磁力固定化的杀微生物酶
阅读：83发布：2021-03-20
专利汇可以提供磁力固定化的杀微生物酶专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供用于减少 植物 、动物、织物和由此所得产品中的微 生物 污染 或感染的组合物和方法。本发明还提供用于减少人类感染的组合物和方法。具体地说，本发明提供在一种组分中包含抑细菌酶、杀细菌酶、抑 真菌 酶或杀真菌酶和在另一种组分中包含这些酶的底物的固体磁纳米颗粒。这些组合物处于休眠状态，且在暴露于 水 合作用和 氧 气时变得有活性。，下面是磁力固定化的杀微生物酶专利的具体信息内容。
1.一种固体抗微生物组合物，其包含：
a.第一组分，其具有磁纳米颗粒的自组装中孔聚集体，这些聚集体包含产生过氧化氢的酶和产生自由基的酶；和
b.第二组分，其具有所述产生过氧化氢的酶的第一底物和所述产生自由基的酶的第二底物；
其中所述组合物基本上无活性，其中所述第一组分和所述第二组分暴露于水合作用或氧气使所述组合物活化，并导致所述产生过氧化氢的酶的所述底物氧化成过氧化氢，其中所述过氧化氢充当所述产生自由基的酶的底物，并且其中产生的所述自由基具有抑微生物或杀微生物活性。
2.如权利要求1所述的抗微生物组合物，其中所述活性是抑细菌或杀细菌活性。
3.如权利要求1所述的抗微生物组合物，其中所述活性是杀病毒活性。
4.如权利要求1所述的抗微生物组合物，其中所述活性是杀真菌活性。
5.一种液体抗微生物组合物，其包含：
a.第一组分，其具有磁纳米颗粒的自组装中孔聚集体，这些聚集体包含产生自由基的酶；和
b.第二组分，其具有所述产生自由基的酶的底物和过氧化氢源；
其中所述组合物基本上无活性，其中混合所述第一组分和所述第二组分使所述组合物活化，并导致所述过氧化氢源充当所述产生自由基的酶的底物，并且其中产生的所述自由基具有抑微生物或杀微生物活性。
6.如权利要求5所述的液体抗微生物组合物，其中所述第一组分还包含产生过氧化氢的酶，并且所述过氧化氢源是所述产生过氧化氢的酶的底物。
7.如权利要求5或6中任一项所述的抗微生物组合物，其中所述活性是抑细菌或杀细菌活性。
8.如权利要求5或6中任一项所述的抗微生物组合物，其中所述活性是杀病毒活性。
9.如权利要求5或6中任一项所述的抗微生物组合物，其中所述活性是杀真菌活性。
10.如权利要求1-4中任一项所述的抗微生物组合物，其中所述第一组分和所述第二组分是层。
11.如权利要求10所述的抗微生物组合物，其中所述层之一在另一所述层的内部。
12.如权利要求1-9中任一项所述的抗微生物组合物，其中所述磁纳米颗粒的中孔聚集体具有氧化铁组合物。
13.如权利要求1-12中任一项所述的抗微生物组合物，其中所述磁纳米颗粒的中孔聚集体具有如下磁纳米颗粒尺寸分布，其中至少90％的磁纳米颗粒具有至少3nm和最多至
30nm的尺寸；以及如下聚集颗粒尺寸分布，其中至少90％的所述磁纳米颗粒的中孔聚集体具有至少10nm和最多至500nm的尺寸。
14.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中所述磁纳米颗粒的中孔聚集体具有至少10emu/g的饱和磁化强度。
15.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中所述产生自由基的酶和所述产生过氧化氢的酶以最多至100％的饱和容量容纳在所述磁纳米颗粒的中孔聚集体中。
16.如权利要求1-15中任一项所述的抗微生物组合物，其中所述产生过氧化氢的酶是氧化酶。
17.如权利要求16所述的抗微生物组合物，其中所述氧化酶是葡萄糖氧化酶或醇氧化酶。
18.如权利要求1-4或6-9中任一项所述的抗微生物组合物，其中所述产生过氧化氢的酶的所述底物是β-D-葡萄糖或醇。
19.如权利要求1-18中任一项所述的抗微生物组合物，其中所述产生自由基的酶是过氧化物酶。
20.如权利要求19所述的抗微生物组合物，其中所述过氧化物酶是乳过氧化物酶。
21.如权利要求19所述的抗微生物组合物，其中所述过氧化物酶是髓过氧化物酶、嗜酸性粒细胞过氧化物酶或甲状腺过氧化物酶。
22.如权利要求19所述的抗微生物组合物，其中所述过氧化物酶的所述底物是硫氰酸盐、碘化物或溴化物。
23.如权利要求1-22中任一项所述的抗微生物组合物，其中所述产生自由基的酶产生次硫氰酸根、次碘酸根或次溴酸根。
24.如权利要求11所述的抗微生物组合物，其中所述产生自由基的酶在所述内部层中。
25.如权利要求1-24中任一项所述的抗微生物组合物，其还包含纤维素酶。
26.如权利要求25所述的抗微生物组合物，其中所述纤维素酶是外切纤维素酶或内切纤维素酶。
27.如权利要求25所述的抗微生物组合物，其中所述纤维素酶掺入到所述抗微生物组合物的外层中。
28.如权利要求1-4中任一项所述的抗微生物组合物，其中所述第一组分还包含基质材料，该基质材料是水溶性纤维素衍生物或水可溶剂化纤维素衍生物。
29.如权利要求1-4中任一项所述的抗微生物组合物，其中所述第二组分还包含基质材料，该基质材料是水溶性纤维素衍生物或水可溶剂化纤维素衍生物。
30.如权利要求28-29中任一项所述的抗微生物组合物，其中所述基质材料是羧甲基纤维素。
31.如权利要求1-4中任一项所述的抗微生物组合物，其还包含藻酸盐衍生物或壳聚糖衍生物。
32.一种农业产品，其包含如权利要求1-31中任一项所述的抗微生物组合物。
33.一种液体杀有害生物剂产品，其包含如权利要求5-9中任一项所述的抗微生物组合物。
34.一种种子包衣，其包含如权利要求1-33中任一项所述的抗微生物组合物。
35.一种改良种子，其包含如权利要求1-33中任一项所述的抗微生物组合物。
36.如权利要求35所述的改良种子，其中所述种子选自下组，该组由以下各项组成：蔬菜、水果、花卉和大田作物。
37.如权利要求36所述的改良种子，其中所述蔬菜种子选自下组，该组由以下各项组成：番茄、豌豆、洋葱、大蒜、欧芹、牛至、罗勒属植物、芫荽叶、胡萝卜、卷心菜、玉米、黄瓜、萝卜、胡椒、西兰花、菜花、黄瓜、菠菜、羽衣甘蓝、甜菜、菊芋和莴苣。
38.如权利要求36所述的改良种子，其中所述水果种子选自下组，该组由以下各项组成：柑橘类、番茄、橙、柠檬、酸橙、鳄梨、克莱门小柑橘、苹果、柿子、梨、桃、油桃、浆果、草莓、树莓、葡萄、蓝莓、黑莓、樱桃、杏、葫芦、西葫芦、绿皮西葫芦、茄子、南瓜、椰子、番石榴、芒果、番木瓜、甜瓜、蜜瓜、罗马甜瓜、西瓜、香蕉、大蕉、凤梨、温柏、山梨、枇杷、李子、黑醋栗、石榴、无花果、橄榄、水果核、坚果、花生、杏仁、腰果、榛子、巴西坚果、阿月浑子果实和澳洲坚果。
39.如权利要求36所述的改良种子，其中所述大田作物选自下组，该组由以下各项组成：玉米、小麦、大豆、卡诺拉、高粱、马铃薯、甘薯、山药、扁豆、豆类、木薯、咖啡树、干草、荞麦、燕麦、大麦、油菜、柳枝稷、象草、甜菜、甘蔗和稻。
40.如权利要求36所述的改良种子，其中所述花卉种子选自下组，该组由以下各项组成：一年生植物、多年生植物、鳞茎、开花木质梗、康乃馨、玫瑰、郁金香、罂粟、金鱼草、百合花、菊花、鸢尾属植物、六出花属植物、绒球花(pom)、紫藤和鹤望兰。
41.如权利要求36所述的改良种子，其中所述种子是番茄种子。
42.一种动物垫料，其包含如权利要求1-33中任一项所述的抗微生物组合物。
43.一种伤口敷料，其包含如权利要求1-33中任一项所述的抗微生物组合物。
44.如权利要求38所述的伤口敷料，其中所述伤口敷料是绷带。
45.一种织物，其包含如权利要求1-33中任一项所述的抗微生物组合物。
46.一种提高植物产品产量的方法，其包括在所述植物种植或发芽之前或在此期间使如权利要求34-41中任一项所述的改良种子暴露于水合作用和氧化作用。
47.一种提高动物产品产量的方法，其包括在所述动物使用之前或在此期间使如权利要求42所述的动物垫料暴露于水合作用和氧气。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述水合作用来自所述动物的尿液。
49.如权利要求47-48中任一项所述的方法，其中所述动物产品选自下组，该组由以下各项组成：活畜、乳、肉、脂肪、蛋、体液、血液、血清、抗体、酶、凝乳酶、骨头、动物副产品和动物废物。
50.如权利要求47-48中任一项所述的方法，其中所述动物选自下组，该组由以下各项组成：奶牛、猪、鸡、火鸡、马、绵羊、山羊、驴、骡子、鸭、鹅、水牛、骆驼、牦牛、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠、狗、猫、仓鼠、豚鼠、爬行动物、两栖动物、鹦鹉、长尾小鹦鹉、澳洲鹦鹉、金丝雀、鸽子、鸽和昆虫。
51.一种减少败血症的方法，其包括将如权利要求44所述的伤口敷料施用至伤口。
52.一种产生如权利要求1-4中任一项所述的抗微生物组合物的方法，其包括使所述第一组分用选自由以下项组成的组的基质材料配制：水溶性纤维素衍生物、水可溶剂化纤维素衍生物、藻酸盐衍生物和壳聚糖衍生物，并使所述第二组分用选自由以下项组成的组的基质材料配制：水溶性纤维素衍生物、水可溶剂化纤维素衍生物、藻酸盐衍生物和壳聚糖衍生物。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述第一组分还经受喷雾干燥、冷冻干燥、转鼓式干燥、脉动燃烧干燥或旋转种子包衣。
54.如权利要求52所述的方法，其中所述第二组分还经受喷雾干燥、冷冻干燥、转鼓式干燥、脉动燃烧干燥或旋转种子包衣。
55.一种减少或消除微生物有害生物生长的方法，其包括用如权利要求5-9中任一项所述的液体抗微生物组合物对物质进行喷涂。
磁力固定化的杀微生物酶
相关申请的交叉引用
[0001] 本申请要求于2015年5月18日提交的美国临时申请号62/163,032和于2015年9月8日提交的美国临时申请号62/215,713的权益，两者通过引用以其全文结合在此。
技术领域
[0002] 本发明提供用于减少植物、动物、织物和由此所得产品中的微生物污染或感染的组合物和方法。本发明还提供用于减少人类感染的组合物和方法。具体地说，本发明提供在一种组分中包含抑细菌酶、杀细菌酶、抑真菌酶和杀真菌酶和在另一种组分中包含这些酶的底物的固体磁纳米颗粒。这些组合物处于休眠状态，且在暴露于水合作用和氧气时变得有活性。
背景技术
[0003] 污染和感染性微生物显著降低世界范围内农产品和动物产品的产量、质量和安全性。仅在美国，所造成的经济损失为每年数百亿美元。此外，当前用于减少动物感染的方法依赖于留在食物链中并产生多重抗药性的“超级细菌”的抗生素的有害过度使用。这些细菌经过选择而在医学上重要的抗生素的存在下存活下来，并成为人类健康的重大威胁。
[0004] 种子可跨农场、州际和国家间传播植物疾病。此类疾病的控制可以从种子着手。种子处理应保护种子免受病原体如细菌、病毒和真菌的侵害。因此，高质量、无病种子是获得较高植物产量和食品安全的重要组成部分。
