一种月季白粉病菌生理小种的快速鉴定方法
阅读：228发布：2024-02-26
专利汇可以提供一种月季白粉病菌生理小种的快速鉴定方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种月季 白粉病 菌生理小种的快速鉴定方法。包括月季白粉病菌分离纯化和扩繁、月季白粉病菌孢子悬浮液制备、月季寄主材料准备、接种、病情观测和统计、分析及鉴定。在分离纯化和扩繁中将来自于月季野生种的白粉病菌转移到大花香 水 月季组培苗的 叶片 上，来自于月季栽培品种的白粉病菌转移到紫月季花组培苗的叶片上，选择了国内11份 鉴别 寄主材料，待鉴月季白粉病菌分离纯化和扩繁后接种在11份鉴别寄主材料，与月季白粉病菌生理小种类型对照表比对即可鉴定出生理小种类型。本发明供鉴别出11个月季白粉病菌生理小种类型，从接种到鉴定仅需要7天，并可对抗月季白粉病菌育种材料的选择提供指导。，下面是一种月季白粉病菌生理小种的快速鉴定方法专利的具体信息内容。
1.一种月季白粉病菌生理小种的快速鉴定方法，包括以下步骤：
(1)月季白粉病菌的分离纯化和扩繁
①在超净工作台上，用已灭菌的解剖针从采自于不同地点的感染了白粉病菌的月季叶片上，分别蘸取白粉病菌转移到组培瓶内的月季组培苗的叶片上，每蘸取一份白粉病菌材料，须更换新的解剖针，保证不同采集地点的白粉病菌不混合，且来自于月季野生种的白粉病菌转移到大花香水月季(Rosa odorata var.gigantea)组培苗的叶片上，来自于月季栽培品种的白粉病菌转移到紫月季花(Rosa chinensis var.semperflorens)组培苗的叶片上；一个采集地点的白粉病菌材料为一个样本，一个样本接种于一个组培瓶内的月季组培苗的叶片上，然后将接种了白粉病菌的组培瓶在组培室内，培养条件为：光照强度为1800～
3200lx，光周期为10-16h光期、8-14h暗期，空气相对湿度75～90％，室温22～28℃的条件下培养5～9d；
②用步骤(1)①同样的方法转移上述组培苗上的白粉病菌单菌落到相应的新的月季组培苗的叶片上，在步骤(1)①同样的培养条件下培养5～9d；
③重复步骤(1)②3次；
④重复步骤(1)②1次，培养时间改为15～20d；
步骤(1)①至步骤(1)④培养期间，组培瓶内的培养基质均为MS+6-BA 0.2mg/L+NAA
0.02mg/L+蔗糖35g/L+琼脂7.0g/L，且组培瓶瓶口用透气性塑料膜封盖；
(2)月季白粉病菌孢子悬浮液的制备
用已灭菌的毛刷将步骤(1)④中组培苗上的白粉病菌刷到含有0.03％(v/v)吐温20的无菌蒸馏水中，每刷一份白粉病菌材料，须更换新的毛刷，不同采集地点的白粉病菌刷入不同容器内的所述含有0.03％(v/v)吐温20的无菌蒸馏水中，保证不同采集地点的白粉病菌不混合；将每个容器内的孢子浓度用含有0.03％(v/v)吐温20的无菌蒸馏水调至1×104～5×104个/ml，用于接种备用；
(3)月季寄主材料的准备
采集如下鉴别寄主材料，采集从寄主材料月季枝条顶端向下第3～4层的完全展开的含有5片或7片叶的无病虫害的完全叶，先将采集的完全叶用解剖镜镜检，确保所采集的完全叶无任何真菌菌落或菌丝后，再用70％(v/v)乙醇处理1min,然后用无菌水清洗3～5次，用无菌的滤纸吸干完全叶表面的水分，叶面朝上平铺在盛有营养基质的培养皿中，每一种寄主材料的完全叶放置在一个培养皿内；所述营养基质配方：MS+苯并咪唑0.4g/L+琼脂8.0g/L；
所述鉴别寄主材料为：木香花(Rosa banksiae)、悬钩子蔷薇(Rosa rubus)、复伞房蔷薇(Rosa brunonii)、弯刺蔷薇(Rosa beggeriana)、‘绿萼’(Rosa‘Vidiflora’)、‘匍匐红’(Rosa‘Pufuhong’)、‘思春’(Rosa‘Sichun’‘) 蜜糖’(Rosa‘Mitang’)、‘粉嘟嘟’(Rosa‘Fendudu’)‘、云玫’(Ros‘a Yunmei’)‘、粉妆阁’(Ros‘a Fenzhuangge’)；
(4)月季白粉病菌的接种
