一种动物心力衰竭模型、构建方法
阅读：109发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种动物心力衰竭模型、构建方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于医学模型技术领域，公开了一种动物心 力 衰竭模型、构建方法，取8周龄雄性SPF级C57/BL6小鼠，将小鼠置于 净化 笼中， 温度 为19-23℃， 相对湿度 40％-50％，保持光照明暗各12h，以小 鼠标 准 饲料 进行饲喂，自由饮 水 ；适应性饲喂1周后植入载有 氧 化低 密度 脂蛋白的微渗透压 泵 4周即得；通过超声心动图及 血浆 BNP水平等确 定心 力衰竭程度。本发明的心力衰竭模型与以往压力负荷型、容量负荷型、心肌缺血型、心脏毒性药物等引起的心力衰竭模型不同，填补了不明原因心力衰竭动物模型的空白，属于高脂血症引起心力衰竭的新型动物心衰模型。本心衰模型重复性好，简单客观。，下面是一种动物心力衰竭模型、构建方法专利的具体信息内容。
1.一种动物心力衰竭模型的构建方法，其特征在于，所述动物心力衰竭模型的构建方法包括以下步骤：
第一步，取8周龄雄性SPF级C57/BL6小鼠，将小鼠置于净化笼中，温度为19-23℃，相对湿度40％-50％，保持光照明暗各12h，以小鼠标准饲料进行饲喂，自由饮水；
第二步，适应性饲喂1周后植入载有OX-LDL的微渗透压泵4周即得。
2.如权利要求1所述的动物心力衰竭模型的构建方法，其特征在于，植入载有OX-LDL200ng/kg/min的微渗透压泵。
3.一种由权利要求1～2任意一项所述动物心力衰竭模型的构建方法构建的动物心力衰竭模型，其特征在于，所述动物模型建模完成后，对模型的左心室舒张期内径、左心室收缩期内径、左心室缩短分数、心重指数、BNP信息进行分析，并对分析后的指标采用盲法检测。
4.如权利要求3所述的动物心力衰竭模型，其特征在于，对模型的左心室舒张期内径、左心室收缩期内径、左心室缩短分数、心重指数、BNP信息进行分析方法包括：
(1)在建模前、后分别测量左心室舒张期内径、左心室收缩期内径、左心室缩短分数；
(2)建模结束后，腹主动脉取血后，分离血清，并在-80℃的条件下保持，剖取心脏，洗去残血，滤纸吸干，称量后计算出心重指数；
(3)通过ELISA法检测血清BNP。
5.如权利要求4所述的动物心力衰竭模型，其特征在于，所述左心室舒张期内径、左心室收缩期内径、左心室缩短分数采用心超测量。
一种动物心力衰竭模型、构建方法
技术领域
[0001] 本发明属于医学模型技术领域，涉及一种动物心力衰竭模型、构建方法及其应用，尤其涉及肥胖相关心力衰竭动物模型的构建方法。
背景技术
[0002] 心力衰竭是心室泵血功能降低不能满足机体生命活动需要的心脏病终末阶段，是临床上常见的心血管综合征，其发病率与死亡率不断上升。引起心力衰竭的病因复杂，如心肌缺血、心脏压力负荷增加、心脏容量负荷增加、神经内分泌细胞因子过度激活、原发性心肌病等原因均会引起心室重构导致心衰症状。确定心衰新的治疗靶点和开发新的预防措施具有重要意义，动物实验是连接医学基础与临床的桥梁与纽带，动物模型是研究心力衰竭发生、发展和防治的一种有效工具。因此前期的实验设计中动物实验的模型建立必不可少。
[0003] 现有技术中，心力衰竭的模型建立的方法有：1)压力超负荷法：主动脉缩窄法、肾动脉缩窄法、肺动脉缩窄法。2)容量负荷法：腹腔静脉造瘘动静脉短路法、肾切除后高盐法、主动脉瓣膜关闭不全法。3)心肌缺血/心肌梗死法。4)药物法。
[0004] 1)压力超负荷法：通过缩窄主动脉或肺动脉，使主动脉压力升高，后负荷增加，后期心脏失代偿，最终形成心力衰竭。腹主动脉缩窄法即通过手术部分结扎腹主动脉，增加外周循环阻力，造成压力超负荷心力衰竭。
[0005] 2)容量负荷法：通过给大鼠腹主动脉下腔静脉造瘘或手术造成小鼠主动脉瓣关闭不全可使大鼠左心室扩大呈球形，射血分数和短轴缩短率明显降低，建立容量超负荷心力衰竭模型。
[0007] 4)心脏毒性药物法：通过给小鼠尾静脉注射阿霉素建立可靠的非缺血性慢性心力衰竭大鼠模型；通过股静脉注射0.1％的戊巴比妥钠及异丙肾上腺素5mg/(kg·d)等建立急性心力衰竭大鼠模型。
