表没食子儿茶素没食子酸酯作为抗丙型肝炎病毒感染的抗病毒试剂的应用
阅读：38发布：2020-11-17
专利汇可以提供表没食子儿茶素没食子酸酯作为抗丙型肝炎病毒感染的抗病毒试剂的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种在 治疗 和/或 预防 丙型 肝炎 病毒（HCV）感染中用作抗病毒 试剂 的式I的类黄 酮 化合物或其一种制药上可接受的盐或酯，其中，R3、R5和/或R7是具有式II的基团，或R1和R2均是OH基。本发明还涉及一种用于降低HCV感染性或用于使HCV失活的活体外的方法，该方法包括使所述丙型肝炎病毒与式（I）的化合物相 接触 的步骤。，下面是表没食子儿茶素没食子酸酯作为抗丙型肝炎病毒感染的抗病毒试剂的应用专利的具体信息内容。
1.一种在治疗和/或预防由丙型肝炎病毒（HCV）所引起的感染中用作抗病毒试剂的具有式（I）的化合物，或它的一种制药上可接受的盐或酯，
其中：
当a是单键时，X是O；或者，当a是双键时，X是O+，
R1和R2彼此独立地是氢原子、羟基或甲氧基，
R3、R5和R7彼此独立地是氢原子、OH基、O-糖基、（C1～C18）烷氧基或具有式（II）的基团：
R4和R6彼此独立地是氢原子或OH基；
当a是单键时，R4’是氢原子，或R4’与R4及它们所连接的碳原子一起是C=O基；或者，当a是双键时，R4’不存在，
a和b相同或不同，且是单键或双键，
前提是R3、R5和R7基团中的至少一个基团是具有式（II）的基团，和/或R1和R2均是OH基，
所述具有式（I）的化合物为纯的立体异构体的形式，或为对映异构体和/或非对映异构体的混合物的形式，该混合物包括外消旋混合物。
2.根据权利要求1所述的用于它的用途的化合物，其特征在于，所述化合物是用于抑制宿主细胞被HCV感染和/或抑制HCV从被感染的宿主细胞向另一宿主细胞播散的抗病毒试剂。
3.根据权利要求2所述的用于它的用途的化合物，其特征在于，所述化合物是用于抑制丙型肝炎病毒进入宿主细胞的抗病毒试剂。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的用于它的用途的化合物，其特征在于，所述化合物是用于抑制丙型肝炎病毒或被丙型肝炎病毒感染的宿主细胞粘附至未被感染的宿主细胞的膜的抗病毒试剂。
5.根据权利要求2～4中任一项所述的用于它的用途的化合物，其特征在于，所述宿主细胞是肝细胞。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的用于它的用途的化合物，其特征在于，所述化合物是用于抑制HCV的表面糖蛋白与宿主细胞中的至少一种靶蛋白相互作用的抗病毒试剂。
7.根据权利要求6所述的用于它的用途的化合物，其特征在于，所述化合物是用于抑制HCV的糖蛋白E1和/或E2与宿主细胞的至少一种靶蛋白相互作用的抗病毒试剂。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的用于它的用途的化合物，其特征在于，所述被丙型肝炎病毒感染的治疗和/或预防旨在用于如下的患者，该患者对通过免疫调制试剂和/或病毒代谢的抑制剂进行的HCV感染的治疗有抗性或不能耐受。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的用于它的用途的化合物，其特征在于，根据本发明的化合物是具有式（III）的化合物，或它的一种制药上可接受的盐或酯：
其中：
R1和R2彼此独立地是氢原子、羟基或甲氧基，
R3、R5和R7彼此独立地是氢原子、OH基、O-糖基、（C1～C18）烷氧基或具有式（II）的基团
R6是氢原子或OH基，且
R3、R5或R7基团中的至少一个基团是具有式（II）的基团，或R1和R2均是OH基。
10.根据权利要求1～8中任一项所述的用于它的用途的化合物，其特征在于，根据本发明的化合物是具有式（IV）的化合物，或它的一种制药上可接受的盐或酯：
其中：
R1和R2彼此独立地是氢原子、羟基或甲氧基，
R3是OH基、O-糖基、（C1～C18）烷氧基或具有式（II）的基团
R5和R7彼此独立地是氢原子、OH基、O-糖基、（C1～C18）烷氧基或具有式（II）的基团，
R6是氢原子或OH基，且
R3、R5或R7基团中的至少一个基团是具有式（II）的基团，或R1和R2均是OH基。
11.根据权利要求1～8中任一项所述的用于它的用途的化合物，其特征在于，根据本发明的化合物是具有式（V）的化合物，或它的一种制药上可接受的盐或酯：
其中：
R1和R2彼此独立地是氢原子、羟基或甲氧基，
R3是OH基、O-糖基、（C1～C18）烷氧基或具有式（II）的基团
R5和R7彼此独立地是氢原子、OH基、O-糖基、（C1～C18）烷氧基或具有式（II）的基团，且
R3、R5或R7基团中的至少一个基团是具有式（II）的基团，或R1和R2均是OH基。
12.根据权利要求1～8中任一项所述的用于它的用途的化合物，其特征在于，根据本发明的化合物是具有式（I）的化合物，或它的一种制药上可接受的盐或酯：
其中：
+
当a是单键时，X是O；或者，当a是双键时，X是O ；a和b相同或不同，且为单键或双键，
R1、R5和R7基团是羟基，
R2是羟基或氢原子，
R3是羟基、氢原子或具有式（II）的没食子酰基
当a是单键时，R4’是氢原子，或者，当a是双键时，R4’不存在，且
R6是氢原子。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的用于它的用途的化合物，其特征在于，所述化合物选自由花色素类、花色苷类、黄酮醇类及黄烷-3-醇类所组成的组中。
14.根据权利要求1～9及11～13中任一项所述的用于它的用途的化合物，其特征在于，所述化合物是选自由花翠素、美丽天人菊碱或矢车菊素所组成的组中的花色素，或者是选自由表没食子儿茶素（EGC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、没食子儿茶素（GC）、儿茶素没食子酸酯（CG）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）、表儿茶素（EC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG），它们的制药上可接受的盐和酯，及它们的混合物所组成的组中的黄烷-3-醇。
15.根据权利要求1～9及11～14中任一项所述的用于它的用途的化合物，其特征在于，所述化合物是表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、花翠素，或它们的一种制药上可接受的盐和酯。
16.根据权利要求1～15中任一项所述的用于它的用途的化合物，其特征在于，所述化合物与要用于治疗和/或预防HCV感染的添加剂联合给药。
17.根据权利要求1～16中任一项所述的用于它的用途的化合物，其特征在于，所述化合物是在治疗和/或预防由HCV病毒所引起的感染中给药的仅有的抗病毒试剂。
18.一种用于降低丙型肝炎病毒（HCV）的感染性或使丙型肝炎病毒（HCV）失活的活体外的方法，所述方法包括使所述丙型肝炎病毒与具有式（I）的化合物，或它的一种制药上可接受的盐或酯相接触的步骤：
其中：
+
当a是单键时，X是O；或者，当a是双键时，X是O，
R1和R2彼此独立地是氢原子、羟基或甲氧基，
R3、R5和R7彼此独立地是氢原子、OH基、O-糖基、（C1～C18）烷氧基或具有式（II）的基团：
R4和R6彼此独立地是氢原子或OH基；
当a是单键时，R4’是氢原子，或R4’与R4及它们所连接的碳原子一起是C=O基；或者，当a是双键时，R4’不存在，
a和b相同或不同，且是单键或双键，
前提是R3、R5和R7基团中的至少一个基团是具有式（II）的基团，和/或R1和R2均是OH基，
所述具有式（I）的化合物为纯的立体异构体的形式，或为对映异构体和/或非对映异构体的混合物的形式，该混合物包括外消旋混合物。
19.根据权利要求18所述的失活的活体外的方法，其中，所述HCV存在于生物样品中。
表没食子儿茶素没食子酸酯作为抗丙型肝炎病毒感染的抗
病毒试剂的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种在治疗和/或预防丙型肝炎病毒（HCV）感染中用作抗病毒试剂的类黄酮化合物，或其一种制药上可以接受的盐或酯。本发明还涉及一种用于使HCV失活的活体外（ex vivo）的方法，该方法包括使所述丙型肝炎病毒与类黄酮化合物或其制药上可接受的盐或酯相接触的步骤。
背景技术
[0003] 丙型肝炎病毒是具有线性单链RNA和正极性（positive polarity）的病毒，且属于丙型肝炎病毒属的黄病毒科。该病毒是仅知的丙型肝炎病毒属的成员。
[0004] 存在有不同地理分布的六种主要的HCV基因型和多于50种的亚型。通过例示，HCV基因型1主要在欧洲和美国，且基因型4主要在中东和非洲。与病毒强倾向于突变有关的HCV的遗传异质性具有重要的临床和诊断意义，且可以解释在开发疫苗中的困难及对目前治疗缺少应答的情况。
[0005] 事实上，参考的治疗（即聚乙二醇干扰素（IFN）α（聚乙二醇干扰素α）和抗病毒（如病毒唑）的组合）是非特异性的，且是适度有效的。因此，基于所涉及的病毒基因型，在40%～80%被感染的患者中观察到缓解，其中基因型1对可用疗法的抗性是最大的。除了它有限的功效之外，该组合疗法具有显著的副作用。对于IFN疗法，最常观察到的有害效果包括流感样症状，如发热、肌肉或关节疼痛或体重减轻。此外，描述了神经精神的副作用，包括精神病人中的情绪波动及甚至的自杀念头。聚乙二醇干扰素还可以诱导自身免疫疾病，或甚至可以恶化在先存在的自身免疫障碍。使用病毒唑所经常观察到的普通副作用是需要在治疗过程中持续监控血液参数的贫血症、特别是溶血性贫血。
