Die Erfindung betrifft Mittel und Verfahren zum Nachweis von Wasserstoffperoxid durch oxidative Kondensation von Chromogenen in Gegenwart von Peroxidase.

Die analytische Bestimmung von Wasserstoffperoxid hat für die medizinische Diagnostik eine erhebliche Bedeutung, da bei einer großen Anzahl von wichtigen Nachweisverfahren Wasserstoffperoxid als Zwischenprodukt gebildet wird, welches danach durch Umsetzung mit geeigneten chromogenen Substanzen, überwiegend in Gegenwart einer Peroxidase (POD) als Katalysator, in eine optisch erfaßbare Substanz überführt wird. Das Ausmaß der Bildung des optisch erfaßbaren Produktes dient als Maß für die Menge des Wasserstoffperoxids beziehungsweise als Maß für die Menge des Wasserstoffperoxid bildenden. Substrates. Beispielhaft für solche Reaktionen seien der Nachweis von Glucose/Glucoseoxidase, Cholesterin/Cholesterinoxidase und Harnsäure/Uricase genannt. Für diese Reaktion sind zahlreiche Chromogene beziehungsweise Indikatorsysteme vorgeschlagen worden. Eines der am häufigsten angewandten Indikatorsysteme ist das von Trinder (Biochem. 6 (1969) 24-27), bei dem Phenol mit 4-Aminoantipyrin (4-AAP) in Gegenwart von POD unter Einwirkung von H₂O₂ oxidativ zu einem Farbstoff gekuppelt wird. Anstelle des Phenols können auch Phenolderivate, Anilinderivate, Naphthol, Naphtholderivate oder ähnlich reagierende Substanzen eingesetzt werden. Anstelle des 4-Aminoantipyrins können auch andere Aminoantipyrinderivate, Vanillindiaminsulfonsäure, Methylbenzothiazolonhydrazon (MBTH), sulfoniertes Methylbenzothiazolonhydrazon (SMBTH) und ähnlich reagierende Verbindungen eingesetzt werden.

Obwohl 4-AAP in dieser Reaktion als empfindliches Reagenz bekannt ist, hat es doch gewisse Nachteile. Insbesondere zeigt sich bei den handelsüblichen Reagenzien, daß bei einer Auftragung der Konzentration des gebildeten Farbstoffs gegen die Konzentration des oxidierenden Agens (H₂O₂bzw. H₂O₂ bildendes Substrat) zwar in weiten Konzentrationsbereichen eine lineare Abhängigkeit besteht, jedoch für geringe Konzentrationen negative Farbstoffkonzentrationen extrapoliert werden. Dies ist darauf zurückzuführen, daß auch hochgereinigtes 4-AAP in der Testmischung bei Belastung oder längerer Lagerung in geringem Maße Zersetzungsprodukte unbekannter Konstitution bildet, die H₂O₂ reduzieren und damit der eigentlichen Nachweisreaktion entziehen.

Es stellte sich deshalb die Aufgabe, 4-AAP so zu stabilisieren, daß sich in den Testsystemen auch bei längerer Lagerung keine oder nur noch vernachlässigbare Mengen der vorstehenden Zersetzungsprodukte bilden.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß sich diese Aufgabe dadurch lösen läßt, daß man das 4-AAP mit einer geringen Menge eines alkalischen Puffers im pH-Bereich von 8,5 - 14,o vermischt lagert und erst kurz vor der Testreaktion durch Zugabe einer größeren Puffermenge vom pH-Wert 5,o-8,o in einen für den Ablauf enzymatischen Reaktion notwendigen Bereich bringt.

Die beiden Zusammensetzungen werden dabei in einem für den Nachweis geeigneten Mengenverhältnis zueinander in einer Verpackungseinheit oder einer Gebrauchseinheit zusammengefaßt. Unter Verpackungseinheit wird dabei verstanden, daß sich die in zwei verschiedenen Behältnissen, meistens in einer für mehrere Teste gedachten Menge, abgepackten Zubereitungen in einer gemeinsamen Umverpackung befinden.

Unter Gebrauchseinheit wird verstanden, daß die Zubereitungen sich in einer gemeinsamen Verpackung befinden, aber physikalisch voneinander getrennt sind und erst durch die Zugabe der Testflüssigkeit vereint werden. Beispielhaft sei erwähnt die Separierung in zwei Tabletten, Mehrschichttabletten, Mehrschichtlyophilisate gegebenenfalls in einer als Reaktionsgefäß dienenden Küvette etc. Besonders bevorzugt ist es die beiden Zusammensetzungen auf saugfähige Träger zu imprägnieren und Stücke davon auf einem Handgriff zu befestigen, so daß beim Eintauchen in die Testflüssigkeit die gewünschte Menge beider Komponenten gleichzeitig abgegeben wird.

Da aromatische Amine normalerweise im neutralen oder sauren Milieu relativ stabil sind, aber im alkalischen Milieu einer oxidativen Zersetzung unterliegen, scheint es außerordentlich überraschend, daß 4-AAP gerade in diesem Bereich stabilisiert werden kann.

