技术领域
[0001] 本
发明属于
生物技术领域,更具体地,涉及一种人参皂苷-短双歧杆菌M-16V微胶囊及其制备方法。
背景技术
[0002] 难溶药物的生物利用度一直是各国科学家努
力研究的问题。据估计,全世界40%的已上市药物是难溶性的,而处在实验室研究阶段的难溶性药物就更多。近年来,国内外针对难溶性药物的技术日趋增多,这些技术包括
纳米技术、微乳技术、脂质体技术、固体分散技术等,受到了工业界的广泛关注。例如中国
专利申请CN105412016A就报道了通过常规的肠溶固体分散体的方法将番茄红素、
白藜芦醇或褪黑素进行分散,从而获得更好的
溶解度。
[0003] 人参皂苷(Ginsenoside)是一种固醇类化合物,三萜皂苷。主要存在于人参属药材中。人参皂苷被视为是人参中的活性成分,因而成为研究的目标。人参皂苷Rh2
单体对癌细胞的生长有抑制作用,能诱导
肿瘤细胞凋亡,逆转肿瘤细胞异常分化,抗肿瘤转移,与
化疗药物联用能起到增效减毒的作用。除抗肿瘤作用外,人参皂苷具有提高
机体免疫力、抗菌、改善心脑血管供血不足、调节中枢神经系统、抗疲劳、延缓衰老等作用。因为人参皂苷影响了多重的代谢通路,所以其效能也是复杂的,而且各种人参皂苷的单体成分是难以分离出来的。通常改进人参皂苷
水溶性的方法包括纳米化、固体脂质体、固体分散体、微乳化等。上述方法中,固体分散技术以及纳米技术是两个在制药工业常见的提高难溶药物溶解度的方法。
[0004]
益生菌在储存过程中对环境因素(热,
氧和湿度)高度敏感,加之胃肠液的破坏作用,导致益生菌到达肠道后活菌数大大降低而不能很好地发挥益生效果。因此,探究保护益生菌并使更多活菌输送到肠道中的方法具有重要意义。在这个意义上,微胶囊化被认为是最有效的方法之一。
[0005] 短双歧杆菌M-16V是一种天然存在于健康宝宝肠道内的有益菌,其已被临床医学研究证实可促进健康的肠道微生态,从而帮助调节免疫平衡。
[0006] 目前尚未有文献报道将人参皂苷及益生菌组合物与微胶囊化方法结合,协同提高其生物利用度。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于将人参皂苷及益生菌组合物同时运用微胶囊化方法,协同提高其生物利用度。
[0008] 本发明提供一种人参皂苷-短双歧杆菌M-16V微胶囊的制备方法,包括:溶液配制、短双歧杆菌M-16V菌种的活化、菌悬液的制备、微胶囊的制备;
[0009] 所述溶液配制步骤包括模拟胃液的配制、模拟肠液的配制、解囊液的配制;
[0010] 所述微胶囊的制备包括:将菌悬液与高温灭菌后的人参皂苷和槐实胶溶液混合均匀后,将菌悬液
挤压入磁力搅拌的无菌CaCl2溶液中,常温下
固化,通过重力沉降从CaCl2溶液中回收微胶囊,然后用
滤纸过滤,水冲洗除去多余氯化
钙和盐类,得到湿微胶囊,然后对湿微胶囊进行干燥,得到人参皂苷-短双歧杆菌M-16V微胶囊。
[0011] 根据本发明,优选地,所述模拟胃液的配制方法包括:配制1-5g/L NaCl溶液,调pH至2-3,110-130℃高压灭菌10-20min;取2-4g胃蛋白酶,加入到灭菌的NaCl溶液中溶解,然后用0.1-0.3μm滤
膜过滤除菌。
[0012] 根据本发明,优选地,所述模拟肠液的配制方法包括:称取KH2PO4 4-8g加入300-800ml蒸馏水溶解,然后调pH为4-8,110-130℃灭菌10-20min;另称取胰蛋白酶5-15g,溶于
200-500ml无菌水,然后与灭菌的KH2PO4溶液混合均匀,定容至500-1500ml,最后用0.1-0.3μm滤膜过滤除菌。
[0013] 根据本发明,优选地,所述解囊液的配制方法包括:分别称取10-18g的KH2PO4和7-15g的C6H8O7,加蒸馏水溶解定容至500-1500ml,然后调节pH为6-8,110-130℃灭菌10-
