使用热稳定丝氨酸蛋白酶的方法
阅读：340发布：2021-01-05
专利汇可以提供使用热稳定丝氨酸蛋白酶的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文描述了使用热稳定丝 氨 酸蛋白酶的方法。，下面是使用热稳定丝氨酸蛋白酶的方法专利的具体信息内容。
1.一种用于生产热稳定丝氨酸蛋白酶的方法，所述方法包括：
(a)用编码与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶的重组构建体转化生产宿主；以及
(b)在37.5℃以上的温度下培养步骤(a)的生产宿主，以提高所述热稳定丝氨酸蛋白酶的表达水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其中任选地从所述生产宿主回收所述热稳定丝氨酸蛋白酶。
3.一种含有热稳定丝氨酸蛋白酶的培养物上清液，所述培养物上清液通过权利要求1或2所述的方法获得。
4.一种饲料、喂养料、饲料添加剂组合物、预混物、食物或谷物产品，其包含与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶，其中所述热稳定丝氨酸蛋白酶可以单独使用或与至少一种直接饲喂微生物组合使用。
5.一种动物饲料，其包含与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶，其中所述热稳定丝氨酸蛋白酶以从1-20g/吨饲料的量存在，并且进一步其中所述热稳定丝氨酸蛋白酶可以单独使用或与至少一种直接饲喂微生物组合使用。
6.根据权利要求4所述的饲料添加剂组合物，用于在动物饲料中使用，所述饲料添加剂组合物进一步包含10和至少一种选自以下的组分：蛋白质、肽、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘油、丙二醇、氯化钠、硫酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、甲酸钠、山梨酸钠、氯化钾、硫酸钾、乙酸钾、柠檬酸钾、甲酸钾、乙酸钾、山梨酸钾、氯化镁、硫酸镁、乙酸镁、柠檬酸镁、甲酸镁、山梨酸镁、焦亚硫酸钠、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。
7.一种用于在动物饲料中使用的颗粒状饲料添加剂组合物，其包含与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶，所述热稳定丝氨酸蛋白酶可以单独使用或与至少一种直接饲喂微生物组合使用，其中所述颗粒状饲料添加剂组合物包含通过选自以下的方法产生的颗粒：高剪切制粒、鼓式制粒、挤出、滚圆、流化床附聚、流化床喷涂、喷雾干燥、冷冻干燥、造粒、喷雾冷却、旋转式圆盘雾化、凝聚、压片或上述方法的任何组合。
8.根据权利要求7所述的颗粒状饲料添加剂组合物，其中所述颗粒的平均直径大于50微米并且小于2000微米。
9.根据权利要求7所述的饲料添加剂组合物，其中所述组合物呈液体形式。
10.根据权利要求9所述的饲料添加剂组合物，其中所述组合物呈适合于在饲料丸粒上喷雾干燥的液体形式。
11.一种用于水解含淀粉材料的方法，所述方法包括：
(a)使含淀粉材料与液体接触以形成醪液；以及
(b)通过使醪液与酶混合物接触而水解醪液中的淀粉以形成液化物，所述酶混合物包含与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述酶混合物进一步包含至少一种选自以下的酶：α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、肌醇六磷酸酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶和木聚糖酶。
13.一种用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，所述方法包括：
(a)用酶混合物液化所述含淀粉材料，所述酶混合物包含与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶；
(b)糖化步骤(a)的产物；
(c)用合适的生物体进行发酵；以及
(d)任选地，回收步骤(c)中产生的产物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，同时进行步骤(b)和(c)。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的方法，其中通过使用1-20g与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶/MT含淀粉材料，氮源添加被消除或减少至少60％。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，当使用1-20g与SEQ ID NO:3、8或10具有至少
80％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶/MT含淀粉材料时，当发酵产物是乙醇时，则步骤(c)中不需要酸性蛋白水解酶。
17.一种降低液化的含淀粉材料的粘度的方法，所述方法包括使含淀粉材料的浆料与热稳定丝氨酸蛋白酶接触，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％序列同一性。
18.一种从油籽作物中提取油的方法，所述方法包括：
(a)使含有油的油籽级分与水性提取剂接触以形成提取物油籽级分；以及
(b)将提取的油籽级分分离成水相、水包油乳液和不溶性相；
(c)在允许酶活性持续足以使所述水包油乳液去稳定的时间的条件下，使所述乳液与单独或至少与磷脂酶组合的至少一种热稳定丝氨酸蛋白酶接触，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％序列同一性；以及
(d)将步骤(c)的去稳定的乳液分离成水相、油相和不溶性相，以从所述油籽中获得油。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述油籽级分来自大豆、玉米籽、油菜籽、棕榈仁、葵花籽、红花籽、椰子、花生、棉籽、芝麻籽、亚麻籽、罂粟籽、扁桃、榛子、核桃、月见草籽、葡萄籽、大麻籽、黑加仑籽、红树莓籽、胡萝卜籽、小茴香籽、蓝莓籽、蔓越莓籽、欧芹籽、洋葱籽、南瓜籽、杏仁、芥菜籽、亚麻籽、蓖麻籽或麻风树。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述油籽级分包含可用作食物、食物成分、食物添加剂或食物补充剂的蛋白质级分。
21.一种植物源油，其根据权利要求18所述的方法制备。
22.一种饲料、喂养料、饲料添加剂组合物、预混物、食物或谷物产物，其包含根据权利要求21所述的油。
23.一种用于制备麦芽汁的方法，所述方法包括：
a)使包含经研磨谷物的混合物的含淀粉材料与水和热稳定丝氨酸蛋白酶接触以形成醪液，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％序列同一性；
b)缓慢地加热步骤(a)的醪液，将淀粉转化为糖；以及
c)将步骤(b)的加热的醪液分离成残余的谷物和液体麦芽汁
其中所述热稳定蛋白酶以从1-30g/吨经研磨谷物的量存在。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，在步骤(a)中与所述热稳定丝氨酸蛋白酶一起添加至少一种α-淀粉酶。
25.一种用于水解至少一种食物或动物副产物的方法，所述方法包括：
(a)使所述食物或动物副产物与液体接触；以及
(b)通过与酶混合物接触而水解醪液中的食物或动物副产物以形成液化物，所述酶混合物包含与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述食物副产物是选自以下的富含角蛋白的物质：羽毛、毛发和羊毛。
27.一种用于水解木质纤维素生物质中的蛋白质的方法，所述方法包括：
(a)使所述生物质与液体接触；以及
(b)通过使所述生物质与包含热稳定丝氨酸蛋白酶的酶混合物接触来水解所述生物质中的蛋白质，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％序列同一性。
使用热稳定丝氨酸蛋白酶的方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0004] 将于2016年12月14日创建并同时提交的、以大小为23KB、名称为“NB40835WOPCT_SequenceListing_ST.txt”的文件形式提供的序列表通过引用以其全文并入本文。
技术领域
[0005] 所述领域涉及使用热稳定丝氨酸蛋白酶的方法。
背景技术
[0006] 蛋白酶(protease)(也称为肽酶或朊酶(proteinase))是一种能够切割肽键的酶。蛋白酶经过多次进化，且不同种类的蛋白酶可以通过完全不同的催化机制进行相同的反
应。蛋白酶可以在动物、植物、真菌、细菌、古细菌和病毒中找到。
应。蛋白酶可以在动物、植物、真菌、细菌、古细菌和病毒中找到。
[0008] 丝氨酸蛋白酶属于羰基水解酶亚组，其包含具有广泛特异性和生物学功能的不同类别的酶。尽管存在这种功能多样性，但丝氨酸蛋白酶的催化机制已与至少两种遗传上不
同的酶家族接近：1)枯草杆菌蛋白酶；和2)胰凝乳蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶(例如胰蛋白酶)。
同的酶家族接近：1)枯草杆菌蛋白酶；和2)胰凝乳蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶(例如胰蛋白酶)。
[0009] 丝氨酸蛋白酶或丝氨酸内肽酶这两个家族具有非常相似的催化机制。这两个酶家族的三级结构汇集了由丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸组成的氨基酸的保守的催化三联体。
[0010] 已经对丝氨酸蛋白酶进行了大量研究，这主要归因于它们在工业应用中有用。另外的工作集中于不利的环境条件(例如，暴露于氧化剂、螯合剂、极端温度和/或pH)，这些条件可能在各种应用中不利地影响这些酶的功能。
[0012] 在一个实施例中，公开了一种用于生产热稳定丝氨酸蛋白酶的方法，所述方法包括：
[0013] (a)用编码与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶的重组构建体转化生产宿主；以及
[0014] (b)在37.5℃以上的温度下培养步骤(a)的生产宿主，以提高所述热稳定丝氨酸蛋白酶的表达水平。
[0015] 在第二个实施例中，可以任选地从所述生产宿主回收所述热稳定丝氨酸蛋白酶。
[0016] 在第三个实施例中，通过本文所述的任何方法获得含有热稳定丝氨酸蛋白酶的培养上清液。
[0017] 在第四个实施例中，公开了包含与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶的饲料、喂养料、饲料添加剂组合物、预混物、食物或谷物产物，其中所述热稳定丝氨酸蛋白酶可以单独使用或与至少一种直接饲喂微生物组合使用。
[0018] 在第五个实施例中，公开了包含与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶的动物饲料，其中所述热稳定丝氨酸蛋白酶以从1-20g/吨饲料的量
存在，并且进一步其中所述热稳定丝氨酸蛋白酶可以单独使用或与至少一种直接饲喂微生
物组合使用。
存在，并且进一步其中所述热稳定丝氨酸蛋白酶可以单独使用或与至少一种直接饲喂微生
物组合使用。
[0019] 在第六个实施例中，公开了如本文所述的饲料添加剂组合物，所述组合物进一步包含至少一种选自以下的组分：蛋白质、肽、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘油、丙二醇、氯化钠、硫酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、甲酸钠、山梨酸钠、氯化钾、硫酸钾、乙酸钾、柠檬酸钾、甲酸钾、乙酸钾、山梨酸钾、氯化镁、硫酸镁、乙酸镁、柠檬酸镁、甲酸镁、山梨酸镁、焦亚硫酸钠、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。
[0020] 在第七个实施例中，公开了包含与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶的动物饲料中使用的颗粒状饲料添加剂组合物，所述热稳定丝氨酸
蛋白酶可以单独使用或与至少一种直接饲喂微生物组合使用，其中所述颗粒状饲料添加剂
组合物包含通过选自以下的方法产生的颗粒：高剪切制粒、鼓式制粒、挤出、滚圆、流化床附聚、流化床喷涂、喷雾干燥、冷冻干燥、造粒、喷雾冷却、旋转式圆盘雾化、凝聚、压片或上述方法的任何组合。
蛋白酶可以单独使用或与至少一种直接饲喂微生物组合使用，其中所述颗粒状饲料添加剂
组合物包含通过选自以下的方法产生的颗粒：高剪切制粒、鼓式制粒、挤出、滚圆、流化床附聚、流化床喷涂、喷雾干燥、冷冻干燥、造粒、喷雾冷却、旋转式圆盘雾化、凝聚、压片或上述方法的任何组合。
[0021] 在第八个实施例中，公开了根据权利要求7所述的颗粒状饲料添加剂组合物，其中这些颗粒的平均直径大于50微米并且小于2000微米。此外，根据权利要求所述的这种颗粒
状饲料添加剂组合物可以是液体形式。甚至进一步，这种液体形式可适用于在饲料丸粒上
喷雾干燥。
状饲料添加剂组合物可以是液体形式。甚至进一步，这种液体形式可适用于在饲料丸粒上
喷雾干燥。
[0022] 在第九个实施例中，公开了水解含淀粉材料的方法，所述方法包括：
[0023] (a)使含淀粉材料与液体接触以形成醪液；以及
[0024] (b)通过使醪液与酶混合物接触而水解醪液中的淀粉以形成液化物，所述酶混合物包含与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶。此外，所述酶混合物可进一步包含至少一种选自以下的酶：α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、肌醇六磷酸酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶和木聚糖酶。
[0026] (a)用酶混合物液化所述含淀粉材料，所述酶混合物包含与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶；
[0027] (b)糖化步骤(a)的产物；
[0028] (c)用合适的生物体进行发酵；以及
[0029] (d)任选地，回收步骤(c)中产生的产物。
[0030] 步骤(b)和(c)可以顺序地进行或可以同时进行。
[0031] 当步骤(b)和(c)同时进行时，通过使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20g热稳定丝氨酸蛋白酶/公吨(MT)含淀粉材料，氮源(如但不限于尿素或氨)的添加被消除或减少至少30％、40％、50％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、
95％、96％、97％、98％或99％，其中使用的所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
95％、96％、97％、98％或99％，其中使用的所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
[0032] 当步骤(b)和(c)同时进行时，通过使用至少3、4、5或6g热稳定丝氨酸蛋白酶/MT干固体材料，氮源(如但不限于尿素)的添加被消除(100％减少)或减少至少30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，其中使用的所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
[0033] 当步骤(b)和(c)同时进行时，通过使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20g热稳定丝氨酸蛋白酶/MT含淀粉材料，氮源(如但不限于尿素)的添加被消除(100％减少)或减少至少30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％或99％，其中使用的所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、
8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且此外当发酵产物是乙醇时，则步骤(c)中不需要酸性蛋白水解酶。
90％、95％、96％、97％、98％或99％，其中使用的所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、
8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且此外当发酵产物是乙醇时，则步骤(c)中不需要酸性蛋白水解酶。
[0034] 在第十一个实施例中，提供了降低液化的含淀粉材料的粘度的方法，所述方法包括使含淀粉材料的浆料与热稳定丝氨酸蛋白酶接触，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID
NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。本文所述的热稳定丝氨酸蛋白酶与浆料的接触可以与其他酶组合，或与包含除本文所述的热稳定丝氨酸蛋白酶之
外的酶的浆料组合。
NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。本文所述的热稳定丝氨酸蛋白酶与浆料的接触可以与其他酶组合，或与包含除本文所述的热稳定丝氨酸蛋白酶之
外的酶的浆料组合。
[0036] (a)使含有油的油籽级分与水性提取剂接触以形成提取物油籽级分；以及
[0037] (b)将提取的油籽级分分离成水相、水包油乳液和不溶性相；
[0038] (c)在允许酶活性持续足以使所述水包油乳液去稳定的时间的条件下，使所述乳液与单独或与磷脂酶组合的至少一种热稳定丝氨酸蛋白酶接触，所述热稳定丝氨酸蛋白酶
与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；以及
与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；以及
[0039] (d)将步骤(c)的去稳定的乳液分离成水相、油相和不溶性相，以从所述油籽中获得油。
[0040] 此外，油籽级分可以来自大豆、玉米籽、油菜籽、棕榈仁、葵花籽、红花籽、椰子、花生、棉籽、芝麻籽、亚麻籽、罂粟籽、扁桃、榛子、核桃、月见草籽、葡萄籽、大麻籽、黑加仑籽、红树莓籽、胡萝卜籽、小茴香籽、蓝莓籽、蔓越莓籽、欧芹籽、洋葱籽、南瓜籽、杏仁、芥菜籽、亚麻籽、蓖麻籽或麻风树。
[0041] 甚至进一步，油籽级分可包含可用作食物、食物成分、食物添加剂或食物补充剂的蛋白质级分。
[0042] 在第十三个实施例中，公开了包含通过本文所述方法获得的油的饲料、喂养料、饲料添加剂组合物、预混物、食物或谷物产物。
[0043] 在第十四个实施例中，公开了用于制备麦芽汁的方法，所述方法包括：
[0044] a)使包含经研磨谷物的混合物的含淀粉材料与水和热稳定丝氨酸蛋白酶接触以形成醪液，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％或99％序列同一性；
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％或99％序列同一性；
[0045] b)缓慢地加热步骤(a)的醪液，将淀粉转化为糖；以及
[0046] c)将步骤(b)的加热的醪液分离成残余的谷物和液体麦芽汁
[0047] 其中所述热稳定蛋白酶以从1-30g/吨经研磨谷物的量存在。
[0048] 此外，可以在步骤(a)中与热稳定丝氨酸蛋白酶一起添加α-淀粉酶。
[0049] 在第十五个实施例中，公开了水解至少一种食物或动物副产物的方法，所述方法包括：
[0050] (a)使所述食物或动物副产物与液体接触；以及
[0051] (b)通过与酶混合物接触而水解食物或动物副产物以形成液化物，所述酶混合物包含与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶。
[0054] (a)使所述生物质与液体接触；以及
[0055] (b)通过使生物质与包含热稳定丝氨酸蛋白酶的酶混合物接触来水解生物质中的蛋白质，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％序列同一性。
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％序列同一性。
[0057] 图1.用于在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中表达ME-3蛋白酶的pHYT-Tce01961质粒的物理图谱。
[0058] 图2.在胃蛋白酶和胰酶存在下用ME-3蛋白酶处理的玉米大豆饲料蛋白水解的剂量应答。
[0059] 图3.在pH 10下孵育的ME-3蛋白酶的热稳定性。
[0060] 图4.在pH 3.75和7.5之间评估pH对ME-3蛋白酶的酶活性的影响。
[0061] 图5.与醪液相比，在90℃至100℃下制粒60秒后，没有任何涂层的ME-3蛋白酶保持超过70％的活性。
[0062] 图6.在Ankom系统上同时进行糖化和发酵的累积压力图。浅灰色线表示无FERMGENTM 2.5x，240ppm尿素，无ME-3添加的条件；中灰色线表示0.178SAPU/g DS
FERMGENTM，600ppm尿素，无ME-3添加的条件；并且黑色线表示无FERMGENTM 2.5x，240ppm尿素加ME-3蛋白酶添加的条件。
FERMGENTM，600ppm尿素，无ME-3添加的条件；并且黑色线表示无FERMGENTM 2.5x，240ppm尿素加ME-3蛋白酶添加的条件。
[0063] 图7.在单个容器中使用50％麦芽和50％玉米的混合物，在用ME-3蛋白酶高温糖化醪制备(mashing)后，麦芽汁中的FAN含量(mg/L)。
[0064] 图8.WP_017594871与嗜热双岐菌属(Thermobifida)蛋白酶(ME-3、Tfpa和Thpa)、和耐热深海放线菌(M.thermotolerans)_WP_078763344、海洋拟无枝菌酸菌(A.marina)_
WP_091675221、海绵异壁放线菌(A.hymeniacidonis)_WP_069846166、海藻糖拟诺卡氏菌
(N.trehalosi)_WP_067965505和糖丝菌属物种(Saccharothrix sp.)_WP_033441214的成
熟链的多个氨基酸序列比对。
WP_091675221、海绵异壁放线菌(A.hymeniacidonis)_WP_069846166、海藻糖拟诺卡氏菌
(N.trehalosi)_WP_067965505和糖丝菌属物种(Saccharothrix sp.)_WP_033441214的成
熟链的多个氨基酸序列比对。
[0065] 以下序列遵循37C.F.R.§§1.821-1.825(“Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence
Disclosures-the Sequence Rules[含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的
要求-序列规则]”)并符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(2009)和欧洲专利公约
(EPC)以及专利合作条约(PCT)法规第5.2和49.5(a-bis)条，以及行政章程第208款和附件C
关于序列表的要求。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R.§1.822中
所述的条例。
Disclosures-the Sequence Rules[含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的
要求-序列规则]”)并符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(2009)和欧洲专利公约
(EPC)以及专利合作条约(PCT)法规第5.2和49.5(a-bis)条，以及行政章程第208款和附件C
关于序列表的要求。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R.§1.822中
所述的条例。
[0066] SEQ ID NO:1列出了编码蛋白酶ME-3的Tce01961n的核苷酸序列。
[0067] SEQ ID NO:2列出了由Tce01961n编码的ME-3前酶原的氨基酸序列。
[0068] SEQ ID NO:3列出了完全加工的成熟酶ME-3(186个氨基酸)的氨基酸序列。
[0070] SEQ ID NO:5列出了为了制备衍生自pHY300PLK(宝生物工程株式会社(Takara Bio Inc.))的pHYT载体，使用BstEII和EcoRI位点在四环素抗性基因之后添加的终止子序
列。
列。
[0071] SEQ ID NO:6列出了克隆到pHY300PLK的BamHI和HindIII位点的接头序列。
[0072] SEQ ID NO:7列出了褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)Tfpa前酶原的氨基酸序列。
[0073] SEQ ID NO:8列出了完全加工的成熟酶Tfpa(186个氨基酸)的氨基酸序列。
[0074] SEQ ID NO:9列出了耐盐嗜热双岐菌(Thermobifida halotolerans)WP_068687914肽酶S1，即Thpa的氨基酸序列。
[0075] SEQ ID NO:10列出了预测的完全加工的成熟酶，即耐盐嗜热双岐菌WP_068687914肽酶S1或Thpa(186个氨基酸)的氨基酸序列。
[0076] SEQ ID NO:11列出了潜能拟诺卡氏菌(Nocardiopsis potens)WP_017594871的氨基酸序列。
[0077] SEQ ID NO:12列出了预测的完全加工的成熟酶潜能拟诺卡氏菌WP_017594871丝氨酸蛋白酶(185个氨基酸)的氨基酸序列。
具体实施方式
[0078] 引用的所有专利、专利申请和出版物均通过引用以其全文并入本文。
[0079] 在本公开中，使用了许多术语和缩写。除非另有特别说明，以下定义适用。
[0080] 在元素或组分前的冠词“一个/种(a/an)”和“所述(the)”在关于所述元素或组分的实例(即，出现)的数目旨在是非限制性的。因此，“一个/种(a/an)”和“所述(the)”应理解为包括一个/种或至少一个/种，并且元素或组分的单数词语形式还包括复数，除非所述数字明显意指单数。
[0081] 术语“包含”意指如权利要求书中所提及的说明的特征、整数、步骤或组分的存在，而并未排除一个或多个其他特征、整数、步骤、组分或其组的存在或添加。术语“包含”旨在包括由术语“基本上由……组成”和“由……组成”所涵盖的实施例。类似地，术语“基本上由……组成”旨在包括由术语“由……组成”所涵盖的实施例。
[0082] 在存在的情况下，所有范围是包含端值的和可组合的。例如，当列举“1至5”的范围时，所列举的范围应解释为包括“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等范围。
[0083] 如本文与数值结合所用的，术语“约”是指数值的+/-0.5的范围，除非所述术语在上下文中另有具体定义。例如，短语“约6的pH值”是指pH值为从5.5至6.5，除非所述pH值另有具体定义。
[0084] 在本说明书全文中给出的每一最大数值限度旨在包括每一较低数值限度，如同此类较低数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书全文中给出的每一最小数值限度将包
括每一较高数值限度，如同此类较高数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书全文中
给出的每一数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同此类较窄
数值范围在本文中全部明确写出一样。
括每一较高数值限度，如同此类较高数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书全文中
给出的每一数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同此类较窄
数值范围在本文中全部明确写出一样。
[0085] 术语“蛋白酶”意指源自微生物(例如真菌、细菌)或衍生自植物或动物的蛋白质或多肽结构域，且其具有催化肽键在蛋白质主链的一个或多个不同位置的切割的能力(如E.C.3.4)。术语“蛋白酶”、“肽酶”和“朊酶”可以互换使用。蛋白酶可以在动物、植物、真菌、细菌、古细菌和病毒中找到。蛋白质水解可通过目前被分为以下六大组的酶实现：天冬氨酰蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。
[0086] 术语“热稳定丝氨酸蛋白酶”意指热稳定的丝氨酸蛋白酶。
[0087] 术语“淀粉”是指由植物的复合多糖碳水化合物构成的任何材料。这个术语是指任何基于植物的材料，包括但不限于谷物、草、块茎、和根，并且更具体地是指小麦、大麦、玉米、黑麦、稻、高粱、麸、木薯、粟、马铃薯、甘薯、和树薯。
[0088] 术语“浆料”是指含淀粉材料(例如，经研磨玉米)和水性组分的混合物，所述水性组分可包括水、去离子水或工业用水(例如，逆流、蒸汽、冷凝水)或其任何组合。术语“浆料”和“醪液”在本文中可互换地使用。
[0089] 术语“使液化”、“液化”、“液化物”及其变体是指将淀粉转化为可溶性糊精化底物(例如较小多糖)的方法或产物。
[0090] “液化物”可以称为“醪液”，或者也可以称为可溶性淀粉底物或液化的底物。在一些情况下，它可以是含有热稳定α淀粉酶的完全碾磨的谷物浆料，所述浆料已经经受高温液化，以产生用于糖化和发酵或同时糖化和发酵(SSF)的可溶性底物。高温是高于谷物多糖的糊化温度的温度。
[0091] 术语“经研磨”在本文中用于指已经进行尺寸减小的植物材料(例如通过碾磨、粉碎、分馏或任何其他粒度减小的手段)。研磨包括干磨或湿磨。“干磨”是指完整干燥谷物的研磨。“湿磨”是指其中首先将谷物浸泡(浸透)在水中以软化谷物的过程。
[0092] 术语“水解”是指化合物通过与水反应而分解的化学反应或过程。淀粉消化酶将淀粉水解成较小的单元，即较小的多糖。
[0093] 术语“木质纤维素”是指包含木质素和纤维素二者的组合物。其还可以含有半纤维素。
[0094] 术语“木质纤维素生物质”是指任何木质纤维素材料，并且包括包含纤维素、半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖的材料。生物质还可以包含附加组分，例如蛋白质和/或脂质。生物质可源自单一来源，或者生物质可包含源自多于一种来源的混合物；25例如，生物质可以包含玉米棒和玉米秸秆的混合物，或者草和叶的混合物。木质纤维素生物质包括但不限于生物能源作物、农业残余物、城市固体废物、工业固体废物、来自纸张生产的淤渣、庭院废物、木材和林业废物。生物质的实例包括但不限于玉米棒、作物残余物30如玉米壳、玉米秸秆、草(包括芒草)、小麦秸秆、大麦秸秆、干草、稻草、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱材料、大豆植物材料、从谷物的研磨或在生产过程中使用谷物得到的组分(如DDGS：干酒糟及可溶物)、乔木、树枝、根、叶、木片、锯屑、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、棕榈空果串(empty palm fruit bunch)和能源甘蔗。术语“能源甘蔗”是指培育用于在能源生产中使用的甘蔗。
其因为比糖更高百分比的纤维而被选择。
其因为比糖更高百分比的纤维而被选择。
[0095] 术语“预处理的木质纤维素生物质”是指在糖化之前已经经受物理、热和/或化学处理的生物质。术语“氨预处理的木质纤维素生物质”是指至少已经经受采用氨的预处理过程的生物质。在一个实施例中，氨预处理是低氨预处理，其中使生物质与包含氨的水溶液接触以形成生物质-氨水混合物，其中氨浓度足以保持所述生物质-氨水混合物的碱性pH，但
相对于生物质的干重量小于约12重量百分比，并且其中生物质的干重量相对于所述生物
质-氨水混合物的重量为至少约15重量百分比的固体，如美国专利号7,932,063(将其通过
引用并入本文)中所公开的。术语“木质纤维素生物质水解产物”是指由木质纤维素生物质的糖化产生的产物。生物质也可以在糖化之前进行预处理或预加工。术语“糖化”和“进行糖化”是指使用酶将多糖转化为右旋糖单体的方法。糖化可以指液化物中多糖的转化。糖化产物是例如葡萄糖和其他小(低分子量)低聚糖，如二糖和三糖。
相对于生物质的干重量小于约12重量百分比，并且其中生物质的干重量相对于所述生物
质-氨水混合物的重量为至少约15重量百分比的固体，如美国专利号7,932,063(将其通过
引用并入本文)中所公开的。术语“木质纤维素生物质水解产物”是指由木质纤维素生物质的糖化产生的产物。生物质也可以在糖化之前进行预处理或预加工。术语“糖化”和“进行糖化”是指使用酶将多糖转化为右旋糖单体的方法。糖化可以指液化物中多糖的转化。糖化产物是例如葡萄糖和其他小(低分子量)低聚糖，如二糖和三糖。
[0096] 术语“SSF”是指同时糖化和发酵。
[0097] 术语“酶混合物”是指至少两种不同酶的混合物或组合，这使得酶对任何催化反应更有效率并且更有效。
[0098] 术语“发酵”或“进行发酵”是指从还原的植物材料转化糖以产生发酵产物的过程。
[0099] 术语“发酵产物”意指通过包括使用发酵生物体的发酵步骤的方法产生的产物。
[0102] 术语“乳液”是指两种或更多种通常不可混溶(不可混合或不可共混)的液体的混合物。在乳液中，一种液体(分散相)分散在另一种液体(连续相)中。乳液的实例包括油醋汁(vinaigrette)、均脂牛乳、蛋黄酱等。
[0104] 术语“醪液”是指任何含有淀粉和/或糖的植物材料如谷粉(例如包含压碎的大麦麦芽、压碎的大麦)和/或其他辅料或其组合的含水浆料，随后与水混合以分离成麦芽汁和
废糟。
废糟。
[0106] 啤酒可以通过基本上相同的方法由各种含淀粉植物材料和/或含糖植物材料(通常是谷类谷物和/或麦芽)制成。谷物淀粉被认为是葡萄糖均聚物，其中葡萄糖残基通过α-
1,4-键或α-1,6-键连接，前者占主导地位。
1,4-键或α-1,6-键连接，前者占主导地位。
[0107] 术语“副产物”是指衍生自制造过程或化学反应的次级产物。它不是生产的主要产物或服务。
[0108] 术语“动物”和“受试者”在本文中可互换地使用。“动物”包括所有非反刍动物(包括人类)和反刍动物。在具体实施例中，所述动物是非反刍动物，例如马和单胃动物。单胃动物的实例包括但不限于：猪(pig和swine)，如仔猪、生长猪、母猪；家禽，如火鸡、鸭、小鸡、肉仔鸡、蛋鸡；鱼，如鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳类，例如虾和对虾。在另外的实施例中，所述动物是反刍动物，包括但不限于牛、小牛、山羊、绵羊、长颈鹿、北美野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和鹿牛羚。
[0109] 如本文所用的术语“病原体”意指任何疾病的致病物。这样的致病物可以包括但不限于细菌、病毒、真菌致病物等。
[0110] “饲料”和“食品”分别意指任何天然或人造饮食、膳食等，或此类膳食的组分，其意在或适合于分别被非人类动物和人类食用、摄取、消化。
[0111] 如本文所用的，术语“食品”以广义使用，并且涵盖用于人类的食品和食品产品以及用于非人类动物的食品(即饲料)。
[0112] 关于在饲养家畜时饲喂动物的产品，使用术语“饲料”。术语“饲料”和“动物饲料”可互换地使用。
[0113] 如本文所用的，术语“直接饲喂微生物”(“DFM”)是活的(有活力的)天然发生的微生物的来源。DFM可以包含一个或多个这样的天然发生的微生物，例如细菌菌株。DFM的类别包括芽孢杆菌属(Bacillus)、乳酸菌和酵母菌。因此，术语DFM涵盖以下一种或多种：直接饲喂细菌、直接饲喂酵母、直接饲喂酵母及其组合。
[0114] 芽孢杆菌属(Bacilli)是独特的、形成孢子的革兰氏阳性杆菌。这些孢子非常稳定，并且可以承受环境条件，如热、湿气和一定范围的pH。这些孢子当被动物摄入后会萌发成有活性的营养细胞，并可用于粗粉和压成丸粒的饮食中。乳酸菌是革兰氏阳性球菌，可产生对病原体有拮抗作用的乳酸。由于乳酸菌似乎有点对热敏感，所以它们不能用于压成丸
粒的饮食中。乳酸菌的种类包括双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳杆菌(Lactobacillus)和
链球菌(Streptococcus)。
粒的饮食中。乳酸菌的种类包括双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳杆菌(Lactobacillus)和
链球菌(Streptococcus)。
[0115] 术语“益生菌”意指通过选择性地刺激一种或有限数量的有益细菌的生长和/或活性来有益地影响宿主的不可消化食物成分。
[0116] 如本文所用的，术语“益生菌培养物”定义了当例如以足够数量摄取或局部应用时，有益地影响宿主生物体(即通过赋予宿主生物体一个或多个可证明的健康益处)的活的
微生物(包括例如细菌或酵母)。益生菌可以改善一个或多个粘膜表面的微生物平衡。例如，粘膜表面可以是肠、泌尿道、呼吸道或皮肤。如本文所用的，术语“益生菌”还涵盖可以刺激免疫系统的有益分支并同时减少在粘膜表面(例如肠)中的炎症反应的活的微生物。虽然没
有益生菌摄入的下限或上限，但是已经表明，至少106-1012，优选至少106-1010，优选108-
109cfu作为日剂量将在受试者中有效地实现有益的健康效果。
微生物(包括例如细菌或酵母)。益生菌可以改善一个或多个粘膜表面的微生物平衡。例如，粘膜表面可以是肠、泌尿道、呼吸道或皮肤。如本文所用的，术语“益生菌”还涵盖可以刺激免疫系统的有益分支并同时减少在粘膜表面(例如肠)中的炎症反应的活的微生物。虽然没
有益生菌摄入的下限或上限，但是已经表明，至少106-1012，优选至少106-1010，优选108-
109cfu作为日剂量将在受试者中有效地实现有益的健康效果。
[0117] 如本文所用的，术语“CFU”意指“菌落形成单位”并且是代表衍生自单个祖细胞的细胞聚集的菌落中的活细胞的测量。
[0118] 术语“分离的”意指处于在自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离物质的非限制性实例包括(1)任何非天然发生的物质，(2)任何物质，包括但不限于，任何宿主细胞、酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子，其至少部分地从与其天然相关的天然发生的成分中的一种或多种或全部中去除；(3)任何经人手修饰的物质(相对于自然界中发现的物质)；或(4)相对于与其天然相关联的其他成分，通过增加物质的量进行修饰的任何物质。术语“分离的核酸分子”、“分离的多核苷酸”、和“分离的核酸片段”将可互换地使用并是指单链或双链的RNA或DNA的聚合物，任选地含有合成的、非-天然的或改变的核苷酸碱基。呈DNA聚合物形式的分离的核酸分子可由cDNA、基因组DNA或合成的DNA的一个或多个区段构成。
[0119] 术语“经纯化的”如应用于核酸或多肽时通常表示基本上不含其他组分的核酸或多肽，如通过本领域熟知的分析技术确定的(例如，纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱液和/或经历密度梯度离心的介质中形成离散的带)。例如，在电泳凝胶中产生基本
上一条带的核酸或多肽是“经纯化的”。经纯化的核酸或多肽是至少约50％纯的，通常是至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约
94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更加纯的(例如，在摩尔基础上按重量计的百分比)。在相关意义上，当在应用纯化或富集技术之后存在分子的浓度的大幅度增加时，对于所述分子而言组合物被富集了。术语“富集”是指化合物、多肽、细胞、核酸、氨基酸或其他特定材料或组分以高于起始组合物的相对或绝对浓度存在于组合物中。
上一条带的核酸或多肽是“经纯化的”。经纯化的核酸或多肽是至少约50％纯的，通常是至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约
94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更加纯的(例如，在摩尔基础上按重量计的百分比)。在相关意义上，当在应用纯化或富集技术之后存在分子的浓度的大幅度增加时，对于所述分子而言组合物被富集了。术语“富集”是指化合物、多肽、细胞、核酸、氨基酸或其他特定材料或组分以高于起始组合物的相对或绝对浓度存在于组合物中。
[0120] 如本文所用的，术语“功能测定”是指提供蛋白质活性指示的测定法。在一些实施例中，该术语是指其中针对以其通常的能力发挥功能的能力来分析蛋白质的测定系统。例如，在蛋白酶的情况下，功能测定涉及确定蛋白酶水解蛋白质底物的有效性。
[0121] 术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换地使用，并且是指通过肽键连接在一起的氨基酸的聚合物。“蛋白质”或“多肽”包含氨基酸残基的聚合序列。贯穿本公开使用了遵照IUPAC-IUB生物化学术语联合委员会(Joint Commission on Biochemical Nomenclature，JCBN)定义的氨基酸的单字母和3字母代码。单字母X是指二十个氨基酸中的任一个。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由多于一种核苷酸序列编码。突变可以由亲本氨基酸的单个字母代码命名，随后是位置编号，然后是变体氨基酸的单个字母
代码。例如，将在位置87处的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)表示为“G087S”或“G87S”。当描述修饰时，位置后面在括号中列出的氨基酸指示由任何列出的氨基酸在所述位置处的取代清
单。例如，6(L,I)意指位置6可以被亮氨酸或异亮氨酸取代。有时，在序列中，将斜线(/)用于定义取代，例如，F/V指示特定位置，在所述位置处可以具有苯丙氨酸或缬氨酸。
代码。例如，将在位置87处的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)表示为“G087S”或“G87S”。当描述修饰时，位置后面在括号中列出的氨基酸指示由任何列出的氨基酸在所述位置处的取代清
单。例如，6(L,I)意指位置6可以被亮氨酸或异亮氨酸取代。有时，在序列中，将斜线(/)用于定义取代，例如，F/V指示特定位置，在所述位置处可以具有苯丙氨酸或缬氨酸。
[0122] “前导序列”或“前导肽序列”是指在信号肽序列与成熟蛋白酶序列之间的、蛋白酶的正确折叠和分泌所必需的氨基酸序列；它们有时被称为分子内伴侣。前导序列或前导肽序列的切割产生成熟的活性蛋白酶。蛋白酶通常表达为前酶。
[0123] 术语“信号序列”和“信号肽”是指可以参与蛋白质的成熟或前体形式的分泌或定向转运的氨基酸残基序列。通常，信号序列位于前体或成熟蛋白序列的N-末端。信号序列可以是内源的或外源的。成熟蛋白中一般不存在信号序列。通常，在蛋白质转运后，信号序列通过信号肽酶从蛋白质切割。