[0008] 临床中，发现越来越多的心衰病人并非因高血压、心肌缺血、心肌梗死、心脏瓣膜关闭不全、心脏毒性药物等原因引起的心力衰竭，此类病人大多肥胖患有高脂血症，例如：血浆中低密度脂蛋白胆固醇较高，体质指数较高，因此寻求一种高脂血症型新型动物心力衰竭模型虚位以待。
[0009] 综上所述，现有技术存在的问题是：现有技术尚缺乏一种稳定的、容易确定实验干预时期的、由OX-LDL引起的动物高脂血症型心力衰竭模型。
[0010] 解决上述技术问题的难度：现有小鼠心力衰竭模型并不涉及高脂血症型心力衰竭模型的建立。
[0011] 解决上述技术问题的意义：近年来，随着生活水平的提高，人们饮食结构的改变，高脂血症(hyperlipidemia，HLP)发病率越来越高，因为长期血脂过高会引发机体代谢紊乱，进而产生动脉粥样硬化、冠心病、心肌梗死等心脑血管疾病，HLP严重危害着人类的身体健康。然而，在临床上，很大部分心衰人群并非是由冠心病、心肌梗死、心肌病等引起的心力衰竭，但此类病人大都存在高脂血症，因此为明确此类人群明发病病因，开发一种由高脂血症引起心力衰竭的动物模型尤为重要。
发明内容
[0012] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种动物心力衰竭模型、构建方法及其应用，具体为一种基于OX-LDL的动物心力衰竭模型应用方法。通过给小鼠皮下植入载有OX-LDL的微渗透压泵方法从而促进小鼠心肌肥厚继而引起小鼠心力衰竭。模型制备方法稳定性、重复性好，简单客观。为研究肥胖合并高脂血症相关慢性心力衰竭提供必要的实验基础。
[0013] 为了实现上述发明目的，本发明提供了一种慢性心力衰竭动物模型的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
[0015] (2)适应性饲喂1周后植入载有OX-LDL(200ng/kg/min)的微渗透压泵4周即得。
[0016] 进一步，所述动物模型建模完成后，采用以下评价指标对动物模型进行评价：左心室舒张期内径、左心室收缩期内径、左心室缩短分数；心重指数；血清BNP；上述评价指标均采用盲法检测。
[0017] 进一步，所述评价的具体方法如下：
[0018] (1)在建模前、后分别测量小鼠左室射血分数、左室内径缩短率；
[0019] (2)建模结束后，腹主动脉取血后，分离血清，并在-80℃的条件下保持，剖取心脏、洗去残血，滤纸吸干，称量后计算出心重指数；
[0020] (3)通过ELISA法检测血清BNP；若与建模前相比，建模后小鼠左心室缩短分数减少率大于等于50％，血清BNP含量大于等于400pg/ml；心重指数至少为5.5g/kg；
[0021] 同时满足上述条件，则慢性心力衰竭的动物模型建模成功。
[0022] 所述左心室舒张期内径、左心室收缩期内径、左心室缩短分数均采用心超测量。
[0023] 本发明提供了新型的动物心力衰竭模型。临床中，发现越来越多的心力衰竭并非因高血压、心肌缺血、心肌梗死、心脏瓣膜关闭不全、心脏毒性药物等原因引起，此类病人大多肥胖合并高脂血症，因此寻求一种高脂血症诱导动物心力衰竭模型虚位以待。
[0024] 本发明的有益效果是：与传统慢性心力衰竭的动物模型相比，本发明采用OX-LDL(200ng/kg/min)的微渗透压泵法构建的动物模型，能够很好地模拟高脂血症引起慢性心力衰竭的病理特征。复制方法稳定性、重复性好，简单客观。为研究肥胖合并高脂血症相关慢性心力衰竭提供必要的实验基础。
[0025] 相比于现有技术，本发明的优点进一步包括：
[0026] 本发明取8周龄雄性SPF级C57/BL6小鼠，将小鼠置于净化笼中，温度为19-23℃，相对湿度40％-50％，保持光照明暗各12h，以小鼠标准饲料进行饲喂，自由饮水；适应性饲喂1周后植入载有氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)的微渗透压泵(OX-LDL 200ng/kg/min)4周即得；通过超声心动图及血浆BNP水平等确定心力衰竭程度。本发明的心力衰竭模型与以往压力负荷型(主动脉缩窄、肺动脉高压等)、容量负荷型(主动脉关闭不全、盐负荷等)、心肌缺血型(冠状动脉结扎等)、心脏毒性药物等引起的心力衰竭模型不同，填补了不明原因心力衰竭动物模型的空白，属于高脂血症引起心力衰竭的新型动物心衰模型。本心衰模型重复性好，简单客观。