[0005] 例如，美国的番茄生产受到细菌性叶斑病(BLS)的严重威胁，这种病是由黄单胞菌属(Xanthomonas spp.)引起。这是一种造成重大经济损失的毁灭性疾病，有报道称，仅在佛罗里达州，该病原体每年给新鲜番茄行业造成多达$8700万的损失。BLS由以下四大黄单胞菌属物种引起：番茄细菌性斑点致病黄单胞菌(X.euvesicartoria)、穿孔黄单胞菌(X.perforans)(即，地毯草黄单胞菌辣椒斑点致病变种(X.axonopodis pv.vesicatoria))、辣椒疮痂病菌(X.vesicatoria)和加德纳黄单胞菌(X.gardneri)，且最近已经引入了外来菌株。
[0006] 细菌感染在叶子和果实上产生单个斑点(病灶)，降低农作物产量。细菌细胞侵袭宿主组织引起整株植物枯萎，并大大降低植物光合作用和产果的能力。果实斑点并不太深入番茄果实，但它们会降低新鲜番茄的价值，因为消费者通常不愿意食用表面带有凸起、结痂黑斑的水果和蔬菜。此外，有各种可定殖在病灶上的真菌和其他细菌，这就产生了继发感染并引起果实腐烂。尽管黄单胞菌属可在成熟果实上导致较少的BLS，但大部分农作物损失是由早期感染造成，这就引起花朵凋谢和幼果脱落。
[0007] 植物病原体通常通过繁殖材料的传播而散播，繁殖材料包括种子、移植物、鳞茎和其他繁殖材料。种子污染是黄单胞菌属引起的BLS爆发的主要原因，但自生宿主植物是另一感染源。已显示，黄单胞菌属可在种子上和内部存活超过16.5个月，甚至有可能存活多年。子叶或胚叶从带有受污染种皮的种子出苗时，它们就会被感染。即使只有一些种子被污染，它们也可以毁坏一块田地，因为受感染的幼苗将感染旁边的幼苗，幼苗比成熟植物更容易感染。
[0008] 控制植物病原体非常依赖合成化学品如铜盐来维持高产量。然而，公众越来越担忧农用化学品残留对人类健康和环境的影响(Mark等人，FEMS Microbiol.Ecol.[欧盟微生物学会杂志]56(2):167-77(2006)；Ritter等人，J.Tox.Environ.Health[毒理学与环境卫生杂志]9(6):441-56(2006))。研究显示，使用合成农用化学品的农民有较多的神经问题，包括头痛、疲劳、失眠、头晕和手颤(http://www.niehs.nih.gov/health/topics/agents/pesticides/)。农用化学品也会引起出生缺陷、神经损伤、癌症、精子活力下降和急性中毒(Moses,AAOHN J.,37(3):115-30(1989)；Reeves和Schafer Int’l J.,Occup.Environ.Health[国际职业和环境卫生杂志]9(1):30-39(2003)]；Carozza等人，Environ.Health Perspect.[环境健康远景]116(4):559-65(2008)；美国环境保护署(U.S.Environmental Protection Agency),2014,http://www.epa.gov/pesticides/food/risks.htm)。
[0009] 细菌植物病原体也受到抗生素的控制。具体地说，对于人类消费的作物来说，合成杀细菌剂最让人关切。由于连续施用至作物而产生的抗生素抗性细菌提供了随后可引起危及生命的人类感染的抗生素抗性细菌的贮库。
[0010] 因此，非常需要较安全且有效的替代方案来控制植物病原体。此外，保护作物免受细菌病原体的侵害对于无法使用合成化学品和抗生素的有机作物来说尤其具有挑战性。
[0011] 人类和农场动物中的抗生素抗性正在以新药研发无法涵盖的速率发展和传播。以常规方式给予农场动物抗生素的广泛实践促成此威胁。全球生产的约一半抗生素用在农业上。这种用途多数促进较快速生长并预防而非治疗疾病。农场动物携带的抗性微生物可通过消费受污染食物、直接与动物接触或通过环境传播(例如，在受污染的水或土壤中)传给人类。
[0012] 例如，乳腺炎是乳腺响应于释放毒素的细菌感染乳头管而造成乳腺组织损伤的炎症反应。这会增加血管渗透性，并导致乳产量减少，并改变乳组成。例如，血液成分、血清蛋白质和酶渗漏到乳中。而且，酪蛋白、乳糖和脂肪品质下降(Harmon,J.Dairy Sci[乳业学报]77(7):2103-2112(1994)；Osteras和Edge Acta Vet Scand[斯堪的纳维亚兽医学报]41(1):63-77(2000)；Nielsen,Economic Impact of Mastitis in Dairy Cows.Department of Animal Breeding and Genetics,Uppsala,Sweden,Swedish University of Agricultural Sciences.2009[乳腺炎对乳牛的经济影响，动物与遗传学系，瑞典乌普萨拉，瑞典农业科学大学2009])。)
[0013] 乳腺炎是由“传染性”病原体和“环境”病原体二者引起。传染性病原体是只存在于乳中的细菌，并在挤奶过程中传播到未受感染的乳房。环境病原体存在于环境中，并在挤奶间感染乳房。近年来，引起乳腺炎的细菌的流行病学已经改变。主要传染性病原体无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)已经从许多畜群中根除，但其他原发性传染性病原体金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)仍然普遍存在。然而，最重要的变化是，环境病原体(例如，乳房链球菌(Str.uberis)、停乳链球菌(Str.Dysgalactiae)、肠杆菌和大肠杆菌样大肠杆菌和克雷伯氏菌属菌种(Klebsiella spp.))引起的乳腺炎已经急剧增加(Jones和J.M.Swisher2009；Jones和T.L.Bailey 2009)。
[0014] 据美国农业部称，乳腺炎是在美国奶牛中导致使用抗生素的首要疾病(Kerr,Drying-Off Lactating Livestock[榨干哺乳期牲畜],Small Farms[小农场]V(2010)。)鉴于如此大量使用抗生素，乳腺炎大大助长了人类健康风险的增加。
[0015] 同样，养禽业一贯地给动物饲喂少量预防性抗生素，包括属于医学上重要的药物类别的抗生素。此举试图避免疾病并强健禽类身体。然而，此实践筛选出可终止于人类食物链的抗药性细菌。
[0016] 因此，出于本文所述的原因，迫切需要新的控制农场动物中的微生物感染和污染的方法。
发明内容
[0017] 本发明提供用于减少植物、动物、织物和由此所得产品中的微生物污染或感染的组合物和方法。发明还提供用于减少人类感染的组合物和方法。具体地说，本发明提供在一种组分中包含稳定化抗微生物酶和在另一种组分中包含这些酶的底物的固体磁纳米颗粒。这些组合物处于休眠状态，且在暴露于水合作用和氧气时变得有活性。随后，这些酶的底物转化为阻止微生物和病毒生长或将其杀死的过氧化氢和自由基。
[0018] 本发明提供了一种新的用安全强效的氧化剂控制农业、工业和医学微生物的方法。本发明有效对抗许多感染性生物和腐败生物。
[0019] 因此，本发明提供固体抗微生物组合物，其包含：第一组分，其具有磁纳米颗粒的自组装中孔聚集体，这些聚集体包含产生过氧化氢的酶和产生自由基的酶；和第二组分，其具有所述产生过氧化氢的酶的第一底物和所述产生自由基的酶的第二底物；其中所述组合物基本上无活性，其中使所述第一组分和所述第二组分暴露于水合作用或氧气使所述组合物活化，并导致所述产生过氧化氢的酶的所述底物氧化成过氧化氢，其中所述过氧化氢充当所述产生自由基的酶的底物，并且其中产生的所述自由基具有抑微生物或杀微生物活性。
[0020] 本发明还提供液体抗微生物组合物，其包含：第一组分，其具有磁纳米颗粒的自组装中孔聚集体，这些聚集体包含产生自由基的酶的；和第二组分，其具有所述产生自由基的酶的底物和过氧化氢源；其中所述组合物基本上无活性，其中混合所述第一组分和所述第二组分使所述组合物活化，并导致所述过氧化氢源充当所述产生自由基的酶的底物，并且其中产生的所述自由基具有抑微生物或杀微生物活性。
[0021] 在本发明的一些实施例中，抗微生物固体或液体组合物是抑细菌、杀细菌、杀病毒或杀真菌的。
[0022] 在固体抗微生物组合物的一些实施例中，所述第一组分和所述第二组分是层。在优选的实施例中，所述层之一在另一层的内部。在更优选的实施例中，产生自由基的酶在所述内部层中。
[0023] 在固体抗微生物组合物的一些实施例中，所述第一组分还包含基质材料，该基质材料是水溶性纤维素衍生物或水可溶剂化纤维素衍生物。在固体抗微生物组合物的其他实施例中，所述第二组分还包含基质材料，该基质材料是水溶性纤维素衍生物或水可溶剂化纤维素衍生物。在优选的实施例中，所述基质材料是羧甲基纤维素。在其他优选的实施例中，固体抗微生物组合物还包含藻酸盐衍生物或壳聚糖衍生物。
[0024] 在本发明的一些实施例中，所述磁纳米颗粒的中孔聚集体具有氧化铁组合物。在其他实施例中，磁纳米颗粒的中孔聚集体具有如下磁纳米颗粒尺寸分布，其中至少90％的磁纳米颗粒具有至少3nm和最多至30nm的尺寸；以及如下聚集颗粒尺寸分布，其中至少90％的所述磁纳米颗粒的中孔聚集体具有至少10nm和最多至500nm的尺寸。在其他实施例中，磁纳米颗粒的中孔聚集体具有至少10emu/g的饱和磁化强度。
[0025] 在本发明的一些实施例中，产生自由基的酶和产生过氧化氢的酶以最多至100％的饱和容量容纳在所述磁纳米颗粒的中孔聚集体中。
[0027] 在本发明的一些实施例中，产生自由基的酶是过氧化物酶。在优选的实施例中，过氧化物酶是乳过氧化物酶。在其他优选的实施例中，过氧化物酶是髓过氧化物酶、嗜酸性粒细胞过氧化物酶或甲状腺过氧化物酶。在其他实施例中，过氧化物酶的底物是硫氰酸盐、碘化物或溴化物。在其他优选的实施例中，产生自由基的酶产生次硫氰酸根、次碘酸根或次溴酸根。
[0028] 在本发明的一些实施例中，抗微生物组合物还包含纤维素酶。在优选的实施例中，纤维素酶是外切纤维素酶或内切纤维素酶。在其他优选的实施例中，纤维素酶掺入到所述抗微生物组合物的外层中。
[0030] 在更优选的实施例中，本发明提供选自由以下项组成的组的改良种子：蔬菜、水果、花卉和大田作物。
[0031] 在更优选的实施例中，所述蔬菜种子选自下组，该组由以下各项组成：番茄、豌豆、洋葱、大蒜、欧芹、牛至、罗勒属植物、芫荽叶、胡萝卜、卷心菜、玉米、黄瓜、萝卜、胡椒、西兰花、菜花、黄瓜、菠菜、羽衣甘蓝、甜菜、菊芋和莴苣。
[0032] 在其他更优选的实施例中，所述水果种子选自下组，该组由以下各项组成：柑橘类、番茄、橙、柠檬、酸橙、鳄梨、克莱门小柑橘、苹果、柿子、梨、桃、油桃、浆果、草莓、树莓、葡萄、蓝莓、黑莓、樱桃、杏、葫芦、西葫芦、绿皮西葫芦、茄子、南瓜、椰子、番石榴、芒果、番木瓜、甜瓜、蜜瓜、罗马甜瓜、西瓜、香蕉、大蕉、凤梨、温柏、山梨、枇杷、李子、黑醋栗、石榴、无花果、橄榄、水果核、坚果、花生、杏仁、腰果、榛子、巴西坚果、阿月浑子果实和澳洲坚果。在一个最优选的实施例中，所述种子是番茄种子。