[0124] 术语“成熟”形式的蛋白质、多肽或肽是指没有信号肽序列和前肽序列的蛋白质、多肽或酶的功能形式。
[0125] 术语“前体”形式的蛋白质或肽是指具有有效地连接到所述蛋白质的氨基或羧基末端的前导序列的成熟形式的蛋白质。前体还可以具有有效地连接到前导序列的氨基末端
的“信号”序列。前体还可以具有涉及翻译后活性的另外的多肽(例如，从其切割以留下成熟形式的蛋白质或肽的多肽)。
的“信号”序列。前体还可以具有涉及翻译后活性的另外的多肽(例如，从其切割以留下成熟形式的蛋白质或肽的多肽)。
[0126] 关于氨基酸序列或核酸序列，术语“野生型”指示氨基酸序列或核酸序列是天然的或天然存在的序列。如本文所用的，术语“天然存在的”是指在自然界中发现的任何物质(例如蛋白质、氨基酸或核酸序列)。相反，术语“非天然存在”是指在自然界中没有发现的任何物质(例如，在实验室中生产的重组核酸和蛋白质序列、或野生型序列的修饰)。
[0127] 如本文所用的，关于氨基酸残基位置，“对应于”(corresponding to或corresponds to)或“对应”是指在蛋白质或肽中所列举位置处的氨基酸残基，或类似于、同源于或等同于蛋白质或肽中所列举残基的氨基酸残基。如本文所用的，“对应区”通常是指相关蛋白质或参比蛋白质中的类似位置。
[0128] 术语“衍生自”和“获得自”不仅是指由所讨论的生物体的菌株生产或可以由其生产的蛋白质，而且是指由从此类菌株分离的DNA序列编码并且在含有此类DNA序列的宿主生物体中生产的蛋白质。另外，所述术语是指由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码并且具
有所讨论的蛋白质的鉴定特征的蛋白质。
有所讨论的蛋白质的鉴定特征的蛋白质。
[0129] 术语“氨基酸”是指蛋白质或多肽的基本化学结构单元。本文用于鉴定特定氨基酸的缩写可以使用本领域已知的三字母或单字母代码，并且另外，Xaa或X可用于指示任何氨基酸。
[0130] 本领域技术人员将认识到，在保留与公开的氨基酸序列相关的功能的同时，可以对本文公开的氨基酸序列进行修改。例如，基因的改变导致给定位点处产生化学上等价的
氨基酸但不影响所编码蛋白质的功能特性是常见的，这是本领域所熟知的。例如，本文公开的氨基酸序列中的任何特定氨基酸都可以替代另一种功能上等价的氨基酸。出于本公开的
目的，取代被定义为以下五组中的一组中的交换：
氨基酸但不影响所编码蛋白质的功能特性是常见的，这是本领域所熟知的。例如，本文公开的氨基酸序列中的任何特定氨基酸都可以替代另一种功能上等价的氨基酸。出于本公开的
目的，取代被定义为以下五组中的一组中的交换：
[0131] 1.小的脂肪族、非极性或轻微极性残基：Ala、Ser、Thr(Pro、Gly)；
[0132] 2.极性、带负电荷的残基及其酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；
[0133] 3.极性、带正电荷的残基：His、Arg、Lys；
[0134] 4.大的脂肪族、非极性残基：Met、Leu、Ile、Val(Cys)；以及
[0135] 5.大的芳香族残基：Phe、Tyr、和Trp。
[0136] 因此，氨基酸丙氨酸(疏水性氨基酸)的密码子可以被编码另一个疏水性较弱的残基(如甘氨酸)或疏水性较强的残基(如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基取代另一个带负电荷的残基(如，热稳定丝氨酸取代谷氨酸)或者
一个带正电荷的残基取代另一个带正电荷的残基(如，赖氨酸取代精氨酸)的改变也可以预
期产生功能上等效的产物。在许多情况下，导致蛋白分子的N-末端和C-末端部分改变的核
苷酸变化也将预计不会改变所述蛋白的活性。所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常
规技术内，如确定所编码的产物的生物活性的保留情况。
一个带正电荷的残基取代另一个带正电荷的残基(如，赖氨酸取代精氨酸)的改变也可以预
期产生功能上等效的产物。在许多情况下，导致蛋白分子的N-末端和C-末端部分改变的核
苷酸变化也将预计不会改变所述蛋白的活性。所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常
规技术内，如确定所编码的产物的生物活性的保留情况。
[0137] 术语“密码子优化的”，如它是指用于转化各种宿主的核酸分子的基因或编码区，是指核酸分子的基因或编码区中密码子的改变，以反映宿主生物体的典型密码子使用，而不改变DNA编码的多肽。
[0138] 术语“基因”是指表达特定蛋白质的核酸分子，包括所述编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’非编码序列)的调控序列。“天然基因”是指自然界中发现的具有其自身调控序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，其包含不是在自然界中一起被发现的调节和编码序列。因此，嵌合基因可以包含衍生自不同来源的调控序列和编码序列，或者包含衍生自同一来源但以不同于天然发生的方式排列的调控序列和编码序列。“内源基因”是指位于生物体基因组的天然位置中的天然基因。“外来”基因是指通常不在宿主生物体中被发现，但通过基因转移引入宿主生物体中的基因。外来基因可以包含插入非天然
生物体中的天然基因或嵌合基因。“转基因”是通过转化程序引入基因组中的一种基因。
生物体中的天然基因或嵌合基因。“转基因”是通过转化程序引入基因组中的一种基因。
[0139] 术语“编码序列”是指编码特异性氨基酸序列的核苷酸序列。“合适的调控序列”是指位于编码序列的上游(5’非编码序列)、内部或下游(3’非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或者翻译的核苷酸序列。调控序列可以包括启动子、翻译前导序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。
[0140] 术语“有效地连接”是指核酸序列在单个核酸分子上的缔合，使得一个核酸片段的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，所述编码序列在启动子的转录控制下)时，启动子与所述编码序列有效地连接。编码序列可以在正义或反义方向上有效地连接到调控序列上。
[0141] 术语“调控序列”或“控制序列”在本文中可互换地使用，并且是指能够增加或减少生物体内特定基因表达的核苷酸序列区段。调控序列的实例包括但不限于启动子、信号序列、操纵子等。如上所述，调控序列可以以正义或反义方向有效地连接到目的编码序列/基因。
[0142] “启动子”或“启动子序列”是指定义在何处RNA聚合酶开始基因转录的DNA序列。启动子序列通常直接位于转录起始位点的上游或5’末端。启动子可以全部衍生自天然或天然发生的序列，或者由衍生自在自然界发现的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA区段。本领域技术人员应当理解，不同的启动子可能指导基因在不同组织或细胞类型中、或在不同发育阶段、或者响应于不同环境或生理条件的表达(“诱导型启动子”)。
[0143] 所述“3’非编码序列”是指位于编码序列下游的DNA序列，并包括编码能够影响mRNA加工或基因表达(如转录终止)的调控信号的序列。
[0144] 如本文所用的，术语“转化”是指将核酸分子转移或引入到宿主生物体中。所述核酸分子可以作为线性或环状形式的DNA引入。所述核酸分子可以是自主复制的质粒，或者它可以整合进生产宿主的基因组中。含有转化的核酸的生产宿主被称为“转化的”或“重组的”或“转基因的”生物体或“转化体”。
[0145] 如本文所用的，术语“重组”是指例如通过化学合成或者通过经基因工程技术操纵分离的核酸区段来将两个原本分离的核酸序列区段进行人工组合。例如，其中一个或多个区段或基因已经被插入的DNA，其自然地或通过实验室操作，从不同的分子、同一分子的另一部分或人工序列插入，导致在基因中引入新的序列并随后在生物体中引入。术语“重组”、“转基因”、“转化”、“工程化”或“外源基因表达修饰”在本文中可互换地使用。
[0146] 术语“重组构建体”、“表达构建体”、“重组表达构建体”和“表达盒”在本文中可互换地使用。重组构建体包含核酸片段，例如在自然界中未全部一起发现的调控序列和编码序列的人工组合。例如，构建体可以包含衍生自不同来源的调控序列和编码序列，或者包含衍生自相同来源但以不同于天然发生的方式排列的调控序列和编码序列。这样一个构建体
可以单独使用或可以与载体结合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于如本领域技术
人员熟知的将用于转化宿主细胞的方法。例如，可以使用质粒载体。技术人员充分了解必须存在于载体上以便成功转化，选择和繁殖宿主细胞的遗传元件。技术人员还将认识到，不同的独立转化事件可以导致不同水平和模式的表达(Jones等人,(1985)EMBO J[欧洲分子生
物学学会杂志]4:2411-2418；De Almeida等人,(1989)Mol Gen Genetics[分子和普通遗传
学]218:78-86)，并且因此通常筛选多个事件，从而获得显示所需表达水平和模式的品系。
此类筛选可以是完成的标准分子生物学测定、生物化学测定以及其他测定，这些测定包括
DNA的印迹分析、mRNA表达的Northern分析、PCR、实时定量PCR(qPCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、蛋白表达的免疫印迹分析、酶测定或活性测定、和/或表型分析。
可以单独使用或可以与载体结合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于如本领域技术
人员熟知的将用于转化宿主细胞的方法。例如，可以使用质粒载体。技术人员充分了解必须存在于载体上以便成功转化，选择和繁殖宿主细胞的遗传元件。技术人员还将认识到，不同的独立转化事件可以导致不同水平和模式的表达(Jones等人,(1985)EMBO J[欧洲分子生
物学学会杂志]4:2411-2418；De Almeida等人,(1989)Mol Gen Genetics[分子和普通遗传
学]218:78-86)，并且因此通常筛选多个事件，从而获得显示所需表达水平和模式的品系。
此类筛选可以是完成的标准分子生物学测定、生物化学测定以及其他测定，这些测定包括
DNA的印迹分析、mRNA表达的Northern分析、PCR、实时定量PCR(qPCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、蛋白表达的免疫印迹分析、酶测定或活性测定、和/或表型分析。
[0147] 术语“生产宿主”、“宿主”和“宿主细胞”在本文中可互换地使用，并且指任何生物体或其细胞，无论是人类还是非人类，其中重组构建体可以稳定或瞬时引入以表达基因。所述术语涵盖了亲本细胞的任何后代，由于在繁殖期间发生的突变，其与亲本细胞不同。
[0148] 术语“百分比同一性”是如通过比较这些序列所确定的两个或更多个多肽序列或者两个或更多个多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，“同一性”也意指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，视情况而定，如通过此类序列的串之间的匹配核苷酸或氨基
酸的数目所确定的。可通过已知方法容易地计算“同一性”和“相似性”，所述方法包括但不限于以下文献中所述的那些：Computational Molecular Biology[计算分子生物学]
(Lesk,A.M.编辑),牛津大学出版社[Oxford University Press],纽约州(1988)；
Biocomputing:Informatics and Genome Projects[生物计算：信息学和基因组工程]
(Smith,D.W.编辑),Academic Press[学术出版社],纽约州(1993)；Computer Analysis of Sequence Data,Part I[序列数据的计算机分析，第一部分](Griffin,A.M.和Griffin,
H.G.编辑)，Humana Press[胡玛纳出版社],新泽西州(1994)；Sequence Analysis in
Molecular Biology[分子生物学中的序列分析](von Heinje,G.编辑),Academic Press
[学术出版社](1987)；和Sequence Analysis Primer[引物序列分析](Gribskov,M.和
Devereux,J.编辑),Stockton Press[斯托克顿出版社],纽约州(1991)。确定同一性和相似
性的方法被编入公开可用的计算机程序中。
酸的数目所确定的。可通过已知方法容易地计算“同一性”和“相似性”，所述方法包括但不限于以下文献中所述的那些：Computational Molecular Biology[计算分子生物学]
(Lesk,A.M.编辑),牛津大学出版社[Oxford University Press],纽约州(1988)；
Biocomputing:Informatics and Genome Projects[生物计算：信息学和基因组工程]
(Smith,D.W.编辑),Academic Press[学术出版社],纽约州(1993)；Computer Analysis of Sequence Data,Part I[序列数据的计算机分析，第一部分](Griffin,A.M.和Griffin,
H.G.编辑)，Humana Press[胡玛纳出版社],新泽西州(1994)；Sequence Analysis in
Molecular Biology[分子生物学中的序列分析](von Heinje,G.编辑),Academic Press
[学术出版社](1987)；和Sequence Analysis Primer[引物序列分析](Gribskov,M.和
Devereux,J.编辑),Stockton Press[斯托克顿出版社],纽约州(1991)。确定同一性和相似
性的方法被编入公开可用的计算机程序中。
[0149] 如本文所用的，“％同一性”或“百分比同一性”或“PID”是指蛋白质序列同一性。百分比同一性可以使用本领域已知的标准技术来确定。有用的算法包括BLAST算法(参见，Altschul等人,J Mol Biol[分子生物学杂志],215:403-410,1990；以及Karlin和
Altschul，Proc Natl Acad Sci USA[美国科学院院报],90:5873-5787,1993)。BLAST程序
使用若干个搜索参数，其中大部分设置为默认值。NCBI BLAST算法按照生物相似性找到最
相关的序列，但是不推荐用于少于20个残基的查询序列(Altschul等人,Nucleic Acids
Res[核酸研究],25:3389-3402,1997和Schaffer等人,Nucleic Acids Res[核酸研究],29:
2994-3005,2001)。核酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：相邻字长阈值＝11；E值截止值＝10；打分矩阵(Scoring Matrix)＝NUC.3.1(匹配＝1，错配＝-3)；空位开放(Gap
Opening)＝5；以及空位延伸＝2。氨基酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：字长大小＝3；E值截止值＝10；评分矩阵＝BLOSUM62；空位开放＝11；以及空位延伸＝1。百分比(％)氨基酸序列同一性值由匹配相同残基的数值除以“参比”序列的残基总数(包括由程序为最佳/最大比对创建的任何空位)来确定。BLAST算法将“参比”序列称为“查询”序列。
Altschul，Proc Natl Acad Sci USA[美国科学院院报],90:5873-5787,1993)。BLAST程序
使用若干个搜索参数，其中大部分设置为默认值。NCBI BLAST算法按照生物相似性找到最
相关的序列，但是不推荐用于少于20个残基的查询序列(Altschul等人,Nucleic Acids
Res[核酸研究],25:3389-3402,1997和Schaffer等人,Nucleic Acids Res[核酸研究],29:
2994-3005,2001)。核酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：相邻字长阈值＝11；E值截止值＝10；打分矩阵(Scoring Matrix)＝NUC.3.1(匹配＝1，错配＝-3)；空位开放(Gap
Opening)＝5；以及空位延伸＝2。氨基酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：字长大小＝3；E值截止值＝10；评分矩阵＝BLOSUM62；空位开放＝11；以及空位延伸＝1。百分比(％)氨基酸序列同一性值由匹配相同残基的数值除以“参比”序列的残基总数(包括由程序为最佳/最大比对创建的任何空位)来确定。BLAST算法将“参比”序列称为“查询”序列。
[0150] 如本文所用的，“同源蛋白质”或“同源蛋白酶”是指在一级、二级和/或三级结构中具有不同相似性的蛋白质。当比对蛋白质时，蛋白质同源性可以是指线性氨基酸序列的相似性。蛋白质序列的同源搜索可以使用来自NCBI BLAST的BLASTP和PSI-BLAST使用阈值(E
值截止值)0.001进行。(Altschul SF,Madde TL,Shaffer AA,Zhang J,Zhang Z,Miller W,
Lipman DJ.Gapped BLAST and PSI BLAST a new generation of protein database
search programs[空位BLAST和PSI BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序],Nucleic
Acids Res[核酸研究]1997年第1组；25(17):3389-402)。使用该信息，可以将蛋白质序列分组。可以使用氨基酸序列构建系统发育树。
值截止值)0.001进行。(Altschul SF,Madde TL,Shaffer AA,Zhang J,Zhang Z,Miller W,
Lipman DJ.Gapped BLAST and PSI BLAST a new generation of protein database
search programs[空位BLAST和PSI BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序],Nucleic
Acids Res[核酸研究]1997年第1组；25(17):3389-402)。使用该信息，可以将蛋白质序列分组。可以使用氨基酸序列构建系统发育树。
[0151] 可以使用LASERGENE生物信息计算包的Megalign程序(DNASTAR公司，麦迪逊，威斯康星州)、Vector NTI v.7.0的AlignX程序(Informax公司，贝塞斯达，马里兰州)或EMBOSS开放软件包(EMBL-EBI；Rice等人,Trends in Genetics[遗传学趋势]16,(6):276-277
(2000))进行序列比对和百分比同一性计算。可以使用具有默认参数的CLUSTAL比对方法
(例如CLUSTALW；例如版本1.83)(Higgins和Sharp,CABIOS,5:151-153(1989)；Higgins等
人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680(1994)；和Chenna等人,Nucleic Acids
Res[核酸研究]31(13):3497-500(2003))(其可通过欧洲生物信息学研究所从欧洲分子生
物学实验室获得)来执行序列的多重比对。用于CLUSTALW蛋白比对的合适参数包括空位存
在罚分＝15、空位延伸＝0.2、矩阵＝Gonnet(例如，Gonnet250)、蛋白结束空位(ENDGAP)＝-
1、蛋白空位距离(GAPDIST)＝4和KTUPLE＝1。在一个实施例中，在慢比对情况下，使用快或慢比对以及默认设置。可替代地，可以修饰使用CLUSTALW方法(例如版本1.83)的参数以同
样使用KTUPLE＝1、空位罚分＝10、空位延伸＝1、矩阵＝BLOSUM(例如BLOSUM64)、窗口
(WINDOW)＝5和顶部存储的对角线(TOP DIAGONALS SAVED)＝5。使用来自Geneious软件(生
物物质有限公司(Biomatters Ltd.))(Robert C.Edgar,MUSCLE:multiple sequence
alignment with high accuracy and high throughput[MUSCLE：具有高精确度和高通量
的多序列比对],Nucl.Acids Res.[核酸研究](2004)32(5):1792-1797)的MUSCLE程序也可
以进行序列的多重比对。
(2000))进行序列比对和百分比同一性计算。可以使用具有默认参数的CLUSTAL比对方法
(例如CLUSTALW；例如版本1.83)(Higgins和Sharp,CABIOS,5:151-153(1989)；Higgins等
人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680(1994)；和Chenna等人,Nucleic Acids
Res[核酸研究]31(13):3497-500(2003))(其可通过欧洲生物信息学研究所从欧洲分子生
物学实验室获得)来执行序列的多重比对。用于CLUSTALW蛋白比对的合适参数包括空位存
在罚分＝15、空位延伸＝0.2、矩阵＝Gonnet(例如，Gonnet250)、蛋白结束空位(ENDGAP)＝-
1、蛋白空位距离(GAPDIST)＝4和KTUPLE＝1。在一个实施例中，在慢比对情况下，使用快或慢比对以及默认设置。可替代地，可以修饰使用CLUSTALW方法(例如版本1.83)的参数以同
样使用KTUPLE＝1、空位罚分＝10、空位延伸＝1、矩阵＝BLOSUM(例如BLOSUM64)、窗口
(WINDOW)＝5和顶部存储的对角线(TOP DIAGONALS SAVED)＝5。使用来自Geneious软件(生
物物质有限公司(Biomatters Ltd.))(Robert C.Edgar,MUSCLE:multiple sequence
alignment with high accuracy and high throughput[MUSCLE：具有高精确度和高通量
的多序列比对],Nucl.Acids Res.[核酸研究](2004)32(5):1792-1797)的MUSCLE程序也可
以进行序列的多重比对。
[0152] 作为某些方面的特征，本文公开了各种多肽氨基酸序列和多核苷酸序列。在某些实施例中可以使用与本文公开的序列具有至少约70％-85％、85％-90％、或90％-95％同一性的这些序列的变体。可替代地，某些实施例中的变体多肽序列或多核苷酸序列可以与本
文公开的序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、
71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述变体氨基酸序列或多核苷酸序列具有与所公开的序列相同的功能，或具有所公开
的序列的功能的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、或99％。
文公开的序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、
71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述变体氨基酸序列或多核苷酸序列具有与所公开的序列相同的功能，或具有所公开
的序列的功能的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、或99％。
[0153] 关于多肽，术语“变体”是指与指定的野生型、亲本或参比多肽不同的多肽，因为它包括一种或多种天然发生的或人造的氨基酸取代、插入或缺失。类似地，关于多核苷酸，术语“变体”是指在核苷酸序列中与指定的野生型、亲本或参比多核苷酸不同的多核苷酸。野生型、亲本或参比多肽或多核苷酸的身份将从上下文中显而易见。
[0154] 术语“质粒”、“载体”和“盒”意指染色体外元件，其通常携带非细胞中心代谢的一部分的基因，并且通常呈双链DNA的形式。这样的元件可以是衍生自任何来源的、单链或双链DNA或RNA的、处于直链或环状形式的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体、或核苷酸序列，其中许多核苷酸序列已经被连接或重组成能够将目的多核苷酸引入细胞中的独特构造。“转化盒”是指包含基因并具有促进特定宿主细胞转化的基因之外的元件的特定载体。
术语“表达盒”和“表达载体”在本文中可互换地使用，并且是指含有基因并具有允许在宿主中表达所述基因的基因之外的元件的特定载体。
术语“表达盒”和“表达载体”在本文中可互换地使用，并且是指含有基因并具有允许在宿主中表达所述基因的基因之外的元件的特定载体。
[0155] 如本文所用的，术语“表达”是指处于前体抑或成熟形式的功能性终产物(例如，mRNA或蛋白质)的生产。表达也可指将mRNA翻译成多肽。
[0156] 基因的表达涉及所述基因的转录并将mRNA翻译成前体或成熟蛋白。“成熟”蛋白指经翻译后加工的多肽；即已经去除了存在于初级翻译产物中的任何前肽或原肽的多肽。“前体”蛋白质指mRNA的翻译初级产物；即具有仍然存在的前肽和原肽。前肽或原肽可以是但不限于细胞内定位信号。“稳定转化”是指将核酸片段转移至宿主生物体的基因组中，包括细胞核的和细胞器的基因组，导致遗传稳定的遗传。相比之下，“瞬时转化”是指将核酸片段转移至宿主生物体的细胞核中或含有DNA的细胞器中，导致基因表达而无整合或稳定的遗传。含有经转化的核酸片段的宿主生物体被称为“转基因的”生物体。
[0157] 所述表达载体可以是用于转化本领域已知的合适的生产宿主的任何数量的载体或盒中的一种。通常，所述载体或盒将包括指导相关基因的转录和翻译的序列、可选择标
记、和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体通常包括含有转录起始对照的基因
的5’区和控制转录终止的DNA片段的3’区。两个对照区都可以衍生自与转化的生产宿主细胞的基因同源的基因和/或对所述生产宿主来说是天然的基因，尽管这样的控制区不需要
如此衍生。
记、和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体通常包括含有转录起始对照的基因
的5’区和控制转录终止的DNA片段的3’区。两个对照区都可以衍生自与转化的生产宿主细胞的基因同源的基因和/或对所述生产宿主来说是天然的基因，尽管这样的控制区不需要
如此衍生。
[0158] 可以包含在表达载体中的可能的起始控制区或启动子是众多的并且是本领域技术人员熟悉的。实际上任何能够驱动这些基因的启动子都是合适的，包括但不限于CYC1、
HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(用于在酵母属中表达)；AOX1(用于在毕赤酵母属中表达)；以及lac、araB、tet、trp、lPL、lPR、T7、tac、和trc(用于在大肠杆菌中表达)以及用于在芽孢杆菌属中表达的amy、apr、npr启动子和各种噬菌体启动子。在一些实施例中，所述启动子是组成型或诱导型启动子。“组成型启动子”是一种在大多数环境和发育条件下具有活性的启动子。“诱导型”或“阻抑型”启动子是指在环境调节或发育调节下具有活性的启动子。在一些实施例中，启动子是诱导型或阻抑型的，原因是环境因素的变化，这些环境因素包括但不限于碳、氮或其他可利用的营养素、温度、pH值、渗透压、一种或多种重金属的存在、抑制剂的浓度、应力或上述因素的组合，如在本领域中已知的。在一些实施例中，诱导型或阻抑型的启动子是通过代谢因素诱导或抑制的，例如某些碳源的水平、某些能量源的水平、某些分解代谢物的水平、或上述因素的组合，如在本领域中已知的。在一个实施例中，所述启动子是对宿主细胞天然的启动子。例如，当里氏木霉
(Trichoderma reesei)为宿主时，启动子是天然的里氏木霉启动子，例如cbh1启动子，其保藏在GenBank中的登录号D86235下。
HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(用于在酵母属中表达)；AOX1(用于在毕赤酵母属中表达)；以及lac、araB、tet、trp、lPL、lPR、T7、tac、和trc(用于在大肠杆菌中表达)以及用于在芽孢杆菌属中表达的amy、apr、npr启动子和各种噬菌体启动子。在一些实施例中，所述启动子是组成型或诱导型启动子。“组成型启动子”是一种在大多数环境和发育条件下具有活性的启动子。“诱导型”或“阻抑型”启动子是指在环境调节或发育调节下具有活性的启动子。在一些实施例中，启动子是诱导型或阻抑型的，原因是环境因素的变化，这些环境因素包括但不限于碳、氮或其他可利用的营养素、温度、pH值、渗透压、一种或多种重金属的存在、抑制剂的浓度、应力或上述因素的组合，如在本领域中已知的。在一些实施例中，诱导型或阻抑型的启动子是通过代谢因素诱导或抑制的，例如某些碳源的水平、某些能量源的水平、某些分解代谢物的水平、或上述因素的组合，如在本领域中已知的。在一个实施例中，所述启动子是对宿主细胞天然的启动子。例如，当里氏木霉
(Trichoderma reesei)为宿主时，启动子是天然的里氏木霉启动子，例如cbh1启动子，其保藏在GenBank中的登录号D86235下。
[0159] 合适的启动子的非限制性实例包括cbh1、cbh2、egl1、egl2、egl3、egl4、egl5、xyn1、和xyn2，产黄青霉菌(P.chrysogenus)的阻抑型酸性磷酸酶基因(phoA)启动子(参见例如Graessle等人,(1997)Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学],63:753-
756)，葡萄糖阻抑型PCK1启动子(参见例如Leuker等人,(1997),Gene[基因],192:235-
240)，麦芽糖诱导型，葡萄糖阻抑型MET3启动子(参见Liu等人，(2006),Eukary.Cell[真核细胞],5:638-649)，pKi启动子和cpc1启动子。其他有用启动子的实例包括来自泡盛曲霉
(A.awamori)和黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶基因的启动子(参见Nunberg等人,(1984)
Mol.Cell Biol.[分子与细胞生物学]15 4:2306-2315和Boel等人,(1984)EMBO J.[欧洲分
子生物学学会杂志]3:1581-1585)。此外，里氏木霉xln1基因的启动子可能是有用的(参见
例如EPA 137280Al)。
756)，葡萄糖阻抑型PCK1启动子(参见例如Leuker等人,(1997),Gene[基因],192:235-
240)，麦芽糖诱导型，葡萄糖阻抑型MET3启动子(参见Liu等人，(2006),Eukary.Cell[真核细胞],5:638-649)，pKi启动子和cpc1启动子。其他有用启动子的实例包括来自泡盛曲霉
(A.awamori)和黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶基因的启动子(参见Nunberg等人,(1984)
Mol.Cell Biol.[分子与细胞生物学]15 4:2306-2315和Boel等人,(1984)EMBO J.[欧洲分
子生物学学会杂志]3:1581-1585)。此外，里氏木霉xln1基因的启动子可能是有用的(参见
例如EPA 137280Al)。
[0160] 控制转录终止的DNA片段也可以衍生自对优选的生产宿主细胞来说是天然的各种基因。在某些实施例中，包括终止控制区是任选的。在某些实施例中，所述表达载体包括衍生自优选的宿主细胞的终止控制区。
[0161] 所述表达载体可以包括在所述生产宿主中，具体是在微生物生产宿主的细胞中。所述生产宿主细胞可以是在真菌或细菌家族中发现的微生物宿主，并且其在大范围的温
度、pH值和溶剂耐受性下生长。例如，预期细菌、藻类和真菌(如丝状真菌和酵母)中的任何一种可以合适地容纳所述表达载体。
度、pH值和溶剂耐受性下生长。例如，预期细菌、藻类和真菌(如丝状真菌和酵母)中的任何一种可以合适地容纳所述表达载体。
[0162] 在所述生产宿主细胞中包括所述表达载体可以用于表达目的蛋白质，使得其可以存在于细胞内、细胞外或细胞内和细胞外的组合中。与用于回收细胞内表达所产生的蛋白
质的方法相比，细胞外表达使从发酵产物中回收所需蛋白质更容易。
质的方法相比，细胞外表达使从发酵产物中回收所需蛋白质更容易。
[0163] 本公开的某些实施例涉及用于生产热稳定丝氨酸蛋白酶的方法，所述方法包括：
[0164] (a)用编码热稳定丝氨酸蛋白酶的重组构建体转化生产宿主，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；以及[0165] (b)在37.5℃以上的温度下培养步骤(a)的生产宿主，以提高所述热稳定丝氨酸蛋
白酶的表达水平。
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；以及[0165] (b)在37.5℃以上的温度下培养步骤(a)的生产宿主，以提高所述热稳定丝氨酸蛋
白酶的表达水平。
[0166] 在另一个方面，可以任选地从生产宿主回收热稳定丝氨酸蛋白酶。
[0167] 在仍另一个方面，通过本文所述的任何方法可以获得含有热稳定丝氨酸蛋白酶的培养上清液。
[0168] 表达将被理解为包括产生热稳定丝氨酸蛋白酶所涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
[0169] 利用克隆方法对核酸序列进行修饰的技术是本领域中众所周知的。
[0170] 编码热稳定丝氨酸蛋白酶的多核苷酸可以以多种方式操作，以提供多核苷酸在芽孢杆菌属宿主细胞中的表达。在插入核酸构建体或载体之前对多核苷酸序列的操作可能是
希望的或必需的，这取决于核酸构建体或载体或芽孢杆菌属宿主细胞。利用克隆方法修饰
核苷酸序列的技术是本领域熟知的。
希望的或必需的，这取决于核酸构建体或载体或芽孢杆菌属宿主细胞。利用克隆方法修饰
核苷酸序列的技术是本领域熟知的。
[0171] 上文定义了调控序列。它们包括表达热稳定丝氨酸蛋白酶所必需或有利的所有成分。每种控制序列对于编码热稳定丝氨酸蛋白酶的核酸序列或可以是天然的或外来的。这
种调控序列包括但不限于前导区、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。可以提供带接头的调控序列以引入的特定的限制性位点便于调控序列与编码热稳定
丝氨酸蛋白酶的核苷酸序列的编码区连接。
种调控序列包括但不限于前导区、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。可以提供带接头的调控序列以引入的特定的限制性位点便于调控序列与编码热稳定
丝氨酸蛋白酶的核苷酸序列的编码区连接。
[0172] 包含编码热稳定丝氨酸蛋白酶的多核苷酸的核酸构建体可以与一种或多种控制序列有效地连接，所述控制序列能够在与控制序列相容的条件下指导编码序列在芽孢杆菌
属宿主细胞中的表达。
属宿主细胞中的表达。
[0173] 每种控制序列对于编码热稳定丝氨酸蛋白酶的多核酸或可以是天然的或外来的。这种控制序列包括但不限于前导区、启动子、信号序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。可以提供带接头的控制序列以引入的特异性限制性位
点，以利于将控制序列与编码热稳定丝氨酸蛋白酶的多核苷酸的编码区连接。
点，以利于将控制序列与编码热稳定丝氨酸蛋白酶的多核苷酸的编码区连接。
[0174] 控制序列可以是适当的启动子区，即芽孢杆菌属宿主细胞识别的核苷酸序列，用于表达编码热稳定丝氨酸蛋白酶的多核苷酸。启动子区含有介导热稳定丝氨酸蛋白酶表达
的转录控制序列。启动子区可以是在所选择的芽孢杆菌属宿主细胞中显示转录活性的任何
核苷酸序列，并且可以从指导合成具有生物活性的胞外或胞内多肽的、与芽孢杆菌属宿主
细胞同源或异源的基因获得。
的转录控制序列。启动子区可以是在所选择的芽孢杆菌属宿主细胞中显示转录活性的任何
核苷酸序列，并且可以从指导合成具有生物活性的胞外或胞内多肽的、与芽孢杆菌属宿主
细胞同源或异源的基因获得。
[0175] 启动子区可包含单个启动子或启动子的组合。当启动子区包含启动子的组合时，启动子优选地串联。启动子区的启动子可以是任何启动子，所述启动子可以引发编码在目
的芽孢杆菌属宿主细胞中具有生物活性的多肽的多核苷酸的转录。启动子相对于编码具有
生物活性的多肽的核苷酸序列可以是天然的、外源的或其组合。这种启动子可以从指导合
成具有生物活性的胞外或胞内多肽的、与芽孢杆菌属宿主细胞同源或异源的基因中获得。
的芽孢杆菌属宿主细胞中具有生物活性的多肽的多核苷酸的转录。启动子相对于编码具有
生物活性的多肽的核苷酸序列可以是天然的、外源的或其组合。这种启动子可以从指导合
成具有生物活性的胞外或胞内多肽的、与芽孢杆菌属宿主细胞同源或异源的基因中获得。
[0176] 因此，在某些实施例中，启动子区包含从细菌来源获得的启动子。在其他实施例中，启动子区包含从革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌获得的启动子。革兰氏阳性细菌包
括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属
(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属
(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、土芽孢杆菌属
(Geobacillus)和大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)。革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠
杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属
(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属
(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)和脲原体属
(Ureaplasma)。
括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属
(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属
(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、土芽孢杆菌属
(Geobacillus)和大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)。革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠
杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属
(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属
(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)和脲原体属
(Ureaplasma)。
[0177] 启动子区可包含从芽孢杆菌属菌株(例如，粘琼脂芽孢杆菌(Bacillus agaradherens)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus
amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus
circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌
(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus
stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus
thuringiensis))获得的启动子；或从链霉菌属(Streptomyces)菌株(例如，变铅青链霉菌
(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus))获得的启动子。
amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus
circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌
(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus
stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus
thuringiensis))获得的启动子；或从链霉菌属(Streptomyces)菌株(例如，变铅青链霉菌
(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus))获得的启动子。
[0178] 用于在本公开的方法中指导编码具有生物活性的多肽的多核苷酸转录的合适启动子的实例是从以下获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces
coelicolor)琼脂酶基因(dagA)、迟缓芽孢杆菌或克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprH)、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(枯草杆菌蛋白酶(subtilisin Carlsberg)基因)、枯草芽孢
杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyE)、地衣芽孢杆菌
(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌拟步行甲亚种CryIIIA基因(cryIIIA)或其部分、
原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Proceedings of the National
Academy of Sciences USA[美国科学院院报]75:3727-3731)、和巨大芽孢杆菌xylA基因
(Rygus和Hillen,1992,J.Bacteriol.[细菌学杂志]174:3049-3055；Kim等人,1996,Gene
[基因]181:71-76)。其他实例是spo1细菌噬菌体启动子和tac启动子的启动子(DeBoer等
人,1983,Proceedings of the National Academy of Sciences USA[美国科学院院报]
80:21-25)。另外的启动子描述于在Scientific American[科学美国人]中的“Useful
proteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”,1980,242:74-94；
和Sambrook、Fritsch和Maniatis,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual[分子
克隆实验室手册],第2版,冷泉港,纽约。
