用于诊断癌侵袭性和遗传不稳定性的标记
阅读：28发布：2023-01-16
专利汇可以提供用于诊断癌侵袭性和遗传不稳定性的标记专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于从患者的癌样本诊断所述患者中癌侵袭性和/或遗传不 稳定性 的方法，其包括：a）体外测量所述患者癌样本中POLQ基因的表达 水 平和对照基因的表达水平；b）计算所述患者癌样本中所述POLQ基因的POLQ的表达水平相对于所述对照基因的表达的表达水平比；c）比较所述POLQ表达水平比与相应的 阈值 ，和d）如果所述POLQ表达水平比高于相应的阈值，则诊断癌为侵袭性和遗传不稳定性。本发明还描述了专用的微阵列和 试剂 盒 ，以及选择适当的 治疗 的方法。，下面是用于诊断癌侵袭性和遗传不稳定性的标记专利的具体信息内容。
1.一种用于从患者的癌样本诊断所述患者中癌的侵袭性的方法，其包括：
a）体外测量所述患者癌样本中POLQ基因和/或一种或多种其同种型的表达水平、和对照基因的表达水平，
b）计算所述患者癌样本中所述POLQ基因和/或同种型的POLQ和/或一种或多种其同种型的表达水平相对于所述对照基因的表达的表达水平比，
c）比较所述基因表达水平比与相应的阈值，和
d）如果所述比高于其相应的阈值，则诊断癌为侵袭性。
2.一种用于从患者的癌样本诊断所述患者中癌的遗传不稳定性的方法，其包括：
a）体外测量所述患者癌样本中POLQ基因和一种或多种其同种型的表达水平、和对照基因的表达水平，
b）计算所述患者癌样本中所述POLQ基因和/或同种型的POLQ和/或一种或多种其同种型的表达水平相对于所述对照基因的表达的表达水平比，
c）比较所述基因表达水平比与相应的阈值，和
d）如果所述比高于其相应的阈值，则诊断癌为遗传不稳定性。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述癌既不是乳癌也不是结肠直肠癌。
4.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述癌是肺癌。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述对照基因是管家基因。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述管家基因是选自B2M、TFRC、YWHAZ、RPLO、18S、GUSB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、POLR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IPO8和HMBS的基因。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述基因选自IPO8、HMBS、GUSB和UBC。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述表达水平在mRNA水平上测量。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述表达水平使用定量PCR或微阵列技术加以测量。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述表达水平在蛋白质水平上测量。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述表达水平使用特异性抗体加以测量。
12.一种包含至多500个探针的微阵列，其中至少一个探针特异性地与POLQ杂交。
13.根据权利要求12所述的微阵列，其中至少一个其它探针特异性地与选自B2M、TFRC、YWHAZ、RPLO、18S、GUSB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、POLR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IPO8和HMBS的基因杂交。
14.根据权利要求13所述的微阵列，其中所述基因选自IPO8、HMBS、GUSB和UBC。
15.一种用于从患者的癌样本中诊断所述患者乳癌的侵袭性和/或遗传不稳定性的试剂盒，其包括根据权利要求12-14任一项所述的微阵列或POLQ特异性扩增引物。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其进一步包括特异于选自B2M、TFRC、YWHAZ、RPLO、
18S、GUSB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、POLR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IPO8和HMBS的基因的扩增引物。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述基因选自IPO8、HMBS、GUSB和UBC。
18.一种用于选择患者中癌的适当治疗的方法，其包括：
a）使用根据权利要求1所述的方法诊断所述患者中所述癌是否为侵袭性，和
b）如果所述癌在步骤a）中诊断为侵袭性，则在外科治疗中增加辅助的辐射疗法或化学疗法。
19.一种用于预后辐射疗法或DNA修复、DNA损伤信号传导或核苷酸代谢抑制因子在患者癌的治疗中效率的方法，其包括：
a）使用根据权利要求2所述的方法诊断所述患者的所述乳癌是否为遗传不稳定性，和b）如果在步骤a）中诊断为遗传不稳定性，则预后辐射疗法或DNA修复抑制因子的效率。
用于诊断癌侵袭性和遗传不稳定性的标记
技术领域