[0033] 在其他更优选的实施例中，所述大田作物选自下组，该组由以下各项组成：玉米、小麦、大豆、卡诺拉、高粱、马铃薯、甘薯、山药、扁豆、豆类、木薯、咖啡树、干草、荞麦、燕麦、大麦、油菜、柳枝稷、象草、甜菜、甘蔗和稻。
[0034] 在其他更优选的实施例中，所述花卉种子选自下组，该组由以下各项组成：一年生植物、多年生植物、鳞茎、开花木质梗、康乃馨、玫瑰、郁金香、罂粟、金鱼草、百合花、菊花、鸢尾花、六出花属植物、绒球花(pom)、紫藤和鹤望兰(bird of paradise)。
[0035] 本发明提供提高植物产品产量的方法，其包括在所述植物种植或发芽之前或在此期间使本文所述的改良种子暴露于水合作用和氧化作用。
[0036] 本发明提供包含本文所述抗微生物组合物的动物垫料。
[0037] 本发明还提供提高动物产品产量的方法，其包括在所述动物使用之前或在此期间使本文所述的动物垫料暴露于水合作用和氧气。在优选的实施例中，所述水合作用来自所述动物尿液。在优选的实施例中，所述动物产品可选自下组，该组由以下各项组成：活畜、乳、肉、脂肪、蛋、体液、血液、血清、抗体、酶、凝乳酶、骨头、动物副产品和动物废物。在其他优选的实施例中，所述动物可选自下组，该组由以下各项组成：奶牛、猪、鸡、火鸡、马、绵羊、山羊、驴、骡子、鸭、鹅、水牛、骆驼、牦牛、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠、狗、猫、仓鼠、豚鼠、爬行动物、两栖动物、鹦鹉、长尾小鹦鹉、澳洲鹦鹉、金丝雀、鸽子、鸽和昆虫。
[0038] 本发明提供包含本文所述抗微生物组合物的伤口敷料。在优选的实施例中，伤口敷料是绷带。在其他实施例中，本发明提供减少败血症的方法，其包括将本文所述伤口敷料施用至伤口。
[0039] 本发明提供包含本文所述抗微生物组合物的织物。
[0040] 本发明提供生产本文所述固体抗微生物组合物的方法，其包括使所述第一组分用选自由以下项组成的组的基质材料配制：水溶性纤维素衍生物、水可溶剂化纤维素衍生物、藻酸盐衍生物和壳聚糖衍生物，并使所述第二组分用选自由以下项组成的组的基质材料配制：水溶性纤维素衍生物、水可溶剂化纤维素衍生物、藻酸盐衍生物和壳聚糖衍生物。在优选的实施例中，所述第一组分或所述第二组分还经受喷雾干燥、冷冻干燥、转鼓式干燥、脉动燃烧干燥或旋转种子包衣。
[0042] 图1.固体抗微生物组件的图解和其用作种子包衣时的功能。
[0043] 图2.使用Amplex Red氧化作为指示，比较游离和固定大豆过氧化物酶加葡萄糖氧化酶(SB1+GOX-1)的速度。与游离酶相比，固定作用使自由基生产效率增加三倍。
[0044] 图3.在溶液中5分钟后，通过存活和死亡荧光测定测量的LP系统对5x106个大肠杆菌细胞的功效。测量不同浓度的葡萄糖或H2O2。(A)LP/GOX固定化(阴影线)对游离(实心)。(B)LP固定化(阴影线)对游离(实心)。
[0045] 图4.固体组件中的SBP和GOX在体外有效地杀死黄单胞菌属。(A)BNC-固定化酶与纤维素膜悬浮底物接触。(B)混合、水合和暴露于生长的细菌单层后，组件在24小时后显示显著生长抑制。
[0046] 图5.固体组件7天后包衣的番茄种子发芽。未观察到有发芽抑制。测试种子和对照种子示出85％发芽率。小麦测定的发芽率为100％。
[0047] 图6.一个实施例的示意图，其中机器产生具有本发明抗微生物组合物的改良种子。
[0048] 图7.固体抗微生物组合物的图表和其用作动物垫料包衣时的功能。
[0049] 图8.一个实施例的示意图，其中机器产生具有本发明抗微生物组合物的改良动物垫料。
[0050] 图9.0.1X至10X酶浓度对野油菜黄单胞菌(Xanthomonas Campestris)致病变种14171的作用。
[0051] 图10.底物浓度对野油菜黄单胞菌致病变种的影响。图10A示意性地示出酶组件在分析中时的布局。图10B示出在所有底物浓度下的生长抑制。
[0052] 图11.0.1X至10X酶浓度对病原性真菌钟器腐霉(Pythium vexans)的作用。
[0053] 图12.番茄种子通过本发明的种子包衣免于假单胞菌属(Pseudomonas)和棍状杆菌属(Clavibacter)病原体的伤害。酶层包含1X酶制剂和1X底物制剂。种子一式三份。图12A示出丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)14045-8b。图12B示出密执安棍状杆菌(Clavibacter michiganensis)0690。
[0054] 图13.种子包衣以距离依赖性方式保护番茄种子免受病原性镰刀菌属物种的伤害。种子包衣包含1X酶制剂和1X底物制剂。一式三份地种植种子，并放置在与真菌接种物不同距离的位置。
具体实施方式
[0055] 本发明提供用于减少植物、动物、织物和由此所得产品中的微生物污染或感染的组合物和方法。这是首次通过在一种组分中包含呈自组装磁纳米颗粒的产生过氧化氢(HPP)的酶和产生自由基(FRP)的酶和在另一种组分中包含这些酶的底物的固体多组分组合物来实现。这些磁力固定化的酶可以呈稳定且无活性的固体或液体组合物。因此，可以在掺入产品之前或之后储存。当需要抗微生物活性时，这些多组分组合物通过暴露于水合作用和/或氧气活化。HPP酶作用于底物，产生过氧化氢和D-葡萄糖酸-δ-内酯。FRP酶作用于过氧化氢和一种或多种其他底物，产生自由基。过氧化氢和自由基具有抗微生物性质。在可替代的实施例中，与产生过氧化氢的酶加其底物相对，提供过氧化氢。
[0056] 包含包埋过氧化物酶的自组装中孔纳米簇具有高度活性且稳健。该技术是生物化学、纳米技术和生物工程的强力结合，一体化组织水平有三：第1水平是过氧化物酶和氧化酶与磁纳米颗粒(MNP)自组装以便合成磁性中孔纳米簇。该水平利用分子自包埋机制固定和稳定酶。第2水平是使MNP稳定成其他矩阵。第3水平是产品整修和封装以递送水平1+2。吸附到酶的磁纳米颗粒的集合在本文中也称为“生物纳米催化剂”(BNC)。
[0057] MNP固定作用提供高活性且具成本效益的过氧化物酶。过氧化物酶是非常强力的酶，但众所周知在工业环境下难以部署，因为存在过量过氧化物有强烈抑制作用。NP增加过氧化反应活性并减少其抑制作用，这使得NP具有工业用途。此外，MNP允许有较宽范围的操作条件，诸如温度、离子强度和pH。(MNP的尺寸和磁化强度影响NP的形成和结构，两者都对包埋的酶的活性具有重大影响。借助它们在各种反应条件下出乎意料的弹性，MNP可用作改良的酶剂或催化剂，当前正在使用其他的此类试剂。此外，可将它们用在其中尚未考虑或发现酶是适用的其他应用中。
[0058] BNC包含作为磁纳米颗粒间空隙空间的中孔。酶优选地包埋或固定在BNC的中孔的至少一部分内。如本文所用，术语“磁性”涵盖所有类型的有用磁特性，包括永久磁性行为、超磁性行为、顺磁性行为、铁磁体行为和亚铁磁体行为。
[0059] 磁纳米颗粒或BNC具有纳米级别的尺寸，即通常不超过500nm。如本文所用，当磁纳米颗粒近乎或基本上为球形时，术语“尺寸”可指磁纳米颗粒的直径。在磁纳米颗粒不是近乎或基本上为球形(例如，基本上卵形或不规则)的情况下，术语“尺寸”可指磁纳米颗粒的最长尺寸或三个尺寸的平均值。术语“尺寸”也可以指一群磁纳米颗粒的尺寸的平均值(即“平均尺寸”)。
[0060] 在不同的实施例中，磁纳米颗粒具有精确地、大约、最多至或小于例如500nm、400nm、300nm、200nm、100nm、50nm、40nm、30nm、25nm、20nm、15nm、10nm、5nm、4nm、3nm、2nm或
1nm的尺寸，或具有在以上示例性尺寸中任何两者所界定的范围内的尺寸。
1nm的尺寸，或具有在以上示例性尺寸中任何两者所界定的范围内的尺寸。
[0061] 在BNC中，单个磁纳米颗粒可视为具有以上提供的任何尺寸的初级纳米颗粒(即，初级微晶)。BNC中纳米颗粒的聚集体的尺寸大于纳米颗粒，且通常具有至少约5nm的尺寸(即，次级尺寸)。在不同的实施例中，聚集体具有精确地、大约、至少、大于、最多至或小于例如5nm、8nm、10nm、12nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm或800nm的尺寸，或具有在以上示例性尺寸中任何两者所界定的范围内的尺寸。
[0062] 通常，初级和/或聚集磁纳米颗粒或其BNC具有尺寸分布，即，它们的尺寸通常是分散的，分散得或窄或宽。在不同的实施例中，初级或聚集体尺寸的任何范围可构成整个初级或聚集体尺寸范围的大部分或小部分。例如，在一些实施例中，特定的初级颗粒尺寸范围(例如，至少约1、2、3、5或10nm和最多至约15、20、25、30、35、40、45或50nm)或特定的聚集体颗粒尺寸范围(例如，至少约5、10、15或20nm和最多至约50、100、150、200、250或300nm)构成整个初级颗粒尺寸范围的至少或大于约50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％。在其他实施例中，特定的初级颗粒尺寸范围(例如，小于约1、2、3、5或10nm或大于约
15、20、25、30、35、40、45或50nm)或特定的聚集体颗粒尺寸范围(例如，小于约20、10或5nm、或大于约25、50、100、150、200、250或300nm)构成整个初级颗粒尺寸范围的不超过或小于约
50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％。
15、20、25、30、35、40、45或50nm)或特定的聚集体颗粒尺寸范围(例如，小于约20、10或5nm、或大于约25、50、100、150、200、250或300nm)构成整个初级颗粒尺寸范围的不超过或小于约
50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％。
[0063] 磁纳米颗粒聚集体(即，“聚集体”)或其BNC可具有任何孔隙度，包括实质上没有孔隙率，这取决于制成它们的单个初级微晶的数量。在特定实施例中，聚集体是中孔的，因为含有间隙中孔(即，位于初级磁纳米颗粒之间，通过堆积排列形成的中孔)。中孔的尺寸通常为至少2nm和最多至50nm。在不同的实施例中，中孔可具有精确地或大约例如2、3、4、5、10、12、15、20、25、30、35、40、45或50nm的孔尺寸，或在以上示例性孔尺寸中任何两者所界定的范围内的孔尺寸。类似于颗粒尺寸的情形，中孔通常存在尺寸分布，即，它们的尺寸通常是分散的，分散得或窄或宽。在不同的实施例中，任何中孔尺寸范围可构成整个中孔尺寸范围或整个孔内容积的大部分或小部分。例如，在一些实施例中，特定的中孔尺寸范围(例如，至少约2、3或5和最多至8、10、15、20、25或30nm)构成整个中孔尺寸范围或整个孔内容积的至少或大于约50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％。在其他实施例中，特定的中孔尺寸范围(例如，小于约2、3、4或5nm，或大于约10、15、20、25、30、35、40、45或50nm)构成整个中孔尺寸范围或整个孔内容积的不超过或小于约50％、40％、30％、20％、10％、5％、