20min。
[0014] 根据本发明,优选地,所述短双歧杆菌M-16V菌种的活化步骤包括:将冻存于-20℃至-10℃的菌株接种至MRS肉汤培养基中,35-42℃静置厌氧培养20-30h,连续活化三代后用于后续实验。
[0015] 根据本发明,优选地,所述菌悬液的制备步骤包括:取1-3%活化好的菌液于MRS肉汤培养基中30-40℃培养10-15h后,离心,弃去上清,用PBS缓冲液调整菌液浓度为108-109CFU/ml,精确活菌数采用平板菌落计数法测定。
[0016] 根据本发明,优选地,所述离心的条件包括:3000-5000r/min,2-6℃,8-12min。
[0017] 根据本发明,优选地,所述微胶囊的制备包括:。
[0018] 用无菌
注射器(23G)将菌悬液挤压入磁力搅拌的无菌CaCl2溶液中;
[0019] 所述常温下固化的时间为20-40min;
[0020] 所述水冲洗的次数为1-3次;
[0022] 本发明还提供由上述制备方法制得的人参皂苷-短双歧杆菌M-16V微胶囊。
[0023] 本发明有益效果:
[0024] 本发明所得短双歧杆菌M-16V微胶囊的活菌数和包埋产率分别为4×108CFU/g和94%,本发明的微胶囊具有较高的包埋产率以及良好的胃酸环境耐受性和肠溶性,解决人参皂苷及益生菌在人体内的生物利用度,最终两者协同使人参皂苷的溶出度和生物利用度大幅提高,生物利用度可达79%。
[0025] 本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
[0026] 通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述,本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
[0027] 图1示出了本发明一种实施方式的微胶囊在胃液中处理释放活菌数随时间变化的图。
具体实施方式
[0028] 下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式,然而应该理解,可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
[0030] 本实施例提供一种人参皂苷-短双歧杆菌M-16V微胶囊及其制备方法,步骤包括:
[0031] (1)溶液配制:模拟胃液、模拟肠液解囊液的配制。
[0032] 模拟胃液的配制方法包括:配制2g/L NaCl溶液,调pH至2.5,121℃高压灭菌15min;取3g胃蛋白酶,加入到灭菌后的NaCl溶液中溶解,然后用0.22μm滤膜过滤除菌;
[0033] 模拟肠液的配制方法包括:称取KH2PO4 6.8g加入500ml蒸馏水溶解,然后调pH为6.8,121℃灭菌15min;另称取胰蛋白酶10g,溶于200ml无菌水,然后与KH2PO4溶液混合均匀,定容至1000ml,最后用0.22μm滤膜过滤除菌;
[0034] 解囊液的配制方法包括:分别称取14.2g KH2PO4和9.6g C6H8O7,加蒸馏水溶解定容至1000ml,然后调节pH为7.5,121℃灭菌15min,备用。
[0035] (2)菌种的活化
[0036] 菌种的活化步骤包括:将冻存于-20℃的菌株接种至MRS肉汤培养基中,37℃静置厌氧培养24h,连续活化三代后用于后续实验。
[0037] (3)菌悬液的制备
[0038] 菌悬液的制备步骤包括:取2%活化好的菌液于MRS肉汤培养基中37℃培养14h后,离心(4000r/min,4℃,10min),弃去上清,用PBS缓冲液调整菌液浓度约109CFU/ml,精确活菌数采用平板菌落计数法测定