附图说明
附图说明
[0028] 图2是本发明实施例提供的超声心动图下小鼠心力衰竭表现示意图；
[0029] 图中：(a)对照组；(b)OX-LDL 2周后；(c)OX-LDL 4周后。
[0030] 图3是本发明实施例提供的血浆BNP浓度示意图。
[0031] 图4是本发明实施例提供的心重指数示意图。
具体实施方式
[0032] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0033] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种动物心力衰竭模型、构建方法及其应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。本发明应用到的仪器及材料有：C57BL/6小鼠；OX-LDL200ng/kg/min，(AbDserotec，USA)；渗透微型泵(DURECT，Cupertino，CA，USA)；心超机器：(VisualSonics Vevo770，VisualSonics Inc.Toronto，Canada)。
[0034] 本发明实施例提供的动物心力衰竭模型通过给小鼠皮下植入载有OX-LDL的微渗透压泵(DURECT，Cupertino，CA，USA)，引起心力衰竭。
[0035] 如图1所示，本发明实施例提供的动物心力衰竭模型的构建方法包括以下步骤：
[0036] S101，取8周龄雄性SPF级C57/BL6小鼠，将小鼠置于净化笼中，温度为19-23℃，相对湿度40％-50％，保持光照明暗各12h，以小鼠标准饲料进行饲喂，自由饮水。
[0037] S102适应性饲喂1周后植入载有OX-LDL(200ng/kg/min)的微渗透压泵4周即得。
[0038] 所述动物模型建模完成后，采用以下评价指标对动物模型进行评价：左心室舒张期内径、左心室收缩期内径、左心室缩短分数。心重指数。血清BNP。上述评价指标均采用盲法检测。
[0039] 所述评价的具体方法如下：
[0040] (1)在建模前、后分别测量左心室舒张期内径、左心室收缩期内径、左心室缩短分数。
[0041] (2)建模结束后，腹主动脉取血后，分离血清，并在-80℃的条件下保持，剖取心脏、洗去残血，滤纸吸干，称量后计算出心重指数。
[0042] (3)通过ELISA法检测血清BNP。若与建模前相比，建模后小鼠左心室缩短分数减少率大于等于50％，血清BNP含量大于等于400pg/ml。心重指数至少为5.5g/kg。
[0043] 同时满足上述条件，则慢性心力衰竭的动物模型建模成功。
[0044] 所述左心室舒张期内径、左心室收缩期内径、左心室缩短分数均采用心超测量。
[0045] 下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
[0046] 实施例
[0047] 本发明实施例提供的动物心力衰竭模型的构建方法包括：
[0048] 1、实验动物
[0049] C57BL/6雄性小鼠，周龄为8w，体重18-22g，小鼠种源购买于Jackson实验室，于复旦大学医学院实验动物部SPF级饲养。
[0050] 2、实验材料
[0051] Vevo 770型小动物超声仪，加拿大VisualSonics生产。微量加样器，德国Eppendorf生产。小动物保温垫，安徽淮北正华公司生产。5％氯胺酮，上海恒瑞制药有限公司生产。超声耦合剂，上海曼吉磁公司生产。5415R型低温离心机，德国Eppendorf生产。OX-LDL，美国AbDserotec生产。渗透压泵，美国DURECT生产。
[0052] 3、实验方法
[0053] 动物模型的建立
[0054] (1)取8周龄雄性SPF级C57/BL6小鼠，将小鼠置于净化笼中，温度为19-23℃，相对湿度40％-50％，保持光照明暗各12h，以小鼠标准饲料进行饲喂，自由饮水。
[0055] (2)适应性饲喂1周。
[0056] (3)术前称重，乙醚麻醉，待动物出现角膜反射消失、肌力下降、软瘫等麻醉反应后，俯卧于鼠板固定。