采用喷雾法或滴液法将步骤(2)来自于不同采集地点的白粉病菌孢子悬浮液分别接种到步骤(3)所述培养皿内的每片叶片上，保证肉眼可见每片叶正面被白粉病菌孢子悬浮液覆盖，每个样本设置3～5个重复；接种完成后，将培养皿在室内光强1800-3200lx、光周期为
10-16h光期、8-14h暗期，空气相对湿度85～95％、室温22-28℃的条件下培养7d；
(5)月季寄主材料的病情观测和统计
接种叶片病情划分为2个等级：0级：抗病，叶片无病斑或<1/5叶面积发病；1级：感病，≧
1/5叶面积发病；
(6)分析及鉴定生理小种
将步骤(5)的统计结果0级用0表示，1级用1表示，一一对应地将不同寄主材料与不同采集地点来源的白粉病菌之间的抗/感性结果列表，并与如下表1月季白粉病菌生理小种类型对照表进行比对鉴定出月季白粉病菌生理小种的类型；
表1 月季白粉病菌生理小种类型对照表
一种月季白粉病菌生理小种的快速鉴定方法
技术领域
[0001] 本发明属木本花卉抗病育种技术领域，具体涉及月季白粉病菌生理小种的快速鉴定方法。
背景技术
[0003] 云南省是我国月季野生资源的分布中心及月季品种的栽培中心。云南切花月季产量从1994年起，已连续15年位居全国第一，在国内70多个大中城市的市场占有率超过70％，是我国主要的切花月季生产基地和集散中心(唐开学，云南蔷薇属种质资源研究[博士论文].昆明：云南大学，2009)。云南省独特的地理及生态环境，在长期的演化过程中，云南野生蔷薇属种质资源有两大特点：从资源分布数量上来看，占全国的43％；从资源分布范围来看，云南蔷薇属资源涵盖了我国蔷薇属蔷薇亚属的9个组7个系，是中国蔷薇属的缩影(中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志第三十七卷[M].北京：科学出版社，1985；唐开学，云南蔷薇属种质资源研究[D].昆明：云南大学，2009)。
[0004] 由白粉病菌(Podosphera pannosa)引起的白粉病害(Powdery mildew)是云南省、全国乃至全球切花月季生产的第一大病害，也是野生月季资源、庭院月季和盆花月季的主要病害之一。目前，生产中主要通过反复施用化学药剂来预防和控制月季白粉病发生，这样不仅增加了生产成本，还造成了对环境的污染和破坏。
[0005] 为了减轻月季生产商的经济损失和减少农药施用引起的环境污染，国内外研究者都在进行月季抗白粉病品种的选育科研工作。然而，由于月季白粉病菌生理小种较多，且存在变种等情况，因此目前国内外尚没有出现具有长效且广谱抗白粉病的月季品种。
[0006] 选育月季抗病品种的前提，就是要了解当地白粉病菌的生理小种情况。研究表明国内外月季白粉病均是由专性活体寄生的叉丝单囊壳属子囊菌(Podosphaera pannosa)，也就是以前命名的Sphaerotheca pannosa引起的病害，且有多个生理小种。生理小种是指种和变种内形态相同，但致病力等方面均有不同表现的群体，这些群体对不同寄主的致病力可以存在差异。早在1983年，研究者在北美洲发现有5个生理小种。2003年，研究者在欧洲发现有8个生理小种。迄今为止，国内尚未有月季白粉病菌生理小种的研究报道。目前，国内外对于植物白粉病菌的生理小种的传统鉴定方法主要是：将不同地理来源的单孢病菌分别接种到鉴别寄主植物上，经过一定发病周期，结合观察和评价寄主叶片的发病情况，以此鉴别出不同的生理小种。
[0007] 一方面，因为月季白粉病菌生理小种的划分具有明显的地域性和特异性，所以鉴别寄主植物材料最好选用鉴定地区本土的材料(同属不同种/品种)；另一方面，如果采用国外的鉴别寄主植物材料，那么将涉及到寄主植物的一系列引种、驯化、繁殖等步骤和过程，这些程序使得生理小种鉴定工作不仅费时费力，且可能会影响后续鉴定工作的准确性(不同地理环境分布不同的生理小种)。目前，美洲和欧洲已分别确定出一套适用于该地区进行月季白粉病菌生理小种鉴定的鉴别寄主体系。然而，中国乃至亚洲尚没有月季白粉病菌生理小种研究的相关报道，所以适用于中国地区进行月季白粉病菌生理小种鉴定的鉴别寄主体系尚未确定。