[0039] (4)微胶囊的制备
[0040] 微胶囊的制备步骤包括:将菌悬液与高温灭菌后的海藻酸钠-刺
云实胶溶液混合均匀后,用无菌注射器(23G)将菌混悬液挤压入磁力搅拌的无菌CaCl2溶液中,常温下固化30min,通过重力沉降从CaCl2溶液中回收微胶囊,然后用滤纸过滤,三次水冲洗3次除去多余
氯化钙和盐类,即得到湿微胶囊,然后对湿微胶囊进行冻干或喷雾干燥。
[0041] 实施例2
[0042] 本实施例提供一种人参皂苷-短双歧杆菌M-16V微胶囊及其制备方法,步骤包括:
[0043] (1)溶液配制:模拟胃液、模拟肠液解囊液的配制。
[0044] 模拟胃液的配制方法包括:配制1g/L NaCl溶液,调pH至2,110-130℃高压灭菌10min;取2g胃蛋白酶,加入到NaCl溶液中溶解,然后用0.1μm滤膜过滤除菌;
[0045] 模拟肠液的配制方法包括:称取KH2PO4 4g加入300ml蒸馏水溶解,然后调pH为4,110℃灭菌10min;另称取胰蛋白酶5g,溶于350ml无菌水,然后与KH2PO4溶液混合均匀,定容至500ml,最后用0.1μm滤膜过滤除菌;
[0046] 解囊液的配制方法包括:分别称取10g KH2PO4和7g C6H8O7,加蒸馏水溶解定容至500ml,然后调节pH为6,110℃灭菌10min,备用。
[0047] (2)菌种的活化
[0048] 菌种的活化步骤包括:将冻存于-20℃的菌株接种至MRS肉汤培养基中,35℃静置厌氧培养20h,连续活化三代后用于后续实验。
[0049] (3)菌悬液的制备
[0050] 菌悬液的制备步骤:取1%活化好的菌液于MRS肉汤培养基中30℃培养10h后,离心(3000r/min,2℃,8min),弃去上清,用PBS缓冲液调整菌液浓度约108CFU/ml,精确活菌数采用平板菌落计数法测定。
[0051] (4)微胶囊的制备
[0052] 微胶囊的制备包括:将菌悬液与高温灭菌后的人参皂苷和槐实胶溶液混合均匀后,用无菌注射器将菌混悬液挤压入磁力搅拌的无菌CaCl2溶液中,常温下固化20min,通过重力沉降从CaCl2溶液中回收微胶囊,然后用滤纸过滤,三次水冲洗1-3次除去多余氯化钙和盐类,即得到湿微胶囊,然后对湿微胶囊进行冻干或喷雾干燥。
[0053] 实施例3
[0054] 本实施例提供一种人参皂苷-短双歧杆菌M-16V微胶囊及其制备方法,步骤包括:
[0055] (1)溶液配制:模拟胃液、模拟肠液解囊液的配制。
[0056] 模拟胃液的制备方法包括:配制5g/L NaCl溶液,调pH至3,130℃高压灭菌20min;取4g胃蛋白酶,加入到NaCl溶液中溶解,然后用0.3μm滤膜过滤除菌;
[0057] 模拟肠液的制备方法包括:称取KH2PO4 8g加入300-800ml蒸馏水溶解,然后调pH为8,130℃灭菌20min;另称取胰蛋白酶15g,溶于500ml无菌水,然后与KH2PO4溶液混合均匀,定容至1500ml,最后用0.3μm滤膜过滤除菌;
[0058] 解囊液的配制方法:分别称取18g KH2PO4和15g C6H8O7,加蒸馏水溶解定容至1500ml,然后调节pH为8,130℃灭菌20min,备用。
[0059] (2)菌种的活化
[0060] 菌种的活化步骤包括:将冻存于-10℃的菌株接种至MRS肉汤培养基中,42℃静置厌氧培养30h,连续活化三代后用于后续实验。
[0061] (3)菌悬液的制备
[0062] 菌悬液的制备步骤包括:取3%活化好的菌液于MRS肉汤培养基中40℃培养15h后,离心(3000-5000r/min,6℃,12min),弃去上清,用PBS缓冲液调整菌液浓度约109CFU/ml,精确活菌数采用平板菌落计数法测定。