[0001] 本发明涉及癌的控制领域，包括所述癌的侵袭性和遗传不稳定性的诊断，以及适当的治疗选择。本发明是在POLQ的过度表达与肿瘤的侵袭性、以及因此患者的生存高度相关这一发现的基础上的。同样其过度表达还与遗传不稳定性相关，其然后可用于杀伤肿瘤细胞。例如，辐射疗法对已经损伤的DNA更有效。同样地，DNA损伤检验点、或DNA复制许可/起始或DNA修复抑制因子可以防止DNA损伤的信号传导（signaling）或修复，从而导致肿瘤细胞死亡（合成疾病致死）（synthetic sickness lethality）。
背景技术
[0002] 癌是多元的疾病，其中一组细胞显示出不受控的增长、侵入并摧毁相邻组织的浸润（invasion），并且有时经由淋巴或血液转移或扩散至身体的其它部位。癌的这三种恶性性质将其与不浸润或转移的良性肿瘤区分开来。
[0003] 目前有一些方法被用于治疗各种类型的癌，包括手术、辐射疗法和化学疗法。成功的癌的疗法涉及原发肿瘤以及任何转移瘤，无论是临床上显著的或是显微的。
[0004] 对于患者，选择合适的治疗是重要的。有必要知道为了防止侵袭性癌的扩散，什么时候立刻使用剧烈的积极治疗操作。相反地，当患者所携带的肿瘤没有必要的时候而进行剧烈的积极治疗，对于患者也是不利的。事实上，剧烈的积极治疗常常导致不利的毒性，可能严重影响患者的生活质量。例如，其中的多数是致突变性的并因此容易诱导继发性肿瘤。
[0005] 另外，这样剧烈的积极治疗通常是非常昂贵的，因而仅应在必要的时候进行。
[0006] 目前，对实体瘤的治疗的选择根据肿瘤的期，其通常使用来自美国癌症联合委员会（AJCC）的肿瘤/结节/转移（TNM）测试进行。TNM系统根据三种类型分配一个数字。“T”表示肿瘤大小，"N"表示淋巴结浸润程度，以及“M”表示转移程度。癌的较宽的期通常被引作数字I、II、III、IV，其来自预后分组的TNM值；更高的数字代表更加进展的癌，其可能有更不好的结果。
[0007] 尽管此测试和分期（staging）系统提供了一些关于患者被诊断为实体癌期的有价值的信息，通常认为其不精确和不充分。特别是，其不能鉴定肿瘤进展的最早期。另外，TNM测试不能给出肿瘤侵袭性的信息，因而其对预后的用处是有限的。最后，其对实体肿瘤是有限的。在另一方面，大多根据细胞生成改变的鉴定来表征液体肿瘤。
[0008] 已描述了一些蛋白和遗传标志物用于意图改善预后信息。特别是，基因表达分析允许多基因预后标记的鉴定。然而，从不同研究中搜集的信息却常证明为混乱的（见例如，Lenz,Gastrointest Cancer Res,1(4Suppl2):S29-32,2007;Walther等人，Nat Rev Cancer,9(7):489-99,2009;Sotiriou&Pusztai,New England J Med,360:790-800,2009;Subramanian.&Simon,J Natl Cancer Inst.,102:464-468,2010）。例如，同一癌的不同标记之间的重叠可能是贫乏的。因为多基因标记主要关注细胞周期或增殖相关的基因，其可靠性也受到质疑，因此其对标准临床-病理（clinico-pathological）分期没有作用。此外，每个标记限定在癌的具体类型中。因此，这些标记不用在常规临床中。
[0009] 真正需要更好的癌的预后测试，其不仅仅改善患者的全面生存，还改善了他们的生活质量，并且使真正能从积极的高花费化学疗法受益的患者坚持该化学疗法。特别是，需要能够可靠用于尽可能多类型的癌的预后的单基因预后标志物。
[0010] 在正常细胞的增殖中，DNA复制是通过已知作为复制聚合酶(POLA、POLD和POLE)的三种DNA聚合酶进行的。可是，在人类细胞中鉴定了10种其它的DNA聚合酶，其被认为是专门的聚合酶，其功能仍大部分未知。因为它们能加工尽管受损了的DNA的能力，所以这些专门的聚合酶看起来是经历了进化而保留的。看起来这些聚合酶还是非常致突变的，其活性被严格控制。
[0011] POLQ（也称为POL theta或POLθ）是这些专门的DNA聚合酶的一种，在其N末端部分包含一个解旋酶域，在其C末端包含一个聚合酶域。尽管此特殊的专门的DNA聚合酶的功能仍大部分未知，看起来其参与基因组稳定性的维持和DNA修复(Seki等人,EMBO J,23:4484-4494,2004;Masuda 等 人 ,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,102:13986-13991,2005,Yoshimura等人,Mol.Cell,24:115-125,2006)，其可能通过促进复制起始的开始（firing）也参与DNA复制的许可和起始（未发表数据）。
[0012] POLQ的 表 达 已 经 在 多 种 肿 瘤 中 得 以 分 析 (Kawamura等 人，Int J Cancer,109:9-16,2004;Pillaire 等 人，Oncogene,29(6):876-887,2010;Lemée 等 人，Proc Natl Acad Sci U S A.,107(30):13390-5,2010;Higgins 等 人，Oncotarget,1(3):175-184,2010)。特别是，Kawamura等人(Int J Cancer,109:9-16,2004)在许多不同的癌性组织中检测到POLQ mRNA表达水平的升高。然而，mRNA水平的测量通过Northern印迹法来进行，其是一种与定量PCR等方法一样灵敏的技术。此外，研究的患者数目非常少，因此很难从这项研究中得出任何有意义的结论。例如，患腺癌的患者数目仅为
7。因此，这些结果的可靠性和显著性似乎是还有讨论的余地。本发明人分析了肿瘤相对于正常组织POLQ基因表达的变化，比较了这些数据与疾病进展和临床特征。其显示POLQ在肿瘤组织中显著地过度表达。另外，其证明POLQ的失控表达积极地有助于肿瘤进展。事实上，POLQ过度表达导致遗传的不稳定和明显的DNA损伤。
7。因此，这些结果的可靠性和显著性似乎是还有讨论的余地。本发明人分析了肿瘤相对于正常组织POLQ基因表达的变化，比较了这些数据与疾病进展和临床特征。其显示POLQ在肿瘤组织中显著地过度表达。另外，其证明POLQ的失控表达积极地有助于肿瘤进展。事实上，POLQ过度表达导致遗传的不稳定和明显的DNA损伤。