coelicolor)琼脂酶基因(dagA)、迟缓芽孢杆菌或克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprH)、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(枯草杆菌蛋白酶(subtilisin Carlsberg)基因)、枯草芽孢
杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyE)、地衣芽孢杆菌
(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌拟步行甲亚种CryIIIA基因(cryIIIA)或其部分、
原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Proceedings of the National
Academy of Sciences USA[美国科学院院报]75:3727-3731)、和巨大芽孢杆菌xylA基因
(Rygus和Hillen,1992,J.Bacteriol.[细菌学杂志]174:3049-3055；Kim等人,1996,Gene
[基因]181:71-76)。其他实例是spo1细菌噬菌体启动子和tac启动子的启动子(DeBoer等
人,1983,Proceedings of the National Academy of Sciences USA[美国科学院院报]
80:21-25)。另外的启动子描述于在Scientific American[科学美国人]中的“Useful
proteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”,1980,242:74-94；
和Sambrook、Fritsch和Maniatis,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual[分子
克隆实验室手册],第2版,冷泉港,纽约。
[0179] 启动子区可以包含是“共有”启动子的启动子，所述启动子具有针对“-35”区的序列TTGACA和针对“-10”区的TATAAT。共有启动子可以从任何可以在芽孢杆菌宿主细胞中起作用的启动子获得。“共有”启动子的构建可以通过使用本领域熟知的方法进行定点诱变来完成，以产生更完美地符合所建立的共有序列的启动子，所述共有序列是针对枯草芽孢杆菌的营养“σA型”启动子的“-10”和“-35”区(Voskuil等人,1995,Molecular Microbiology[分子微生物学]17:271-279)。
[0180] 控制序列也可以是合适的转录终止子序列，如芽孢杆菌宿主细胞识别的终止转录的序列。终止子序列与编码热稳定丝氨酸蛋白酶的核苷酸序列的3’末端有效地连接。可以使用任何在芽孢杆菌宿主细胞中起作用的终止子。
[0181] 控制序列也可以是合适的前导序列，即对芽孢杆菌宿主细胞的翻译重要的mRNA的非翻译区。前导序列与核苷酸序列的5’末端有效地连接，指导具有生物活性的多肽的合成。
在所选择的芽孢杆菌宿主细胞中起作用的任何前导序列均可用于本发明。
在所选择的芽孢杆菌宿主细胞中起作用的任何前导序列均可用于本发明。
[0182] 控制序列也可以是mRNA稳定序列。术语“mRNA稳定序列”在本文中定义为位于启动子区下游和编码热稳定丝氨酸蛋白酶的多核苷酸编码序列上游的序列，其中启动子区有效地连接，使得可以加工从启动子区合成的所有mRNA以产生在转录物的5’末端具有稳定序列的mRNA转录物。例如，在mRNA转录物的5’末端存在这种稳定序列会增加它们的半衰期
(Agaisse和Lereclus,1994,同上,Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]
177:3465-3471)。mRNA加工/稳定序列与细菌16S核糖体RNA的3’端互补。在某些实施例中，mRNA加工/稳定序列产生基本上单一大小的转录物，在转录物的5’末端具有稳定序列。mRNA加工/稳定序列优选地与细菌16S核糖体RNA的3’端互补。参见，美国专利号6,255,076和美国专利号5,955,310。
(Agaisse和Lereclus,1994,同上,Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]
177:3465-3471)。mRNA加工/稳定序列与细菌16S核糖体RNA的3’端互补。在某些实施例中，mRNA加工/稳定序列产生基本上单一大小的转录物，在转录物的5’末端具有稳定序列。mRNA加工/稳定序列优选地与细菌16S核糖体RNA的3’端互补。参见，美国专利号6,255,076和美国专利号5,955,310。
[0183] 然后可以使用本领域已知的方法或本文所述的那些方法将核酸构建体引入芽孢杆菌宿主细胞中，用于引入和表达热稳定丝氨酸蛋白酶。
[0184] 包含编码目的蛋白质的目的DNA的核酸构建体也可以如上所述类似地构建。
[0185] 为了获得引入的DNA的目的蛋白质的分泌，控制序列还可以包含信号肽编码区，所述信号肽编码区编码与多肽的氨基末端连接的氨基酸序列，所述氨基酸序列可以指导表达
的多肽进入细胞分泌途径。信号肽编码区相对于多肽可以是天然的或可以从外源获得。核
苷酸序列的编码序列的5’末端可以固有地含有信号肽编码区，所述区在翻译阅读框中与编码分泌多肽的编码区的区段天然连接。可替代地，编码序列的5’末端可含有信号肽编码区，所述区对编码分泌多肽的编码序列部分而言是外源的。在编码序列通常不含有信号肽编码
区的情况下，可能需要外源信号肽编码区。可替代地，外源信号肽编码区可简单地取代天然信号肽编码区，以相对于通常与编码序列相关的天然信号肽编码区获得增强的多肽分泌。
信号肽编码区可以从芽孢杆菌属物种的淀粉酶或蛋白酶基因获得。然而，任何能够指导表
达的多肽进入所选择的芽孢杆菌宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区都可用于本发明。
的多肽进入细胞分泌途径。信号肽编码区相对于多肽可以是天然的或可以从外源获得。核
苷酸序列的编码序列的5’末端可以固有地含有信号肽编码区，所述区在翻译阅读框中与编码分泌多肽的编码区的区段天然连接。可替代地，编码序列的5’末端可含有信号肽编码区，所述区对编码分泌多肽的编码序列部分而言是外源的。在编码序列通常不含有信号肽编码
区的情况下，可能需要外源信号肽编码区。可替代地，外源信号肽编码区可简单地取代天然信号肽编码区，以相对于通常与编码序列相关的天然信号肽编码区获得增强的多肽分泌。
信号肽编码区可以从芽孢杆菌属物种的淀粉酶或蛋白酶基因获得。然而，任何能够指导表
达的多肽进入所选择的芽孢杆菌宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区都可用于本发明。
[0186] 用于芽孢杆菌宿主细胞的有效信号肽编码区是从以下获得的信号肽编码区：来自芽孢杆菌NCIB 11837的生麦芽糖淀粉酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶基因、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶基因(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA基因。
[0187] 因此，可以构建包含编码热稳定丝氨酸蛋白酶构建体的多核苷酸构建体，所述丝氨酸蛋白酶构建体包含编码目的多肽(POI)的核酸，使宿主细胞表达目的多肽。由于遗传密码中已知的简并性，编码相同氨基酸序列的不同多核苷酸可以用本领域常规技术进行设计
和制备。例如，可以应用密码子优化来优化具体宿主细胞中的生产。
和制备。例如，可以应用密码子优化来优化具体宿主细胞中的生产。
[0188] 可以将编码目的蛋白质的核酸掺入载体中，其中可以使用熟知的转化技术(例如本文所公开的那些技术)，将所述载体转移至宿主细胞中。
[0189] 载体可以是可以转化到宿主细胞中并在宿主细胞内复制的任何载体。例如，包含编码POI的核酸的载体可以在作为繁殖和扩增载体的手段的细菌宿主细胞中转化并复制。
载体也可以被转化到本公开的芽孢杆菌属表达宿主中，使得编码蛋白质的核酸(例如，ORF)可以被表达为功能性蛋白质。
载体也可以被转化到本公开的芽孢杆菌属表达宿主中，使得编码蛋白质的核酸(例如，ORF)可以被表达为功能性蛋白质。
[0190] 可用常规技术修饰以包含并且表达编码POI的核酸的代表性载体是载体p2JM103BBI。
[0191] 可以将编码热稳定丝氨酸蛋白酶或POI的多核苷酸有效地连接到允许在宿主细胞中转录的合适的启动子上。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序
列，并且可以衍生自编码与宿主细胞同源抑或异源的蛋白质的基因。评估启动子活性/强度的手段对于本领域技术人员是常规的。
列，并且可以衍生自编码与宿主细胞同源抑或异源的蛋白质的基因。评估启动子活性/强度的手段对于本领域技术人员是常规的。
[0192] (尤其是在细菌宿主细胞中)用于指导编码本公开的comS1多肽或POI的多核苷酸序列的转录的适合的启动子的实例包括大肠杆菌的乳糖操纵子的启动子、天蓝色链霉菌琼
脂酶基因dagA或celA启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。
脂酶基因dagA或celA启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。
[0193] 用于指导编码POI的多核苷酸序列的转录的启动子可以是PCT国际公开WO 2001/51643中所阐述的野生型aprE启动子、突变体aprE启动子或共有aprE启动子。在某些其他实施例中，用于指导编码POI的多核苷酸序列的转录的启动子是野生型spoVG启动子、突变体
spoVG启动子或共有spoVG启动子(Frisby和Zuber，1991)。
spoVG启动子或共有spoVG启动子(Frisby和Zuber，1991)。
[0194] 用于指导编码热稳定丝氨酸蛋白酶或POI的多核苷酸序列转录的启动子是核糖体启动子，例如核糖体RNA启动子或核糖体蛋白质启动子。核糖体RNA启动子可以是衍生自枯
草芽孢杆菌的rrn启动子，更具体地，rrn启动子可以是来自枯草芽孢杆菌rrnB、rrnI或rrnE核糖体启动子。在某些实施例中，核糖体RNA启动子是来自PCT国际公开号WO2013/086219中阐述的来自枯草芽孢杆菌的P2rrnI启动子。
草芽孢杆菌的rrn启动子，更具体地，rrn启动子可以是来自枯草芽孢杆菌rrnB、rrnI或rrnE核糖体启动子。在某些实施例中，核糖体RNA启动子是来自PCT国际公开号WO2013/086219中阐述的来自枯草芽孢杆菌的P2rrnI启动子。
[0195] 适合的载体可以进一步包含使得所述载体能够在宿主细胞中复制的核酸序列。此类赋能序列的实例包括质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1、pIJ702等的复制起点。
[0196] 适合的载体还可以包含可选择标记，例如其产物弥补分离的宿主细胞中的缺陷的基因，如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性(例如氨苄青
霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四环素抗性等)的基因。
霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四环素抗性等)的基因。
[0197] 适合的表达载体典型地包括克隆载体的组分，例如像允许载体在选择的宿主生物体中自主复制的元件和用于选择目的一个或多个表型可检测的标记。表达载体典型地还包
含控制核苷酸序列，例如像启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号以及任选地抑制子基因、一个或多个激活子基因序列、或类似序列。
含控制核苷酸序列，例如像启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号以及任选地抑制子基因、一个或多个激活子基因序列、或类似序列。
[0198] 此外，适合的表达载体可以进一步包含编码氨基酸序列的序列，所述氨基酸序列能够将目的蛋白质靶向宿主细胞细胞器(如过氧化物酶体)或靶向具体宿主细胞区室。这样
的靶向序列可以是例如氨基酸序列“SKL”。对于在控制序列的指导下进行表达，将目的蛋白质的核酸序列以适合的方式有效地连接到控制序列，使得表达发生。
的靶向序列可以是例如氨基酸序列“SKL”。对于在控制序列的指导下进行表达，将目的蛋白质的核酸序列以适合的方式有效地连接到控制序列，使得表达发生。
[0199] 如本文所述的用于连接编码目的蛋白质的DNA构建体、启动子、终止子和/或其他元件，并将它们插入到包含复制必需信息的适合载体中的方案是本领域技术人员熟知的。
[0200] 包含多核苷酸构建体或表达载体的分离的细胞有利地用作重组产生POI的宿主细胞。所述细胞可以用编码POI的DNA构建体转化，方便地通过将构建体(按一个或多个拷贝)
整合到宿主染色体中。整合通常被认为是有利的，因为如此引入的DNA序列更可能稳定地维持在细胞中。DNA构建体整合到宿主染色体中可以应用常规方法进行，例如通过同源或异源重组。例如，PCT国际公开号WO 2002/14490描述了芽孢杆菌转化的方法、其转化体及其文
库。可替代地，可以用如上所述的与不同类型的宿主细胞相关的表达载体转化细胞。
整合到宿主染色体中。整合通常被认为是有利的，因为如此引入的DNA序列更可能稳定地维持在细胞中。DNA构建体整合到宿主染色体中可以应用常规方法进行，例如通过同源或异源重组。例如，PCT国际公开号WO 2002/14490描述了芽孢杆菌转化的方法、其转化体及其文
库。可替代地，可以用如上所述的与不同类型的宿主细胞相关的表达载体转化细胞。
[0201] 在其他实施例中，从表达宿主中缺失基因是有利的，其中基因缺陷可以通过表达载体治愈。已知的方法可用于获得具有一个或多个失活基因的细菌宿主细胞。可以通过完
全或部分缺失，通过插入失活或通过使基因对其预期目的不起作用的任何其他方式使得所
述基因被阻止表达功能性蛋白来完成基因灭活。
全或部分缺失，通过插入失活或通过使基因对其预期目的不起作用的任何其他方式使得所
述基因被阻止表达功能性蛋白来完成基因灭活。
[0202] 用于转化细菌和培养细菌的技术是本领域中标准和熟知的。它们可以用于转化本发明的改善宿主以产生目的重组蛋白。将DNA构建体或载体引入宿主细胞中包括如下技术
如：转化；电穿孔；核显微注射；转导；转染，例如脂质介导的转染和DEAE-糊精介导的转染；
用磷酸钙DNA沉淀孵育；用DNA包被的微粒高速轰击；基因枪(gene gun)或生物射弹转化和
原生质体融合等。Brigidi等人还公开了细菌的转化和表达方法(1990)。Ferrari等人(美国专利号5,264,366)描述了用于蛋白酶缺失的芽孢杆菌菌株的一般转化和表达方案。
如：转化；电穿孔；核显微注射；转导；转染，例如脂质介导的转染和DEAE-糊精介导的转染；
用磷酸钙DNA沉淀孵育；用DNA包被的微粒高速轰击；基因枪(gene gun)或生物射弹转化和
原生质体融合等。Brigidi等人还公开了细菌的转化和表达方法(1990)。Ferrari等人(美国专利号5,264,366)描述了用于蛋白酶缺失的芽孢杆菌菌株的一般转化和表达方案。
[0203] 将核酸转化为丝状真菌(如曲霉属物种(Aspergillus spp.)，例如米曲霉(A.oryzae)或黑曲霉(A.niger)、灰腐质酶(H.grisea)、特异腐质霉(H.insolens)和里氏木霉(T.reesei.))的方法是本领域熟知的。用于转化曲霉属宿主细胞的合适的程序描述于例
如EP238023中。用于转化木霉属宿主细胞的合适的程序描述于例如Steiger等人,2011,
Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]77:114-121。
如EP238023中。用于转化木霉属宿主细胞的合适的程序描述于例如Steiger等人,2011,
Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]77:114-121。
[0204] 生产宿主的选择可以是任何合适的微生物，如细菌、真菌和藻类。
[0205] 典型地，选择将取决于编码热稳定丝氨酸蛋白酶的基因及其来源而变化。
[0206] 将DNA构建体或载体引入宿主细胞中包括技术例如转化；电穿孔；核显微注射；转导；转染，(例如脂质转染介导的和DEAE-右旋糖酐介导的转染)；与磷酸钙DNA沉淀一起孵
育；用DNA包被的微粒高速轰击；和原生质体融合。公开了可以使用的一般方法的基本文献包括Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]
(第2版，1989)；Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual[基因转移和表达：实验室手册](1990)；以及Ausubel等人编辑,Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学现代方法](1994))。本发明的转化的方法可以导致转化载体的全部或
一部分稳定整合到宿主细胞(例如丝状真菌宿主细胞)的基因组中。然而，还考虑了导致维
持自主复制的染色体外转化载体的转化。
育；用DNA包被的微粒高速轰击；和原生质体融合。公开了可以使用的一般方法的基本文献包括Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]
(第2版，1989)；Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual[基因转移和表达：实验室手册](1990)；以及Ausubel等人编辑,Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学现代方法](1994))。本发明的转化的方法可以导致转化载体的全部或
一部分稳定整合到宿主细胞(例如丝状真菌宿主细胞)的基因组中。然而，还考虑了导致维
持自主复制的染色体外转化载体的转化。
[0207] 许多标准转染方法可以用于产生表达大量蛋白酶的细菌和丝状真菌(例如曲霉或木霉)细胞系。用于将DNA构建体引入产生纤维素酶的木霉(Trichoderma)菌株的一些公开
方法包括：Lorito、Hayes、DiPietro和Harman,(1993)Curr.Genet.[现代遗传学]24:349-
356；Goldman、VanMontagu和Herrera-Estrella，(1990)Curr.Genet.[现代遗传学]17:169-
174；和Penttila、Nevalainen、Ratto、Salminen和Knowles，(1987)Gene[基因]6:155-164，还参见USP 6.022,725；USP 6,268,328和Nevalainen等人，“The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and
Heterologous Genes[木霉属的分子生物学及其在同源和异源基因表达中的应用]”，在：
Molecular Industrial Mycology[分子工业真菌学],编辑,Leong和Berka,Marcel Dekker
Inc.[马塞尔德克尔公司],纽约州(1992),第129-148页；针对曲霉属，包括Yelton、Hamer和Timberlake，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]81:1470-1474，针对镰刀
菌属，包括Bajar、Podila和Kolattukudy,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院
报]88:8202-8212，针对链霉菌属，包括Hopwood等人,1985,Genetic Manipulation of
Streptomyces:Laboratory Manual[链霉菌属的遗传操作：实验室手册],The John Innes
Foundation[约翰英纳斯基金会],诺维奇，英国和Fernandez-Abalos等人,Microbiol[微生
物学]149:1623-1632(2003)，并且针对芽孢杆菌属，包括Brigidi、DeRossi、Bertarini、Riccardi和Matteuzzi,(1990)FEMS Microbiol.Lett.[FEMS微生物学快报]55:135-138。
方法包括：Lorito、Hayes、DiPietro和Harman,(1993)Curr.Genet.[现代遗传学]24:349-
356；Goldman、VanMontagu和Herrera-Estrella，(1990)Curr.Genet.[现代遗传学]17:169-
174；和Penttila、Nevalainen、Ratto、Salminen和Knowles，(1987)Gene[基因]6:155-164，还参见USP 6.022,725；USP 6,268,328和Nevalainen等人，“The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and
Heterologous Genes[木霉属的分子生物学及其在同源和异源基因表达中的应用]”，在：
Molecular Industrial Mycology[分子工业真菌学],编辑,Leong和Berka,Marcel Dekker
Inc.[马塞尔德克尔公司],纽约州(1992),第129-148页；针对曲霉属，包括Yelton、Hamer和Timberlake，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]81:1470-1474，针对镰刀
菌属，包括Bajar、Podila和Kolattukudy,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院
报]88:8202-8212，针对链霉菌属，包括Hopwood等人,1985,Genetic Manipulation of
Streptomyces:Laboratory Manual[链霉菌属的遗传操作：实验室手册],The John Innes
Foundation[约翰英纳斯基金会],诺维奇，英国和Fernandez-Abalos等人,Microbiol[微生
物学]149:1623-1632(2003)，并且针对芽孢杆菌属，包括Brigidi、DeRossi、Bertarini、Riccardi和Matteuzzi,(1990)FEMS Microbiol.Lett.[FEMS微生物学快报]55:135-138。
[0208] 然而，可以使用用于将外源核苷酸序列引入宿主细胞的任何熟知的程序。这些包括使用磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、基因枪法、脂质体、显微注射、原生质载体、病毒载体，以及用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA、或其他外源遗传材料引入宿主细胞的任何其他熟知方法(参见例如，Sambrook等人，同上)。还使用的是美国专利号6,255,
115中描述的农杆菌介导的转染方法。只需要使用能够成功地将至少一个基因引入能够表
达所述基因的宿主细胞中的具体基因工程化程序。
115中描述的农杆菌介导的转染方法。只需要使用能够成功地将至少一个基因引入能够表
达所述基因的宿主细胞中的具体基因工程化程序。
[0209] 将表达载体引入细胞后，在有利于表达在启动子序列控制下的基因的条件下培养转染或转化的细胞。
[0210] 用于培养细胞的培养基可以是适合于使宿主细胞生长和获得α-葡糖苷酶多肽的表达的任何常规培养基。合适的培养基和培养基组分可从商业供应商获得或可以根据公开
的配方(例如，如在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目
录中所述)来制备。
的配方(例如，如在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目
录中所述)来制备。
[0211] 可以使用从宿主细胞中分泌的热稳定丝氨酸多肽，最少的后期处理，作为全肉汤配制品。
[0212] 取决于所使用的宿主细胞，可以进行转录后和/或翻译后修饰。转录后和/或翻译后修饰的一个非限制性实例是多肽的“剪切”或“截短”。例如，这可以导致使热稳定丝氨酸蛋白酶从无活性或基本上无活性的状态变为活性状态，如前肽在进行进一步的翻译后加工
后成为具有酶活性的成熟肽的情况一样。在另一个情况下，所述剪切可导致获得如热稳定
丝氨酸蛋白酶多肽并且进一步去除N或C-末端氨基酸以产生截短形式的保留酶活性的热稳
定丝氨酸蛋白酶。
后成为具有酶活性的成熟肽的情况一样。在另一个情况下，所述剪切可导致获得如热稳定
丝氨酸蛋白酶多肽并且进一步去除N或C-末端氨基酸以产生截短形式的保留酶活性的热稳
定丝氨酸蛋白酶。
[0213] 转录后或翻译后修饰的其他实例包括但不限于肉豆蔻酰化、糖基化、截短、脂化和酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化。本领域技术人员将认识到蛋白质可能经历的转录后或翻译后修饰的类型可取决于表达蛋白质的宿主生物体。
[0214] 在一些实施例中，脂肪酶和/或肌醇六磷酸酶可以添加到发酵过程的任何一个步骤中。
[0215] 在一些实施例中，可以使用本领域已知的任何培养方法来实现重组微生物的所消耗的全发酵液的制备，从而导致热稳定丝氨酸蛋白酶的表达。
[0216] 因此，发酵可以理解为包括在实验室或工业发酵罐中在合适的培养基和允许α-葡糖苷酶能够被表达或分离的条件下进行的摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、补料分批发酵或固态发酵)。术语“所消耗的全发酵液”在本文中定义为包括培养基、胞外蛋白质(例如，酶)和细胞生物质的发酵材料的未分级内容物。应当理解，术语“所消耗的全发酵液”还涵盖已经使用本领域熟知的方法裂解或透化的细胞生物质。
[0217] 宿主细胞可以在允许表达热稳定丝氨酸蛋白酶的合适条件下培养。这些酶的表达可以是组成型的，使得它们能被连续产生，或诱导型的，需要刺激来启动表达。在诱导型表达的情况下，当需要时可通过例如向培养基中添加诱导物质，例如地塞米松或IPTG或槐糖
来启动蛋白质生产。
来启动蛋白质生产。
[0218] 本领域熟知的任何发酵方法都可以合适用来使如上所述的转化的或衍生的真菌菌株发酵。在一些实施例中，真菌细胞在分批或连续发酵条件下生长。
[0219] 经典的分批发酵是封闭的系统，其中在发酵开始时设定培养基的组成，并且所述组成在发酵期间不改变。在发酵开始时，用一种或多种所需生物体接种培养基。换言之，整个发酵过程发生而自始至终没有向发酵系统添加任何组分。
[0220] 可替代地，分批发酵符合关于添加碳源的“分批”的资格。此外，通常在整个发酵过程中进行尝试来控制因素如pH和氧气浓度。通常，分批系统的代谢物和生物质组成不断变化直到发酵停止的时间。在分批培养中，细胞通过静态停滞期进展到高生长对数期，最后进入生长速率减少或停止的稳定期。不经处理，稳定期中的细胞将最终死亡。通常，在对数期的细胞负责产物的大量生产。标准分批系统的合适的变体是“补料分批发酵”系统。在典型的分批系统的这种变化中，随着发酵的进展，将底物以增量添加。当已知分解代谢物抑制将抑制细胞的代谢时和/或在发酵培养基中希望具有有限量的底物的情况下，补料分批系统
是有用的。在补料分批系统中测量实际的底物浓度是困难的并且因此其是基于可测量因子
的变化而估测的，所述因子为如pH、溶解氧、和废气(如CO2)的分压。分批和补料分批发酵是本领域熟知的。
是有用的。在补料分批系统中测量实际的底物浓度是困难的并且因此其是基于可测量因子
的变化而估测的，所述因子为如pH、溶解氧、和废气(如CO2)的分压。分批和补料分批发酵是本领域熟知的。
[0221] 连续发酵是另一种已知的发酵方法。它是开放的系统，在所述系统中，将定义的发酵培养基连续添加到生物反应器中，同时去除等量的条件培养基以用于处理。连续发酵通常将培养物保持在恒定的密度，其中将细胞主要维持在对数期生长。连续发酵允许对一种
或多种影响细胞生长和/或产物浓度的因素进行调节。例如，限制营养素(如碳源或氮源)可以维持在固定的速率，并允许调节所有其他参数。在其他系统中，影响生长的许多因素可以不断改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统努力保持稳定态的生长
条件。因此，由于转移培养基而引起的细胞损失应当与发酵中的细胞生长速率相平衡。调节用于连续发酵过程的营养素和生长因子的方法以及最大化产物形成速率的技术在工业微
生物学领域中是熟知的。
或多种影响细胞生长和/或产物浓度的因素进行调节。例如，限制营养素(如碳源或氮源)可以维持在固定的速率，并允许调节所有其他参数。在其他系统中，影响生长的许多因素可以不断改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统努力保持稳定态的生长
条件。因此，由于转移培养基而引起的细胞损失应当与发酵中的细胞生长速率相平衡。调节用于连续发酵过程的营养素和生长因子的方法以及最大化产物形成速率的技术在工业微
生物学领域中是熟知的。
[0222] 分离和浓缩技术是本领域已知的，并且常规方法可用于制备包含本发明的热稳定丝氨酸蛋白酶多肽的浓缩溶液或肉汤。
[0223] 发酵后，获得发酵液，通过常规分离技术去除微生物细胞和各种悬浮固体(包括剩余的粗发酵材料)，以便获得热稳定丝氨酸蛋白酶溶液。通常使用过滤、离心、微滤、旋转真空鼓式过滤、超滤、离心然后超滤、提取或色谱法等。
[0224] 有时可能需要浓缩包含α-葡糖苷酶多肽的溶液或肉汤以优化回收。使用未浓缩的溶液或肉汤通常会增加孵育时间，以便收集富集或纯化的酶沉淀。
[0225] 可以使用常规浓缩技术浓缩含酶溶液直至获得所需酶水平。含酶溶液的浓缩可以通过在本文中所讨论的技术中的任一种来实现。富集和纯化方法的实例包括但不限于旋转
真空过滤和/或超滤。
真空过滤和/或超滤。
[0226] 含有溶液或肉汤的热稳定丝氨酸蛋白酶可以浓缩至浓缩的含有溶液或肉汤的热稳定丝氨酸蛋白酶多肽的酶活性达到所希望的水平。
[0227] 可以使用例如沉淀剂，如金属卤化物沉淀剂进行浓缩。金属卤化物沉淀剂包括但不限于碱金属氯化物、碱金属溴化物和这些金属卤化物中的两种或更多种的共混物。
[0228] 示例性金属卤化物包括氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾和这些金属卤化物中的两种或更多种的共混物。金属卤化物沉淀剂，氯化钠，也可用作防腐剂。对于生产规模的回收，可以如上一般情况下所述经由用聚合物絮凝除去细胞来富集或部分纯化热稳定丝氨酸蛋白酶多肽。或者，可以通过微滤富集或纯化酶，然后使用可用的膜和设备通过超滤进行浓
缩。然而，对于一些应用，酶不需要富集或纯化，并且可以裂解和使用全肉汤培养物而无需进一步处理。然后可以将酶加工成例如颗粒。
缩。然而，对于一些应用，酶不需要富集或纯化，并且可以裂解和使用全肉汤培养物而无需进一步处理。然后可以将酶加工成例如颗粒。
[0229] 热稳定丝氨酸蛋白酶能以本领域技术人员已知的各种方式被分离或纯化，这取决于样品中存在的其他组分。标准纯化方法包括但不限于色谱法(例如离子交换、亲和力、疏水性、色谱聚焦、免疫学和尺寸排阻)、电泳(例如，制备型等电聚焦)、差异溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、提取微量过滤、两相分离和结晶。例如，目的蛋白可以使用标准抗目的蛋白抗体柱进行纯化。超滤和渗滤技术联合蛋白浓缩也是有用的。对于合适的纯化技术中的一般指
导，请参见Scopes，Protein Purification[蛋白质纯化](1982)。所需的纯化程度将根据目的蛋白质的用途而变化。在一些情况下，将不需要纯化。
导，请参见Scopes，Protein Purification[蛋白质纯化](1982)。所需的纯化程度将根据目的蛋白质的用途而变化。在一些情况下，将不需要纯化。
[0230] 用于检测和测量酶的酶活性的测定法是熟知的。用于检测和测量蛋白酶(如本文所述的热稳定丝氨酸蛋白酶多肽)的活性的各种测定法也是本领域普通技术人员已知的。
具体地，测定可用于测量基于从酪蛋白或血红蛋白释放酸可溶性肽的蛋白酶活性，其作为
280nm下的吸光度测量或使用Folin方法进行比色测量并且染料标记偶氮酪蛋白的水解，其
作为440-450nm下的吸光度测量
具体地，测定可用于测量基于从酪蛋白或血红蛋白释放酸可溶性肽的蛋白酶活性，其作为
280nm下的吸光度测量或使用Folin方法进行比色测量并且染料标记偶氮酪蛋白的水解，其
作为440-450nm下的吸光度测量
[0231] 其他示例性测定涉及显色底物的溶解(参见例如，Ward“,Proteinases[蛋白酶]”,在Fogarty(编辑),Microbial Enzymes and Biotechnology[微生物酶与生物技术],Applied Science[应用科学出版社],伦敦,[1983]，第251-317页中)。一种使用高标记荧光素异硫氰酸酯(FITC)酪蛋白作为底物的蛋白酶检测方法，也可以使用所述程序的修饰的版
本，其描述于Twining[Twining,S.S.,(1984)“Fluorescein Isothiocyanate-Labeled
Casein Assay for Proteolytic Enzymes”[荧光素异硫氰酸酯标记酪蛋白酶蛋白水解测
定]Anal.Biochem.[生物化学年鉴]143:30-34]。
本，其描述于Twining[Twining,S.S.,(1984)“Fluorescein Isothiocyanate-Labeled
Casein Assay for Proteolytic Enzymes”[荧光素异硫氰酸酯标记酪蛋白酶蛋白水解测
定]Anal.Biochem.[生物化学年鉴]143:30-34]。
[0232] 其他示例性测定包括但不限于：酪蛋白切割成三氯乙酰酸溶性肽，其含有酪氨酸和色氨酸残基，随后通过与福林酚试剂反应并在660nm进行产物的比色检测，内部淬灭FRET(荧光共振能量转移)多肽底物的切割，随后使用荧光计检测产物。荧光共振能量转移
(FRET)是由一个被激发的荧光团(或供体)向合适的猝灭剂(或受体)分子的非辐射能量转
移。FRET用于各种应用，包括含有底物的蛋白酶活性测定，其中荧光团通过含有酶切割位点的短肽序列从猝灭剂中分离出来。当荧光团和猝灭剂分离时，肽的蛋白水解产生荧光。许多本领域技术人员已知的附加参考文献提供了合适的方法(参见，例如，Wells等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],11:7911-7925[1983]；Christianson等人,Anal.Biochem.[分析生
物化学],223:119-129[1994]；以及Hsia等人,Anal Biochem.[分析生物化学],242:221-
227[1999])。
(FRET)是由一个被激发的荧光团(或供体)向合适的猝灭剂(或受体)分子的非辐射能量转
移。FRET用于各种应用，包括含有底物的蛋白酶活性测定，其中荧光团通过含有酶切割位点的短肽序列从猝灭剂中分离出来。当荧光团和猝灭剂分离时，肽的蛋白水解产生荧光。许多本领域技术人员已知的附加参考文献提供了合适的方法(参见，例如，Wells等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],11:7911-7925[1983]；Christianson等人,Anal.Biochem.[分析生
物化学],223:119-129[1994]；以及Hsia等人,Anal Biochem.[分析生物化学],242:221-
227[1999])。
[0233] 在仍另一方面，公开了包含与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％或99％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白的饲料、喂养料、饲料添加剂组合物、预混物、食物或谷物产物，所述热稳定丝氨酸蛋白酶可以单独使用或与至少一种直接饲喂微生物组
合使用。
98％或99％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白的饲料、喂养料、饲料添加剂组合物、预混物、食物或谷物产物，所述热稳定丝氨酸蛋白酶可以单独使用或与至少一种直接饲喂微生物组
合使用。
[0234] 至少一个DFM可以包括至少一个活的微生物，如活的细菌菌株或活的酵母或活的真菌。优选地，DFM包含至少一个活细菌。
[0235] DFM可能是一种形成孢子的菌株，因此术语DFM可能由孢子组成或包含孢子，例如细菌孢子。因此，如本文所用的“活的微生物”可能包括微生物孢子，如内孢子或分生孢子。
可替代地，本文所述饲料添加剂组合物中的DFM可能不由微生物孢子组成或不包含微生物
孢子，例如内孢子或分生孢子。
可替代地，本文所述饲料添加剂组合物中的DFM可能不由微生物孢子组成或不包含微生物
孢子，例如内孢子或分生孢子。
[0236] 微生物可以是自然发生的微生物，也可以是转化的微生物。
[0237] 本文所述的DFM可包含如下一个或多个属的微生物：乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、芽孢杆菌属、片球菌属
(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、肉食杆菌属
(Carnobacterium)、丙酸菌属(Propionibacterium)、双歧杆菌属(Bifido bacterium)、梭菌属(Clostridium)和巨球型菌属(Megasphaera)及其组合。
(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、肉食杆菌属
(Carnobacterium)、丙酸菌属(Propionibacterium)、双歧杆菌属(Bifido bacterium)、梭菌属(Clostridium)和巨球型菌属(Megasphaera)及其组合。
[0238] 优选地，DFM包含一种或多种选自以下的芽孢杆菌属物种的细菌菌株：枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)和解淀粉芽孢杆菌。
[0239] 如本文所用的“芽孢杆菌属”包括如本领域技术人员已知的“芽孢杆菌”属内的所有物种，包括但不限于：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、吉氏芽孢杆菌
(B.gibsonii)、短小芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。据认识，芽孢杆菌属继续经历分类学重
组。因此，所述属旨在包括已重新分类的物种，包括但不限于：例如嗜热脂肪芽孢杆菌(现在称为“嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)”)或多黏芽孢杆菌
(Bacillus polymyxa)(现在是“多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)”)的此类生物体在胁迫环境条件下的抗性内生孢子的产生被认为是芽孢杆菌属的定义性特性，尽管这个
特征也适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属、线性杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属
(Halobacillus)、类芽孢杆菌属、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属
(Thermobacillus)、脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
(B.gibsonii)、短小芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。据认识，芽孢杆菌属继续经历分类学重
组。因此，所述属旨在包括已重新分类的物种，包括但不限于：例如嗜热脂肪芽孢杆菌(现在称为“嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)”)或多黏芽孢杆菌
(Bacillus polymyxa)(现在是“多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)”)的此类生物体在胁迫环境条件下的抗性内生孢子的产生被认为是芽孢杆菌属的定义性特性，尽管这个
特征也适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属、线性杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属
(Halobacillus)、类芽孢杆菌属、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属
(Thermobacillus)、脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
[0240] 在另一方面，DFM可以进一步与如下乳杆菌物种组合：乳脂链球菌(Lactococcus cremoris)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)及其组合。
[0241] DFM可以进一步与如下乳杆菌属物种组合：布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳酸杆菌(Lactobacillus
casei)、开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)、双叉乳酸杆菌(Lactobacillus
bifidus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、
唾液乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、发酵乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、香肠乳杆菌
(Lactobacillus farciminis)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、戴耳布吕克氏乳杆
菌(Lactobacillus delbreuckii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、类植物乳杆
菌(Lactobacillus paraplantarum)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、加氏乳杆菌
(Lactobacillus gasseri)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)和詹氏乳杆菌
(Lactobacillus jensenii)及其任何组合。
casei)、开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)、双叉乳酸杆菌(Lactobacillus
bifidus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、
唾液乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、发酵乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、香肠乳杆菌