2％、1％、0.5％或0.1％。
2％、1％、0.5％或0.1％。
[0064] 磁纳米颗粒可具有本领域中已知的任何组合物。在一些实施例中，磁纳米颗粒是或包括具有磁性的零价金属部分。此类零价金属的一些实例包括钴、镍和铁，以及混合物和合金。在其他实施例中，磁纳米颗粒是或包括磁性金属的氧化物，诸如钴、镍或铁的氧化物，或它们的混合物。在一些实施例中，磁纳米颗粒具有不同的核心和表面部分。例如，磁纳米颗粒可具有由元素铁、钴或镍组成的核心部分以及由钝化层(如金属氧化物或贵金属包衣，如金层、铂层、钯层或银层)组成的表面部分。在其他实施例中，金属氧化物磁纳米颗粒或其聚集体涂覆有贵金属包衣。贵金属包衣可以例如减少磁纳米颗粒表面上的电荷数量，这可以有益地增加在溶液中的分散性，并更好地控制BNC的尺寸。在将螯合有机酸，如柠檬酸、丙二酸或酒石酸用在生物化学反应或过程中时，贵金属包衣防止磁纳米颗粒因沥滤或螯合引起的氧化、溶解。钝化层可具有任何合适厚度，且具体地说，至少、最多至或少于、约例如，0.1nm、0.2nm、0.3nm、0.4nm、0.5nm、0.6nm、0.7nm、0.8nm、0.9nm、1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、
6nm、7nm、8nm、9nm或10nm，或在这些值中任何两者所界定的范围内的厚度。
6nm、7nm、8nm、9nm或10nm，或在这些值中任何两者所界定的范围内的厚度。
[0065] 本发明可使用的磁性材料在本领域中是熟知的。非限制性实例包括铁磁体和铁磁体材料，包括矿石，如铁矿石(磁铁矿或天然磁石)、钴和镍。在其他实施例中，使用稀土磁体。非限制性实例包括钕、钆、镝、钐-钴、钕-铁-硼等。在另外的其他实施例中，磁体包括复合材料。非限制性实例包括陶瓷、铁氧体和铝镍钴磁体。在优选的实施例中，磁纳米颗粒具有氧化铁组合物。氧化铁组合物可以是以下任一者：本领域中已知的磁性或超顺磁性氧化铁组合物，例如，磁铁矿(FesO/O、赤铁矿(α-Fe2θ3)、磁赤铁矿(γ-Fe2C>3)或根据化学式AB2O4的尖晶石型铁氧体，其中A是二价金属(例如，Xn2+、Ni2+、Mn2+、Co2+、Ba2+、Sr2+或其组合)，且B是三价金属(例如，Fe3+、Cr3+或其组合)。
[0066] 单个磁纳米颗粒或其聚集体或其BNC具有任何合适程度的磁性。例如，磁纳米颗粒、BNC或BNC骨架组件可具有至少或最多至约5、10、15、20、25、30、40、45、50、60、70、80、90或100emu/g的饱和磁化强度(Ms)。磁纳米颗粒、BNC或BNC-骨架组件优选地具有不超过(即，最多至)或小于5emu/g，和更优选地，最多至或小于4emu/g、3emu/g、2emu/g、1emu/g、0.5emu/g或0.1emu/g的剩余磁化强度(Mr)。磁纳米颗粒、BNC或BNC-骨架组件的表面磁场可以是约或至少例如约0.5、1、5、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000高斯(G)，或在以上值中任何两者所界定的范围内的磁场。如果包括微粒，微粒也可以具有任何上述磁场强度。
[0067] 磁纳米颗粒或其聚集体可制成吸附适量的酶，最多至或低于饱和水平，这取决于应用，以产生最终BNC。在不同的实施例中，磁纳米颗粒或其聚集体可吸附约、至少、最多至或少于例如，1、5、10、15、20、25或30pmol/m2的酶。可替代地，磁纳米颗粒或其聚集体可可吸附量为约、至少、最多至或少于例如，约饱和水平的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的酶。
[0068] 本发明的抗微生物组件可有效对抗众多病原体。在一些实施例中，病原体包括病原性植物细菌物种，诸如燕麦食酸菌(Acidovorax avenae)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、须芒草伯克霍尔德氏菌(Burkholderia andropogonis)、石竹伯克霍尔德氏菌(Burkholderia caryophylli)、水稻细菌性谷枯病菌(Burkholderia glumae)、韧皮层杆菌属(Candidatus Liberibacter)、玉米红化病植原体(Candidatus Phytoplasma solani)、密执安棍状杆菌、达旦提狄克氏菌(Dickeya dadantii)、番石槽欧文氏菌(Erwinia psidii)、黑胫病果胶杆菌(Pectobacterium atrosepticum)、甜菜果胶杆菌(Pectobacterium betavasculorum)、胡萝卜果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)、胡萝卜果胶杆菌甜菜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.betavasculorum)、山葵果胶杆菌(Pectobacterium wasabiae)、植原体、扁桃假单胞菌(Pseudomonas amygdali)、铁角藏假单胞菌(Pseudomonas asplenii)、番木瓜假单胞菌(Pseudomonas caricapapayae)、菊苣属假单胞菌(Pseudomonas cichorii)、晕斑假单胞菌(Pseudomonas coronafaciens)、皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugate)、天仙果假单胞菌(Pseudomonas ficuserectae)、变黄假单胞菌(Pseudomonas flavescens)、褐鞘假单胞菌(Pseudomonas fuscovaginae)、向日葵假单胞菌(Pseudomonas helianthi)、边缘假单胞菌(Pseudomonas marginalis)、栖稻假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)、帕勒隆尼氏假单胞菌(Pseudomonas palleroniana)、罂粟壳假单胞菌(Pseudomonas papaveris)、萨洛蒙假单胞菌
(Pseudomonas salomonii)、萨氏假单胞菌(Pseudomonas savastanoi)、丁香假单胞菌、番茄假单胞菌(Pseudomonas tomato)、涡轮假单胞菌(Pseudomonas turbinellae)、绿黄假单胞菌(Pseudomonas viridiflava)、Psyllid yellows、青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、带化红球菌(Rhodococcus fascians)、柑桔顽固病菌(Spiroplasma citri)、地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)、野油菜黄单胞菌、野油菜黄单胞菌、白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae)和叶缘焦枯病菌(Xylella fastidiosa)。
(Pseudomonas salomonii)、萨氏假单胞菌(Pseudomonas savastanoi)、丁香假单胞菌、番茄假单胞菌(Pseudomonas tomato)、涡轮假单胞菌(Pseudomonas turbinellae)、绿黄假单胞菌(Pseudomonas viridiflava)、Psyllid yellows、青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、带化红球菌(Rhodococcus fascians)、柑桔顽固病菌(Spiroplasma citri)、地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)、野油菜黄单胞菌、野油菜黄单胞菌、白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae)和叶缘焦枯病菌(Xylella fastidiosa)。
[0069] 在其他实施例中，抗微生物组件有效对抗非植物病原体细菌，包括大肠杆菌(Escherishia Coli)、布氏杆菌属种(Brucella sp.)、弧菌属种(Vibrio sp.)、沙雷氏菌属种(Serrati asp.)、诺卡氏菌属种(Nocardia sp.)、钩端螺旋体属种(Leptospira sp.)、分枝杆菌属种(Mycobacterium sp.)、梭菌属种(Clostridium sp.)、芽孢杆菌属种(Bacillus sp.)、假单胞菌属种、葡萄球菌属种(Staphylococcus sp.)、奈瑟氏菌属种(Neisseria sp.)、嗜血杆菌属种(Haemophilus sp.)、螺杆菌属种(Helicobacter sp.)、支原体属种(Mycoplasma sp.)、假单胞菌属、密螺旋体属种(Treponema sp.)和耶尔森菌属种(Yersinia sp)。
[0070] 在其他实施例中，抗微生物组件有效对抗植物病原体真菌，包括以下属，诸如子囊菌属(Ascidium sp.)、链格孢属种(Alternaria sp.)、蜜环菌属种(Armillaria sp.)、壳二孢属种(Ascochyta sp.)、曲霉属种(Aspergillus sp.)、双极霉属种(Bipoloaris)、烟管菌属种(Bjerkandera sp.)、葡萄孢属种(Botrytis sp.)、角担菌属种(Ceratobasidium sp.)、尾孢菌属种(Cercospora sp.)、金锈菌属种(Chrysimyxa sp.)、枝孢属种(Cladosporium sp.)、旋孢腔菌种(Cochliobolus sp.)、鞘锈菌属种(coleosporium sp.)、刺盘孢属种(Colletotrichum sp.)、帚梗柱孢属种(Cylindrocladium sp.)、壳囊孢属种(Cytospora sp.)、间座壳属种(Diaporthe sp.)、亚隔孢壳属种(Didymella sp.)、内脐蠕孢属种(Drechslera sp.)、白粉菌属种(Erysiphe sp)、外担菌属种(Exobasidium sp.)、镰刀菌属种、灵芝属种(Ganoderma sp.)、赤霉菌属种(Gibberella sp.)、胶锈菌属种(Gymnospragium sp.)、卷担菌属种(Helicobasidium sp.)、纤孔菌属种(Inonotus sp.)、小球腔菌属种(Leptosphaeria sp.)、白壳菌属种(Leucostoma sp.)、小皮伞属种(Marasmius sp.)、叉丝壳属种(Microspaera sp.)、毛霉属种(Mucor sp.)、球腔菌属种(Mycosphaerella sp.)、丛赤壳属种(Nectria sp.)、粉孢属种(Oidium sp.)、钉孢属种(Passalora sp.)、拟盘多毛孢属种(Pestalotiopsis sp.)、色链隔孢属种
