。侵染完毕后取出外植体用无菌滤纸吸干表面菌液，转入共培养培养基(MS)，于28℃、黑暗条件下共培养48h。共培养结束后将外植体转移至黄花蒿愈伤组织诱导培养基(MS+0.5mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA)，并添加400mg/L Carb和25mg/L Kan，每二周更换新鲜培养基。3周后，提取愈伤组织DNA，以NPTIIF和NPTIIR为引物，PCR鉴定结果表明基因转化成功。将转基因愈伤组织在45℃条件下烘干，粉碎后，用8倍体积的甲醇回流提取1h，取样品进行分析，分析条件为：高效液相色谱(HPLC)检测:采用Agilent 1260 series液相色谱(安捷伦，美国)，Ecosil C18柱(4.6um×150mm,5um)、柱温为30℃，流速为1mL/min，进样量为10μL，检测波长为278nm，流动相A为水(含0.15％醋酸)，流动相B为乙腈(含0.15％醋酸)，洗脱程序为：0-52min,8％B-85％B；52-52min,85％B-8％B；55-60min,8％B-8％B。HPLC分析结果表明，与野生型相比，转基因黄花蒿愈伤组织中山奈酚的含量提高了81.34％，而二氢山奈酚降低了69.12％。
[0052] 实例五
[0053] 一、二氢黄酮醇氧化酶基因过表达载体构建
[0054] 于0.5mL离心管中加入5×PCR Buffer、F5’引物1ul、R3’引物1ul、DNA模板1ul、2.5mM dNTPs 5ul、DNA聚合酶1ul、ddH2O 31ul。采用如下程序进行PCR：95℃4min，94℃
1.5min，56℃退火1min，72℃2min，35个循环，72℃延伸5min。10×NEB缓冲液5ul，pcxsn ul(2ug),XCmI 1ul,ddH2O 37ul。酶切程序：37℃酶切1h。PCxsn酶切完成后，取5ul PCR反应液，用琼脂糖凝胶电泳，然后根据回收条带最亮的片段。将回收得到的目的片段，用A尾试剂盒对其加A尾，体系如下：50ul总体积，10×A tailing buffer 5ul、A-Tailing enzyme
0.5ul、dNTP 4ul、DNA片段12ul、ddH2O 28.5ul。体系混匀后，于72℃反应20min。最后于置于冰中1-2min。得到的载体PCxsn酶切回收得到的片段与经过加A尾处理的CsECGT基因片段，按照如下体系进行添加：连接总体积10ul，T4DNA Buffer 5ul，Pcxsn片段3ul，目的片段
20ul,T4DNA连接酶1ul，ddH2O 21ul。试剂混匀后，16℃过夜，再65℃灭活。热激法，将连接好的重组目的基因，转入到DH5a的感受态中，复苏45min后，涂于含kan+抗性的LB固态平板上。
37℃倒置培养过夜，挑取阳性克隆菌。进行菌落PCR验证。扩大培养验证得到的阳性克隆菌，并作出如下三个处理：取一管菌液送出测序；留一管菌液存样，备用；剩余的菌液用来提取质粒。提取的质粒，转入到农杆菌GV3101感受中。
1.5min，56℃退火1min，72℃2min，35个循环，72℃延伸5min。10×NEB缓冲液5ul，pcxsn ul(2ug),XCmI 1ul,ddH2O 37ul。酶切程序：37℃酶切1h。PCxsn酶切完成后，取5ul PCR反应液，用琼脂糖凝胶电泳，然后根据回收条带最亮的片段。将回收得到的目的片段，用A尾试剂盒对其加A尾，体系如下：50ul总体积，10×A tailing buffer 5ul、A-Tailing enzyme
0.5ul、dNTP 4ul、DNA片段12ul、ddH2O 28.5ul。体系混匀后，于72℃反应20min。最后于置于冰中1-2min。得到的载体PCxsn酶切回收得到的片段与经过加A尾处理的CsECGT基因片段，按照如下体系进行添加：连接总体积10ul，T4DNA Buffer 5ul，Pcxsn片段3ul，目的片段
20ul,T4DNA连接酶1ul，ddH2O 21ul。试剂混匀后，16℃过夜，再65℃灭活。热激法，将连接好的重组目的基因，转入到DH5a的感受态中，复苏45min后，涂于含kan+抗性的LB固态平板上。
37℃倒置培养过夜，挑取阳性克隆菌。进行菌落PCR验证。扩大培养验证得到的阳性克隆菌，并作出如下三个处理：取一管菌液送出测序；留一管菌液存样，备用；剩余的菌液用来提取质粒。提取的质粒，转入到农杆菌GV3101感受中。
[0055] 二、过表达载体转化烟草
[0056] 将转入过表达载体的农杆菌GV3101(-70℃中保存)，进行活化，于28℃条件下，避光培养48h。挑取活化得到的单菌落于含Kan+Rif+Gen三种抗性的新鲜LB液中，28℃，200rpm/min,避光培养48h。按照4:100的量接种扩大培养液到50ml新鲜含相同抗生素的LB液中，同样条件下培养3-4h，此时的菌液OD值为0.6-1.0之间。将得到的菌液，先置于冰中
2min待其冷却后，4℃，6000rpm/min，10min，弃上清，然后用冷的无菌水重悬菌体，充分混匀后，同样条件下离心，该步骤重复一次。最后，用20mL冷的MS液重悬菌体，混匀后，置于冰中，备用。在灭菌了的超净工作台上，进行如下操作。用无菌水，打湿滤纸，取野生型的绿色嫩叶置于滤纸片上。用灭菌过的手术刀，将其切成1cm2左右大小的叶片。用干滤纸片，吸干叶片表面的水分。接着，将其浸泡在20mL含农杆菌的MS液体的离心管中，15min，期间不时颠倒离心管，让叶片与液体充分混匀。时间到后，用干滤纸片，吸干烟叶上面的水分。将吸干水分后的烟叶，置于培养皿(含MS盐固态培养基)上，让叶片充分展开，使其与培养基接触。置于暗处，培养2-3d后，转移至新鲜MS培养基中(含0.1mg/LNAA+1mg/L6-BA+30mg/LHyg+400mg/LCef)25℃下，培养14d后，转移至新MS培养基(含0.1mg/LNAA+1mg/L6-BA+30mg/LHyg+