(Lactobacillus farciminis)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、戴耳布吕克氏乳杆
菌(Lactobacillus delbreuckii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、类植物乳杆
菌(Lactobacillus paraplantarum)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、加氏乳杆菌
(Lactobacillus gasseri)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)和詹氏乳杆菌
(Lactobacillus jensenii)及其任何组合。
[0242] 在仍另一方面，DFM可以进一步与如下双歧杆菌属物种(Bifidobacteria spp)组合：乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium
bifidium)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium
animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium
infantis)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、假小链双歧杆菌
(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、青春双岐杆菌(Bifidobacterium
adolescentis)和角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)及其任何组合。
bifidium)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium
animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium
infantis)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、假小链双歧杆菌
(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、青春双岐杆菌(Bifidobacterium
adolescentis)和角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)及其任何组合。
[0243] 可以提到的细菌有以下几个物种：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、肠球菌、肠球菌属物种和片球菌属物种、乳杆菌属物种、双歧杆菌属物种、嗜酸乳杆菌、乳酸片球菌(Pediococsus acidilactici)、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌
(Bifidobacterium bifidum)、枯草芽孢杆菌、特恩丙酸杆菌(Propionibacterium
thoenii)、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、动物双歧杆菌动物亚种(Bifidobacterium animalis
ssp.animalis)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、蜡样芽孢杆菌、唾液乳杆菌亚种唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius ssp.Salivarius)、丙酸杆菌物种及其组合。
(Bifidobacterium bifidum)、枯草芽孢杆菌、特恩丙酸杆菌(Propionibacterium
thoenii)、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、动物双歧杆菌动物亚种(Bifidobacterium animalis
ssp.animalis)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、蜡样芽孢杆菌、唾液乳杆菌亚种唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius ssp.Salivarius)、丙酸杆菌物种及其组合。
[0244] 本文所述的直接饲喂微生物包含一种或多种细菌菌株，可以是同一类型的(属、种和菌株)，也可以包含属、种和/或菌株的混合物。
[0245] 可替代地，DFM可以与WO 2012110778中公开的一种或多种产品或这些产品中包含的微生物相结合，总结如下：枯草芽孢杆菌菌株2084登录号NRRl B-50013、枯草芽孢杆菌菌株LSSAO1登录号NRRL B-50104、和枯草芽孢杆菌菌株15A-P4ATCC登录号PTA-6507(来自
Enviva (以前称为 )；枯草芽孢杆菌菌株C3102(来自 )；枯
草芽孢杆菌菌株PB6(来自 )；短小芽孢杆菌(8G-134)；肠球菌NCIMB 10415(SF68)
(来自 )；枯草芽孢杆菌菌株C3102(来自 & )；地衣
芽孢杆菌(来自 )；肠球菌和片球菌(来自Poultry )；乳杆菌、双歧
杆菌和/或肠球菌来自 )；枯草芽孢杆菌菌株QST 713(来自 )；解淀
粉芽孢杆菌CECT-5940(来自 & Plus)；屎肠球菌(Enterococcus
faecium)SF68(来自 )；枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(来自 )；
乳酸菌7屎肠球菌(来自 )；芽孢杆菌菌株(来自 )；酿酒酵母
(Saccharomyces cerevisiae)(来自 )；肠球菌(来自Biomin )；乳酸
片球菌(Pediococcus acidilactici)、肠球菌、动物双歧杆菌动物亚种、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌亚种(来自Biomin )；香肠乳杆菌(来自 )；肠球菌(来自Oralin
)；肠球菌(2个菌株)、乳酸乳球菌DSM 1103(来自Probios-pioneer )；
鼠李糖乳杆菌和(来自 )；枯草芽孢杆菌(来自 )；肠球菌(来自
)；酿酒酵母(来自Levucell SB )；酿酒酵母(来自Levucell SC 0&
ME)；乳酸片球菌(来自Bactocell)；酿酒酵母(来自 (以前称为
))；酿酒酵母NCYC Sc47(来自 SC47)；丁酸梭菌(来自 )；
肠球菌(来自Fecinor and Fecinor )；酿酒酵母NCYC R-625(来自 )；
酿酒酵母(来自 )；肠球菌和鼠李糖乳杆菌(来自 )；枯草芽孢杆菌
和米曲霉(来自 )；蜡样芽孢杆菌(来自 )；蜡样芽孢杆菌变
体toyoi NCIMB 40112/CNCM I-1012(来自 )、或其他DFM，例如地衣芽孢
杆菌和枯草芽孢杆菌(来自 YC)和枯草芽孢杆菌(来自 )。
Enviva (以前称为 )；枯草芽孢杆菌菌株C3102(来自 )；枯
草芽孢杆菌菌株PB6(来自 )；短小芽孢杆菌(8G-134)；肠球菌NCIMB 10415(SF68)
(来自 )；枯草芽孢杆菌菌株C3102(来自 & )；地衣
芽孢杆菌(来自 )；肠球菌和片球菌(来自Poultry )；乳杆菌、双歧
杆菌和/或肠球菌来自 )；枯草芽孢杆菌菌株QST 713(来自 )；解淀
粉芽孢杆菌CECT-5940(来自 & Plus)；屎肠球菌(Enterococcus
faecium)SF68(来自 )；枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(来自 )；
乳酸菌7屎肠球菌(来自 )；芽孢杆菌菌株(来自 )；酿酒酵母
(Saccharomyces cerevisiae)(来自 )；肠球菌(来自Biomin )；乳酸
片球菌(Pediococcus acidilactici)、肠球菌、动物双歧杆菌动物亚种、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌亚种(来自Biomin )；香肠乳杆菌(来自 )；肠球菌(来自Oralin
)；肠球菌(2个菌株)、乳酸乳球菌DSM 1103(来自Probios-pioneer )；
鼠李糖乳杆菌和(来自 )；枯草芽孢杆菌(来自 )；肠球菌(来自
)；酿酒酵母(来自Levucell SB )；酿酒酵母(来自Levucell SC 0&
ME)；乳酸片球菌(来自Bactocell)；酿酒酵母(来自 (以前称为
))；酿酒酵母NCYC Sc47(来自 SC47)；丁酸梭菌(来自 )；
肠球菌(来自Fecinor and Fecinor )；酿酒酵母NCYC R-625(来自 )；
酿酒酵母(来自 )；肠球菌和鼠李糖乳杆菌(来自 )；枯草芽孢杆菌
和米曲霉(来自 )；蜡样芽孢杆菌(来自 )；蜡样芽孢杆菌变
体toyoi NCIMB 40112/CNCM I-1012(来自 )、或其他DFM，例如地衣芽孢
杆菌和枯草芽孢杆菌(来自 YC)和枯草芽孢杆菌(来自 )。
[0246] DFM可能与 结合， 可商购自丹尼斯科公司。Enviva 是一个芽孢杆菌菌株2084登录号NRRl B-50013、芽孢杆菌菌株LSSAO1登录号
NRRL B-50104和芽孢杆菌菌株15A-P4ATCC登录号PTA-6507的组合(如在US 7,754,469 B中
所教导的-通过引用并入本文)。
NRRL B-50104和芽孢杆菌菌株15A-P4ATCC登录号PTA-6507的组合(如在US 7,754,469 B中
所教导的-通过引用并入本文)。
[0247] 也可以将本文所述的DFM与来自以下属的酵母结合：假单胞菌属物种
[0248] 优选地，本文所述的DFM包括通常被认为是安全(GRAS)的微生物，优选地是经GRAS批准的微生物。
[0249] 本领域普通技术人员将容易地知道来自本文所述属中的特定微生物物种和/或菌株，其用于食品和/或农业工业中并且其通常被认为适合于动物消费。
[0250] 在某些实施例中，重要的是DFM具有对热的耐受性，即耐热性。当饲料粒化时尤其如此。因此，在另一个实施例中，DFM可能是耐热微生物，例如耐热细菌，包括例如芽孢杆菌属物种。
[0251] 在其他方面，可能需要DFM包括产孢子细菌，如芽孢杆菌纲(Bacilli)，例如芽孢杆菌属物种。芽孢杆菌能在生长不利的条件下形成稳定的内生孢子，对热、pH、水分和消毒剂有很强的抵抗力。
[0252] 本文所述的DFM可减少或阻止致病性微生物(如产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)和/或大肠杆菌和/或沙门氏菌属物种(Salmonella spp)和/或弯曲杆菌属物
种(Campylobacter spp))在肠道内的建立。换句话说，DFM可能具有抗病原性。如本文所用的术语“抗病原性”，是指DFM抵抗病原体的作用(负作用)。
种(Campylobacter spp))在肠道内的建立。换句话说，DFM可能具有抗病原性。如本文所用的术语“抗病原性”，是指DFM抵抗病原体的作用(负作用)。
[0253] 如上所述，DFM可以是任何合适的DFM。例如，下面的测定“DFM测定”可以用来确定微生物是否适合成为DFM。如本文所用的DFM测定在US 2009/0280090中有更详细的说明。为了避免疑问，根据本文所讲授的“DFM测定”，选择作为抑制性菌株(或抗病原性DFM)的DFM，是一种适合于根据本公开使用的DFM，即跟据本公开的饲料添加剂组合物中使用的DFM。
[0254] 每根试管中都植入了来自代表性簇的代表性病原体(如细菌)。
[0255] 来自潜在DFM的上清液，经好氧或厌氧培养，被添加到接种的管中(不添加上清液的对照组除外)并孵育。孵育后，对每一种病原菌分别测定对照和处理的上清的管的光密度(OD)。
[0256] 与对照组(不含任何上清液)相比，产生了较低的OD的(潜在的DFM)菌株的菌落可以将其分类为抑制性菌株(或抗病原性DFM)。因此，如本文所用的DFM测定在US 2009/
0280090中有更详细的说明。
0280090中有更详细的说明。
[0257] 优选地，本DFM测定中使用的代表性病原体可以是下列一种(或多种)：梭菌属，例如产气荚膜梭菌和/或艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)、和/或大肠杆菌和/或
沙门氏菌物种和/或弯曲杆菌物种。在一个优选的实施例中，所述测定用一个或多个产气荚膜梭菌和/或艰难梭状芽孢杆菌和/或大肠杆菌，优选地产气荚膜梭菌和/或艰难梭状芽孢
杆菌，更优选地产气荚膜梭菌进行。
沙门氏菌物种和/或弯曲杆菌物种。在一个优选的实施例中，所述测定用一个或多个产气荚膜梭菌和/或艰难梭状芽孢杆菌和/或大肠杆菌，优选地产气荚膜梭菌和/或艰难梭状芽孢
杆菌，更优选地产气荚膜梭菌进行。
[0258] 抗致病性DFM包括以下一种或多种细菌，并描述于WO 2013029013：枯草芽孢杆菌菌株3BP5登录号NRRL B-50510、
[0259] 枯草芽孢杆菌菌株918ATCC登录号NRRL B-50508、和
[0260] 枯草芽孢杆菌菌株1013ATCC登录号NRRL B-50509中。
[0261] DFM可以作为一种或多种培养物和一种或多种载体制备(如果使用的话)，并可以将它们添加到条带或桨式混合器中，并且混合约15分钟，尽管时间可以增加或减少。将组分混合，这样使得导致培养物和载体的均匀混合物。最终产物优选地为干燥的可流动粉末。
DFM包括含一种或多种菌株，然后可以将其添加到动物饲料或饲料预混物，添加到动物的
水，或以其他本领域已知的途径给予(优选地与本文所述的酶同时)。
DFM包括含一种或多种菌株，然后可以将其添加到动物饲料或饲料预混物，添加到动物的
水，或以其他本领域已知的途径给予(优选地与本文所述的酶同时)。
[0262] 在DFM混合物中包含单个菌株的比例可以从1％到99％不等，优选从25％到75％不等。
[0263] 动物饲料中DFM的适合剂量范围为约1x 103CFU/g饲料至约1x 1010CFU/g饲料，适当地在约1x 104CFU/g饲料至约1x 108CFU/g饲料之间，适当地在约7.5x 104CFU/g饲料至约
1x 107CFU/g饲料之间。
1x 107CFU/g饲料之间。
[0264] 在另一方面，喂养料中DFM的剂量超过约1x 103CFU/g饲料，适当地超过约1x 104CFU/g饲料，适当地超过约5x 104CFU/g饲料，或适当地超过约1x 105CFU/g饲料。
[0265] 饲料添加剂组合物中DFM的剂量从约1x 103CFU/g组合物至约1x 1013CFU/g组合物，优选1x 105CFU/g组合物至约1x 1013CFU/g组合物，更优选在约1x 106CFU/g组合物至约
1x 1012CFU/g组合物之间，并且最优选在约3.75x 107CFU/g组合物至约1x 1011CFU/g组合物之间。在另一方面，饲料添加剂组合物中DFM的剂量大于约1x 105CFU/g组合物，优选大于约
1x 106CFU/g组合物，并且最优选大于约3.75x 107CFU/g组合物。在一个实施例中，饲料添加剂组合物中DFM的剂量大于约2x 105CFU/g组合物，适当地大于约2x 106CFU/g组合物，适当地大于约3.75x 107CFU/g组合物。
1x 1012CFU/g组合物之间，并且最优选在约3.75x 107CFU/g组合物至约1x 1011CFU/g组合物之间。在另一方面，饲料添加剂组合物中DFM的剂量大于约1x 105CFU/g组合物，优选大于约
1x 106CFU/g组合物，并且最优选大于约3.75x 107CFU/g组合物。在一个实施例中，饲料添加剂组合物中DFM的剂量大于约2x 105CFU/g组合物，适当地大于约2x 106CFU/g组合物，适当地大于约3.75x 107CFU/g组合物。
[0266] 用于在动物饲料中使用的饲料添加剂组合物可以包含与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶，所述热稳定丝氨酸蛋白酶可以单独使用或与至少一种直接饲喂微生物组合使用，并且包含至少一种选自以下
的组分：蛋白质、肽、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘油、丙二醇、氯化钠、硫酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、甲酸钠、山梨酸钠、氯化钾、硫酸钾、乙酸钾、柠檬酸钾、甲酸钾、乙酸钾、山梨酸钾、氯化镁、硫酸镁、乙酸镁、柠檬酸镁、甲酸镁、山梨酸镁、焦亚硫酸钠、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。
94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶，所述热稳定丝氨酸蛋白酶可以单独使用或与至少一种直接饲喂微生物组合使用，并且包含至少一种选自以下
的组分：蛋白质、肽、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘油、丙二醇、氯化钠、硫酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、甲酸钠、山梨酸钠、氯化钾、硫酸钾、乙酸钾、柠檬酸钾、甲酸钾、乙酸钾、山梨酸钾、氯化镁、硫酸镁、乙酸镁、柠檬酸镁、甲酸镁、山梨酸镁、焦亚硫酸钠、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。
[0267] 在仍另一方面，公开了包含与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％或99％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶的用于在动物饲料中使用的颗粒状饲料添
加剂组合物，所述热稳定丝氨酸蛋白酶可以单独使用或与至少一种直接饲喂微生物组合使
用，其中所述颗粒状饲料添加剂组合物包含通过选自以下的方法产生的颗粒：高剪切制粒、鼓式制粒、挤出、滚圆、流化床附聚、流化床喷涂、喷雾干燥、冷冻干燥、造粒、喷雾冷却、旋转式圆盘雾化、凝聚、压片或上述方法的任何组合。
98％或99％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶的用于在动物饲料中使用的颗粒状饲料添
加剂组合物，所述热稳定丝氨酸蛋白酶可以单独使用或与至少一种直接饲喂微生物组合使
用，其中所述颗粒状饲料添加剂组合物包含通过选自以下的方法产生的颗粒：高剪切制粒、鼓式制粒、挤出、滚圆、流化床附聚、流化床喷涂、喷雾干燥、冷冻干燥、造粒、喷雾冷却、旋转式圆盘雾化、凝聚、压片或上述方法的任何组合。
[0268] 此外，颗粒状饲料添加剂组合物的颗粒可具有大于50微米并且小于2000微米的平均直径。
[0269] 饲料添加剂组合物可以是液体形式，并且液体形式也可以是所述适合于在饲料丸粒上喷雾干燥。
[0270] 动物饲料可以包括植物材料，如玉米、小麦、高粱、大豆、卡诺拉油菜、向日葵，或针对家禽、猪、反刍动物、水产养殖和宠物的这些植物材料或植物蛋白源中的任何的混合物。预期动物性能参数，如生长、采食量和饲料效率，但同时改善的均匀性、降低的动物房内的氨浓度以及因此改善的动物的福利和健康状况，都将得到改善。更具体地，如本文所用的
“动物性能”可以通过动物的饲料效率和/或增重和/或通过饲料转化率和/或通过饲料中的营养素的消化率(例如氨基酸消化率)和/或饲料中的可消化能或代谢能和/或通过氮保留
量和/或通过动物的避免坏死性肠炎的负面影响的能力和/或通过受试者的免疫应答来确
定。
“动物性能”可以通过动物的饲料效率和/或增重和/或通过饲料转化率和/或通过饲料中的营养素的消化率(例如氨基酸消化率)和/或饲料中的可消化能或代谢能和/或通过氮保留
量和/或通过动物的避免坏死性肠炎的负面影响的能力和/或通过受试者的免疫应答来确
定。
[0271] 优选地，“动物性能”通过饲料效率和/或动物增重和/或饲料转化率来确定。
[0272] “改善的动物性能”意指与不包含本发明的饲料添加剂组合物的饲料相比，由于使用所述饲料添加剂组合物，受试者中的饲料效率增加和/或增重增加和/或饲料转化率降低和/或饲料中的营养素或能量的消化率改善和/或氮保留量改善和/或避免坏死性肠炎的负
面影响的能力改善和/或免疫应答改善。
面影响的能力改善和/或免疫应答改善。
[0273] 优选地，“改善的动物性能”意指存在增加的饲料效率和/或增加的增重和/或降低的饲料转化率。如本文所用的，术语“饲料效率”是指当一段时间内给动物无限制地喂食或饲喂规定量的食物时出现的动物增重的量。
[0274] “增加的饲料效率”意指与在不存在根据本发明的饲料添加剂组合物的情况下饲喂的动物相比，在饲料中使用本发明的饲料添加剂组合物导致每单位饲料摄入量中增重增
加。
加。
[0275] 如本文所用的，术语“饲料转化率”是指饲喂给动物以使动物体重增加的规定量的饲料量。
[0276] 改善的饲料转化率意指较低的饲料转化率。
[0277] “较低的饲料转化率”或“改善的饲料转化率”意指在饲料中使用饲料添加剂组合物导致动物增重指定量饲喂给动物的所需要的饲料量低于饲料添加剂组合物的情况下使动物增重相同量时所需的饲料量。
[0278] 如本文所用的营养素消化率是指从胃肠道或胃肠道特定区段(例如小肠)消失的营养物质的比率。营养素消化率可测量为所给予至受试者的营养物与受试者粪便中所排出
来的营养物之间的差值、或给予至受试者的营养物与保留在胃肠道指定区段(例如回肠)上
的消化物中的营养物之间的差值。
来的营养物之间的差值、或给予至受试者的营养物与保留在胃肠道指定区段(例如回肠)上
的消化物中的营养物之间的差值。
[0279] 如本文所用的，营养素消化率可通过在一段时间期间收集总排泄物，测量所摄入营养物与所排泄的营养物之间的差值；或利用不会被动物吸收，并允许研究者计算整个胃
肠道或胃肠道区段中所消失的营养素的量的惰性标记物来测量。这样的惰性标记可以是二
氧化钛、氧化铬或酸不溶性灰分。消化率可以表示为在饲料中营养素的百分比，或表示为可消化的营养素的质量单位/饲料中的营养素的质量单位。
肠道或胃肠道区段中所消失的营养素的量的惰性标记物来测量。这样的惰性标记可以是二
氧化钛、氧化铬或酸不溶性灰分。消化率可以表示为在饲料中营养素的百分比，或表示为可消化的营养素的质量单位/饲料中的营养素的质量单位。
[0280] 如本文所用的营养素消化率涵盖淀粉消化率、脂肪消化率、蛋白质消化率和氨基酸消化率。
[0281] 如本文所用的能量消化率意指所消费的饲料总能量减去粪便的总能量，或所消费的饲料总能量减去动物胃肠道指定区段(例如回肠)中剩余消化物的总能量。如本文所用
的，代谢能是指表观代谢能，并且意指所消耗的饲料总能量减去粪便、尿和消化的气体产物中包含的总能量。可使用与测定营养素消化率相同的方法，通过总能量的摄入量与粪便排
出的总能量之间的差值，或与胃肠道特定区段(例如回肠)中存在的消化物总能量之间的差
值来测量能量消化率和代谢能，同时对氮排泄进行适当校正来计算饲料的代谢能。
的，代谢能是指表观代谢能，并且意指所消耗的饲料总能量减去粪便、尿和消化的气体产物中包含的总能量。可使用与测定营养素消化率相同的方法，通过总能量的摄入量与粪便排
出的总能量之间的差值，或与胃肠道特定区段(例如回肠)中存在的消化物总能量之间的差
值来测量能量消化率和代谢能，同时对氮排泄进行适当校正来计算饲料的代谢能。
[0282] 在一些实施例中，本文所述的组合物可提高受试者对膳食半纤维素或纤维的消化率或利用率。在一些实施例中，所述受试者是猪。
[0283] 如本文所用的氮保留意指受试者将饮食中的氮保有为体重的能力。当氮排泄量超过每日摄入量时，会出现负的氮平衡，肌肉减少时通常会观察到此现象。正的氮平衡常常与肌肉生长相关，尤其是对于生长期动物来说。
[0284] 氮保留可以测量为在一段时间内氮的摄入量与通过排泄物和尿液完全收集而得出的氮排出量之间的差值。应当理解，排出的氮包括饲料中未消化的蛋白质、内源性蛋白质的分泌物、微生物蛋白质和尿氮。
[0285] 如本文所用的术语存活率，是指存活的受试者人数。术语“改善的生存率”是“降低的死亡率”的另一种说法。
[0286] 如本文所用的术语屠体收率是指经过商业或实验宰杀过程之后，作为活体重量一部分的屠体的量。术语屠体是指为食用而已被宰杀，并去除头部、内脏、四肢部分、和羽毛或皮的动物躯体。如本文所用的，术语产肉量是指作为活体重量一部分的可食用肉量，或作为活体重量一部分的特定肉块量。
[0287] “增加的增重”是指与饲喂不含所述饲料添加剂组合物的饲料的动物相比，饲喂包含饲料添加剂组合物的饲料时体重增加的动物。
[0288] 如本文所用的术语“动物”包括所有非反刍动物和反刍动物。在具体实施例中，所述动物是非反刍动物，例如马和单胃动物。单胃动物的实例包括但不限于：猪(pig和swine)，如仔猪、生长猪、母猪；家禽，如火鸡、鸭、小鸡、肉仔鸡、蛋鸡；鱼，如鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳类，例如虾和对虾。在另外的实施例中，所述动物是反刍动物，包括但不限于牛、小牛、山羊、绵羊、长颈鹿、北美野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和鹿牛羚。
[0289] 在本发明上下文中，术语“宠物食品”旨在被理解为意指用于以下的食物：家庭动物，如但不限于狗、猫、沙鼠、仓鼠、南美栗鼠、褐鼠、豚鼠；鸟类宠物，如金丝雀、长尾小鹦鹉和鹦鹉；爬行动物宠物，如海龟、蜥蜴和蛇；以及水生宠物，如热带鱼和青蛙。
[0290] 术语“动物饲料组合物”、“饲料”、“喂养料”和“秣料(fodder)”可互换地使用，并且包含选自以下的一种或多种饲料原料，该组包含：a)谷类，如小粒谷物(如小麦、大麦、黑麦、燕麦及其组合)和/或大粒谷物，如玉米或高粱；b)来自谷类的副产物，如玉米蛋白粉、具有可溶物的干酒糟(Distillers Dried Grains with Solubles)(DDGS)(具体是基于玉米的具有可溶物的干酒糟(cDDGS))、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)获得自以下来源的蛋白质：如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉油菜、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；d)获得自植物和动物来源的油和脂肪；和/或e)矿物质和维生素。
[0291] 本文所述的热稳定丝氨酸蛋白酶或饲料添加剂组合物可以用作饲料或用于饲料的制备中。术语“饲料添加剂组合物”和“酶组合物”在本文中可互换地使用。
[0292] 取决于用途和/或应用模式和/或施用模式，饲料可呈溶液形式或呈固体形式或呈半固体形式。
[0293] 当用作或用于制备饲料(如功能性饲料)时，本文所述的酶或饲料添加剂组合物可以与以下中的一种或多种结合使用：营养上可接受的载体、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅剂、营养活性成分。例如，提及至少一种选自以下的组分：蛋白质、肽、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘油、丙二醇、氯化钠、硫酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、甲酸钠、山梨酸钠、氯化钾、硫酸钾、乙酸钾、柠檬酸钾、甲酸钾、乙酸钾、山梨酸钾、氯化镁、硫酸镁、乙酸镁、柠檬酸镁、甲酸镁、山梨酸镁、焦亚硫酸钠、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。
[0294] 在一个优选的实施例中，将本发明的酶或饲料添加剂组合物与饲料组分混合以形成喂养料。如本文所用的，“饲料组分”意指喂养料的全部或部分。喂养料的部分可意指喂养料的一种成分或喂养料的一种以上(例如2种或3种或4种或更多种)成分。在一个实施例中，术语“饲料组分”涵盖预混物或预混物成分。优选地，饲料可以是秣料或其预混物、复合饲料或其预混物。可以将所述饲料添加剂组合物与复合饲料、复合饲料组分混合或将其混合至
复合饲料的预混物或混合至草料、草料组分或草料的预混物中。
复合饲料的预混物或混合至草料、草料组分或草料的预混物中。
[0295] 本文所述的任何喂养料可包含一种或多种选自包含以下的组的饲料材料：a)谷类，如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦、黑小麦以及它们的组合)和/或大粒谷物例如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，如玉米蛋白粉、湿饼(特别是基于玉米的湿饼)、干酒糟(DDG)(特别是基于玉米的干酒糟(cDDG))、具有可溶物的干酒糟(DDGS)(特别是基于玉米
的具有可溶物的干酒糟(cDDGS))、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)获得自以下来源的蛋白质：如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉油菜、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；d)获得自植物和动物来源的油和脂肪；e)矿物质和维生素。
的具有可溶物的干酒糟(cDDGS))、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)获得自以下来源的蛋白质：如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉油菜、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；d)获得自植物和动物来源的油和脂肪；e)矿物质和维生素。
[0296] 如本文所用的，术语“秣料”意指提供给动物的任何食物(而不是动物必须自己觅食)。秣料涵盖已经切下的植物。此外，秣料包括青贮饲料、压缩的和压成丸粒的饲料、油和混合给养，也包括发芽谷物和豆类。
[0297] 秣料可以获得自选自以下的植物中的一种或多种：玉米(玉蜀黍)、苜蓿(紫苜蓿)、大麦、百脉根、芸苔属、休马流甘兰(Chau moellier)、羽衣甘蓝、油菜籽(卡诺拉油菜)、芜菁甘蓝(瑞典甘蓝)、萝卜、三叶草、杂种三叶草、红三叶草、地下三叶草、白三叶草、羊茅草、雀麦草、粟、燕麦、高粱、大豆、树(用作树干草的修剪下的树嫩枝)、小麦、和豆科植物。
[0298] 术语“复合饲料”意指呈粗粉、丸粒、球丸(nut)、饼或碎屑形式的商业饲料。复合饲料可由多种原料和添加剂共混而来。根据目标动物的特定需求配制这些共混物。
[0299] 复合饲料可以是提供所有每日所需营养素的完全饲料、提供口粮(蛋白质、能量)的一部分的浓缩物或仅提供另外的微量营养素(如矿物质和维生素)的补充剂。
[0300] 用于复合饲料中的主要成分是饲料谷物，其包括玉米、小麦、卡诺拉油菜粉、油菜籽粉、羽扇豆、大豆、高粱、燕麦和大麦。
[0301] 合适地，本文所提及的预混物可以是由微量成分构成的组合物，所述微量成分为如维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物和其他必需成分。预混物通常是适合于共混进商业口粮内的组合物。
[0302] 在一个实施例中，喂养料包含以下或由以下组成：玉米、DDGS(例如，cDDGS)、小麦、小麦麸、或其任何组合。
[0303] 在一个实施例中，饲料组分可为玉米、DDGS(例如，cDDGS)、小麦、小麦麸、或其组合。在一个实施例中，喂养料包含以下或由以下组成：玉米、DDGS(例如，cDDGS)或其组合。
[0305] 例如，喂养料可以含有约5％至约40％的玉米DDGS。对于家禽，所述喂养料平均可含有约7％至15％的玉米DDGS。对于猪(swine或pig)，所述喂养料可含有平均5％至40％的
玉米DDGS。它也可以含有玉米作为单一谷物，在这种情况下，所述喂养料可以包含约35％至约80％的玉米。
玉米DDGS。它也可以含有玉米作为单一谷物，在这种情况下，所述喂养料可以包含约35％至约80％的玉米。
[0306] 在包含混合谷物(例如包含如玉米和小麦)的喂养料中，所述喂养料可包含至少10％的玉米。
[0307] 另外或可替代地，喂养料也可包含至少一种高纤维饲料材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物以提供高纤维喂养料。高纤维饲料材料的实例包括：小麦、大麦、黑麦、燕麦，来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、玉米蛋白饲料、湿饼、干酒糟(DDG)、具有可溶物的干酒糟(DDGS)、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣。一些蛋白质源也可视为高纤维：获得自如以下来源的蛋白质：向日葵、羽扇豆、蚕豆和棉花。在一个方面，如本文所述的喂养料包含选自以下的至少一种高纤维材料和/或所述至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物，例如：具有可溶物的干酒糟(DDGS)(具体是
cDDGS)、湿饼、干酒糟(DDG)(具体是cDDG)、麦麸和小麦。在一个实施例中，本发明的喂养料包含选自以下的至少一种高纤维材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物：
例如含可溶物干酒糟(DDGS)(具体是cDDGS)、麦麸和小麦。
cDDGS)、湿饼、干酒糟(DDG)(具体是cDDG)、麦麸和小麦。在一个实施例中，本发明的喂养料包含选自以下的至少一种高纤维材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物：
例如含可溶物干酒糟(DDGS)(具体是cDDGS)、麦麸和小麦。
[0308] 所述饲料可以是以下中的一种或多种：复合饲料和预混物，包括丸粒、饲料块(nut)或(牲畜用)饼状物；作物或作物残余物：玉米、大豆、高粱、燕麦、大麦、椰子核、稻草、谷壳、甜菜残渣；鱼粉；肉粉和骨粉；糖蜜；油饼和滤饼；低聚糖；糖渍饲用植物：青贮饲料；海草；种子和谷物，完整的或通过压碎、研磨等制备；发芽谷物及豆类；酵母提取物。
[0309] 如本文所用的，术语“饲料”在一些实施例中涵盖宠物食物。宠物食物是旨在由宠物消费的植物或动物材料，如狗食或猫食。宠物食物(如狗食和猫食)可以干燥形式(如用于狗的磨碎食物)或湿罐装形式。猫食可含有氨基酸牛磺酸。
[0310] 动物饲料还可以包括鱼食。鱼食通常含有使养殖鱼保持良好健康所需的大量营养素、痕量元素和维生素。鱼食可以呈小片、丸粒或片的形式。压成丸粒的形式(其中的一些快速沉降)经常用于较大鱼或底饲物种。一些鱼食还含有添加剂(如β胡萝卜素或性激素)以人工增强观赏性鱼的颜色。
[0311] 在仍另一方面，动物饲料涵盖鸟食。鸟食包括用于喂鸟器中以及用于饲喂宠物鸟的食物。典型地，鸟食由多种种子组成，但也可涵盖板油(牛肉或羊肉脂肪)。
[0312] 如本文所用的，术语“接触”指的是间接或直接将热稳定丝氨酸蛋白酶(或包含热稳定丝氨酸蛋白酶的组合物)应用到产品(例如饲料)中。可以使用的应用方法的实例包括
但不限于：在包含饲料添加剂组合物的材料中处理产品、通过将饲料添加剂组合物与产品
混合而直接应用、将饲料添加剂组合物喷涂至产品表面上或将产品浸入饲料添加剂组合物
的配制品中。在一个实施例中，优选地将本发明的饲料添加剂组合物与产品(例如喂养料)
混合。可替代地，喂养料的乳液或原始成分中可包括饲料添加剂组合物。对于一些应用而
言，重要的是，使组合物在待影响/处理的产品表面上可用或可用于待影响/处理的产品表
面。这允许所述组合物赋予性能益处。
但不限于：在包含饲料添加剂组合物的材料中处理产品、通过将饲料添加剂组合物与产品
混合而直接应用、将饲料添加剂组合物喷涂至产品表面上或将产品浸入饲料添加剂组合物
的配制品中。在一个实施例中，优选地将本发明的饲料添加剂组合物与产品(例如喂养料)
混合。可替代地，喂养料的乳液或原始成分中可包括饲料添加剂组合物。对于一些应用而
言，重要的是，使组合物在待影响/处理的产品表面上可用或可用于待影响/处理的产品表
面。这允许所述组合物赋予性能益处。
[0313] 在一些方面，所述的热稳定丝氨酸蛋白酶用于食品或饲料的预处理。例如,饲料具有10％-300％的水分混合并与蛋白酶在5℃-80℃下孵育，优选地在25℃-50℃，更优选地在
30℃-45℃之间在有氧条件下孵育1分钟至72小时或在厌氧条件下孵育1天至2个月。预处理
后的材料可以直接饲喂给动物(所谓的液体饲喂)。预处理的材料也可以在升高的温度(60
℃-120℃)下蒸汽制粒。蛋白酶可以通过真空喷涂机浸渍到饲料或食品材料中。
30℃-45℃之间在有氧条件下孵育1分钟至72小时或在厌氧条件下孵育1天至2个月。预处理
后的材料可以直接饲喂给动物(所谓的液体饲喂)。预处理的材料也可以在升高的温度(60
℃-120℃)下蒸汽制粒。蛋白酶可以通过真空喷涂机浸渍到饲料或食品材料中。
[0314] 可将热稳定丝氨酸蛋白酶(或包含热稳定丝氨酸蛋白酶的组合物)和受控量的所述酶用以散布、涂布和/或浸渍产品(例如喂养料或喂养料的原材料)。
[0315] 优选地，饲料添加剂组合物将是热稳定的以便进行高至约70℃、高至约85℃、或高至约95℃的热处理。热处理可以进行长达约1分钟；长达约5分钟；长达约10分钟；长达约30分钟；长达约60分钟。术语“热稳定”意指加热至特定温度之前添加剂中存在/有活性的酶组分和/或DFM的至少约75％在冷却至室温之后仍存在/有活性。优选地，加热至特定温度之前添加剂中存在且有活性的包含一种或多种细菌菌株的蛋白酶组分和/或DFM的至少约80％在冷却至室温之后仍存在且有活性。在一个特别优选的实施例中，将饲料添加剂组合物均
化，以制成粉末。
化，以制成粉末。
[0316] 可替代地，将饲料添加剂组合物配制成如WO 2007/044968中所述的颗粒(称为TPT颗粒)，该文献通过引用并入本文。
[0317] 在另一个优选的实施例中，当将饲料添加剂组合物配制成颗粒时，这些颗粒包含喷涂在蛋白质核心上的水合屏障盐。此类的盐涂层的优点在于使耐热性改善、使储存稳定
性改善和保护免受其他原本会不利影响所述至少一种蛋白酶和/或包含一种或多种细菌菌
株的DFM的饲料添加剂的影响。优选地，用于盐涂层的盐在20℃具有大于0.25的水活度或大于60％的恒定湿度。优选地，盐涂层包含Na2SO4。
性改善和保护免受其他原本会不利影响所述至少一种蛋白酶和/或包含一种或多种细菌菌
株的DFM的饲料添加剂的影响。优选地，用于盐涂层的盐在20℃具有大于0.25的水活度或大于60％的恒定湿度。优选地，盐涂层包含Na2SO4。
[0318] 制备饲料添加剂组合物的方法也可包括将粉末制成丸粒的另外的步骤。粉末可以与本领域已知的其他组分进行混合。可强加力使粉末、或包含粉末的混合物通过模具，并将所得线料切成适宜的不同长度的丸料。
[0319] 制备热稳定丝氨酸蛋白酶(或包含热稳定丝氨酸蛋白酶的组合物)的方法还可以包括将粉末制成粒料的另外步骤。粉末可以与本领域已知的其他组分进行混合。可强加力
使粉末、或包含粉末的混合物通过模具，并将所得线料切成适宜的不同长度的丸料。
使粉末、或包含粉末的混合物通过模具，并将所得线料切成适宜的不同长度的丸料。
[0320] 任选地，制粒步骤可包括在丸粒形成之前进行的蒸汽处理或调理阶段。可将包含粉末的混合物置于调节器中，例如带有蒸汽注射的搅拌器。将混合物在达到指定温度的调
节器中加热，如从60℃-100℃，典型的温度将是70℃、80℃、85℃、90℃、或95℃。停留时间可以是从几秒钟到几分钟并且甚至几小时不等。如5秒钟、10秒钟、15秒钟、30秒钟、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟和1小时。应当理解，本文所述的热稳定丝氨酸蛋白酶(或包含热稳定丝氨酸蛋白酶的组合物)适于添加到任何适宜的饲料材料中。
节器中加热，如从60℃-100℃，典型的温度将是70℃、80℃、85℃、90℃、或95℃。停留时间可以是从几秒钟到几分钟并且甚至几小时不等。如5秒钟、10秒钟、15秒钟、30秒钟、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟和1小时。应当理解，本文所述的热稳定丝氨酸蛋白酶(或包含热稳定丝氨酸蛋白酶的组合物)适于添加到任何适宜的饲料材料中。
[0321] 技术人员应当理解，不同的动物要求不同的喂养料，甚至同一种动物也可能要求不同的喂养料，这取决于饲养所述动物的目的。
[0322] 任选地，喂养料还可含有另外的矿物质(如，例如钙)和/或另外的维生素。在一些实施例中，喂养料为玉米大豆粉混合物。
[0323] 喂养料典型地在饲料磨机中生产，在磨机中首先将原料研磨成合适的粒度，然后与适当的添加剂混合。然后，可以将喂养料生产成糊状或丸粒；后者通常涉及这样的方法，通过所述方法将温度升高至目标水平，然后使饲料通过模具从而生产出特定大小的丸粒。
让丸粒冷却。随后，可添加液体添加剂例如脂肪和酶。制备喂养料也可涉及另外的步骤，所述步骤包括制粒之前的挤出或膨化，具体是通过至少可包括使用蒸汽的适宜技术进行的挤
出或膨化。
让丸粒冷却。随后，可添加液体添加剂例如脂肪和酶。制备喂养料也可涉及另外的步骤，所述步骤包括制粒之前的挤出或膨化，具体是通过至少可包括使用蒸汽的适宜技术进行的挤
出或膨化。
[0324] 所述喂养料可为用于以下的喂养料：单胃动物，如家禽(例如肉鸡、下蛋鸡、肉用种鸡、产仔鸡、火鸡、鸭、鹅、水禽)和猪类(所有年龄类别)；反刍动物，如牛(例如奶牛或公牛(包括牛犊))、马、绵羊、宠物(例如狗、猫)或鱼(例如无胃鱼，有胃鱼，淡水鱼，如鲑鱼、鳕鱼、鳟鱼和鲤鱼(例如锦鲤鱼)，海鱼(如黑鲈)；和甲壳类动物，如虾、贻贝和扇贝)。优选地，所述喂养料用于家禽。
[0325] 所述饲料添加剂组合物和/或包含其的喂养料可以任何合适的形式使用。所述饲料添加剂组合物能以固体或液体配制品或其替代物形式使用。固体制剂的实例包括粉剂、
糊剂、大丸粒、胶囊剂、丸粒、片剂、尘剂和颗粒，其可以是可润湿的、喷雾干燥的或冷冻干燥的。液体制剂的实例包括但不限于水性、有机或水性-有机溶液、悬浮液和乳液。
糊剂、大丸粒、胶囊剂、丸粒、片剂、尘剂和颗粒，其可以是可润湿的、喷雾干燥的或冷冻干燥的。液体制剂的实例包括但不限于水性、有机或水性-有机溶液、悬浮液和乳液。
[0326] 在一些应用中，可将所述饲料添加剂组合物与饲料混合或在饮用水中施用。
[0328] 可使喂养料和/或饲料添加剂组合物与至少一种矿物质和/或至少一种维生素混合。由此衍生的组合物可在本文中称为预混物。
[0329] 在一些实施例中，基于纯酶蛋白，热稳定丝氨酸蛋白酶在喂养料中可以以1ppb(十亿分之几)到10％(w/w)的范围存在。在一些实施例中，蛋白酶在喂养料中以1-100ppm(百万分之一)的范围存在。优选剂量可以是每吨饲料产品或饲料组合物1-20g热稳定丝氨酸蛋白
酶，或在最终产品中1-20ppm热稳定丝氨酸蛋白酶的最终剂量。
酶，或在最终产品中1-20ppm热稳定丝氨酸蛋白酶的最终剂量。
[0330] 优选地，热稳定丝氨酸蛋白酶可以在喂养料中以至少约200PU/kg或至少约300PU/kg饲料或至少约400PU/kg饲料或至少约500PU/kg饲料或至少约600PU/kg饲料、或至少约
700PU/kg饲料、至少约800PU/kg饲料、至少约900PU/kg饲料、或至少约1000PU/kg饲料、或至少约1500PU/kg饲料、或至少约2000PU/kg饲料、或至少约2500PU/kg饲料、或至少约3000PU/kg饲料、或至少约3500PU/kg饲料、或至少约4000PU/kg饲料、或至少约4500PU/kg饲料、或至少约5000PU/kg饲料存在。
700PU/kg饲料、至少约800PU/kg饲料、至少约900PU/kg饲料、或至少约1000PU/kg饲料、或至少约1500PU/kg饲料、或至少约2000PU/kg饲料、或至少约2500PU/kg饲料、或至少约3000PU/kg饲料、或至少约3500PU/kg饲料、或至少约4000PU/kg饲料、或至少约4500PU/kg饲料、或至少约5000PU/kg饲料存在。