[0057] (4)剪去背部2厘米左右的皮毛，并用酒精局部消毒。
[0059] (6)逐层缝合。常规喂养4周即得心力衰竭模型。
[0060] 4、实验分组
[0061] 对照组、OX-LDL 2周组、OX-LDL 4周组。
[0062] 5、心脏超声检测
[0063] 建模前及建模后，使用加拿大VisualSonic公司Vevo770超声诊断仪和30MHz高频探头进行小鼠的心脏超声检测心脏功能，具体步骤为：
[0064] (1)称重后，按100mg/kg的5％氯胺酮的剂量腹腔注射小鼠使其肌力下降，达浅麻醉状态，以避免检测过程中躁动而影响结果。
[0065] (2)小鼠仰卧位，固定于Vevo770高频超声系统自带的加热板上，以保持体温的恒定。用脱毛膏脱去心前区毛。
[0066] (3)涂适量超声胶于心前区，待小鼠心率稳定在500beats/min左右时，用VisualSonics Vevo770超声仪中央频率为30mHz的探头在动物胸壁上开始采集胸骨旁长轴切面、心尖四腔切面，记录心电图，测量心率(HR)。
[0067] (4)记录B-Mode图像。
[0068] (5)取胸骨旁左室长轴切面，在二尖瓣腱索水平获得M型切面图像。
[0069] (6)测量左室舒张期内径(LVIDd)、左室收缩期内径(LVIDs)、缩短分数(LVFS％)，同时记录心电图和心率(HR)等指标。
[0070] (7)对于不同个体，Vevo770均设置为相同参数。每个测量指标均选取三个不同的心动周期后取平均值得到。
[0071] 6、标本取材及处理：小鼠经麻醉后，经颈动脉取血1ml后迅速开胸取出心脏，用冰生理盐水洗净残血，滤纸吸干心脏并称重。剪掉左右心房和主肺动脉，紧贴室间隔右下侧剪下右心室游离壁。取左心室垂直于长轴切取厚约3mm的心肌组织块放入10％中性福尔马林(磷酸盐缓冲液配制)固定，余下部分放入液氮中保存。所有标本制作条件完全相同以避免人工误差。
[0072] 7、ELISA法检测血清BNP。
[0073] 8、统计学分析：测量数据结果使用SPSS16.0分析，以Mean±SD表示，组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA，LSD)法，p＜0.05代表有统计学显著性差异。统计图表的制作使用SigmaPlot 10.0完成。
[0074] 9、实验结果：
[0075] (1)OX-LDL诱导心力衰竭模型小鼠心脏高频超声变化：如图2所示，本发明实施例提供的超声心动图下小鼠心力衰竭表现示意图。(a)对照组。(b)OX-LDL 2周后。(c)OX-LDL 4周后。
[0076] 图2结果显示，OX-LDL 2周组的LVIDd、LVIDs与对照组比较无统计学差异(P＞0.05)。OX-LDL 4周组的LVIDd、LVIDs与对照组比较显著扩大变化(P＜0.01)。OX-LDL 2周组的LVFS％与对照组比较无统计学差异(P＞0.05)。OX-LDL 4周组的LVFS％与对照组比较显著下降(P＞0.05)。
[0077] (2)OX-LDL诱导心力衰竭模型小鼠BNP的变化。
[0078] 图3结果显示，OX-LDL 2周组的BNP与对照组比较无统计学差异(P＞0.05)。OX-LDL 4周组的BNP与对照组比较显著下降(P＜0.01)。
[0079] (3)OX-LDL诱导心力衰竭模型小鼠心脏质量/体重的变化情况(HW/BW)[0080] 图4结果显示OX-LDL 2周组与对照组比较HW/BW无统计学差异(P＞0.05)，OX-LDL4周与对照组比较HW/BW显著升高(P＜0.01)。
[0081] 下面结合效果对本发明作进一步描述。
[0082] 本发明与压力负荷、容量负荷、心肌缺血、心脏毒性药物等引起的心力衰竭模型不同，填补了不明原因心力衰竭动物模型的空白。建立OX-LDL引起心力衰竭的新型动物心力衰竭模型前需进行：小鼠皮下植入载有OX-LDL的微渗透压泵(DURECT，Cupertino，CA，USA)。通过超声心动图及血浆BNP浓度测定实时确定实验干预时期。
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