(Phaeoramularia sp.)、茎点霉属种(Phoma sp.)、叶点霉属种(Phyllostica sp.)、疫霉属种(Phytophtora sp.)、假尾孢菌属种(Pseudocercospora sp.)、柄锈菌属种(Puccinia sp.)、核腔菌属种(Pyrenophora sp.)、丝核菌属种(Rhizoctonia sp.)、根霉属种(rhizopus sp.)、壳针孢属种(Septoria sp.)、痂圆孢属种(Sphaceloma sp.)、匐柄霉属种(Stemphylium sp.)、小点霉属种(Stigmina sp.)、腥黑粉菌属种(Tilletia sp.)、核瑚菌属种(Typhula sp.)、单胞锈菌属种(Uromyces sp.)、黑粉菌属种(Ustilago sp.)、轮枝孢属种(Verticillium sp)。
(Phaeoramularia sp.)、茎点霉属种(Phoma sp.)、叶点霉属种(Phyllostica sp.)、疫霉属种(Phytophtora sp.)、假尾孢菌属种(Pseudocercospora sp.)、柄锈菌属种(Puccinia sp.)、核腔菌属种(Pyrenophora sp.)、丝核菌属种(Rhizoctonia sp.)、根霉属种(rhizopus sp.)、壳针孢属种(Septoria sp.)、痂圆孢属种(Sphaceloma sp.)、匐柄霉属种(Stemphylium sp.)、小点霉属种(Stigmina sp.)、腥黑粉菌属种(Tilletia sp.)、核瑚菌属种(Typhula sp.)、单胞锈菌属种(Uromyces sp.)、黑粉菌属种(Ustilago sp.)、轮枝孢属种(Verticillium sp)。
[0071] 在其他实施例中，本发明有效对抗植物病毒，包括植物病毒，如花叶病毒(Mosaic Viruses)、斑点病毒(Mottle Viruses)、菜豆金色花叶病毒(Begomoviruses)、香石竹潜病毒(Carlaviruses)、香石竹斑驳病毒(Carmoviruses)、长线状病毒(Criniviruses)、豆科病毒(Fabaviruses)、真菌传棒状病毒(Furoviruses)、玉米褪绿斑驳病毒(Machlomoviruses)、柘橙病毒属(Macluraviruses)、坏死病毒属(Necroviruses)、马铃薯x病毒(Potexviruses)、纤细病毒(Tenuiviruses)和番茄斑萎病毒(Tospoviruses)。
[0072] 磁纳米颗粒或其聚集体或其BNC具有任何合适孔内容积。例如，磁纳米颗粒或其聚集体可具有约、至少、最多至或小于例如约0.01、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1cm3/g的孔内容积，或在以上值中任何两者所界定的范围内的孔内容积。[0052]磁纳米颗粒或其聚集体或其BNC具有任何合适比表面积。例如，磁纳米颗粒或其聚集体可具有约、至少、最多至或少于例如，约50、
60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200m2/g的比表面积。
60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200m2/g的比表面积。
[0073] MNP、它们的结构、组织、合适酶和用途在WO 2012122437和WO 2014055853中有所描述，这些文献的全文通过引用结合在此。
[0074] 在一些实施例中，本发明提供产生过氧化氢(HPP)的酶。在某些实施例中，HPP酶是氧化酶，其可以是EX 1.1.3亚属的。在特定实施例中，氧化酶可以是EC 1.1.3.3(苹果酸氧化酶)、EC 1.1.3.4(葡萄糖氧化酶)、EC 1.1.3.5(己糖氧化酶)、EC 1.1.3.6(胆固醇氧化酶)、EC 1.1.3.7(芳基-醇氧化酶)、EC 1.1.3.8(L-古洛糖酸内酯氧化酶)、EC 1.1.3.9(半乳糖氧化酶)、EC 1.1.3.10(吡喃糖氧化酶)、EC 1.1.3.11(L-山梨糖氧化酶)、EC1.1.3.12(吡哆醇4-氧化酶)、EC 1.1.3.13(醇氧化酶)、EC 1.1.3.14(儿茶酚氧化酶)、EC 1.1.3.15(2-羟酸氧化酶)、EC 1.1.3.16(蜕皮素氧化酶)、EC 1.1.3.17(胆碱氧化酶)、EC 1.1.3.18(仲醇氧化酶)、EC 1.1.3.19(4-羟基扁桃酸氧化酶)、EC 1.1.3.20(长链醇氧化酶)、EC 1.1.3.21(甘油-3-磷酸氧化酶)、EC 1.1.3.22、EC 1.1.3.23(硫胺氧化酶)、EC 1.1.3.24(L-葡糖酸内酯氧化酶)、EC 1.1.3.25、EC 1.1.3.26、EC 1.1.3.27(羟基植烷酸氧化酶)、EC
1.1.3.28(核苷氧化酶)、EC 1.1.3.29(N-酰基氨基己糖氧化酶)、EC 1.1.3.30(聚乙烯醇氧化酶)、EC 1.1.3.31、EC 1.1.3.32、EC 1.1.3.33、EC1.1.3.34、EC 1.1.3.35、EC 1.1.3.36、EC 1.1.3.37(D-阿拉伯糖-l,4-内酯氧化酶)(D-arabinono-l,4-lactone oxidase)、EC
1.1.3.38(香草醇氧化酶)、EC1.1.3.39(核苷氧化酶，H2O2形成)、EC 1.1.3.40(D-甘露醇氧化酶)或EC1.1.3.41(木糖醇氧化酶)。
1.1.3.28(核苷氧化酶)、EC 1.1.3.29(N-酰基氨基己糖氧化酶)、EC 1.1.3.30(聚乙烯醇氧化酶)、EC 1.1.3.31、EC 1.1.3.32、EC 1.1.3.33、EC1.1.3.34、EC 1.1.3.35、EC 1.1.3.36、EC 1.1.3.37(D-阿拉伯糖-l,4-内酯氧化酶)(D-arabinono-l,4-lactone oxidase)、EC
1.1.3.38(香草醇氧化酶)、EC1.1.3.39(核苷氧化酶，H2O2形成)、EC 1.1.3.40(D-甘露醇氧化酶)或EC1.1.3.41(木糖醇氧化酶)。
[0075] 本发明在固体抗微生物组合物的一个顺序组分中提供产生自由基(FRP)的酶。在一些实施例中，FRP是过氧化物酶。过氧化物酶广泛见于生物系统中并形成将过氧化氢(H2O2)还原为水，以将大量各种从苯酚到芳香胺的芳香化合物氧化的氧化还原酶的子集。
[0076] 过氧化物酶属于亚属EC 1.11.1。在某些实施例中，EC 1.11.1酶可以更具体地说是例如，EC 1.11.1.1(NADH过氧化物酶)、EC 1.11.1.2(NADPH过氧化物酶)、EC 1.11.1.3(脂肪酸过氧化物酶)、EC 1.11.1.4、EC 1.11.1.5(细胞色素-c过氧化物酶)、EC 1.11.1.6(过氧化氢酶)、EC1.11.1.7(过氧化物酶)、EC 1.11.1.8(碘化物过氧化物酶)、EC 1.11.1.9(谷胱甘肽过氧化物酶)、EC 1.11.1.10(氯化物过氧化物酶)、EC 1.11.1.11(L-抗坏血酸过氧化物酶)、EC 1.11.1.12(磷脂-氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶)、EC 1.11.1.13(锰过氧化物酶)、EC 1.11.1.14(二芳基丙烷过氧化物酶)或EC 1.11.1.15(过氧化物氧还蛋白(peroxiredoxin))。
[0077] 在其他实施例中，过氧化物酶也可以通过功能进一步具体化，例如，木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶或多功能过氧化物酶。过氧化物酶也可以指定为真菌、微生物、动物或植物过氧化物酶。过氧化物酶也可以指定为I类、II类或III类过氧化物酶。过氧化物酶也可以指定为髓过氧化物酶(MPO)、嗜酸性粒细胞过氧化物酶(EPO)、乳过氧化物酶(LPO)、甲状腺过氧化物酶(TPO)、前列腺素H合成酶(PGHS)、谷胱甘肽过氧化物酶、卤代过氧化物酶、过氧化氢酶、细胞色素c过氧化物酶、山葵过氧化物酶、花生过氧化物酶、大豆过氧化物酶、芜青过氧化物酶、烟草过氧化物酶、番茄过氧化物酶、大麦过氧化物酶或过氧蛋白。在这些具体实施例中，过氧化物酶是乳过氧化物酶。
[0078] 乳过氧化物酶/葡萄糖氧化酶(LP/GOX)抗微生物系统在体液如乳、唾液、泪液和粘液中天然存在(Bosch等人，J.Applied Microbiol.[应用微生物学杂志],89(2),215–24(2000))。这个系统利用硫氰酸盐(SCN-)和碘化物(I-)，两种天然存在的化合物，它们对哺乳动物和高等动物无害(Welk等人Archives of Oral Biology[口腔生物学档案],2587(2011))。LP在过氧化氢(H2O2)存在下将硫氰酸根和碘离子分别氧化为次硫氰酸根(OSCN-)和次碘酸根(OI-)。这个系统中的H2O2是GOX在氧气存在下作用于β-D-葡萄糖而提供。这些自由基化合物进而氧化微生物的细胞膜中的巯基基团(Purdy,Tenovuo等人Infection and Immunity[感染与免疫],39(3),1187(1983)；Bosch等人，J.Applied Microbiol.[应用微生物学杂志],89(2),215–24(2000)，导致膜渗透性受损(Wan,Wang等人Biochemistry Journal[生物化学杂志],362,355–362(2001))，并最终导致微生物细胞死亡。次硫氰酸根和次碘酸根的浓度低至20μM可导致抑制细胞生长(Bosch,van Doorne等人2000)。LP/GOX系统仅凭自己就有效作用于硫氰酸盐；当与碘化物成对时，存在协同作用，改善抑生物或杀生物活性，并扩展易受影响的目标范围，包括革兰氏阴性菌(例如，大肠杆菌、铜绿假单胞菌)、革兰氏阳性菌(例如，金黄色葡萄球菌、链球菌属种)和真菌(例如，白念珠菌(C.albicans))(Reiter,Marshall等人感染和免疫，13(3),800–807(1976)；Bosch等人，应用微生物学杂志,89(2),215–24(2000)；Welk等人口腔生物学档案,2587(2011))。此外，LP/GOX系统在两个阶段起作用：(1)产生次硫氰酸根和次碘酸根并作用于细胞膜上，然后在耗尽这些化合物时，(2)过量H2O2累积，将其自身的氧化损伤作用于细胞结构(Reiter,Marshall等人1976)。前述参考文件通过引用以其全文结合在此。