[0331] 在另一方面，热稳定丝氨酸蛋白酶可以在喂养料中以低于约60,000PU/kg饲料、或以低于约70,000PU/kg饲料、或以低于约80,000PU/kg饲料、或以低于约90,000PU/kg饲料、或以低于约100,000PU/kg饲料、或以低于约200,000PU/kg饲料、或以低于约60000PU/kg饲
料、或以低于约70000PU/kg饲料存在。
料、或以低于约70000PU/kg饲料存在。
[0332] 范围可以包括但不限于上面讨论的较低和较高范围的任何组合。
[0333] 应当理解，一个蛋白酶单位(PU)是在pH 10.0在50℃下，每分钟内从酪蛋白底物释放2.3微克酚类化合物(表示为酪氨酸等价物)的酶量。这可被称为确定1PU的测定法。
[0334] 包含热稳定丝氨酸蛋白酶和本文所述的组合物的制剂可以以任何合适的方式制备以确保所述制剂包含活性酶。此类制剂可以是液体、干粉或颗粒。优选地，所述饲料添加剂组合物呈适合于在饲料丸粒上喷雾干燥的液体形式。
[0335] 干粉或颗粒可以通过本领域技术人员已知的手段制备，例如高剪切制粒、鼓式制粒、挤出、滚圆、流化床附聚、流化床喷雾。
[0336] 本文所述的热稳定丝氨酸蛋白酶和组合物可以被包衣，例如被封装。在一个实施例中，涂层保护酶免受热影响并且可视为防热剂。
[0337] 将本文所述的饲料添加剂组合物配制成干粉或颗粒，如WO 2007/044968(称为TPT颗粒)或WO 1997/016076或WO 1992/012645中所述(所述文献各自通过引用全部并入本文
中)。
中)。
[0338] 在一个实施例中，可以将饲料添加剂组合物配制成用于饲料组合物的颗粒，所述颗粒包含：芯；活性剂；和至少一个涂层，在选自以下的一种或多种的条件后，颗粒的活性剂保持至少50％活性、至少60％活性、至少70％活性、至少80％活性：a)饲料制粒方法，b)蒸汽加热的饲料预处理方法，c)储存，d)作为未经制粒混合物中的成分储存，和e)作为包含选自以下的至少一种化合物的饲料基础混合物或饲料预混物中的成分储存：微量矿物质、有机
酸、还原糖、维生素、氯化胆碱以及产生酸性或碱性饲料基础混合物或饲料预混物的化合
物。
酸、还原糖、维生素、氯化胆碱以及产生酸性或碱性饲料基础混合物或饲料预混物的化合
物。
[0339] 关于颗粒，至少一个涂层可包含占所述颗粒的至少55％w/w的水分水合材料；和/或至少一个涂层可包含两个涂层。所述两个涂层可为水分水合涂层和防潮涂层。在一些实
施例中，所述水分水合涂层可为所述颗粒的25％w/w至60％w/w并且所述防潮涂层可为所述
颗粒的2％w/w至15％w/w。所述水分水合涂层可选自无机盐、蔗糖、淀粉和麦芽糖糊精，并且所述防潮涂层可选自聚合物、树胶、乳清和淀粉。
施例中，所述水分水合涂层可为所述颗粒的25％w/w至60％w/w并且所述防潮涂层可为所述
颗粒的2％w/w至15％w/w。所述水分水合涂层可选自无机盐、蔗糖、淀粉和麦芽糖糊精，并且所述防潮涂层可选自聚合物、树胶、乳清和淀粉。
[0340] 所述颗粒可使用饲料制粒方法制备并且所述饲料预处理方法可在70℃至95℃(如在85℃至95℃)进行长达若干分钟。
[0341] 可将饲料添加剂组合物配制成用于动物饲料的颗粒，所述颗粒包含：芯；活性剂，在储存之后以及在颗粒作为一种成分的蒸汽加热制粒方法之后，所述颗粒的活性剂保持至少80％活性；防潮涂层；和水分水合涂层，其至少为所述颗粒的25％w/w，所述颗粒在蒸汽加热制粒方法之前具有小于0.5的水活性。
[0342] 所述颗粒可具有选自聚合物和树胶的防潮涂层并且所述水分水合材料可为无机盐。所述水分水合涂层可为所述颗粒的25％w/w至45％w/w并且所述防潮涂层可为所述颗粒
的2％w/w至10％w/w。
的2％w/w至10％w/w。
[0343] 颗粒可使用蒸汽加热制丸方法制备，所述方法可在85℃至95℃进行长达若干分钟。
[0344] 可替代地，所述组合物处于适合于消耗的液体制剂中，优选地，这种液体消费品含有以下中的一种或多种：缓冲剂、盐、山梨糖醇和/或甘油。
[0345] 此外，可通过将一种或多种酶施用(例如喷涂)于载体底物(如碾碎的小麦)上来配制饲料添加剂组合物。
[0346] 在一个实施例中，饲料添加剂组合物可以被配制成预混物。仅举个实例，所述预混物可包含一种或多种饲料组分，如一种或多种矿物质和/或一种或多种维生素。
[0347] 在一个实施例中，将直接饲喂微生物(“DFM”)和/或热稳定丝氨酸蛋白酶与至少一种生理学上可接受的载体一起配制，所述载体选自以下中的至少一种：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石、PVA、山梨糖醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐及其混合物。
[0348] 在另一个实施例中，公开了水解含淀粉材料的方法，所述方法包括：
[0349] (a)使所述含淀粉材料与液体接触以形成醪液；以及
[0350] (b)通过使醪液与包含热稳定丝氨酸蛋白酶的酶混合物接触来水解醪液中的淀粉以形成液化物，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％或99％序列同一性。
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％或99％序列同一性。
[0351] 此外，所述酶混合物可以包含至少一种选自以下的酶：α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、肌醇六磷酸酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶和木聚糖酶。
[0352] 使用这些酶中任一的量范围从0.5至500微克/g饲料或进料。
[0353] α-淀粉酶(α-1,4-葡萄糖-4-葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.1.)水解淀粉内的α-1,4-糖苷键，主要是随机产生更小的分子量的葡萄糖。这些多肽主要用于淀粉加工和酒精生产。可以使用任何α-淀粉酶，例如美国专利号8,927,250和7,354,752中所述。
[0354] 淀粉葡糖苷酶催化末端1,4-连接的α-D-葡萄糖残基相继从麦芽寡糖和多糖的非还原末端的水解，并伴随β-D-葡萄糖的释放。可以使用任何淀粉葡糖苷酶。
[0355] 肌醇六磷酸酶是指能够催化植酸盐水解为(1)肌醇和/或(2)其一、二、三、四和/或五磷酸盐及(3)无机磷酸盐的蛋白质或多肽。例如，具有催化活性的酶如在酶委员会EC编号3.1.3.8或EC编号3.1.3.26中定义的。可以使用任何植酸酶，例如美国专利号8,144,046、8,
673,609和8,053,221中所述。
673,609和8,053,221中所述。
[0356] 支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)是一种特殊的葡聚糖酶，是降解支链淀粉(一种由麦芽糖单元组成的多糖聚合物，也称为α-1,4-；α-1,6-葡聚糖)的淀粉分解内切酶。因此，这是脱支酶的一个实例。支链淀粉酶又称出芽短梗霉聚糖-6-葡聚糖水解酶。支链淀粉酶通常由芽孢杆菌属物种分泌。例如，脱支芽孢杆菌(Bacillus deramificans)(美国专利号5,817,
498；1998)、嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)(欧洲专利号0 063
909)和长野芽孢杆菌(美国专利号5,055,403)。商业使用的具有支链淀粉酶活性的酶是生
产自，例如，芽孢杆菌物种(来自杜邦-杰能科公司(DuPont-Genencor)的商品名
l-100和来自诺维信公司(Novozymes)的 D2)。脱支酶的其
他实例包括但不限于来自磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、假单胞菌属物种的
异淀粉酶，以及来自结状闪烁杆菌(Fervidobacterium nodosum)的热稳定支链淀粉酶(例
如，WO 2010/76113)。来自假单胞菌属物种的异淀粉酶可作为来自麦格酶国际公司
(Megazyme International)的纯化的酶使用。可以使用任何支链淀粉酶。
498；1998)、嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)(欧洲专利号0 063
909)和长野芽孢杆菌(美国专利号5,055,403)。商业使用的具有支链淀粉酶活性的酶是生
产自，例如，芽孢杆菌物种(来自杜邦-杰能科公司(DuPont-Genencor)的商品名
l-100和来自诺维信公司(Novozymes)的 D2)。脱支酶的其
他实例包括但不限于来自磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、假单胞菌属物种的
异淀粉酶，以及来自结状闪烁杆菌(Fervidobacterium nodosum)的热稳定支链淀粉酶(例
如，WO 2010/76113)。来自假单胞菌属物种的异淀粉酶可作为来自麦格酶国际公司
(Megazyme International)的纯化的酶使用。可以使用任何支链淀粉酶。
[0357] 葡聚糖酶是分解葡聚糖的酶，是葡萄糖亚单位组成的多糖。当它们进行糖苷键的水解时，它们是水解酶。
[0358] β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)消化纤维。它有助于植物细胞壁(纤维素)的分解。
[0359] 纤维素酶是由真菌、细菌和原生动物产生的几种酶的一种，它能催化溶纤作用、纤维素和一些相关多糖的分解。这个名称也用于任何自然发生的混合物或各种此类酶的复合物，这些酶连续或协同作用以分解纤维素材料。可以使用任何纤维素酶。
[0360] 木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是向直链多糖β-1,4-木聚糖降解为木糖，其分解半纤维素(植物细胞壁的主要组分之一)的一类酶给出的名称。可以使用任何木聚糖酶。
[0361] 淀粉(Starch或amylum)是由通过糖苷键连接的大量葡萄糖单元组成的聚合碳水化合物。淀粉可以通过酸、各种酶或两者的组合水解成更简单的碳水化合物。
[0363] 可以使用任何合适的含淀粉材料。通常基于所希望的发酵产物选择起始材料。含淀粉材料的实例包括但不限于全谷物、玉米、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱(milo)、西米、木薯、树薯、高粱、稻、豌豆、菜豆或其混合物或由其衍生的淀粉、或谷类。起始材料可以是干燥固体，如但不限于如本文所述的饲料或进料的干燥固体。考虑的还有蜡质和非蜡质类型或
玉米和大麦。用于乙醇生产的含淀粉材料是玉米或小麦。最初使用湿磨、干磨或干磨方法从植物谷物收集淀粉。
玉米和大麦。用于乙醇生产的含淀粉材料是玉米或小麦。最初使用湿磨、干磨或干磨方法从植物谷物收集淀粉。
[0364] 通过本领域已知的方法还原或研磨包含植物材料的底物。植物材料可以从以下获得：小麦、玉米、黑麦、高粱(买罗高粱)、稻、粟、大麦、黑小麦、木薯(树薯)、马铃薯、甘薯、甜菜、甘蔗和豆类，如大豆和豌豆。优选的植物材料包括玉米、大麦、小麦、稻、买罗高粱及其组合。植物材料可包括杂交品种和经遗传修饰的品种(例如包含异源基因的转基因玉米、大麦或大豆)。
[0365] 含有淀粉的植物的任何部分可用于生产液化物，包括但不限于植物部分，如叶、茎、壳、外壳、块茎、穗轴、谷物等。优选的全谷物包括玉米、小麦、黑麦、大麦、高粱及其组合。
在其他实施例中，淀粉可以从分馏的谷粒谷物获得，包括纤维、胚乳和/或胚芽组分。用于分馏植物材料(如玉米和小麦)的方法是本领域已知的。在一些实施例中，可以将从不同来源
获得的植物材料(例如玉米和蜀黍或玉米和大麦)混合在一起。研磨方法是本领域熟知的，
参见The Alcohol Textbook:A Reference for the Beverage,Fuel and Industrial
Alcohol Industries[醇教科书：饮料、燃料和工业酒精行业参考]第3版.K.A.Jacques等人编辑,(1999)Nottingham University Press[诺丁汉大学出版社]。参见，第2章和第4章。
在其他实施例中，淀粉可以从分馏的谷粒谷物获得，包括纤维、胚乳和/或胚芽组分。用于分馏植物材料(如玉米和小麦)的方法是本领域已知的。在一些实施例中，可以将从不同来源
获得的植物材料(例如玉米和蜀黍或玉米和大麦)混合在一起。研磨方法是本领域熟知的，
参见The Alcohol Textbook:A Reference for the Beverage,Fuel and Industrial
Alcohol Industries[醇教科书：饮料、燃料和工业酒精行业参考]第3版.K.A.Jacques等人编辑,(1999)Nottingham University Press[诺丁汉大学出版社]。参见，第2章和第4章。
[0366] 在一些实施例中，无论是通过研磨还是其他方式还原的植物材料将与溶液组合，产生包含淀粉底物的浆料。在一些实施例中，浆料可包括来自淀粉加工的侧流，例如逆流。
在一些实施例中，浆料将包含15％-55％ds(例如，20％-50％、25％-45％、25％-40％和
20％-35％)。在一些实施例中，浆料可包含10％至60％的逆流。包含还原的植物材料的浆料可以经受液化过程，其中可以在液化步骤期间添加α淀粉酶。这导致了液化物。为了产生液化物，可以将单一或分开剂量的α淀粉酶添加到浆料中。本领域技术人员可以容易地确定用于液化过程的α淀粉酶的有效剂量。
在一些实施例中，浆料将包含15％-55％ds(例如，20％-50％、25％-45％、25％-40％和
20％-35％)。在一些实施例中，浆料可包含10％至60％的逆流。包含还原的植物材料的浆料可以经受液化过程，其中可以在液化步骤期间添加α淀粉酶。这导致了液化物。为了产生液化物，可以将单一或分开剂量的α淀粉酶添加到浆料中。本领域技术人员可以容易地确定用于液化过程的α淀粉酶的有效剂量。
[0367] 用于液化的α淀粉酶的量是有效引起大部分淀粉液化的量。在其他的实施例中，所述量有效地使得大于40％(包括50％、60％、70％、80％、90％和100％)的淀粉能够液化。在一些实施例中，范围将为0.05至50AAU/g ds(α-淀粉酶单位/克干固体(例如，饲料或进料，如玉米))，也可以为0.1至20AAU/gDS，并且也可以为1.0至10AAU/gDS。在另外的实施例中，α淀粉酶剂量范围将为0.01至10.0kg/公吨(MT)ds；也可以为0.05至5.0kg/MT ds；并且也可以为0.1至4.0kg/MT ds。
[0368] α淀粉酶可以在比还原的植物材料的颗粒状淀粉的淀粉糊化温度低0至30℃的温度下添加。这个温度可以是低于淀粉糊化温度0至25℃、0至20℃、0至15℃和0至10℃。这一具体值可变化并且取决于包含浆料的谷物的类型而变化。例如，玉米的淀粉糊化温度通常
高于黑麦或小麦的淀粉糊化温度。在一些实施例中，温度将为45℃至80℃之间、也可为50℃至75℃之间、也可为50℃至72℃之间，并且在一些实施例中，温度将低于68℃；低于65℃、低于62℃、低于60℃并且低于55℃。在其他实施例中，温度将高于40℃、高于45℃、高于50℃、以及高于55℃。在一些优选的实施例中，孵育温度将为58℃至72℃之间，并且也可以为60℃至68℃之间。
高于黑麦或小麦的淀粉糊化温度。在一些实施例中，温度将为45℃至80℃之间、也可为50℃至75℃之间、也可为50℃至72℃之间，并且在一些实施例中，温度将低于68℃；低于65℃、低于62℃、低于60℃并且低于55℃。在其他实施例中，温度将高于40℃、高于45℃、高于50℃、以及高于55℃。在一些优选的实施例中，孵育温度将为58℃至72℃之间，并且也可以为60℃至68℃之间。
[0369] 在一些实施例中，浆料将保持在约3.0至小于6.5的pH范围内、也可在4.0至小于6.2的pH范围内、也可在约4.5至小于6.0的pH范围内、并且优选地在约5.0至6.0的pH范围内(例如约5.4至5.8)，并且浆料中的研磨颗粒将与酶组合物接触持续2分钟至8小时(例如，5
分钟至3小时；15分钟至2.5小时和30分钟至2小时)的一段时间。在另外的步骤中，通过将孵育的底物暴露于升高的温度(如高于淀粉糊化温度0℃至55℃)，使得孵育的底物液化。(例
如，65℃至120℃、70℃至110℃、70℃至90℃)在约4.0至6.5的pH下，持续2分钟至8小时的一段时间(例如，2分钟至6小时、5分钟至4小时、并且优选地1小时至2小时)。在一些实施例中，可以将温度升高至约85℃-90℃之间的温度，并且可以使用单剂量的α淀粉酶。如果温度升高到90℃-105℃以上，可在温度恢复正常后添加第二剂量的α淀粉酶。在另一个实施例中，温度可以升高至约105℃和140℃之间，并且可以使用分开剂量的α淀粉酶，其中一部分在升高温度之前添加，并且另一部分在温度降低至至少低于105℃(包括低于104℃、103℃、102℃、101℃、100℃、99℃、98℃、97℃、96℃、95℃、94℃、93℃、92℃和91℃，但优选地低于90℃)之后添加。在一些实施例中，在糖化之前冷却所得的液化物。
分钟至3小时；15分钟至2.5小时和30分钟至2小时)的一段时间。在另外的步骤中，通过将孵育的底物暴露于升高的温度(如高于淀粉糊化温度0℃至55℃)，使得孵育的底物液化。(例
如，65℃至120℃、70℃至110℃、70℃至90℃)在约4.0至6.5的pH下，持续2分钟至8小时的一段时间(例如，2分钟至6小时、5分钟至4小时、并且优选地1小时至2小时)。在一些实施例中，可以将温度升高至约85℃-90℃之间的温度，并且可以使用单剂量的α淀粉酶。如果温度升高到90℃-105℃以上，可在温度恢复正常后添加第二剂量的α淀粉酶。在另一个实施例中，温度可以升高至约105℃和140℃之间，并且可以使用分开剂量的α淀粉酶，其中一部分在升高温度之前添加，并且另一部分在温度降低至至少低于105℃(包括低于104℃、103℃、102℃、101℃、100℃、99℃、98℃、97℃、96℃、95℃、94℃、93℃、92℃和91℃，但优选地低于90℃)之后添加。在一些实施例中，在糖化之前冷却所得的液化物。
[0370] 以上获得的液化物可以与葡糖淀粉酶、酸稳定的α淀粉酶和酸性真菌蛋白酶(如来自杜邦公司(DuPont)的FERMGENTM或来自CTE环球公司(CTE Global)的AP1)以单剂量或分开
剂量接触，只要维持所希望的酶的比率。因此，分开剂量意味着以所希望的比率的总剂量添加多于一个部分，包括两个部分或三个部分。在一个实施例中，总剂量的一部分在开始时添加，第二部分在所述过程中的特定时间添加。在一个实施例中，在糖化开始时(或SSF)添加至少一部分剂量以开始糖化过程。在一个实施例中，酶组合物中的每种酶可以分别添加到
液化物中，但在时间上同时或足够接近，使得维持所述活性比率。可替代地，可以在糖化和发酵中的一种或两种期间添加包含葡糖淀粉酶、酸稳定α淀粉酶和酸性真菌蛋白酶的酶共
混物组合物。葡糖淀粉酶、酸稳定α淀粉酶和酸性真菌蛋白酶的比率优选地为约1:1.5:0.1至约1:8:1，并且更优选地约1:2:0.2至1:5:0.6，如通过GAU:SSU:SAPU测量。
剂量接触，只要维持所希望的酶的比率。因此，分开剂量意味着以所希望的比率的总剂量添加多于一个部分，包括两个部分或三个部分。在一个实施例中，总剂量的一部分在开始时添加，第二部分在所述过程中的特定时间添加。在一个实施例中，在糖化开始时(或SSF)添加至少一部分剂量以开始糖化过程。在一个实施例中，酶组合物中的每种酶可以分别添加到
液化物中，但在时间上同时或足够接近，使得维持所述活性比率。可替代地，可以在糖化和发酵中的一种或两种期间添加包含葡糖淀粉酶、酸稳定α淀粉酶和酸性真菌蛋白酶的酶共
混物组合物。葡糖淀粉酶、酸稳定α淀粉酶和酸性真菌蛋白酶的比率优选地为约1:1.5:0.1至约1:8:1，并且更优选地约1:2:0.2至1:5:0.6，如通过GAU:SSU:SAPU测量。
[0371] 糖化或SSF过程通常包括添加尿素或氨作为宿主生物的氮源(例如但不限于酵母)。在商业乙醇设备中，在糖化或SSF期间氮源(如尿素)的添加典型地在200-1000ppm之
间，如至少200、300、400、500、600、700、800、900至高达1000ppm尿素。乙醇设备中的另一种富含氮源是玉米仁中存在的玉米蛋白质。当被水解成较小的片段像小肽和氨基酸时，这种
氮源可用于发酵生物体。
间，如至少200、300、400、500、600、700、800、900至高达1000ppm尿素。乙醇设备中的另一种富含氮源是玉米仁中存在的玉米蛋白质。当被水解成较小的片段像小肽和氨基酸时，这种
氮源可用于发酵生物体。
[0372] 如本文所述，令人惊讶和出乎意料地发现，当在由含淀粉材料生产发酵产物的方法的液化步骤期间存在热稳定丝氨酸蛋白酶如ME3时，在糖化或SSF过程期间添加氮源的需
求减少至少30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、
98％或99％或完全消除(100％减少)。这表明与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％或99％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶(如但不限于本文所述的ME-3)可以将
玉米蛋白质水解至使发酵生物体能够使用玉米蛋白质作为氮源的程度。因此，可以向SSF添加更少的尿素或完全不添加尿素。氮源的强烈减少或消除使得设备能够以较低的成本运
行。
求减少至少30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、
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97％、98％或99％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶(如但不限于本文所述的ME-3)可以将
玉米蛋白质水解至使发酵生物体能够使用玉米蛋白质作为氮源的程度。因此，可以向SSF添加更少的尿素或完全不添加尿素。氮源的强烈减少或消除使得设备能够以较低的成本运
行。
[0373] 此外，这表明在发酵过程中可能不需要存在除热稳定丝氨酸蛋白酶之外的蛋白酶(如但不限于本文所述的ME-3)，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
[0374] 糖化过程可持续12至120小时。然而，通常进行糖化30分钟至2小时，并且然后在发酵期间完成糖化。有时这被称为同时糖化和发酵(SSF)。糖化通常在30℃至65℃的温度下进行，并且典型地在3.0至5.0的pH，包括4.0至5.0下进行。糖化可导致可发酵糖的产生。
[0375] 在一些实施例中，可发酵糖被发酵微生物发酵。接触步骤和发酵步骤可以在相同反应容器中同时进行或顺序进行。通常，发酵过程描述于：The Alcohol Textbook[醇教科书]第3版,A Reference for the Beverage,Fuel and Industrial Alcohol Industries
[饮料、燃料和工业酒精行业参考],编辑Jacques等人,(1999)Nottingham University
Press[诺丁汉大学出版社],英国。
[饮料、燃料和工业酒精行业参考],编辑Jacques等人,(1999)Nottingham University
Press[诺丁汉大学出版社],英国。
[0376] 在一些实施例中，所述方法进一步包括在合适的发酵条件下使用可发酵糖(糊精，例如葡萄糖)作为微生物发酵中的发酵进料，以获得最终产物，如醇(例如乙醇)、有机酸(例如琥珀酸、乳酸)、糖醇(例如甘油)、抗坏血酸中间产物(例如葡糖酸盐、DKG、KLG)、氨基酸(例如赖氨酸)、蛋白质(例如抗体及其片段)。
[0377] 可发酵糖可以被酵母在15℃至40℃、20℃至38℃、并且还25℃至35℃的温度范围下发酵；pH范围为pH 3.0至6.5；还为pH 3.0至6.0；pH 3.0至5.5、pH 3.5至5.0、并且还为pH
3.5至4.5，持续5hr至120小时、优选地12至120小时、并且更优选地从24至90小时的一段时间，以产生醇产物，优选为乙醇。
3.5至4.5，持续5hr至120小时、优选地12至120小时、并且更优选地从24至90小时的一段时间，以产生醇产物，优选为乙醇。
[0378] 酵母细胞通常以每ml发酵液104至1012，并且优选地从107至1010活酵母计数的量提供。除了发酵微生物(例如酵母)营养素之外，发酵还包括任选地酸和另外的酶。在一些实施例中，除了上述原料之外，发酵培养基将含有补充物，包括但不限于维生素(例如生物素、叶酸、烟酸、核黄素)、辅因子，以及大量营养素和微量营养素和盐(例如(NH4)2SO4；K2HPO4；NaCl；MgSO4；H3BO3；ZnCl2；和CaCl2)。
[0379] 在一些优选的实施例中，碾磨的植物材料包括大麦、买罗高粱、玉米及其组合，并且接触和发酵步骤在3.5至5.5的pH范围、30℃至45℃的温度范围内、以及持续48至90小时的一段时间同时进行，其中至少50％的淀粉被溶解。
[0380] 发酵过程的一个最终产物可以是醇产物，例如乙醇。其他最终产物可以是发酵副产物，如可以用作动物饲料的干酒糟(DDG)和干酒糟加可溶物(DDGS)。
[0381] 使用本领域已知的合适的发酵微生物，发酵最终产物可包括但不限于甘油、1,3-丙二醇、葡糖酸盐、2-酮基-D-葡糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡糖酸盐、2-酮基-L-古洛糖酸、琥珀酸、乳酸、氨基酸及其衍生物。
[0382] 发酵生物体的实例是产乙醇微生物或产乙醇微生物，如表达醇脱氢酶和丙酮酸脱氢酶的产乙醇细菌，并且可以从发酵单胞菌(Zymomonas moblis)获得(参见例如USP 5,
000,000；USP 5,028,539，USP 5,424,202；USP 5,514,583和USP 5,554,520)。在另外的实施例中，产乙醇微生物表达木糖还原酶和木糖醇脱氢酶(将木糖转化为木酮糖的酶)。在另
外的实施例中，木糖异构酶用于将木糖转化为木酮糖。在特别优选的实施例中，使用能够将戊糖和己糖发酵成乙醇的微生物。例如，在一些实施例中，微生物可以是天然或非基因工程化的微生物，或者在其他实施例中，微生物可以是重组微生物。
000,000；USP 5,028,539，USP 5,424,202；USP 5,514,583和USP 5,554,520)。在另外的实施例中，产乙醇微生物表达木糖还原酶和木糖醇脱氢酶(将木糖转化为木酮糖的酶)。在另
外的实施例中，木糖异构酶用于将木糖转化为木酮糖。在特别优选的实施例中，使用能够将戊糖和己糖发酵成乙醇的微生物。例如，在一些实施例中，微生物可以是天然或非基因工程化的微生物，或者在其他实施例中，微生物可以是重组微生物。
[0383] 发酵微生物包括但不限于来自芽孢杆菌属、乳杆菌属、大肠杆菌、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)(例如檬泛菌(P.citrea))、假单胞菌属和克雷白氏杆菌属
(Klebsiella)(例如产酸克雷白氏菌(K.oxytoca))的细菌菌株。(参见例如USP 5,028,539、USP 5,424,202和WO 95/13362)。芽孢杆菌属是优选的发酵微生物。在发酵步骤中使用的发酵微生物将取决于待生产的最终产物。
(Klebsiella)(例如产酸克雷白氏菌(K.oxytoca))的细菌菌株。(参见例如USP 5,028,539、USP 5,424,202和WO 95/13362)。芽孢杆菌属是优选的发酵微生物。在发酵步骤中使用的发酵微生物将取决于待生产的最终产物。
[0384] 产生乙醇的微生物可以是真菌微生物，如木霉属、酵母、并且特别是如酿酒酵母(S.cerevisiae)(USP 4,316,956)的酵母属。各种酿酒酵母是可商购的并且这些包括但不
限于FALI(弗莱希曼酵母公司(Fleischmann’s Yeast))、SUPERSTART(奥泰公司
(Alltech))、FERMIOL(帝斯曼公司食品配料部(DSM Specialties))、(Ethanol Red，弗曼迪斯公司(Fermentis)，法国)、( Thrive，杜邦公司(DuPont))、RED STAR(乐斯
福公司(Lesaffre))以及Angel醇酵母(天使酵母公司(Angel Yeast Company)，中国)。
限于FALI(弗莱希曼酵母公司(Fleischmann’s Yeast))、SUPERSTART(奥泰公司
(Alltech))、FERMIOL(帝斯曼公司食品配料部(DSM Specialties))、(Ethanol Red，弗曼迪斯公司(Fermentis)，法国)、( Thrive，杜邦公司(DuPont))、RED STAR(乐斯
福公司(Lesaffre))以及Angel醇酵母(天使酵母公司(Angel Yeast Company)，中国)。
[0385] 例如，当乳酸是所希望的最终产物时，可以使用乳杆菌属物种(干酪乳杆菌(L.casei))；当甘油或1,3-丙二醇是所希望的最终产物时，可以使用大肠杆菌；并且当2-酮基-D-葡糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡糖酸盐和2-酮基-L-古洛糖酸是所希望的最终产物时，檬泛菌(Pantoea citrea)可用作发酵微生物。以上列举的列表仅是实例，并且本领域技术人
员将知道可以适当地用于获得所希望的最终产品的许多发酵微生物。
员将知道可以适当地用于获得所希望的最终产品的许多发酵微生物。
[0386] 产生的最终产物可以从发酵培养基中分离和/或纯化。分离和纯化方法是已知的，例如通过使培养基经受萃取、蒸馏和柱色谱。在一些实施例中，通过将培养基提交至高压液相色谱(HPLC)分析来直接鉴定最终产物。
[0387] 可以通过例如离心分离成液相和固相来分离醪液，并且回收最终产物如醇和固体。醇可以通过如蒸馏和分子筛脱水或超滤等方法回收。
[0388] 在一些实施例中，在乙醇生产方法中使用根据本发明的酶共混物或组合物将导致乙醇的产率大于8％、10％、12％、14％、16％、17％、18％、19％、20％、21％和22％(v/v)。
[0389] 任选地，在发酵之后，可以通过例如蒸馏提取醇(例如乙醇)。乙醇可用于燃料乙醇、便携式(portable)乙醇或工业乙醇。
[0390] 在另一个实施例中，公开了用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，所述方法包括：
[0391] (a)用含有热稳定丝氨酸蛋白酶的酶混合物液化含淀粉材料，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；
[0392] (b)糖化步骤(a)的产物；
[0393] (c)用合适的生物体进行发酵；以及
[0394] (d)任选地，回收步骤(c)中产生的产物。
[0395] 在另一方面，可以进行这个方法，其中步骤(b)和(c)顺序或同时进行。
[0396] 令人惊讶的是，已经发现当在发酵含淀粉材料的液化步骤期间存在热稳定丝氨酸蛋白酶如ME-3时，在糖化或SSF过程期间添加氮源的需求减少至少30％、40％、50％、60％、
65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或完全消除(100％减少)。
当同时进行步骤(b)和(c)时，通过使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19或20g热稳定丝氨酸蛋白酶/公吨(MT)含淀粉材料，氮源(如但不限于)尿素或氨的添加被消除或减少至少30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％或99％，其中使用的所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。当步骤(b)和(c)同时进行时，通过使用至少3、4、5或6g热稳定丝氨酸蛋白酶/MT干固体材料，氮源(如但不限于)尿素或氨的添加被消除或减少至少30％、40％、50％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，其中使用的所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％或99％序列同一性。据信当顺序进行步骤(b)和(c)时，可以观察到步骤(b)中氮源的类似减少或消除。
65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或完全消除(100％减少)。
当同时进行步骤(b)和(c)时，通过使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19或20g热稳定丝氨酸蛋白酶/公吨(MT)含淀粉材料，氮源(如但不限于)尿素或氨的添加被消除或减少至少30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％或99％，其中使用的所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。当步骤(b)和(c)同时进行时，通过使用至少3、4、5或6g热稳定丝氨酸蛋白酶/MT干固体材料，氮源(如但不限于)尿素或氨的添加被消除或减少至少30％、40％、50％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，其中使用的所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％或99％序列同一性。据信当顺序进行步骤(b)和(c)时，可以观察到步骤(b)中氮源的类似减少或消除。
[0397] 当步骤(b)和(c)同时进行时，通过使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20g热稳定丝氨酸蛋白酶/MT含淀粉材料，氮源(如但不限于尿素或氨)的添加被消除或减少至少30％、40％、50％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％或99％，其中使用的所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且此外当发酵产物是乙醇时，则步骤(c)中不需要酸性蛋白水解酶。
96％、97％、98％或99％，其中使用的所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且此外当发酵产物是乙醇时，则步骤(c)中不需要酸性蛋白水解酶。
[0398] 如本文所述，在由含淀粉材料生产发酵产物的方法中使用与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶，可以导致额外的益处，如粗蛋白质水平增加、酸水解脂肪水平增加、甘油水平下降(低甘油形成)、乙醇产生速度加快和乙醇产率增加。水解脂肪水平的增加表明油的回收率增加。甘油是使用一
定可用的碳的发酵的低价值副产物。甘油减少表明更有效地使用了碳，并且甘油水平降低
表明对酵母的压力较小。此外，甘油产生的任何减少都能使碳流向更高价值的产物，如乙
醇，并且可导致粘度降低。
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶，可以导致额外的益处，如粗蛋白质水平增加、酸水解脂肪水平增加、甘油水平下降(低甘油形成)、乙醇产生速度加快和乙醇产率增加。水解脂肪水平的增加表明油的回收率增加。甘油是使用一
定可用的碳的发酵的低价值副产物。甘油减少表明更有效地使用了碳，并且甘油水平降低
表明对酵母的压力较小。此外，甘油产生的任何减少都能使碳流向更高价值的产物，如乙
醇，并且可导致粘度降低。
[0399] 在一个实施例中，公开了用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，所述方法包括：
[0400] (a)用含有热稳定丝氨酸蛋白酶的酶混合物液化含淀粉材料，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；
[0401] (b)糖化步骤(a)的产物；
[0402] (c)用合适的生物体进行发酵；以及
[0403] (d)任选地，回收步骤(c)中产生的产物，
[0404] 其中，当与不包含所述热稳定丝氨酸蛋白酶的对照发酵结束时获得的材料相比时，在发酵结束时获得的材料的酸水解脂肪增加了，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID
NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
[0405] 在一个实施例中，公开了用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，所述方法包括：
[0406] (a)用含有热稳定丝氨酸蛋白酶的酶混合物液化含淀粉材料，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；
[0407] (b)糖化步骤(a)的产物；
[0408] (c)用合适的生物体进行发酵；以及
[0409] (d)任选地，回收步骤(c)中产生的产物，
[0410] 其中，当与不包含所述热稳定丝氨酸蛋白酶的对照发酵结束时获得的材料相比时，所述发酵产物(如但不限于乙醇)以更快的速率产生，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ
ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
[0411] 在一个实施例中，公开了用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，所述方法包括：
[0412] (a)用含有热稳定丝氨酸蛋白酶的酶混合物液化含淀粉材料，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；
[0413] (b)糖化步骤(a)的产物；
[0414] (c)用合适的生物体进行发酵；以及
[0415] (d)任选地，回收步骤(c)中产生的产物，
[0416] 其中，当与不包含所述热稳定丝氨酸蛋白酶的对照发酵的发酵产物产率相比时，所述发酵产物(如但不限于乙醇)产率更高，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或
10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
[0417] 在一个实施例中，公开了用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，所述方法包括：
[0418] (a)用含有热稳定丝氨酸蛋白酶的酶混合物液化含淀粉材料，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；
[0419] (b)糖化步骤(a)的产物；
[0420] (c)用合适的生物体进行发酵；以及
[0421] (d)任选地，回收步骤(c)中产生的产物，
[0422] 其中，当与不包含所述热稳定丝氨酸蛋白酶的对照发酵结束时获得的材料相比时，在发酵结束时获得的材料的甘油水平降低了，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:
3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
[0423] 下文考虑的发酵产物可包括醇类(例如乙醇、甲醇、丁醇；多元醇，如甘油、山梨糖醇和肌醇)；有机酸，如柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸、葡萄糖酸等；抗生素如青霉素和四环素；酶、维生素和激素。
[0424] 在另一个实施例中，发酵产物可以是乙醇，例如燃料乙醇；饮用乙醇，如可饮用的中性酒精；或工业乙醇或如啤酒和葡萄酒等消耗性酒精工业、乳制品工业(例如发酵乳制品)、皮革工业和烟草工业中使用的产品。啤酒类型可包含爱尔啤酒、陶特啤酒、波特啤酒、陈贮啤酒、苦啤酒、麦芽酒、发泡酒、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒或淡啤酒。当乙醇是发酵产物时，它可以用作燃料，其典型地与汽油共混。
[0425] 将淀粉加工为葡萄糖通常由两个步骤组成，并且这些步骤包括淀粉的液化和液化淀粉的糖化。另外的步骤可包括(a)当所希望的最终产物是纯化的右旋糖或果糖时的纯化
和异构化，或(b)当所希望的最终产物是例如醇(例如乙醇)时的发酵和蒸馏。
和异构化，或(b)当所希望的最终产物是例如醇(例如乙醇)时的发酵和蒸馏。
[0426] 淀粉液化步骤的目的是将淀粉聚合物颗粒的浆料转化成具有低粘度的较短链长糊精的溶液。这是方便处理淀粉转化过程中使用的工业设备的重要步骤。通常，淀粉通过使用高温和酶促生物转化而液化。例如，常见的酶促液化方法包括添加热稳定细菌α淀粉酶
(例如，来自美国丹尼斯科公司的杰能科部门(Danisco U.S.,Inc,Genencor Division)的
PRIME和 FRED、 ETHYL、 RSL、
CL、 HT-WB或者来自诺维信公司的TERMAMYL SC、TERMAMYL
SUPRA或TERMANYL 120L)至包含包括淀粉的底物的浆料中并将pH调节至5.5至6.5之间并且
温度至大于90℃。 RSL、 CL和 HT-WB可以相关的
商业剂量添加，范围为从至少0.05至5kG/公吨(MT)含淀粉材料，如至少约0.05、0.1、0.2、
0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0kG/公吨(MT)或之间的任何剂量。将淀粉液化，并且然后对酶进行糖化。典型地，糖化(在碳水化合物加工的情况下)在葡糖淀粉酶(如来自黑曲霉的葡糖淀粉酶(例如，OPTIDEX L-400、
SSF、 CS、Spirizyme Fuel、Spirizyme Achieve)的存
在下在比液化步骤的pH更酸的pH下进行。
(例如，来自美国丹尼斯科公司的杰能科部门(Danisco U.S.,Inc,Genencor Division)的
PRIME和 FRED、 ETHYL、 RSL、
CL、 HT-WB或者来自诺维信公司的TERMAMYL SC、TERMAMYL
SUPRA或TERMANYL 120L)至包含包括淀粉的底物的浆料中并将pH调节至5.5至6.5之间并且
温度至大于90℃。 RSL、 CL和 HT-WB可以相关的
商业剂量添加，范围为从至少0.05至5kG/公吨(MT)含淀粉材料，如至少约0.05、0.1、0.2、
0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0kG/公吨(MT)或之间的任何剂量。将淀粉液化，并且然后对酶进行糖化。典型地，糖化(在碳水化合物加工的情况下)在葡糖淀粉酶(如来自黑曲霉的葡糖淀粉酶(例如，OPTIDEX L-400、
SSF、 CS、Spirizyme Fuel、Spirizyme Achieve)的存
在下在比液化步骤的pH更酸的pH下进行。
[0427] 在发酵或SSF之后，可以将发酵产物从发酵培养基分离。可以蒸馏醪液(浆液)以提取所希望的发酵产物，例如乙醇。可替代地，可通过微量或膜过滤技术从培养基中提取所希望的发酵产物。也可以通过汽提或本领域熟知的其他方法回收发酵产物。
[0428] 从木质纤维素生物质生产可发酵糖需要处理生物质以从生物质的多糖中释放糖，如葡萄糖，木糖和阿拉伯糖。木质纤维素生物质可以通过本领域技术人员已知的任何方法
进行处理以在水解产物中产生可发酵糖。可以使用物理、热或化学处理或其组合对生物质
进行预处理，并且酶促糖化。热化学预处理方法包括蒸汽喷炸(steam explosion)或使生物质溶胀以释放糖的方法(参见例如WO 2010113129；WO 2010113130，两者均通过引用并入)。