[0008] 准确预测月季白粉病菌的种类，及时检测其生理小种的分化演替，对于防治月季白粉病、引进抗病材料和选育抗病新品种具有重要意义。鉴于我们国内尚缺乏一套适合国内各个地区用于对月季白粉病菌生理小种鉴定的鉴别寄主体系，传统的寄主发病情况统计法耗时费力，鉴定周期较长等技术问题，探索出一种方法简单、鉴别准确、筛选快速的适用于国内月季白粉病菌生理小种的鉴别方法势在必行。
发明内容
[0009] 本发明的目的在于提供一种能够适用于中国国内各个地区月季白粉病菌生理小种的鉴定方法，同时具有操作简单、鉴别准确、筛选快速的特点。
[0010] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0011] 一种月季白粉病菌生理小种的快速鉴定方法，包括以下步骤：
[0012] (1)月季白粉病菌的分离纯化和扩繁
[0013] ①在超净工作台上，用已灭菌的解剖针从采自于不同地点的感染了白粉病菌的月季叶片上，分别蘸取白粉病菌转移到组培瓶内的月季组培苗的叶片上，每蘸取一份白粉病菌材料，须更换新的解剖针，保证不同采集地点的白粉病菌不混合，且来自于月季野生种的白粉病菌转移到大花香水月季(Rosa odorata var.gigantea)组培苗的叶片上，来自于月季栽培品种的白粉病菌转移到紫月季花(Rosa chinensis var.semperflorens)组培苗的叶片上；一个采集地点的白粉病菌材料为一个样本，一个样本接种于一个组培瓶内的月季组培苗的叶片上，然后将接种了白粉病菌的组培瓶在组培室内，在培养条件为：光照强度为1800～3200lx，光周期为10-16h光期、8-14h暗期，空气相对湿度75～90％，室温22～28℃的条件下培养5～9d；
[0014] ②用步骤(1)①同样的方法转移上述组培苗上的白粉病菌单菌落到相应的新的月季组培苗的叶片上，在步骤(1)①同样的培养条件下培养5～9d；
[0015] ③重复步骤(1)②3次；
[0016] ④重复步骤(1)②1次，培养时间改为15～20d；
[0018] (2)月季白粉病菌孢子悬浮液的制备
[0019] 用已灭菌的毛刷将步骤(1)④中组培苗上的白粉病菌刷到含有0.03％(v/v)吐温20的无菌蒸馏水中，每刷一份白粉病菌材料，须更换新的毛刷，不同采集地点的白粉病菌刷入不同容器内的所述含有0.03％(v/v)吐温20的无菌蒸馏水中，保证不同采集地点的白粉病菌不混合；将每个容器内的孢子浓度用含有0.03％(v/v)吐温20的无菌蒸馏水调至1×
4 4
10～5×10个/ml，用于接种备用；
4 4
10～5×10个/ml，用于接种备用；
[0020] (3)月季寄主材料的准备
[0021] 采集如下鉴别寄主材料，采集从寄主材料月季枝条顶端向下第3～4层的完全展开的含有5片或7片叶的无病虫害的完全叶，先将采集的完全叶用解剖镜镜检，确保所采集的完全叶无任何真菌菌落或菌丝后，再用70％(v/v)乙醇处理1min,然后用无菌水清洗3～5次，用无菌的滤纸吸干完全叶表面的水分，叶面朝上平铺在盛有营养基质的培养皿中，每一种寄主材料的完全叶放置在一个培养皿内；所述营养基质配方：MS+苯并咪唑0.4g/L+琼脂8.0g/L；
[0022] 所述鉴别寄主材料为：木香花(Rosa banksiae)、悬钩子蔷薇(Rosa rubus)、复伞房蔷薇(Rosa brunonii)、弯刺蔷薇(Rosa beggeriana)‘；绿萼’(Rosa‘Vidiflora’)‘、匍匐红’(Rosa‘Pufuhong’)‘、思春’(Rosa‘Sichun’‘) 蜜糖’(Rosa‘Mitang’)‘、粉嘟嘟’(Rosa‘Fendudu’)‘、云玫’(Ros‘a Yunmei’)‘、粉妆阁’(Ros‘a Fenzhuangge’)；
[0023] (4)月季白粉病菌的接种
[0024] 采用喷雾法或滴液法将步骤(2)来自于不同采集地点的白粉病菌孢子悬浮液分别接种到步骤(3)所述培养皿内的每片叶片上，保证肉眼可见每片叶正面被白粉病菌孢子悬浮液覆盖，每个样本设置3～5个重复；接种完成后，将培养皿在室内光强1800-3200lx、光周期为10-16h光期、8-14h暗期，空气相对湿度85～95％、室温22-28℃的条件下培养7d；