Als alkalische Puffer können alle diejenigen verwendet werden, die den gewünschten pH-Bereich einstellen und mit den anderen Reagenzien, insbesondere den verwendeten Enzymen, verträglich sind. Beispielhaft seien Alkali-Carbonat/Bicarbonatpuffer, Borat-, Phosphat-, Glycin-, Veronal-, Tris- und Tra-Puffer genannt.

Als neutrale oder saure Puffer, in denen die Nachweisreaktion durchgeführt wird, seien beispielsweise Phosphat-, Citrat- und Acetat- Puffer genannt. Da die zur Bildung von H_ZO_Z aus dem Substrat in den oben erwähnten Testen benötigten Enzyme und sonstige Hilfsreagenzien und auch die Peroxidase normalerweise in saurem Milieu stabiler sind als im alkalischen Milieu, ist es vorteilhaft, diese vom 4-AAP zu trennen und zusammen mit dem "sauren" Puffer zu lagern. Das fertige Reagenzsystem wird dann kurz vor der Durchführung der Reaktion durch Mischen der beiden Komponenten im geeigneten Verhältnis hergestellt. Die Lagerung erfolgt für beide Komponenten üblicherweise in fester Form als Lyophilisat, Pulver, Tablette oder imprägniert auf saugfähige Träger , aus denen durch Zusatz von Wasser das Reagenz hergestellt wird, oder die auch direkt in die zu untersuchende gelöste Probe eingegeben werden können.

In den folgenden Beispielen sind einige Anwendungen der Erfindung beschrieben.

Beispiel 1

Glucose-Farbtest mit 4-Aminoantipyrin /GOD, POD

Ein Reagenzstreifen von 1o mm Breite und ca. 98 mm Länge, an welchem am unteren Ende 2 voneinander getrennte Bezirke der Fläche 1o x 15 mm befestigt sind und wovon der eine 7,7 mg 4-Aminoantipyrin zusammen mit 757_/ug NaHC0₃ und 878_/ug Na₂CO₃, imprägniert auf Filterpapier (598 Schleicher u. Schüll) aus wäßriger Lösung (pH = 1₀,5) und der andere 9oo U Glucoseoxidase sowie 55 U Peroxidase imprägniert auf das Polyamid/Cellulosevlies (VS 532, Binzer) aus o,1 molaren Phosphatpuffer pH = 6,₀ , enthält, wird in 5o ml einer o,1 molaren Phosphatpufferlösung pH = 7,o , die 1o mMol/1 Phenol enthält, eluiert.

In 2 ml dieser Lösung wird o,1 ml Uranylacetat enteiweißtes Serum zupipettiert, gut gemischt und das Reaktionsgemisch 3o Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen.

Die nach dieser Zeit abgeschlossene Farbreaktion wird wahlweise bei 5o5 oder 546 nm gemessen. Die Linearitätsprüfung von o - 6₀₀ mg Glucose/1 mit 6 beziehungsweise 12 Wochen bei 35° C unter Licht- und Feuchtigkeitsausschluß gelagerten Reagenzstreifen, eluiert in frischer o,1 molarer Phosphatpuffer-Lösung von pH = 7,o mit lO mMol/l Phenol, zeigt, daß praktisch ein vernachlässigbarer negativer Achsenabschnitt auftritt.

Vergleicht man in analoger Weise hergestellte Reagenzstreifen, bei dem das 4-Aminoantipyrin-Papier mit Phosphatpuffer auf pH = 7,o abgepuffert ist, so ergibt sich mit steigender Belastungszeit ein zunehmender negativer Achsenabschnitt.

Beispiel 2

Cholesterin-Farbtest mit 4-Aminoantipyrin (CHE, CHO, POD)

Ein Reagenzstreifen von 6 mm Breite und ca. 75 mm Länge, an welchem am unteren Ende 2 voneinander getrennte Bezirke der Fläche 6 x 6 mm befestigt sind und wovon der eine 41o ug 4-Aminoantipyrin zusammen mit 84_/ug NaHCO₃ sowie 1o6 ug NaCO₃ imprägniert auf Filterpapier (598 F Schleicher u. Schüll) aus wäßriger Lösung (pH = 1₀,₀) und der andere 0,3 U Cholesterinoxidase, o,6 U Cholesterinesterase sowie 4,7 U Peroxidase imprägniert auf Papier 598 F aus o,1 molaren Phosphatpuffer-Lösung pH 7,5 , die lo mmol/1 Phenol enthält, wird eluiert.

Zu dieser Lösung wird o,o2 ml Serum zupipettiert, gut gemischt und das Reaktionsgemisch 3o Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen.

Die nach dieser Zeit abgeschlossene Farbreaktion wird wahlweise bei 5₀5 oder 546 nm gemessen.

Die Linearitätsprüfung von o - 400 mg Cholesterin/dl mit 6 beziehungsweise 12 Wochen bei 35°C unter Licht-und Feuchtigkeitsausschluß gelagerten Reagenzstreifen eluiert in frischer Phosphatpuffer-Lösung pH = 7,5 , die 1o mmol/1 Phenol enthält, zeigt, daß kein negativer Achsenabschnitt auftritt.

Vergleicht man in analoger Weise hergestellte Reagenzstreifen, bei dem das 4-Aminoantipyrin-Papier mit Phosphatpuffer auf pH = 7,o abgepuffert ist, so ergibt sich mit steigender Belastunszeit ein zunehmender negativer Achsenabschnitt.