[0006] 这些不同的有害的副作用是患者拒绝治疗的主要原因。因此需要有更加有效、实际可行且具有更好耐受的治疗选择。
[0008] 为了解决现有技术中的这些问题，本发明人已经示出不管其病毒的基因型如何，包含具有化学式 的3,4,5-三羟基-苯基的类黄酮，且更具体的是特定的儿茶素均具有特异性的HCV抗病毒效果。
[0009] 类黄酮化合物是植物中，且特别是在大部分水果和蔬菜中天然存在的物质。类黄酮化合物是造成花和水果具有不同颜色的原因，且提供了食品中食用抗氧化剂的重要来源，且构成多酚的亚类。很多类黄酮化合物具有治疗特性，且因它们在抑制转移灶的血管生成和形成过程中的卓越潜能而出名。在类黄酮中，且更具体地在3-羟基类黄酮中，区分出黄酮醇类、花色苷类、白花色苷类和儿茶素类作为亚类。儿茶素类被认为是研究最多的类黄酮化合物。
[0010] 儿茶素、它们的衍生物或它们的降解产物拥有多种治疗特性。已经广泛描述了它们以分离的儿茶素的形式或以绿茶（它们大部分来源于绿茶）的提取物的形式的治疗效果。完全在例示的基础上，可例举儿茶素、(-)-表儿茶素（EC）、(-)-表没食子儿茶素（EGC）、(-)-表儿茶素-3-没食子酸酯（ECG）和表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）。这样，儿茶素因此可以被描述为对肥胖症或心血管疾病（如动脉粥样硬化）具有预防性效果。儿茶素还被描述为具有抗菌的抗氧化、抗癌或抗病毒的效果（Khan N等、Life Sci.200781、19-33）。
[0011] 这些儿茶素的作用模式是不同。因此，在乳腺癌或前列腺癌的情况下，儿茶素的抗致癌性与EGCG对癌细胞的细胞毒性作用相关联（Stuart EC等、Life Sci.2006、79:2329-36）。认为儿茶素的抗病毒效果经过不同的代谢途径。在流感或乙型肝炎病毒的情况中，认为EGCG和/或ECG抑制病毒复制和/或转录（Song J M等、Antiviral Research2005 68 66-74;.Xu等、2007）。关于流感病毒或人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1），EGCG抑制与它们各自的宿主细胞结合（Song J M等、Antiviral Research2005 68 66-74;
和Nance CL等、J Allergy Clin Immunol2009 123:459-65）。在单纯疱疹病毒（1型和2型）的情况下，EGCG通过响应于与包膜蛋白结合而产生孔从而诱导病毒死亡（Isaacs CE等、Antimicrob Agents Chemother.2008 52:962-70）。
和Nance CL等、J Allergy Clin Immunol2009 123:459-65）。在单纯疱疹病毒（1型和2型）的情况下，EGCG通过响应于与包膜蛋白结合而产生孔从而诱导病毒死亡（Isaacs CE等、Antimicrob Agents Chemother.2008 52:962-70）。
[0012] 关于肝脏，儿茶素特别因为它们的抗氧化特性而被描述为肝脏保护性的。此外，它们常常与肝病的治疗疗法相关联。因此，儿茶素被描述为在乙型病毒性肝炎或丙型病毒性肝炎的治疗中降低细胞坏死（Patrick L等、Altern Med Rev.1999Aug;4(4):220-38）。该作用不依赖于病毒感染自身，但能够降低与其相关联的肝脏的坏死性炎症。
[0013] 已经提出将儿茶素用于涉及由吲哚胺2,3-二加氧酶（IDO）介导的免疫抑制路径的疾病的治疗，其中是特定的癌症及包括丙型肝炎的病毒性感染（WO2008115804）。因此，该治疗疗程不是特异性的且是间接的，因为它需要通过免疫调制进行治疗。
[0014] 现有技术还描述了通过使用抗病毒试剂结合细胞蛋白酶体的抑制剂来治疗丙型肝炎。在提到的细胞蛋白酶体抑制剂中，还描述了EGCG的特征。然而，仍热有待描述蛋白酶体抑制剂在该治疗中的作用机制及优点（WO2011/009961）。
[0015] 还提到聚合型的儿茶素治疗丙型肝炎（US2010/0055065）。描述了该多酚聚合物显示出通过抑制HCV病毒的复制而具有抗病毒活性，但是受到包含至少三种单体的限制。许多多酚，且更具体地所有的儿茶素被认为是潜在的单体。但是，在该研究过程中，作者已经使用的仅有Lohmann等（Science、1999）描述的基因型1b复制子。
[0016] 但是，现有技术中没有一篇文献描述了具有HCV特异性抗病毒效果的分子，该分子对接受治疗的患者是有效的，同时对接受治疗的患者具有小的有害副作用或没有有害副作用，且该分子不管所涉及的病毒基因型如何均对丙型肝炎病毒具有特异性。
发明内容
[0017] 为了解决现有技术中的所有问题，本发明涉及一种在治疗和/或预防由丙型肝炎病毒（HCV）所引起的感染中用作抗病毒试剂的具有式（I）的化合物，或其一种制药上可接受的盐或酯，
[0018]
[0019] 其中：+
[0020] 当a是单键时，X是O；或者，当a是双键时，X是O，
[0021] R1和R2彼此独立地是氢原子、羟基或甲氧基，
[0022] R3、R5和R7彼此独立地是氢原子、羟基（OH）、O-糖基、（C1～C18）烷氧基或具有式（II）的基团：
[0023]
[0024] R4和R6彼此独立地是氢原子或OH基；
[0026] a和b相同或不同，且是单键或双键，
[0027] 前提是R3、R5和R7基团中的至少一个基团是具有式（II）的基团，和/或R1和R2均是羟基（OH）基团，
[0028] 所述具有式（I）的化合物为纯的立体异构体的形式，或为对映异构体和/或非对映异构体的混合物的形式，该混合物包括外消旋混合物。
[0029] 基于所述具有式（I）的化合物，a和b是单键或双键，且a和b不同时是双键。
[0030] 如本文所使用的，术语“制药上可接受的”及其所涉及的语法上的变形指组合物、载剂、稀释剂和药剂（reagent），这些物质以可互换的方式使用，且可以给药哺乳动物而不会引起有害的生理反应（如恶心、头晕、停食等）。
[0031] 术语“制药上可接受的酯或盐”涉及无机和有机、相对无毒的酸加成盐（acid addition salt），或涉及本发明的化合物的酯，该酯通常通过使游离酸与适当的有机或无机碱发生反应来制备。这样的盐或酯可以在化合物的最终分离和纯化过程中原位制备。尤其可以通过分离地使纯化的化合物以其纯化的形式与有机酸或无机酸发生反应且通过分离由此形成的盐来制备酸加成盐。其中，酸加成盐的实例中指出的是氢溴酸盐、氢氯化物、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、醋酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酚盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐（glucoheptanate）、乳糖醛酸盐、氨基磺酸盐、丙二酸盐、水杨酸盐、丙酸盐、亚甲基-双-b-羟基萘酸盐、龙胆酸、羟乙磺酸盐、二对甲苯酰酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、环己基氨基磺酸盐和奎尼酸盐十二烷基磺酸盐等。（参加例如通过引用并入本文的S M Berge等“Pharmaceutical Salts”J Pharm Sci,66:p1-19(1977)）。
[0032] 根据本发明的化合物是HCV的特异性抑制剂，因为该化合物在单链RNA病毒内仅抑制黄病毒科的一个单独成员：HCV。此外，与一些抗HCV的病毒性抑制剂不同，根据本发明的化合物相对HCV的所有基因型均具有有效的抗病毒效果，所以即使相对于被认为对传统抗病毒剂最具抗性的基因型也具有有效的抗病毒效果。这适用于HCV基因型I的情况。这是使得该化合物成为感兴趣的抑制剂的原因。
[0033] 此外，本发明人已经示出在类黄酮家族的分子中，仅具有3,4,5-三羟基-苯基的分子对HCV具有抗病毒效果。因此，3,4,5-三羟基-苯基的存在对于根据本发明的化合物的抗病毒活性是必需的。该结构发现于具有式（II）的没食子酰基中以及在R1和R2是羟基的中心杂环（色满杂环（chroman heterocycle））的C2中。
[0034] 基于根据本发明的化合物的一个变体，R3、R5或R7基团中的任一个基团是具有式（II）的基团，且R1和R2基团均是OH基。
[0035] 基于本发明的化合物的第二变体，R3、R5和R7基团中的至少两个基团是具有式（II）的基团。
[0036] 本发明人已经证实3,4,5-三羟基-苯基对具有式（I）的化合物的抗病毒特性的叠加效果，这样具有含两个3,4,5-三羟基-苯基的式（I）的化合物的抗病毒效果远远高于仅具有一个基团的化合物的抗病毒效果。
[0037] 有利地，根据本发明的化合物是具有式（I）的化合物，其中R3、R5和R7彼此独立地是选自由O-甲基、O-乙基或O-丙基所组成的组中的O-烷基。
[0038] 术语“O-糖基”应理解为指包括至少一个糖的一个或多个碳链，也就是说指与具有式（I）的化合物的OH基结合的单糖或寡糖；所述单糖或寡糖可能被C1～C6烷基或酚基取代。