[0025] (5)月季寄主材料的病情观测和统计
[0026] 接种叶片病情划分为2个等级：0级：抗病，叶片无病斑或<1/5叶面积发病；1级：感病，≥1/5叶面积发病；
[0027] (6)分析及鉴定生理小种
[0028] 将步骤(5)的统计结果0级用0表示，1级用1表示，一一对应地将不同寄主材料与不同采集地点来源的白粉病菌之间的抗/感性结果列表，并与如下表1月季白粉病菌生理小种类型对照表进行比对鉴定出月季白粉病菌生理小种的类型；
[0029] 表1 月季白粉病菌生理小种类型对照表
[0030]
[0031] 注：表1中0：抗病；1：感病。
[0032] 本发明供鉴别出11个月季白粉病菌生理小种类型，分别代号为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K，即A型、B型、C型、D型、E型、F型、G型、H型、I型、J型、K型。
[0033] A型月季白粉病菌生理小种表示：所述的11份鉴别寄主材料与A型月季白粉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果均为抗病，即统计结果为0。
[0034] B型月季白粉病菌生理小种表示：所述的11份鉴别寄主材料中只有‘思春’1份鉴别寄主材料与B型月季白粉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果为感病，即统计结果为1，其余10份鉴别寄主材料与B型月季白粉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果均为抗病，即统计结果为0。
[0035] C型月季白粉病菌生理小种表示：所述的11份鉴别寄主材料中有‘匍匐红’和‘思春’2份鉴别寄主材料与C型月季白粉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果为感病，即统计结果为1，其余9份鉴别寄主材料与C型月季白粉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果均为抗病，即统计结果为0。
[0036] D型月季白粉病菌生理小种表示：所述的11份鉴别寄主材料中有‘粉妆阁’、‘匍匐红’和‘思春’3份鉴别寄主材料与D型月季白粉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果为感病，即统计结果为1，其余8份鉴别寄主材料与D型月季白粉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果均为抗病，即统计结果为0。
[0037] E型月季白粉病菌生理小种表示：所述的11份鉴别寄主材料中有‘云玫’、‘粉妆阁’、‘匍匐红’和‘思春’4份鉴别寄主材料与E型月季白粉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果为感病，即统计结果为1，其余7份鉴别寄主材料与E型月季白粉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果均为抗病，即统计结果为0。
[0038] F型月季白粉病菌生理小种表示：所述的11份鉴别寄主材料中有‘绿萼’‘、云玫’、‘粉妆阁’、‘匍匐红’和‘思春’5份鉴别寄主材料与F型月季白粉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果为感病，即统计结果为1，其余6份鉴别寄主材料与F型月季白粉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果均为抗病，即统计结果为0。
[0039] G型月季白粉病菌生理小种表示：所述的11份鉴别寄主材料中有弯刺蔷薇、‘绿萼’、‘云玫’、‘粉妆阁’‘、匍匐红’和‘思春’6份鉴别寄主材料与G型月季白粉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果为感病，即统计结果为1，其余5份鉴别寄主材料与G型月季白粉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果均为抗病，即统计结果为0。