发明内容
[0013] 本发明人已经显示POLQ在多种不同癌中过度表达，这种过度表达给出关于患者预后的信息。例如，在93例肺癌中的大多数中发现POLQ过度表达。无论生存期检验如何（总体生存、无复发生存、无疾病生存），这种过度表达与患者生存相关。显著地，POLQ与患者生存之间的统计学关联不依赖于肿瘤期和治疗。
[0014] 因而，本发明提供了用于诊断患者中癌的侵袭性的方法。根据本发明的方法，提高的POLQ基因表达水平表明所述癌的侵袭性。
[0015] 因此，本发明提供了用于从患者的癌样本诊断所述患者中癌的侵袭性的方法，其包括：
[0016] a）体外测量所述患者癌样本中POLQ基因的表达水平和对照基因的表达水平，[0017] b）计算所述患者的癌样本中所述POLQ基因的POLQ表达水平相对于所述对照基因的表达的表达水平比，
[0018] c）比较所述POLQ表达水平比与相应的阈值，和
[0019] d）如果所述POLQ表达水平比高于相应的阈值，则诊断癌为侵袭性。
[0020] 在另一方面，本发明的方法允许检测展现遗传不稳定性的癌细胞，即DNA损伤或因起点开始的扰动导致的“复制压力”。POLQ的失控表达导致增加的有丝分裂的异常，例如染色单体断裂、染色体端-端融合、双着丝粒的染色体以及其它异常。因此，POLQ的过度表达导致DNA损伤和染色体的不稳定性。
[0021] 因此，本发明提供了用于从患者的癌样本诊断所述患者中癌的遗传不稳定性的方法，其包括：
[0022] a）体外测量所述患者癌样本中POLQ基因的表达水平和对照基因的表达水平，[0023] b）计算所述患者癌样本中所述POLQ基因的POLQ的表达水平相对于所述对照基因的表达的表达水平比，
[0024] c）比较所述POLQ表达水平比与相应的阈值，和
[0025] d）如果所述POLQ表达水平比高于其相应的阈值，则诊断癌为遗传不稳定或复制压力。
[0026] 应该理解两种方法可以结合。因而，在另一方面，本发明涉及用于诊断患者中癌的侵袭性和用于检测表现遗传不稳定性的癌细胞的方法。因而，本发明的方法呈现出允许检测与不良生存预后和遗传不稳定性相关的遗传事件的优点。
[0027] 如本文所用，术语“癌”和“癌性的”指或描述哺乳动物中通常以细胞生长失控为特点的病理状态。本文使用的术语“癌”和“癌性的”意为包括该疾病的所有期。因此，本文所用的“癌”可包括良性和恶性肿瘤两者。有利地，所述癌是早期或中期癌。“早/中期”，在本文中其意为包括介于IA期和IIIA期之间的癌。发生于癌前细胞中的最早期事件之一是由起点开始的扰动导致的“复制压力”。本发明人显示出POLQ与参与复制起始的蛋白相互作用，并且它的失控通过扰动起点的时间来干扰起点许可。本发明人显示POLQ可能更多地参与DNA复制的起始而不是延伸。因此，POLQ是早期癌特别有用的标志物。在本发明优选的实施方案中，本发明方法的癌是处于早期的癌。癌的实例包括但不限于，癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病或淋巴恶性肿瘤。这样癌的更具体的实例包括但不限于，鳞状细胞癌（如上皮鳞状细胞癌）、包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状细胞癌的肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、包括胃肠道癌和胃肠道间质癌的胃部或胃癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、肝癌、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏的或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、雀斑恶性黑色素瘤、肢端雀斑样黑色素瘤、结节性黑色素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤（包括低等级的/滤泡性的非霍奇金氏淋巴瘤（NHL）；小淋巴细胞（SL）NHL、中间级/滤泡性NHL；中间级的弥漫性NHL；高等级的免疫母细胞性NHL；高等级的淋巴母细胞性NHL；高等级的小无核裂细胞NHL；巨大肿块（bulky disease）NHL；
套细胞淋巴瘤；艾滋相关淋巴瘤和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血病）；慢性淋巴细胞性白血病（CLL）；急性淋巴母细胞性白血病（ALL）；毛细胞白血病；慢性髓细胞性白血病；和移植后淋巴增生性障碍（PTLD）、以及与瘢痣病相关的异常血管增生、水肿（如脑肿瘤相关的）、梅格斯综合征、脑、以及头颈癌，以及相关的转移。
套细胞淋巴瘤；艾滋相关淋巴瘤和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血病）；慢性淋巴细胞性白血病（CLL）；急性淋巴母细胞性白血病（ALL）；毛细胞白血病；慢性髓细胞性白血病；和移植后淋巴增生性障碍（PTLD）、以及与瘢痣病相关的异常血管增生、水肿（如脑肿瘤相关的）、梅格斯综合征、脑、以及头颈癌，以及相关的转移。
[0028] 在具体的实施方案中，使用本发明的方法可预后的癌包括除乳癌之外的任何类型的癌。在另一实施方案中，本发明的癌包括除结肠癌之外的任何类型的癌。在又一实施方案中，除乳癌和结肠癌之外的所有癌都对本发明的方法有响应。在又一实施方案中，本发明的方法可用于上述的2、3、4或更多种癌的组合。
[0029] 在最优选的实施方案中，本发明的方法用于肺癌。
