技术领域
[0001] 本
发明涉及免疫球蛋白的分离方法，具体涉及牛血清去除IgG的生产方法。
背景技术
[0002] 人和动物血液中富含
蛋白质和酶，能够
治疗和挽救生命。有些蛋白质在红细胞中，有些蛋白质存在于血清中。从上世纪中叶，蛋白质的提纯和分离已经成为研究的重要方向。迄今为止，可实现分离的蛋白质有：
白蛋白、脂蛋白、
纤维蛋白、免疫球蛋白G(IgG)等。
[0003] 新生牛血清是
疫苗生产最重要的细胞培养基，同时也是酶免
试剂盒的重要辅料，市场需求巨大。新生牛血清在我国，是无菌采集刚出生未进食(出生14小时内，未进食)的小
公牛动脉血制作成的血清，《药典》要求内毒素低于10EU/ml、血红蛋白低于200mg/ml、外观澄明。国外引进的新生牛血清，是新出生小公牛喂食过初乳4-14天，颈部
放血制作的血清，含大量脂类成分、外观浑浊、粘稠，难以除菌过滤；通常溶血严重、还污染有内毒素、BVDV等，进一步限制了使用价值。
[0004] IgG是动物血清中主要的免疫球蛋白，它是一种参与免疫功能的天然血清成分，也是唯一能穿过胎盘的免疫球蛋白。牛血清中的免疫球蛋白(
抗体)对细胞会产生毒性作用，如果新生牛血清含有大量免疫球蛋白(抗体)则会严重影响细胞的生长；国内麻疹、
风疹、腮腺炎、乙型脑炎、
水痘、狂犬病等诸多病毒性疫苗均采用细胞培养法生产，细胞培养液中必须加入一定量新生牛血清，如果新生牛血清中有抗相应病毒的免疫球蛋白(抗体)存在，将会严重影响病毒性疫苗的
质量。牛血清的质量直接关系到
生物制品的质量和产量，天然牛血清IgG不仅会干扰细胞培养，同时也会干扰疫苗生产中的病毒生长。新生牛血清中IgG含量与胎牛相比要高很多，大约是胎牛的80倍。
[0005]
血浆和血清中含有蛋白质以及其他例如酶等化合物，当血液从动物身上流出暴露在空气或容器中，会变得很不稳定。即使添加
柠檬酸钠等化学试剂也仅仅能在一定程度上增加其
稳定性，防止
凝结。从血清中分离蛋白所用的任何方法都要考虑血清和蛋白质自身的不稳定性。因此，规模化的从血清中去除IgG是一个重大的挑战。
[0006] 由于进口胎牛血清的价格昂贵，而国产胎牛血清产量有限，国内大部分生物制品企业在研发阶段使用胎牛血清，为了降低成本同时保证货源充足，在大生产过程中以使用国产新生牛血清为主，由于IgG含量较高，对产品的质量和产量有一定负面影响。
[0007]
现有技术中常用的分离免疫球蛋白的方法有低温
乙醇沉淀法、盐析法、层析法等。自上世纪40年代，Cohn开发了低温乙醇法分离工艺，乙醇低温沉淀IgG一直是最为广泛的蛋白质分离方法，但是这种方法收率低、生产环境要求低温、能耗较高且容易使得IgG形成聚集体。国内一些业内人士尝试盐析法分离IgG，例如中国
专利文献CN10232117A和CN1824679A均公开了盐析法分离动物血液中的免疫球蛋白，盐析法虽然简单，但免疫球蛋白的分离效果不好，还需要后续脱盐处理。层析法分离IgG的应用中，多是用离子交换层析法，但是需采用阳离子与阴离子结合或两步阴离子交换柱层析，否则纯化效果难于达到要求。例如美国专利文献US3664994A公开了利用DEAE葡聚糖介质从牛血清中分离IgG的过程；
美国专利文献US4911910A利用QAE介质从牛血中分离IgG，收率超过85％，但是对料液的pH和盐浓度有较高的要求。目前，亟需简单且易规模化生成的牛血清去除IgG的生成方法。
发明内容
[0008] 为解决现有技术中牛血清产量低且IgG含量较高、不能规模化生成的技术问题，本发明提供一种牛血清去除IgG的生产方法。