[0040] H型月季白粉病菌生理小种表示：所述的11份鉴别寄主材料中有木香花、悬钩子蔷薇、复伞房蔷薇和‘蜜糖’4份鉴别寄主材料与H型月季白粉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果为抗病，即统计结果为0；其余7份鉴别寄主材料与H型月季白粉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果均为感病，即统计结果为1。
[0041] I型月季白粉病菌生理小种表示：所述的11份鉴别寄主材料中有木香花、悬钩子蔷薇和复伞房蔷薇3份鉴别寄主材料与I型月季白粉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果为抗病，即统计结果为0；其余8份鉴别寄主材料与I型月季白粉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果均为感病，即统计结果为1。
[0042] J型月季白粉病菌生理小种表示：所述的11份鉴别寄主材料中有木香花和悬钩子蔷薇2份鉴别寄主材料与J型月季白粉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果为抗病，即统计结果为0；其余9份鉴别寄主材料与J型月季白粉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果均为感病，即统计结果为1。
[0043] K型月季白粉病菌生理小种表示：所述的11份鉴别寄主材料中有木香花1份鉴别寄主材料与K型月季白粉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果为抗病，即统计结果为0；其余10份鉴别寄主材料与K型月季白粉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果均为感病，即统计结果为1。
[0044] 与现有技术相比，本发明的主要创新点和有益效果是：
[0045] 1、以前期大量实验数据为基础，本发明提供了一套适用于我国各地区进行月季白粉病菌生理小种鉴定的鉴别寄主体系。这套体系包含11份月季寄主材料，这些材料均来源于国内，不仅具有自主知识产权，且均可在全国范围内进行栽培和繁殖,同时具有较强的鉴别能力。这为研究者在当地进行生理小种鉴定工作提供了可操作的寄主材料，同时为抗月季白粉病菌育种材料的选择提供了指导。
[0046] 2、以往的寄主材料发病情况的调查和统计方法需要用计算机软件进行病级的计算和统计，且统计数据以0-1之间的非整数形式表示，这样不仅费时费力，而且为后续的生理小种鉴定带来很多的数据困扰。本发明简化了寄主材料发病情况的调查和统计方法，直接用肉眼就可判断出病级水平，且统计数据仅用0和1整数形式表示，不仅省时省力，而且为后续的生理小种鉴定工作提供了更加直观的数据形式，从而提高了鉴定的效率。
[0047] 3、本发明方法从白粉病菌接种寄主材料到完成生理小种鉴定工作[从步骤(4)至步骤(6)]仅需要7d时间，而传统方法需要10d以上，故具有鉴定周期短、快速的特点。
[0048] 4、本发明采用的寄主材料为离体叶片，而传统方法为扦插苗，故本方法不仅占用空间少，且操作简便；本发明在相对封闭的培养皿中进行白粉病菌侵染寄主实验，可排除不同的生理小种菌类型通过空气而混合的可能性，从而保证了实验结果的准确性。
[0049] 5、本发明所述月季白粉病菌的分离纯化和扩繁步骤能使月季白粉病菌生理小种得以很好的分离和纯化。其不仅能准确地分离出月季白粉病菌的某一个生理小种，且因其明确指定了两种月季寄主材料，故可让分离后的白粉病菌在合适的月季叶片上得以顺利地纯化和扩繁。而现有技术没能提供这些参数，几乎忽略了此步骤的重要性，因而不能很准确地分离出月季白粉病菌的某一个生理小种，更不能让分离出的白粉病菌得以顺利地纯化和扩繁，病菌生理小种的混合扩繁将影响后续生理小种的鉴定等实验的开展和深入。