[0039] 典型地，O-糖基包括选自由葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖所组成的组中的至少一个单糖。优选地，所述糖基选自由单糖、双糖或三糖所组成的组。
[0040] 有利地，根据本发明的化合物是糖苷配基（aglycane）。
[0041] 本发明还涉及一种具有式（I）的化合物，或其一种制药上可接受的盐或酯，[0042]
[0043] 其中：
[0044] 当a是单键时，X是O；或者，当a是双键时，X是O+；a和b相同或不同，且是单键或双键，
[0045] R1、R5和R7基团是羟基，
[0046] R2是羟基或氢原子，
[0047] R3是羟基、氢原子或具有式（II）的没食子酰基
[0048]
[0049] 当a是单键时，R4’是氢原子，或者，当a是双键时，R4’不存在，且[0050] R6是氢原子。
[0051] 根据第一变体，根据本发明的化合物是具有式（III）的化合物，或其一种制药上可接受的盐或酯：
[0052]
[0053] 其中：
[0054] R1和R2彼此独立地是氢原子、羟基或甲氧基，
[0055] R3、R5和R7彼此独立地是氢原子、OH基、O-糖基、（C1～C18）烷氧基或具有式（II）的基团
[0056]
[0057] R6是氢原子或OH基，且
[0058] R3、R5或R7基团中的至少一个基团是具有式（II）的基团，或者R1和R2均是OH基。
[0059] 优选地，所述化合物是花色素或花色苷。典型地，根据本发明的化合物是具有式（III）的化合物，其中，R1、R2、R3、R5和R7是OH基，且R6是氢原子。这样的具有式（III）的化合物是花翠素(3,3',4',5,5',7-氯化六羟基花色基元（Hexahydroxyflavylium chloride），CAS编号528-53-0)。花翠素可以通过R3、R5和/或R7基团上的糖基化而被改性。花翠素可以为盐的形式，如氯化花翠素。
[0060] 典型地，根据本发明的化合物是具有式（III）的化合物，其中，R1、R2、R5和R7是OH基，且R3和R6是氢原子。这样的具有式（III）的化合物是矢车菊素（Tricetinidin）(3',4',5,5',7-氯化五羟基花色基元，CAS编号65618-21-5)。矢车菊素可以通过R3、R5或R7基团上的糖基化而被改性。矢车菊素可以在茶中发现，且是表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）通过氧化脱没食子酸化作用发生降解的产物。
[0061] 典型地，根据本发明的化合物是具有式（III）的化合物，其中，R1、R2、R3和R7是OH基，R6是氢原子，R5是O-甲基。这样的具有式（III）的化合物是美丽天人菊碱（Pulchellidin）（3,7,3',4',5'-五羟基-5-甲氧基花色基元，CAS编号19077-86-2）。美丽天人菊碱可以通过R3和R7基团上的糖基化而被改性。
[0062]
[0063] 基于第二变体，根据本发明的化合物是具有式（IV）的化合物，或其一种制药上可接受的盐或酯：
[0064]
[0065] 其中：
[0066] R1和R2彼此独立地是氢原子、羟基或甲氧基，
[0067] R3是OH基、O-糖基、（C1～C18）烷氧基或具有式（II）的基团
[0068]
[0069] R5和R7彼此独立地是氢原子、OH基、O-糖基、（C1～C18）烷氧基或具有式（II）的基团，
[0070] R6是氢原子或OH基，且
[0071] R3、R5或R7基团中至少一个基团是具有式（II）的基团，或R1和R2均是OH基。
[0072] 优选地，根据本发明的化合物是黄酮醇(3-羟基-2-苯基色烯-4-酮)。
[0073] 典型地，根据本发明的化合物是具有式（IV）的化合物，其中，R1、R2、R3、R5和R7是OH基；R6是氢原子。所述具有式（IV）的化合物是杨梅酮（或3,3',4',5',5,7-六羟基-2-苯基色烯-4-酮，CAS编号529-44-2）。杨梅酮可通过糖基化（特别是在R3基团上的糖基化）而被改性。
[0074]
[0075] 根据第三变体，根据本发明的化合物是具有式（V）的化合物，或其一种制药上可接受的盐或酯：
[0076]
[0077] 其中：
[0078] R1和R2彼此独立地是氢原子、羟基或甲氧基，
[0079] R3是OH基、O-糖基、（C1～C18）烷氧基或具有式（II）的基团
[0080]
[0081] R5和R7彼此独立地是氢原子、OH基、O-糖基、（C1～C18）烷氧基或具有式（II）的基团，且
[0082] R3、R5或R7基团中的至少一个基团是具有式（II）的基团，或R1和R2均是OH基。
[0083] 优选地，根据本发明的化合物是黄烷-3-醇（黄烷醇或儿茶素）。
[0084] 儿茶素是类黄酮的亚族，类黄酮的结构是基于2-苯基-3-色满基（chromano）的。
[0085] 典型地，根据本发明的化合物是具有式（V）的化合物，其中，R1、R2、R3、R5和R7是OH基，根据本发明的化合物在中心杂环（色满杂环）的C2和C3基团位于顺式位置时是指(-)-表没食子儿茶素（EGC）（(2R,3R)-2-(3,4,5-三羟基苯基)色满-3,5,7-三醇，CAS编号970-74-1），且在中心杂环（色满杂环）的C2和C3基团位于反式位置时是指(-)-没食子儿茶素（(2S,3R)-3,4-二羟基-2-(3,4,5-三羟基苯基)-2H-1-苯并吡喃-3,5,7-三醇;CAS编号3371-27-5），或(+)-没食子儿茶素（GC）（(2R,3S)-2-(3,4,5-三羟基苯基)-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3,5,7-三醇;CAS编号970-73-0）。
[0086]
[0087] 典型地，根据本发明的化合物是具有式（V）的化合物，其中，R1、R5和R7是OH基；R2是氢原子；R3是具有式（II）的没食子酰基，根据本发明的化合物在中心杂环（色满杂环）的C2和C3基团位于顺式位置时被认为是(-)-表儿茶素没食子酸酯（ECG）（(2R,3R)-2-(3,4-二羟基苯基)-3,4-二氢-1(2H)-苯并吡喃-3,5,7-三醇3-(3,4,5-三羟基苯甲酸酯)，CAS编号1257-08-5），且在中心杂环（色满杂环）的C2和C3基团位于反式位置时被认为是儿茶素-3-没食子酸酯（CG）（(2S,3R)-2-(3,4-二羟基苯基)-3,4-二氢-1(2H)-苯并吡喃-3,5,7-三醇3-(3,4,5-三羟基苯甲酸酯)，CAS编号130405-40-2）。
[0088]
[0089] 典型地，根据本发明的化合物是具有式（V）的化合物，其中，R1、R2、R5和R7是OH基；R3是具有式（II）的没食子酰基，根据本发明的化合物在中心杂环（色满杂环）的C2和C3基团位于顺式位置时被认为是(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）（(2R,3R)-5,7-二羟基-2-(3,4,5-三羟基苯基)-3,4-二氢-2H-色烯-3-基3,4,5-三羟基苯甲酸酯;CAS编号989-51-5），且在中心杂环（色满杂环）的C2和C3基团位于反式位置时被认为是(-)-没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）（(2S,3R)-2-(3,4,5-三羟基苯基)-3,4-二氢-1(2H)-苯并吡喃-3,5,7-三醇3-(3,4,5-三羟基苯甲酸酯)，CAS编号4233-96-9）。
[0090]
[0091] 优选地，根据本发明的化合物选自由花翠素、杨梅酮、美丽天人菊碱、矢车菊素、表没食子儿茶素（EGC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、没食子儿茶素（GC）、儿茶素没食子酸酯（CG）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG），其制药上可接受的盐和酯，及其混合物所组成的组。
[0092] 以有利的方式，根据本发明的所述化合物选自由表没食子儿茶素（EGC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、没食子儿茶素（GC）、儿茶素没食子酸酯（CG）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG），其制药上可接受的盐和酯，及其混合物所组成的组。
[0093] 优选地，根据本发明的所述化合物是表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG），或其制药上可接受的盐和酯中的一种。
[0094] 根据本发明的类黄酮化合物是在植物且特别是在大部分水果和蔬菜中天然存在的物质，该类黄酮化合物可以通过纯化获得。通过实例的方式，可以通过从绿茶或黑茶中提取经各种过滤过程获得儿茶素，如在专利US6.383.392或EP1077211中所描述的。还可以通过从植物中纯化获得花色苷类，如在现有技术的文献中且特别在专利申请US2010041877或US2003147980中所描述的。可以在商业渠道中发现所述类黄酮化合物。
[0095] 还可以通过本领域技术人员已知的实施方法（特别如固相合成方法）以化学合成的方式获得类黄酮化合物。可以在商业渠道中发现所述类黄酮化合物。
