一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的制备方法及其应用
专利汇可以提供一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的制备方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种高耐受型β- 葡萄糖 苷酶的制备方法及其应用，涉及化工技术领域，从棘孢曲霉中分离所述的β-葡萄糖苷酶，将固定化β-葡萄糖苷酶进行去凝胶化处理，得到β-葡萄糖苷酶液，选取占比为15％芦荟，1.5％酒精提取液,0.2％透明质酸,其余占比的去离子 水 ,分别添加DEAE层析后0.25 氯化钠 梯度洗脱的分布收集酶液0,10,20,30,40U/L,将 混合液 静置40天,静置的环境 温度 在45-55℃，将静置好的混合液冷却2-3d，分装 装瓶 ，制得保湿精华液成品，通过对制得的β-葡萄糖苷酶进行凝胶化，保证了β-葡萄糖苷酶的酶负载量高，从而使得β-葡萄糖苷酶的耐受性大大提高，同时操作简单，制备耗时短，对酶的活性影响小，增强了酶的生化性质，减低了生产成本。，下面是一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的制备方法及其应用专利的具体信息内容。
1.一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于，从棘孢曲霉中分离所述的具有增香功能的β-葡萄糖苷酶，包括以下步骤：
S1、将选取的棘孢曲霉接入PDB培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉16g，蒸馏水
1000ml稀释）进行活化培养3d，活化培养的环境温度保持在28℃±2℃；
S2、将活化培养后的棘孢曲霉放至摇床内进行发酵摇床培养，培养时间8d，摇床培养的环境温度保持在26℃±2℃；
S3、将发酵摇床培养的棘孢曲霉菌株转接入1000mL三角瓶，28℃的培育环境下，220r/min下液体发酵培养36h，按1％接种量接入50L发酵罐，在200r/min、pH7.0、通气量0.7vvm条件下，培养36h后，再按10v/v％接种量转入500L发酵罐，在220r/min，pH7.0，通气量0.7-
1.2vvm下，培养3d；
S4、取发酵阶段的棘孢曲霉发酵液40ml在4℃、10000g条件下离心10min，弃上清液，收集菌体；
将发酵培养液进行检测，将装有菌悬液的离心管置于冰浴中，实施超声波破碎；
破碎的细胞溶液在4℃、5000g环境条件下离心15min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液，取得棘孢曲霉胞内粗酶液；
S5、从棘孢曲霉胞内粗酶液中提取蛋白质，使用pH值为4.8～5.0的物质的量浓度为18～22mM的醋酸-醋酸钠溶液，以0.15～0.3mL/min冲洗分子筛凝胶层析柱，随后对提取的蛋白质使用DEAE-阴离子交换柱层析进行分离，得到初步得到的β-葡萄糖苷酶，备用；
S6、将正硅酸乙酯与水混合，其中正硅酸乙酯与水的比例为1：500，混合均匀后加入盐酸搅拌，将温度升至55-65℃回流1-2h，之后冷却至室温，得到反应混合液，加入初步得到的β-葡萄糖苷酶，低温静置下凝胶化，得到固定化β-葡萄糖苷酶。
2.根据权利要求1所述的一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于，所述S4中使用的检测方法为将发酵培养液于3000r/min离心10min，得上清粗酶液，用微量进样器取0.1mL适度稀释的粗酶液，加入0.9mLpH4.5的0.2mo/LNa2HPO4-0.1mol/L柠檬酸缓冲液,于50℃恒温水浴预热5～10min,再加入已预热5～10min的1mL5mmol·L/L的p-NPG溶液，用秒表精确计时,10min后立即加入1mL1mol·L-1的Na2CO3溶液终止反应，室温放置5min，于
4420nm处测光吸收值OD。
3.根据权利要求1所述的一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于，所述S6中的正硅酸乙酯与水的摩尔比为1:2。
4.根据权利要求1所述的一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的应用，其特征在于，所述高耐受性β-葡萄糖苷酶耐65-100℃高温，耐质量浓度4-6％的氯化钠，耐质量分数3％醋酸和体积分数11％以上的酒精。