[0050] 综上所述，本发明提供的这套适用于我国各地区进行月季白粉病菌生理小种鉴定的鉴别寄主体系，使在国内进行月季白粉病菌生理小种的鉴定工作成为可能；本发明方法各步骤的协同作用，使得月季白粉病菌生理小种的鉴定周期缩短至7天，鉴定材料用量少，操作简便，占用空间小，准确度较高。
[0051] 本发明涉及的上述生物材料均可以从商业渠道购买。如可从云南丽都花卉发展有限公司购买，该公司地址：云南省玉溪市通海县四街镇，邮政编码：652702。
[0052] 同时，本发明涉及的上述生物材料均在表4所列非专利文献公开，所述生物材料申请人在基地均有活体保存，申请人保证自本专利申请日起20年内向公众发放。申请人联系地址:云南省昆明市盘龙区北京路2238号，云南省农业科学院花卉研究所，邮编：650205。
具体实施方式
[0054] 实施例1国内25个地区的月季白粉病菌生理小种的鉴定
[0055] 由于云南省是我国月季野生资源的分布中心及月季品种的栽培中心，也是我国月季白粉病的主要发生地。所以，本实施案例以云南省为主含13个地区及涵盖了其他多个省份不同地区为采集地点。
[0056] (1)月季白粉病菌的分离纯化和扩繁
[0057] ①在超净工作台上，用针尖直径0.1mm已灭菌的解剖针从采自于如下国内25个不同地点的感染了白粉病菌的月季叶片上，分别蘸取白粉病菌转移到按常规植物组织培养扩繁的组培瓶内的月季组培苗的叶片上，每蘸取一份白粉病菌材料，须更换新的解剖针，保证不同采集地点的白粉病菌不混合，来自于月季野生种的白粉病菌转移到大花香水月季(Rosa odorata var.gigantea)组培苗的叶片上，来自于月季栽培品种的白粉病菌转移到紫月季花(Rosa chinensis var.semperflorens)组培苗的叶片上；一个采集地点的白粉病菌材料为一个样本，一个样本接种于一个组培瓶内的月季组培苗的叶片上，然后将接种了白粉病菌的组培瓶在组培室内，在培养条件为：光照强度为1800～3200lx，光周期为12h光期、12h暗期，空气相对湿度75～90％，室温25℃±1℃的条件下培养7d。月季白粉病菌可参照文献(冯丽艳，王玉霞，刘忠巍，张玉晶.月季白粉病的诊断与防治[J].吉林蔬菜，2014，Z1期，48-49.)中的诊断方法对感染了白粉病菌的月季叶片进行诊断。
[0058] ②用步骤(1)①同样的方法转移上述组培苗上的白粉病菌单菌落到相应的新的月季组培苗的叶片上，在步骤(1)①同样的培养条件下培养5-9d；
[0059] ③重复步骤(1)②3次；
[0060] ④重复步骤(1)②1次，在步骤(1)①同样的培养条件下培养15d；
[0061] 步骤(1)①至步骤(1)④培养期间，组培瓶内的培养基质均为MS+6-BA0.2mg/L+NAA 0.02mg/L+蔗糖35g/L+琼脂7.0g/L，且组培瓶瓶口用透气性塑料膜封盖。
[0062] 国内25个不同地点：云南省13个县市：丽江市(简写：LJ)、大理州大理市(简写：DL)、大理州宾川县(简写：BC)、大理州祥云县(简写：XY)、昭通市(简写：ZT)、西双版纳州勐海县(简写：MH)、普洱市(简写：PE)、临沧市(简写：LC)、红河州蒙自市(简写：MZ)、玉溪市(简写：YX)、楚雄州楚雄市(简写：CX)、昆明市(简写：KM)、曲靖市(简写：QJ)；辽宁省2个市：沈阳市(简写：SY)、抚顺市(简写：FS)；广西省1个市：南宁市(简写：NN)；陕西省2个市：宝鸡市(简写：bj)、汉中市(简写：HZ)；福建省1个市：福州市(简写：FZ)；四川省1个市：自贡市(简写：
ZG)；河南省1个市：南阳市(简写：NY)；北京市(简写：BJ)；天津市(简写：TJ)；广东省1个市：
广州市(简写：GZ)；湖北省1个市：武汉市(简写：WH)。
ZG)；河南省1个市：南阳市(简写：NY)；北京市(简写：BJ)；天津市(简写：TJ)；广东省1个市：
广州市(简写：GZ)；湖北省1个市：武汉市(简写：WH)。
[0063] (2)月季白粉病菌孢子悬浮液的制备