也可以使用化学糖化。可以在进一步化学处理之前使用物理处理使粒度减小。化学处理包
括碱处理如用强碱(氨或NaOH)、5或酸处理(US 8545633，WO 2012103220，通过引用并入)。
进行处理以在水解产物中产生可发酵糖。可以使用物理、热或化学处理或其组合对生物质
进行预处理，并且酶促糖化。热化学预处理方法包括蒸汽喷炸(steam explosion)或使生物质溶胀以释放糖的方法(参见例如WO 2010113129；WO 2010113130，两者均通过引用并入)。
也可以使用化学糖化。可以在进一步化学处理之前使用物理处理使粒度减小。化学处理包
括碱处理如用强碱(氨或NaOH)、5或酸处理(US 8545633，WO 2012103220，通过引用并入)。
[0429] 例如，可以用氨预处理生物质(US 20080008783、US 7932063、US 7781191、US 7998713、US 7915017，所有这些都通过引用并入)。这些处理从生物质中释放聚合糖。预处理可以是低氨预处理，其中生物质与包含氨的水溶液接触以形成生物质氨水混合物，其中
氨浓度足以维持生物质-氨水混合物的碱性pH但小于相对于生物质的干重的约12％重量。
在实施例中，相对于生物质-氨水混合物的重量，生物质的干重为至少约15％重量固体，如美国专利号7,932,063中所公开的，其通过引用并入本文。
氨浓度足以维持生物质-氨水混合物的碱性pH但小于相对于生物质的干重的约12％重量。
在实施例中，相对于生物质-氨水混合物的重量，生物质的干重为至少约15％重量固体，如美国专利号7,932,063中所公开的，其通过引用并入本文。
[0430] 将聚合糖转化为单体糖的糖化可以是通过酶处理或化学处理。在合适的条件下使预处理的生物质与糖化酶聚生体20接触以产生包含可发酵糖的木质纤维素生物质水解产
物。在糖化之前，可以使经预处理的生物质达到所希望的水分含量并被处理以改变pH、组成或温度，使得糖化酶聚生体的酶将是活性的。
物。在糖化之前，可以使经预处理的生物质达到所希望的水分含量并被处理以改变pH、组成或温度，使得糖化酶聚生体的酶将是活性的。
[0431] pH可以通过添加呈固体或液体形式的酸来改变。可替代地，可以利用可从发酵回收的二氧化碳(CO2)来降低pH。例如，CO2可以从发酵罐收集并进料到闪蒸罐中的预处理产
物顶部空间中，或者如果存在足够的液体则鼓泡通过经预处理的生物质，同时30监测pH，直至达到所希望的pH。使温度达到与糖化酶活性相容的温度，如下所指出。典型地合适的条件可以包括从约40℃至约50℃的温度和在从约4.8至约5.8之间的pH。
物顶部空间中，或者如果存在足够的液体则鼓泡通过经预处理的生物质，同时30监测pH，直至达到所希望的pH。使温度达到与糖化酶活性相容的温度，如下所指出。典型地合适的条件可以包括从约40℃至约50℃的温度和在从约4.8至约5.8之间的pH。
[0432] 纤维素生物质或木质纤维素生物质的酶糖化典型地利用酶组合物或共混物来分解纤维素和/或半纤维素并产生含糖5(例如像，葡萄糖、木糖和阿拉伯糖)的水解产物。糖化酶在Lynd,L.R.等人(Microbiol.Mol.Biol.Rev.[微生物学与分子生物学综述],66:506-
577，2002)中综述。
577，2002)中综述。
[0433] 可以使用包括一种或多种糖苷酶的糖化酶共混物。糖苷酶水解二糖、低聚糖和多糖的醚键并且在通用组“水解酶”(EC 3.)的酶分类EC 3.2.1.x(Enzyme Nomenclature[酶
命名法]1992,Academic Press[学术出版社],圣地亚哥,加利福尼亚州,具有增刊1(1993)、
增刊2(1994)、增刊3(1995)、增刊4(1997)和增刊5[分别在Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学
杂志],223:1-5,1994；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志],232:1-6,1995；
Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志],237:1-5,1996；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂
志],250:1-6,1997；以及Eur.15J.Biochem.[欧洲生物化学杂志],264:610-650 1999中])
中找到。
命名法]1992,Academic Press[学术出版社],圣地亚哥,加利福尼亚州,具有增刊1(1993)、
增刊2(1994)、增刊3(1995)、增刊4(1997)和增刊5[分别在Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学
杂志],223:1-5,1994；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志],232:1-6,1995；
Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志],237:1-5,1996；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂
志],250:1-6,1997；以及Eur.15J.Biochem.[欧洲生物化学杂志],264:610-650 1999中])
中找到。
[0434] 在糖化中有用的糖苷酶可以通过它们水解的生物质组分进行分类。在糖化中有用的糖苷酶可以包括纤维素水解糖苷酶(例如，纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶，b-葡糖苷酶)、半纤维素水解糖苷酶(例如，木聚糖酶，内切木聚糖酶、外切木聚糖酶、b-木糖苷酶、阿拉伯糖-木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果胶酶、葡糖醛酸酶)和淀粉水解糖苷酶(例如，淀粉酶、a-淀粉酶、b-淀粉酶、葡糖淀粉酶、a-葡萄糖苷酶、异淀粉酶)。
此外，可能有用的是将其他活性物添加到糖化酶聚生体如肽酶(EC 3.4.x.y)、脂肪酶
(EC3.1.1.x和3.1.4.x)，木质素酶(EC 1.11.1.x)或阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)以促进从生
物质的其他组分释放多糖。本领域中已知的是，产生多糖水解酶的微生物经常表现出活性，如降解纤维素的能力，所述活性由具有不同底物特异性的若干种酶或一组酶催化。因此，来自微生物的“纤维素酶”可以包含一组酶，其中一种或多种或全部可以有助于纤维素降解活性。
此外，可能有用的是将其他活性物添加到糖化酶聚生体如肽酶(EC 3.4.x.y)、脂肪酶
(EC3.1.1.x和3.1.4.x)，木质素酶(EC 1.11.1.x)或阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)以促进从生
物质的其他组分释放多糖。本领域中已知的是，产生多糖水解酶的微生物经常表现出活性，如降解纤维素的能力，所述活性由具有不同底物特异性的若干种酶或一组酶催化。因此，来自微生物的“纤维素酶”可以包含一组酶，其中一种或多种或全部可以有助于纤维素降解活性。
[0435] 商业或非商业的酶制剂，例如纤维素酶，可以包含许多酶，这取决于获得所述酶所使用的纯化方案。对于糖化有用的许多糖基水解酶及其组合物公开在WO 2011/038019或WO 2012/125937(将其通过引用并入本文)中。用于糖化的附加酶包括例如水解在两种或更多
种碳水化合物之间或在碳水化合物与非碳水化合物部分之间的糖苷键的糖基水解酶。
种碳水化合物之间或在碳水化合物与非碳水化合物部分之间的糖苷键的糖基水解酶。
[0436] 合适的酶可包括来自糖苷水解酶家族的酶，如GH3、GH5、GH 6、GH 7、GH10、GH11、GH39、GH43、GH51和GH 61家族。GH是一组水解两个或更多个碳水化合物之间的糖苷键，或碳水化合物与非碳水化合物部分之间的糖苷键的酶。GH家族已经基于序列相似性进行了分类，并且可以在碳水化合物-活性酶(CAZy)数据库中获得(Cantarel等人(2009)Nucleic
Acids Res.[核酸研究](数据库第37期)：D233-238)。
Acids Res.[核酸研究](数据库第37期)：D233-238)。
[0437] 这些酶能够作用于许多底物并且在糖化过程中是有效的。糖苷水解酶家族3(“GH3”)酶具有许多已知活性：b-葡糖苷酶(EC:3.2.1.21)；b-木糖苷酶(EC:3.2.1.37)；N-乙酰基b-葡糖胺酶(EC:3.2.1.52)；葡聚糖b-1,3-葡糖苷酶(EC:3.2.1.58)；纤维糊精酶
(EC:3.2.1.74)；外切-1,3-1,4-葡聚糖酶(EC:3.2.1)；和b-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)。糖苷水解酶家族39(“GH39”)酶具有a-L-艾杜糖苷酸酶(EC:3.2.1.76)或b-木糖苷酶(EC:
3.2.1.37)活性。
(EC:3.2.1.74)；外切-1,3-1,4-葡聚糖酶(EC:3.2.1)；和b-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)。糖苷水解酶家族39(“GH39”)酶具有a-L-艾杜糖苷酸酶(EC:3.2.1.76)或b-木糖苷酶(EC:
3.2.1.37)活性。
[0438] 糖苷水解酶家族43(“GH43”)酶具有以下活性：L-25a-阿拉伯呋喃糖酶(EC 3.2.1.55)；b-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)；内切阿拉伯聚糖酶(EC 3.2.1.99)；和半乳聚糖1,
3-b-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.145)。糖苷水解酶家族51(“GH51”)酶具有L-a-阿拉伯呋喃糖酶(EC 3.2.1.55)或内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)活性。糖苷水解酶家族10(“GH10”)描述于例如，Schmidt等30人,1999,Biochemistry[生物化学]38:2403-2412和Lo Leggio等人,2001,
FEBS Lett[欧洲生化学会联盟通讯]509:303-308和糖苷水解酶家族11(“GH11”)更全面地
描述于Hakouvainen等人,1996,Biochemistry[生物化学]35:9617-24。合适的酶可以包括
已经重新分类为辅助活性家族9(AA9；cazypedia.org)的糖苷水解酶家族61(“GH61”)酶，并且在本文中可以称为GH61酶。如美国专利申请公开号US 2014/0106408中所述，合适的酶可包括EG4(例如来自里氏木霉及其变体，如描述于例如WO 201517256A1、WO 201517255A1、WO
201517254A1中，通过引用并入)、Fv3A、Fv51A和/或Fv43D(如来自轮枝镰孢菌(Fusarium
verticilloides)如描述于例如US 2014/016408中，通过引用并入)。合适的酶可以包括例
如以下中公开的酶：PCT申请公开号WO 03/027306、WO 200352118_A2、WO 200352054_A2、WO
200352057_A2、WO 200352055_A2、WO 200352056_A2、WO 200416760_A2、WO 9210581_A1、WO
200448592_A2、WO 200443980_A2、WO 200528636_A2、WO 200501065_A2、WO 2005/001036、WO 2005/093050、WO 200593073_A1、WO 200674005_A2、WO 2009/149202、WO 2011/038019、WO 2010/141779、WO 2011/063308、WO 2012/125951、WO 2012/125925、WO 2012125937、WO/
2011/153276、WO 2014/093275、WO 2014/070837、WO 2014/070841、WO 2014/070844、WO
2014/093281、WO 2014/093282、WO 2014/093287、WO 2014/093294、WO 2015/084596或WO
2016/069541，通过引用并入。
3-b-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.145)。糖苷水解酶家族51(“GH51”)酶具有L-a-阿拉伯呋喃糖酶(EC 3.2.1.55)或内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)活性。糖苷水解酶家族10(“GH10”)描述于例如，Schmidt等30人,1999,Biochemistry[生物化学]38:2403-2412和Lo Leggio等人,2001,
FEBS Lett[欧洲生化学会联盟通讯]509:303-308和糖苷水解酶家族11(“GH11”)更全面地
描述于Hakouvainen等人,1996,Biochemistry[生物化学]35:9617-24。合适的酶可以包括
已经重新分类为辅助活性家族9(AA9；cazypedia.org)的糖苷水解酶家族61(“GH61”)酶，并且在本文中可以称为GH61酶。如美国专利申请公开号US 2014/0106408中所述，合适的酶可包括EG4(例如来自里氏木霉及其变体，如描述于例如WO 201517256A1、WO 201517255A1、WO
201517254A1中，通过引用并入)、Fv3A、Fv51A和/或Fv43D(如来自轮枝镰孢菌(Fusarium
verticilloides)如描述于例如US 2014/016408中，通过引用并入)。合适的酶可以包括例
如以下中公开的酶：PCT申请公开号WO 03/027306、WO 200352118_A2、WO 200352054_A2、WO
200352057_A2、WO 200352055_A2、WO 200352056_A2、WO 200416760_A2、WO 9210581_A1、WO
200448592_A2、WO 200443980_A2、WO 200528636_A2、WO 200501065_A2、WO 2005/001036、WO 2005/093050、WO 200593073_A1、WO 200674005_A2、WO 2009/149202、WO 2011/038019、WO 2010/141779、WO 2011/063308、WO 2012/125951、WO 2012/125925、WO 2012125937、WO/
2011/153276、WO 2014/093275、WO 2014/070837、WO 2014/070841、WO 2014/070844、WO
2014/093281、WO 2014/093282、WO 2014/093287、WO 2014/093294、WO 2015/084596或WO
2016/069541，通过引用并入。
[0439] 糖化酶可以商购获得。此类酶包括例如， CP纤维素酶、木聚糖酶、 1500、 DUET、
TrioTM、 (来自杜邦公司)、 SSF和Novozyme-188(诺维信公司)。
SSF可以以0.06％至0.08％重量酶/重量玉米的商业相关剂量给药。所
需的实际剂量取决于发酵条件：时间、初始pH和固体水平。 CS酶可以
0.055％w/w至0.075％w/w的商业相关剂量(淀粉、干固体基础)添加。这相当于0.375至
0.50kg CS/MT谷物“原样”。可以添加额外的酶，例如但不限于海藻糖酶。
TrioTM、 (来自杜邦公司)、 SSF和Novozyme-188(诺维信公司)。
SSF可以以0.06％至0.08％重量酶/重量玉米的商业相关剂量给药。所
需的实际剂量取决于发酵条件：时间、初始pH和固体水平。 CS酶可以
0.055％w/w至0.075％w/w的商业相关剂量(淀粉、干固体基础)添加。这相当于0.375至
0.50kg CS/MT谷物“原样”。可以添加额外的酶，例如但不限于海藻糖酶。
[0440] 此外，糖化酶可以作为细胞提取物或全细胞液体培养基的粗制剂提供。可以使用已经工程化以表达一种或多种糖化酶的重组微生物来产生这些酶。例如，可用于经预处理
的木质纤维素生物质的糖化的H3A蛋白质制剂是由里氏木霉的基因工程化的菌株生产的酶
的粗制剂，其包括纤维素酶和半纤维素酶的组合并且描述于WO 2011/038019(将其通过引
用并入本文)中。
的木质纤维素生物质的糖化的H3A蛋白质制剂是由里氏木霉的基因工程化的菌株生产的酶
的粗制剂，其包括纤维素酶和半纤维素酶的组合并且描述于WO 2011/038019(将其通过引
用并入本文)中。
[0441] 应当理解，在预处理的木质纤维素生物质材料与乙酰胺酶接触的实施例中，酶可以与糖化酶聚生体一起引入或与糖化酶聚生体分开引入。
[0442] 可以使用化学糖化处理，并且其是本领域技术人员已知的，如用包括HCl和H2SO4的无机酸的处理(US 5580389、WO 2011002660，通过引用并入)。10糖如葡萄糖、木糖和阿拉伯糖通过木质纤维素生物质的糖化被释放，并且这些单体糖为在发酵方法中使用的生物催
化剂提供碳水化合物来源。这些糖存在于用作发酵培养基的生物质水解产物中。所述发酵
培养基可以仅由水解产物构成，或者可以包括除了水解产物之外的组分如山梨糖醇或甘露
糖醇，其最终浓度为约5mM，如US 7,629,156(将其通过引用并入本文)中所述。生物质水解产物可占发酵培养基的至少约50％。在实施例中，发酵液体培养基的最终体积的约10％是
含有发酵微生物的种子接种物。
化剂提供碳水化合物来源。这些糖存在于用作发酵培养基的生物质水解产物中。所述发酵
培养基可以仅由水解产物构成，或者可以包括除了水解产物之外的组分如山梨糖醇或甘露
糖醇，其最终浓度为约5mM，如US 7,629,156(将其通过引用并入本文)中所述。生物质水解产物可占发酵培养基的至少约50％。在实施例中，发酵液体培养基的最终体积的约10％是
含有发酵微生物的种子接种物。
[0443] 包含与发酵微生物接触的木质纤维素生物质水解产物的发酵培养基在发酵容器中发酵，所述发酵容器是容纳发酵培养基和至少一种生物催化剂的任何容器，并且具有用
于管理发酵过程的阀门、通风口和/或端口。利用葡萄糖并且优选木糖(天然或通过基因工
程)产生目标产物的任何微生物可用于木质纤维素生物质水解产物中可发酵糖的发酵。可
通过发酵生产的目标产物包括例如酸、醇、烷烃、烯烃、芳族化合物、醛、酮、生物聚合物、蛋白质、肽、氨基酸、维生素、抗生素和药物。醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇、丙三醇、赤藓糖醇、木糖醇、甘露糖醇和山梨糖醇。酸可以包括乙酸、甲酸、乳酸、丙酸、3-羟基丙酸、丁酸、葡萄糖酸、衣康酸、柠檬酸、琥珀酸、3-羟基丙酸、富马酸、马来酸和乙酰丙5酸。氨基酸可以包括谷氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。附加的目标产物包括甲烷、乙烯、丙酮和工业酶。
于管理发酵过程的阀门、通风口和/或端口。利用葡萄糖并且优选木糖(天然或通过基因工
程)产生目标产物的任何微生物可用于木质纤维素生物质水解产物中可发酵糖的发酵。可
通过发酵生产的目标产物包括例如酸、醇、烷烃、烯烃、芳族化合物、醛、酮、生物聚合物、蛋白质、肽、氨基酸、维生素、抗生素和药物。醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇、丙三醇、赤藓糖醇、木糖醇、甘露糖醇和山梨糖醇。酸可以包括乙酸、甲酸、乳酸、丙酸、3-羟基丙酸、丁酸、葡萄糖酸、衣康酸、柠檬酸、琥珀酸、3-羟基丙酸、富马酸、马来酸和乙酰丙5酸。氨基酸可以包括谷氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。附加的目标产物包括甲烷、乙烯、丙酮和工业酶。
[0444] 将木质纤维素生物质水解产物中的糖发酵成目标产物可以通过一种或多种适当的微生物进行，这些生物催化剂能够在含有生物质水解产物的培养基中在单步或多步发酵
中生长。合适的微生物可选自细菌、丝状真菌和酵母。合适的微生物可以是野生型微生物或重组微生物，并且可以包括例如属于埃希氏杆菌属(Escherichia)、发酵单胞菌属
(Escherichia)、酵母属、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、链霉菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属和梭状芽孢杆菌属(Clostridiuma)的15有机体。合适的微生物的典型实例包
括重组大肠杆菌、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌、酿酒酵母、热纤维梭菌(Clostridia thermocellum)、厌氧嗜热杆菌(Thermoanaerobacterium
saccharolyticum)和树干毕赤酵母(Pichia stipitis)。为了在木质纤维素生物质水解产
物发酵液体培养基中良好生长并且具有高产品产量，可以选择或工程化微生物以对存在于
生物质水解产物中的抑制剂如乙酸盐具有较高的耐受性。例如，生物催化剂可以产生乙醇
作为目标产物，如由运动发酵单胞菌产生乙醇，或由酿酒酵母产生乙醇。合适的工程化运动发酵单胞菌和酿酒酵母菌株是本领域已知的，例如US 8,247,208和US 8,669,076中所述，
两者均通过引用并入本文。
中生长。合适的微生物可选自细菌、丝状真菌和酵母。合适的微生物可以是野生型微生物或重组微生物，并且可以包括例如属于埃希氏杆菌属(Escherichia)、发酵单胞菌属
(Escherichia)、酵母属、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、链霉菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属和梭状芽孢杆菌属(Clostridiuma)的15有机体。合适的微生物的典型实例包
括重组大肠杆菌、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌、酿酒酵母、热纤维梭菌(Clostridia thermocellum)、厌氧嗜热杆菌(Thermoanaerobacterium
saccharolyticum)和树干毕赤酵母(Pichia stipitis)。为了在木质纤维素生物质水解产
物发酵液体培养基中良好生长并且具有高产品产量，可以选择或工程化微生物以对存在于
生物质水解产物中的抑制剂如乙酸盐具有较高的耐受性。例如，生物催化剂可以产生乙醇
作为目标产物，如由运动发酵单胞菌产生乙醇，或由酿酒酵母产生乙醇。合适的工程化运动发酵单胞菌和酿酒酵母菌株是本领域已知的，例如US 8,247,208和US 8,669,076中所述，
两者均通过引用并入本文。
[0445] 用对于所用的特定微生物合适的条件进行发酵。可对条件如pH、温度、氧含量和混合进行调整。酵母和细菌生物催化剂的发酵条件是本领域熟知的。此外，糖化和发酵可在同一个容器中同时发生，称为同步糖化和发酵(SSF)。此外，部分糖化可能在称为HSF(混合糖化和发酵)的方法中在同时发生的糖化和发酵期间之前发生。
[0446] 对于大规模发酵，典型地首先生长发酵微生物的较小培养物(种子培养物)。将所述种子培养物作为接种物典型地以最终体积的从约2％至约20％的范围添加到发酵培养基
中。典型地通过发酵微生物的发酵产生含有由所述发酵微生物制成的目标产物的发酵液体
培养基。例如，在乙醇方法中，发酵液体培养基可以是含有从约6％至约10％乙醇的啤酒。除目标产物外，发酵液体培养基含有来自水解产物培养基以及来自所述水解产物培养基中的
糖的生物催化剂代谢的水、溶质和固体，以及生物催化剂本身。目标产物可以从发酵液体培养基分离，产生贫化液体培养基，其可以称为全釜馏物。例如，当乙醇是产物时，典型地使用醪塔(beer column)蒸馏所述液体培养基以产生乙醇产物流和全釜馏物。蒸馏可以是使用
本领域技术人员已知的任何条件，包括在大气压或减压下。使馏出的乙醇进一步通过精馏
柱和分子筛以回收乙醇产物。
中。典型地通过发酵微生物的发酵产生含有由所述发酵微生物制成的目标产物的发酵液体
培养基。例如，在乙醇方法中，发酵液体培养基可以是含有从约6％至约10％乙醇的啤酒。除目标产物外，发酵液体培养基含有来自水解产物培养基以及来自所述水解产物培养基中的
糖的生物催化剂代谢的水、溶质和固体，以及生物催化剂本身。目标产物可以从发酵液体培养基分离，产生贫化液体培养基，其可以称为全釜馏物。例如，当乙醇是产物时，典型地使用醪塔(beer column)蒸馏所述液体培养基以产生乙醇产物流和全釜馏物。蒸馏可以是使用
本领域技术人员已知的任何条件，包括在大气压或减压下。使馏出的乙醇进一步通过精馏
柱和分子筛以回收乙醇产物。
[0447] 目标产物可以可替代地在后续步骤中除去，例如在分离发酵液体培养基后从固体或液体级分中除去。
[0448] 在液化期间可以与本文所述的热稳定丝氨酸蛋白酶一起添加α-淀粉酶。任选产生碳水化合物源的酶，如葡糖淀粉酶，和/或任选的支链淀粉酶。可以使用任何α-淀粉酶。
[0449] α-淀粉酶和支链淀粉酶如上所述。
[0450] 用于第二代生物乙醇生产的生物质需要在酶水解之前进行预处理以产生可发酵糖。生物质通常在酸性或碱性条件下在高于100℃的温度下进行预处理(DUNSON等人,
TREATMENT OF BIOMASS TO OBTAIN FERMENTABLE SUGARS[处理生物质以获得可发酵糖]
.WO 2006110901(A2)―2006-10-19)。
TREATMENT OF BIOMASS TO OBTAIN FERMENTABLE SUGARS[处理生物质以获得可发酵糖]
.WO 2006110901(A2)―2006-10-19)。
[0451] 热稳定和热活性蛋白酶像本文所述的热稳定丝氨酸蛋白酶可用于此类过程中以水解生物质中存在的任何蛋白质，以向产乙醇微生物提供氨基酸和肽营养素，并降低生物
质浆料的粘度。在碱性条件下预处理(如用稀释的铵(WO 2006110901)预处理)的生物质，特别适合用所述热稳定丝氨酸蛋白酶(由于其高pH)水解。
质浆料的粘度。在碱性条件下预处理(如用稀释的铵(WO 2006110901)预处理)的生物质，特别适合用所述热稳定丝氨酸蛋白酶(由于其高pH)水解。
[0452] 在仍另一方面，公开了用于水解木质纤维素生物质中的蛋白质的方法，所述方法包括：
[0453] (a)使所述生物质与液体接触；以及
[0454] (b)通过使生物质与包含热稳定丝氨酸蛋白酶的酶混合物接触来水解生物质中的蛋白质，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％序列同一性。
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％序列同一性。
[0455] 在另一个实施例中，公开了降低液化的含淀粉材料的粘度的方法，所述方法包括使含淀粉材料的浆料与热稳定丝氨酸蛋白酶接触，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:
3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
[0456] 在另一个实施例中，公开了从油籽作物中提取油的方法，所述方法包括：
[0457] (a)使含有油的油籽级分与水性提取剂接触以形成提取物油籽级分；以及
[0458] (b)将提取的油籽级分分离成水相、水包油乳液和不溶性相；
[0459] (c)在允许酶活性持续足以使所述水包油乳液去稳定的时间的条件下，使所述乳液与单独或与磷脂酶组合的至少一种热稳定丝氨酸蛋白酶接触，所述热稳定丝氨酸蛋白酶
与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；以及
与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；以及
[0460] (d)将步骤(c)的去稳定的乳液分离成水相、油相和不溶性相，以从所述油籽中获得油。
[0461] 此外，油籽级分可以来自大豆、玉米籽、油菜籽、棕榈仁、葵花籽、红花籽、椰子、花生、棉籽、芝麻籽、亚麻籽、罂粟籽、扁桃、榛子、核桃、月见草籽、葡萄籽、大麻籽、黑加仑籽、红树莓籽、胡萝卜籽、小茴香籽、蓝莓籽、蔓越莓籽、欧芹籽、洋葱籽、南瓜籽、杏仁、芥菜籽、亚麻籽、蓖麻籽或麻风树。
[0462] 所述油籽级分可包含可用作食物、食物成分、食物添加剂或食物补充剂的蛋白质级分。
[0463] 显然，植物源油可以通过使用本文所述的方法制备。
[0464] 此外，饲料、喂养料、饲料添加剂组合物、预混物、食物或谷物产物可包含本文所述的油。
[0465] 植物源脂质，特别是油，是用于食品加工和工业进料的脂质的主要来源。最近，植物源脂质引起人们关注并且用作燃料石化产品的替代物。植物脂质可以衍生自植物、灌木或树木的一个或多个部分。在各种植物中，根、茎、皮、叶、花、种子、果实或其他部分可以作为油的来源。这些脂质可以机械地提取(例如通过施加外部压力)、或化学地提取(例如通过有机或水性溶剂提取方法)或组合方法提取。
[0466] 从油籽植物获得的油以其在食物和食物产品中的用途以及用于肥皂、洗涤剂、洗剂、润滑剂、杀虫剂、油漆、涂料、油墨和其他工业或消费品而闻名。虽然绝大多数油籽油是用有机溶剂提取方法提取的，但现在有些油提取是通过水性提取来提取的。
[0467] 近年来已开发出用于从油籽中提取油的水性方法。参见Freitas等人,Fett/Lipid 99:333-337,1997；和Caetano等人,La Rivista Italiana Delle Sostanze Grasse[意大
利脂肪物质杂志]79:165-169,2002。Freitas和Caetano等人提供了挤出和蛋白酶处理的组
合，以在水性方法中提取油。水性方法步骤本质上比有机溶剂提取步骤更安全，并且因此，对于水性提取方法，资本设备的初始启动投资显著更少。
利脂肪物质杂志]79:165-169,2002。Freitas和Caetano等人提供了挤出和蛋白酶处理的组
合，以在水性方法中提取油。水性方法步骤本质上比有机溶剂提取步骤更安全，并且因此，对于水性提取方法，资本设备的初始启动投资显著更少。
[0468] 如本文所用的，“乳液”包含至少瞬时稳定的体系，所述体系包含至少两种彼此不完全混溶或可溶于彼此的材料的物理混合物。如本文所用的，优选的乳液当在允许不受干扰时不易分离，并且可以保持混合相当长的时间。它们优选地长时间保持稳定，如大于约1、
2、4、8、12或24小时，或甚至更长的时间。
2、4、8、12或24小时，或甚至更长的时间。
[0469] 虽然乳液体系可包含固体、液体和气体，但优选地，用于本文的乳液至少包含脂质相和水相，两者均为液态。乳液中的一相是连续的，而另一相分散于其中并且因此与前一相不连续。例如，“水包油”乳液具有分散在连续水相中的不连续相的油，而“油包水”乳液具有分散在连续脂质或油相中的不连续水相。在实际意义上，不连续相由分散在另一相中并包含在另一相中的小液滴组成。因此，不连续相有时也被称为“内部”相，并且通过类比，连续相有时被称为“外部”相。在某些情况下，乳液可以转化，即连续相和不连续相可以改变角色，例如，水包油乳液变成油包水乳液，反之亦然。
[0470] 如本文所用的术语“水包油”和“油包水”仅仅是描述性的，以帮助理解哪个相是连续的并且分散在给定的乳液体系中；这些术语并非旨在将乳液字面上限制为油和水。“水”或水相可含有一种或多种溶质，如盐，和任何数量的其他可溶性或部分可溶性化合物。类似地，“油”或脂质相可含有多种脂质或脂溶性化合物。
[0471] 如本文所用的，“油”表示在室温下保持液体的一组脂肪(或脂质)中的任何一种。如本文所用的，“植物油”表示从植物的任何组织获得的任何此类油。植物油在本文中可替代地称为“植物源油”。在某些实施例中，植物油是可食用的，而在其他实施例中，它们不一定是可食用的。一些油可以适当且安全地用于外部施用于动物如人，而其他油可以是完全
地不可食用的，并且对于外用于动物也是不安全的。尽管如此，这些油对于用于工业过程，作为润滑剂、清洁或磨光产品，或者仅仅作为制备需要脂质作为原料的其他组合物或产品
的进料是有价值的。例如，一些脂质可用作燃料或燃料补充剂。目前对生物或可再生燃料来源如可燃燃料(例如用于生物柴油的脂质)具有大量关注。
地不可食用的，并且对于外用于动物也是不安全的。尽管如此，这些油对于用于工业过程，作为润滑剂、清洁或磨光产品，或者仅仅作为制备需要脂质作为原料的其他组合物或产品
的进料是有价值的。例如，一些脂质可用作燃料或燃料补充剂。目前对生物或可再生燃料来源如可燃燃料(例如用于生物柴油的脂质)具有大量关注。
[0472] 如本文所用的“油籽”是指由植物产生的任何含有油的种子、坚果、仁等。考虑所有这些植物以及它们的种子、坚果或仁都可用于本文。例如，国家可持续农业信息服务列出了以下用于食物、专业或工业用途的油的来源：扁桃、杏仁、鳄梨、山毛榉果实、山桑子、黑加仑、琉璃苣、巴西坚果、金盏花、藏茴香籽、腰果、蓖麻籽、柑橘籽、丁香、可可、咖啡、干椰子肉(干燥的椰子)、芫荽、玉米籽、棉籽、接骨木果、月见草、葡萄籽、落花生、榛子、大麻籽、希蒙得木、亚麻籽、澳洲坚果、肉豆蔻、瓜子、芥菜籽、印楝籽、黑芝麻、肉豆蔻、棕榈仁、鸡蛋果、美洲山核桃、阿月浑子、罂粟籽、南瓜籽、油菜籽、树莓籽、辣椒、野玫瑰果、橡胶籽、红花籽、沙棘、芝麻籽、大豆、大戟、荨麻、向日葵籽、营养植物(tropho plant)、番茄籽或胡桃。还用于本文的是各种油籽和相关植物，感兴趣的是其油含量用作燃料，如“生态燃料”，生物柴油等。这些植物包括但不限于麻疯树属(jatropha)(例如麻风树(Jatropha curcas)、麻疯树(J.mahafalensis)及其栽培种)；棕榈(Elaeis guineensis)(例如油棕(Oil palm))、油桐
(Aleurites fordii)(桐油树(tung oil tree)或木油桐(wood oil tree))、蓖麻(Ricinus communis)(蓖麻子树(castor bean tree))、兰氏香脂苏木(Copaifera langsdorfii)(兰
氏香脂树(diesel tree))和水黄皮(Pongammia pinnata)(红河油树(Honge oil tree)或
水黄皮树(Pongam tree)及其栽培种))。
(Aleurites fordii)(桐油树(tung oil tree)或木油桐(wood oil tree))、蓖麻(Ricinus communis)(蓖麻子树(castor bean tree))、兰氏香脂苏木(Copaifera langsdorfii)(兰
氏香脂树(diesel tree))和水黄皮(Pongammia pinnata)(红河油树(Honge oil tree)或
水黄皮树(Pongam tree)及其栽培种))。
[0473] 如本文所用的“含有油的级分”或“含有脂质的级分”是指油籽或其一些部分或部分，与如何获得无关。在优选的实施例中，含有油的级分将包含油籽的油(或脂肪或脂质含量)的全部或至少大部分。在其他的实施例中，先前加工步骤可以在获得级分之前从油籽中去除至少一些或甚至大部分油。因此，例如，在使用大豆作为油籽来源的某些实施例中，“级分”包含大豆粉或大豆薄片。优选地，所获得的粉或薄片是“全脂”，如本领域所理解的术语。然而，这并不排除使用本文提供的方法，例如，部分脱脂的级分，如大豆粉或大豆薄片。经济因素可以提供使用含有至少大部分脂肪的级分的商业动机，但是使用包含少于全部油籽的
大部分脂肪的所公开的方法级分没有已知的技术障碍。
大部分脂肪的所公开的方法级分没有已知的技术障碍。
[0474] 对于某些实施例，含有油的级分来自食物或工业用油的主要来源。目前，优选大豆、玉米籽、棉籽、和油菜籽、以及向日葵籽、红花、亚麻籽和花生作为食物油的来源。
[0475] 如本文所用的，“水性溶剂”至少包含水。水性溶剂典型地包含其他组分，如盐、缓冲化合物、小分子等。可以存在任何数量和浓度的额外的组分，条件是水性溶剂基本上是均匀溶液或水中的悬浮液。这种水性溶剂，其中额外的组分为基本上均匀的溶液或悬浮液，为方便起见，有时在本文中称为“水性提取剂”，并将其与溶剂本身(例如，水)区分。这两个术语是如本文所定义的同义词。优选地存在的所有组分在水性提取剂或水性溶剂中都是真溶液。水性溶剂与有机溶剂的区别在于不是水作为溶剂，术语“有机溶剂”是指大多数其他有机化合物并含有碳原子的溶剂。有机溶剂比水性溶剂更具挥发性和潜在爆炸性。典型地，油的有机溶剂提取是指用于通过与有机溶剂(如正己烷或其他己烷)直接接触从油籽中去除
油的任何方法。
油的任何方法。
[0476] 如上文所述，提供了使包含油相和水相的乳液去稳定的方法或工艺。所述乳液衍生自或由从油籽中水性溶剂提取脂质产生。在允许酶活性持续足以使水包油乳液去稳定的
时间的条件下，使所述乳液与单独或与磷脂酶组合的至少一种热稳定丝氨酸蛋白酶接触，
所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
时间的条件下，使所述乳液与单独或与磷脂酶组合的至少一种热稳定丝氨酸蛋白酶接触，
所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
[0477] 在另一方面，热稳定丝氨酸蛋白酶可以与至少一种磷脂酶组合使用。虽然本文考虑使用来自任何来源如动物、植物或微生物的这些酶活性，但酶活性优选地包含来自哺乳
动物胰腺、紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber)、米曲霉或黑曲霉的磷脂酶活性。在一个实施例中，磷脂酶活性来自猪胰腺。
动物胰腺、紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber)、米曲霉或黑曲霉的磷脂酶活性。在一个实施例中，磷脂酶活性来自猪胰腺。
[0478] 水相是连续相，并且油相可以是不连续相，即乳液是水包油乳液。
[0479] 从水相中分离油的方法是本领域已知的。通常，它们涉及重力或更优选地超过重力的力，例如通过如离心的物理手段施加的力。在一个实施例中，乳液以分批处理离心。在各种实施例中，分离条件可包括在酶处理后将乳液调节至优选的温度，例如通过加热。在另一个实施例中，优选连续离心以将油与水相分离。连续过程可能优于大规模操作，并且非常适合于通过容器装满处理材料，例如，从筒仓、罐、桶等、或甚至在连接的一系列这种容器中。
[0480] 这种方法可以改善乳液中油的产率。技术人员将理解如何在各种基础上监测产率。通常，通过比较例如使用本文公开的方法的油的产率(例如，基于未处理乳液的油含量的理论最大产率的％)与不使用使乳液与酶活性接触的步骤的水性提取的产率来进行产率
比较。可以使用其他产率基础，例如，使用本文公开的方法相对于“对照”方法改善油回收率。
比较。可以使用其他产率基础，例如，使用本文公开的方法相对于“对照”方法改善油回收率。
[0481] 乳液可以与至少一种酶活性接触，所述酶活性包含单独或与磷脂酶组合的至少一种如本文所述的热稳定丝氨酸蛋白酶活性。虽然本文考虑使用来自任何来源如动物、植物
或微生物的这些酶活性，但酶活性优选地包含来自哺乳动物胰腺、紫红链霉菌
(Streptomyces violaceoruber)、米曲霉或黑曲霉的磷脂酶活性。在一个实施例中，磷脂酶活性来自猪胰腺。
或微生物的这些酶活性，但酶活性优选地包含来自哺乳动物胰腺、紫红链霉菌
(Streptomyces violaceoruber)、米曲霉或黑曲霉的磷脂酶活性。在一个实施例中，磷脂酶活性来自猪胰腺。
[0482] 根据本文公开的方法，已证明各种磷脂酶活性可用于使乳液去稳定。用于本文目的的磷脂酶包括但不限于磷脂酶A(包括A1和A2)，磷脂酶B(有时也称为溶血磷脂酶)、磷脂
酶C和磷脂酶D。磷脂酶是一类水解磷脂的酶，如磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺。在磷脂酶类
中，酶有五个主要的亚类，A1、A2、B、C和D磷脂酶。
酶C和磷脂酶D。磷脂酶是一类水解磷脂的酶，如磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺。在磷脂酶类
中，酶有五个主要的亚类，A1、A2、B、C和D磷脂酶。
[0483] A1磷脂酶(E.C.3.1.1.32)优先地水解磷脂的sn1酯键，如磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺，以产生1-溶血磷脂加羧酸。典型地，A1磷脂酶需要钙作为辅因子。A1磷脂酶通常展现出比A2磷脂酶更广泛的特异性。
[0484] A2磷脂酶(E.C.3.1.1.4)优先地水解磷脂的sn2酯键，如磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺，以产生2-溶血磷脂加羧酸。除磷脂外，A2磷脂酶对胆碱衍生物和磷脂的水解显示出一定的特异性。典型地，A2磷脂酶需要钙作为辅因子。
[0485] B磷脂酶(E.C.3.1.1.5)也称为溶血磷脂酶。它们优先地水解2-溶血磷脂的sn1酯键，以产生甘油磷脂加羧酸。B磷脂酶也会水解1-溶血磷脂的sn2酯键。
[0486] C磷脂酶(E.C.3.1.4.3)优先地水解磷脂的磷酸键，如磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺，以产生相应的二酰甘油和磷酸胆碱。除磷脂水解外，C磷脂酶也会作用于溶血磷脂。
[0487] D磷脂酶(E.C.3.1.4.4)优先地水解磷脂的磷酸键，如磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺，以产生相应的磷脂酸和胆碱。除磷脂水解外，D磷脂酶也会作用于溶血磷脂。
[0488] 磷脂酶可以单独使用或组合使用，或者可以使用相同或不同的E.C.分类以及来自相同或不同的来源的一种或多种活性的混合物。含有一种或多种磷脂酶活性的粗酶或部分
纯化的酶制剂用于在本文的一些实施例中使用。磷脂酶的商业来源也适用于本文。例如，杰能科-丹尼斯科部门(Genencor-A Danisco Division)(罗切斯特，纽约州)分别提供来自细
菌和真菌来源的 和 G999磷脂酶。磷脂酶C可商购获得，例如，购
自西格玛公司(Sigma)(圣路易，密苏里州)。
纯化的酶制剂用于在本文的一些实施例中使用。磷脂酶的商业来源也适用于本文。例如，杰能科-丹尼斯科部门(Genencor-A Danisco Division)(罗切斯特，纽约州)分别提供来自细
菌和真菌来源的 和 G999磷脂酶。磷脂酶C可商购获得，例如，购
自西格玛公司(Sigma)(圣路易，密苏里州)。
[0489] C磷脂酶(E.C.3.1.4.3)优先地水解磷脂的磷酸键，如磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺，以产生相应的二酰甘油和磷酸胆碱。除磷脂水解外，C磷脂酶也会作用于溶血磷脂。
[0490] D磷脂酶(E.C.3.1.4.4)优先地水解磷脂的磷酸键，如磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺，以产生相应的磷脂酸和胆碱。除磷脂水解外，D磷脂酶也会作用于溶血磷脂。
[0491] 含有油的油籽级分包含细胞，并且所述方法进一步包括在使含油籽级分与水性提取剂接触之前破坏细胞的步骤。目前优选的破坏细胞的方法包括施加机械力。挤出是破坏
含有油的种子中细胞的方便方法。挤出机的这种用途在本领域中是已知的，因此例如单螺
杆或双螺杆挤出机是有用的。本领域技术人员可以通过测量油回收率或产率来容易地确定
破坏油籽中细胞的参数，同时改变挤出参数，如速度、通过时间、压力、温度、pH等。除了另外的机械方法如压制、滚动、打磨、超声处理和其他的之外，破坏细胞的其他方法包括化学和/或酶处理。
含有油的种子中细胞的方便方法。挤出机的这种用途在本领域中是已知的，因此例如单螺
杆或双螺杆挤出机是有用的。本领域技术人员可以通过测量油回收率或产率来容易地确定