[0030] 如文中使用的，术语“POLQ”指编码DNA聚合酶θ（Entrez基因ID号：10721;mRNA序列参照号:NM_199420.3;蛋白序列参照号:NP_955452.3）。此外，本发明包括所述POLQ基因的所有同种型。同种型，如此处所用，涉及POLQ基因的所有不同形式，并可能由突变造成，或可能通过可选的剪接来自同一基因。多数同种型由单核苷酸多态性或SNP、相同基因的等位基因间小的遗传差别引起的。这些发生在一个基因内特定的个别的核苷酸位点。在此定义中也包括通过采用不同的启动子从相同的基因产生不同版本的信使RNA的情况，该启动子引起越过某些外显子的转录。因而，应当理解本发明的方法不局限于POLQ本身，也包含一个或多个POLQ同种型。根据本发明的方法，测量POLQ基因和/或一个或多个其同种型的表达水平，并计算表达比。
[0031] 根据本发明，癌的“侵袭性”意指所述癌浸润相邻组织、发生转移的倾向以及所述浸润可能出现的速度。癌的侵袭性显然与生存相关，可以使用上述方法预后患者的生存，其中诊断为侵袭性的病例导致不好的生存预后，而没有侵袭性的诊断则产生良好的生存预后。
[0032] 如文中使用的，癌的“遗传不稳定性”意指所述癌的肿瘤细胞具有遭受DNA损伤或“复制压力”(例如休眠起点的再激活)的倾向。遗传不稳定性是更加常常发生DNA损伤的癌的标志。通过“DNA损伤”，表明对DNA的损伤通过引起DNA的共价修饰、DNA断裂或使其偏离其正常的双螺旋构象而影响DNA的正常功能。DNA损伤包括结构变形，其干扰复制与转录，以及能使碱基对断裂并改变DNA序列的点突变。一般而言，当一个细胞发生DNA损伤时，细胞周期停止在三个检验点之一（GI/S、S期内或G2/M）。细胞周期停止可导致DNA修复过程的激活（在DNA损伤相对小的情况），或者导致凋亡的诱导（在严重的DNA损伤的情况）。
[0033] DNA损伤可由内源的过程自发产生，如由正常代谢产生的活性氧和自由基引起的碱基的氧化和DNA链中断的发生，在DNA复制期间由DNA聚合酶产生的碱基的甲基化、脱嘌呤、脱嘧啶、碱基的错配等等。DNA损伤也可以由环境危害引起，如辐射（例如，紫外线辐射、X-射线、γ射线、电离辐射）、天然毒素（例如，植物毒素）、合成毒素、药物（例如，癌症化学疗法，辐射疗法），烷化剂，等等。DNA损伤可导致或来自于各种疾病，包括遗传性的遗传疾病和由于暴露于环境危害引起的疾病。DNA损伤也可由吸烟（烟包含遗传毒性的芳香化合物）引起，其导致例如心脏病，或由其它疾病如癌（包括肺癌）的治疗引起。
[0034] 使用待检测患者的癌样本进行上述方法。在某些情况中，根据本发明的方法可进一步包括从患者获取癌样本的预备步骤。通过“癌样本”，指肿瘤组织样本。甚至在癌患者中，肿瘤位点的组织也包括非肿瘤的健康组织。因而“癌样本”应当被限定于取自患者的肿瘤组织。所述“癌样本”可以是活检样本或取自外科手术切除疗法的样本。
[0035] 另外，根据本发明的方法可以在从患者获取样本以及如上述步骤a）之间包括其它的预备步骤，相应的为将癌样本（以及任选地健康的组织样本）转换成mRNA（或相应的cDNA）样本或转换成蛋白质样本，随后其可备用于步骤a）中的体外基因表达水平的测量。mRNA（以及逆转录为cDNA）或蛋白质从组织样本中的制备或提取仅仅是本领域技术人员熟知的常规程序。
[0036] 一旦获得了即用的癌mRNA（或对应的cDNA）或蛋白质样本，可进行POLQ基因表达水平的测量，其取决于转换和可获得的即用样本的类型，是在mRNA（即，根据样本中mRNA的含量）还是在蛋白质（即，根据样本中蛋白质的含量）水平。在某些实施方案中，可以在mRNA水平测量一些基因的表达水平，而在蛋白质的水平测量其它基因的表达水平。在这个情况中，取自患者的癌样本的一部分被转换为mRNA（或对应的cDNA）样本而另一部分被转换成蛋白质样本。在其它实施方案中，所有被测试的基因的表达水平是在mRNA水平测量或在蛋白质水平测量。
[0037] 当在mRNA水平测量表达水平时，显著地可以使用熟知的技术进行，如定量PCR或核酸微阵列技术（包括cDNA和寡核苷酸微阵列）。这些技术现在已被本领域技术人员常规使用，因此不需要在此详细地描述。使用定量PCR的实施方案的实施例在实验部分描述。可选地，可以使用允许根据mRNA含量评价基因表达水平的任何已知或未来技术。例如，可以使用原位杂交中偶联荧光的组织微阵列。组织微阵列（也称为TMA）由石蜡块组成，其中多至1000个独立的组织核以阵列形式组装，以允许多重组织学分析。在组织微阵列技术中，使用空心针从石蜡包埋的组织（如临床活检或肿瘤样本）的目标区域取出直径小如0.6mm的组织核。然后将该组织核以精确的空间阵列模式插入受体石蜡块中。使用切片机对所述块切片，装于显微镜玻片上，然后通过任何标准组织学分析的方法分析。每个微阵列块可被切为100-500个切片，其可被用于独立的测试。在组织微阵列中通常采用的测试包括免疫组织化学和原位杂交中的荧光。对于在mRNA水平的分析，可以将组织微阵列技术偶联至原位杂交中的荧光。
[0038] 当在蛋白质水平测量表达水平时，显著地可以使用特异性的抗体进行，特别地使用熟知的技术，如Western印迹、ELISA或ELISPOT、抗体微阵列、或偶联免疫组织化学的组织微阵列。
[0039] 通过计算所述患者癌样本中的POLQ基因的表达水平相对于对照基因表达水平的表达水平比，通过比较得到的表达水平比与相应的阈值，进行所述患者的癌样本中被测量基因的表达水平的比较。根据本发明，所述的对照基因是在所有细胞类型中表达的基因。更特别地，根据本发明的对照基因是在构成肿瘤位点的组织的所有细胞中表达的基因。在另一方面，对照基因的表达水平不受细胞状态的影响，即，在健康细胞和肿瘤细胞中对照基因表达为相同的水平。在一个特定的实施方案中，对照基因是管家基因。管家基因是在所有细胞类型中表达的基因，其为所有细胞类型的维持提供了基本的功能。人类管家基因的列表可在Eisenberg等人（Trends in Genetics19:362-365,2003）中找到。根据本发明优选的管家基因是选自B2M、TFRC、YWHAZ、RPLO、18S、GUSB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、POLR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IPO8和HMBS的基因。根据本发明，进一步优选的管家基因选自IPO8、HMBS、GUSB和UBC。