[0096] 在本发明的上下文中，术语“丙型肝炎病毒”或“HCV”应理解为指丙型肝炎病毒的所有基因型，已有描述或还没有描述的基因型，特别是基因型第1～6型以及它们的亚型，尤其是1a、1b、2a、2b、3、4、5和6型基因型。该术语还应理解为是指能够感染受试者的宿主细胞（如受试者的靶细胞）的重组或非重组的HCV病毒。术语“靶细胞”或“HCV的靶细胞”、“宿主细胞”或“HCV的宿主细胞”应理解为是指易于被HCV感染的细胞。根据本发明的宿主细胞或靶细胞是肝细胞。
[0097] 术语“抗病毒试剂”用于指如下的试剂：能够与HCV病毒与它的组分中的一种或多种直接相互作用，且通过降低或消除病毒的进入、病毒复制或发病机理或在宿主细胞中发生的任何其它事件或其组合来引起HCV感染的抑制。例如，该抗病毒试剂的直接作用与在治疗HCV感染中所使用的化合物通过例如刺激免疫系统的间接作用形成显著差异。
[0098] 术语“被HCV病毒感染”或提及HCV的“病毒性感染”指被HCV病毒感染的受试者或患者的病况。被HCV病毒感染指无临床症状或慢性的HCV感染，而不管它们发展的阶段。该术语还指HCV病毒在宿主细胞中的发病机理中所涉及的进入、复制或任何其它事件或过程。因此，所述感染包括感染试剂（infectious agent）（如能够感染受试者的宿主细胞（如受试者的靶细胞）的重组或非重组的HCV病毒）的论述。
[0099] 目前关于HCV感染所使用的术语“预防”涉及降低病毒感染的风险或抑制病毒感染的发展。根据本发明的能够抑制感染早期的化合物在HCV感染的预防中是特别有利的。
[0100] 目前所使用的术语“治疗”通常指与例如HCV感染相关的疾病或病理状况的征兆或症状特别是由于病毒的抑制而改善，终止其发展，患者的病毒载量的降低或病毒的根除。因此，该术语是指带来HCV进展的衰退、降低、抑制的意思，或HCV感染或该感染的一种或多种症状的预防。
[0101] 根据本发明的所述化合物是抗病毒试剂，特别是用于通过抑制靶细胞（如肝细胞）被丙型肝炎病毒感染和/或抑制丙型肝炎病毒在两个靶细胞间的播散。例如，从被感染的肝细胞中播散至未被感染的肝细胞。
[0102] 根据本发明的化合物抑制病毒感染的两种主要模式，即健康靶细胞（如未被感染的肝细胞）被分离的病毒感染，及第二种模式为病毒从细胞至细胞的散布，换句话说是未被感染的靶细胞被已感染的靶细胞感染。该后一种播散模式是重要的，因为怀疑该模式是特定科的包膜病毒在体内途径的主要模式。
[0103] 优选地，所述化合物是用于抑制丙型肝炎病毒进入的抗病毒试剂。病毒性进入的抑制剂的使用在肝脏移植的情况中可以是特别有利的，以预防移植的肝脏被感染。本发明人通过使用允许感兴趣的病毒包膜糖蛋白（是感染性病毒样颗粒）表达的参考研究模式已经证实所述抑制方法。
[0104] 因此，根据本发明，术语“病毒性进入的抑制（inhibition of viral entry）”或“病毒进入的抑制（inhibition of virus entry）”应理解为从宿主细胞外进入宿主细胞内的病毒基因组的通路的抑制，不管它涉及由单个的病毒颗粒介导的感染还是导致未被感染的宿主细胞感染的其它任何机制。该术语还可理解为指抑制在病毒基因组在宿主细胞的细胞质中释放之前的病毒性感染的任何步骤。这些在释放之前的步骤是：i）病毒或被感染的细胞粘附或附着至第二宿主细胞通常是未被感染的宿主细胞）的表面；ii）与特异的病毒性受体的相互作用；及，iii）病毒颗粒的病毒性脂质包膜与细胞膜（细胞质膜或胞内膜）的融合，从而能够使病毒基因组引入被感染的细胞的细胞质中。本发明人已经进行了实验，旨于将HCV进入宿主细胞的机制分离成它的三个组成步骤，且已经示出仅附着步骤被具有式（I）的化合物（如EGCG、ECG、EGC或花翠素）所抑制。附着步骤是参与病毒性进入机制中的最早的步骤。与“结合”有关的实验及通过对附着至细胞的病毒RNA的定量RT-PCR的定量或壳体蛋白的定量可以支持这样的结果。
[0105] 优选地，所述化合物是用于抑制HCV的表面糖蛋白在病毒基因组进入未被感染的宿主细胞的步骤中行使其功能的抗病毒试剂。这可以通过沉降（pull down）或微量热法测试及表面等离子共振分析（Biacore公司）证实。
[0106] 有利地，根据本发明的化合物是用于抑制丙型肝炎病毒或被丙型肝炎病毒感染的宿主细胞粘附至未被感染的宿主细胞膜的抗病毒试剂。优选地，所述化合物是用于抑制HCV的表面糖蛋白与宿主细胞的至少一种靶蛋白相互作用的抗病毒试剂，且该抗病毒试剂更特别地是用于抑制HCV的糖蛋白（如E1和/或E2糖蛋白），且尤其是：基因型1a的HCV的E1蛋白（Acc编号:AAB67037SEQ ID NO:1）或E2蛋白（Acc编号:AAB67037SEQ ID NO:2），基因型1b的HCV的E1蛋白（Acc编号:AY734976SEQ ID NO:3）或E2蛋白（Acc编号:AY734976SEQ ID NO:4），基因型2a的HCV的E1蛋白（Acc编号:AB047639SEQ ID NO:5）或E2蛋白（Acc编号:AB047639SEQ ID NO:6），基因型2b的HCV的E1蛋白（Acc编号:AY734982SEQ ID NO:7）或E2蛋白（Acc编号:AY734982SEQ ID NO:8），基因型3a的HCV的E1蛋白（Acc编号:AY734984SEQ ID NO:9）或E2蛋白（Acc编号:AY734984SEQ ID NO:10），基因型4的HCV的E1蛋白（Acc编号:AY734986SEQ ID NO:11）或E2蛋白（Acc编号:AY734986SEQ ID NO:12），基因型5的HCV的E1蛋白（Acc编号:AY785283SEQ ID NO:13）或E2蛋白（Acc编号:AY785283SEQ ID NO:14），基因型6的HCV的E1蛋白（Acc编号:AY736194SEQ ID NO:15）或E2蛋白（Acc编号:AY736194SEQ ID NO:16）。
[0107] 术语“抑制HCV表面糖蛋白的相互作用”或“抑制HCV表面糖蛋白的结合”或“抑制糖蛋白E1和/或E2的相互作用”应理解为是指抑制HCV的至少一种表面糖蛋白、且特别是糖蛋白E1或E2中的一种与靶宿主细胞的至少一种蛋白或糖蛋白的特异性结合。例如，抑制糖蛋白E1和/或E2与肝细胞的粘多糖之间的相互作用。可以在病毒颗粒的表面上发现HCV的表面糖蛋白，但HCV的表面糖蛋白还结合至被感染的靶细胞的表白。HCV的表面糖蛋白且特别是糖蛋白E1和/或E2结合至靶蛋白发生在HCV与靶细胞的附着或粘附步骤中，或被感染的靶细胞附着或粘附至另一靶细胞的步骤中。
[0108] 在本发明的上下文中，“靶蛋白”或“宿主细胞的靶蛋白”是表面蛋白或糖蛋白，即跨膜的蛋白或糖蛋白，或锚定至宿主细胞的质膜表面。这些蛋白被HCV的表面糖蛋白且特别是糖蛋白E1和/或E2特异性识别。可以通过实例的方式注意到靶细胞（如肝细胞）的粘多糖。
[0109] 因此，本发明人已经证实了通过具有式（I）的化合物（如EGCG、ECG、EGC或花翠素）的抑制具体涉及糖蛋白E1和/或E2。根据本发明的化合物抑制HCV的E1和/或E2蛋白与靶蛋白（如肝细胞的粘多糖）之间的相互作用。此外，本发明人已经清楚地证明由具有式（I）的化合物（如EGCG、ECG、EGC或花翠素）介导的对病毒性进入的抑制效果，直接涉及在其保守区域中的病毒包膜的糖蛋白。实际上，本发明人已经示出在HCV的所有病毒基因型（基因型1a、1b、2a、2b、3、4、5和6）中均观察到具有式（I）的化合物（如EGCG、ECG、EGC或花翠素）的抑制效果，表明根据本发明的分子与糖蛋白E1和/或E2的结合在糖蛋白E1和/或E2的高度保守的区域中进行。
[0110] 根据本发明，治疗和/或预防被丙型肝炎病毒感染旨在用于如下的患者，该患者对通过免疫调制试剂和/或病毒代谢的抑制剂进行HCV感染的治疗有抗性或不能耐受。
[0111] HCV的基因型1对目前的治疗最具有抗性。它是美国、日本和西欧中丙型肝炎中70%已知病例的原因。但是，少于50%的患者对目前的治疗获得了持久的病毒学应答。根据本发明的化合物对所有已描述的基因型的HCV的病毒感染，且特别是对基因型1的HCV的病毒感染提供抑制，且证实根据本发明的化合物对基因型1的HCV具有非常强的抗病毒能力。
[0112] “病毒性抑制剂”可以被定义为以下三组。
[0113] 第一组包括病毒性代谢的抑制剂。术语“病毒性代谢的抑制剂”理解为指：i）翻译的抑制剂，特别是内部核糖体进入位点（IRES）抑制剂、核酶或siRNA；ii）蛋白成熟的抑制剂，如蛋白酶抑制剂（NS3/NS4a蛋白酶）；iii）病毒基因组复制的抑制剂，特别是病毒性RNA和聚合酶RNA之间结合的抑制剂，或NS5B聚合酶的抑制剂（可以是核苷酸或非核苷酸抑制剂或解螺旋酶的抑制剂）；vi）病毒性组装的抑制剂，如糖基化的抑制剂。
[0114] 第二组的抑制剂包含进入肝细胞的“病毒性进入的抑制剂”。被如此认为的这些抑制剂包括能够全部或部分抑制以下步骤的任何分子：宿主细胞被单个病毒颗粒或被感染的宿主细胞识别的步骤，或者病毒或被感染的宿主细胞的膜附着至未被感染的宿主细胞的细胞表面的步骤，或者病毒性颗粒被宿主细胞内吞的步骤，或者病毒性膜与胞内膜（endosomal membrane）融合的步骤。
[0115] 第三组包含“免疫调制试剂”。术语“免疫调制试剂”理解为合成或天然来源的分子，该分子有助于在病毒性感染的过程中起始或加强哺乳动物中的免疫应答。通过免疫调制试剂的实例，可提及1型干扰素（如干扰素α（IFN-α）、干扰素β（IFN-β）或干扰素ω（IFN-ω）），2型干扰素（如γ干扰素IFN-γ）和聚乙二醇化干扰素。