破坏油籽中细胞的参数，同时改变挤出参数，如速度、通过时间、压力、温度、pH等。除了另外的机械方法如压制、滚动、打磨、超声处理和其他的之外，破坏细胞的其他方法包括化学和/或酶处理。
[0492] 水包油乳液可以与酶活性接触，所述酶活性包含单独或与磷脂酶组合的至少一种热稳定的丝氨酸蛋白酶。
[0493] 所述方法可包括用于任一或两个分离步骤的离心步骤。本领域技术人员将理解使用离心分离不同密度的相，如所提供方法的乳液中存在的油相和水相。
[0494] 在分离步骤之前，可以将pH调节至约3.5至约5之间。这种调节可能有助于以各种方式使乳液去稳定。在不将所述方法限制于任何一种操作理论的情况下，pH调节可有助于
沉淀一种或多种蛋白质，所述蛋白质可能参与稳定乳液。可替代地，它们可以使减慢或防止不连续相聚结或聚集的基团上的电荷差异最小化。通过允许酶在去稳定化过程中更好地发
挥作用，pH调节也可以起作用-例如，允许酶和底物更快地缔合、增强实际催化作用、或通过帮助产物更快地扩散或离开活性位点，从而驱动底物向产物的转化。
沉淀一种或多种蛋白质，所述蛋白质可能参与稳定乳液。可替代地，它们可以使减慢或防止不连续相聚结或聚集的基团上的电荷差异最小化。通过允许酶在去稳定化过程中更好地发
挥作用，pH调节也可以起作用-例如，允许酶和底物更快地缔合、增强实际催化作用、或通过帮助产物更快地扩散或离开活性位点，从而驱动底物向产物的转化。
[0495] 可以将水包油乳液的pH调节至约3.5和约5之间。存在多种影响pH调节的方法-包括但不限于添加HCl或其他酸，包括有机酸或其盐。对于食物用途，这些酸优选地是食物成分，或通常被适当的监管机构认为可安全用于食物中。
[0496] 在一些情况下，在第一分离步骤中，水性提取剂中的至少一种磷脂酶活性或一种蛋白酶活性与水包油乳液分离。存活或共分离的酶(磷脂酶或蛋白酶)在本文中有时称为延
滞(carryover)活性。当提供合适的活性条件持续足够的时间时，水包油乳液中存在延滞活性并使所述乳液去稳定。这种最初提供足够的酶，然后采用合适的方法条件以在后续步骤
中提供延滞活性的方法可以通过允许一步添加以满足整个方法来促进油的回收。技术人员
可以容易地确定是否已将足够的酶活性带入水包油乳液中。
滞(carryover)活性。当提供合适的活性条件持续足够的时间时，水包油乳液中存在延滞活性并使所述乳液去稳定。这种最初提供足够的酶，然后采用合适的方法条件以在后续步骤
中提供延滞活性的方法可以通过允许一步添加以满足整个方法来促进油的回收。技术人员
可以容易地确定是否已将足够的酶活性带入水包油乳液中。
[0497] 油籽级分可以获得自大豆、玉米籽、油菜籽、棕榈仁、葵花籽、红花籽、椰子、花生、棉籽、芝麻籽、亚麻籽、罂粟籽、扁桃、榛子、核桃、月见草籽、葡萄籽、大麻籽、黑加仑籽、红树莓籽、胡萝卜籽、小茴香籽、蓝莓籽、蔓越莓籽、欧芹籽、洋葱籽、南瓜子、杏仁、芥菜籽、亚麻籽或蓖麻籽。如上文所讨论，被认为是对生物柴油和类似燃料相关用途有用或潜在有用的各种物种包括例如麻风树、油棕、桐油树或木油桐、蓖麻子树、兰氏香脂树、和红河油树以及任何前述物种的任何栽培种也可考虑用于本文。
[0498] 在另一方面，油籽级分包含可用作食物、食物成分、食物添加剂或食物补充剂的蛋白质级分。有时或甚至经常是油籽的蛋白质级分比油级分更有价值的情况。水性提取方法的一个预期益处是它们使提取的残余物处于天然或更具功能状态，例如，通过与水性溶剂
接触，蛋白质不会变性或会保持更大的功能性；这对食物加工商来说很有价值。无论是用作食物还是饲料或其他用途，本文提供的方法允许回收未暴露于潜在危险或有害有机溶剂的
蛋白质级分。因此，蛋白质不太可能变性，并且甚至可能在某些消费者群体中具有更好的消费者接受度。
接触，蛋白质不会变性或会保持更大的功能性；这对食物加工商来说很有价值。无论是用作食物还是饲料或其他用途，本文提供的方法允许回收未暴露于潜在危险或有害有机溶剂的
蛋白质级分。因此，蛋白质不太可能变性，并且甚至可能在某些消费者群体中具有更好的消费者接受度。
[0499] 还提供了通过本文所述方法制备的蛋白质组合物，以及包含通过本文公开的方法或过程制备的蛋白质的食物产品、消费品和工业进料。
[0500] 油籽级分可包含大豆薄片或大豆粉。油籽级分优选的是“全脂”薄片或“全脂”粉。本领域技术人员将理解，“全脂”是使用如来自大豆和玉米的油籽级分的本领域术语。全脂在某种意义上与脱脂-其中基本上所有脂质都从例如大豆薄片、大豆粉或玉米胚芽中去除
相反。本领域技术人员将理解，本文提供的方法不仅与全脂级分相容，而且与油籽的部分脱脂级分-无论是薄片、粗粉、胚芽、粉等相容。
相反。本领域技术人员将理解，本文提供的方法不仅与全脂级分相容，而且与油籽的部分脱脂级分-无论是薄片、粗粉、胚芽、粉等相容。
[0501] 与不使用使乳液与酶活性接触的步骤的水性溶剂提取相比，有可能提高来自油籽的油的产率。在更优选的实施例中，油回收率接近用有机溶剂提取获得的。
[0502] 在又另一方面，提供了植物源油，所述油通过本文所述的任何方法制备。在一个实施例中，油基本上不含蛋白质、磷脂或水性杂质。还提供了包含油的食物产物。
[0503] 在另一个实施例中，描述了用于制备麦芽汁的方法，所述方法包括：
[0504] a)使包含经研磨谷物的混合物的含淀粉材料与水和热稳定丝氨酸蛋白酶接触以形成醪液，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％或99％序列同一性；
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％或99％序列同一性；
[0505] b)缓慢地加热步骤(a)的醪液，将淀粉转化为糖；以及
[0506] c)将步骤(b)的加热的醪液分离成残余的谷物和液体麦芽汁，
[0507] 其中热稳定蛋白酶以从1-30g/吨经研磨谷物的量存在，例如至少1、2、3、4、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30g/吨经研磨谷物。
[0508] 另外，α-淀粉酶可以在步骤(a)中与热稳定丝氨酸蛋白酶一起添加。
[0509] 麦芽汁生产典型地需要使经研磨谷物的混合物与水接触，并且在本文所述的方法中，将与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶添加到醪液桶中以形成醪液。热稳定蛋白酶以从1-30g/吨经研磨谷物的量存在，
例如至少1、2、3、4、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、
26、27、28、29或30g/吨经研磨谷物。
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶添加到醪液桶中以形成醪液。热稳定蛋白酶以从1-30g/吨经研磨谷物的量存在，
例如至少1、2、3、4、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、
26、27、28、29或30g/吨经研磨谷物。
[0510] 在另一方面，α-淀粉酶可以与热稳定丝氨酸蛋白酶一起添加。
[0511] 在醪液中，存在的酶将谷物中的淀粉(长链碳水化合物)转化为较小的分子或单糖(单糖、二糖和三糖)。这种转化过程称为糖化。糖化醪制备过程的结果是富含糖的液体或
“麦芽汁”，然后滤过醪液的底部，进入称为过滤(lautering)，即分离的过程。在分离之前，可以将醪液温度升高至约75℃-78℃(称为“出醪(mashout)”)以释放更多淀粉并降低醪液
粘度。可以在谷物上撒上额外的水以提取额外的糖(称为喷射(sparging)的过程)。
“麦芽汁”，然后滤过醪液的底部，进入称为过滤(lautering)，即分离的过程。在分离之前，可以将醪液温度升高至约75℃-78℃(称为“出醪(mashout)”)以释放更多淀粉并降低醪液
粘度。可以在谷物上撒上额外的水以提取额外的糖(称为喷射(sparging)的过程)。
[0512] 可以在糖化过程期间添加蛋白酶以从麦芽汁中存在的蛋白质释放氮源。标准酿造质量控制分析包括游离氨基氮(FAN)的测试。这允许估计酵母在啤酒发酵期间可利用的细
胞生长和增殖的单个氨基酸和小肽的浓度。在酿造过程中包含非麦芽原料作为辅料增加了
对麦芽汁中较高FAN含量的要求，以确保适当的发酵过程。
胞生长和增殖的单个氨基酸和小肽的浓度。在酿造过程中包含非麦芽原料作为辅料增加了
对麦芽汁中较高FAN含量的要求，以确保适当的发酵过程。
[0513] 如本文所述，与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶(如但不限于本文所述的ME-3)促进麦芽汁中游离α-氨基氮
(FAN)的剂量依赖性产生。
(FAN)的剂量依赖性产生。
[0514] 在另一个实施例中，描述了水解至少一种食物或动物副产物的方法，所述方法包括：
[0515] (a)使所述食物或动物副产物与液体接触；以及
[0516] (b)通过与包含热稳定丝氨酸蛋白酶的酶混合物接触来水解食物或动物副产物以形成液化物，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％或99％序列同一性。
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％或99％序列同一性。
[0517] 所述食物副产物可以是选自以下的富含角蛋白的物质：羽毛、毛发和羊毛。
[0518] 蛋白质可以通过化学水解或酶水解而水解成合适长度的多肽和寡肽以及游离氨基酸。蛋白质水解产物制剂可用于人类营养(例如作为能量饮料、重量控制和运动营养产品中的成分、作为老年人和体重过轻患者的营养来源)以及可用于香料工业。蛋白质可以衍生自植物或动物。
[0519] 在许多设施中，副产物与被加工食物同时产生。处理副产物的成本可能很高，并且存在潜在的收益流。
[0520] 可用于动物食物的人类食物副产物的实例包括谷物产物(壳、麸、胚芽、谷蛋白粉、粗玉米粉和粉)；加工小麦面粉时产生的小麦粗粉；果皮、外皮、果渣、果肉、剔除品或加工供人食用的水果或蔬菜产生的其他类似物质；人类食物，如薯片、曲奇饼、面包、糕点产品和不掺入次级品的面食(可安全用作动物食物，但由于质量原因，如错误的尺寸、形状、颜色或质地对作为人类食品是不可接受的)。
[0521] 动物副产物是来自屠宰场、动物收容所、动物园和兽医的兽体和兽体的部分，以及最初不旨在供人类消费(包括餐饮业(所有来自餐馆、公共饮食业设施、中央厨房、屠宰场和家庭厨房的废食物)的动物产品。动物产品副产物的实例包括但不限于血粉(来自屠宰场操作)、家禽副产物粉、胶原蛋白和明胶(来自屠宰的家畜的经煮制的皮肤和其他部分)、羽毛(来自家禽加工)、羽毛粉(来自家禽加工)、羊毛脂(来自羊毛的清洁)、皮革、粪肥、肉和骨粉(来自动物骨和内脏的化制(rendering))等。
[0522] 本文所述的与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶可以用于从动物中去除蛋白质及用于其随后的降解或处置，如
像羽毛、皮肤、毛发和兽皮。在一些情况下，与在滚烫的水或去毛方法中的传统浸泡相比，将动物尸体浸泡在包含本文所述的热稳定丝氨酸蛋白酶的溶液中可以起到保护皮肤免受损
伤的作用。在一个实施例中，羽毛可以在适合于消化或引发羽毛退化的条件下用本文所述
的热稳定丝氨酸蛋白酶进行喷雾。在一些实施例中，所述变体可以与氧化剂组合使用。
像羽毛、皮肤、毛发和兽皮。在一些情况下，与在滚烫的水或去毛方法中的传统浸泡相比，将动物尸体浸泡在包含本文所述的热稳定丝氨酸蛋白酶的溶液中可以起到保护皮肤免受损
伤的作用。在一个实施例中，羽毛可以在适合于消化或引发羽毛退化的条件下用本文所述
的热稳定丝氨酸蛋白酶进行喷雾。在一些实施例中，所述变体可以与氧化剂组合使用。
[0523] 在一些实施例中，通过使用热稳定丝氨酸蛋白酶，可以辅助与未加工的羽毛相关的油或脂肪的去除，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与本文所述的SEQ ID NO:3、8或10具有至少
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施例中，将本文所述的一种或多种ME-3(热稳定丝氨酸蛋白酶)同源物和/或变体在用于清洁羽毛的组合物中使用，并且用来对纤
维进行消毒和部分脱水。在又其他实施例中，本文所述的与SEQ ID NO:3、8或10具有至少
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶用于从羽毛回收蛋白质。
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施例中，将本文所述的一种或多种ME-3(热稳定丝氨酸蛋白酶)同源物和/或变体在用于清洁羽毛的组合物中使用，并且用来对纤
维进行消毒和部分脱水。在又其他实施例中，本文所述的与SEQ ID NO:3、8或10具有至少
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶用于从羽毛回收蛋白质。
[0524] 本文公开的组合物和方法的非限制性实例包括：
[0525] 1.一种用于生产热稳定丝氨酸蛋白酶的方法，所述方法包括：
[0526] (a)用编码热稳定丝氨酸蛋白酶的重组构建体转化生产宿主，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；以及[0527] (b)在37.5℃以上的温度下培养步骤(a)的生产宿主，以提高所述热稳定丝氨酸蛋
白酶的表达水平。
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；以及[0527] (b)在37.5℃以上的温度下培养步骤(a)的生产宿主，以提高所述热稳定丝氨酸蛋
白酶的表达水平。
[0528] 2.根据实施例1所述的方法，其中任选地从所述生产宿主回收所述热稳定丝氨酸蛋白酶。
[0529] 3.一种含有热稳定丝氨酸蛋白酶的培养物上清液，所述培养物上清液通过实施例1或2所述的方法获得。
[0530] 4.一种包含与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白的饲料、喂养料、饲料添加剂组合物、预混物、食物或谷物产物，其中所述热稳定丝氨酸蛋白酶可以单独使用或与至少一种直接饲喂微生物组合使用。
[0531] 5.一种包含与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶的动物饲料，其中所述热稳定蛋白酶以从1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20g/吨饲料的量存在，并且进一步其中所述热稳定丝氨酸蛋白酶可以单独使用或与至少一种直接饲喂微生物组合使用。
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20g/吨饲料的量存在，并且进一步其中所述热稳定丝氨酸蛋白酶可以单独使用或与至少一种直接饲喂微生物组合使用。
[0532] 6.用于在动物饲料中使用的根据实施例4所述的饲料添加剂组合物进一步包含10和至少一种选自以下的组分：蛋白质、肽、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘油、丙二醇、氯化钠、硫酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、甲酸钠、山梨酸钠、氯化钾、硫酸钾、乙酸钾、柠檬酸钾、甲酸钾、乙酸钾、山梨酸钾、氯化镁、硫酸镁、乙酸镁、柠檬酸镁、甲酸镁、山梨酸镁、焦亚硫酸钠、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。
[0533] 7.一种包含与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶的用于在动物饲料中使用的颗粒状饲料添加剂组合物，所述热
稳定丝氨酸蛋白酶可以单独使用或与至少一种直接饲喂微生物组合使用，其中所述颗粒状
饲料添加剂组合物包含通过选自以下的方法产生的颗粒：高剪切制粒、鼓式制粒、挤出、滚圆、流化床附聚、流化床喷涂、喷雾干燥、冷冻干燥、造粒、喷雾冷却、旋转式圆盘雾化、凝聚、压片或上述方法的任何组合。
稳定丝氨酸蛋白酶可以单独使用或与至少一种直接饲喂微生物组合使用，其中所述颗粒状
饲料添加剂组合物包含通过选自以下的方法产生的颗粒：高剪切制粒、鼓式制粒、挤出、滚圆、流化床附聚、流化床喷涂、喷雾干燥、冷冻干燥、造粒、喷雾冷却、旋转式圆盘雾化、凝聚、压片或上述方法的任何组合。
[0534] 8.一种根据实施例7所述的颗粒状饲料添加剂组合物，其中所述颗粒的平均直径大于50微米并且小于2000微米
[0535] 9.根据实施例7所述的饲料添加剂组合物，其中所述组合物呈液体形式。
[0536] 10.根据实施例9所述的饲料添加剂组合物，其中所述组合物呈适合于在饲料丸粒上喷雾干燥的液体形式。
[0537] 11.一种用于水解含淀粉材料的方法，所述方法包括：
[0538] (a)使含淀粉材料与液体接触以形成醪液；以及
[0539] (b)通过使醪液与包含热稳定丝氨酸蛋白酶的酶混合物接触来水解醪液中的淀粉以形成液化物，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％或99％序列同一性。
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％或99％序列同一性。
[0540] 12.根据实施例11所述的方法，其中所述酶混合物进一步包含至少一种选自以下的酶：α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、肌醇六磷酸酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶和木聚糖酶。
[0541] 13.一种用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，所述方法包括：
[0542] (a)用含有热稳定丝氨酸蛋白酶的酶混合物液化含淀粉材料，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；
[0543] (b)糖化步骤(a)的产物；
[0544] (c)用合适的生物体进行发酵；以及
[0545] (d)任选地，回收步骤(c)中产生的产物。
[0546] 13b.根据实施例13所述的方法，其中步骤(b)和(c)顺序进行。
[0547] 14.根据实施例13所述的方法，其中步骤(b)和(c)同时进行。
[0548] 15.根据实施例13或实施例14所述的方法，其中通过使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20g与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶/MT含淀粉材料，氮源(如但不限于尿素或氨)的添加被消除或减少
至少30％、40％、50％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
至少30％、40％、50％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
[0549] 15b.根据实施例13或实施例14所述的方法，其中通过使用至少3、4、5或6g与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶/MT干固体，氮源的添加被消除或减少至少30％、40％、50％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％或99％。
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶/MT干固体，氮源的添加被消除或减少至少30％、40％、50％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％或99％。
[0550] 15c.根据实施例1b5所述的方法，其中所述氮源选自由尿素和氨组成的组。
[0551] 15d.根据实施例13或实施例14所述的方法，其中当与不包含所述热稳定丝氨酸蛋白酶的对照发酵结束时获得的材料相比时，在发酵结束时获得的材料的酸水解脂肪的水平
增加了，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％序列同一性。
增加了，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％序列同一性。
[0552] 15e.根据实施例13或实施例14所述的方法，其中当与不包含所述热稳定丝氨酸蛋白酶的对照发酵相比时，所述发酵产物(如但不限于乙醇)以更快的速率产生，所述热稳定
丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
[0553] 15f.根据实施例13或实施例14所述的方法，其中当与不包含所述热稳定丝氨酸蛋白酶的对照发酵的发酵产物产率相比时，所述发酵产物(如但不限于乙醇)产率更高，所述
热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
[0554] 15h.根据实施例13或实施例14所述的方法，其中当与不包含所述热稳定丝氨酸蛋白酶的对照发酵结束时获得的材料相比时，在发酵结束时获得的材料的甘油的水平降低
了，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
了，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
[0555] 16.根据实施例15所述的方法，其中当使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20g与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶/MT含淀粉材料时，当发酵产物是乙醇时，则步骤(c)中不
需要酸性蛋白水解酶。
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的热稳定丝氨酸蛋白酶/MT含淀粉材料时，当发酵产物是乙醇时，则步骤(c)中不
需要酸性蛋白水解酶。
[0556] 17.一种降低液化的含淀粉材料的粘度的方法，所述方法包括使含淀粉材料的浆料与热稳定丝氨酸蛋白酶接触，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
[0557] 18.一种从油籽作物中提取油的方法，所述方法包括：
[0558] (a)使含有油的油籽级分与水性提取剂接触以形成提取物油籽级分；以及
[0559] (b)将提取的油籽级分分离成水相、水包油乳液和不溶性相；
[0560] (c)在允许酶活性持续足以使所述水包油乳液去稳定的时间的条件下，单独或至少与磷脂酶组合，使水包油乳液与至少一种热稳定丝氨酸蛋白酶接触，所述热稳定丝氨酸
蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；以及[0561] (d)将步骤(c)的去稳定的乳液分离成水相、油相和不溶性相，以从所述油籽中获
得油。
蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；以及[0561] (d)将步骤(c)的去稳定的乳液分离成水相、油相和不溶性相，以从所述油籽中获
得油。
[0562] 19.根据实施例19所述的方法，其中所述油籽级分来自大豆、玉米籽、油菜籽、棕榈仁、葵花籽、红花籽、椰子、花生、棉籽、芝麻籽、亚麻籽、罂粟籽、扁桃、榛子、核桃、月见草籽、葡萄籽、大麻籽、黑加仑籽、红树莓籽、胡萝卜籽、小茴香籽、蓝莓籽、蔓越莓籽、欧芹籽、洋葱籽、南瓜籽、杏仁、芥菜籽、亚麻籽、蓖麻籽或麻风树。
[0563] 20.根据实施例18所述的方法，其中所述油籽级分包含可用作食物、食物成分、食物添加剂或食物补充剂的蛋白质级分。
[0564] 21.一种植物源油，其根据实施例18所述的方法制备。
[0565] 22.一种饲料、喂养料、饲料添加剂组合物、预混物、食物或谷物产物，其包含根据实施例21所述的油。
[0566] 23.一种用于制备麦芽汁的方法，所述方法包括：
[0567] a)使包含经研磨谷物的混合物的含淀粉材料与水和热稳定丝氨酸蛋白酶接触以形成醪液，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％或99％序列同一性；
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％或99％序列同一性；
[0568] b)缓慢地加热步骤(a)的醪液，将淀粉转化为糖；以及
[0569] c)将步骤(b)的加热的醪液分离成残余的谷物和液体麦芽汁
[0570] 其中所述热稳定蛋白酶以从1-30g/吨经研磨谷物的量存在。
[0571] 24.根据实施例23所述的方法，其中在步骤(a)中与所述热稳定丝氨酸蛋白酶一起添加至少一种α-淀粉酶。
[0572] 25.一种用于水解至少一种食物或动物副产物的方法，所述方法包括：
[0573] (a)使所述食物或动物副产物与液体接触；以及
[0574] (b)通过与包含热稳定丝氨酸蛋白酶的酶混合物接触来水解醪液中的食物或动物副产物以形成液化物，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％序列同一性。
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％序列同一性。
[0575] 26.根据实施例25所述的方法，其中所述食物副产物是选自以下的富含角蛋白的物质：羽毛、毛发和羊毛。
[0576] 27.一种用于水解木质纤维素生物质中的蛋白质的方法，所述方法包括：
[0577] (a)使所述生物质与液体接触；以及
[0578] (b)通过使生物质与包含热稳定丝氨酸蛋白酶的酶混合物接触来水解生物质中的蛋白质，所述热稳定丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:3、8或10具有至少80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％序列同一性。
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％序列同一性。
[0579] 实例
[0580] 除非在本文中另有定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。Singleton等人，DICTIONARY OF
MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY[微生物学和分子生物学词典],第2版,John Wiley
and Sons[约翰威利父子公司],纽约(1994),以及Hale和Marham，THE HARPER COLLINS
DICTIONARY OF BIOLOGY[哈珀柯林斯生物学词典],Harper Perennial[哈珀永久出版社],
纽约州(1991)为技术人员提供了本公开中所使用的许多术语的通用词典。
MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY[微生物学和分子生物学词典],第2版,John Wiley
and Sons[约翰威利父子公司],纽约(1994),以及Hale和Marham，THE HARPER COLLINS
DICTIONARY OF BIOLOGY[哈珀柯林斯生物学词典],Harper Perennial[哈珀永久出版社],
纽约州(1991)为技术人员提供了本公开中所使用的许多术语的通用词典。
[0581] 本公开在下面的实例中进一步定义。应当理解，这些实例尽管说明了某些实施例，但仅以示例的方式给出。从以上的讨论和所述实例中，本领域的技术人员能够确定本公开的本质特性，并且在不脱离本公开的实质和范围的情况下，可进行各种变化和修改以使其
适应各种用途和条件。
适应各种用途和条件。
[0582] 实例1
[0583] 热裂纤维素溶解酶(Thermobifida cellulosilytica)DSM 44535丝氨酸蛋白酶ME-3
[0584] 选择从莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心(Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)(布伦瑞
克(Braunschweig)，德国)获得的细菌菌株热裂纤维素溶解酶DSM 44535作为可用于多种工
业应用的酶的潜在来源。通过合成技术使用 测序对菌株的整个基因组进
行测序。基因组测序和序列数据的集合由碱基清理(BaseClear)(莱顿市(Leiden)，荷兰)进行。重叠群通过BioXpr(那慕尔(Namur)，比利时)进行注释。
克(Braunschweig)，德国)获得的细菌菌株热裂纤维素溶解酶DSM 44535作为可用于多种工
业应用的酶的潜在来源。通过合成技术使用 测序对菌株的整个基因组进
行测序。基因组测序和序列数据的集合由碱基清理(BaseClear)(莱顿市(Leiden)，荷兰)进行。重叠群通过BioXpr(那慕尔(Namur)，比利时)进行注释。
[0585] 在热裂纤维素溶解酶DSM 44535，Tce01961n(SEQ ID NO:1)中以这种方式鉴定的基因之一编码蛋白酶，所述蛋白酶命名为ME-3，显示与其他细菌的丝氨酸蛋白酶同源。编码蛋白酶ME-3的Tce01961n的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中所示。由Tce01961n编码的ME-3前
酶原的氨基酸序列如SEQ ID NO:2中所示。在N-末端，如使用SignalP(Emanuelsson等人
(2007)Nature Protocols[自然试验方案],2:953-971)所确定的，ME-3前酶原具有预测长
度为27个残基(在SEQ ID NO:2中的氨基酸1-27)的信号肽。信号肽序列的存在表明所述丝
氨酸蛋白酶是分泌的酶。与其他丝氨酸蛋白酶一样，所述酶具有前序列，预测长度为162个残基(SEQ ID NO:2中的氨基酸28-189)。前序列预测基于对同源蛋白酶如纤维单胞菌蛋白
酶(Cellulomonadin)(Shaw等人,(2007)Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst
Commun[晶体学报第F节结构生物学与结晶通讯]63:266-269)和褐色嗜热裂孢菌
(Thermobifida fusca)蛋白酶A(Kelch BA&Agard DA(2007)J Mol Biol.[分子生物学杂
志]370:784-795)中原成熟连接的知识。
酶原的氨基酸序列如SEQ ID NO:2中所示。在N-末端，如使用SignalP(Emanuelsson等人
(2007)Nature Protocols[自然试验方案],2:953-971)所确定的，ME-3前酶原具有预测长
度为27个残基(在SEQ ID NO:2中的氨基酸1-27)的信号肽。信号肽序列的存在表明所述丝
氨酸蛋白酶是分泌的酶。与其他丝氨酸蛋白酶一样，所述酶具有前序列，预测长度为162个残基(SEQ ID NO:2中的氨基酸28-189)。前序列预测基于对同源蛋白酶如纤维单胞菌蛋白
酶(Cellulomonadin)(Shaw等人,(2007)Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst
Commun[晶体学报第F节结构生物学与结晶通讯]63:266-269)和褐色嗜热裂孢菌
(Thermobifida fusca)蛋白酶A(Kelch BA&Agard DA(2007)J Mol Biol.[分子生物学杂
志]370:784-795)中原成熟连接的知识。
[0586] 完全加工的成熟酶ME-3(186个氨基酸)的氨基酸序列描述于SEQ ID NO:3中。
[0587] 实例2
[0588] ME-3蛋白酶的异源表达
[0589] 使用由枯草芽孢杆菌aprE启动子、经修饰的枯草芽孢杆菌aprE信号肽序列、编码ME-3蛋白酶的原成熟序列的密码子优化的序列、和BPN’终止子组成的表达盒，在枯草芽孢杆菌中产生ME-3蛋白酶。
[0590] 与编码ME-3蛋白酶的原成熟序列的密码子优化的DNA序列融合的修饰的aprE信号肽序列的序列描述于SEQ ID NO:4中。将ME-3表达盒克隆到pHYT复制穿梭载体中并转化到
合适的枯草芽孢杆菌菌株中。
合适的枯草芽孢杆菌菌株中。
[0591] 通过使用BstEII和EcoRI位点(终止子序列如SEQ ID NO:5中所示)在四环素抗性基因之后添加终止子，从pHY300PLK(宝生物工程株式会社)获得了pHYT载体。还使用克隆到BamHI和HindIII位点的接头(接头序列如SEQ ID NO:6中所示)除去pHY300PLK中的HindIII
位点。图1中示出了用于表达ME-3蛋白酶的pHYT载体(pHYT-Tce01961)的图谱。
位点。图1中示出了用于表达ME-3蛋白酶的pHYT载体(pHYT-Tce01961)的图谱。
[0592] 为了产生ME-3蛋白酶，用含有pHYT-Tce01961的枯草芽孢杆菌转化体接种在每个孔中含有150μL大豆胰蛋白胨肉汤(TBS)+15ppm四环素的96孔盘。将96孔盘在37℃，200rpm下在振荡孵育器中孵育过夜。将30μL这种过夜(预)培养物添加到含有3mL富集的半定义培
养基(基于MOP缓冲液，以尿素作为主要氮源，葡萄糖作为主要碳源，并且补充有1％大豆蛋白胨)的24孔盘中的孔中，所述培养基补充有5mM CaCl2和25ppm四环素。将24孔盘在32℃，
200rpm孵育48小时。
养基(基于MOP缓冲液，以尿素作为主要氮源，葡萄糖作为主要碳源，并且补充有1％大豆蛋白胨)的24孔盘中的孔中，所述培养基补充有5mM CaCl2和25ppm四环素。将24孔盘在32℃，
200rpm孵育48小时。
[0593] 通过以4500rpm离心20分钟收获培养物。将得到的上清液通过0.22μm过滤器过滤，以产生无细胞上清液。上清液含有ME-3蛋白酶(通过SDS-PAGE确认)，所述级分进一步用于测定，并且在一些情况下如下所述进一步纯化。
[0594] 通过将无细胞上清液在70℃下在水浴中孵育1小时来纯化ME-3蛋白酶。
[0595] 将孵育的上清液在5100g离心10分钟，并且随后通过0.22um过滤器过滤。添加0.02％叠氮化物，并使用10.000MWCO的Viva旋转20ml超滤管(赛多利斯(Sartorius))缓冲
交换所述样品。进行离心至原始体积的5％-10％，并且添加pH 7.0的25mM HEPES缓冲液、
1mM CaCl2、0.02％叠氮化物至20mL的最终体积。将此步骤重复3次，并且最后从超滤管中回收样品，并且添加pH 7.0的25mM HEPES缓冲液、1mM CaCl2、0.02％叠氮化物，以获得所希望的最终体积。
交换所述样品。进行离心至原始体积的5％-10％，并且添加pH 7.0的25mM HEPES缓冲液、
1mM CaCl2、0.02％叠氮化物至20mL的最终体积。将此步骤重复3次，并且最后从超滤管中回收样品，并且添加pH 7.0的25mM HEPES缓冲液、1mM CaCl2、0.02％叠氮化物，以获得所希望的最终体积。
[0596] 评估温度对ME-3蛋白酶表达的影响。将含有ME-3表达盒的枯草芽孢杆菌菌株在抗生素选择下在2mL LB肉汤中于37℃培养8小时。将100μL这种预培养物的等分试样添加到含有10mL补充有抗生素的富含半定义培养基(基于MOP缓冲液，以尿素作为主要氮源，葡萄糖
作为主要碳源，并且补充有1％大豆蛋白胨)的125mL带挡板的烧瓶中。随着在250rpm下的持续转动混合，将烧瓶在37℃或42℃下孵育2天。通过离心(20,000g持续1min)回收培养物上
清液，并且用于使用如下文实例3中所述的Suc-AAPF-pNA底物定量ME-3蛋白酶。
作为主要碳源，并且补充有1％大豆蛋白胨)的125mL带挡板的烧瓶中。随着在250rpm下的持续转动混合，将烧瓶在37℃或42℃下孵育2天。通过离心(20,000g持续1min)回收培养物上
清液，并且用于使用如下文实例3中所述的Suc-AAPF-pNA底物定量ME-3蛋白酶。
[0597] 使用标准曲线计算ME-3蛋白酶的浓度，所述曲线是使用纯化的酶产生的。来自在37℃和42℃下生长的培养物的ME-3蛋白酶(3个重复)的平均产率报告于下表1中。如所示出
的，当细胞在42℃生长时，与37℃相比，获得了增加大约50％的ME-3蛋白酶产率。
的，当细胞在42℃生长时，与37℃相比，获得了增加大约50％的ME-3蛋白酶产率。
[0598]
[0599] 实例3
[0600] 体外ME-3蛋白酶活性
[0601] 胃蛋白酶和胰酶存在下ME-3对玉米大豆饲料的影响
[0602] 1.玉米大豆饲料的酶处理
[0603] 将玉米大豆饲料面粉(组合物示出于表2)筛分至小于212μm的粒度，并且悬浮在水中至10％(w/w)浆液，并且将pH调节至pH 3。将138μL此浆液添加到96MTP孔板中的每个孔
中。添加pH 3的在50mM的乙酸盐中制备的ME-3蛋白酶的20μL样品，然后添加10μL猪胃蛋白酶(西格玛公司，P7000，在水中以800U/mL制备)。在iEMS微板摇床孵育器(iEMS)中(以
1150rpm)，在40℃下将板孵育45min。然后添加34μL猪胰酶(西格玛公司P7545，在1M碳酸氢钠中制备为0.463mg/mL)，并且在iEMS(以1150rpm)中在40℃下将板孵育60分钟。然后在5
℃、4000rpm下将板离心15min，将20μL上清液转移至在每个孔中含有180μL水的新板(康宁(corning)板#3641未结合)以进行10x稀释。
中。添加pH 3的在50mM的乙酸盐中制备的ME-3蛋白酶的20μL样品，然后添加10μL猪胃蛋白酶(西格玛公司，P7000，在水中以800U/mL制备)。在iEMS微板摇床孵育器(iEMS)中(以
1150rpm)，在40℃下将板孵育45min。然后添加34μL猪胰酶(西格玛公司P7545，在1M碳酸氢钠中制备为0.463mg/mL)，并且在iEMS(以1150rpm)中在40℃下将板孵育60分钟。然后在5
℃、4000rpm下将板离心15min，将20μL上清液转移至在每个孔中含有180μL水的新板(康宁(corning)板#3641未结合)以进行10x稀释。
[0604] 2.蛋白质水解度测量
[0605] 蛋白质水解度(DH)基于伯胺基团与邻苯二醛的反应(OPA测定)，如由P.M.Nielsen,D.Petersen和C.Dambmann.Improved Method for Determining Food
Protein Degree of Hydrolysis[用于确定食品蛋白质水解度的改善的方法].Journal of
Food Science[食品科学杂志].66(2001)642-646描述的。此OPA测定用于确定水解程度。
Protein Degree of Hydrolysis[用于确定食品蛋白质水解度的改善的方法].Journal of
Food Science[食品科学杂志].66(2001)642-646描述的。此OPA测定用于确定水解程度。
[0606] 3.在溶液中使用AAPF底物测量催化活性
[0607] 为了测量蛋白酶的催化活性，使用底物Suc-AAPF-pNA(西格玛公司，S-7388)。如下进行活性测量：将含有酶的5μL上清液、50μL 0.2M Mes-NaOH(pH6.0)、50μL水或55μL水(空白)、5μL Suc-AAPF-pNA(20mg/mL)添加到96孔微板(Costar 3695，康宁公司，纽约州，美国)的半底部区中。在410nm处跟踪水解程度长达20min。
[0608] 4.饲料提取物的催化活性测量
[0609] 对于进料制粒过程中ME-3回收的测定，在测定之前，使用具有粒度<0.75μm选择的Perten实验室研磨机碾磨饲料样品。将5克碾磨的饲料溶解在50mL含有1％(w/v)SDS的pH 10的0.1M Tris溶液中，并且离心。过滤上清液，并且使用上述AAPF-pNA底物和方法检测蛋白酶活性。示于表2的玉米大豆饲料的组成源自以下参考文献：Interactions of phytate and myo-inositol phosphate esters(IP1-5)including IP5isomers with dietary
protein and iron and inhibition of pepsin.[植酸盐和包括IP5异构体的肌醇磷酸酯
(IP1-5)与膳食蛋白质和铁的相互作用以及胃蛋白酶的抑制]S.Yu,A.Cowieson,C.Gilbert,
P.Plumstead和S.Dalsgaard.J.Anim.Sci.[动物科学杂志]90(2012)1824-1832,补充信息。
protein and iron and inhibition of pepsin.[植酸盐和包括IP5异构体的肌醇磷酸酯
(IP1-5)与膳食蛋白质和铁的相互作用以及胃蛋白酶的抑制]S.Yu,A.Cowieson,C.Gilbert,
P.Plumstead和S.Dalsgaard.J.Anim.Sci.[动物科学杂志]90(2012)1824-1832,补充信息。
[0610]
[0611] 在胃蛋白酶和胰酶的存在下，以不同浓度(500、1000、1500ppm)的ME-3蛋白酶进行的玉米大豆饲料处理的结果如下图2所示。
[0612] 实例4
[0613] ME-3蛋白酶在各种pH下的热稳定性
[0614] 将等分试样的ME-3蛋白酶在含有5mM CaCl2和0.005％Triton X-100的pH10的0.1M Tris中在96孔MTP板中在72℃至95℃的温度下孵育60秒。将板冷却至4℃，并使用实例
3所述的方法，使用AAPF-pNA底物在37℃下测量催化活性。结果示出于表3中。从图3中可以看出，ME-3在pH 10下在90℃保持约80％的活性。在其他实验中，未检测到EDTA的影响(未呈现数据)。还使用0.1M乙酸盐在pH 4.5和pH 5.5下测量ME-3的热稳定性。发现在85.5℃下孵育10min后，ME-3酶在pH 4.5和5.5下保持约85％的活性，而在100℃下5min的孵育期间，在pH 5.5下的残余活性为约65％。
3所述的方法，使用AAPF-pNA底物在37℃下测量催化活性。结果示出于表3中。从图3中可以看出，ME-3在pH 10下在90℃保持约80％的活性。在其他实验中，未检测到EDTA的影响(未呈现数据)。还使用0.1M乙酸盐在pH 4.5和pH 5.5下测量ME-3的热稳定性。发现在85.5℃下孵育10min后，ME-3酶在pH 4.5和5.5下保持约85％的活性，而在100℃下5min的孵育期间，在pH 5.5下的残余活性为约65％。
[0615] 实例5
[0616] ME-3蛋白酶的pH曲线
[0617] 在pH 3.75和7.5之间评估pH对ME-3蛋白酶的活性的影响。使用两种储备缓冲液以产生所述pH范围：0.1M柠檬酸盐缓冲液和0.2M磷酸盐缓冲液，两者均含有0.05％(w/v)吐温(Tween)-80。使用实例3中描述的AAPF-pNA底物测定法在40℃下测量酶的催化活性，并且结果示出于图4中。还研究了ME-3蛋白酶在低pH下的稳定性。发现在pH 2.5下孵育30min后，酶相对于在pH 5.0下测量的活性保留了90％的活性(数据未示出)。
[0618] 实例6
[0619] 对饲料直接喷雾ME-3蛋白酶的制粒稳定性
[0620] 通过测量所述过程后酶活性恢复百分比来评估动物饲料制粒期间ME-3蛋白酶的稳定性。根据标准操作过程，在丹尼斯技术学院(科灵(Kolding)，丹麦)在不同温度下进行饲料制粒。将没有涂层的ME-3酶稀释到600mL水中，并且然后直接喷雾到120Kg的饲料上。将喷雾了ME-3的饲料样品在90℃、95℃、100℃下制粒60秒。为了在此过程后确定蛋白酶稳定性，使用Perten实验室研磨机碾磨丸粒，并且在含有1％(w/v)SDS的50mL的0.1M Tris pH