[0040] 根据本发明，“阈值”意指允许区分样本的值，其中目标基因的表达水平比对应于患者癌样本中所述目标基因或低或高的表达水平。特别地，如果基因表达水平比低于或等于阈值，那么在患者癌样本中的该基因表达水平被认为是低的，而如果基因表达水平比高于阈值，那么在患者癌样本中的该基因表达水平被认为是高的。对于每个基因，且取决于用于测量基因表达水平的方法的不同，最佳的阈值可不同。但是，本领域技术人员基于多种对照癌样本的分析以及比较其与对照基因（例如，管家基因）的表达，可以容易地确定该阈值，在所述对照癌样本中对于该特定基因的表达水平（低或高）是已知的。
[0041] 本发明进一步涉及专用于实现根据本发明方法的微阵列，其包括最多500个、优选最多300个、最多200个、更优选最多150个、最多100个、甚至更优选最多75个、最多50个、最多40个、最多30个、最多20个、最多10个不同的探针，其中至少1个特异性地结合POLQ mRNA（或相应的cDNA）或蛋白质。
[0042] 在一个优选的实施方案中，所述微阵列是核酸微阵列，其包括最多500个、优选最多300个、最多200个、更优选最多150个、最多100个、甚至更优选最多75个、最多50个、最多40个、最多30个、最多20个、最多10个不同的探针（因而，例如排除了全基因组（pangenomic）微阵列），其中至少1个特异性地与POLQ mRNA（或相应的cDNA）杂交。除特异性地杂交POLQ的探针外，所述微阵列还包含至少一个特异性地杂交管家基因的探针。在一个实施方案中，所述管家基因选自B2M、TFRC、YWHAZ、RPLO、18S、GUSB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、POLR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IPO8和HMBS。更优选地，管家基因选自IPO8、HMBS、GUSB和UBC基因。根据本发明，“核微阵列”由不同的核酸探针组成，其附着于基底，该基底可以是微芯片、玻片或微球大小的珠。微芯片可以由聚合物、塑料、树脂、多糖、硅或基于硅的物质、碳、金属、无机玻璃或硝化纤维构成。探针可以是核酸，例如cDNA（“cDNA微阵列”）或寡核苷酸（“寡核苷酸微阵列”，寡核苷酸长度为大约25至大约60个碱基对或更短）。
[0043] 可选择地，在另一个实施方案中，所述微阵列可以是抗体微阵列，其包括最多500个、优选最多300个、最多200个、更优选最多150个、最多100个、甚至更优选最多75个、最多50个、最多40个、最多30个、最多20个、最多10个不同的抗体，其中至少1个特异性地结合POLQ蛋白质。除特异性地结合POLQ蛋白质的抗体外，所述微阵列还包含至少一个特异性地结合管家蛋白质的抗体。在一个实施方案中，所述管家蛋白质选自B2M、TFRC、YWHAZ、RPLO、18S、GUSB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、POLR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IPO8和HMBS蛋白质。在一个优选的实施方案中，所述管家蛋白质选自IPO8、HMBS、GUSB和UBC蛋白质。
[0044] 除核酸或抗体微阵列技术外，可以使用定量PCR，因而待检测的基因特异的扩增引物对于进行根据本发明的方法也非常有用。因而，本发明进一步涉及用于从患者的癌样本中诊断所述患者癌的侵袭性和遗传不稳定性的试剂盒，其包括如上所述的专用微阵列或POLQ特异的扩增引物。在此，当试剂盒包含扩增引物时，所述试剂盒还可包含其它基因特异的扩增引物，所述试剂盒优选包含最多100、最多75、50、最多40、最多30、优选最多25、最多20、最多15、更优选最多10、最多8、最多6、甚至更优选最多5、最多4、最多3或甚至2或1或甚至0对其它基因而非POLQ特异的扩增引物。例如，除POLQ的引物外，所述试剂盒可以包含至少一对用于至少一个管家基因的扩增引物。在一个实施方案中，所述管家基因选自B2M、TFRC、YWHAZ、RPLO、18S、GUSB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、POLR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IPO8和HMBS。在一个优选的实施方案中，所述管家基因选自IPO8、HMBS、GUSB和UBC基因。
[0045] 如上提及的，预后与其侵袭性相关联的癌进展的能力，对于选择适当的治疗非常重要，理由是除传统的外科治疗外，每次必要时且仅在必要时，使用具有潜在严重副作用的剧烈且昂贵的治疗。因而，本发明还涉及用于在患者中选择适当的癌治疗的方法，其包括：
[0046] a）使用如上所述的根据本发明的方法诊断所述患者中所述癌是或不是侵袭性，以及
[0047] b）如果所述癌在步骤a）中诊断为侵袭性，则在外科治疗中增加辅助的辐射疗法或化学疗法。
[0048] 除了其对癌侵袭性的预后价值外，发明人还发现基于POLQ表达水平分析的相同测试也允许诊断是否存在遗传不稳定性，因而导致上述方法可用于诊断遗传不稳定性。特别地，本发明人显示失控的POLQ表达与DNA断裂频率的增加相关。因而，在一个优选的实施方案中，本发明的方法被用于诊断DNA断裂。
[0049] 这种遗传不稳定性以及DNA断裂频率的显著增加，可能导致有关辅助疗法的选择。特别地，遗传不稳定性可能有助于肿瘤细胞突变，以及因此增殖和粘附的失控，DNA损伤的出现也可被用于抗肿瘤细胞。事实上，对于连续的增殖，那些DNA断裂被修复，而具有大量DNA损伤的细胞通常容易引起细胞死亡。结果，辐射疗法可能不能在所有情况中有效，但其对已经存在增加的DNA断裂频率的肿瘤细胞的效率可被改善。例如，辐射疗法可能对于被本发明的方法鉴定的POLQ过度表达的肿瘤细胞高度有效，原因是这些细胞含有高水平的DNA断裂和染色体不稳定性。以同样的方式，使用DNA修复抑制因子可允许冻结DNA断裂而导致肿瘤细胞死亡。