[0116] 根据第一优选的变体，根据本发明的化合物与附加试剂（additional agent）共给药，目的是用于治疗和/或预防HCV的感染。所述附加试剂优选地是如上文中定义的病毒性抑制剂。
[0117] 所述多种抑制剂的组合使用可以降低与常常在治疗具有高突变率的病毒时所观察到的病毒性抗性有关的风险。
[0118] 有利地，上述附加试剂是免疫调制试剂或HCV的病毒性代谢的抑制剂。
[0119] 根据第二优选变体，所述化合物是在被丙型肝炎病毒感染的治疗和/或预防中给药的仅有的抗病毒试剂。
[0120] 有利地，所述化合物是以药物组合物的形式制备的。典型地，所述药物组合物包含制药上可接受的载剂和根据本发明的化合物。
[0121] 术语“制药上可接受的载剂”理解为指不会在人类或动物中产出副反应（例如过敏反应）的任何溶剂、分散介质、延缓吸收试剂等。制药上可接受的载剂对于本领域技术人员来说是公知的，且包括那些在《雷氏药学大全》（麦克出版公司，伊斯顿，美国，1985）中描述的载剂。特别依赖于给药途径来选择具体的制药上可接受的载剂，给药途径例如为口服、舌下给药、鼻腔给药、口腔给药、经皮给药、静脉注射给药、肌肉给药和/或直肠给药。剂量依赖于如正在考虑的活性成分、给药模式、治疗适应证、年龄、体重和患者的病况等因素。
[0122] 本发明还涉及一种治疗或预防HCV感染的方法，包括向有需要的个体给药治疗有效量的具有式（I）的化合物、其制药上可接受的盐和酯，或其混合物；所述具有式（I）的化合物为纯的立体异构体的形式，或为对映异构体和/或非对映异构体的混合物的形式，该混合物优选包括外消旋混合物。所述具有式（I）的化合物选自由花翠素、杨梅酮、美丽天人菊碱、矢车菊素、表没食子儿茶素（EGC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、没食子儿茶素（GC）、儿茶素没食子酸酯（CG）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG），其制药上可接受的盐和酯，及其混合物所组成的组。所述个体优选是哺乳动物，更优选是人。本领域技术人员可以容易地确定治疗有效量。
[0123] 如本文所使用的，术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指在组织、动物或人类生物系统中引起生物或药物响应的抗病毒试剂（如具有式（I）的类黄酮化合物或它们的衍生物）的量，该生物或药物响应包括主要由于抑制病毒、终止它的发展、减少患者的病毒载量或根除病毒而减轻HCV感染的症状。为了本发明的目的，治疗有效量还可以被认为是活性试剂的“预防的量”。
[0124] 术语“患者”或“有需要的患者”理解为指被HCV感染或可能被HCV感染的人类或非人类的哺乳动物。在优选的实施方式中，上述患者是人类。在另一实施方式中，上述患者是黑猩猩。
[0125] 本发明的目的还涉及一种优选在活体外用于降低丙型肝炎病毒（HCV）的感染性或使HCV失活的方法，包括使所述丙型肝炎病毒与具有式（I）的化合物，或其一种制药上可接受的盐或酯相接触的步骤：
[0126]
[0127] 其中：
[0128] 当a是单键时，X是O；或者，当a是双键时，X是O+，
[0129] R1和R2彼此独立地是氢原子、羟基或甲氧基，
[0130] R3、R5和R7彼此独立地是氢原子、OH基、O-糖基、（C1～C18）烷氧基或具有式（II）的基团：
[0131]
[0132] R4和R6彼此独立地是氢原子或OH基；
[0133] 当a是单键时，R4’是氢原子，或R4’与R4及它们所连接的碳原子一起是C=O基团；或者，当a是双键时，R4’不存在，
[0134] a和b相同或不同，且是单键或双键，
[0135] 前提是R3、R5和R7基团中的至少一个基团是具有式（II）的基团，和/或R1和R2均是OH基，
[0136] 所述具有式（I）的化合物为纯的立体异构体的形式，或为对映异构体和/或非对映异构体的混合物的形式，该混合物包括外消旋混合物。
[0137] HCV与具有式（I）的化合物接触一段时间且处于足以实现使病毒部分或完全失活或抑制的条件下。根据本发明，在感染的步骤之前或在感染的步骤过程中，使HCV与具有式（I）的化合物相接触。感染的步骤是使病毒与靶细胞或其细胞相接触的步骤。
[0138] 术语“感染性”理解为指病毒的感染性质，即病毒引起本发明含义内的病毒性感染的能力，特别是降低病毒进入靶细胞的能力，优选降低病毒附着至靶细胞的能力。
[0139] 有利地，可以通过使可能包含HCV病毒的样品与具有式（I）的化合物在液体或半液体介质中相接触来实施根据本发明的活体外的方法。具有式（I）的化合物优选以0.5μM～100μM的浓度，有利地以10μM～80μM的浓度或以20μM～70μM的浓度使用。典型地，具有式（I）的化合物以50μM的浓度使用。所述方法可以在4℃～37℃、优选
4℃～10℃或20℃～37℃的温度下实施。
4℃～10℃或20℃～37℃的温度下实施。
[0140] 根据本发明的化合物可以与所述病毒接触15～90min、优选从30～45min的时间段。
[0141] 优选地，根据用于降低HCV感染性或使HCV感染性失活的活体外的方法，所述丙型肝炎病毒存在于生物样品中。
[0142] 术语“生物样品”指生物来源的样品或从生物有机体或实体（如器官、组织、细胞、细胞群、生物流体、纯化的蛋白或肽）中获得的样品。在没有限制的情况下，实例包括：生物来源的液体样品，如血液、血浆、血清、脑脊髓液、淋巴或细胞裂解液；固体样品，如特别是要用于移植用途的器官，或能够用于与移植物相关的用途的组织或细胞培养物。
[0143] 根据有利的变体，根据本发明的降低HCV感染性或使HCV失活的活体外的方法包括清洗生物样品的额外步骤。该步骤允许从所述生物样品中减少或除去具有式（I）的化合物。该清洗步骤可以在具有式（I）的化合物的混合物在所述生物样品中孵育的步骤之后进行。
[0144] 根据本发明的活体外的方法还可包括检查和监控生物样品的感染性的额外步骤。这样的步骤被认为是在使具有式（I）的化合物与生物样品相接触的步骤之前或在该接触之后，以确定是否应考虑使生物样品与具有式（I）的化合物接触的另一循环。特别可以通过使HCV感染能够被早期检测到的任何手段进行这样的检查和监控步骤。因此，例如可以通过使用病毒性蛋白的特异性抗体或通过使用HCV RNA的PCR分析的检测进行HCV的特异性标记物的检测。
附图说明
附图说明
[0145] 图1：基 于 以 (EGCG ) 或by ( )出售的50μΜ的(+)-儿茶素(C)、
(-)-表儿茶素(EC)、(-)-表儿茶素-3-没食子酸酯(ECG)、(-)-表没食子儿茶素(EGC)和(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯，或DMSO的存在下，Huh-7细胞被JFH1-Rluc病毒相对病毒性感染的图解。
(-)-表儿茶素(EC)、(-)-表儿茶素-3-没食子酸酯(ECG)、(-)-表没食子儿茶素(EGC)和(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯，或DMSO的存在下，Huh-7细胞被JFH1-Rluc病毒相对病毒性感染的图解。
[0146] 图2：基于在感染过程中培养基中EGCG的浓度（0；0.5；5；50μΜ），或在感染步骤之前使用50μΜ EGCG对病毒进行预处理，Huh-7细胞被JFH1-Rluc病毒相对病毒性感染的图解。
[0147] 图3：基于感染培养基中EGCG（50μΜ）或二甲基亚砜（DMSO）的存在，被1a、1b、2a、2b、3、4、5或6型基因型的HCV病毒的感染性病毒样颗粒（HCVpp）感染或被水疱性口炎病毒VSV的病毒样颗粒感染的Huh-7细胞的相对病毒性感染的图解，在上述感染性病毒样颗粒（HCVpp）的表面上表达包膜蛋白E1和E2，上述水疱性口炎病毒VSV的病毒样颗粒表达VSV的包膜蛋白（VSVpp）。
[0148] 图4：基于感染培养基中EGCG（50μΜ）或二甲基亚砜（DMSO）的存在，被黄热病病毒（YFV）或辛德比斯病毒（SINV）感染的Huh-7细胞或被牛病毒性腹泻病毒（BVDV）感染的马-达氏牛肾（MDBK）细胞的相对病毒性感染的图解。
[0149] 图5：在EGCG（50μΜ）存在或不存在的情况下，对于Huh-7细胞被JFH1病毒的病毒性感染的每一感染位点的细胞数量的图解。
[0150] 图6：在感染培养基被DMSO或EGCG处理之后进行的传代P0至P4的过程中，细胞被上清液感染的细胞百分比的图解。
[0151] 图7：图7A.例示用于研究EGCG对如下过程的抑制效果的实验条件的简图：HCV的进入（样品5），且更具体地，附着步骤（样品2），与宿主细胞的受体的相互作用（样品3），及病毒和细胞膜的内吞和融合的步骤（样品4），使用DMSO作为对照（样品1）。
[0152] 图7B.基于在样品1～5中DMSO或EGCG（50μΜ）的存在下，Huh-7细胞被JFH1-Rluc病毒相对病毒性感染的图解。
[0153] 图8：基于EGCG或花翠素（逐渐增加的浓度）的存在下，Huh-7细胞被HCVcc病毒相对病毒性感染的图解。该曲线图示出代表独立进行的三个实验的实验。
[0154] 图9：基于DMSO、50μΜ EGCG、50μΜ氯化花翠素或500μg/mL肝素的存在下，HCVcc病毒对Huh-7细胞的相对病毒性附着的图解。该相对附着被表示为已被主观分配为100%的值的对照（DMSO）的百分比。
具体实施方式