5.根据权利要求1所述的一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的应用，其特征在于，所述S4中的超声波破碎条件为：超声仪探头置于液面下1cm，功率455W，超声时间4s，工作间隔为4s，工作总时间为30min，工作环境温度为0-4℃。
6.一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的应用，其特征在于，所述固定化β-葡萄糖苷酶在使用时，进行去凝胶化处理后，可以配制化妆品保湿精华液，包括以下步骤：
S1、将固定化β-葡萄糖苷酶进行去凝胶化处理，得到β-葡萄糖苷酶液；
S2、选取占比为15％芦荟，1.5％酒精提取液, 0.2％透明质酸,其余占比的去离子水,分别添加DEAE层析后0.25氯化钠梯度洗脱的分布收集酶液0,10,20,30,40U/L,将混合液静置40天,静置的环境温度在45-55℃；
S3、将静置好的混合液冷却2-3d，分装装瓶，制得保湿精华液成品。
一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的制备方法及其应用
技术领域
背景技术
发明内容
1000ml稀释）进行活化培养3d，活化培养的环境温度保持在28℃±2℃；
S2、将活化培养后的棘孢曲霉放至摇床内进行发酵摇床培养，培养时间8d，摇床培养的环境温度保持在26℃±2℃；
S3、将发酵摇床培养的棘孢曲霉菌株转接入1000mL三角瓶，28℃的培育环境下，220r/min下液体发酵培养36h，按1％接种量接入50L发酵罐，在200r/min、pH7.0、通气量0.7vvm条件下，培养36h后，再按10v/v％接种量转入500L发酵罐，在220r/min，pH7.0，通气量0.7-
1.2vvm下，培养3d；
S4、取发酵阶段的棘孢曲霉发酵液40ml在4℃、10000g条件下离心10min，弃上清液，收集菌体。将发酵培养液进行检测，将装有菌悬液的离心管置于冰浴中，实施超声波破碎。破碎的细胞溶液在4℃、5000g环境条件下离心15min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液，取得棘孢曲霉胞内粗酶液；
S5、从棘孢曲霉胞内粗酶液中提取蛋白质，使用pH值为4.8～5.0的物质的量浓度为18～22mM的醋酸-醋酸钠溶液，以0.15～0.3mL/min冲洗分子筛凝胶层析柱，随后对提取的蛋白质使用DEAE-阴离子交换柱层析进行分离，得到初步得到的β-葡萄糖苷酶，备用；
S6、将正硅酸乙酯与水混合，其中正硅酸乙酯与水的比例为1：500，混合均匀后加入盐酸搅拌，将温度升至55-65℃回流1-2h，之后冷却至室温，得到反应混合液，加入初步得到的β-葡萄糖苷酶，低温静置下凝胶化，得到固定化β-葡萄糖苷酶。
S2、选取占比为15％芦荟，1.5％酒精提取液, 0.2％透明质酸,其余占比的去离子水,分别添加DEAE层析后0.25氯化钠梯度洗脱的分布收集酶液0,10,20,30,40U/L,将混合液静置40天,静置的环境温度在45-55℃。
该高耐受型β-葡萄糖苷酶的制备方法及其应用，通过对制得的β-葡萄糖苷酶进行凝胶化，保证了β-葡萄糖苷酶的酶负载量高，显著提高β-葡萄糖苷酶的酶活稳定性，从而使得β-葡萄糖苷酶的耐受性大大提高，同时操作简单，制备耗时短，对酶的活性影响小，增强了酶的生化性质，减低了生产成本。
具体实施方式
S1、将选取的棘孢曲霉接入PDB培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉16g，蒸馏水
1000ml稀释）进行活化培养3d，活化培养的环境温度保持在28℃±2℃；
S2、将活化培养后的棘孢曲霉放至摇床内进行发酵摇床培养，培养时间8d，摇床培养的环境温度保持在26℃±2℃；
S3、将发酵摇床培养的棘孢曲霉菌株转接入1000mL三角瓶，28℃的培育环境下，220r/min下液体发酵培养36h，按1％接种量接入50L发酵罐，在200r/min、pH7.0、通气量0.7vvm条件下，培养36h后，再按10v/v％接种量转入500L发酵罐，在220r/min，pH7.0，通气量0.7-
1.2vvm下，培养3d；