[0009] 本发明提供一种牛血清去除IgG的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0010] 1)预过滤，通过五层无菌纱布预过滤，滤除纤维蛋白集结体
块以及少许免疫球蛋白
凝块，保留滤液A；
[0011] 2)将步骤1)所得滤液A，通过膜孔孔径为0.5um的陶瓷复合
膜过滤，保留滤液B；
[0012] 3)将步骤2)所得滤液B，通过复合过滤膜，滤除高
密度免疫球蛋白分子，保留滤液C，所述复合过滤膜为为键合有苯丙
氨酸亲和配基的由羟乙基
纤维素改性的聚酰胺微孔滤膜复合膜；
[0013] 4)将步骤3)所得滤液C通过截留分子量150kD的中空纤维
超滤柱进行循环超滤，滤除大量大分子免疫球蛋白，将所得滤液D回收低温无菌保存；
[0014] 5)取步骤4)所得滤液D，通过装有
吸附剂的层析柱，收集层析液；
[0015] 6)将步骤5)中的层析液置于反应罐中，加乙醇沉淀，调pH，控制
温度，控制反应时间，然后进行离心分离，得上清液；
[0016] 7)将步骤6)中的上清液中加入高选择性吸附剂，吸附絮凝反应一段时间后，通过膜孔孔径0.01-0.05um的陶瓷复合膜过滤，收集滤液E，制得去除IgG的牛血清制品，所述高选择性吸附剂包括砜基结构连接载体和聚乙二醇链。
[0017] 优选的，所述步骤7)中，将收集的滤液E进行灭菌处理，具体的，将滤液E通过γ射线照射，然后装入连续流血浆灭菌器内并以45°
角度采用紫外线照射，最终得到去除IgG的无菌牛血清成品。
[0018] 优选的，步骤2)和7)中使用的陶瓷复合膜管，事先经过高温
蒸汽压
力灭菌半小时。
[0019] 优选的，步骤5)中吸附剂选用Sepharose-SPA吸附剂。
[0020] 优选的，步骤5)中吸附剂选用Celite503吸附剂。
[0021] 进一步优选的所述Celite503吸附剂颗粒密度为4g/ml-10g/ml。
[0022] 进一步优选的，层析柱流速至少为3cm/min。
[0023] 优选的，步骤6)乙醇沉淀过程中，将乙醇分为10份批量加入，先加入5份乙醇，反应1h，再加入3份乙醇，反应0.5h，最后加入2份乙醇反应1h。
[0024] 进一步优选的，调节乙醇沉淀的pH为5-6，将反应温度逐渐降低为零下4℃，控制反应时间为2-3h。
[0025] 优选的，步骤7)中，陶瓷复合膜过滤的孔径为0.02um。
[0026] 与现有技术相比，本发明提供的牛血清去除IgG的生成方法，操作简单、生成过程对血清无污染，本发明的方法，通过层层过滤、吸附以及层析，先通过纱布预过滤，滤除纤维蛋白集结体块以及少许免疫球蛋白凝块；再通过孔径为0.5um的陶瓷复合膜过滤，以滤除大分子纤维蛋白和少量发生结块的免疫球蛋白体；通过复合过滤膜，滤除高密度免疫球蛋白分子；通过截留分子量150kD的中空纤维超滤柱进行循环超滤，滤除大量大分子免疫球蛋白；通过吸附剂与小分子量的IgG吸附结合，形成大分子团，可进一步滤除IgG；乙醇沉淀和加入高选择性吸附剂，进一步将小分子IgG絮凝沉淀，最后过滤杀菌，得去除IgG的牛血清。本发明的层层滤除方法，大大提高IgG的去除率，将IgG去除率提高至90％以上，且有效去除纤维蛋白等。本发明采取的血清去除IgG的方法，简便快捷，工艺稳定且适于大批量生产，且有效去除牛血清中的IgG和纤维蛋白，
葡萄糖含量低，能够彻底杜绝病毒、病菌和支原体的污染，所得的牛血清能够用于含血清细胞培养液。
具体实施方式
[0027] 为了使本技术领域的人员更好的理解本
申请中的技术方案，下面将结合
实施例来对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请的一部分实施例，基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