[0155] 材料和方法
[0156] 药剂
[0157] 杜氏改良培养基（杜氏改良伊格尔培养基DMEM, ），杜氏极限必需培养基（极限必需伊格尔MEM, ）、盐水磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲盐水PBS）、减少血清培养基（ ）、丙氨酰-谷氨酰胺（GLUTAMAX-ITM）、山
羊血清、马血清以及胎牛血清（FCS）是购自 的产品。4',6-二脒
基-2-苯基吲哚（DAPI）获自MOLECULAR (-)-表没食子儿茶素没食子酸酯
（EGCG ）和聚乙烯醇( 3-88)购自 体
内转染试剂 购自 (+)-儿茶素、(-)-表儿茶素、(-)-表
儿茶素-3-没食子酸酯（ECG）、(-)-表没食子儿茶素（EGC）和(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG ）购自 公司（里昂，法国）。氯化花翠素
由Extrasynthèse生产（里昂，法国）。其它药剂购自 公司。
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由Extrasynthèse生产（里昂，法国）。其它药剂购自 公司。
[0158] 抗体
[0159] 通过使用 设备按照制造商的建议体外产生被称作MAb2D12(ATCC CRL-1689)的针对黄热病病毒（YFV）包膜蛋白（E）的小鼠单克隆抗体（MAb）及被称作NS3MAb Osc-23的针对牛病毒性腹泻病毒（抗-BVDV）NS3蛋白的小鼠单克隆抗体（Boulanger,D,等,J Gen Virol,1991.7:p.1195-1198）。被称作MAb5A6的小鼠单克隆抗体抗-CD81（Oren,R,等,Mol Cell Biol,1990.10(8):p4007-15）由S Levy（斯坦福大学）友情提供，且单克隆抗体抗-CD81（被称作MAb JS-81）购自BD Cy3山羊
抗-小鼠IgG抗体缀合物购自
抗-小鼠IgG抗体缀合物购自
[0160] 细胞系和细胞培养条件
[0161] 人类肝细胞系Huh-7（Nakabayashi,H等;Cancer Res,1982.42(9)p3858-63）以TM及HEK293T细胞培养在补充有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（GLUTAMAX-I ）和10%胎牛血清的DMEM培养基（ ）中。马-达氏牛肾（MDBK）细胞培养在补充有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（GLUTAMAX-ITM）和10%马血清的DMEM培养基中。BHK-21细胞培养在补充有L-丙氨TM
酰-L-谷氨酰胺（GLUTAMAX-I ）和10%胎牛血清的MEM培养基（ ）中。
酰-L-谷氨酰胺（GLUTAMAX-I ）和10%胎牛血清的MEM培养基（ ）中。
[0162] HCVcc
[0163] 编码分离的JFH1（基因型2a，GenBank登记号AB237837）的基因组的质粒的修改版由T Wakita先生（传染疾病国家研究所，东京，日本）（Wakita,T,等,Nat Med,2005.11(7):p791-6）友情提供。经修改的JFH1病毒性克隆包含导致以下氨基酸改变（F172C和P173S、N534K）的突变，这些突变已经示出引起病毒性载量的增加（Delgrange,D,等,J Gen Virol,2007.88(Pt9):p2495-503）。此外，编码196TSSSYMVTNDC残基的E1序列已经被修改，以便重构HCV的E1糖蛋白的表位A4（SSGLYHVTNDC）（Dubuisson,J,等,J Virol,1994.68(10):p6147-60），如在现有技术中的文献中所描述的（Goueslain,L,等,J Virol,2010.84(2):p773-87）。质粒JFH-Luc包含海肾荧光素酶（Rluc）的基因作为报告基因，且质粒JFH-ΔE1E2-Luc包含不会导致在E1E2区域内发生阅读框移位的缺失（Wakita,T,等,Nat Med,2005.11(7):p791-6），如在现有技术中所描述的（Goueslain,L,等 ,J Virol,2010.84(2):p773-87 和 Rocha-Perugini,V, 等 ,PLoS ONE,2008.3(4):p e1866）。
[0164] 为了产生HCV的基因组RNA，通过在Xbal限制性位点（restriction site）处的剪切使质粒在HCV cDNA的3’端线性化。使用Mung大豆核酸酶（Mung bean nuclease）处理后，接着将线性DNA用作使用 试剂盒（购自 ）进行的体外转录的模板。体外转录的RNA通过电穿孔法被转染进入Huh-7细胞中，如在现有技术中所描述的（Kato,T,等,Gastroenterology,2003.125(6):p1808-1817）。如在现有技术中所描述的获得病毒性提取物（Delgrange,D,等,J Gen Virol,2007.88(Pt9):p2495-503）。
[0165] 考虑到对被HCVcc病毒感染的测试，将Huh-7细胞培养在24孔培养板中，其中在37℃2小时的时段内进行感染。考虑到使用EGCG的测试，在感染之前病毒在EGCG的存在下预孵育45min，和/或在感染的过程中添加EGCG至培养基中直至反应终止，除非有其它指示。在特定测试的过程中，在感染步骤之后的不同时间段（感染后24、48或72小时）添加EGCG。通过使用海肾荧光素酶测试系统试剂盒（购自 ），或通过在感染后48小时或72小时使用抗-E1的抗体（A4）的免疫荧光检测，在感染步骤后48小时测量细胞裂解液中的荧光素酶的活性评定感染率。
[0166] HCV的假颗粒（HCVpp）
[0167] 现有技术中已经描述了假型的逆转录病毒颗粒（Bartosch,B,J Dubuisson and F L,J Exp Med2003.197(5):p633-42）。简单来讲，293T细胞与源自小鼠白血病病毒（murine leukemia virus，MLV）的编码荧光素酶（Op De Beeck,A,等,J Virol,2004.78(6):p2994-3002）的转染载体，包括小鼠白血病病毒的Gag-Pol基因的构建体的载体，和表达包膜糖蛋白的载体共转染。使用转染试剂 500在供应商推荐的条件下实施该共转染。编码以下基因型的HCV病毒性包膜糖蛋白的质粒由J Ball（诺丁汉大学，英国）友情提供（Lavillette,D,等,Hepatology,2005.41(
2):p265-74）：基 因 型1b-UKN1b-5.23(AY734976)，基 因型 2b-UKN2b-1.1(AY734982)，基 因 型 3a-UKN3a-1.28(AY734984)，基 因 型 4-UKN4-11.1(AY734986)，基 因 型
5-UKN5-14.4(AY785283)，基因型6-UKN6-5.340(AY736194)。现有技术中（Bartosch,B,J Dubuisson and F L,J Exp Med2003.197(5):p633-42）已经描 述了基因型 1a-H77（AAB67037，具有修改位于R564C、V566A、G650E的三个氨基酸的突变）的质粒，且基因型2a-JFH-1（AB047639）的质粒由R.Bartenschlager（海德堡大学,德国）友情提供。编码水疱性口炎病毒（VSV G）的G蛋白的表达载体phCMV-G已经用于在对应于小鼠白血病病毒（VSVpp）的中心的带有VSV G包膜糖蛋白的假型逆转录病毒颗粒的受控生产。文献中已经描述了表达荧光素酶的HCVpp的转染反应（Op De Beeck,A,等,J Virol,2004.78(6):p2994-3002）。
2):p265-74）：基 因 型1b-UKN1b-5.23(AY734976)，基 因型 2b-UKN2b-1.1(AY734982)，基 因 型 3a-UKN3a-1.28(AY734984)，基 因 型 4-UKN4-11.1(AY734986)，基 因 型
5-UKN5-14.4(AY785283)，基因型6-UKN6-5.340(AY736194)。现有技术中（Bartosch,B,J Dubuisson and F L,J Exp Med2003.197(5):p633-42）已经描 述了基因型 1a-H77（AAB67037，具有修改位于R564C、V566A、G650E的三个氨基酸的突变）的质粒，且基因型2a-JFH-1（AB047639）的质粒由R.Bartenschlager（海德堡大学,德国）友情提供。编码水疱性口炎病毒（VSV G）的G蛋白的表达载体phCMV-G已经用于在对应于小鼠白血病病毒（VSVpp）的中心的带有VSV G包膜糖蛋白的假型逆转录病毒颗粒的受控生产。文献中已经描述了表达荧光素酶的HCVpp的转染反应（Op De Beeck,A,等,J Virol,2004.78(6):p2994-3002）。
[0168] 其它病毒