S4、取发酵阶段的棘孢曲霉发酵液40ml在4℃、10000g条件下离心10min，弃上清液，收集菌体。将发酵培养液进行检测，使用的检测方法为将发酵培养液于3000r/min离心10min，得上清粗酶液，用微量进样器取0.1mL适度稀释的粗酶液，加入0.9mLpH4.5的0.2mo/LNa2HPO4-0.1mol/L柠檬酸缓冲液,于50℃恒温水浴预热5～10min,再加入已预热5～10min的1mL5mmol·L/L的p-NPG溶液，用秒表精确计时,10min后立即加入1mL1mol·L-1的Na2CO3溶液终止反应，室温放置5min，于4420nm处测光吸收值OD，每毫升酶液每分钟水解产生1μmol的对硝基苯酚的酶活力,定义为一个酶活单位，计算公式如下:U＝C×N/10×0.1＝C·N＝0.369·OD·N，上式中,U：酶活单位(μ/mL),10:反应时间,N:原酶液稀释倍数,0.1:取
0.1mL酶液反应,C:对应于对硝基苯酚-光密度曲线上的值C＝0.369·OD·N，将装有菌悬液的离心管置于冰浴中，实施超声波破碎。超声波破碎条件为：超声仪探头置于液面下1cm，功率455W，超声时间4s，工作间隔为4s，工作总时间为30min，工作环境温度为0-4℃，破碎的细胞溶液在4℃、5000g环境条件下离心15min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液，取得棘孢曲霉胞内粗酶液；
S5、从棘孢曲霉胞内粗酶液中提取蛋白质，使用pH值为4.8～5.0的物质的量浓度为18～22mM的醋酸-醋酸钠溶液，以0.15～0.3mL/min冲洗分子筛凝胶层析柱，随后对提取的蛋白质使用DEAE-阴离子交换柱层析进行分离，得到初步得到的β-葡萄糖苷酶，备用；
S6、将正硅酸乙酯与水混合，其中正硅酸乙酯与水的比例为1：500，正硅酸乙酯与水的摩尔比为1:2，混合均匀后加入盐酸搅拌，将温度升至55-65℃回流1-2h，之后冷却至室温，得到反应混合液，加入初步得到的β-葡萄糖苷酶，低温静置下凝胶化，得到固定化β-葡萄糖苷酶，该β-葡萄糖苷酶耐65-100℃高温，耐质量浓度4-6％的氯化钠，耐质量分数3％醋酸和体积分数11％以上的酒精。
S2、选取占比为15％芦荟，1.5％酒精提取液, 0.2％透明质酸,其余占比的去离子水,分别添加DEAE层析后0.25氯化钠梯度洗脱的分布收集酶液0,10,20,30,40U/L,将混合液静置40天,静置的环境温度在45-55℃。
S1、将选取的棘孢曲霉接入PDB培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉16g，蒸馏水
1000ml稀释）进行活化培养3d，活化培养的环境温度保持在28℃±2℃；
S2、将活化培养后的棘孢曲霉放至摇床内进行发酵摇床培养，培养时间8d，摇床培养的环境温度保持在26℃±1℃；
S3、将发酵摇床培养的棘孢曲霉菌株转接入1000mL三角瓶，28℃的培育环境下，220r/min下液体发酵培养36h，按1％接种量接入50L发酵罐，在200r/min、pH7.0、通气量0.7vvm条件下，培养36h后，再按10v/v％接种量转入500L发酵罐，在220r/min，pH7.0，通气量0.7-
1.2vvm下，培养3d；
S4、取发酵阶段的棘孢曲霉发酵液40ml在4℃、10000g条件下离心10min，弃上清液，收集菌体。菌体使用的检测方法为将发酵培养液于3000r/min离心10min，得上清粗酶液，用微量进样器取0.1mL适度稀释的粗酶液，加入0.9mLpH4.5的0.2mo/LNa2HPO4-0.1mol/L柠檬酸缓冲液,于50℃恒温水浴预热5～10min,再加入已预热5～10min的1mL5mmol·L/L的p-NPG溶液，用秒表精确计时,10min后立即加入1mL1mol·L-1的Na2CO3溶液终止反应，室温放置
5min，于4420nm处测光吸收值OD，每毫升酶液每分钟水解产生1μmol的对硝基苯酚的酶活力,定义为一个酶活单位，计算公式如下:U＝C×N/10×0.1＝C·N＝0.369·OD·N，上式中,U：酶活单位(μ/mL),10:反应时间,N:原酶液稀释倍数,0.1:取0.1mL酶液反应,C:对应于对硝基苯酚-光密度曲线上的值C＝0.369·OD·N。将装有菌悬液的离心管置于冰浴中，实施超声波破碎。超声波破碎条件为：超声仪探头置于液面下1cm，功率455W，超声时间4s，工作间隔为4s，工作总时间为30min，工作环境温度为0-4℃，破碎的细胞溶液在4℃、5000g环境条件下离心15min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液，取得棘孢曲霉胞内粗酶液；