[0079] 工业上已经使用并批准该酶系统来控制生物膜，诸如牙膏和乳防变质剂。该系统大致上无特异性且稳健，反应要求极少。一项研究发现，在每两个月进行接种18个月后，具有针对革兰氏(-)和(+)细菌和白念珠菌的稳定抑生物或杀生物活性，Bosch等人，应用微生物学杂志,89(2),215–24(2000)。有效的pH范围为3-7，LP活性峰值是在pH 5处(Reiter,Marshall等人1976；Purdy,Tenovuo等人1983)。通常在pH 3下见到针对细菌的较高活性，但这有可能是因为低pH抑制生长(Reiter,Marshall等人1976)。除pH外，LP/GOX系统的唯一严格要求是存在氧气，没了氧气，GOX无法从葡萄糖产生H2O2。前述参考文件通过引用以其全文结合在此。
[0080] LP/GOX已经被描述为微生物(包括细菌和真菌)的杀有害生物剂。(还参见美国专利号6,447,811，通过引用将其全文并入本文)。因此，在一些实施例中，本文所述发明提供呈固体或液体制剂的磁力固定化的杀有害生物剂。杀有害生物剂包含产生自由基的过氧化物酶。在一些实施例中，过氧化物酶是乳过氧化物酶。杀有害生物剂还包含过氧化物源，可包括氧化葡萄糖的酶。
[0081] 本发明提供无活性磁力固定化的酶。这些酶可以是无活性的，因为它们未暴露于水、氧气、底物或它们的任何组合。在本发明的一个优选实施例中，磁力固定化的酶在油基中。这限制了使用之前的酶促活性。固定化酶在暴露于水合作用和/或氧气时活化。在一个更优选的实施例中，磁力固定化的酶在油基中，该油基包含使油在水性溶液中乳化以形成水包油乳液的试剂。在另一个更优选的实施例中，该油是矿物油、植物油或动物油。示例性矿物油包括石蜡油和煤油型油。示例性动物油包括鱼油，诸如鲱鱼油和鲭鱼油。植物油的实例是花生油、芝蔴油、油菜籽油、亚麻籽油、蓖麻油、大豆油、玉米胚芽油和棉籽油。
[0082] 在其他实施例中，为了进一步促进磁力固定化的酶分布在表面上，还可向组合物或油基添加本领域中已知的一种或多种分散剂。在一些实施例中，分散剂是非离子型表面张力降低物质。在优选的实施例中，分散剂是乙氧基化醇和磷脂酰基脂质。
[0083] 在其他实施例中，可以添加一种或多种粘合剂。粘合剂可帮助防止磁力固定化的酶被雨水或其他条件从植物上淋洗掉。粘合剂在本领域中是熟知的。实例是淀粉，胶如黄原胶、阿拉伯树胶和羧甲基纤维素(CMC)。
[0084] 可通过喷涂、喷洒、雾化、顶置喷涂、浇洒、沉浸和滴灌来施用组合物。特别有利于施用组合物的方法是同时以低体积方法(雾化系统)和高体积方法。可将滴灌用于在石棉和其他生长衬底上的培养系统。根据本发明的磁力固定化的酶也可以用于为滴灌系统消毒。在后两种情况中，存在油基严格来说不是最优活性所必需。浸没在有组合物的浴中尤其适合处理植物部分，具体地说可收获的部分，诸如鳞茎、块茎、果实等。
[0085] 磁力固定化的酶可以制成不同形式以便可商购获得。在一个优选的实施例中，过氧化物酶活性被尽可能长久地延缓，因为这会增加产品的储存寿命。酶活性在暴露于水合作用(即，水)和氧气时开始。在这种情况下，葡萄糖氧化酶/葡萄糖系统是过氧化氢供体。在更优选的实施例中，过氧化氢供体与过氧化物酶分开提供。此外，如果需要，油基和分散剂也可以分开封装。
[0086] 在另一实施例中，提供试剂盒来形成组合物，该试剂盒包含含过氧化物酶(例如乳过氧化物酶)的任选地浓缩的酶组合物和过氧化氢供体(例如葡萄糖氧化酶和葡萄糖)。在优选的实施例中，试剂盒还可包含硫氰酸盐、碘化物、油、乳化剂或分散剂。在更优选的实施例中，这些成分在使用前彼此混合。在另一实施例中，试剂盒可包含一种或多种浓缩形式的成分，以在使用前或在使用的同时稀释或水合。
[0087] 在β-D-葡萄糖氧化为H2O2或纤维素衍生的糖氧化为H2O2的实施例中，纤维素酶可与本发明组合物一起提供。在一些实施例中，种子包衣还包含纤维素酶。
[0088] 在一些实施例中，纤维素酶是本领域内已知的外切纤维素酶、内切纤维素酶、半纤维素酶或它们的组合。内切纤维素酶(EC 3.2.1.4)随机裂解非晶态位点的内键，产生新的链末端。外切纤维素酶(EC 3.2.1.91)裂解内切纤维素酶产生的暴露链末端的两个至四个单元，得到四糖或二糖，诸如纤维二糖。主要有两类外切纤维素酶[或纤维二糖水解酶(CBH)]-CBHI从还原端逐渐起作用，而CBHII从纤维素的非还原端逐渐起作用。纤维二糖酶(EC3.2.1.21)或β-葡糖苷酶将外切纤维素酶产物水解成单个单糖。氧化性纤维素酶通过自由基反应使纤维素解聚，正如纤维二糖脱氢酶(受体)。纤维素磷酸化酶利用磷酸而非水使纤维素解聚。
[0089] 在其他实施例中，内切纤维素酶可包括EC 3.2.1.4、内切-1,4-β-D-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,4-内切葡聚糖水解酶、纤维素酶A、纤维素酶AP、内切葡聚糖酶D、碱性纤维素酶、纤维素酶A 3、环糊精酶、9.5纤维素酶、微晶纤维素酶、pancellase SS和1,4-(1,3,
1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶)。纤维素酶通常是由纤维素的真菌、细菌和原生动物产生。‘内切葡聚糖酶’的其他名称是：内切-1,4-β-葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶(CMCase)、内切-1,4-β-D-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,4-内切葡聚糖水解酶和环糊精酶。
1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶)。纤维素酶通常是由纤维素的真菌、细菌和原生动物产生。‘内切葡聚糖酶’的其他名称是：内切-1,4-β-葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶(CMCase)、内切-1,4-β-D-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,4-内切葡聚糖水解酶和环糊精酶。
[0090] 在一些实施例中，本文所述方法使用表达本发明中使用的酶的重组细胞。重组DNA技术在本领域中是已知的。在一些实施例中，细胞经表达载体转化，诸如表达这些酶的质粒。在其他实施例中，载体具有例如用于转录起始、转录终止翻译起始和翻译终止的一个或多个遗传信号。此处，将编码这些酶的核酸克隆进载体，以便在正确地转化到合适宿主生物中时表达。合适的宿主细胞可来自如本领域中熟知的细菌、真菌、植物或动物。
[0091] 在一些实施例中，本发明提供了基质材料是生物聚合物。实例包括多糖(例如，纤维素、半纤维素、木聚糖、壳聚糖、菊粉、葡聚糖、琼脂糖和藻酸)、聚乳酸和聚乙醇酸。在其他实施例中，基质材料是水溶性纤维素衍生物、水可溶剂化纤维素衍生物、藻酸盐衍生物和壳聚糖衍生物。
[0092] 在一些实施例中，基质包括纤维素。纤维素是化学式为(C6H10O5)n的有机化合物，一种由几百到几千个β(1→4)连接的D-葡萄糖单元的直链组成的多糖。本发明中使用的纤维素可以得自或源自植物、藻类或微生物来源。在一些实施例中，本发明提供本领域中已知的纤维素衍生物。纤维素的羟基(-OH)可与本领域中已知的试剂部分或完全反应。在优选的实施例中，纤维素衍生物是纤维素酯和纤维素醚(-OR)。在更优选的实施例中，纤维素衍生物是醋酸纤维素、三乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丙酸纤维素(CAP)、乙酸丁酸纤维素(CAB)、硝化纤维(硝酸纤维素)、硫酸纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、乙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素(HPC)、羟乙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、乙基羟乙基纤维素和羧甲基纤维素(CMC)。
[0093] 在一些实施例中，基质包含羧甲基纤维素。羧甲基纤维素(CMC)或纤维素胶[1]是纤维素衍生物，其中羧甲基(-CH2-COOH)结合到组成纤维素主链的吡喃葡萄糖单体的一些羟基上。它是利用本领域内已知的技术合成，例如通过纤维素与氯乙酸的碱催化反应。极性(有机酸)羧基使纤维素变得可溶并具有化学活性。CMC的功能性质取决于纤维素结构的取代度(即，多少羟基已经参与取代反应)，以及纤维素主链结构的链长和羧甲基取代基的群聚度。
[0094] 在一些实施例中，基质包含羟丙基纤维素(HPC)。HPC是纤维素的衍生物，具有水溶性和有机溶性。HPC是纤维素的醚，其中重复葡萄糖单元中的一些羟基已经利用环氧丙烷被羟丙基化，形成-OCH2CH(OH)CH3基团。每个葡萄糖单元的被取代羟基的平均数目被称为取代度(DS)。完全取代提供的DS为3。因为添加的羟丙基包含羟基，这也可以在制备HPC期间醚化。当发生这种情况时，每个葡萄糖环的羟丙基的摩尔数量，即取代摩尔(MS)可大于3。因为纤维素是非常结晶的，HPC必须具有约4的MS，以在水中达到良好溶解度。HPC具有疏水基团和亲水基团的组合，所以具有较低的临界溶解温度(LCST)，为45℃。在低于LCST的温度下，HPC易于溶解在水中；高于LCST时，HPC不可溶。根据在水中的浓度，HPC形成液晶和许多中间相。此类中间相包括各向同性的、各向异性的、向列型和胆甾相。最后一种产生许多颜色，诸如紫色、绿色和红色。
[0095] 在一些实施例中，基质包含甲基纤维素。甲基纤维素(或methylcellulose)衍生自纤维素。它是一种亲水的纯净形式的白色粉末，并溶解在冷(而不是热)水中，形成透明粘稠的溶液或凝胶。甲基纤维素并不天然存在，且是通过加热纤维素与苛性溶液(例如氢氧化钠溶液)并用氯甲烷处理。在随后的取代反应中，羟基残基(-OH官能团)被甲醇盐(-OCH3基团)替代。
[0096] 依据被取代的羟基数目，可以制备不同类型的甲基纤维素。纤维素是由许多连接的葡萄糖分子组成的聚合物，每个分子暴露三个羟基。将给定形式的甲基纤维素的取代度(DS)定义为每个葡萄糖被取代的羟基的平均数量。因此，DS的理论最大值为3.0，然而，较通常的数值是1.3–2.6。