[0050] 事实上，发明人显示DNA修复的抑制导致POLQ过度表达的细胞的活力降低。如在实验例中所示，POLQ过度表达的细胞显示对DNA修复抑制因子增加的敏感性。
[0051] 因而，本发明还涉及用于预后辐射疗法或DNA修复抑制因子在患者癌的治疗中效率的方法，其包括：
[0052] a）使用如上所述的根据本发明的方法诊断所述患者的所述癌是或不是遗传不稳定性，和
[0053] b）如果在步骤a）诊断为遗传不稳定性，则预后辐射疗法或DNA修复、DNA损伤检验点或DNA复制许可/起始抑制因子的效率。
[0054] 根据本发明，“DNA修复抑制因子”意指能够抑制DNA断裂（特别是双链DNA断裂）修复的分子。然而，这种表述不应当被理解为限定性的，DNA修复抑制因子的实例包括DNA修复蛋白PARP的抑制因子（参见，例如WO2004080976、WO2005/053662、WO2009/046205）、组蛋白脱乙酰基酶的抑制因子，如PCT申请WO2008/082856中描述的那些，和DNA聚合酶β的抑制因子（参见WO2007001684）。“DNA损伤检验点抑制因子”是能够阻断参与DNA损伤检验点中任何蛋白质活性的分子。此种蛋白质的实例包括ATM/ATR、Chk2和Chk1。“DNA复制许可/起始抑制因子”是能够阻断参与DNA复制许可中任何蛋白质活性的分子，例如Cdt1、Cdc6、Mcm1-7和其它为技术人员所知的。
[0056] 图1：POLQ基因表达水平对患者的癌特异性生存的影响。（A）根据原发肿瘤中DNA POLQ表达水平与相邻正常组织相比，肺腺癌患者的Kaplan-Meier总体生存。患者：n=93；表明来自每次对数秩（log-rank）检验的p值。（B）根据原发肿瘤中DNA POLQ表达水平与相邻正常组织相比，肺腺癌患者的Kaplan-Meier无进展生存。患者：n=93;表明来自每次对数秩检验的p值。（C）根据原发肿瘤中DNA POLQ表达水平与相邻正常组织相比，肺腺癌患者的Kaplan-Meier无复发生存。患者：n=93;表明来自每次对数秩检验的p值。
[0057] 图2：POLQ基因过度表达对敏感于DNA修复抑制因子的细胞的影响。使用亚有效（sub-efficient）剂量的PARP抑制因子处理使用携带POLQ的pcDNA载体（A）或对应的空白载体（C）转染的肺MRC5成纤维细胞的培养物，并监测细胞增殖。在亚致死（sub-lethal）剂量(4Gy)下辐射使用携带POLQ的载体（B）或对应的空白载体（D）转染的MRC5细胞的培养物，在PARP抑制因子存在下监测细胞增殖。
[0058] 图3：POLQ消耗对DNA复制的影响。在转染有POLQ siRNA的MRC5细胞中评估POLQ消耗对S期的影响，并与LUC siRNA对照(Ctrl)作比较：（A）在胸苷追踪后（thymidine chase）8小时处于S期的细胞平均数的定量；（B）PCNA染色阳性的细胞的平均数的定量；（C）相对于肌动蛋白转录物的细胞周期蛋白E的mRNA水平的定量。
具体实施方式
[0059] 实施例
[0060] 1.材料与方法
[0061] 1.1.研究设计、患者和肿瘤样本、差异的基因表达
[0062] 在2006年至2010年间，在图卢兹大学Rangueil-Larrey（无对应中译文）医学中心（法国）选择93位携带I至IIIA期的肺腺癌的患者。本研究包含的患者的评估标准是冷冻的肿瘤组织和相邻的非肿瘤组织的有效性、以及获得非常高质量的RNA样本的可能性。排除标准是非腺癌组织学、IIIB或IV期的肿瘤、或少于70%的肿瘤细胞的比例。
[0063] 基于临床和解剖病理学数据使用TNM系统来确定肿瘤期。解剖病理学家对肿瘤形态的分析依据2004年的世界卫生组织分类(Travis,William D;Brambilla,Elisabeth;Muller-Hermelink,H Konrad等人，eds,Pathology and Genetics of Tumours of the Lung,Pleura,Thymus and Heart,World Health Organization Classification of Tumours,Lyon:IARC Press,2004)来进行。只有包含70%以上肿瘤细胞的肿瘤才能留作本发明分析。
[0064] 所有的肿瘤组织样本为外科收集的，即刻放于液氮中速冻，并储藏直至RNA提取。使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)根据制造商的说明来制备肿瘤RNA。在提取过程中，通过在60个10μm厚的或者5个300μm厚的冰冻组织切片上进行苏木精-伊红染色，来控制所有的肿瘤样本使其具有足够的肿瘤细胞构成（cellularity）（即，>70%的肿瘤细胞）。
同样地，用苏木精-伊红玻片对每个正常样本的玻片染色，由病理学家分析。检查每一个正常样本，以（i）确保没有任何赘生病变；（ii）定量正常上皮、纤维和脂肪成分百分比。使用Agilent BioAnalyzer2100评价所有法国人RNA样本的质量和数量，仅选择呈现合适比
28S/18S(≥1.7)和具有合适的RNA完整指数（RNA integrity number）（RIN≥7）的RNA用于分析。
同样地，用苏木精-伊红玻片对每个正常样本的玻片染色，由病理学家分析。检查每一个正常样本，以（i）确保没有任何赘生病变；（ii）定量正常上皮、纤维和脂肪成分百分比。使用Agilent BioAnalyzer2100评价所有法国人RNA样本的质量和数量，仅选择呈现合适比
28S/18S(≥1.7)和具有合适的RNA完整指数（RNA integrity number）（RIN≥7）的RNA用于分析。