10溶液中于22℃提取20min。将提取物离心并通过滤纸过滤。然后使用实例3中所述的AAPF-pNA底物测定法将滤液用于确定ME-3的催化活性。如图5示出的，在90℃至100℃下制粒60秒后，没有任何涂层的ME-3酶保留了超过70％的活性。
10溶液中于22℃提取20min。将提取物离心并通过滤纸过滤。然后使用实例3中所述的AAPF-pNA底物测定法将滤液用于确定ME-3的催化活性。如图5示出的，在90℃至100℃下制粒60秒后，没有任何涂层的ME-3酶保留了超过70％的活性。
[0621] 实例7
[0622] 淀粉液化以及同时糖化和发酵中ME-3蛋白酶的评估
[0623] 如下所述，在实验室规模的玉米液化以及同时糖化和发酵(SSF)方案中测试ME-3蛋白酶的效果。使用Retsch ZM200碾磨机研磨玉米仁(阿里勃洛克动物营养公司(Arie
Blok Animal Nutrition)，NL-3440AA武尔登(Woerden)，商品编号：3777)，具有如下设置：
3mm筛，10k rpm。通过向面粉中添加1:1的自来水/去矿物质水混合物，将研磨的玉米面粉用于产生32.0％干固体的2kG浆料。用H2SO4将pH调节至5.5，并且然后以相关的商业剂量给药RSL(含有细菌α淀粉酶的杜邦公司商业产品)。随后，添加ME-3蛋白酶至最
终浓度为5ug/gDS，并且使用顶置式混合器在恒定搅拌下将2kG混合物在85℃孵育2小时。通过不向液化添加蛋白酶来产生对照样品。孵育后，收集处理过的玉米样品(液化物)并用于
随后的同时糖化和发酵(SSF)实验，并且还通过HPLC尺寸排阻分析等分试样以确定玉米液
化的程度。
Blok Animal Nutrition)，NL-3440AA武尔登(Woerden)，商品编号：3777)，具有如下设置：
3mm筛，10k rpm。通过向面粉中添加1:1的自来水/去矿物质水混合物，将研磨的玉米面粉用于产生32.0％干固体的2kG浆料。用H2SO4将pH调节至5.5，并且然后以相关的商业剂量给药RSL(含有细菌α淀粉酶的杜邦公司商业产品)。随后，添加ME-3蛋白酶至最
终浓度为5ug/gDS，并且使用顶置式混合器在恒定搅拌下将2kG混合物在85℃孵育2小时。通过不向液化添加蛋白酶来产生对照样品。孵育后，收集处理过的玉米样品(液化物)并用于
随后的同时糖化和发酵(SSF)实验，并且还通过HPLC尺寸排阻分析等分试样以确定玉米液
化的程度。
[0624] 玉米液化期间的粘度分析。使用Retsch ZM200碾磨机研磨玉米仁(阿里勃洛克动物营养公司，NL-3440AA武尔登(Woerden)，商品编号：3777)，设置为：3mm筛，10k rpm。通过向面粉中添加1:1的自来水/去矿物质水混合物，将研磨的玉米面粉用于产生25克32％干固
体玉米浆料。用硫酸将pH调节至5.5，并且然后以商业相关剂量添加 CL(含
有细菌α淀粉酶的杜邦公司商业产品)。向此浆液中添加ME-3蛋白酶至最终浓度为10微克/
克干固体(ug/gDS)。作为对照样品，没有添加蛋白酶。将样品在快速粘度分析仪(Perten仪器，RVA4500，设置：160rpm)中于85℃孵育1小时，并且然后将温度降至32℃。在32℃下15分钟后，取孵育最后一分钟的平均最终粘度水平，并且结果示出于表3。
体玉米浆料。用硫酸将pH调节至5.5，并且然后以商业相关剂量添加 CL(含
有细菌α淀粉酶的杜邦公司商业产品)。向此浆液中添加ME-3蛋白酶至最终浓度为10微克/
克干固体(ug/gDS)。作为对照样品，没有添加蛋白酶。将样品在快速粘度分析仪(Perten仪器，RVA4500，设置：160rpm)中于85℃孵育1小时，并且然后将温度降至32℃。在32℃下15分钟后，取孵育最后一分钟的平均最终粘度水平，并且结果示出于表3。
[0625]
[0626] 同时糖化和发酵(SSF)
[0627] 将液化样品(含有和不含添加到液化反应的蛋白酶)的pH调节至4.8，并在商业相关的剂量下添加 SSF(含有真菌α淀粉酶、真菌葡糖淀粉酶和酸性真菌蛋
白酶的杜邦公司商业产品)。然后，添加0.1％w/w活性干酵母(Ethanol Red，弗曼迪斯公司，法国)。将50克此混合物样品等分到SSF容器中。添加0或0.178SAPU/g DS的FERMGENTM 2.5x(含有酸性真菌蛋白酶的杜邦公司商业产品)和各种量的尿素(0、200和600ppm)。实验以一
式两份进行。使用下述两种不同的方法进行发酵孵育。
白酶的杜邦公司商业产品)。然后，添加0.1％w/w活性干酵母(Ethanol Red，弗曼迪斯公司，法国)。将50克此混合物样品等分到SSF容器中。添加0或0.178SAPU/g DS的FERMGENTM 2.5x(含有酸性真菌蛋白酶的杜邦公司商业产品)和各种量的尿素(0、200和600ppm)。实验以一
式两份进行。使用下述两种不同的方法进行发酵孵育。
[0628] SSF方法1。将发酵容器在32℃下在水浴中孵育，同时施加300rpm的磁力搅拌。在四个不同的时间点(5h、22h、29h和46小时)收集样品。使用如下所述的HPLC分离和定量分析这些样品的乙醇浓度。
[0629] HPLC(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)1200系列)运行条件如下：Phenomenex RezexTM RFQ-快速酸H+柱保持在80℃，以0.01N H2SO4溶剂的1.0mL/min等度流速，10μL注射体积和5.3min洗脱运行时间运行。将折射率检测用于乙醇的定量，并且结果示出于表4中。
[0630]
[0631]
[0632] 表4显示，如果尿素剂量从600降低至200ppm(相当于67％尿素剂量减少)，则通过液化酶如SPEZYME RSL形成乙醇的速率较慢。当将ME-3蛋白酶添加到包含SPEZYME RSL的液
化混合物中时，发酵速率与包含600ppm尿素时获得的发酵速率相当。此外，当使用零或仅
200ppm尿素代替时，向包含SPEZYME RSL的液化混合物中添加ME-3产生相同的乙醇产率。因此，在液化期间添加ME-3允许显著减少或消除尿素需求。
化混合物中时，发酵速率与包含600ppm尿素时获得的发酵速率相当。此外，当使用零或仅
200ppm尿素代替时，向包含SPEZYME RSL的液化混合物中添加ME-3产生相同的乙醇产率。因此，在液化期间添加ME-3允许显著减少或消除尿素需求。
[0633] SSF方法2。将发酵容器在32℃下在水浴中孵育，并且施加300rpm的磁力搅拌。使用ANKOM RF气体产生系统(安卡姆科技公司(ANKOM Technology)，马斯顿(Macedon)，纽约州，美国)随时间记录累积压力，该系统提供了监测和测量气体产生的易于使用的方法。气体(CO2)生产是乙醇生产的量度。气体产生速率示出于图6。图6显示了来自在Ankom系统上进
行同时糖化和发酵的累积压力图。在中灰色线是对照条件，其中600ppm尿素和0.178SAPU/
TM
gDS FERMGEN 2.5x被添加到发酵中，并且在液化中没有使用ME-3。浅灰色线显示使用
240ppm尿素的乙醇产率，并且没有添加到发酵中的FERMGENTM 2.5x，并且在液化中没有使用ME-3。黑色线显示当ME-3蛋白酶添加到液化中时的乙醇产率，并且发酵用240ppm尿素进行
并且不添加FERMGENTM 2.5x。如可以观察到的，即使尿素剂量降低60％并且没有FERMGENTM蛋白酶添加到发酵中，当将ME-3蛋白酶添加到液化中时，与对照条件相比，乙醇产率得到改善。
行同时糖化和发酵的累积压力图。在中灰色线是对照条件，其中600ppm尿素和0.178SAPU/
TM
gDS FERMGEN 2.5x被添加到发酵中，并且在液化中没有使用ME-3。浅灰色线显示使用
240ppm尿素的乙醇产率，并且没有添加到发酵中的FERMGENTM 2.5x，并且在液化中没有使用ME-3。黑色线显示当ME-3蛋白酶添加到液化中时的乙醇产率，并且发酵用240ppm尿素进行
并且不添加FERMGENTM 2.5x。如可以观察到的，即使尿素剂量降低60％并且没有FERMGENTM蛋白酶添加到发酵中，当将ME-3蛋白酶添加到液化中时，与对照条件相比，乙醇产率得到改善。
[0634] 通过液化样品玉米的HPLC分析检测玉米面粉蛋白质水解。为了通过ME-3蛋白酶评估玉米蛋白质水解，使用HPLC尺寸排阻来量化玉米蛋白质溶解。将液化结束样品以13,
000rpm旋转5分钟，并且将200uL上清液通过0.22um过滤器过滤。将5μL此滤液的等分试样注射到HPLC(安捷伦科技1200系列)上(在Waters 1.7um/300mm柱上)；并以
0.4mL/min运行。运行缓冲液：25mM NaPO4pH6.8，0.1M NaCl。将保留时间7min至10min之间的总面积积分，检测：OD220nm。
000rpm旋转5分钟，并且将200uL上清液通过0.22um过滤器过滤。将5μL此滤液的等分试样注射到HPLC(安捷伦科技1200系列)上(在Waters 1.7um/300mm柱上)；并以
0.4mL/min运行。运行缓冲液：25mM NaPO4pH6.8，0.1M NaCl。将保留时间7min至10min之间的总面积积分，检测：OD220nm。
[0635] 液化样品中肽的HPLC检测结果示出于表5中，显示为曲线下积分面积，对于使用和不使用ME-3蛋白酶处理的样品，保留时间在7-10分钟之间。表5中示出的蛋白质水解结果表明，当在液化中添加ME-3时，观察到可溶性肽水平的增加。
[0636]
[0637] 实例8
[0638] ME-3蛋白酶在高温糖化醪制备中产生游离氨基氮中的用途
[0639] 标准酿造质量控制分析包括游离氨基氮(FAN)的测试。这允许估计酵母在啤酒发酵期间可利用的细胞生长和增殖的单个氨基酸和小肽的浓度。在酿造过程中包含非麦芽原
料作为辅料增加了对麦芽汁中较高FAN含量的要求，以确保适当的发酵过程。用50％比尔森麦芽(比尔森麦芽；福格桑(Fuglsang)丹麦，批次13.01.2016)和50％玉米谷粉(布伦塔格公司(Benntag)北欧；Nordgetreide GmBH Lübec，德国，批次：02.05.2016)使用4.0:1的水与谷粉比率在糖化醪制备操作中测试蛋白酶ME-3。比尔森麦芽用布勒公司(Buhler Miag)麦
芽研磨机(0.5mm设置)研磨。
料作为辅料增加了对麦芽汁中较高FAN含量的要求，以确保适当的发酵过程。用50％比尔森麦芽(比尔森麦芽；福格桑(Fuglsang)丹麦，批次13.01.2016)和50％玉米谷粉(布伦塔格公司(Benntag)北欧；Nordgetreide GmBH Lübec，德国，批次：02.05.2016)使用4.0:1的水与谷粉比率在糖化醪制备操作中测试蛋白酶ME-3。比尔森麦芽用布勒公司(Buhler Miag)麦
芽研磨机(0.5mm设置)研磨。
[0640] 将粗玉米(1.5g)、麦芽(研磨的比尔森麦芽，1.5g)和自来水(12.0g)在Wheaton杯(带盖的Wheaton玻璃容器)中混合，用12.0g自来水预孵育，用2.5M硫酸将pH调节至pH 5.4，并且加热至70℃。基于ppm活性蛋白质(总共0.5mL)添加ME-3蛋白酶，并且添加水作为无酶
对照。将商业上相关剂量的α-淀粉酶( 5T，杜邦公司商业产品)应用于所有样品
以促进液化。将Wheaton杯置于干燥浴(赛默科技公司(Thermo Scientific)Stem station)
中，磁力搅拌并应用以下糖化醪制备程序；保持在70℃持续30分钟；通过以2℃/分钟升高温度来加热至95℃持续12.5分钟；保持在95℃持续17.5分钟；冷却至70℃持续15分钟并且在
70℃保持30分钟，并且最后加热至79℃持续15分钟并洗出(mashed off)。将10mL样品转移
至福尔肯管中并在100℃下煮沸20分钟以确保酶完全失活。通过在Multifuge X3R离心机
(贺利氏(Heraeus))中以4500rpm在10℃下离心30分钟，将谷物与麦芽汁分离。
对照。将商业上相关剂量的α-淀粉酶( 5T，杜邦公司商业产品)应用于所有样品
以促进液化。将Wheaton杯置于干燥浴(赛默科技公司(Thermo Scientific)Stem station)
中，磁力搅拌并应用以下糖化醪制备程序；保持在70℃持续30分钟；通过以2℃/分钟升高温度来加热至95℃持续12.5分钟；保持在95℃持续17.5分钟；冷却至70℃持续15分钟并且在
70℃保持30分钟，并且最后加热至79℃持续15分钟并洗出(mashed off)。将10mL样品转移
至福尔肯管中并在100℃下煮沸20分钟以确保酶完全失活。通过在Multifuge X3R离心机
(贺利氏(Heraeus))中以4500rpm在10℃下离心30分钟，将谷物与麦芽汁分离。
[0641] 收集上清液用于游离的α氨基氮分析(FAN)。使用EBC 8.10国际方法在麦芽汁中测量FAN含量(mg/升)，用于通过比色法(应用Genesys 10S UV-Vis分光光度计)使用茚三酮确
定麦芽汁的游离氨基氮含量。如图7中示出的，ME-3蛋白酶促进了麦芽汁中游离α-氨基氮
(FAN)的剂量依赖性产生。
定麦芽汁的游离氨基氮含量。如图7中示出的，ME-3蛋白酶促进了麦芽汁中游离α-氨基氮
(FAN)的剂量依赖性产生。
[0642] 实例9
[0643] 借助ME-3蛋白酶从油籽中提取油
[0644] 将片状、去壳和碾磨的花生种子(花生(Arachis hypogaea))悬浮于含有5mM CaCl2(pH8.0)的2mL 0.1M Tris-HCl中，并在60℃下在1180ppm振荡下孵育3h以模拟油提取
过程。在提取结束时，使用台式离心机通过以4000rpm离心15min收集油水上清液。用ME-3蛋白酶处理收集的上清液，以水解在油水乳液中分配的蛋白质。简而言之，将120μL等分试样的上清液与增加量的ME-3(3.7μg蛋白质/μL储备溶液)蛋白酶(0、1、3、5和10μL)混合，并且在60℃和1180rpm振荡孵育1h(n＝2)。在孵育期结束时，将反应混合物冷却至0℃并取20μL各样品以测量600nm处的浊度。结果示出于表6中，并且它们显示添加ME-3蛋白酶降低了样
品的浊度。
过程。在提取结束时，使用台式离心机通过以4000rpm离心15min收集油水上清液。用ME-3蛋白酶处理收集的上清液，以水解在油水乳液中分配的蛋白质。简而言之，将120μL等分试样的上清液与增加量的ME-3(3.7μg蛋白质/μL储备溶液)蛋白酶(0、1、3、5和10μL)混合，并且在60℃和1180rpm振荡孵育1h(n＝2)。在孵育期结束时，将反应混合物冷却至0℃并取20μL各样品以测量600nm处的浊度。结果示出于表6中，并且它们显示添加ME-3蛋白酶降低了样
品的浊度。
[0645]
[0646] 反应混合物的浊度降低归因于油蛋白质乳液中蛋白质的水解。众所周知，植物油可以用有机溶剂如己烷提取，但火灾和爆炸的风险很高。在降低的温度下用水性溶液进行
植物油提取可以避免这些风险，但水油乳液的形成是一个挑战，因为难以将游离油从水相
分离。使用蛋白酶水解植物材料或植物种子细胞壁以释放更多的捕获的油，以及水油乳液
中的蛋白质部分也增加了油产率(如专利申请US 2010227042中所述)。
植物油提取可以避免这些风险，但水油乳液的形成是一个挑战，因为难以将游离油从水相
分离。使用蛋白酶水解植物材料或植物种子细胞壁以释放更多的捕获的油，以及水油乳液
中的蛋白质部分也增加了油产率(如专利申请US 2010227042中所述)。
[0647] 与专利US 2010227042中公开的热稳定性较差的蛋白酶相比，使用热稳定蛋白酶如ME-3与从植物和藻类的高温油提取过程更相容。包括磷脂酶在内的脂肪酶也可用于此方
法，但使用热稳定蛋白酶的优点在于它水解植物蛋白质，包括可能引起变应原性的那些蛋
白质和对消化产生负面影响的蛋白质抑制剂，从而产生更希望的产物。
法，但使用热稳定蛋白酶的优点在于它水解植物蛋白质，包括可能引起变应原性的那些蛋
白质和对消化产生负面影响的蛋白质抑制剂，从而产生更希望的产物。
[0648] 实例10
[0649] 用ME-3蛋白酶水解角蛋白
[0650] 如下所述进行ME-3蛋白酶对角蛋白水解的评估。将剂量为0、5μL、10μL和20μL的ME-3蛋白酶(3.7mg蛋白质/mL)添加到悬浮于含有5mM CaCl2(pH8.0)和0.1mL半胱氨酸(0.1M)的0.1M Tris-HCl的1％(w/w)羊毛角蛋白(K0044，东京化工株式会社(Tokyo
Chemical Industry Co.Ltd))的2mL悬浮液中。反应在60℃下进行，以1180rpm振荡3h(n＝
3)。在孵育期结束时，将反应混合物以10,000rpm离心20min。去除上清液，并且干燥沉淀物，并且称重以确定水解的羊毛的量。结果示出于表7中，并且表明增加量的ME-3蛋白酶有效地水解羊毛角蛋白。
Chemical Industry Co.Ltd))的2mL悬浮液中。反应在60℃下进行，以1180rpm振荡3h(n＝
3)。在孵育期结束时，将反应混合物以10,000rpm离心20min。去除上清液，并且干燥沉淀物，并且称重以确定水解的羊毛的量。结果示出于表7中，并且表明增加量的ME-3蛋白酶有效地水解羊毛角蛋白。
[0651]
[0652] 富含角蛋白的材料包括家禽羽毛、哺乳动物毛发和羊毛是高度交联的蛋白质，众所周知难以用酶水解。某些蛋白酶可以在一定程度上水解这些角蛋白材料中的一些，如羽
毛(Pedersen等人,Comparison of four feed proteases for improvement of
nutritive value of poultry feather meal[用于改善家禽羽毛粉营养价值的四种饲料
蛋白酶的比较].J.Anim.Sci[动物科学杂志].2012,第90卷第4期增刊,第350-352页)。然
而，之前评估的蛋白酶都不是有效的，并且由于它们在升高的温度下的不稳定性，没有一种蛋白酶可以水解羊毛角蛋白。
毛(Pedersen等人,Comparison of four feed proteases for improvement of
nutritive value of poultry feather meal[用于改善家禽羽毛粉营养价值的四种饲料
蛋白酶的比较].J.Anim.Sci[动物科学杂志].2012,第90卷第4期增刊,第350-352页)。然
而，之前评估的蛋白酶都不是有效的，并且由于它们在升高的温度下的不稳定性，没有一种蛋白酶可以水解羊毛角蛋白。
[0653] 观察到ME-3蛋白酶水解角蛋白羊毛材料的效率可能是由于其对高温的耐受性，因为角蛋白在较高温度下更容易展开。此外，目前制备用于动物饲料和宠物食物的羽毛粉的
方法通常涉及用高温处理羽毛(角蛋白含量高)以杀死可能的病原体并且使羽毛蛋白质变
性。ME-3蛋白酶可以单独使用或与羽毛的高温处理组合使用(如专利号US 2015197783中所
述)。
方法通常涉及用高温处理羽毛(角蛋白含量高)以杀死可能的病原体并且使羽毛蛋白质变
性。ME-3蛋白酶可以单独使用或与羽毛的高温处理组合使用(如专利号US 2015197783中所
述)。
[0654] 实例11
[0655] ME-3蛋白酶水解生物质中的蛋白质的用途
[0656] 用于第二代生物乙醇生产或其他目的的生物质需要在进行酶水解以产生可发酵糖之前进行预处理。生物质通常在升高的温度下(典型地高于100℃)，在酸性或碱性条件下预处理(如专利申请WO 2006110901，WO 2014202716中所述)。
[0657] 在这样的过程中可以使用热稳定蛋白酶如ME-3来水解生物质中存在的蛋白质，以向发酵生物体如产乙醇生物体提供额外的氨基酸和肽营养素，并且还降低生物质浆料的粘
度以增加其流动性。碱性预处理的生物质，如稀氨水预处理(如专利WO 2006110901中所述)由于ME-3的较高pH最佳值而特别适合于ME-3处理以产生这些营养素。为了评估ME-3在这些
条件下的效果，使用用稀氨水预处理并在去离子水中以10％(w/v)悬浮的玉米秸秆(63％固
体)。浆料的pH为8.25。将浆液分配到12个管中，每个管含有4mL浆液。ME-3蛋白酶(3.7mg/ml)以0、1、5、10、15和25μL(n＝2)给药。将样品混合并在60℃下进行反应4h。然后将样品离心并将收集的上清液通过0.45μm过滤器过滤并用水稀释10倍。如实例3中所述，通过使20uL稀释的样品与OPA试剂反应，将样品用于测量蛋白质和氨基酸的游离氨基基团。通过ME-3进行生物质处理的蛋白质水解程度示出于表8。从表8可以看出，OPA值表示的游离氨基基团随着ME-3的添加而增加。
度以增加其流动性。碱性预处理的生物质，如稀氨水预处理(如专利WO 2006110901中所述)由于ME-3的较高pH最佳值而特别适合于ME-3处理以产生这些营养素。为了评估ME-3在这些
条件下的效果，使用用稀氨水预处理并在去离子水中以10％(w/v)悬浮的玉米秸秆(63％固
体)。浆料的pH为8.25。将浆液分配到12个管中，每个管含有4mL浆液。ME-3蛋白酶(3.7mg/ml)以0、1、5、10、15和25μL(n＝2)给药。将样品混合并在60℃下进行反应4h。然后将样品离心并将收集的上清液通过0.45μm过滤器过滤并用水稀释10倍。如实例3中所述，通过使20uL稀释的样品与OPA试剂反应，将样品用于测量蛋白质和氨基酸的游离氨基基团。通过ME-3进行生物质处理的蛋白质水解程度示出于表8。从表8可以看出，OPA值表示的游离氨基基团随着ME-3的添加而增加。
[0658]
[0659] 实例12
[0660] ME-3蛋白酶的同源物
[0661] 用针对NCBI的nr和pat数据库的ME-3蛋白酶(SEQ ID NO:3)的BlastP搜索揭示了如下另外两种嗜热裂孢菌属(Thermobifida)物种中的ME-3蛋白酶的同源物：褐色嗜热裂孢
菌和耐盐嗜热双岐菌。
菌和耐盐嗜热双岐菌。
[0662] 存在于褐色嗜热裂孢菌中的同源物Tfpa首先由Kelch,B.A.和Agard,D.A.(2007)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]370:784-795描述。NCBI(PDB ID)的Tfpa登录号为2PFE。登
录号WP_011290931、WP_016188200和SCV75185是相同的蛋白质(成熟链)。耐盐嗜热双岐菌
中ME-3蛋白酶同源物(Thpa)的NCBI蛋白质登录号是WP_068687914。褐色嗜热裂孢菌Tfpa前
酶原的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。在N-末端，Tfpa前酶原具有信号肽，所述信号肽具有31个残基的预测长度(SEQ ID NO:7中的氨基酸1-31)。Tfpa的前序列具有151个残基的长
度(SEQ ID NO:7中的氨基酸32-182)，并且完全加工的成熟酶Tfpa(186个氨基酸)的氨基酸
序列描绘于SEQ ID NO:8中。
录号WP_011290931、WP_016188200和SCV75185是相同的蛋白质(成熟链)。耐盐嗜热双岐菌
中ME-3蛋白酶同源物(Thpa)的NCBI蛋白质登录号是WP_068687914。褐色嗜热裂孢菌Tfpa前
酶原的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。在N-末端，Tfpa前酶原具有信号肽，所述信号肽具有31个残基的预测长度(SEQ ID NO:7中的氨基酸1-31)。Tfpa的前序列具有151个残基的长
度(SEQ ID NO:7中的氨基酸32-182)，并且完全加工的成熟酶Tfpa(186个氨基酸)的氨基酸
序列描绘于SEQ ID NO:8中。
[0663] 耐盐嗜热双岐菌WP_068687914肽酶S1，即Thpa的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。基于与ME-3蛋白酶和Tfpa前酶原的比对，WP_068687914的序列似乎缺少N-末端信号肽的一
部分。预测的部分信号肽对应于15个残基(SEQ ID NO:9中的氨基酸1-15)。预测的耐盐嗜热双岐菌WP_068687914的前序列具有152个残基的长度(SEQ ID NO:9中的氨基酸16-167)。预
测的完全加工的成熟酶耐盐嗜热双岐菌WP_068687914，即Thpa(186个氨基酸)的氨基酸序
列描绘于SEQ ID NO:10中。
部分。预测的部分信号肽对应于15个残基(SEQ ID NO:9中的氨基酸1-15)。预测的耐盐嗜热双岐菌WP_068687914的前序列具有152个残基的长度(SEQ ID NO:9中的氨基酸16-167)。预
测的完全加工的成熟酶耐盐嗜热双岐菌WP_068687914，即Thpa(186个氨基酸)的氨基酸序
列描绘于SEQ ID NO:10中。
[0664] 通过NCBI数据库的BLAST P搜索发现ME-3蛋白酶的不属于嗜热裂孢菌属的另外的同源物包括以下S1蛋白酶：潜能拟诺卡氏菌蛋白酶(WP_017594871)、耐热深海放线菌
(Marinactinospora thermotolerans)(WP_078763344.1)，海洋拟无枝菌酸菌
(Amycolatopsis marina)(WP_091675221.1)、海绵异壁放线菌(Actinoalloteichus
hymeniacidonis)(WP_069846166.1)、海藻糖拟诺卡氏菌(Nocardiopsis trehalosi)(WP_
067965505.1)、糖丝菌属物种NRRL B-16314(WP_033441214.1)。计算所有成熟酶序列的序
列同一性交叉百分比，并示出于表9中。
(Marinactinospora thermotolerans)(WP_078763344.1)，海洋拟无枝菌酸菌
(Amycolatopsis marina)(WP_091675221.1)、海绵异壁放线菌(Actinoalloteichus
hymeniacidonis)(WP_069846166.1)、海藻糖拟诺卡氏菌(Nocardiopsis trehalosi)(WP_
067965505.1)、糖丝菌属物种NRRL B-16314(WP_033441214.1)。计算所有成熟酶序列的序
列同一性交叉百分比，并示出于表9中。
[0665] 潜能拟诺卡氏菌WP_017594871的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。预测的信号肽长29个氨基酸。预测的潜能拟诺卡氏菌WP_017594871蛋白酶的前序列长度为161个氨基酸，并且预测的完全加工的成熟酶潜能拟诺卡氏菌WP_017594871丝氨酸蛋白酶(185个氨基酸)
的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
[0666]
[0667] 针对ME-3(SEQ ID NO:3)、Tfpa(SEQ ID NO:8)、Thpa(SEQ ID NO:10)、潜能拟诺卡氏菌_WP_017594871(SEQ ID NO:12)、耐热深海放线菌WP_078763344(氨基酸197-381)；海洋拟无枝菌酸菌WP_091675221(氨基酸193-435)；海绵异壁放线菌WP_069846166(氨基酸
201-385)；海藻糖拟诺卡氏菌WP_067965505(氨基酸191-375)；和糖丝菌属物种NRRL B-
16314WP_033441214(氨基酸191-437)的成熟氨基酸序列的多序列比对示出于图8中。使用
来自Geneious软件(生物物质有限公司(Biomatters Ltd.))(Robert C.Edgar.MUSCLE:
multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput[MUSCLE：具
有高精确度和高通量的多序列比对],Nucl.Acids Res.[核酸研究](2004)32(5):1792-
1797)的MUSCLE程序使用默认参数来比对这些序列。
201-385)；海藻糖拟诺卡氏菌WP_067965505(氨基酸191-375)；和糖丝菌属物种NRRL B-
16314WP_033441214(氨基酸191-437)的成熟氨基酸序列的多序列比对示出于图8中。使用
来自Geneious软件(生物物质有限公司(Biomatters Ltd.))(Robert C.Edgar.MUSCLE:
multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput[MUSCLE：具
有高精确度和高通量的多序列比对],Nucl.Acids Res.[核酸研究](2004)32(5):1792-
1797)的MUSCLE程序使用默认参数来比对这些序列。
[0668] 实例13
[0669] ME-3蛋白酶对体外玉米干物质消化率和瘤胃发酵中气体产生的影响
[0670] 在使用马齿玉米作为底物(4mm碾碎的)的体外分批发酵系统中评估ME-3蛋白酶对干物质消化率(DMD)、气体产生、淀粉消化率和pH的影响。在三个单独的运行中评估三种剂量(0.25、0.5和0.75mg/g饲料底物)的酶功效，每次运行中每个酶剂量4个重复。在将缓冲的瘤胃内容物与底物和酶在160mL血清小瓶中39℃孵育7h后，在瘤胃发酵模式上确定ME-3的
有效性。
有效性。
[0671] 实验基于之前建立和公开的方案(Adesogan,A.T.,Krueger,N.A.和Kim,S.C.2005.Anim.Feed Sci.Technol.[动物饲料科学与技术]123:211-223)。在体外分批发
酵系统中使用的马齿玉米具有88.8％干物质(DM)、9.3％粗蛋白(CP)、3.2％酸性洗涤剂纤
维(ADF)、8.3％用淀粉酶(aNDF)处理的中性洗涤剂纤维、76.9％非纤维碳水化合物(NFC)、
88.0％总可消化营养素(TDN)。将碾碎的马齿玉米(4mm)称重(每次运行6次重复)至F57滤袋
(安卡姆科技公司(ANKOM Technology)，马斯顿(Macedon)，纽约州)。
酵系统中使用的马齿玉米具有88.8％干物质(DM)、9.3％粗蛋白(CP)、3.2％酸性洗涤剂纤
维(ADF)、8.3％用淀粉酶(aNDF)处理的中性洗涤剂纤维、76.9％非纤维碳水化合物(NFC)、
88.0％总可消化营养素(TDN)。将碾碎的马齿玉米(4mm)称重(每次运行6次重复)至F57滤袋
(安卡姆科技公司(ANKOM Technology)，马斯顿(Macedon)，纽约州)。
[0672] 在放入瓶中之前，将酶样品在0.1M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中稀释，并添加到0.5g F57袋中的碾碎的马齿玉米中(Krueger,N.A.和A.T.Adesogan.2008.Anim.Feed
Sci.Tech.[动物饲料科学与技术]145:84-94；Goering,H.K.和P.J.Van Soest.1970.农业
手册编号379，ARS USDA,华盛顿特区,第20页)。用Uline公司的桌面塑料袋封口机(Uline
Tabletop Poly Bag Sealer)( AIE-200类型)密封F57滤袋，然后立即放入发酵
容器(160mL血清瓶)中。还包括仅由滤袋组成的空瓶，以及仅含有不含酶的碾碎的马齿玉米的对照。在消耗总混合给养(TMR)后，从三头泌乳的、瘤胃插管的荷斯坦奶牛中代表性地吸出瘤胃液2h至3h。基于干物质饲喂至瘘管奶牛的TMR成分组合物由以下组成：38.2％玉米青贮饲料、27.3％碾碎的去壳玉米、含有44％粗蛋白的14.5％大豆粉、9.1％柑橘渣、4.5％饲养场预混物、4.0％中期开花的苜蓿干草、1.8％能量增强剂(MS专业营养(MS Specialty
Nutrition)，敦提(Dundee)、伊利诺伊州)、0.5％Novasil(巴斯夫公司(BASF)，德国)，总计
100％。
Sci.Tech.[动物饲料科学与技术]145:84-94；Goering,H.K.和P.J.Van Soest.1970.农业
手册编号379，ARS USDA,华盛顿特区,第20页)。用Uline公司的桌面塑料袋封口机(Uline
Tabletop Poly Bag Sealer)( AIE-200类型)密封F57滤袋，然后立即放入发酵
容器(160mL血清瓶)中。还包括仅由滤袋组成的空瓶，以及仅含有不含酶的碾碎的马齿玉米的对照。在消耗总混合给养(TMR)后，从三头泌乳的、瘤胃插管的荷斯坦奶牛中代表性地吸出瘤胃液2h至3h。基于干物质饲喂至瘘管奶牛的TMR成分组合物由以下组成：38.2％玉米青贮饲料、27.3％碾碎的去壳玉米、含有44％粗蛋白的14.5％大豆粉、9.1％柑橘渣、4.5％饲养场预混物、4.0％中期开花的苜蓿干草、1.8％能量增强剂(MS专业营养(MS Specialty
Nutrition)，敦提(Dundee)、伊利诺伊州)、0.5％Novasil(巴斯夫公司(BASF)，德国)，总计
100％。
[0673] 将收集的瘤胃液通过四层粗棉布过滤，然后与预热的人工唾液(39℃)混合。人工唾液的组合物包括CaCl2·2H2O、MnCl2·4H2O、CoCl2·6H2O、FeCl2·6H2O的微量矿物质溶液；
Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O的常量矿物质溶液；(NH4)2HCO3和NaHCO3的缓冲溶液；胰蛋白酶蛋白胨溶液(胰蛋白胨，西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，圣路易斯，密苏里
州，美国)；氧化还原指示剂刃天青和含有半胱氨酸HCl、1M NaOH、Na2S·9H2O和蒸馏水的还原溶液。瘤胃液和人工唾液之间的体积比为1:2。将缓冲的瘤胃液(52mL)添加到含有滤袋的
160mL血清瓶中，并且用橡胶塞封闭瓶并用铝密封圈进行密封。将瓶在39℃下在强制空气
(forced-air)孵育器中孵育7h。在孵育结束时，将含有残余物的滤袋在60℃下烘箱干燥48h并称重以量化DMD。用压力传感器测量瓶内的气体压力，并随后在7h孵育下转换为气体体
积。以下公式用于将气体压力转换为气体体积：
Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O的常量矿物质溶液；(NH4)2HCO3和NaHCO3的缓冲溶液；胰蛋白酶蛋白胨溶液(胰蛋白胨，西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，圣路易斯，密苏里
州，美国)；氧化还原指示剂刃天青和含有半胱氨酸HCl、1M NaOH、Na2S·9H2O和蒸馏水的还原溶液。瘤胃液和人工唾液之间的体积比为1:2。将缓冲的瘤胃液(52mL)添加到含有滤袋的
160mL血清瓶中，并且用橡胶塞封闭瓶并用铝密封圈进行密封。将瓶在39℃下在强制空气
(forced-air)孵育器中孵育7h。在孵育结束时，将含有残余物的滤袋在60℃下烘箱干燥48h并称重以量化DMD。用压力传感器测量瓶内的气体压力，并随后在7h孵育下转换为气体体
积。以下公式用于将气体压力转换为气体体积：
[0674] 气体体积(mL)＝(气体压力(psi)*4.8843)+3.1296
[0675] 基于使用160mL血清瓶的实验条件确定所述等式，并用于表10和11的所有实验
[0676] 统计分析：对于苯实例中描述的实验，使用SAS的GLIMMIX程序(版本9.1；SAS研究所(SAS Institute)，凯利(Cary)，北卡罗来纳州)分析收集的数据。将实验被设计为完全随机区组设计，其中每次运行被认为是一个区组。当以不同剂量测试酶时，剂量用作模型中的固定效应。响应变量包括体外DMD和气体产生。运行被认为是一个随机因素。模型的固定效应包括在孵育后不同小时测量的发酵参数的采样时间。在进行最终分析之前，使用SAS的
UNIVARIATE程序测试残差的离群值和正态性。处理影响在P<0.05被证明是显著的，而在
0.05≤P≤0.10定义了任何趋势。
UNIVARIATE程序测试残差的离群值和正态性。处理影响在P<0.05被证明是显著的，而在
0.05≤P≤0.10定义了任何趋势。
[0677] 下表10中示出的结果表明，在体外瘤胃发酵条件下，蛋白酶ME-3能够以剂量应答方式促进DMD和气体产生。
[0678]
[0679] a-c意指行内不同上标具有差异(P<0.05)。
[0680] 实例14
[0681] ME-3蛋白酶作为液化蛋白酶的进一步评估
[0682] 进行液化-SSF研究，其中在实验室规模的玉米液化和同时糖化和发酵(SSF)中进一步测试热稳定丝氨酸蛋白酶ME-3。将来自商业乙醇设备的经研磨的玉米面粉用于通过将
6:4w/w自来水:来自商业乙醇设备的逆流的混合物添加到面粉中来产生33％干固体的浆
料。用H2SO4将pH调节至5.1，并且然后以相关的商业剂量给药 HT-WB(含有细
菌α淀粉酶的杜邦公司商业产品)。将混合物在85℃下孵育20分钟。然后将浆液在100℃下煮沸10分钟，并且随后在85℃下冷却10分钟。添加另一剂量的 HT-WB，并且另
外添加ME-3蛋白酶至3、4、5或6ug/gDS的最终浓度。使用顶置式混合器在持续搅拌下将液化延长另外2小时。通过不向液化添加蛋白酶来产生对照样品。孵育后，收集处理过的玉米样品(液化物)并用于随后的SSF实验。
6:4w/w自来水:来自商业乙醇设备的逆流的混合物添加到面粉中来产生33％干固体的浆
料。用H2SO4将pH调节至5.1，并且然后以相关的商业剂量给药 HT-WB(含有细
菌α淀粉酶的杜邦公司商业产品)。将混合物在85℃下孵育20分钟。然后将浆液在100℃下煮沸10分钟，并且随后在85℃下冷却10分钟。添加另一剂量的 HT-WB，并且另
外添加ME-3蛋白酶至3、4、5或6ug/gDS的最终浓度。使用顶置式混合器在持续搅拌下将液化延长另外2小时。通过不向液化添加蛋白酶来产生对照样品。孵育后，收集处理过的玉米样品(液化物)并用于随后的SSF实验。
[0683] 将液化物样品(含有和不含添加到液化反应的ME-3蛋白酶)的pH调节至4.8，并将相应剂量的真菌α淀粉酶、真菌葡糖淀粉酶和真菌海藻糖酶添加到含有98克液化物的每个
SSF容器中。然后，添加2mL繁殖的酵母培养物( Thrive，杜邦公司)，并且随
后以表11中所示的不同浓度添加尿素和FERMGENTM 2.5x(含有酸性真菌蛋白酶的杜邦公司
商业产品)。实验以一式四份进行。
SSF容器中。然后，添加2mL繁殖的酵母培养物( Thrive，杜邦公司)，并且随
后以表11中所示的不同浓度添加尿素和FERMGENTM 2.5x(含有酸性真菌蛋白酶的杜邦公司
商业产品)。实验以一式四份进行。
[0684] 将发酵容器在32℃下在强制空气孵育器中以150rpm孵育。在五个不同的时间点(16h、24h、40h、48h和54小时)收集样品。如下所述分析这些样品的乙醇浓度、甘油浓度、酸水解脂肪和粗蛋白质分析。
[0685] 为了确定乙醇和甘油浓度，将发酵样品以12,000g离心3分钟。向500ul上清液中添加50ul的1N H2SO4并在室温下放置5分钟。将样品在蒸馏水中稀释11x并在HPLC分析之前通
过0.2μm过滤器过滤。HPLC(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)UltiMate 3000)运
行条件如下： RezexTM有机酸(ROA)300x 7.80mm柱保持在65℃，以0.01N
H2SO4溶剂的0.7mL/min等度流速，20μL注射体积和23min洗脱运行时间运行。将折射率检测用于定量乙醇和甘油。结果示出于表11(甘油)和表12(乙醇)中。
过0.2μm过滤器过滤。HPLC(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)UltiMate 3000)运
行条件如下： RezexTM有机酸(ROA)300x 7.80mm柱保持在65℃，以0.01N
H2SO4溶剂的0.7mL/min等度流速，20μL注射体积和23min洗脱运行时间运行。将折射率检测用于定量乙醇和甘油。结果示出于表11(甘油)和表12(乙醇)中。
[0686] 结束的发酵材料也在中西部实验室(13611B奥马哈街，内布拉斯加州68144)进行酸水解脂肪分析(使用AOAC 954.02方法，但以下除外：15mL PET醚和乙醚管代替25mL容器，并且消解管(digi tube)代替莫秋尼耳(mojonnier)管)和粗蛋白质分析(方案AOAC
990.03)。结果在示出于表11。
990.03)。结果在示出于表11。
[0687] 对从发酵结束获得的材料的分析显示，ME-3处理导致更高水平的粗蛋白质和酸水解脂肪，后者表明乙醇设备中玉米油产率潜在地更高。此外，发现ME-3处理的液化物的甘油水平较低，这在工业中被认为是阳性的并且与较高的乙醇产率结合。
[0688] 表11显示了使用不同的ME-3剂量测量在发酵结束时(54小时)测量获得的酸水解脂肪、粗蛋白和甘油水平的结果。ND表示未确定。
[0689]
[0690] 还确定了乙醇产率(如实例7中所述)并且结果显示当在液化和随后的SSF期间当以不同浓度添加ME-3时，观察到明显的剂量应答效应和更快的乙醇产生速率，如表12报告
的。此外，发现ME-3处理的液化物在发酵结束时(54小时，表12)的乙醇水平略高。
的。此外，发现ME-3处理的液化物在发酵结束时(54小时，表12)的乙醇水平略高。
[0691]
[0692]
[0693] 在另一项研究中，ME-3剂量在液化期间加倍。发现随后的SSF可以使用SSF蛋白酶以正常水平进行而不需要任何尿素。因此，发现不仅可以替换所有尿素，而且与对照相比，乙醇形成速率以及最终乙醇产率(在53小时测量)增加，如表13中示出的。
[0694]
[0695] 在本研究中，使用Retsch ZM200碾磨机研磨玉米仁(阿里勃洛克动物营养公司，NL-3440AA武尔登(Woerden)，商品编号：3777)，设置为：3mm筛，10k rpm。通过向面粉中添加
1:1的自来水/来自商业乙醇设备的逆流混合物，将研磨的玉米面粉用于产生32.64％干固
体的浆料。用H2SO4将pH调节至5.5，并且然后以相关的商业剂量给药 RSL(含
有细菌α淀粉酶的杜邦公司商业产品)。随后，添加ME-3蛋白酶至最终浓度为0、3或6ug/gDS，并且使用顶置式混合器在恒定搅拌下将混合物在85℃孵育2小时。通过不向液化添加蛋白
酶来产生对照样品。孵育后，收集处理过的玉米样品(液化物)并用于随后的SSF实验。
1:1的自来水/来自商业乙醇设备的逆流混合物，将研磨的玉米面粉用于产生32.64％干固
体的浆料。用H2SO4将pH调节至5.5，并且然后以相关的商业剂量给药 RSL(含
有细菌α淀粉酶的杜邦公司商业产品)。随后，添加ME-3蛋白酶至最终浓度为0、3或6ug/gDS，并且使用顶置式混合器在恒定搅拌下将混合物在85℃孵育2小时。通过不向液化添加蛋白
酶来产生对照样品。孵育后，收集处理过的玉米样品(液化物)并用于随后的SSF实验。
[0696] 将液化物样品(含有和不含添加到液化反应的ME-3蛋白酶)的pH调节至4.8，并将相应剂量的真菌α淀粉酶、真菌葡糖淀粉酶和真菌海藻糖酶添加到含有98克液化物的每个
SSF容器中。然后，添加2ml繁殖的酵母培养物( Thrive，杜邦公司)，并且随
后以表13中所示的不同浓度添加尿素和FERMGENTM 2.5x(含有酸性真菌蛋白酶的杜邦公司
商业产品)。实验以一式两份进行。
SSF容器中。然后，添加2ml繁殖的酵母培养物( Thrive，杜邦公司)，并且随
后以表13中所示的不同浓度添加尿素和FERMGENTM 2.5x(含有酸性真菌蛋白酶的杜邦公司
商业产品)。实验以一式两份进行。
[0697] 将发酵容器在32℃下在强制空气孵育器中以150rpm孵育。在四个不同的时间点(24h、30h、47h和53小时)收集样品。使用如下所述的HPLC分离和定量分析这些样品的乙醇浓度。
[0698] 将发酵样品以15,000g离心7分钟。将上清液在0.01N H2SO4中稀释11x并在HPLC分析之前通过0.22μm过滤器过滤。HPLC(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)1200系列)运行条件如下：Phenomenex RezexTM RFQ-快速酸H+柱保持在80℃，以0.01N H2SO4溶剂的
1.0mL/min等度流速，10μL注射体积和5.3min洗脱运行时间运行。将折射率检测用于乙醇的定量，并且结果示出于表13中。
1.0mL/min等度流速，10μL注射体积和5.3min洗脱运行时间运行。将折射率检测用于乙醇的定量，并且结果示出于表13中。
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