[0097] 在一些实施例中，基质包含藻酸盐。藻酸盐(Alginate)，也称为藻酸(Alginic acid)和褐藻胶，是广泛分布在褐藻的细胞壁中的阴离子多糖。当与水结合时，形成粘性胶。在萃取形式下，它迅速吸水；它能够在水中吸收200-300倍于自身的重量。它以丝状、颗粒状或粉末形式销售。本发明提供已知藻酸盐和藻酸盐衍生的材料的基质材料。在优选的实施例中，藻酸盐-衍生的材料包括藻酸盐-聚赖氨酸-藻酸盐(APA)、藻酸盐/聚-l-赖氨酸/胶质/聚-1-赖氨酸/藻酸盐(APPPA)、藻酸盐/聚-1-赖氨酸/胶质/聚-l-赖氨酸/胶质(APPPP)和藻酸盐/聚-L-赖氨酸/壳聚糖/聚-l-赖氨酸/藻酸盐(APCPA)、藻酸盐-聚亚甲基-共-胍-藻酸盐(A-PMCG-A)、羟甲基丙烯酸酯-甲基丙烯酸甲酯(HEMA-MMA)、多层HEMA-MMA-MAA、聚丙烯腈-氯乙烯(PAN-PVC)。
[0098] 在一些实施例中，基质包含壳聚糖。壳聚糖是线性多糖，其由随机分布的β-(1-4)-连接D-葡糖胺(脱乙酰单元)和N-乙酰基-D-葡糖胺(乙酰化单元)构成。壳聚糖的氨基具有约6.5的pKa值，这导致酸性至中性溶液的质子化，其中电荷密度取决于pH和％DA-值。这使得壳聚糖具有水溶性，并使其成为生物粘合剂，容易结合至待负电荷表面，如粘膜膜。它在商业上通过用氢氧化钠使几丁质脱乙酰产生，几丁质是甲壳类(诸如蟹和虾)的外骨骼以及真菌的细胞壁中的结构元件。壳聚糖在农业中作为种子处理剂和生物杀有害生物剂使用。在酿酒中，它被用作澄清剂，也帮助防止腐败。它也用在绷带中用来减少出血和用作抗细菌剂。它也用来帮助通过皮肤递送药物。
[0099] 在其他实施例中，基质材料可以是丙烯腈/甲基丙烯磺酸钠、(AN-69)、聚乙二醇/聚五甲基环戊硅氧烷/聚二甲基硅氧烷(PEG/PD5/PDMS)、聚JVjiV-二甲基丙烯酰胺(PDMAAm)、硅质封装物和硫酸纤维素/藻酸钠/聚亚甲基-共-胍(CS/A/PMCG)。
[0100] 在一些实施例中，本发明提供尤其用于种子包衣的抗微生物组合物。易受到响应本文披露的酶系统的病原体伤害的任何种子将受益。在一些实施例中，种子可以是植物、水果、大田作物和花卉的。在其他实施例中，本发明提供尤其用于工业或商业相关驯养动物的垫料和由此衍生的产品的抗微生物组合物。许多驯养动物是本领域中已知的。在其他实施例中，本发明提供尤其用于伤口敷料的抗微生物组合物。许多伤口敷料是本领域中已知的。本发明提供了抵抗响应本文披露的酶系统的病原体或污染物的织物。织物包含本文所述的抗微生物组合物。
[0101] 本发明的一些实施例提供用于减少人类感染的组合物和方法。这是首次通过在一种组分中包含呈磁纳米颗粒的产生过氧化氢(HPP)的酶和产生自由基(FRP)的酶和在另一种组分中包含这些酶的底物的多组分组合物来实现。固体组合物稳定且无活性。因此，可以在掺入产品之前或之后储存。当需要抗微生物活性时，多组分组合物通过水合作用活化。HPP酶作用于底物，产生过氧化氢和D-葡萄糖酸-δ-内酯。FRP酶作用于过氧化氢和一种或多种其他底物，产生自由基。过氧化氢和自由基具有抗微生物性质。
[0102] 为了使在此所述的本发明可以得到更完全的理解，列出了以下实例。应理解的是这些实例仅出于说明性目的而不应理解为以任何方式限制本发明。实例
实例1-优化磁纳米颗粒固定化的HPP和FRP酶
实例1-优化磁纳米颗粒固定化的HPP和FRP酶
[0103] 在BNP中将基于大豆过氧化物酶(SBP)的、一种产生自由基的酶(FRP)用作催化剂。BNP通过将苯酚转化为多酚而将其去除，多酚通过过滤或离心被去除。SBP的最优条件(即，BNP浓度和pH)是如下确定：
[0104] 合并大豆过氧化物酶加葡萄糖氧化酶(SBP/GOX)系统，并共同固定在纳米颗粒簇中。为了消除底物缓冲液中对过氧化氢的需要，葡萄糖氧化酶(GOX)可在氧气和β-D-葡萄糖的存在下用于为组合的过氧化物酶催化剂提供过氧化氢。使用改进的基于高通量微板的测定法用不同量的GOX筛选过氧化物酶催化剂(HRP、SBP或其组合)。用50mM葡萄糖产生H2O2。将总过氧化物酶浓度保持在60nM以进行筛选，并测试不同浓度的GOX(600nm、60nm和6nM GOX)。与10x和0.1x GOX:过氧化物酶系统相比，由等份的固定在240mg/ml材料中的SBP:HRP:GOX组成的三酶系统具有最高自由基产生活性。
[0105] 与游离系统相比，使用如上所确定的优化条件，过氧化物酶利用葡萄糖产生H2O2的活性示出3倍增加。使用这个系统来限定任何过氧化物酶的筛选条件(pH、离子强度、浓度和时间)来形成有效的固定化酶簇。
[0106] 确定了最佳制备条件和三酶系统的SBP、HRP和GOX的比率，对于该系统针对10、50和100mM葡萄糖产生过氧化氢来筛选β-D-葡萄糖浓度(图2)。苯酚浓度增加至1mM。在通过离心去除聚合丸粒后，在OD270下测量未反应的苯酚。3小时后，10mM葡萄糖示出最大活性。这表明，葡萄糖相对于自由基底物的极高浓度是没必要的。虽然葡萄糖相比于其他底物应保持过量，但对于有产生自由基的底物的化学计量反应而言，其在这个系统中的浓度可能可以进一步降至10mM之下。
[0107] 利用上述系统，确定优化的乳过氧化物酶(“LP”或“LCP”)固定条件。利用过氧化氢作为氧化剂(LCP，图3A)或利用葡萄糖作为氧化剂时的LCP加GOX(LCP:GOX，图3B)，确立用于杀死大肠杆菌的在液体介质中的优化LP/GOX条件。分别以125nM:25nM、125nM:12.5nM、125nM:6.25nM测试不同比率的LP:GOX。
[0108] 用125、250或500μg/ml磁纳米颗粒固定混合酶。将新鲜50μl大肠杆菌细胞(最终浓度106个细胞/ml)分布在96孔微板中，并用30μl固定化酶溶液、20μl SCN(0.02M)/20μl H2O2(过氧化物作为氧化剂：1M、0.1M、0.01M)或20μl SCN(0.02M)/20μl葡萄糖(葡萄糖作为氧化剂：1M、0.1M、0.01M)培养。添加100μl 100mM PBS缓冲液，最后体积为200μl。对照包括未固定化酶，只有试剂和100％杀死对照的70％乙醇。所有处理都是一式三份地进行。
[0109] 培养后，对微板离心，以回收细胞。然后将细胞转移至荧光板，进行LIVE/DEAD染色。LIVE/ BacLightTM细菌活力试剂盒(生命技术公司(Life Technologies)，目录号L-7007)提供两种不同的用于快速区分带有完整质膜的活细菌和带有受损膜的死细菌的核酸探针。用荧光读板仪(Biotek)测量荧光计数。使用活细胞和死细胞的标准曲线(乙醇处理后)量化死细胞的数量。将处理功效评估为暴露至固定化酶配方5min后活细菌与死细菌的比率。
[0110] 发现单独的固定化LP(125nM酶:500μg/ml NP)的最高功效为在20μl 0.1M H2O2(10mM最终浓度)的情况下，在5min内杀死约68％细胞(图3A)。当使用固定化LP:GOX(125nM LP:25nM GOX:500μg/ml NP)和20μl 1M葡萄糖(100mM最终浓度)时，5min时的功效为100％(图3B)。在所有情况下，发现固定化酶具有高于其未固定化对应物的功效。实例2-产生固体抗微生物LP/GOX组件
[0111] 将LP/GOX系统(包括FRP底物)划分为固体抗微生物组件，该固体抗微生物组件通过防止GOX消耗葡萄糖和在氧气存在下产生H2O2来稳定活性。将划分的试剂配制成多层包衣组件(第2水平)，使得该配方只有在湿润时活化，并允许底物扩散到酶。LP/GOX是产生抑微生物和杀微生物活性的亚自由基(hyporadical)的非特异性抗微生物系统。这种系统可以施用在如本文所述的新颖植物种子包衣中，防止因为源于土壤的植物病原体的作用损失活种子。
[0112] 通过干燥20μl第1层或第2层的溶液，针对每层制造2mm的圆盘。水活化的圆盘由固定化的酶、底物和将它们保持在一起的纤维素基质构成。第一层含有固定化的LCP/GOX、底物KI和KSCN、以及食品蓝着色剂。第二层含有葡萄糖、KI、KSCN和食品黄着色剂。前者是蓝色的酶/底物点，而后者是只有黄色底物的点。两种都是在粘滞羧甲基纤维素(CMC)溶液中制备，通过移液管将该溶液转移到蜡膜(便于容易移除)上，并干燥24h，留下具有其各自组分的小浓缩圆盘。黄色和蓝色点堆叠在一起形成“夹心”，通过水分活化。表1.蓝色的酶/底物层1
表2.黄色葡萄糖/底物层2
表3.蓝色阴性对照/底物层1
表2.黄色葡萄糖/底物层2
表3.蓝色阴性对照/底物层1
[0113] 在干燥形式时，该组件稳定且无活性。然而，在水合作用时，底物(O2、葡萄糖、KI和KSCN)扩散至固定化酶。水活化的组件合并所有组分，得到针对培养皿上大肠杆菌和黄单胞菌属培养物的杀细菌活性。
[0114] 用类似于抗生素圆盘扩散测定的方法测定水活化的制剂针对植物病原体的功效。在圆盘扩散测定中，将浸渍在已知浓度的抗微生物物质中的小纸盘放置在微生物培养琼脂板上，然后培养形成菌苔。生长抑制区的尺寸可与特定抗微生物物质对特定微生物的抗微生物效果的量级相关联。将第1层与第2层彼此叠加放在刚接种黄单胞菌aa CU6923的利马豆琼脂上(图4A)。然后在室温下培养板24h。不含酶的阴性对照不展现透明。相比之下，具有固定化酶的圆盘杀死黄单胞菌属或防止其生长，如约1cm透明无细菌生长的区域所示。用含配方的酶24H和多达5周后观察细菌生长的总抑制。(图4B)。在马-欣二氏琼脂上的大肠杆菌培养物上发现类似结果，但透明区较小且较少。这可能是因为大肠杆菌是过氧化氢酶(+)生物体。它可消耗反应期间产生的一些过氧化氢，导致LCP/GOX系统的亚基(hypo-radical)产生较低且较慢。因此，过氧化氢酶(+)生物体可需要较高浓度的酶和底物。
实例3-LP/GOX种子包衣
实例3-LP/GOX种子包衣
[0115] 用本文披露的抗微生物组合物以顺次2层系统将种子进行包衣。聚合物的浓度可基于所需包衣厚度而不同。固定化酶的浓度可基于所需抗微生物活性的功效和持续时间而不同。
[0116] 根据以下方案示出固体抗微生物LP/GOX组件具有植物安全性：将1mL黄色葡萄糖/底物混合物与500μL蓝色酶/底物混合物组合。对1mL黄色和500μL蓝色对照进行相同操作。使混合物涡旋。利用夹钳，将20颗番茄种子各自浸入酶和对照混合物中，并允许干燥过夜。
然后将种子置于位于空无菌培养板底部的潮湿滤纸上，在三个部分作如下标记：酶包衣+、酶包衣-、无包衣。7天后，检查种子的发芽情况。
然后将种子置于位于空无菌培养板底部的潮湿滤纸上，在三个部分作如下标记：酶包衣+、酶包衣-、无包衣。7天后，检查种子的发芽情况。
[0117] 酶包衣未抑制种子7天后发芽(图5)。测试和对照种子示出85％发芽率。在相同测定法中使用小麦，发芽率为100％(数据未显示)。