S5、从棘孢曲霉胞内粗酶液中提取蛋白质，使用pH值为4.8～5.0的物质的量浓度为18～22mM的醋酸-醋酸钠溶液，以0.15～0.3mL/min冲洗分子筛凝胶层析柱，随后对提取的蛋白质使用DEAE-阴离子交换柱层析进行分离，得到初步得到的β-葡萄糖苷酶，备用；
S6、将正硅酸乙酯与水混合，其中正硅酸乙酯与水的比例为1：500，正硅酸乙酯与水的摩尔比为1:2，混合均匀后加入盐酸搅拌，将温度升至50-60℃回流1-2h，之后冷却至室温，得到反应混合液，加入初步得到的β-葡萄糖苷酶，低温静置下凝胶化，得到固定化β-葡萄糖苷酶，该β-葡萄糖苷酶耐65-100℃高温，耐质量浓度4-6％的氯化钠，耐质量分数3％醋酸和体积分数11％以上的酒精。
S2、选取占比为15％芦荟，1.5％酒精提取液, 0.2％透明质酸,其余占比的去离子水,分别添加DEAE层析后0.25氯化钠梯度洗脱的分布收集酶液0,10,20,30,40U/L,将混合液静置40天,静置的环境温度在45-55℃。
S1、将选取的棘孢曲霉接入PDB培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉16g，蒸馏水
1000ml稀释）进行活化培养3d，活化培养的环境温度保持在28℃±2℃；
S2、将活化培养后的棘孢曲霉放至摇床内进行发酵摇床培养，培养时间8d，摇床培养的环境温度保持在26℃±2℃；
S3、将发酵摇床培养的棘孢曲霉菌株转接入1000mL三角瓶，28℃的培育环境下，220r/min下液体发酵培养36h，按1％接种量接入50L发酵罐，在200r/min、pH7.0、通气量0.7vvm条件下，培养36h后，再按10v/v％接种量转入500L发酵罐，在220r/min，pH7.0，通气量0.7-
1.2vvm下，培养3d；
S4、取发酵阶段的棘孢曲霉发酵液40ml在4℃、10000g条件下离心10min，弃上清液，收集菌体。将发酵培养液进行检测，使用的检测方法为将发酵培养液于3000r/min离心10min，得上清粗酶液，用微量进样器取0.1mL适度稀释的粗酶液，加入0.9mLpH4.5的0.2mo/LNa2HPO4-0.1mol/L柠檬酸缓冲液,于50℃恒温水浴预热5～10min,再加入已预热5～10min的1mL5mmol·L/L的p-NPG溶液，用秒表精确计时,10min后立即加入1mL1mol·L-1的Na2CO3溶液终止反应，室温放置5min，于4420nm处测光吸收值OD，每毫升酶液每分钟水解产生1μmol的对硝基苯酚的酶活力,定义为一个酶活单位，计算公式如下:U＝C×N/10×0.1＝C·N＝0.369·OD·N，上式中,U：酶活单位(μ/mL),10:反应时间,N:原酶液稀释倍数,0.1:取
0.1mL酶液反应,C:对应于对硝基苯酚-光密度曲线上的值C＝0.369·OD·N。将装有菌悬液的离心管置于冰浴中，实施超声波破碎。超声波破碎条件为：超声仪探头置于液面下1cm，功率455W，超声时间4s，工作间隔为4s，工作总时间为30min，工作环境温度为0-4℃，破碎的细胞溶液在4℃、5000g环境条件下离心15min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液，取得棘孢曲霉胞内粗酶液；
S5、从棘孢曲霉胞内粗酶液中提取蛋白质，使用pH值为4.8～5.0的物质的量浓度为18～22mM的醋酸-醋酸钠溶液，以0.15～0.3mL/min冲洗分子筛凝胶层析柱，随后对提取的蛋白质使用DEAE-阴离子交换柱层析进行分离，得到初步得到的β-葡萄糖苷酶，备用；
S6、将正硅酸乙酯与水混合，其中正硅酸乙酯与水的比例为1：500，正硅酸乙酯与水的摩尔比为1:2，混合均匀后加入盐酸搅拌，将温度升至55-65℃回流1-2h，之后冷却至室温，得到反应混合液，加入初步得到的β-葡萄糖苷酶，低温静置下凝胶化，得到固定化β-葡萄糖苷酶，该β-葡萄糖苷酶耐65-100℃高温，耐质量浓度4-6％的氯化钠，耐质量分数3％醋酸和体积分数11％以上的酒精。
S2、选取占比为10％芦荟，1％酒精提取液, 0.1％透明质酸,其余占比的去离子水,分别添加DEAE层析后0.25氯化钠梯度洗脱的分布收集酶液0,10,20,30,40U/L,将混合液静置
40天,静置的环境温度在45-55℃。
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