[0063] (4)微胶囊的制备
[0064] 微胶囊的制备包括:将菌悬液与高温灭菌后的人参皂苷和槐实胶溶液混合均匀后,用无菌注射器将菌混悬液挤压入磁力搅拌的无菌CaCl2溶液中,常温下固化40min,通过重力沉降从CaCl2溶液中回收微胶囊,然后用滤纸过滤,三次水冲洗3次除去多余氯化钙和盐类,即得到湿微胶囊,然后对湿微胶囊进行冻干或喷雾干燥。
[0065] 试验方案:
[0066] 本发明微胶囊具有较高的包埋产率以及良好的胃酸环境耐受性和肠溶性,以提高人参皂苷及益生菌在人体内的生物利用度,下面以试验例作为论证。
[0067] (1)微胶囊的释放特性:
[0068] 肠溶性微胶囊不仅要求微胶囊能抵抗胃酸环境的破坏,也要能在肠道顺利释放菌体。因此研究微胶囊的胃肠释放特征是必然的,先将实施例1所制得的微胶囊置于模拟胃液1h,然后将微胶囊转移至模拟肠液中处理4h。这模拟了微胶囊被人体摄取时所经历的胃肠道运输环境,从而考察微胶囊在人体胃肠道运输过程中的释放特性。
[0069] 由图1可知,微胶囊在胃液中处理0.5h时,迅速释放活菌数5.5log(CFU/g),1h时释放活菌数只略微增加.这与微胶囊在模拟胃液中活菌存活率变化趋势相对应。微胶囊转入肠液处理0.5h后,迅速释放活菌达7.2log(CFU/g),处理1.5h后释放活菌数基本稳定在7.75log(CFU/g),表明微胶囊具有较好的肠溶性。本发明的微胶囊在肠道中释放时间为
1.5h,表明不同
包埋材料及实验方法得到的微胶囊肠溶性不同,本发明所制备的微胶囊肠溶性好。
[0070] (2)生物利用度的测定:
[0071] 选择雌雄小鼠80只,体重18-25g,将实验小鼠随机分为四组,分别为实施例1、实施例2、实施例3、对照组;实施例1、实施例2、实施例3通过微胶囊灌胃
给药,对照组通过人参皂苷静脉注射的方式给药。
[0072] 别给四组小鼠按100mg/kg给药,并于给药后0、10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min、100min和120min于眼眶静脉取血,然后置于加有肝素钠的离心管中,5000rpm离心分离
血浆。各样品取150μL血浆,加入450μL乙腈,涡旋震荡45s,15000rpm离心。取上层清液20μL进样,HPLC测定人参皂苷。
[0073] 表1实施例与对照组的Cmax和Tmax比较
[0074] 组别 Cmax(ng/mL) Tmax(min)实施例1 3533.81±455.37 113.8±21.2
实施例2 3319.05±441.26 104.5±18.4
实施例3 3208.25±386.47 101.5±29.4
对照组 1129.35±214.12 81.4±19.6
[0075] 表2实施例与其他组的生物利用度的比较
[0076]样品 生物利用度(%)
实施例1 79
实施例2 70
实施例3 73
对照组 46
[0077] 结果测定除人参皂苷静脉组外的各组的平均最大浓度Cmax和以及达到平均最大浓度的时间Tmax如表1,同时根据平均血药浓度数据用程序拟合,口服给药浓度数据与静脉注射给药数据相比,计算人参皂苷的生物利用度,数据如表2。结果显示实施例1-3拥有最大的Cmax以及最长的Tmax,这是由于人参皂苷微胶囊化处理使得人参皂苷更易被吸收,此外UGTs和人参皂苷的缓释使其生物利用度最高。因此证明了本发明的先进性。
[0078] 以上已经描述了本发明的各实施例,上述说明是示例性的,并非穷尽性的,并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下,对于本技术领域的普通技术人员来说许多
修改和变更都是显而易见的。