[0065] 使用High-Capacity cDNA Archive试剂盒(Applied Biosystems)逆转录总RNA。使用TaqMan低密度阵列(Applied Biosystems)一式三份地测量转录水平。使用TaqMan Universal PCR Master Mix和TaqMan低密度阵列技术(Applied Biosystems)从肿瘤和正常样本中一式三份地扩增所有被研究的基因。使用TaqMan低密度阵列技术和7900HT快速实时PCR系统进行PCR扩增。通过使用从各cDNA扩增的4个对照（GUSB、HMBS、IPO8和UBC），基因表达在样品之间得以归一化。通过使用GeNorm程序，选择这4个对照基因作为在TaqMan低密度人内源对照阵列(Applied Biosystems)上被测试的16个中最稳定的(B2M、TFRC、YWHAZ、RPLO、18S、GUSB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、POLR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IPO8、HMBS)。
[0066] 用于分析每个测试和对照基因的引物DNA序列内容和Applied Biosystems的参照都选自Applied Biosystem网站(http://products.appliedbiosystems.com)。在稀释100倍的不同探针存在时以及 Preamp Master Mix（Early Access)试剂（Applied Biosystems）存在时，在StepOne实时PCR系统(Applied Biosystems)中以14个循环扩增cDNA。预先扩增的产物随后稀释5倍。预先扩增的cDNA随后在
Master Mix(Applied Biosystems)存在下重悬于DNA结合样本上样试剂缓冲液(Applied Biosystems)中。同时，每探针在分析上样试剂缓冲液(Applied Biosystems)中稀释至TM
1/100。在Fluidigm Biomark 中进行扩增。预先扩增的cDNA和探针分开上样于96.96动态阵列（Dynamic Array）(Fluidigm)。在Biomark Reader(Fluidigm)上进行实时PCR反应的检测。
Master Mix(Applied Biosystems)存在下重悬于DNA结合样本上样试剂缓冲液(Applied Biosystems)中。同时，每探针在分析上样试剂缓冲液(Applied Biosystems)中稀释至TM
1/100。在Fluidigm Biomark 中进行扩增。预先扩增的cDNA和探针分开上样于96.96动态阵列（Dynamic Array）(Fluidigm)。在Biomark Reader(Fluidigm)上进行实时PCR反应的检测。
[0067] 分析参数如制造者的建议（质量阈值=0.65;基线校正=线性;Ct阈值法=自动全面)。Fluidigm PCR数据以单拷贝（monoplicates）形式生成；它们随后用GenEx软件(http://genex.gene-quantification.info/,MultiD)来分析，使用下列规程:&)使数据相对于TLDA鉴定的管家基因(GUSB、IPO8、UBC、HMBS)进行归一化：组织中的Ct—同一组织中4个管家基因的Ct平均值，2）肿瘤组织相对于相邻非肿瘤组织的归一化：Λ Λ Λ
RNA拷贝数=2 Ct。可比较肿瘤组织与相邻非肿瘤组织的比：Nrel=2 Ct正常/2 Ct肿Λ
瘤=2 (Ct正常–Ct肿瘤)。若Nrel>1则基因过度表达，若Nrel<1则基因低表达，
3/二项式转化（binomial transformation）：为获得允许统计检验性能的正态分布：
Λ Λ
Log2(Nrel)=Log2(2 Ct正常/2 Ct肿瘤)=Ct正常–Ct肿瘤。若Ct健康-Ct肿瘤>0则
基因过度表达，若Ct健康-Ct肿瘤<0则基因低表达。
RNA拷贝数=2 Ct。可比较肿瘤组织与相邻非肿瘤组织的比：Nrel=2 Ct正常/2 Ct肿Λ
瘤=2 (Ct正常–Ct肿瘤)。若Nrel>1则基因过度表达，若Nrel<1则基因低表达，
3/二项式转化（binomial transformation）：为获得允许统计检验性能的正态分布：
Λ Λ
Log2(Nrel)=Log2(2 Ct正常/2 Ct肿瘤)=Ct正常–Ct肿瘤。若Ct健康-Ct肿瘤>0则
基因过度表达，若Ct健康-Ct肿瘤<0则基因低表达。
[0068] 1.2统计分析
[0069] 作为第一步，对于每个被研究的基因，通过二项式检验来评估观察到50%以上的患者过度表达或低表达所述基因的可能性（阈值：对于过度表达Nrel>2，对于低表达Nres<1/2）。显著水平是0.05，Benjamini和Yekutieli的程序用作评估测试的多重性。用非参数Spearman's相关性（Spearman's rho）评价基因之间的相关性。通过卡方检验或Fisher's精确检验，来比较表达水平（根据Nrel分布的百分位点分为3类）相对于治疗（仅有手术、手术-化学疗法-辐射疗法、或手术-化学疗法）、肿瘤分级（N或TNM）、肿瘤分化（很少分化、中等分化、或完全分化）、栓的存在、以及吸烟习惯。与表达水平（分为3类）相关的患者的生存通过Kaplan Meier方法来评估，并通过对数秩检验来比较。与基因表达水平相关的生存用Cox模型以多变量来分析。
[0070] 1.3POLQ的亚克隆