300mg/LCef)，每隔14d转移一次，转移4-5次后，烟叶即可分化成为幼小烟苗，将其插入到含
0.1mg/LNAA+25mg/LHyg+100mg/L Cef的MS培养基中，25℃下，培养至其长出根系。
2min待其冷却后，4℃，6000rpm/min，10min，弃上清，然后用冷的无菌水重悬菌体，充分混匀后，同样条件下离心，该步骤重复一次。最后，用20mL冷的MS液重悬菌体，混匀后，置于冰中，备用。在灭菌了的超净工作台上，进行如下操作。用无菌水，打湿滤纸，取野生型的绿色嫩叶置于滤纸片上。用灭菌过的手术刀，将其切成1cm2左右大小的叶片。用干滤纸片，吸干叶片表面的水分。接着，将其浸泡在20mL含农杆菌的MS液体的离心管中，15min，期间不时颠倒离心管，让叶片与液体充分混匀。时间到后，用干滤纸片，吸干烟叶上面的水分。将吸干水分后的烟叶，置于培养皿(含MS盐固态培养基)上，让叶片充分展开，使其与培养基接触。置于暗处，培养2-3d后，转移至新鲜MS培养基中(含0.1mg/LNAA+1mg/L6-BA+30mg/LHyg+400mg/LCef)25℃下，培养14d后，转移至新MS培养基(含0.1mg/LNAA+1mg/L6-BA+30mg/LHyg+
300mg/LCef)，每隔14d转移一次，转移4-5次后，烟叶即可分化成为幼小烟苗，将其插入到含
0.1mg/LNAA+25mg/LHyg+100mg/L Cef的MS培养基中，25℃下，培养至其长出根系。
[0057] 三、转基因烟草鉴定及黄酮类化合物分析
[0058] 待烟草长出根后移栽至土壤中继续培养，3周后，提取烟叶DNA，以NPTIIF和NPTIIR为引物，PCR鉴定结果表明基因转化成功。将转基因烟草在45℃条件下烘干，粉碎后，用8倍体积的甲醇回流提取1h，取样品进行分析，分析条件为：高效液相色谱(HPLC)检测:采用Agilent 1260 series液相色谱(安捷伦，美国)，Ecosil C18柱(4.6um×150mm,5um)、柱温为30℃，流速为1mL/min，进样量为10μL，检测波长为278nm，流动相A为水(含0.15％醋酸)，流动相B为乙腈(含0.15％醋酸)，洗脱程序为：0-52min,8％B-85％B；52-52min,85％B-8％B；55-60min,8％B-8％B。HPLC分析结果表明，与野生型相比，转基因烟叶山奈酚的含量提高了90.57％。
[0059] 文中所用引物：
[0060]引物名称 引物序列
M13F 5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’(SEQ ID No.7)
M13R 5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’(SEQ ID No.8)
DHFORNAiF 5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT CCAGACGGACAACGAATC-3’(SEQ ID No.9)DHFORNAiR 5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT TTGACAACAACCCAAGCA-3’(SEQ ID No.10)Agri 51 5’-CAACCACGTCTTCAAAGCAA-3’(SEQ ID No.11)
Agri 56 5’-CTGGGGTACCGAATTCCTC-3’(SEQ ID No.12)
PDKFP 5’-ATTACAGTTGGGAAATTGGGTT-3’(SEQ ID No.13)
Agri 69 5’-AGGCGTCTCGCATATCTCAT-3’(SEQ ID No.14)
NPTIIF 5’-GATTGAACAAGATGGATT-3’(SEQ ID No.15)
NPTIIR 5’-CATTTTCCACCATGATATTC-3’(SEQ ID No.16)
M13F 5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’(SEQ ID No.7)
M13R 5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’(SEQ ID No.8)
DHFORNAiF 5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT CCAGACGGACAACGAATC-3’(SEQ ID No.9)DHFORNAiR 5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT TTGACAACAACCCAAGCA-3’(SEQ ID No.10)Agri 51 5’-CAACCACGTCTTCAAAGCAA-3’(SEQ ID No.11)
Agri 56 5’-CTGGGGTACCGAATTCCTC-3’(SEQ ID No.12)
PDKFP 5’-ATTACAGTTGGGAAATTGGGTT-3’(SEQ ID No.13)
Agri 69 5’-AGGCGTCTCGCATATCTCAT-3’(SEQ ID No.14)
NPTIIF 5’-GATTGAACAAGATGGATT-3’(SEQ ID No.15)
NPTIIR 5’-CATTTTCCACCATGATATTC-3’(SEQ ID No.16)
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