[0001]
技术领域
[0002] 本
发明涉及
生物化学领域,具体地说,涉及一种多受体激动剂PO13及应用。
背景技术
[0003] 胃泌酸调节肽(oxyntomodulin,OXM)是由胰高血糖素原基因在肠道L细胞和中枢神经元内转录加工后得到的37个
氨基酸组成的脑肠肽。OXM通过同时激活胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)受体和胰高血糖素受体(glucagon receptor,GCGR)发挥显著抑制食欲,减少
能量摄入,增加能量消耗,促进胰岛素释放及远期β细胞保护的功能。其中GLP-1R介导的有效降低血糖和保护胰岛β细胞的功能,是目前糖尿病药物开发的重要靶点。
[0004] 垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP)是由垂体分泌的、或目的组织自分泌和旁分泌的、具有重要生物学功能的神经多肽,属于是促胰液素/高血糖素/血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide)家族中的新成员。PACAP的具有3个B类G蛋白偶联受体:PAC1-R是PACAP的特异受体;VPAC1-R和VPAC2-R是PACAP和VIP的共同受体;PACAP对3个受体具有相同的激动功能。PACAP具有显著的抗细胞凋亡,调节
细胞增殖分化;神经保护和促进神经修复;调节血管功能;促进
激素分泌,调节内分泌平衡;调节性腺功能和生殖细胞的产生;参与消化活动调节能量代谢平衡;调节内分泌平衡;促进觉醒,帮助提升学习和记忆能
力;等的作用。目前已有研究显示PACAP是
预防与
治疗神经退行性
疾病的潜在药物,如阿尔兹海默症病人中脑部的PACAP显著下调,提示补充PACAP及其相关多肽可有效预防与治疗阿尔兹海默症。
发明内容
[0005] 本发明的目的是在生物信息学分析的
基础上,构建同时具备OXM和PACAP活性的短肽,或者说既能增强OXM活性,又能增强PACAP活性的短肽;本发明首次化学合成OXM与PACAP高度同源的N端13个氨基酸的多受体激动剂PO13,其氨基酸序列如SEQ NO.1所示;并且首次尝试检测其体内生物学功能。
[0006] SEQ NO.1:His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr。
[0007] 我们通过生物信息学分析方法,将OXM与PACAP进行比对后发现:它们的N端13个氨基酸高度同源,如图1所示,提示13个氨基酸可能承载OXM与PACAP共同的作用。并且作为内源性的多肽类激素,OXM和PACAP均容易受到体内二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase -4,DPP-4)的对多肽N端的
水解,造成活性减退和丧失,甚至形成自身的
抑制剂;因此体内额外补充OXM和PACAP的N端高同源性的13氨基酸组成的短肽,可能有效稀释DPP-4对OXM和PACAP的降解作用,从而同时增强OXM和PACAP的相关活性。
[0008] 研究发现PO13具有:同时有效激活OXM受体(GLP-1R和GCGR)和PACAP的相关受体(VPAC1/2和PACAP),是一个多向受体的激动剂;同时具备OXM和PACAP的生物学功能;显著抑制
摄食,降低体重,提高
机体糖耐受,具有治疗肥胖、糖尿病等能量代谢失调疾病的潜能;并且显著抑制东莨菪
碱诱导的学习记忆损伤,降低脑部
氧化损伤,提高脑部神经递质活性,提高觉醒,促进学习记忆;而且有效抵抗抑郁产生;能够同时抵抗谷氨酸钠造成的摄食障碍、肥胖、神经损伤与抑郁;具有治疗神经退行性疾病及
抑郁症的潜能;因此PO13具备同时治疗能量代谢失调如肥胖、糖尿病合并神经退行性疾病,如阿尔兹海默症、帕金森症;及(或)抑郁症及(或)学习记忆功能衰退等疾病。
[0009] 与
现有技术相比,本发明具有如下有益效果:本发明的多肽是OXM与PACAP的N端具有高度同源性的13个氨基酸,同时激活OXM与PACAP的受体,同时具备OXM与PACAP生物学活性,因此具有一石多
鸟的作用;能同时用于治疗肥胖、糖尿病等的能量代谢失调疾病,兼并阿尔兹海默症、帕金森症等神经退行性疾病及(或)抑郁症及(或)学习记忆功能衰退等疾病。13个氨基酸组成的PO13短肽采用化学合成,成本低廉;而且序列完全来自体内多肽,几乎不产生免疫反应;因此适用于长期大量的使用。
附图说明
[0010] 图1 为PO13序列的设计思路;图2为化学合成PO13的质谱图(A)和高效液相纯度分析图(B) ;
125