[0064] 用已灭菌的毛刷将步骤(1)④中组培苗上的白粉病菌刷到含有0.03％(体积分数)吐温20的无菌蒸馏水中，每刷一份白粉病菌材料，须更换新的毛刷，不同采集地点的白粉病菌刷入不同容器内的所述含有0.03％(体积分数)吐温20的无菌蒸馏水中，保证不同采集地点的白粉病菌不混合；将每个容器内的孢子浓度用含有0.03％(体积分数)吐温20的无菌蒸4 4
馏水调至1×10～5×10个/ml，用于接种备用。
馏水调至1×10～5×10个/ml，用于接种备用。
[0065] (3)月季寄主材料的准备
[0066] 采集如下鉴别寄主材料，采集从寄主材料月季枝条顶端向下第3～4层的完全展开的含有5片或7片叶的无病虫害的完全叶，先将采集的完全叶用解剖镜镜检，确保所采集的完全叶无任何真菌菌落或菌丝后，再用体积分数为70％乙醇处理1min,然后用无菌水清洗3～-5次，用无菌的滤纸吸干完全叶表面的水分，叶面朝上平铺在盛有营养基质的培养皿中，每一种寄主材料的完全叶放置在一个培养皿内；所述营养基质配方：MS+苯并咪唑0.4g/L+琼脂8.0g/L；
[0067] 所述鉴别寄主材料为：木香花(Rosa banksiae)、悬钩子蔷薇(Rosa rubus)、复伞房蔷薇(Rosa brunonii)、弯刺蔷薇(Rosa beggeriana)‘、绿萼’(Rosa‘Vidiflora’)‘、匍匐红’(Rosa‘Pufuhong’)‘、思春’(Rosa‘Sichun’‘) 蜜糖’(Rosa‘Mitang’)‘、粉嘟嘟’(Rosa‘Fendudu’)‘、云玫’(Ros‘a Yunmei’)‘、粉妆阁’(Ros‘a Fenzhuangge’)。
[0068] (4)月季白粉病菌的接种
[0069] 采用喷雾法或滴液法将步骤(2)25个采集地点的白粉病菌孢子悬浮液分别接种到步骤(3)所述培养皿内的每片叶片上，保证肉眼可见每片叶正面被白粉病菌孢子悬浮液均匀覆盖，每个样本设置3～5个重复，接种1片完全叶为1个重复，一个采集地点的白粉病菌孢子悬浮液分别接种到步骤(3)所述每一个培养皿内的每片叶片上；接种完成后，将培养皿在室内光强1800-3200lx、光周期为12h光期、12h暗期，空气相对湿度85～95％、室温25℃±1℃的条件下培养7d；
[0070] (5)月季寄主材料的病情观测和统计
[0071] 接种叶片病情划分为2个等级：0级：抗病，叶片无病斑或<1/5叶面积发病；1级：感病，≥1/5叶面积发病；
[0072] (6)分析及鉴定生理小种
[0073] 将步骤(5)的统计结果，0级用0表示，1级用1表示，一一对应地将不同寄主材料与不同地区来源的白粉病菌之间的抗/感性结果列入表格(见下表2、表3)，表格中直观反应出的0/1组合矩阵类型即为月季白粉病菌生理小种的类型，0/1组合矩阵类型与月季白粉病菌生理小种类型对照表(表1)进行比对，判断并标出月季白粉病菌生理小种的类型(A至K，表2、表3)。
[0074] 试验结果：
[0075] 根据下述表格2、表3，可直观统计出所采集的全国范围内的25个县市地区月季白粉病菌生理小种的类型，包含A至K共计11个类型。从表2和表3中可以查询并判断出某个地区的生理小种的类型，例如采自北京地区的为E型月季白粉病菌生理小种,它对所述11份鉴别寄主材料中的‘云玫’、‘粉妆阁’‘、匍匐红’和‘思春’4份鉴别寄主材料感病，即统计结果为1，其余7份鉴别寄主材料均为抗病，即统计结果为0。不仅可鉴定出月季白粉病菌生理小种的类型，同时还可指导该地区月季育种，选择对该地区月季白粉病菌生理小种具有抗性的育种材料。
[0076] 表2 不同寄主材料与25个不同地理来源的月季白粉病菌之间的抗/感结果
[0077]
[0078] 表3 不同寄主材料与25个不同地理来源的月季白粉病菌之间的抗/感结果
[0079]
[0080]
[0081] 注：表2和表3中0：抗病；1：感病。
[0082] 表4 本发明涉及的生物材料在非专利文献公开列表
[0083]
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