一种酶活性及热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶
阅读：47发布：2023-02-22
专利汇可以提供一种酶活性及热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种酶活性提高的谷 氨 酰胺转氨酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明以MTG在大肠杆菌中的高效表达为改造平台，对MTG成熟酶N端氨基酸进行缺失和饱和突变，得到了酶学性质较好的突变株，比酶活提高1.85倍，热 稳定性 提高2.7倍。改造后的酶更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。，下面是一种酶活性及热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶专利的具体信息内容。
一种酶活性及热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶
技术领域
背景技术
[0002] 微生物谷氨酰胺转胺酶（蛋白质-谷氨酸-谷氨酰胺转胺酶，Microbial Transglutaminase，EC2.3.2.13简称MTG）其生物学功能是直接改变蛋白质本身以及蛋白质所附着的细胞、组织等的结构与功能性质的特性，提高蛋白质的营养价值。因此，MTG在食品、纺织、生物制药等领域有着广泛的应用前景。但由于MTG自身的一些缺陷如比酶活、热稳定性等因素，限制了MTG的应用范围。因此基于已得到的MTG在大肠杆菌中的表达平台，利用氨基酸缺失和饱和突变，对MTG进行分子改造，以期得到酶学性质更适合工业应用的MTG。
发明内容
[0003] 为改善MTG比酶活低，热稳定性差的现状，本研究通过对MTG的N端氨基酸进行缺失，从而降低底物与MTG活性中心的结合阻力，提高MTG对底物的亲和能力。对得到比酶活提高的突变株继续利用饱和突变，改变MTG内部氨基酸之间的极性作用，继而提高MTG比酶活和热稳定性。本研究提供一种新的改造思路，结合理性设计和饱和突变，提高改造效率，并得到了比酶活和热稳定都提高的突变株。
[0004] 在前期研究中，本研究室筛选出一株新的产谷氨酰胺转胺酶的菌株（Streptomyces hygroscopicus CCTCC NO.M203062），通过基因克隆方法，得到了MTG基因序列及其上下游序列，含MTG自身的启动子和终止子（Genebank：EU477523），并实现了MTG和其酶原区在大肠杆菌中的高效表达（Liu S,Zhang D,Wang M,Cui W，Chen K,Liu Y，Du G，Chen J,Zhou Z(2011)The pro-region of Streptomyces hygroscopicus transglutaminase affects its secretion by Escherichia coli.FEMS Microbiol Lett324(2):98-105）。基于大肠杆菌构建平台，我们对MTG成熟酶N端氨基酸进行缺失和饱和突变，得到了酶学性质较好的突变株。
[0005] 本发明所用到的培养基：
[0006] LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，pH 7.0；
[0007] TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，甘油8g/L，17mmol/L KH2PO4，72mmol/LK2HPO4。
[0008] 本发明中谷氨酰胺转胺酶活力的测定：
[0009] 比色法测定酶活：以N-α-CBZ-GLN-GLY为作用底物，L-谷氨酸-γ单羟胺酸做标准曲线。1个单位谷氨酰胺转胺酶酶活定义为：37C时每分钟催化形成1μmol L-谷氨酸-γ单羟胺酸的酶量(U/mL)。
[0010] 试剂A：100mg的Nα-CBZ-GLN-GLY溶解于2mL 0.2moL/L的NaOH溶液中，加入0.2mol/L pH6.0的Tris-HC缓冲液4mL，0.1mol/L羟胺2mL，0.01mol/L的还原型谷胱甘肽
2mL，并调节pH至6.0。
2mL，并调节pH至6.0。
[0011] 试剂B：3mol/L的HCL，12%TCA，5%FeCL3按1：1：1混合。