图3为PO13的受体选择性鉴定, (A)PO13有效竞争[ I]OXM对GLP-1R和GCGR的结合,(B)PO13有效激活PAC1R、VPAC1R和VPAC2R;
图4为PO13抑制摄食(A)、减低体重(B);
图5为PO13有效提高糖耐受,减低血糖指数;
图6为PO13保护脑部抗氧化(A)、提高脑部神经递质活性(B);
图7为PO13抑制东莨菪碱诱导的学习记忆损伤(A)并且缩短悬尾绝望模型的不动时间(B);
图8 为PO13抑制谷氨酸钠诱导的肥胖、神经损伤与抑郁:抑制体重增加(A),减低脑部脂质过氧化物水平(B),缩短被迫游泳的静止时间(C)及延长避暗实验的潜伏期(D)。
具体实施方式
[0011] 下面结合具体
实施例对本发明做进一步地描述,但具体实施例并不对本发明做任何限定。
[0012] 实施例1:PO13的化学合成与鉴定PO13的序列为: HSQGTFTSDYSKY,如SEQ NO.1所示;采用化学合成的方法制备,PO13序列的设计思路如图1。如图2A所示,质谱结果显示化学合成多肽分子量为1520.59,与理论值相符;HPLC结果显示纯度大于99%(图2B)。
[0013] 实施例2: PO13是多向激动剂125
受体竞争性结合实验结果表明:如图3A所示,PO13竞争 I标记的OXM对GLP-1R的半有效浓度EC50为35.1±2.3nM,而对GCGR的EC50为23.1±1.9nM,因此PO13与OXM相同,既能激活GLP-1R又能激活GCGR。
[0014] 如图3B所示,PO13均有效促进分别高表达PAC1、VPAC1和VPAC2的CHO细胞的增殖,而且活性与浓度呈正比,显示PO13能同时有效激活PACAP的3个受体。
[0015] 综上所述,PO13能够有效激活OXM和PACAP的受体,是两者的有效替代物。
[0016] 实施例3: PO13有效抑制摄食、降低体重小鼠禁食过夜后,
腹腔注射10nmol/kg PO13后给予食物,没隔1h测定消耗的食物量,共计6h,已注射生理盐水(saline)作为对照,结果如图4A显示,PO13显著抑制了小鼠摄食量(*,p<0.01, PO13 vs. saline);小鼠连续腹腔注射PO13(10nmol/kg/d)14天后,测定小鼠的体重,结果如图4B所示,与注射生理盐水相比,PO13显著减轻了小鼠的体重(*,p<0.01, PO13 vs. saline)。
[0017] 实施例4: PO13有效提高糖耐受,减低血糖指数当PO13(10nmol/kg)与高浓度
葡萄糖(5mg/kg)共同腹腔注射小鼠,收集注射前(0h)和注射后0.5-2h内每隔0.5h的血糖,血糖指数(如图5)显示,与生理盐水相比,PO13显著降低了血糖指数(*,p<0.01, PO13 vs. saline),提高机体处理高糖的能力。
[0018] 实施例5: PO13降低脑部氧化水平,提高神经递质活性小鼠连续腹腔注射PO13(10nmol/kg/d)14天后,对小鼠脑部的脂质过氧化物(MDA)的测定显示,PO13注射小鼠脑部氧化水平显著降低(图6A,*,p<0.01, PO13 vs. saline),并且分解神经递质的乙酰胆碱的乙酰胆碱酯酶浓度显著降低,提示脑部神经递质浓度提高(图6B,*,p<0.01, PO13 vs. saline)。
[0019] 实施例6 :PO13提高学习记忆能力和抵抗抑郁小鼠连续腹腔注射PO13(10nmol/kg/d)14天后,东莨菪碱(Scop)(3mg/kg)注射小鼠,小鼠避暗实验测定小鼠潜伏期,发现如图6A所示,PO13有效提高延长小鼠避暗实验的潜伏期,抵抗东莨菪碱对学习记忆的损伤(图7A,*,p<0.01,PO13 vs. Scop)。进行悬尾绝望实验,发现在5min内PO13显著减少悬尾后的不动时间(图7B,*,p<0.01, PO13 vs. saline),显示PO13具有抑制抑郁的功能。
[0020] 实施例7 :PO13同时抑制肥胖与神经损伤及抵抗抑郁高剂量谷氨酸钠不仅诱导肥胖,而且导致脑部神经损伤并造成抑郁,利用谷氨酸钠诱导的小鼠肥胖模型,发现PO13能够有效抑制谷氨酸钠造成的体重增加(图8A,*,p<0.01, Glu+PO13 vs. Glu)、降低大脑海
马区的脂质过氧化物(MDA)的水平(图8B,*,p<0.01, Glu+PO13 vs. Glu),减少小鼠被迫游泳的抑郁实验的不动时间(图8C,*,p<0.01, Glu+PO13 vs. Glu),并且提高小鼠的避暗实验的认知测定的潜伏期(图8D,*,p<0.01, Glu+PO13 vs. Glu);因此,证明PO13同时具备抑制摄食障碍、肥胖等代谢失调兼和抵抗神经损伤,提高认知与预防抑郁症的活性。