[0028] 选未进食的新生公牛(出生14小时内)，并检查幼牛档案：包括母系年龄、体重、健康状况、近1年有无疫情、近1年的疫苗注射以及幼牛体重等情况，并将上述内容登记入待
采血幼牛的血液档案中。
[0029] 将选好的待采血幼牛剃毛，并进行清洁消毒处理，依次采用碘酒和酒精进行全身消毒处理。使用无菌
采血针从清洁消毒后幼牛的静脉进行
全血采集，采血量不超过其体重的1.1％，并将采集到的全血存放在离心瓶中并于4℃温度下静置8-20h。待自然出清后，以5000转离心处理50-60min，静置，待瓶中血清与红细胞明显分层后，离心分离，吸取上层血清(取血清为样品1)至无菌容器中，将分离好的牛血清在-20℃温度下保存。
[0030] 将处理得到的牛血清进行处理，首先，将得到的冷冻血清置于
冰箱中融化，并将融化后的牛血清通过五层无菌纱布预过滤，滤除纤维蛋白集结体块以及少许免疫球蛋白凝块，保留滤液A(取滤液A为样品2)。
[0031] 将所得滤液A，通过孔径为0.5um的陶瓷复合膜过滤，以滤除大分子纤维蛋白，保留滤液B，此过程可滤除少量发生结块的免疫球蛋白体。
[0032] 将滤液B通过复合过滤膜，滤除高密度免疫球蛋白分子，保留滤液C(取滤液C为样品3)。
[0033] 所述复合过滤膜为键合有苯丙氨酸亲和配基的由羟乙基纤维素改性的聚酰胺微孔滤膜复合膜。该复合过滤膜的配基键合量高，对牛血清中的免疫球蛋白具有较好的过滤纯化效果，且性能稳定。并且该复合过滤膜还大大减少了对除免疫球蛋白以外生物大分子的非特异性吸附。
[0034] 根据新生幼牛血清中免疫球蛋白的分子大小的特点，免疫球蛋白IgG平均分子量为150kD、IgM分子量为1000kD、IgA分子量为400kD。将过滤液通过截留分子量150kD的中空纤维超滤柱进行循环超滤，可大大去除血清中的免疫球蛋白，并保留对对细胞生长有益的血清白蛋白、小分子肽、氨基酸、微量元素等小分子物质。
[0035] 将所得滤液C通过截留分子量150kD的中空纤维超滤柱进行循环超滤，滤除大量大分子免疫球蛋白，并回收血清中的血清白蛋白、小分子肽、微量元素等小分子成分，将得滤液D回收低温无菌保存(取滤液D为样品4)。
[0036] 由于血清中脂类和免疫球蛋白、血红蛋白、内毒素等聚合成大于100nm的颗粒，100-300kD超滤膜可能难以
透析出来，超滤柱可有效将上述血清杂质富集在截留部分。因此，通过截留分子量150kD的中空纤维超滤柱循环超滤后，IgG大量减少。但仍有小分子量的IgG残留在滤液D中。通过吸附剂与小分子量的IgG吸附结合，形成大分子团，可进一步滤除IgG。
[0037] 通过金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)与亲和层析技术相结合的生产工艺进行分离IgG，可将未被过滤的小分子免疫球蛋白吸附絮结。采用现有技术的方法制备Sepharose-SPA吸附剂。在50ml三角烧瓶中加入蒸馏水20ml，加入固体溴化氰1.4g，加盖后温和振荡，溶解。倒入已盛有琼脂糖珠(4B)的烧杯中，立即搅拌，并滴加2mol/L NaOH溶液，边加边搅拌，使pH维持在11。反应6min后，倒入布氏漏斗，迅速以预冷的0.1mol/L NaHCO3溶液500ml抽滤洗涤已活化的琼脂糖珠。洗涤时间不超过90Sec，立即将此琼脂糖珠加入预先以0.1mol/L NaHCO3平衡的SPA液10ml中(10mg/ml)，于4℃搅拌16h～20h，即得到Sepharose-SPA的吸附剂。