[0071] 将人POLQ cDNA以2步转移至载体pcDNA3.1(Invitrogen)中。首先用RsrII和XhoI 消 化 含 有 POLQ cDNA的 pFast Bac HTC POLQ(Seki 等 人，Nucleic Acids Res.31:6117-6126,2003)，给出POLQ cDNA的N端部分(1.2kb)。随后该产物先被EcoRV和XhoI消化，而后被插入pcDNA3.1(Invitrogen)。然后通过用XhoI和SacII消化pFast Bac HTC POLQ分离POLQ cDNA的C端部分(6.7kb)，用XhoI消化该载体后，将C端部分插入已含有POLQ cDNA的N端部分的pcDNA3.1载体中的。然后确认POLQ cDNA的完整序列。
[0072] 1.4细胞工程
[0073] 如(Pillaire等人，Cell Cycle6:471-7,2007)所述，使MRC5-SV细胞(ATCC)生长并转染。还如(Bergoglio等人，J Cell Science115:4413-4418,2002)公开的，进行细胞周期分析研究。如前所公开的(Bergoglio等人，J Cell Science115:4413-4418,2002)，进行细胞周期分析和细胞毒性研究。秋水仙酰胺处理3小时后收集细胞，制备中期涂片（spread）。对于每个克隆，在3次独立的实验中最少分析100个中期，通过学生t检验计算p值(Bergoglio等人，Cancer Res62:3511-3514,2002)。
[0074] 2.结果
[0075] 2.1.大多DNA复制基因在配对的（coupled）肺肿瘤中失控
[0076] 根据选择的多于80个基因，生成93例配对原发性肺腺癌在进展的不同期的基因表达谱（表1），所述基因已知在DNA复制的起始/许可、跨损伤（translesional，TLS）或常规的DNA延伸、DNA损伤反应（DDR）、DNA叉保护或复制引发的双螺旋断裂的修复中起作用。
[0077] 特别地，通过实时PCR分析显示POLQ在93例患者的大多数中高度表达。事实上，与所述患者的相邻对照组织(N)相比，POLQ在肿瘤组织（T）中上调(表1)。
[0078] 表1：在配对的NSCLC肿瘤中POLQ的差异表达
[0079]
[0080] 如表2所示，我们观察到POLQ基因上调大于2倍（T/N>2）。
[0081] 表2：精确的二项式检验(P值<0.05)
[0082]
[0083] 2.2.失控的3R表达与不良预后相关
[0084] 同生存者函数平等的（for equality of）对数秩检验表明POLQ(p<0.0033)DNA聚合酶基因的上调与无疾病生存相关。当调查患者的无复发生存时，这个基因的过度表达又与患者的结果显著相关(p<0.05)。最后，我们分析无疾病生存标准，发现当测量总体生存时，POLQ(p<0.0008)与较高的发病率相关（图1）。
[0085] 表3：多变量分析–癌特异性生存(n=93)
[0086]
[0087] *:p<0,05的显著性
[0088] **:p<0,01的显著性
[0089] ***:p<0,001的显著性
[0090] 因此，无论用何标准评估生存，POLQ的过度表达都与生存相关。重要的是，这种相关不依赖于肿瘤期和治疗。
[0091] 2.3.POLQ的过度表达导致遗传异常
[0092] 为调查POLQ过度表达对基因组稳定性的影响，使用携带POLQ的质粒或相应的空质粒转染MRC5细胞。分析来自转染的克隆(Q1、Q2、Q3)和同基因对照的中期涂片。POLQ过度表达导致了呈现四倍体、端-端融合和染色单体断裂的细胞的频率的显著增加（在POLQ细胞中检测到25%的异常中期，相对于在对照中检测到13%；表4）。这些数据表明自发的染色体不稳定性发生在POLQ过度表达的细胞中，这也许是增加的DNA断裂的结果。
[0093] 表4：在POLQ过度表达的MRC5细胞中的染色体异常
[0094]
[0095] 2.4.POLQ过度表达的细胞显示对DNA修复抑制因子较高的敏感性
[0096] 在碱基切除修复（BER）或替代的非同源末端连接(NHEJ)中提出的POLQ的作用，可能是过度表达的POLQ干扰了BER和/或B-NHEJ途径，并导致內源DNA损伤的积累（包括由活性氧物质产生的损伤）。
[0097] 为了验证这一假设，POLQ过度表达的MRC5细胞(Q14)用亚有效（sub-efficient）剂量的PARP抑制因子处理或者不作处理。如图2所示，当过度表达POLQ的MRC5细胞用所述PARP抑制因子处理时，其增殖受到显著地影响，与DNA损伤的延迟修复相符合。同样地，Q14细胞经亚致死剂量的辐射后，显示出在细胞增殖上的显著延迟。相反地，不过度表达POLQ的MRC5细胞不受PARP抑制因子处理或温和辐射的影响。
[0098] 2.5.POLQ的生物学作用与进入S期相关联
[0099] 通过将POLQ-特异的siRNA转染入MRC5细胞中并监测POLQ-消耗的细胞的细胞周期状态，调查POLQ在复制中的作用。很清楚地，在POLQ siRNA-表达的细胞中处于S期的细胞数比对照细胞中的更低，表明S期进展的扰动。这种解释通过PCNA蛋白（S细胞的标志物）的免疫染色得以印证，在对照细胞和转染的细胞两者中：在POLQ siRNA转染的细胞群中，而不在对照中，观察到在呈现染色的细胞中的显著升高，这与DNA复制开始相一致。
[0100] 这种S期的扰动可能是因为对复制起始、对复制延伸、或对两者的影响。为评估POLQ在DNA复制起始中的抑制效果，通过在POLQ-消耗的细胞以及对照细胞中使用Northern印迹法来评价细胞周期蛋白E的mRNA(CCNE1,Genbank ID:NM_001238;和CCNE2,Genbank ID:NM_057749)。当比对肌动蛋白转录物水平归一化时，在POLQ siRNA-表达的细胞中细胞周期蛋白E的转录物水平明显得到更多的提高。因为细胞周期蛋白E是S期的起始所必须的，POLQ的消耗导致复制起始活性的升高。已知POLQ影响叉的速度(Lemée等人，Proc Natl Acad Sci U S A.,107(30):13390-5,2010)。因此，POLQ表达的失控干扰复制的许可，在该研究的肿瘤中引发复制压力和遗传不稳定性。
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