[0169] 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的NADL毒株和黄热病病毒（YFV）的17D毒株被用作对照。按照之前所述生产BVDV（Lecot,S,等,J Virol2005.79(16):p10826-9）。将MDBK细胞接种在24孔板中的盖玻片上，且在24小时后被感染。在EGCG存在下，这些细胞在37℃在感染倍数（MI）大约为1处被BVDV感染1小时，然后它们被培养15小时。被感染的细胞以及对照细胞在PBS缓冲液中进行冲洗，然后被3%的多聚甲醛固定，以使用抗-NS3MAb的抗体（单克隆抗体）（Osc-23）进行免疫荧光染色。考虑到YFV感染，将Huh-7细胞接种在24孔板中的盖玻片上，且在24小时后被感染。在EGCG存在下，这些细胞在37℃在MI大约为1处被YFV病毒感染1小时，然后它们被培养23小时。被感染的细胞以及对照细胞在PBS缓冲液中进行冲洗，然后被3%的多聚甲醛固定。使用抗-E MAb2D12的抗体进行免疫荧光反应。通过从体外转录的RNA进行BHK-21细胞的电穿孔法获得Toto1101/Luc样品（Bick,M J,等,J Virol2003.77(21):p11555-62）以及表达荧光素酶（萤火虫荧光素酶系统）的辛德比斯病毒（SINV）（由Mr MacDonald友情提供,洛克菲勒大学,纽约,美国）。简单来讲，将15μg RNA与4×106个BHK-21细胞混合，然后使用方波电穿孔器在25μF和140V进行电穿孔的步骤。48小时后回收上清液。
[0170] 间接的免疫荧光显微镜观察
[0171] 如在文献中所描述的进行检测在被感染的细胞中表达的免疫荧光病毒性蛋白的程序（Rouille,Y,等,J Virol,2006.80(6):p2832-41）。通过在含1μg/ml的4',6'-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的PBS缓冲液中孵育5min进行细胞核的染色。使用安放介质（mounting medium） （10%Mowiol,25%甘油,0.1M Tris-HCl pH8.5）将盖玻片安放在玻璃载片上，然后通过装配有放大10×和20×、物镜数值孔径为0.5的AXIOPHOT荧光显微镜进行观察。使用照相机Coolsnap ES（Photometrix）特别使用荧光激发和发射滤光片收集荧光信号。使用Adobe 软件对图像进行组装和处理。
对于定量步骤，记录随机获取的每一盖玻片的各区域的图像。对被抗-E MAb A4、抗-BVDV NS3或抗-YFV E的抗体标记的细胞进行计数，且被记录为被感染的细胞。通过DAPI染色的细胞核对细胞总数进行计数。感染被定义为被感染的细胞对细胞总数的比值。
对于定量步骤，记录随机获取的每一盖玻片的各区域的图像。对被抗-E MAb A4、抗-BVDV NS3或抗-YFV E的抗体标记的细胞进行计数，且被记录为被感染的细胞。通过DAPI染色的细胞核对细胞总数进行计数。感染被定义为被感染的细胞对细胞总数的比值。
[0172] 测试HCVcc病毒从细胞至细胞的播散
[0173] 在24孔板中培养的Huh-7细胞在2小时的时间段中被HCVcc感染。去除接种液，且替换为含EGCG（50μM）或等量二甲基砜（DMSO）（作为对照）的补充有胎牛血清和1%低熔点琼脂糖凝胶（ 琼脂糖，购自）的DMEM培养基。这些细胞在37℃孵育3天时间，在结束时去除琼脂糖且使用之前描述的用于HCV E1蛋白的间接免疫荧光检测感染位点。
[0174] 关于结合的实验
[0175] 在DMSO或50μM EGCG的存在下，Huh-7细胞在4℃被JFH-Luc病毒感染1小时（附着/结合步骤）。上述细胞用PBS清洗，然后在DMSO或50μM EGCG的存在下在4℃再孵育1小时（后附着/结合至宿主细胞受体的步骤）。然后，这些细胞被清洗以去除EGCG或DMSO，且在DMSO或50μM EGCG的存在下在37℃孵育1小时（内吞/融合的步骤）。最后，上述细TM
胞被清洗，且使用补充有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（GLUTAMAX-I ）和10%胎牛血清的DMEM培养基（ ）在进行37℃孵育48小时。通过使用海肾荧光素酶检测系统试剂盒（购自 ）测量细胞裂解液中的荧光素酶的活性计算感染的水平。
胞被清洗，且使用补充有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（GLUTAMAX-I ）和10%胎牛血清的DMEM培养基（ ）在进行37℃孵育48小时。通过使用海肾荧光素酶检测系统试剂盒（购自 ）测量细胞裂解液中的荧光素酶的活性计算感染的水平。
[0176] 定量“结合”测试
[0177] HCVcc.对于定量“结合”测试，HCVcc病毒是大量生产的，且通过在碘克沙醇梯度中的浓缩和分离进行纯化。使用8%PEG6000在4℃沉淀被感染的细胞的上清液过夜，且在10000rpm离心25分钟。将沉淀块重悬在1mL PBS中，装载指连续的碘克沙醇梯度（10～
40%）中，且在4℃36000rpm离心16小时。收集500μl的各部分，且确定每一部分的滴度。
合并感染最强的部分以进行实验。
40%）中，且在4℃36000rpm离心16小时。收集500μl的各部分，且确定每一部分的滴度。
合并感染最强的部分以进行实验。
[0178] 定量“结合”测试.在4℃ EGCG（50μM）、氯化花翠素（50μM）或猪小肠肝素（500μg/mL）的存在下，使HCVcc病毒与Huh-7细胞接触1小时。在使用PBS清洗三次后，使用NucleoSpin RNA II试剂盒（Macherey-Nagel,迪伦,德国），以及通过定量RT-PCR进行定量的HCV RNA（Castelain等,J Clin Virol2004）提取总的RNA（病毒性和细胞的RNA）。肝素作为对照平行使用。
[0179] 实例1
[0180] 不同的绿茶儿茶素对HCV病毒感染的效果的测试
[0181] 在DMSO或50μM以下不同的儿茶素的存在下，Huh-7细胞被JFH1-Rluc病毒感染达2小时：(+)-儿茶素(C)、(-)-表儿茶素(EC)、(-)-表儿茶素-3-没食子酸酯(ECG)、(-)-表没食子儿茶素(EGC)和(-)-表没食子儿茶素-3-没食 子 酸 酯（购 自 （EGCG ） 或
（EGCG ））。EGCG这些组合物的纯度不同，
DMSO用作不同儿茶素的
溶剂，且DMSO作为对照测试。
（EGCG ））。EGCG这些组合物的纯度不同，
DMSO用作不同儿茶素的
溶剂，且DMSO作为对照测试。
[0182]
[0183] 感染后48小时裂解上述细胞，且定量荧光素酶的表达。
[0184] 对基于感染过程中培养基中存在的儿茶素的Huh7细胞被JFH1-Rluc病毒相对性病毒感染（图1）的测量允许清楚地证实(+)-儿茶素(C)或(-)-表儿茶素(EC)均没有诱发对HCV病毒引起的病毒性感染的抑制。实际上，相对性病毒性感染的测量与对DMSO观察到的结果相同。
[0185] 但是，应注意到购自 或 的EGCG示出显著抗病毒效果，病毒性感染的抑制率高于95%。关于ECG和EGC分子，也发现抗病毒性效果，但是具有较低的病毒性感染的抑制率，大约分别为40%和80%。
[0186] 与EGCG相比，在ECG或EGC的存在下，对相对性病毒性感染的测量表明了色满杂环的C2-3,4,5-三羟基-苯基和在色满杂环的C3没食子酰基中存在的该相同结构对EGCG的抗病毒作用的叠加效果。
[0187] 假定EGCG分子（不管是购自 还是 ）在抑制HCV感染方面均具有相同的效果，则在以下部分仅例示购自 的
EGCG。
EGCG。
[0188] 实例2
[0189] 在渐增剂量的EGCG（0；0.5；5；50μΜ）的存在下，体外培养的Huh-7细胞被JFH1-RLuc病毒或预先用EGCG（50μΜ）孵育45分钟的病毒感染达2小时。感染之后，使用补充有10%胎牛血清的DMEM培养基清洗上述细胞，且在相同的培养基中孵育该细胞。感染后48小时，裂解这些细胞，且在20μL细胞裂解液与荧光素底物孵育之后通过光度计对海肾荧光素酶的活性进行定量。
[0190] 图2示出EGCG对病毒性感染的抑制是剂量依赖性的。
[0191] 在50μM处，EGCG使培养的Huh-7细胞的病毒性感染降低大于10倍（IC50=5μM）。但是，病毒性复制不受EGCG的影响（结果未示出）。因此，EGCG抑制病毒性感染的早期阶段，即，使病毒能够进入细胞的步骤。
[0192] 相反，如果未被感染的细胞在感染之前或之后经该分子处理，则观察到EGCG对病毒性进入没有效果。因此，由EGCG引起的抑制直接作用在病毒上，而不是作用在宿主细胞上。当在感染之前将病毒与上述分子一起孵育（预处理50μM）时，观察到EGCG的抑制效果增加，这支持了该假设。
[0193] 实例3
[0194] 病毒性包膜蛋白在病毒性进入中起到非常关键的作用。实际上，除了允许与宿主细胞受体相互作用之外，这些蛋白使得能够引起病毒性包膜和细胞包膜之间的融合。为了研究EGCG对被HCV病毒感染的初始阶段的效果，使用了参考研究模型，以允许感兴趣的病毒性包膜糖蛋白的表达：这些是感染性病毒样颗粒。
[0195] 不同基因型的HCV病毒存在于全球人群中。因此，为了确定相对于HCV的病毒基因型EGCG的抑制效果的特异性，研究了不同基因型的HCV病毒的包膜糖蛋白E1和E2。产生在其表面上表达1a、1b、2a、2b、3、4、5和6型基因型的HCV病毒的包膜蛋白E1和E2的感染性病毒样颗粒（HCVpp）；且作为对照，产生表达包膜蛋白VSV的VSV病毒的病毒样颗粒（VSVpp）。产生的各种病毒样颗粒均表达荧光素酶，以便对感染进行定量。