[0012] 配制0-4μmol/mL的L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸标准溶液。取1mL试剂A与0.4mL不同浓度的L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸标准溶液混合，37℃水浴10分钟。加0.4mL试剂B终止反应，在525nm比色，绘制出标准曲线。以0.4mL经适当稀释的酶液代替标准溶液，在相同条件下保温和比色，从标准曲线求出酶活。以100C加热10分钟的离心后的上清液为空白。酶活力(u/mL)=(6.8548×OD525-0.0164)×稀释倍数
[0013] 本发明以MTG在大肠杆菌中的高效表达为改造平台，对MTG成熟酶N端氨基酸进行缺失和饱和突变，得到了酶学性质较好的突变株，比酶活提高1.85倍，热稳定性提高2.7倍。改造后的酶更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。附图说明
[0014] 图1S.hygroscopicus来源MTG晶体结构模拟
[0016] 图3饱和突变株发酵上清酶活和热稳定性检测
[0017] 表1MTG发酵上清酶活和TGase酶学性质
[0018] 表2MTG突变株酶学性质
具体实施方式
[0019] 实施例1：吸水链霉菌来源MTG晶体结构模拟
[0020] 以已报道的S.mobaraensis的TGase晶体结构为模板，在swiss-model网站（http:∥swissmodel.expasy.org/）模拟S.hygroscopicus TGase的晶体结构，如图1所示。
[0021] 实施例2：高活性突变株的获得（Del1-4）
[0022] 1、利用定点突变试剂盒（TaKaRa），分别缺失N端的7个氨基酸（Asp 1、Ala 2、Ala3、Asp 4、Glu 5、Arg 6、Val 7），缺失一个氨基酸命名为Del 1，以此类推，缺失前七个氨基酸命名为Del1-7，转化子由上海生工进行测序。
[0023] 2、将测序正确的质粒，转化E.coli BL 21，挑选转化子接种到LB液体培养基中，37℃，培养12h，转接到TB培养基中，接种量为3%。菌体长到OD600为2时，加入IPTG诱导，并将培养温度降到20℃，培养48h。
[0024] 3、收集发酵上清，检测发酵上清酶活，并对样品进行His-镍柱纯化，纯化蛋白电泳如图2所示。
[0025] 4、对纯化的蛋白的比酶活和Km值进行测定，结果如表1所示。实验结果表明Del1，比酶活有提高，但Del 1-2酶活明显降低，当缺失到Del 1-3、Del 1-4的酶活得到明显提高，而缺失到Del 1-5、Del 1-6酶活降低，到Del 1-7则检测不到酶活。对缺失后的序列在swiss-model中模拟晶体结构，如图3所示，由于是N端氨基酸的缺失，TGase结构基本没变，但是对于N端loop结构的位置影响比较大，Del 1、Del 1-3、Del 1-4、Del 1-5的N端都有活性中心上游转移到了一侧，而Del 1-2的loop则仍在活性中心上游，且更靠近活性中心，同时检测Km值，Del 1-2的Km值偏大，说明缺失N端1-2影响了TGase与底物的结合能力，而Del 1-3、Del 1-4的Km值和对照相比偏小，说明N端由活性中心上游转移到一侧，有助于底物的结合。
[0026] 表1 MTG发酵上清酶活和TGase酶学性质
[0027]
[0028] 实施例3：高活性及热稳定突变株的获得（TG-Del 1-4E5D）
[0029] 利用定点突变，基于实施例2中得到的Del 1-4为突变出发菌株，继续将MTG的N端第5个氨基酸进行饱和突变，将得到的正确子进行转化E.coli BL 21，发酵条件同上。对发酵上清进行酶活检测，如图3，并对发酵液进行热稳定性粗测，55℃处理10min（图3C）。得到4株在酶活没有降低的情况下，热稳定性有一定提高的突变株。对突变株纯化，检测酶学性质，如表2所示，突变株TG-Del 1-4E5D（缺失N端的4个氨基酸，并将第五个氨基酸E突变成D）的热稳定性和比酶活都有显著提高。
[0030] 表2 MTG突变株酶学性质
[0031]
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