[0118] 在一个小种子批次的实例中，将1g种子浸泡在10ml第1层配方中1min，并在真空烘箱中低温干燥(例如，约40℃)。然后将干燥种子浸在第2层配方中，并在真空烘箱中低温干燥(例如，约40℃)。可使用这种包衣方法优化酶配方、试剂和粘度。粘度与干燥后留在种子上的聚合物的量有关。
[0119] 在一个较大批次种子包衣(例如大于1g、10g或多达5kg或更多种子)的实例中，可使用如本领域中已知的商业种子包衣机。(图6。)示例性种子包衣机可包含立式圆筒形定子和卧式板型转子。转子使种子旋转，由此迫使其上升通过定子，在定子中失去速度并再次螺旋式下降，进入混合室的中部。混合室的中部可包括旋转的旋转盘，确保包衣材料分散。可替代地对于低粘度溶液，喷涂喷嘴可喷涂溶液或使其雾化。
[0120] 在一些实施例中，可利用混合相和干燥相。第一，以约1:2比率将含有酶的溶液涂在旋转种子上(酶重量:种子重量)。可使用干燥喷气流干燥机干燥种子。干燥所需的时间可基于种子和待蒸发的水的量而变化。当种子完全干燥时，以约1:2比率(酶重量:种子重量)将含有葡萄糖、其他底物或其他试剂的第2层的溶液涂在旋转种子上。可使用干燥喷气流干燥机干燥旋转的种子。层溶液与种子的比率可如本领域中已知的一样变化，以优化最终种子包衣。
[0121] 对于超过10kg的较大批次而言，可使用顺次种子包衣机促进在包衣间隙干燥种子。通过本领域中已知的机械方式(例如传送带)将种子从一个包衣机移动到另一个包衣机。所述移动所用时间可用于干燥，然后进入下一次包衣(图6)。
[0122] 本领域的技术人员将认识到，另外的层或组分可在该过程中的任何时间添加至被包衣的种子，只要其不防止抗微生物组合物的活化。其他包衣步骤可包括其他有机、无机和生物添加剂，诸如干燥剂(例如滑石)、着色剂(例如染料)、杀有害生物剂(例如杀虫剂)、植物有益细菌(例如植物生长促进根际细菌孢子)或其他化合物(例如杀真菌剂、肥料、常量营养素和微量营养素)。种子的引发(例如预先水合作用)可通过控制允许在包衣第一层期间渗入种子的水量来优化。
[0123] 在生长室中测试种子包衣的功效，在生长室中，包衣的种子在目标病原体(例如番茄的黄单胞菌属)的存在下在最小水琼脂上生长。放置包衣的种子以在接种了病原体的琼脂表面上发芽。种子周围的抑制区的直径示出配方的功效。
[0124] 可替代地，在受控生长室(14h白天，10h黑夜，60％湿度，22℃)中，种子在约10g接种土壤(每g土壤约105个病原体细胞)中生长。通过测量出苗(发芽率)、植物中病原体的存在或发生率和发芽后死亡率测试土壤功效。实例4-LP/GOX动物垫料包衣
[0125] 在本发明的一个实例中，用磨过的玉米芯(图7，绿色产品公司(Green Products Company)，爱荷华康拉德(Conrad,Iowa))给动物垫料涂上本文披露的固体抗微生物组件。“仿木”材料可在水中吸收其自身的重量，而较软的木髓和木轴可在水中吸收多至4.5倍于自身的重量。该材料具有机械抗性、生物可降解性、可堆肥性和再生性。直径小于3.2mm的颗粒(例如GreenTru1/8”)主要用于小动物垫料。它是由木质环制成，且具有良好吸收特性。
GreenTru 1020玉米芯目前用于“载体”应用(杀有害生物剂和肥料)，在这些应用中，需要大量玉米芯颗粒。
GreenTru 1020玉米芯目前用于“载体”应用(杀有害生物剂和肥料)，在这些应用中，需要大量玉米芯颗粒。
[0126] 玉米芯颗粒在4℃吸入了葡萄糖(100mM)、KI和KSCN(每种0.5mM)和0.5％聚合物，50％持水量(WHC)达24小时，然后在50℃与100℃之间风干至10％水分。“负载的”颗粒充当反应试剂的贮存器。将负载的颗粒浸在含有如本文所披露的固定化酶系统和最佳CMC浓度的包衣配方中。将包衣的颗粒干燥24小时。
[0127] 液体细菌培养物中和固体细菌培养物上示出功能化垫料颗粒的功效。对于固体培养物，将10个具有包衣材料的颗粒置于接种了目标细菌的培养皿上。用10μl水或人造奶牛尿液(2％尿素，pH 6)活化颗粒。测量颗粒周围的非生长区(环)的直径得到抑制效率。
[0128] 在溶液中，向1ml细菌培养物(105、106、107和108个细菌)添加1个颗粒。在5分钟、1小时、24小时和48小时时如上文之前针对LIVE/ 试剂盒所述测量活细胞和死细胞的百分比。
[0129] 对于较大批量的材料包衣(例如大于1g、10g或最多至5kg或更多玉米芯材料)，可使用如上文所述的商业包衣机。(图8。)首先，用含有葡萄糖(50至100mM)和试剂(KSCN和KI分别为0.5mM)和0.5％聚合物(CMC)的溶液喷涂材料，比率1:1(1g材料针对1g溶液)。然后在50℃与100℃之间的温度下干燥材料。在一些实施例中，可使用喷气流。然后以1:2比率(溶液重量:材料重量)将含有固定化酶的溶液涂在材料上。例如，这可以是2％聚合物和0.5mM KSCN和KI。聚合物的浓度基于所需包衣厚度而不同。固定化酶的浓度基于所需抗微生物活性和功效和持续时间而不同。针对垫料和病原体优化酶浓度。将最终材料干燥至约10％或更少的含水量。干燥所需的时间基于材料和待蒸发的水的量而变化。
[0130] 对于超过10kg的较大批次而言，可使用顺次颗粒包衣机促进在包衣间隙干燥种子。将种子以机械方式从一个包衣机移动到另一个包衣机(例如通过传送带)，以便在下一次包衣之前提供干燥时间。实例5-牛乳过氧化物酶和黑曲霉葡萄糖氧化酶种子包衣
[0131] 在本发明的另一个实例中，LP/GOX以1:10LP比GOX的比率配制。GOX来自黑曲霉(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)，圣路易斯，MO，目录号G7141)。LP来自牛乳(西格玛奥德里奇，圣路易斯，MO，目录号61328)。因此，酶的1X组合物是用38.7nM乳糖过氧化物酶和387nM葡萄糖氧化酶和300μg/ml NP配制。组合物还具有0.3mM KI和0.5mM NH4SCN。首先将酶共同固定。简单地说，将酶混合在一起，然后添加至声处理的NP(1min，40％功率)，至最终体积为1ml。然后以1100rpm将试管振荡1小时。
[0132] 通过将20μl点置于琼脂板上制造0.1X、0.2X、1X、5X和10X浓度的固定化酶组件。将组件中羧甲基纤维素聚合物(CMC)的量保持恒定为4％，并用食品着色剂(FD&C Blue 1和red 40，10μl/ml)将配方变成蓝色。每个点含有20μl制剂，制剂在室温下干燥过夜，或在真空下干燥1小时。
[0133] 1X底物制剂含有4％CMC、0.3mM KI、0.5mM NH4SCN和50mM葡萄糖。通过增加底物浓度分析不同底物浓度(1X、5X、10X和20X)，而CMC的量保持恒定为4％。用食品着色剂(FD&C yellow 5，10μl/ml)把配方染成黄色。每个点含有20μl制剂，制剂在室温下干燥过夜，或在真空下干燥1小时。
[0134] 酶组件有效抑制细菌生长。使细菌在液体培养物或固体琼脂板(琼脂15g/L)的LB培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g NaCl/L)上生长。在野油菜黄单胞菌致病变种、丁香假单胞菌番茄变种、和密执安棍状杆菌的野外分离株上测试配方。用玻璃珠程序以约6.6x 105个细菌/板将细菌(48小时液体培养物调整为106个细菌/ml)铺板在琼脂板上，以形成细菌菌苔。接种后，将含有酶的干燥圆盘放在表面上，并将干燥圆盘与底物加在它们上部。CMC再水合时，底物(包括食品着色剂)扩散，使得圆盘变绿。另选地，将包衣的种子置于琼脂表面。在室温下培养板48至96小时，并一式三份地完成板。如图9所示，酶组件以剂量依赖方式有效抑制野油菜黄单胞菌。抑制圈随酶浓度而增加。类似地，图10示出即使在最低底物浓度下都抑制野油菜黄单胞菌。
[0135] 酶组件有效抑制真菌生长。使真菌生长在马铃薯葡萄糖琼脂上。用一塞(7mm直径)集中在板上中央的真菌菌株接种新的板。接种板后，将含有酶稀释液的干燥圆盘加到琼脂表面上，并将干燥圆盘与底物加在它们上部。CMC再水合时，底物(包括食品着色剂)扩散，使得圆盘变绿。在与接种物相同距离的地方添加圆盘，观察菌丝的生长。图11示出钟器腐霉与渐增酶浓度之间的剂量依赖性抑制。
[0136] 酶组件有效保护番茄种子。手动包衣番茄种子(罗格斯变种(var.Rutgers))，首先将种子浸在酶制剂中，真空干燥第一层，将种子浸在底物制剂中，并在室温下第二次真空干燥种子。在每个包衣步骤时将10和13μl之间的每种溶液沉积在种子上。使种子干燥过夜，并在4℃下储存直至进一步使用。图12示出包衣的种子有效避免丁香假单胞菌和密执安棍状杆菌感染。
[0137] 在本发明的另一演示中，以与接种物塞不同的距离放置包衣的种子，接种物塞含有木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。还分析了钟器腐霉和立枯丝核菌(数据未显示)。在室温下培养真菌，并一式三份地完成板。图13示出镰刀菌属在3、5和7天后的距离依赖性抑制。
[0138] 讨论。含有共同固定的乳过氧化物酶和葡萄糖氧化酶的制剂有效防止农业材料受黄单胞菌属、假单胞菌属、棍状杆菌属、腐霉属和镰刀菌属的伤害。对照指示仅有染料或底物对细菌或真菌无作用。针对所有细菌都观察到强的杀细菌作用，其中水合聚合物形成透明卫生区(图9-11)或在包衣的种子周围形成透明卫生区(图12-13)。已显示，卫生区域与酶浓度最具依赖性(图2)。底物的浓度对短期卫生影响很小，但在维持长期效果方面可能具有决定作用。仅固定化葡萄糖氧化酶也具有适度水平的杀细菌活性，因为产生过氧化氢。然而，抗细菌作用因为存在共同固定的牛乳过氧化物酶而显著增加。
[0139] 在真菌病原体尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和钟器腐霉的情况中，观察到极强的负化学排斥。如图11和13中所示，菌丝体的生长是各向异性的，且朝向含有酶制剂的区域(点或包衣的种子)较缓慢。对于镰刀菌属和腐霉属，观察到超过2周的保护作用。在测试的酶和底物范围内，未观察到对立枯丝核菌具有显著作用。
[0140] 因为酶甚至在0.1X浓度下的作用都很大，可使用约1g牛乳过氧化物酶来包衣和保护3030万个番茄种子，并且使用1g葡萄糖氧化酶保护303万个番茄种子。类似地，1kg碘化钾和硫氰酸铵分别足以包衣和保护9亿1200万和11.93亿个种子。因为一升牛乳含有约33mg乳过氧化物酶，可以处理一升乳来提取足量乳过氧化物酶来保护约1百万个番茄种子免受真菌和细菌病原体的伤害。一头奶牛平均每天产生约20升乳。每升含有足量乳过氧化物酶来包衣约2000万个番茄种子。组合物可用于包衣其他种子；与用于番茄种子的量相比，每粒种子使用的溶液量与种子表面积成比例。
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