[0196] 为了这样作，在50μΜEGCG或DMSO的存在下，Huh-7细胞被测试的各种不同基因型的HCVpp病毒样颗粒或VSVpp病毒样颗粒感染达2小时。DMSO是EGCG的溶剂，且用作对照。感染后48小时，裂解上述细胞，且在20μL细胞裂解液与荧光素底物孵育之后通过光度计对海肾荧光素酶的活性进行定量。
[0197] 虽然VSVpp对感染没有效果，但EGCG（50μΜ）对所有测试的基因型的HCVpp引起的感染均有抑制效果（图3）。
[0198] 因此，EGCG的抑制效果直接涉及病毒性包膜糖蛋白。因此，由EGCG介导的对病毒性进入的抑制是由于抑制了附着步骤（即与宿主细胞受体的初始相互作用）或抑制了病毒性包膜和细胞包膜之间的融合的步骤，或抑制了这两个步骤。
[0199] 进一步地，表达不同病毒性基因型的病毒性糖蛋白的HCVpp的应用示出，不管所测试的基因型如何，EGCG均是HCV的有效抗病毒试剂。可以观察到，在EGCG的存在下，1b、2a、2b和4型基因型的HCVpp引起的感染具有基本为零相对感染。对于基因型1a、3a、5和
6型，观察到的相对感染非常低，即在5%至13%之间。因此，虽然在EGCG的存在下由VSVpp引起的感染所测量的相对感染率为85%，但在EGCG的存在下由HCVpp引起的感染（不管涉及的基因型如何）所测量的相对感染率在13%至0%之间。这些结果示出EGCG在治疗丙型肝炎（不管涉及的病毒性基因型如何）中作为抗病毒剂的巨大潜力。此外，应特别注意到EGCG也抑制HCV基因型1，HCV基因型1对目前的治疗最具抗性且是欧洲和美国人群中的主要基因型。
6型，观察到的相对感染非常低，即在5%至13%之间。因此，虽然在EGCG的存在下由VSVpp引起的感染所测量的相对感染率为85%，但在EGCG的存在下由HCVpp引起的感染（不管涉及的基因型如何）所测量的相对感染率在13%至0%之间。这些结果示出EGCG在治疗丙型肝炎（不管涉及的病毒性基因型如何）中作为抗病毒剂的巨大潜力。此外，应特别注意到EGCG也抑制HCV基因型1，HCV基因型1对目前的治疗最具抗性且是欧洲和美国人群中的主要基因型。
[0200] 实例4
[0201] 实例2证实EGCG对HCV（不管其基因型）的抗病毒性质。此外，实例2证实因为EGCG不抑制VSV感染，因此该效果对HCV是特异性的。但是，当HCV是具有正极性的单链RNA基因组的病毒时，VSV是未分段（non segmented）的反义RAN病毒。
[0202] 因此，为了确定EGCG在甚至是单链正RNA病毒内的特异性水平，在EGCG的存在下使用黄病毒科中的其它病毒进行感染实验。
[0203] 对黄热病病毒（YFV）、辛德比斯病毒（SINV）或牛病毒性腹泻病毒（BVDV）进行测试。在EGCG（50μΜ）或二甲基亚砜（DMSO）的存在下进行感染。被这些各种病毒感染的细胞是：被YFV或SINV感染的是Huh-7细胞，或被BVDV感染的是MDBK细胞。在针对YFV病毒使用抗E（2D12）抗体或针对BVDV病毒使用抗NS3（osc-23）抗体标记被感染的细胞之后，通过免疫荧光进行感染的定量。然后使用Cy3标记的二抗进行检测步骤。考虑到SINV病毒，后者表达荧光素酶，通过荧光素酶的定量进行相对感染的测量。
[0204] 基于细胞被YFV、BVDV和SINV病毒感染（图4）的过程中培养基中EGCG或DMSO的存在，对感染的定量清楚地示出EGCG对这些病毒中的任一种的细胞感染均不具有抑制效果。
[0205] 因此，EGCG不是黄病毒科的其它成员的抗病毒剂。EGCG的抗病毒效果是特异性针对HCV的。
[0206] 实例5
[0207] 上面描述的结果示出EGCG抑制病毒进入培养的细胞。病毒性感染的第二模式是从细胞至细胞的病毒播散。为了确定EGCG是否也抑制病毒从细胞至细胞的传播，在存在或不存在EGCG（50μM）时，使用JFH1病毒感染Huh-7细胞达2小时，且然后将Huh-7细胞孵育在包含1%琼脂糖的培养基中。琼脂糖防止细胞被分泌至培养基中的病毒所感染，因此由于细胞自身相互接触使得可以观察病毒从细胞至细胞的播散。
[0208] 在感染后72小时，固定上述细胞，且在经抗E1的抗体标记后通过免疫荧光检测感染。然后，使用Cy3联接的二抗进行检测的步骤。细胞核经DAPI染色进行染色。对每感染位点的细胞的数量进行定量（图5）。在EGCG的存在下，感染位点少很多。它们包含平均3～4个被感染的细胞，示出病毒在感染细胞之后没有增殖。相反，对照位点包含平均45个被感染的细胞。鉴于前面所提到的，EGCG是HCV病毒细胞至细胞增殖的抑制剂。
[0209] 因此，EGCG显示为抗病毒剂的良好的候选者，以预防健康的肝脏在其移植到被感染的患者中之后被再感染。
[0210] 实例6
[0211] 进行涉及在存在或不存在EGCG的情况下从被感染的细胞的上清液进行的相继感染的实验，以便测试EGCG对被感染细胞的上清液的毒力的效力，及其它从被感染的培养上清液中根除病毒的能力。使用病毒HCV JFH（P0）感染Huh-7细胞。感染后添加DMSO或50μM的EGCG。48小时后收集培养上清液，然后该上清液用于在DMSO或50μM EGCG（P1）的存在下感染健康细胞。48小时后依次收集该培养物（P1）的上清液以用于再感染健康细胞（P2）。该程序再重复进行两次（达到P4）。在使用针对病毒性包膜蛋白E1（A4）抗体的抗体标记上述细胞之后，通过免疫荧光在每一传代细胞中对被感染的细胞数量进行定量。在经DAPI标记染色之后对细胞核进行计数以对细胞的总数量进行定量。
[0212] 上清液在从一个培养物至另一培养物的每一次传代中被感染的细胞的百分比依赖于EGCG或DMSO的添加（图6），该研究示出从第三代向前EGCG允许从培养上清液中消除HCV，且在第四代完全消除。这支持了EGCG在被感染HCV的患者中作为治疗性分子的良好的候选者的结论。
[0213] 实例7
[0214] HCV病毒进入宿主细胞由三个步骤组成：i）病毒或被感染的宿主细胞附着至未被感染的宿主细胞的表面；ii）与特异性病毒性受体的相互作用；及iii）病毒性脂质包膜和被感染的宿主细胞（胞内膜或细胞质膜）的融合，以使病毒基因组能够引入被感染的细胞的细胞质中。为了确定EGCG抑制了这些步骤中的哪个步骤，将病毒性进入以如下方式分开，以独立地研究EGCG对这些步骤中的每一步骤的抑制效果（见图7A）。
[0215] 通过使细胞与病毒相接触然后在4℃孵育一小时，以影响病毒颗粒附着至细胞的步骤。在去除病毒性接种物之后，通过在4℃孵育该细胞1小时进行第二步骤，从而允许附着的病毒加强它们与它们的受体的结合。在4℃，中断内吞的过程。然后，在37℃进行内吞以及病毒性膜和细胞膜融合的第三步骤达1小时。
[0216] 根据如在简图（图7A）中示出的相关样品，在不同步骤的过程中添加DMSO或50μΜ EGCG。因此，样品1是在第一步骤的过程中接收DMSO的对照样品。其它样品对应于在以下过程中添加50μΜ EGCG：在附着步骤的过程中（样品2）；与宿主细胞上的受体相互作用（样品3）；内吞以及病毒性脂质包膜和被感染的宿主细胞的融合（样品4）；或在病毒性进入的所有三个步骤的过程中（样品5）。
[0217] 之后，细胞在37℃孵育45小时，然后被裂解以对荧光素酶活性进行定量。感染被表示为在没有EGCG的情况下测量的荧光素酶活性的百分比。三次重复进行实验，且给出的值对应于这三次不同实验的平均值。
[0218] 如图7B中所示，当从附着步骤（样品2和样品5）添加EGCG时，观察到感染的显著下降。另一方面，EGCG似乎对与宿主细胞受体相互作用的步骤（样品3）或在内吞或融合的步骤（样品4）过程中没有作用。总之，所有这些结果均证实EGCG抑制HCV与宿主细胞的细胞质膜结合的早期步骤，即抑制HCV病毒附着至宿主细胞的步骤。
[0219] 实例8
[0220] 当存在剂量递增的EGCG或氯化花翠素时，使用HCVcc感染Huh-7细胞2小时时间段。在接种34小时后，使用抗E1的抗体（A4），然后用缀合至荧光染料Cy3的抗小鼠IgG的二抗，通过免疫荧光检测包膜蛋白E1来确定感染率。该实验示出氯化花翠素，如EGCG一样，也以剂量依赖的方式抑制细胞被HCVcc感染（图8）。在这些实验中确定半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration）（抑制50%感染的浓度-IC50）。计算EGCG的IC50为大约11μM，而氯化花翠素的IC50为大约3.5μM。
[0221] 这些结果在另一方面示出氯化花翠素是HCV进入细胞的新的抑制剂，且另一方面示出作为抗HCV的抗病毒试剂，该分子与EGCG相比具有更高的效力。
[0222] 实例9
[0223] 实例3证实EGCG抑制由HCV的表面糖蛋白介导的HCV进入细胞的早期步骤。
[0224] 为了确定EGCG是否抑制附着至细胞表面的步骤，已经进行了定量的“结合”（或附着）测试。平行测试了氯化花翠素的作用。肝素（HCV附着至细胞表面的已知的抑制剂）用作阳性对照。在4℃，在DMSO、50μΜ EGCG、50μΜ氯化花翠素或500μg/mL肝素的存在下，上述细胞与纯化的HCVcc孵育至10的感染复数。使用冷的PBS清洗这些细胞三次，且提取总RNA。通过利用定量RT-PCR对病毒性基因组RNA进行定量来确定被固定的病毒的量。正如预期的，在肝素的存在下，病毒对细胞表面的附着大大降低（图9）。以相似的方式，在EGCG或氯化花翠素的存在下，也观察到病毒对细胞表面的附着大大减少。所有这些结果均示出EGCG和氯化花翠素均可能通过直接作用于病毒颗粒，通过防止HCVcc附着在细胞表面来抑制病毒性进入。
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