[0038] Celite503吸附剂也常用于血清蛋白的吸附去除工艺，本发明中也可以采用颗粒密度为4g/ml-10g/ml的Celite503吸附剂作为吸附材料。
[0039] 将滤液D通过装有Sepharose-SPA或Celite503吸附剂的层析柱，流速至少为3cm/min，IgG分子被吸附在层析柱，保留层析液(取层析液为样品5)。
[0040] 层析液置于反应罐中，加乙醇沉淀，调pH，控制温度，控制反应时间，然后进行离心分离，得上清液。
[0041] 在乙醇沉淀步骤中，将乙醇分为10份批量加入，先加入5份乙醇，反应1h，再加入3份乙醇，反应0.5h，最后加入2份反应1h。调节乙醇沉淀的pH为5-6，将反应温度逐渐降低为零下4℃，控制反应时间为2-3h。沉淀后的离心提取上清液，离心时间为8-10min。
[0042] 在上清液中加入高选择性吸附剂，所述高选择性吸附剂包括砜基结构连接载体和聚乙二醇链，采用现有技术的制备方法：将载体分散于二乙烯基砜(DVS)溶液中，反应后离心分离，固体用无水乙醇洗涤，得到乙烯基砜活化的载体材料；将乙烯基砜活化的载体材料分散于聚乙二醇溶液，反应后离心分离，固体用无水乙醇洗涤，得到担载型抗体高选择性吸附配基。
[0043] 由于所述高选择性吸附剂以聚乙二醇链为功能配基，并采用砜基结构连接载体和聚乙二醇链，能够高效地选择性结合免疫球蛋白，从而将小分子的免疫球蛋白吸附絮结为分子团，便于滤除。
[0044] 吸附絮凝反应一段时间后，通过膜孔孔径0.01-0.05um的陶瓷复合膜过滤，将免疫球蛋白分子团滤除，收集滤液E，将收集的滤液E进行灭菌处理，具体的，将滤液通过γ射线照射，然后装入连续流血浆灭菌器内并以45°角度采用紫外线照射，最终得到去除IgG的无菌牛血清成品(取血清成品为样品6)。
[0045] 在其他优选方案中，本发明中使用的陶瓷复合膜管，事先经过高温
蒸汽压力灭菌半小时，待陶瓷复合膜管冷却至常温后再进行过滤。
[0046] 优选的，陶瓷复合膜过滤的孔径为0.02um。
[0047] 对上述收集到的牛血清样品IgG蛋白质含量检测、纤维蛋白含量检测、细菌检测及病毒检测，所采用的检测方法采用本领域技术人员使用的常规检测方法进行检测，计算样品1-6的IgG和纤维蛋白去除情况，检测结果参见表1所述。
[0048] 表1
[0049]
[0050]
[0051] 综上所述，本发明提供牛血清去除IgG的生产方法，通过层层过滤、吸附以及层析，先通过纱布预过滤，滤除纤维蛋白集结体块以及少许免疫球蛋白凝块；再通过孔径为0.5um的陶瓷复合膜过滤，以滤除大分子纤维蛋白和少量发生结块的免疫球蛋白体；通过复合过滤膜，滤除高密度免疫球蛋白分子；通过截留分子量150kD的中空纤维超滤柱进行循环超滤浓缩1倍，滤除大量大分子免疫球蛋白；通过吸附剂与小分子量的IgG吸附结合，形成大分子团，可进一步滤除IgG；乙醇沉淀和加入高选择性吸附剂，进一步将小分子IgG絮凝沉淀，最后过滤杀菌，得去除IgG的牛血清。本发明的层层滤除方法，大大提高IgG的去除率，将IgG去除率提高至90％以上，且有效去除纤维蛋白等。本发明采取的血清去除IgG的方法，简便快捷，工艺稳定且适于大批量生产，且有效去除牛血清中的IgG和纤维蛋白，葡萄糖含量低，能够彻底杜绝病毒、病菌和支原体的污染，所得的牛血清能够用于含血清细胞培养液。
[0052] 应当理解，虽然本
说明书是按照各个实施例描述的，但并非每个实施例仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
[0053] 上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
